JP2005507654A - 増幅した癌遺伝子およびそれらの癌への関与 - Google Patents
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Abstract
乳房および/または肺および/または脳および/または結腸および/または前立腺および/または卵巣の癌遺伝子において増幅される、ガラニン、ガラニン受容体2(GALR2)およびガラニン受容体3(GALR3)の遺伝子を利用して、ヒト等の哺乳動物における腫瘍および癌の診断、予防および治療に用いられる、方法および組成物が開示される。ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子並びにそれらの発現タンパク質産物および抗体を、癌治療またはワクチンのための診断または標的として使用する。また、これらは、癌の診断、予防および治療に有用な化合物および試薬を同定するのにも使用される。また、腫瘍形成中のGALR2−GALR3ヘテロ複合体形成についても、開示される。
Description
【発明の背景】
【0001】
1.発明の分野
本発明は、癌遺伝子並びに癌の診断および治療に関する。より詳細には、本発明は、一定の種類の癌に関与する、増幅および過剰発現したガラニン遺伝子、ガラニン受容体2(GALR2)遺伝子およびガラニン受容体3(GALR3)遺伝子に関する。また、本発明は、腫瘍形成中の機能的に重要なGALR2−GALR3ヘテロ複合体の形成に関する。本発明は、増幅した遺伝子、それらのコードされたタンパク質、および抗体、インヒビター、活性化剤等、並びに乳癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌を含む癌の診断、ワクチンおよび抗癌療法におけるそれらの使用に関する。
【0002】
2.発明の背景
癌および遺伝子の増幅:
癌は、米国において、心疾患に続く第二位の死亡原因であり(Boring等、CA Cancer J.Clin.,43:7,1993)、アメリカ人の3人に1人が発病する。アメリカ人の4人に1人が癌で死亡する。癌の特徴は、細胞の増殖が無制御状態で生じ、これにより、正常組織の局部的な浸潤または異常増殖の全身的広がりが生じる。特定の種類の癌または特定の段階の癌の発病は、これらの両方を含むことがある。
【0003】
生体において機能している種々の組織における細胞の分裂または増殖は、通常は秩序正しく、且つ、制御された方法で生じる。これは、とりわけ、接触、シグナル伝達、および隣接細胞間の他のコミュニケーションを含む、繊細な増殖制御機構により可能となる。機能する組織においては、通常、成長シグナル(促進または阻害)が細胞間で交換される。細胞は、通常、促進シグナルの不存在下では分裂せず、阻害シグナルが優位となったときに分裂が停止する。しかしながら、このようなシグナル伝達またはコミュニケーションは、癌細胞では不良であるか、完全に停止する。その結果、細胞は分裂し続け、隣接する構造体に侵入し、最初の腫瘍塊から独立し、身体の他の部分で新たな増殖をおこなう。悪性疾患における後者の進行は、「転移」と称される。
【0004】
癌は、一般的に、良性腫瘍ではなく悪性腫瘍と称される。良性腫瘍細胞は、正常な周囲細胞に類似している。これらの種類の腫瘍は、ほとんど常に線維性被膜に封入されており、身体の他の部分に転移する可能性がない。これらの腫瘍は、局所器官に影響を及ぼすが、これらの器官を破壊はしない。これらは、通常、長年の間、症状なしで小さいままの状態で存在する。治療は、腫瘍が他の器官を妨害する程度に大きく成長したときにのみ必要となる。これに対して、悪性腫瘍は、良性腫瘍の増殖速度よりも速く成長し、局所組織に浸透してこれを破壊する。ある種の悪性腫瘍は、血液またはリンパ系を通って体全体に広がることがある。予測ができず、且つ、無制御の増殖のため、悪性腫瘍は危険であり、多くの場合に致命的結果を生じる。これらの腫瘍は、形態学的に最初の組織に典型的なものではなく、封入もされていない。悪性腫瘍は、一般的に外科的切除の後に再発する。
【0005】
したがって、治療は、通常、悪性癌または悪性腫瘍を対象とする。悪性増殖に介入することは、癌の成長の初期の段階では最も効果的である。したがって、癌形成の早期の症状に対して感受性のあるマーカーを見出すこと、およびそれに関連した強力な成長抑制剤を同定することが、非常に重要である。このような診断剤および治療剤を開発するには、特に腫瘍形成性との関連における、細胞分裂および分化についての遺伝子制御機構の理解が必要となる。癌は、細胞内での正常な機能を有し、且つ、一度の突然変異または異常レベルでの発現により癌を誘発するか、またはその一因となる癌遺伝子における先天的または後天的な突然変異により生じる。十分に検討されているある腫瘍は、活性化癌遺伝子および不活性化腫瘍抑制遺伝子を含む、数種の異なる独立的に突然変異した遺伝子を有している。これらの各突然変異は、全体として、完全な新生物の表現型を表す形質の一部を付与する役割を果たすと思われる(Land等、Science,222:771,1983;Ruley、Nature,4:602,1983;Hunter、Cell,64:249,1991)。
【0006】
一つのこのような突然変異は、遺伝子増幅である。遺伝子増幅には、DNAコピー数が相対的に増加する特定の遺伝子を含む染色体領域が関与し、これにより、存在するいずれかの遺伝子のコピー数が増加する。一般的に、遺伝子増幅により、転写および翻訳のレベルが増加して、対応する遺伝子mRNAおよびタンパク質の産生量が増加する。遺伝子の増幅により悪影響が生じ、これが癌の形成および増殖の一因となる(Lengauer等、Nature,396:643−649,1999)。
【0007】
遺伝子の全集合体は、種々の異なる種類の腫瘍細胞において、明らかに過剰発現するか、または違った形で発現することが、癌の研究者により一般的に理解されている。さらに、これらの過剰発現した遺伝子の極めて少数だけが、癌表現型に原因として関与していると思われる。残りの過剰発現した遺伝子は、DNAの複製に関与するより多くの基本的な一次的事象、例えば、一群の遺伝子の過剰発現、による二次的な結果であると思われる。一方、遺伝子の増幅は、固形腫瘍における重要な遺伝的変更であることが定説となっている(Knuutila等、Am.J.Pathol.,152(5):1107−23,1998;Knuutila等、Cancer Genet.Cytogenet.,100(1):25−30,1998)。
【0008】
ある種の周知の遺伝子、例えば、c−mycの過剰発現が、遺伝子増幅の不存在下でかなりの高レベルで観察された(Yoshimoto等、JPN J.Cancer Res.,77(6):540−5,1986)。しかしながら、これらの遺伝子は、しばしば増幅され(Knuutila等,Am.J.Pathol.,152(5):1107−23,1998)、これにより活性化される。このような特性は、癌遺伝子の顕著な特徴であると考えられる。増幅の不存在下での過剰発現は、これらの状況でのより高い転写効率により生じることがある。c−mycの場合、例えば、Yoshimoto等は、その転写速度は、試験した腫瘍細胞系で大きく増加することを明らかにした。したがって、癌組織における遺伝子の過剰発現および増幅の特性および相互作用は、癌の発生における遺伝子の役割の重要な目安となる。すなわち、腫瘍における所定の遺伝子のDNAコピーの増加は、その過剰発現の他、およびそれを越えて、腫瘍形成および進行におけるそれらの機能を示すことがある。
【0009】
過剰発現と増幅とは同じ現象ではないことに留意しなければならない。過剰発現は、単一の未増幅遺伝子から得ることができ、増幅された遺伝子は、必ずしもmRNAおよびタンパク質の発現レベルの増加にはつながらない。したがって、一方の現象が他方の現象を生じるか否か、または関連しているか否かを予測することはできない。しかしながら、遺伝子の増幅と遺伝子産物の過剰発現の両方が、前癌状態または癌状態にある細胞または組織で生じる状況では、その遺伝子とその産物から、介入のための診断標的および治療の適時の情報の両方が得られる。一部の遺伝子は、その位置が真の癌遺伝子に隣接していることによって増幅されることがあるので、腫瘍パネルにおける近位遺伝子のDNAコピー数を測定することにより、増幅ユニットの中心点にある増幅遺伝子を、より重要な他の増幅遺伝子に近接しているために増幅されることがある増幅遺伝子から区別できるようにすることも有益である。
【0010】
したがって、増幅された癌遺伝子を見出すことおよびその特徴付けは、それらの過剰発現またはディファレンシャル発現の特徴とともに、およびそれらに加えて、診断、ワクチンおよび治療用途のための新規な目的につながる有望な手段となる。さらに、ヒトゲノムの作業草案の完了およびそれと並行したゲノム技術における進歩により、有効な癌マーカーの同定および抗癌剤における新たな期待が生まれる。ハイスループットのマイクロアレイ検出およびスクリーニング技術、コンピュータによる遺伝子およびゲノム解析ツール並びにマルチプラットホーム機能性ゲノムおよびプロテオミクスバリデーションシステムは、その全てが、癌研究および発見における用途に役立つ。現代の配列決定技術およびゲノム解析の出現とともに、数多くの未知の遺伝子および未知または部分的に公知の機能を有する遺伝子を、明らかにすることができる。
【0011】
ガラニンおよびガラニン受容体:
最近の発明まで、ガラニン、GALR2およびGALR3は、癌と関連していると考えられていたが、その単離および特徴付けに成功していなかったため、腫瘍発生におけるそれらの役割を理解することはできなかった。
【0012】
ガラニンは、痛みのプロセッシングにおいて複雑な役割を有する、アミノ酸29個または30個の神経ペプチドである。いくつかのガラニン受容体亜型が、異なる分布で、後根神経節および脊髄に存在する。ガラニン受容体1型(GALR1)は、主に基底前脳、視床下部だけでなく、脊髄においても発現されることが知られている。一方、ガラニン受容体2型(GALR2)は、脳において広く分布していることが判明しており、下垂体および抹消組織にも存在する(Depczynski等、Annals of the New York Academy of Sciences、1998年12月21日、863pp.120−128、米国)。最近、GALR2は、G(q)タンパク質、G(i)タンパク質およびG(12)タンパク質へのカップリングにより、小細胞肺癌細胞における複数のシグナル伝達経路を開始することが判明している(Wittau等、Oncogene 19(37):4199−209,(2000))。
【0013】
SethiおよびRozengurtは、ガラニンが、小細胞肺癌細胞において、Ca2+可動化、イノシトールホスフェートの蓄積およびクローンの増殖を促進するということを開示することにより、GALR3が癌に関与していると報告している(Cancer Res.51,1674−1679(1991))。神経ペプチドであるガラニンを、蛍光Ca2+インジケータであるフラ−2−テトラアセトキシメチルエステルを含んだ小細胞肺癌(SCLC)細胞に添加すると、細胞内濃度が迅速かつ一時的に増加する。ガラニンがCa2+([Ca2+]i)を増加し、その後同種脱感作が生じる。ガラニンは、濃度に依存して[Ca2+]iを増加させ、このときのハーフマキシマム効果(EC50)は、H69およびH510 SCLC細胞において、20〜22nMである。ガラニンの[Ca2+]iへの効果は細胞外Ca2+のキレート化によりブロックされないので、ガラニンは、細胞内貯蔵からCa2+を可動化する。百日咳毒素での前処理(200ng/mlで4時間)を行なった場合には、ガラニン誘起Ca2+可動化は防止されない。これに対して、タンパク質キナーゼCをホルボールエステルで直接活性化すると、ガラニンにより誘起されるCa2+応答が減衰する。ガラニンの効果は、膜ポテンシャルにおける変化と分離して考えることができる。ガラニンは、ビス(1,3−ジエチルチオバルビツレート)−トリメチンオキソノールを含んだSCLC細胞における膜のポテンシャルを増加させず、脱分極SCLC細胞、すなわち、Na+の代わりに145mMのK+を含有する溶液に懸濁した細胞においてCa2+可動化を誘起する。また、ガラニンは、時間および投与量に依存してイノシトールホスフェートの形成の増加を生じる(EC50 10nM)。イノシトールトリスホスフェート画分が急速に増加した後、イノシトールモノホスフェート画分がゆっくりと増加する。ガラニンは、半固形(アガロース含有)培地において、H69およびH510細胞の両方のクローン成長を促進する。この成長促進効果は、ガラニン濃度(EC50 20nM)にはっきりと依存しており、最近同定された広域スペクトル神経ペプチド拮抗剤である[Arg6,D−Trp7,9,Mephe8]P物質により著しく阻害される。得られた結果から、ガラニン受容体が、SCLC細胞中でイノシトールホスフェートおよび[Ca2+]i応答と結びついており、特に、この神経ペプチドが、これらのヒト癌細胞についての直接の成長因子としての役割を果たすことができることが分かる。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、癌における、増幅された遺伝子などの遺伝子の単離、特徴付け、過剰発現および影響、並びに哺乳動物、例えばヒト、における腫瘍および癌、例えば、乳癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌の診断、ワクチン、予防および治療に使用するための方法および組成物に関する。本発明は、ガラニン遺伝子、ガラニン受容体2(GALR2)遺伝子およびガラニン受容体3(GALR3)遺伝子の新規な特質を見出したことに基づくものである。また、本発明は、腫瘍形成に関与するGALR2−GALR3の機能的に重要なヘテロ複合体に関する。
【0015】
ガラニン受容体に対するリガンドであるガラニンは、増幅され且つ過剰発現されたガラニン受容体を含有する肺腫瘍において、しばしば増幅され且つ過剰発現される。このことは、ガラニン自己分泌ループは、過剰表現される肺癌における遺伝的圧力下にあり、ガラニンおよびその受容体が肺癌において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【0016】
本明細書において実証されているように、ガラニンは、ヒト肺腫瘍の70%超において増幅されるアンプリコンの中心点にあると思われる。このことは、その遺伝子が重要な生物学的機能を有しており、腫瘍形成中に、該遺伝子のDNAコピーの増加が選択されるようになっていることを示している。本明細書において実証されているように、ガラニン遺伝子は、ヒト肺癌においてもしばしば増幅および過剰発現する。したがって、本明細書に開示されているように、ガラニン遺伝子およびその発現されたタンパク質産物は、癌治療のための診断に使用することができ、癌治療のための標的として使用することもできる。また、これらを使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定および設計できる。
【0017】
GALR2は、同じヒトの肺、乳房、結腸、前立腺および卵巣の原発性腫瘍において、しばしばGALR3とともに共増幅される。このことは、GALR2とGALR3の両方が腫瘍形成中に選択され、GALR2−GALR3の機能的に重要なヘテロ複合体が存在すると思われることを意味している。GALR2およびGALR1は、GALR3と、それぞれアミノ酸の相同性が58%および36%であり、GALR2のみが、増加したGALR3遺伝子コピー数をも含む同じ肺腫瘍において増幅することが判明した。
【0018】
GALR3は、ガラニンが小細胞肺癌細胞におけるCa2+可動化、イノシトールホスフェートの蓄積およびクローンの成長を促進することから、癌に関与している。本明細書により初めて開示されるように、GALR3は、ヒトの肺腫瘍、乳腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍の50%において増幅するアンプリコンの中心点にあると思われる。このことは、その遺伝子が重要な生物学的機能を有しており、腫瘍形成中に、該遺伝子のDNAコピーの増加が選択されるようになっていることを示している。GALR3遺伝子は、ヒト肺癌においてもしばしば過剰発現する。したがって、GALR3遺伝子およびその発現されたタンパク質産物は、癌治療のための診断に使用することができ、癌治療のための標的として使用することもできる。また、これらを使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定および設計できる。
【0019】
本発明の一つの態様によれば、遺伝子治療、アンチセンス核酸および小干渉RNA(siRNA)の開発、並びに免疫診断または免疫療法の開発における、ガラニン、GALR2および/またはGALR3の使用が提供される。また、本発明には、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体と特異的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体および人工的に作り出された抗体(ヒト化抗体等)およびフラグメントの製造および使用が含まれる。また、本発明によれば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の機能または活性の一つ以上を阻害することができる、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の拮抗剤(アンタゴニスト)およびインヒビターが提供される。好適な拮抗剤として、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質を結合および妨害または中和し、また、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質または後者の機能のためのGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と天然において相互作用するタンパク質との結合について、天然型のガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と競合する、、小分子(分子量:約500未満)、大分子(分子量:約500超)、フラグメントおよび一本鎖抗体などの抗体、およびガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の転写を妨害する核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子、リボザイムおよび小干渉RNA(siRNA))を挙げることができる。ガラニン、GALR2またはGALR3の一定の突然変異体を誘起することにより、ガラニン、GALR2またはGALR3の活性を弱めるものである有用なアゴニストとしても、小分子、大分子、および「中和」抗体以外の抗体が挙げられる。
【0020】
さらに、本発明によれば、ガラニン活性、GALR2活性またはGALR3活性のインヒビターであって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体である、インヒビターが提供される。
【0021】
また、本発明によれば、ガラニン活性、GALR2活性またはGALR3活性のインヒビターであって、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質またはGALR3タンパク質を過剰発現している細胞に結合することにより、細胞の抑制または死滅を生じる抗体である、インヒビターが提供される。
【0022】
さらに、本発明によれば、転写または翻訳に影響を及ぼすことにより、ガラニン、GALR2またはGALR3の発現を減少させることができる分子が提供される。小分子(分子量:約500未満)、大分子(分子量:約500超)、並びに核酸分子、例えば、リボザイム、siRNAおよびアンチセンス分子、例えば、アンチセンスRNA、アンチセンスDNAまたはDNAデコイもしくはデコイ(おとり)分子(例えば、Morishita等、Ann.NY Acad.Sci.,947:294−301,2001;Andratschke等、Anticancer Res.,21:(5)3541−3550,2001)はいずれも、発現または増幅を阻害するのに利用できる。
【0023】
上述のように、ガラニン遺伝子配列、GALR2遺伝子配列およびGALR3遺伝子配列を、RNA干渉において用いることもできる。RNA干渉の現象については、Bass,Nature,411:428−29(2001);Elbashir等,Nature,411:494−98(2001);およびFire等、Nature,391:806−11(1998)に記載され、考察されている。これらにおいては、干渉RNAの製造方法についても考察されている。
【0024】
本発明の一つの態様によれば、哺乳動物における癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断方法であって、例えば、前癌状態または癌状態の疑いのある組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;正常な哺乳動物における前記組織または他の組織における領域から生物学的対照試料を得る工程と;生物学的試験試料と生物学的対照試料との両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のメッセンジャーRNA転写物のレベルを検出する工程とを含んでなり、生物学的検体における転写物レベルが、生物学的対照試料における転写物レベルよりも高い場合に、組織に癌が存在することが示される前記方法が提供される。他の態様によれば、生物学的対照試料は、異なる個体から得てもよいし、集団でみられるベースライン値を基準とした標準化値であってもよい。
【0025】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断方法であって、例えば、前癌状態または癌状態の疑いのある組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;生物学的検体におけるガラニンDNAコピー数、GALR2DNAコピー数またはGALR3DNAコピー数を検出することにより、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子が生物学的試験検体において増幅されているかどうかを決定する工程とを含んでなり、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の増幅が、組織に癌が存在することを示す前記方法が提供される。
【0026】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断方法であって、例えば、前癌状態または癌状態の疑いのある組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;前記試料を、抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体または抗GALR3抗体と接触させる工程と;生物学的検体におけるガラニン遺伝子発現レベル、GALR2遺伝子発現レベルまたはGALR3遺伝子発現レベルをそれぞれ検出する工程とを含んでなり、生物学的検体におけるガラニン遺伝子発現レベル、GALR2遺伝子発現レベルまたはGALR3遺伝子発現レベルが、生物学的対照試料におけるものよりも高い場合に、組織に癌が存在することが示される前記方法が提供される。他の態様によれば、生物学的対照試料は、異なる個体から得てもよいし、集団でみられるベースライン値を基準とした標準化値であってもよい。
【0027】
本発明のさらに別の態様によれば、データを比較および編集するための方法であって、該データが電子フォーマットまたは紙フォーマットに保存される前記方法が提供される。電子フォーマットは、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーなどからなる群から選択されるものであり、データは、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションによるか、または上記の保存フォーマットのいずれかを用いることにより、表示、送信または解析される。ここで、データは、試料を採取する部位、または上記のプロセスに続いてデータを輸送する位置において、比較および編集される。
【0028】
本発明のさらに別の態様によれば、肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣のような哺乳動物の器官および組織における癌の増殖を予防、制御または抑制する方法であって、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のインヒビターを、上記器官または組織に投与することにより、ガラニンタンパク質活性、GALR2タンパク質活性、GALR3タンパク質活性またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体活性を阻害することを含む前記方法が提供される。このようなインヒビターは、とりわけ、ガラニンタンパク質に対する抗体、GALR2タンパク質に対する抗体、GALR3タンパク質に対する抗体もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する抗体または上記タンパク質もしくは複合体のポリペプチド部分に対する抗体、ガラニンタンパク質に対する拮抗剤、GALR2タンパク質に対する拮抗剤、GALR3タンパク質に対する拮抗剤、GALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する拮抗剤または他の小分子に対する拮抗剤とすることができる。
【0029】
本発明のさらなる態様によれば、肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣のような哺乳動物の器官および組織における癌の増殖を予防、制御または抑制する方法であって、上記器官または組織に、ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAまたはRNAと相互作用することのできるヌクレオチド分子を投与し、これによりそれぞれガラニン遺伝子の機能、GALR2遺伝子の機能またはGALR3遺伝子の機能をブロックまたは妨害することを含んでなる前記方法が提供される。このようなヌクレオチド分子は、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子のアンチセンスヌクレオチド、ガラニンRNA、GALR2RNAまたはGALR3RNAのリボザイム、小干渉RNA(siRNA)であってもよく、またはガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子と三重らせんを形成することができるものであってもよい。
【0030】
本発明のさらなる態様によれば、患者の癌、例えば、肺癌および脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を治療するための治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のメッセンジャーRNA転写物のレベルを検出する工程とを含んでなり、前記第二試料における転写物レベルが、前記第一試料におけるものよりも低い場合に、前記処置計画が前記患者に有効であることが示される前記方法が提供される。
【0031】
本発明の別の態様によれば、臨床試験において、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を抑制する化合物の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のメッセンジャーRNA転写物のレベルを検出する工程とを含んでなり、前記第二試料における転写物レベルが、前記第一試料におけるものよりも低い場合に、前記化合物がこのような癌を抑制するのに有効であることが示される前記方法が提供される。
【0032】
本発明の別の態様によれば、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を治療するための治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数を検出することにより、前記第一試料および前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子増幅状態を調べる工程とを含んでなり、前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数が、前記第一試料におけるものよりも少ない場合には、増幅されたガラニン、GALR2および/またはGALR3を有する細胞が除去または抑制されているため、前記処置計画が有効であることが示される前記方法が提供される。
【0033】
本発明のさらに別の態様によれば、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を治療するための治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;前記試料を抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体または抗GALR3抗体と接触させる工程と;前記第一試料と前記第二試料の両方において、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子発現レベルを検出する工程とを含んでなる前記方法が提供される。前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子発現レベルが、前記第一試料におけるものよりも低い場合には、前記処置計画が前記患者に有効であることが示される。
【0034】
本発明のさらに別の態様によれば、例えば臨床試験において、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を抑制するための化合物の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数を検出することにより、前記第一試料および前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子増幅状態を調べる工程とを含んでなり、前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数が、前記第一試料におけるものよりも少ない場合には、増幅されたガラニン、GALR2および/またはGALR3を有する細胞が除去または抑制されているため、前記化合物が有効であることが示される前記方法が提供される。
【0035】
本発明の一つの態様によれば、哺乳動物における癌の診断方法であって、前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルを測定し、これにより試験レベルについてのデータを得る工程と;前記試験レベルを、対照レベルについてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照レベルに対して前記生物学的検体の試験レベルが上昇している場合に、前記哺乳動物に癌が存在することが示される前記方法が提供される。
【0036】
本発明の別の態様によれば、患者における治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、患者から得た癌細胞の第一試料におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを測定する工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記処置計画の適用の所定の時間後に得た前記患者からの癌細胞の第二試料におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを測定する工程と;前記第一試料と前記第二試料におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを比較する工程とを含んでなり、前記第二試料におけるレベルのデータが前記第一試料におけるものよりも減少している場合に、前記処置計画が前記患者に有効であることが示される前記方法が提供される。
【0037】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物組織における癌の増殖を阻害する方法であって、前記組織をGALR2−GALR3ヘテロ複合体のインヒビターと接触させる工程を含んでなり、該インヒビターが、GALR2−GALR3ヘテロ複合体に結合する抗体、またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する拮抗剤、例えば、小分子である前記方法が提供される。
【0038】
本発明のさらに別の態様によれば、医薬組成物の製造方法であって、a)GALR2−GALR3ヘテロ複合体のモジュレータである化合物を同定する工程と;b)前記化合物を合成する工程と;c)必要に応じて前記化合物を好適な添加物と混合する工程とを含んでなる前記方法が提供される。
【0039】
本発明のさらに別の態様によれば、GALR2−GALR3ヘテロ複合体またはそのフラグメントを含んでなる医薬組成物が提供され、前記フラグメントは、GALR2−GALR3ヘテロ複合体の機能的特徴を有するものである。
【0040】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により製造される医薬組成物であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0041】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の方法により製造される医薬組成物であって、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質またはGALR3タンパク質を過剰発現する細胞に結合し、これにより前記細胞を死滅させる抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0042】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン由来、GALR2由来またはGALR3由来のポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは突然変異体を含んでなり、前記ポリペプチドが、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする阻害活性を有するものである、医薬組成物が提供される。
【0043】
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物における免疫応答を誘起する方法であって、前記哺乳動物をガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと接触させる工程を含んでなり、前記免疫応答により、抗体および/またはT細胞免疫応答が生じ、これにより前記哺乳動物が卵巣癌などの癌から保護される、前記方法が提供される。
【0044】
本発明の別の態様によれば、癌の診断および/または癌治療の有効性のモニタリングに用いられる、単離されたガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子アンプリコンであって、例えば、前癌状態または癌状態にあると疑われる組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;正常な哺乳動物における前記組織または他の組織における領域から生物学的対照試料を得る工程と;生物学的試験試料と生物学的対照試料との両方において、それぞれの遺伝子アンプリコンレベルを検出する工程とを含んでなり、生物学的検体における増幅レベルが、生物学的対照試料におけるものよりも高い場合に、前記組織が前癌状態または癌状態にあることが示される、前記遺伝子アンプリコンが提供される。他の態様によれば、生物学的対照試料は、異なる個体から得てもよいし、集団でみられるベースライン値を基準とした標準化値、例えば細胞1個あたり2個の遺伝子コピー、としてもよい。
【0045】
本発明の別の態様によれば、単離されたガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子アンプリコンであって、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子と少なくとも約90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド、例えば、配列番号1に記載のもの、配列番号2に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記配列番号1のポリヌクレオチドもしくは前記配列番号2に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約90%の配列同一性を有する、腫瘍細胞中で過剰発現するポリヌクレオチドなどの、それぞれの遺伝子の完全または部分的に増幅された産生物を含んでなる、前記アンプリコンが提供される。
【0046】
本発明のさらに別の態様によれば、前癌状態または癌状態にあると疑われる領域からの生物学的検体を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質のモジュレータと接触させることにより、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を調節する方法が提供され、前記モジュレータは、例えば、小分子である。
【0047】
本発明のさらに別の態様によれば、前癌状態または癌状態にあると疑われる領域からの生物学的検体を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質のモジュレータと接触させることにより、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を調節する方法であって、前記モジュレータが、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の転写を部分的または完全に阻害するものである前記方法が提供される。
【0048】
本発明の別の態様によれば、医薬組成物の製造方法であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性などの、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性のインヒビターである化合物を同定する工程と;前記化合物を合成する工程と;必要に応じて前記化合物を好適な添加物と混合する工程とを含んでなる前記方法が提供される。
【0049】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0050】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質を過剰発現する細胞に結合し、これにより前記細胞を死滅させる抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0051】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン由来、GALR2由来、GALR3由来またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体由来のポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは突然変異体を含んでなり、前記ポリペプチドが、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする阻害活性を有するものである、医薬組成物が提供される。
【0052】
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物における免疫応答を誘起する方法であって、前記哺乳動物をガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと接触させる工程を含んでなり、前記免疫応答により、抗体および/またはT細胞免疫応答が生じ、これにより前記哺乳動物が、乳癌、結腸癌、前立腺癌および/または卵巣癌などの癌から保護される、前記方法が提供される。
【0053】
本発明の別の態様によれば、siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子が裸オリゴヌクレオチド、センス分子、アンチセンス分子、デコイDNA分子またはベクターの形態で供給され、前記siRNAがガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子またはその転写物と相互作用するものであり、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであり、前記ウイルスが、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたは他の好適なウイルスベクターである、前記方法が提供される。
【0054】
本発明のさらに別の態様によれば、デコイ分子をそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記分子が裸オリゴヌクレオチド、センス分子、アンチセンス分子、デコイDNA分子またはベクターの形態で供給され、前記分子がガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子と相互作用するものであり、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであり、前記ウイルスが、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたは他の好適なウイルスベクターである、前記方法が提供される。
【0055】
本発明のさらなる態様によれば、ガラニンデコイ、GALR2デコイ、GALR3デコイ、アンチセンス、三重らせん形成分子およびリボザイムを、いずれかの割合で、同時または連続して投与でき;上記のうちの2つだけを、いずれかの割合で同時または連続して投与でき;またはそれらを単独で投与できる(すなわち、デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスまたはリボザイムが、ガラニン、GALR2またはGALR3のうちの一つだけを標的とする)。さらに、異なる配列を有するが、所定の標的(すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3)に対して指向したデコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスまたはリボザイムを、等モル割合などのいずれかの割合で同時または連続して投与できる。したがって、本明細書における記載を参照することにより当業者には明らかであるように、2種の異なるガラニンデコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスおよび/またはリボザイム、1種のGALR2デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンス、リボザイムおよび/または3種の異なるGALR3デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスおよび/またはリボザイムをいずれかの割合、例えば、等モル割合を選択して投与できる。当然のことながら、当業者は、他の順列および割合を用いることができる。
【0056】
本発明の別の態様によれば、ガラニン−siRNAおよび/またはGALR2−siRNAおよび/またはGALR3−siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子の1種以上のものが、裸オリゴヌクレオチド、センス分子、アンチセンス分子またはベクターの形態で供給され、前記siRNA(単一または複数)がガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性と相互作用し、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであり、前記ウイルスが、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたは他の好適なウイルスベクターである、前記方法が提供される。換言すれば、ガラニン−siRNA、GALR2−siRNAおよびGALR3−siRNAを、いずれかの割合で、同時または連続して投与でき;上記のうちの2つだけを、いずれかの割合で同時または連続して投与でき;またはそれらを単独で投与できる(すなわち、siRNAは、ガラニン、GALR2またはGALR3のうちの一つだけを標的とする)。さらに、異なる配列を有するが、所定の標的(すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3)に対して指向したsiRNAを、等モル割合などのいずれかの割合で同時または連続して投与できる。したがって、本明細書における記載を参照することにより当業者には明らかであるように、2種の異なるガラニンsiRNA、1種のGALR2siRNAおよび3種の異なるGALR3siRNAを、いずれかの割合、例えば、等モル割合を選択して投与できる。当然のことながら、当業者は、他の順列および割合を用いることができる。さらに、siRNAは、デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスおよびリボザイムのうちの一種以上とともに、用いることができる。
【0057】
本発明の別の態様によれば、ガラニンsiRNAおよび/またはGALR2siRNAおよび/またはGALR3siRNAを含むベクターを投与することにより、遺伝子の生体内発現をブロックする方法であって、前記siRNAがガラニンの活性および/またはGALR2の活性および/またはGALR3の活性と相互作用するものであり、前記siRNAが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において、ガラニン遺伝子および/またはGALR2遺伝子および/またはGALR3遺伝子の転写後発現抑制を生じるものである、前記方法が提供される。
【0058】
さらに、本発明の別の態様によれば、本明細書に記載されているベクターを投与することにより、生体外で細胞を処理する方法であって、前記ベクターが、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルス、例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスである、前記方法が提供される。
【0059】
その生体内または生体外治療用途では、トランスフェクションまたは感染により細胞内に入るウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いて、siRNA/shRNA/デコイ分子を投与することが好適である。特に、本発明による治療薬としてのベクターは、不完全ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、または不完全レトロウイルスベクター、例えば、マウスレトロウイルスとすることができる。
【0060】
本発明の別の態様によれば、ガラニン拮抗活性、GALR2拮抗活性、GALR3拮抗活性またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、前記分子を癌細胞と接触させる工程と;前記細胞におけるガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルを測定することにより、試験レベルについてのデータを得る工程と;前記試験レベルを対照レベルと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記細胞中のガラニン、GALR2、GALR3および/またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルが減少している場合に、前記試験分子がガラニン拮抗活性、GALR2拮抗活性、GALR3拮抗活性および/またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性を有することが示される、前記方法が提供され、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルは、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、ノーザンハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイ分析により測定される。
【0061】
本発明の別の態様によれば、ガラニン拮抗活性、GALR2拮抗活性、GALR3拮抗活性またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、前記分子を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体と接触させる工程と;ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する前記試験分子の影響を測定する工程とを含んでなる前記方法が提供され、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベル、前記影響は、結合アッセイにより測定される。
【0062】
特に示さない限り、本明細書において種々の文法的形態で使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用できるが、以下で、好ましい方法および材料を説明する。矛盾のある場合には、定義を含む本明細書を優先とする。さらに、材料、方法および例は、説明の目的のみで挙げられており、本発明を限定するものではない。
【0063】
本発明のさらなる特徴、目的および利点は、請求の範囲および以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、説明の目的でのみ挙げられており、本発明の精神および範囲内で種々の変更および修正ができることは、当業者にはこの詳細な説明から明らかであろう。
【発明の具体的説明】
【0064】
本発明によれば、哺乳動物、例えばヒト、における腫瘍および癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断、予防および治療のための、方法および組成物が提供される。本発明は、ガラニン遺伝子、ガラニン受容体2(GALR2)遺伝子およびガラニン受容体3(GALR3)遺伝子の新規な特質を見出したことに基づくものである。したがって、ガラニン、GALR3および/またはGALR2の遺伝子並びにそれらの発現されたタンパク質産物を診断に使用することができ、治療のための標的として使用することもできる。また、これらを使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定することもできる。
【0065】
本発明では、ガラニンおよびGALR3が、ヒト肺の原発性腫瘍においてしばしば増幅および過剰発現されることが示される。また、本発明では、第二ガラニン受容体(GALR2)が、同じヒトの肺腫瘍、脳腫瘍、乳腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍においてしばしばGALR3とともに共増幅されることが示される。このことは、GALR2とGALR3の両方が腫瘍形成中に選択され、且つGALR2−GALR3の機能的に重要なヘテロ複合体が存在することを意味している。
【0066】
また、本発明では、ガラニン受容体に対するリガンドであるガラニンが、増幅され且つ過剰発現されたガラニン受容体を含有する肺腫瘍においてしばしば増幅(70%超、54/77試験試料)および過剰発現(78%、39/50試験試料)されることも示される。これらの知見は、ガラニン自己分泌ループが過剰表現される肺癌における遺伝的圧力下にあり、ガラニンおよびその受容体が肺癌において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【0067】
定義:
動物における「癌」とは、発癌細胞に典型的な特徴、例えば、無制御増殖、特殊化した機能の損失、不死、顕著な転移の可能性、抗アポトーシス活性の顕著な増加、高成長および増殖速度並びに一定の特徴的なモルホロジーおよび細胞マーカー、を有する細胞が存在することを意味する。ある状況では、癌細胞は、腫瘍の形態であり、このような細胞は、動物内に局部的に存在したり、独立した細胞、例えば、白血病細胞として血流で循環することがある。
【0068】
「癌を検出する」または「癌の診断をする」という表現は、動物が癌状態または前癌状態にあるか否かを決定することを意味する。また、「癌を検出する」とは、動物に前癌細胞または癌細胞が存在する可能性についての間接的な証拠を得たり、患者が癌にかかりやすいかどうかを評価することをも意味する。癌は、本発明による方法を単独で用いるか、他の方法と組み合わせて用いるか、動物の健康の状態についての他の情報を考慮にいれて用いることにより検出することができる。
【0069】
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるか、並びに全てが前癌状態細胞および癌状態細胞並びに前癌状態組織および癌状態組織であるか否かとは無関係に、全ての新生物細胞の成長および増殖を意味する。
【0070】
「前癌状態」という用語は、悪性疾患または癌を生じる可能性のある変化に関する特徴を有する細胞または組織を意味する。この例として、乳房組織における腺腫様成長、または、例えば、ディスプラスチックニーバス症候群、皮膚の悪性黒色腫の前兆等の状態などがある。さらなる例として、ディスプラスチックニーバス症候群、ポリポシス症候群、前立腺形成異常および他のこのような新生物の他に、異常新生物などが挙げられる。これは、前癌病変が、臨床的に同定できるか否かには無関係である。
【0071】
本明細書で使用される「異なった形で発現された遺伝子転写物」という用語は、健康な生体における同じ組織の細胞または同じ生体における同じ組織の細胞にみられる遺伝子転写物のコピー数または状態と比較して、腫瘍または癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌および卵巣癌を有する生体の異なる種類の細胞または組織において異なるコピー数でみられる、癌遺伝子等の遺伝子の転写物を意味する。遺伝子転写物の複数のコピーが、腫瘍または癌を有する生体にみられる場合があるのに対して、同じ生物における同じ組織の健康な生体または健康な細胞では同じ遺伝子転写物のコピー数が少ないか、またはこの逆であることがある。
【0072】
「異なる形で発現された遺伝子」は、標的遺伝子、フィンガープリント遺伝子または経路遺伝子であることができる。例えば、本明細書で使用される「フィンガープリント遺伝子」という用語は、発現パターンを、腫瘍および癌を評価するための予後マーカーまたは診断マーカーとして使用することができる異なる形で発現された遺伝子、または腫瘍および癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣癌の治療に有用な化合物を同定するのに使用できる異なる形で発現された遺伝子を意味する。例えば、腫瘍および癌と関連して通常示されるフィンガープリント遺伝子発現パターンに対する化合物の影響を利用して、腫瘍治療剤および癌治療剤としての化合物の効力を評価したり、または腫瘍および癌の治療のための臨床評価を受けている患者のモニタリングをおこなうことができる。
【0073】
本明細書で使用される「フィンガープリントパターン」という用語は、一連(2〜一定の状態で存在する全てのフィンガープリント遺伝子の範囲であることができる)のフィンガープリント遺伝子の発現パターンを測定するときに生成されるパターンを意味する。フィンガープリントパターンは、「発現プロフィール」と称されることもある。フィンガープリントパターンまたは発現プロフィールは、単一のフィンガープリント遺伝子の発現と同じ診断、予後および化合物同定法に使用することができる。
【0074】
本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、遺伝子発現レベルまたは遺伝子産物活性レベルをモジュレーションすることにより、腫瘍および癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣癌、の症状を予防および/または改善する、異なる形で発現された遺伝子を意味する。したがって、標的遺伝子の発現、標的遺伝子、または標的遺伝子産物の活性をモジュレーションする化合物を、腫瘍および癌の診断、治療または予防に使用できる。本発明の特定の標的遺伝子は、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子である。
【0075】
一般的に、「遺伝子」は、調節機能、触媒機能を有し、および/またはタンパク質をコードしているRNAに転写されることができるゲノム上の領域である。真核遺伝子は、別のバージョンの成熟タンパク質をコードする異なるRNAスプライス変異体を産生するように組織化することがある、イントロンとエクソンを典型的に有する。当業者には、本発明に、別のプロモーター部位または別のポリアデニル化部位のために生じる、スプライス変異体、対立遺伝子変異体および転写物を含む、観察される全てのガラニンコード転写物、GALR2コード転写物およびGALR3コード転写物が含まれることは明らかであろう。「全長」遺伝子またはそのRNAには、天然のスプライス変異体、対立遺伝子変異体、他の別の転写物や、天然の変異体および得られるRNA分子と同じ機能を有する、組み換え技術により生成したスプライス変異体が含まれる。癌遺伝子を含む遺伝子の「フラグメント」は、機能ドメイン、例えば、触媒ドメイン、DNA結合ドメイン等を表すか、表さない遺伝子からのいずれかの部分であることができる。フラグメントは、好ましくは連続する少なくとも25個のアミノ酸、好ましくは連続する少なくとも約30個、40個、50個、60個、65個、70個、75個もしくはそれ以上、またはそれらの周囲またはそれらの間の整数のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0076】
本明細書で使用される「経路遺伝子」という用語は、腫瘍および癌に関与する他の遺伝子産物と相互作用する、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子である。また、経路遺伝子は、標的遺伝子および/またはフィンガープリント遺伝子特性を示すものでもよい。
【0077】
本明細書で使用される「検出可能な」RNA発現レベルとは、当技術分野において現在公知の標準的手法または将来のある時点で標準となる手法により検出されることのできるレベルを意味する。これらの手法には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ、RT(逆転写酵素)結合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ノーザンブロットおよび/またはRNA分解酵素保護分析などがある。必要とする発現レベルにおける差の程度は、標準的特徴付け法により可視化または測定できる程度であればよい。
【0078】
本明細書で使用される「形質転換細胞」という用語は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子を、細胞(またはその原種)に、例えば、組み換えDNA法またはウイルスにより導入したものを意味する。
【0079】
本発明による核酸分子、例えば、ガラニン遺伝子またはそのサブ配列を、インサートの発現を容易にする、以下で説明するベクターに挿入することができる。核酸分子、およびそれらがコードするポリペプチドを、診断剤もしくは治療剤として直接使用してもよいし、または治療剤もしくは診断剤として臨床的に有用である抗体を生成するのに使用できる(ポリペプチドの場合は直接、または核酸分子の場合には間接的に)。従って、本発明による核酸を含有するベクター、これらのベクターでトランスフェクションされた細胞、発現されたポリペプチド、およびポリペプチド全体またはその抗原フラグメントに対して生成された抗体は、本発明の態様に含まれる。
【0080】
「構造遺伝子」とは、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、次に特異的ポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される、DNA配列である。
【0081】
「単離されたDNA分子」とは、生体の染色体またはゲノムDNAから分離されたDNAのフラグメントである。また、単離は、オリジナルソースまたはその周囲からのある程度の分離の意味も含むものと定義される。例えば、アビジン遺伝子をコードするクローンDNA分子は、単離DNA分子である。単離DNA分子の別の例として、生体のゲノムDNAに組み込まれていない、化学合成DNA分子または酵素的に産生したcDNAが挙げられる。単離したDNA分子は、当技術分野において公知の方法で処理して汚染物を除去することにより、DNA分子が精製されてより均一な状態になったとみなされるようにすることができる。
【0082】
しばしば「コピーDNA」と称される「相補的DNA」(cDNA)は、逆転写酵素によりmRNAテンプレートから形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの部分に相補的なプライマーを用いて、逆転写を開始する。また、当業者は、「cDNA」という用語を、このような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖を含む二本鎖DNA分子を指すのにも使用する。
【0083】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAの一つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【0084】
「増幅」という用語は、生体内または生体外での核酸または遺伝子を増幅、重複、増殖または多発現により、約2.5倍以上のコピーを生じることを意味する。例えば、2.5以上のコピー数を生じるガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の増幅は、増幅されたとみなされる。しかしながら、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子コピー数の増加が、2.5倍未満であっても、遺伝子の増幅として考えることができる。2.5倍という数字は、生物学的状態というよりは現在の検出限界によるものである。
【0085】
「アンプリコン」という用語は、前癌状態または癌状態の細胞または組織から単離することができる、一つ以上の遺伝子を含有する増幅産物を意味する。ガラニンアンプリコン、GALR2アンプリコンまたはGALR3アンプリコンは、生体内または生体外での核酸または遺伝子の増幅、重複、増殖または多発現の結果得られるものである。また、ここで定義される「アンプリコン」には、完全または部分的に増幅されたガラニン遺伝子および/またはGALR2遺伝子および/またはGALR3遺伝子も含まれる。例えば、アンプリコンは、配列番号1またはその識別できるフラグメントに対して配列が少なくとも約90%同一であるポリヌクレオチドを含んでなる。
【0086】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自己複製能を有する、核酸分子、例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージである。クローニングベクターは、典型的には(i)外来DNA配列を、ベクターの実質的な生物学的機能を損なうことなく、測定可能な方法で挿入することができる、一つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および(ii)クローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択に使用するのに好適であるマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子には、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を付与する遺伝子などがある。
【0087】
「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の遺伝子の転写を可能にする一連の特定核酸要素を有する組み換え的または合成的に生成する核酸構築物である。典型的には、遺伝子発現を、構成または誘導プロモーター、組織に好ましい調節要素およびエンハンサーを含む、一定の調節要素の制御下に配置する。
【0088】
「組み換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含むいずれかの原核細胞または真核細胞でよい。また、この用語には、宿主細胞の染色体またはゲノムにおけるクローン遺伝子(単一または複数)を含むように遺伝子的に設計された、原核細胞または真核細胞を含む。
【0089】
「アンチセンスRNA」:真核生物において、RNAポリメラーゼは、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生する。DNA分子を、RNA転写物が好ましいmRNAの配列に相補的である配列を有するRNAポリメラーゼテンプレートを含むように設計することができる。RNA転写物は、「アンチセンスRNA」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA発現を阻害することができる(例えば、Rylova等、Cancer Res,62(3):801−8,2002;Shim等、Int.J.Cancer,94(1):6−15,2001)。
【0090】
「アンチセンスDNAまたはDNAデコイまたはデコイ分子」:第一核酸分子に関して、相補的配列であるか、第一分子の相補配列またはその一部に相同である配列で生成される第二DNA分子または第二キメラ核酸分子は、第一分子の「アンチセンスDNAまたはDNAデコイまたはデコイ分子」と称される。また、「デコイ分子」という用語には、DNAまたはPNA(ペプチド核酸)(Mischiati等、Int.J.Mol.Med.,9(6):633−9,2002)を含んでなり、且つタンパク質結合部位、好ましくは調節タンパク質の結合部位、より好ましくは転写因子の結合部位の配列を含む、一本鎖または二本鎖であることができる、核酸分子なども含まれる。アンチセンスDNA分子およびデコイDNA分子を含むアンチセンス核酸分子の用途は、当技術分野において公知であり、例えば、Morishita等、Ann.N Y Acad.Sci.,947:294−301,2001;Andratschke等、Anticancer Res,21:(5)3541−3550,2001に記載されている。アンチセンスDNAまたはPNA分子は、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の機能および/または発現を、阻害、ブロックまたは調節することができる。
【0091】
「動作可能に連結された」という用語は、調節要素と遺伝子またはそのコード領域との間の接続を説明するのに使用される。すなわち、遺伝子発現は、典型的に構成または誘導プロモーター、組織特異的調節要素およびエンハンサーを含む、一定の調節要素の制御下に置かれる。このような遺伝子領域またはコード領域は、調節要素「に動作可能に連結された」または「に動作可能となるように連結された」と言われ、遺伝子またはコード領域が調節要素により制御されるか、影響されることを意味する。
【0092】
「配列の相同性」は、2つ以上の核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドの間の配列関係を説明するのに使用され、(a)基準配列、(b)比較ウィンドウ、(c)配列の同一性、(d)配列の同一性の割合(%)、(e)実質的同一性または「相同性」などの用語との関連において理解される。
【0093】
(a)「基準配列」は、配列の比較の基礎として使用される定義された配列である。基準配列は、特定配列の一部または全体、例えば、全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメント、または完全cDNAまたは遺伝子配列であることができる。ポリペプチドについて、基準ポリペプチド配列の長さは、一般的に少なくとも約16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約25個のアミノ酸、最も好ましくは約35個のアミノ酸、約50個のアミノ酸または約100個のアミノ酸である。核酸については、基準核酸配列の長さは、一般的に少なくとも約50個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75個のヌクレオチド、最も好ましくは約100個のヌクレオチドもしくは約300個のヌクレオチドまたはそれらの付近またはそれらの間の整数のヌクレオチドである。
【0094】
(b)「比較ウィンドウ」には、ポリヌクレオチド配列を基準配列と比較でき、且つ比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、2つの配列の最適整列についての基準配列(付加、置換または欠失を含まない)と比較して付加、置換または欠失(すなわち、ギャップ)を含む、ポリヌクレオチド配列の連続および特定セグメントを参照することが含まれる。一般的に、比較ウィンドウは、長さが少なくとも20個の連続ヌクレオチドであり、必要に応じて30個、40個、50個、100個またはそれ以上であることができる。当業者には、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれていることによる基準配列に対して誤解を招くような高い類似性がでるのを回避するために、ギャップペナルティーが典型的に導入され、且つマッチ数から差し引くことは、分かるであろう。
【0095】
比較のための配列の整列法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、ローカル相同性アルゴリズム(SmithおよびWaterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981));相同性整列アルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970));類似性法についてのサーチ(PearsonおよびLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:2444(1988));PC/GeneプログラムのCLUSTAL(カリフォルニア州Mountain ViewにあるIntelligenetics社)およびGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA(米国ウィスコンシン州Madison、Science Dr.7にあるGenetics Computer Group(GCG))のWisconsin Genetics Software Packageを含むがこれらには限定されない、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(CLUSTALプログラムは、HigginsおよびSharp、Gene,73:237−244,1988;Corpet等、Nucleic Acids Research,16:881−90,1988;Huang等、Computer Applications in the Biosciences,8:1−6,1992;およびPearson等、Methods in Molecular Biology,24:7−331,1994により十分に記載されている)によりおこなうことができる。データベース類似性サーチに使用することができるプログラムのBLASTに属するものには、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのBLASTN;タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのBLASTX;タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのBLASTP;ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのTBLASTN;およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのTBLASTXなどがある。Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学における現在のプロトコール)、第19章、Ausubel等編、Greene Publishing and Wiley−Interscience社、New York,1995参照。上記プログラムの新しいバージョンまたは新しいプログラムは全て、将来入手可能となることは疑いなく、本発明に使用できる。
【0096】
特に示さない限り、ここで記載の配列同一性/類似性値は、デフォルトパラメータを用いて、プログラムのBLAST2.0パッケージソフトまたはそれらの後継ソフトを用いて得た値を意味する(Altschul等、Nucleic Acids Res,2:3389−3402,1997)。これらのパラメータのデフォルト設定値は、将来必要に応じて容易に変更できる。
【0097】
当業者には、BLASTサーチは、タンパク質をランダム配列としてモデル化できることが理解できるであろう。しかしながら、実在する数多くのタンパク質は、一つ以上のアミノ酸に濃化したホモポリマートラクト、短期リピートまたは領域であることができる非ランダム配列の領域を含んでなる。このような低複雑領域は、たとえタンパク質の他の領域が全く異なるとしても、無関係なタンパク質の間に整列できる。多数の低複雑性フィルタープログラムを用いて、このような低複雑整列を減少させることができる。例えば、SEG(WootenおよびFederhen,Comput.Chem.,17:149−163,1993)およびXNU(ClaverieおよびStates,Comput.Chem.,17:191−1,1993)低複雑フィルターは、単独または組み合わせて用いることができる。
【0098】
(c)2つの核酸配列またはポリペプチド配列における「配列の同一性」または「同一性」は、特定比較ウィンドウで最大の一致について整列したときに同一である2つの配列における残基を参照することを含み、付加、欠失および置換を考慮することができる。配列の同一性の割合(%)をタンパク質に関連して使用するとき、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によりしばしば異なり、アミノ酸残基が、同様の化学的性質(例えば、電荷または疎水性)を有する他のアミノ酸残基の代わりに置き換わり、したがって、分子の機能性を変化させないことが分かる。配列が、保存的置換で異なる場合、配列の同一性(%)を、上方向に調整して、置換の保存性について修正できる。このような保存的置換により異なる配列は、配列の類似性を有すると言われる。この調整をする方法は、当業者には周知である。典型的には、これには、全ミスマッチではなく一部分としての保存的置換のスコアリングをすることにより、配列の同一性(%)を増加させることを含む。すなわち、例えば、同一のアミノ酸にスコア1、非保存的置換にスコアゼロを付与する場合には、保存的置換には、0と1との間のスコアが付与される。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムPC/GENE(米国カリフォルニア州Mountain ViewにあるIntelligenetics社製)において実行されるような、例えば、MeyersおよびMiller,Computer Applic.Biol.Sci.,4:11−17,1988のアルゴリズムにしたがって算出される。
【0099】
(d)「配列の同一性の割合(%)」は、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、2つの配列の最適な整列についての基準配列(付加、置換または欠失を含まない)と比較して、付加、置換または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでいてよい、比較ウィンドウについて2つの最適に整列された配列を比較することにより求められた値を意味する。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に生じる位置の数を求めて整合位置の数を得ること、整合位置数を比較のウィンドウの位置の総数で割り、そして得られた結果に100をかけて配列の同一性の割合(%)を得ることにより、算出される。
【0100】
(e)(i)それらの種々の文法的な形態における「実質的同一性」または「相同性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的パラメータを用いて記載されている整列プログラムの一つを用いて基準配列と比較したときに、所望の同一性、例えば、少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも70%の配列の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する配列を含んでなることを意味する。当業者には、これらの値は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレーム位置等を考慮することにより、2つのヌクレオチド配列によりコードされた対応するタンパク質の同一性を求めるために適切に調整できることは分かるであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、80%、90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を意味する。
【0101】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の目安は、2つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションするか否かにある。しかしながら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションしない核酸であっても、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、依然として実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーを、遺伝子コードにより許される最大のコドン縮重を用いて作製するときに生じることがある。2つの核酸配列が実質的に同一であることの一つの目安は、第一核酸がコードするポリペプチドが、第二核酸によりコードされているポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。ただし、このような交差反応性は、2つのポリペプチドが実質的に同一であると思われる場合には、必要としない。
【0102】
(e)(ii)ペプチドに関連して種々の文法的形態で使用される「実質的な同一性」または「相同性」という用語は、ペプチドが、特定の比較ウィンドウについて、所望の同一性、例えば、基準配列に対して少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも70%の配列の同一性、基準配列に対してさらに好ましくは80%の配列の同一性、さらに好ましくは85%の配列の同一性、最も好ましくは少なくとも90%または95%の配列の同一性を有する配列を含んでなることを示す。好ましくは、最適な整列は、NeedlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970の相同性整列アルゴリズムを用いておこなわれる。2つのペプチド配列が実質的に同一であることの目安は、一つのペプチドが第二ペプチドに対する抗体と免疫学的に反応性があることである。ただし、このような交差反応性は、2つのポリペプチドが実質的に同一であると思われるときには必要としない。したがって、例えば、2つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合、ペプチドは、第二ペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似している」ペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化により異なることがあることを除いて、上記したように、配列を共有している。保存的置換は、典型的には以下の基内の置換を含むが、これらには限定されない:グリシンおよびアラニン;バリン、イソロイシンおよびロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン;セリンおよびトレオニン;リジンおよびアルギニン;並びにフェニルアラニンおよびチロシン、並びに当業者に公知のもの。
【0103】
「ガラニン」という用語は、ガラニン核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号A28025、ヒトプレプロガラニンcDNA配列である配列番号1[UnigeneクラスターID(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/):Hs.1907,Human Galanin.]のヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするアミノ酸配列GenBank寄託番号CAA01907、ヒトプレプロガラニンアミノ酸配列である配列番号2と実質的な配列の相同性;または(iii)コードしているアミノ酸配列GenBank寄託番号AAB20740、ヒトガラニンペプチド配列である配列番号3と実質的な配列の相同性を有する)を意味する。
【0104】
ガラニンポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。「ガラニンポリヌクレオチド」および「ガラニンポリペプチド」は、天然、組み換えまたは合成(例えば、化学合成により得た)物であることができる。
【0105】
「GALR2」という用語は、GALR2核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003857、ヒトガラニン受容体2(GALR2)のヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするアミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号043603。UnigeneクラスターGALR2はHs.158351である]と実質的な配列の相同性を有する)を意味する。
【0106】
GALR2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。「GALR2ポリヌクレオチド」および「GALR2ポリペプチド」は、天然、組み換えまたは合成(例えば、化学合成により得た)物であることができる。
【0107】
「GALR3」という用語は、GALR3核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003614、ヒトガラニン受容体3(GALR3)のヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするアミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号060755。UnigeneクラスターGALR3はHs.158353であり、寄託番号BF116239およびBF512731の2ESTを含む]と実質的な配列の相同性を有する)を意味する。
【0108】
GALR3ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。「GALR3ポリヌクレオチド」および「GALR3ポリペプチド」は、天然、組み換えまたは合成(例えば、化学合成により得た)物であることができる。
【0109】
「GALR2−GALR3ヘテロ複合体」という用語は、GALR2およびGALR3タンパク質もしくはポリペプチド、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003614、ヒトガラニン受容体3(GALR3)のGALR3ヌクレオチド配列またはGenBank寄託番号NM_003857、ヒトガラニン受容体2(GALR2)のGALR2ヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするGALR3アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号060755。UnigeneクラスターGALR3はHs.158353であり、寄託番号BF116239およびBF512731の2ESTを含む]またはGALR2アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号043603。UnigeneクラスターGALR2はHs.158351である]と実質的な配列の相同性を有する)の複合体、混合物または組み合わせを意味する。また、「GALR2−GALR3ヘテロ複合体」は、個々または転写もしくは翻訳融合としてタンパク質またはポリペプチド、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003614、ヒトガラニン受容体3(GALR3)のGALR3ヌクレオチド配列またはGenBank寄託番号NM_003857、ヒトガラニン受容体2(GALR2)のGALR2ヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするGALR3アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号060755。UnigeneクラスターGALR3はHs.158353であり、寄託番号BF116239およびBF512731の2ESTを含む]またはGALR2アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号043603。UnigeneクラスターGALR2はHs.158351である]と実質的な配列の相同性を有する)を発現する、構築物または発現ベクターにおける、GALR2核酸とGALR3核酸(DNAもしくはRNAまたはそれらのフラグメント)の混合物または組み合わせから得ることもできる。
【0110】
GALR2−GALR3ヘテロ複合体は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。
【0111】
本明細書で使用される「生物学的検体」という用語は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体の核酸またはポリペプチドを含有しているか、または含有している疑いのある、生体内またはインサイチュで得られたり、到達したり、または採取された標的生物学的目標物を意味する。生物学的検体は、典型的には真核性のもの、例えば、昆虫類、原性動物、鳥類、魚類、は虫類、好ましくは哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギ、最も好ましくは霊長類、例えば、チンパンジーまたはヒト、例えば、診断検査、治療および/または治療のモニタリングを必要とする患者からのものである。
【0112】
本明細書で使用される「生物学的試料」という用語は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体の核酸またはポリペプチドを含有しているか、または含有している疑いのある、生体内またはインサイチュで得られたり、到達したり、または採取された生物学的組織または流体オリジンの試料を含む、生物学的検体から得られる試料を意味する。このような試料には、患者等のヒト、マウスおよびラットなどの哺乳動物から単離した器官、組織、画分および細胞などがあるが、これらには限定されない。また、生物学的試料には、組織、例えば、組織学的研究の目的のために採取された凍結切片などの、生物学的試料の切片も含まれる。生物学的試料は、典型的には真核生物起源のもの、例えば、昆虫類、原性動物、鳥類、魚類、は虫類、好ましくは哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギ、最も好ましくは霊長類、例えば、チンパンジーまたはヒトからのものである。
【0113】
「生物学的検体または試料を得る」とは、本発明に記載の方法に使用するための組織または細胞試料を含む、生体内またはインサイチュでの生物学的検体を得ることを意味する。これは、動物から細胞の試料を取り除くことによりおこなうことが最も多いが、生体内もしくはインサイチュまたは以前に単離した細胞(例えば、別の人から、別の時間で、および/または別の目的で単離したもの)を用いることによっておこなうこともできる。
【0114】
「対照試料」は、健康で癌のない動物を代表する生物学的材料の試料を意味する。対照試料におけるガラニン、GALR2、GALR3もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルまたはコードする対応遺伝子コピー数は、同じ種の正常で癌のない動物の一般的な集団の代表であることが望ましい。この試料は、本発明に記載の方法で使用される目的のための動物から採取することもできるし、あるいは、他の理由により採取されたものであるが、本発明による方法に使用するのに好適である、正常で癌のない動物を代表する生物学的材料であることもできる。また、対照試料は、癌を有するか、癌を有する疑いのある動物の正常組織から得ることもできる。また、対照試料は、正常で癌のない動物からの測定に基づいて以前に確立された、癌のない集団を代表する一定レベルのガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を意味することもできる。また、生物学的対照試料は、異なる個体から得られる試料を意味してもよいし、または集団から得られたベースラインデータに基づいた標準化値であることもできる。さらに、対照試料を、特定の年齢、性別、民族性または他の人口統計学的パラメータによって定義することもできる。ある状況では、対照は、特定の測定においては潜在的である。潜在的な対照の一例として、正常で癌のない動物の代表的なレベルよりも高いレベルが存在するときにのみ、検出法により、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体または対応の遺伝子コピー数が検出可能である場合が挙げられる。遺伝子の典型的な対照レベルは、細胞1個あたりのコピー数が2である。別の例は、アッセイの対照レベルが既知である場合の免疫組織化学的アッセイに関連するものである。このような対照の他の例は、当業者の知識の範囲内である。
【0115】
「データ」は、診断、予防、モニタリングまたは治療用の試験レベルを生成するのに適用される、上記したような「生物学的試料」または「対照試料」に関して得られる情報を含むが、これらには限定されない。本発明は、電子フォーマットまたは紙フォーマットに保存されているデータを比較および編集するための方法に関する。電子フォーマットは、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーなどからなる群から選択されることができ、データは、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションによるか、または上記の保存フォーマットのいずれかを用いることにより、表示、送信または解析される。ここで、データは、試料を採取する部位、または上記したプロセスに続いてデータを輸送する位置で、比較および編集される。
【0116】
ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子の「過剰発現」、またはガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリヌクレオチドもしくはタンパク質またはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体の「増加した」または「上昇した」レベルは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の対照レベルと比較してそれぞれ高く検出される、ガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体のレベルを意味する。発現の数値測定値について統計的解析により比較してもよいし、または適任の研究者により実験結果を目視により調査することにより比較してもよい。
【0117】
対照試料において「予測される」ガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルは、典型的な癌のない試料を表すレベルであり、且つそこからガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはGALR2−GALR3ヘテロ複合体が上昇または診断レベルで存在することが識別できるレベルを意味する。好ましくは、「予測」レベルは、その哺乳動物の年齢、性別、病歴等の因子だけでなく、試験される特定の生物学的検体について制御される。
【0118】
ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性をモジュレーションする化合物を試験するためのアッセイ(単一または複数)と関連して用いられる「機能的効果」という表現には、間接的または直接的にガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の影響下にあるいずれかのパラメータ、例えば、機能的、物理的または化学的効果、例えば、プロテアーゼ活性、癌細胞において遺伝子増幅または過剰発現を誘発する能力、および癌細胞増殖を悪化させる能力の測定が含まれる。「機能的効果」には、試験管内活性、生体内活性および生体外活性などが含まれる。
【0119】
「機能性効果を測定する」は、間接的または直接的にガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の影響下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的および化学的効果を増加または減少させる化合物についてアッセイすることを意味する。このような機能的効果は、当業者に公知のいずれかの手段、例えば、タンパク質についての分光特性(例えば、蛍光、吸光度、屈折率)、流体力学的性質(例えば、形状)、クロマトグラフィー特性または溶解度特性の変化、ガラニン、GALR2またはGALR3の誘導可能なマーカーまたは転写活性化の測定;結合活性の測定、または結合アッセイ、例えば、基質結合のアッセイおよび細胞増殖の測定;シグナル伝達の測定;細胞形質転換の測定等により、測定できる。
【0120】
「インヒビター」、「活性化剤」、「モジュレータ」および「調節因子」は、同定された機能を活性化、阻害、モジュレーション、調節および/またはブロックする分子を意味する。例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性について、このような分子は、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の試験管内アッセイおよび生体内アッセイを用いて確認できる。インヒビターは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を部分的または完全にブロックしたり、その活性化を減少、防止または遅延させたり、その細胞応答感度を減少させる化合物である。これは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質に、直接または受容体等の他の中間分子を介して結合することによりなされうる。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性の阻害を含む、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性をブロックする拮抗剤または抗体は、このようなインヒビターであると考えられる。活性化剤は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質に、直接またはそれらの受容体等の他の中間分子を介して結合することにより、その活性を増加させたり、高めたり、その活性化を促進したり、加速したり、またはその細胞応答を増感させたりする化合物である。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のアゴニストは、このような活性化剤であると考えられる。モジュレータは、インヒビターまたは活性化剤であることができる。モジュレータは、ガラニン、GALR2、GALR3もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体またはそれらの受容体を直接結合しても、しなくてもよい。モジュレータは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性または活性化、またはガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する細胞感度に影響を及ぼしたり、変更したりする。また、モジュレータは、ガラニン、GALR2またはGALR3のmRNAの転写を阻害する小分子等の化合物であってもよい。ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の調節因子には、ガラニン、GALR2もしくはGALR3の遺伝子またはそのコード領域の転写/発現に影響を及ぼすおよび/またはそれを制御するいずれかの要素、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド核酸等がある。
【0121】
また、本発明によるインヒビター、活性化剤、モジュレータおよび調節因子の群には、遺伝学的に修飾された種類のガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、例えば、活性を変更した種類も含まれる。したがって、この群には、天然のタンパク質だけでなく、合成リガンド、拮抗剤、アゴニスト、抗体、小化学分子等が含まれる。
【0122】
「インヒビター、活性化剤またはモジュレータのアッセイ」は、例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を試験管内、細胞において発現させ、推定インヒビター化合物、活性化化合物、モジュレータ化合物または調節因子化合物を適用した後、上述のようにしてガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性または転写に対する機能的効果を測定することを含む、実験手順を意味する。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を含有するか、含有する疑いのある試料を、可能性のある活性化剤、インヒビターまたはモジュレータで処理する。活性化、阻害または変化の程度は、意図する試料についての活性の測定値を対照試料と比較することにより調べられる。しきい値レベルを設定して、活性化または阻害を評価する。例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドの阻害は、対照に対するガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性値が80%以下であるときに得られると考えられる。同様に、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドの活性化は、対照に対するガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性値が2倍以上高いときに得られると考えられる。
【0123】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態でみられるときに通常ともなう成分が、その状態とは異なる程度まで少なくなっている物質を意味する。「単離する」とは、最初のソースまたは環境からのある程度までの分離を意味する。「精製する」とは、単離以上の高い程度にまで浄化することを意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の物質が十分に不存在の状態であり、いずれの不純物も、タンパク質の生物学的性質に顕著に影響したり、不都合な結果を生じないような状態を意味する。すなわち、本発明による核酸またはペプチドは、細胞物質、ウイルス物質、または組み換えDNA法により産生したときには培地、または化学的前駆体もしくは化学的に合成したときには他の化学物質を実質的に含まないときには、精製されている。純度および均質性は、典型的には分析化学的方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて測定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に一つのバンドを生じることを示すことがある。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に附することができるタンパク質については、異なる修飾は、異なる分離タンパク質を生じることがあり、これらは、別個に精製できる。種々のレベルの純度は、本明細書に記載の種々の方法において本発明により必要に応じて適用できる。標準が特記されていない場合には、当技術分野において公知である通常の純度標準を使用できる。
【0124】
「単離された核酸分子」とは、状況に応じて、生体の天然ゲノムにおいて連続する遺伝子または遺伝子フラグメントの5’および3’コード配列から分離される核酸分子を意味することがある。また、「単離された核酸分子」という用語には、天然でない核酸分子、例えば、組み換えDNA法により生成した核酸分子も含まれる。
【0125】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびその一本鎖または二本鎖の形態のポリマーを意味する。この用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、且つ基準ヌクレオチドと同様な方法で代謝される、合成、天然および非天然である、公知のヌクレオチド類似体または修正主鎖残基もしくは結合を含む核酸を含む。このような類似体としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2−o−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド核酸(PNA)などがあるが、これらには限定されない。
【0126】
特に示さない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、はっきりと明示された配列だけでなく、その保存的に修正した変異体(例えば、縮重コドンの置換)および相補的配列をも含む。具体的には、縮重コドンの置換は、一つ以上の選択された(または全ての)コドンの第三の位置が好適な混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置き換わった配列を生成することによりなされる(Batzer等、Nucleic Acid Res,19:081,1991;Ohtsuka等、J.Biol.Chem.,260:2600−2608,1985;Rossolini等、Mol.Cell Probes,8:91−98,1994)。「核酸」という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと同じ意味で使用できる。
【0127】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、且つ発現ベクターの複製または発現を支持する天然細胞または形質転換細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、生体内細胞等であることができる。宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌(E.coli)または真核細胞、例えば、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物細胞、例えば、CHO、HeLa等であってよい。
【0128】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸だけでなく、天然アミノ酸と同様な方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体をも意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているものだけでなく、後で修正されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびo−ホスホセリン、ホスホトレオニンでもよい。「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素に結合している炭素、カルボキシル基、アミノ基およびR基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を意味する。このような類似体は、修正R基(例えば、ノルロイシン)または修正ペプチド主鎖を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模擬体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然のアミノ酸と類似の方法で機能する構造を有する化学的化合物を意味する。アミノ酸および類似体は、当技術分野において周知である。
【0129】
アミノ酸は、それらの公知の3つの文字記号、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されている一文字記号により表すことができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードにより表されることができる。
【0130】
「保存的に修飾した変異体」は、アミノ酸と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列について、保存的に修正された変異体は、同一または類似のアミノ酸配列をコードし、且つ縮重配列を含む、核酸を意味する。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUの全ては、アラニンをコードしている。したがって、アラニンが特定されている全てのアミノ酸の位置で、これらのコドンのいずれかが同じ意味で使用されて対応のヌクレオチド配列を構築することができる。得られる核酸変異体は、これらが同じタンパク質をコードするので、保存的に修正された変異体である(配列の改変のみであることを前提として)。当業者には、AUG(メチオニンについての唯一のコドン)およびUGG(トリプトファン)を除いて、核酸における各コドンを、保存的に修正して機能的に同一のペプチドまたはタンパク質分子を得ることができることが分かるであろう。
【0131】
アミノ酸配列に関して、当業者には、単一のアミノ酸または少数(典型的には約10より少ない)のアミノ酸を変更、付加または欠失する、ポリペプチドもしくはタンパク質配列に対する置換、欠失、または付加は、その改変により、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置き換えられる場合に「保存的に修正された変異体」であることは明らかであろう。保存的置換(同類置換)は、当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへの変更;アルギニンからリジンへの変更;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変更;アスパルテートからグルタメートへの変更;システインからセリンへの変更;グルタミンからアスパラギンへの変更;グルタメートからアスパルテートへの変更;グリシンからプロリンへの変更;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変更;イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変更;ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変更;リジンからアルギニン、グルタミンまたはグルタメートへの変更;メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変更;フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変更;セリンからトレオニンへの変更;トレオニンからセリンへの変更;トリプトファンからチロシンへの変更;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変更;バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更などがある。他の保存的および半保存的置換は当技術分野において周知であり、本発明の実施に用いることができる。
【0132】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、長さまたは翻訳後修正(例えば、グリコシル化またはリン酸化)とは無関係に、アミノ酸の鎖を説明するのに使用される。したがって、これらの用語は、本明細書において交換可能に使用してアミノ酸残基のポリマーを表すことができる。また、これらの用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応の天然アミノ酸の人工の化学的模擬体である、アミノ酸ポリマーに適用される。したがって、「ポリペプチド」という用語には、全長天然タンパク質だけでなく、全長天然タンパク質または天然タンパク質の特定のドメインもしくは一部分に相当する組み換えまたは合成により生成したポリペプチドが含まれる。この用語は、アミノ末端メチオニンを付加して原核細胞における発現を容易にする、成熟タンパク質も含む。
【0133】
本発明によるポリペプチドは、化学的な合成または組み換えDNA法により合成できる。また、本発明によるポリペプチドは、これらが精製の標準的な生化学的方法により自然に発現される組織から精製できる。
【0134】
また、本発明には、本発明によるタンパク質またはポリペプチドの生物学的機能または活性の一つ以上を有する「機能性ポリペプチド」も含まれる。これらの機能または活性には、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質に通常結合するタンパク質の一部または全てを結合する能力が含まれる。
【0135】
機能性ポリペプチドは、本明細書に記載のガラニン、GALR2またはGALR3の標準配列であると考えられるものから修正された一次アミノ酸配列を含むことがある。好ましくは、これらの修正は、本明細書に記載の保存的なアミノ酸置換である。
【0136】
「標識」または「検出可能な部分」は、意図する核酸またはタンパク質分子と連結したときに、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的または化学的手段により検出できるようになる組成物である。例えば、有用な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般的に使用されているもの)、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンなどがある。「標識核酸またはオリゴヌクレオチドプローブ」は、リンカーもしくは化学結合により共有的にか、またはイオン結合、ファンデルワールス力、静電気引力、疎水性相互作用、または水素結合により非共有的に、核酸またはプローブの存在が、核酸またはプローブに結合した標識の存在を検出することにより、標識に結合されるものである。
【0137】
本明細書で使用される「核酸またはオリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、一種以上の化学結合、通常は相補塩基対形成、通常は水素結合形成により、相補配列の標的核酸に結合できる核酸として定義される。本明細書で使用される「プローブ」という用語には、天然(すなわち、A、G、CまたはT)または修正塩基(7−デアザグアノシン、イノシン等)が含まれる。さらに、プローブにおける塩基は、ハイブリダイゼーションを阻害しない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合により接合できる。当業者には、プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じてプローブ配列との完全相補性を欠く標的配列を結合できることが分かるであろう。プローブは、好ましくは同位体、例えば、発色団、発光団、色原体で直接的に、またはストレプトアビジン複合体が後で結合できるビオチンで間接的に標識される。プローブの有無についてアッセイすることにより、意図する標的遺伝子の有無を検出できる。
【0138】
「に選択的に(または特異的に)ハイブリダイゼーションする」という表現は、配列が複合体混合物(例えば、総細胞またはライブラリーDNAまたはRNA)に存在するときに、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に特定のヌクレオチド配列にのみへの分子の結合、デュープレキシングまたはハイブリダイゼーションを意味する。
【0139】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という表現は、プローブが、その標的相補配列に、典型的には核酸複合混合物においてハイブリダイゼーションするが他の配列にはハイブリダイゼーションしない条件を意味する。ストリンジェント条件は、配列依存性であり且つ環境依存性であり、例えば、配列が長いほど、より高い温度での特異性でハイブリダイゼーションすることができる。核酸のハイブリダイゼーションに対する指針が、Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイのストラテジーの概要)」、(1993)に広範に記載されている。本明細書で使用される本発明との関連で使用される「ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする」という用語は、互いに少なくとも60%相同であるヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイゼーションしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明するために使用される。好ましくは、少なくとも約65%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約75%以上が互いに相同である配列が、典型的に互いにハイブリダイゼーションしたままである条件である。
【0140】
一般的には、ストリンジェント条件は、定義されたイオン強度pHでの特異的配列についての融点(Tm)よりも約5〜10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補のプローブの50%が、平衡(標的配列がTmで過剰に存在すると、プローブの50%が平衡で占有される)で標的配列にハイブリダイゼーションする温度(定義されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下)である。ストリンジェント条件は、塩濃度が、pH7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、温度が、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃および長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド超)のついては少なくとも約60℃である条件である。また、ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドを添加することにより得ることもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも10倍である。
【0141】
例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば、以下の条件であることができる:ホルムアミド50%、5xSSCおよび1%SDSにおいて42℃でインキュベーション、または5xSSCおよび1%SDSにおいて、65℃でインキュベーション、0.2xSSCおよび0.1%SDSにおいて、65℃で洗浄。別の条件には、例えば、少なくとも68℃で20時間のハイブリダイゼーションした後2xSSC、0.1%SDSにおいて55℃で30分間2回洗浄および60℃で15分間3回洗浄と同じストリンジェント条件が含まれる。別の代替条件として、6xSSCにおいて約45℃でのハイブリダイゼーション後、0.2xSSC、0.1%SDSにおいて50〜65℃で1回以上の洗浄がある。PCRについては、約36℃の温度が、低ストリンジェンシー増幅について典型である。ただし、アニーリング温度は、プライマー長さに応じて約32℃〜48℃で異なることができる。高ストリンジェンシーPCR増幅については、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて約50℃〜約65℃の範囲であることができる。高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅の両方について典型的なサイクル条件として、90℃〜95℃で30秒間〜2分間の変性段階、30秒〜2分のアニーリング段階、約72℃で1〜2分間の伸長段階が挙げられる。
【0142】
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションしない核酸は、これらをコードしているポリペプチドが実質的に同一である場合には、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより許される最大コドン縮重を用いて形成されるときに生じる。このような場合において、核酸は、典型的には、中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションする。例示的な「中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件」としては、ホルムアミド40%、1M NaCl、1%SDSからなる緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーションおよび1xSSC、45℃での洗浄が挙げられる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者には、同様なストリンジェンシー条件とするのに、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用できることは、容易に分かるであろう。
【0143】
数値および範囲との関連で使用される「約」または「おおよそ」という用語は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであるように、反応混合物に所望量の核酸またはポリペプチドを有するなど、本発明を意図したように実施できるような、近似するか、または挙げられた値または範囲に近い値または範囲を意味する。これは、少なくとも部分的には、核酸組成物、年齢、人種、性別が異なること、並びに生物系の解剖的変異、生理学的変異および不正確性によるものである。したがって、これらの用語は、統計誤差から生じる以上の値を含む。
【0144】
「抗体」は、抗原を特異的に結合し且つ認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントによりコードされているフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子だけでなく、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子などが含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類される。重鎖は、それぞれ免疫グロブリンの種類であるIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを定義する、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類される。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含んでなる。各四量体は2つの同一のポリペプチド鎖対からなる。各対は、一つの「軽」鎖(約2kDa)と一つの「重」鎖(約70kDa以下)を有する。抗体は、例えば、無傷免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生成される多数の十分に特徴付けされたフラグメントとして存在する。種々の抗体フラグメントは、無傷抗体の消化の観点から定義されるが、当業者には、このようなフラグメントは、デノボ化学法または組み換えDNA法により合成できることが十分分かるであろう。したがって、本明細書で使用される用語「抗体」には、例えば、抗体全体の修正により生成される抗体フラグメント、組み換えDNA法を用いてデノボ合成したもの(例えば、一本鎖Fv)、ヒト化抗体、およびフェーズ表示ライブラリーを用いて同定されたものなども含まれる(例えば、Knappik等、J.Mol.Biol.,296:57−86,2000;McCafferty等、Nature、348:2−4,1990参照)。抗体(組み換え抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)の調製について、当技術分野において公知の手法を、本発明とともに使用できる(例えば、KohlerおよびMilstein,Nature,256(5517):495−497,1975;Kozbor等、Immunology Today,4:72,1983;Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Theraphy,Alan R.Liss社、第77−96頁、1998参照)。
【0145】
一本鎖抗体の産生についての方法(米国特許第4,946,778号明細書参照)は、本発明によるポリペプチドに対する抗体を産生するのに適合させることができる。トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば、他の哺乳動物を使用して、ヒト化抗体を発現することができる。また、ファージ提示法を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックFabフラグメントを同定することもできる(例えば、McCafferty等,Nature,348:2−4,1990;Marks等、Biotechnology,10(7):779−783,1992参照)。
【0146】
「抗体」という用語は、アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体およびブロッキング抗体または中和抗体を含む、最も広義の意味で使用される。
【0147】
「ブロッキング抗体」は、上記したように、抗原の生物学的活性を特異的に結合およびブロックする、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント、相同体、類似体または模擬体によりコードされている可変およびフレームワーク領域を含んでなるポリペプチドを意味する一種の抗体である。例として、ガラニン、GALR2またはGALR3に対するブロッキング抗体は、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする。ブロッキング抗体は、ポリペプチドの臨界領域に結合し、これによりその機能を阻害する。臨界領域には、タンパク質−タンパク質相互作用部位、例えば、活性部位、機能ドメイン、リガンド結合部位および認識部位などが含まれる。ブロッキング抗体は、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて、抗原を少量(強い過敏性反応を生じない程度の少量)反復注射することにより、誘発させることができる(Bellanti JA,Immunology,WB Saunders社、第131−368頁(1971)参照)。ブロッキング抗体は、マーカータンパク質の機能のブロッキングおよび発癌性増殖の阻害に重要な役割を果たす。例えば、Jopling等、J.Biol.Chem.,277(9):6864−73(2002);Drebin等、Cell,41(3):697−706(1985);Drebin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(23):9129−33(1986)参照。
【0148】
本明細書において、抗ガラニン、抗GALR2、抗GALR3または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体のブロッキング抗体による「腫瘍細胞の殺生」という用語は、機能または結合をブロッキングして腫瘍細胞増殖に関連した経路をブロッキングすることによる腫瘍細胞の増殖の阻害を意味する。例えば、抗表皮細胞成長因子受容体モノクローナル抗体は、自己分泌経路をブロッキングすることによりA431腫瘍細胞増殖を阻害する。Mendelsohn等、Trans Assoc Am Physicians,100:173−8(1987);Masui等、Cancer Res,44(3):1002−7(1984)参照。
【0149】
本明細書において、「ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用ブロッキング抗体」という用語は、ガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体との相互作用により、タンパク質の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害したり、腫瘍細胞殺生機構を介在したり、腫瘍細胞の増殖を阻害したりする、抗ヒトガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体を意味する。ガラニン、GALR2またはGALR3を発現する腫瘍細胞に単に結合するだけの抗体に対して、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対するブロッキング抗体は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性に関連する機構による腫瘍細胞殺生を介在する。腫瘍発生成長の阻害については、Drebin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(23):9129−33(1986)、および抗体介在抗増殖活性の例については、Mendelsohn等,Trans Assoc Am Physicians,100:173−8(1987)参照のこと。
【0150】
「抗ガラニン」抗体は、ガラニン遺伝子、cDNAまたはそのサブ配列によりコードされているポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。また、抗ガラニン抗体には、ガラニンの発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0151】
「抗GALR2」抗体は、GALR2遺伝子、cDNAまたはそのサブ配列によりコードされているポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。また、抗GALR2抗体には、GALR2の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0152】
「抗GALR3」抗体は、GALR3遺伝子、cDNAまたはそのサブ配列によりコードされているポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。また、抗GALR3抗体には、GALR3の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0153】
「抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体」抗体は、GALR2−GALR3ヘテロ複合体またはそのフラグメントを特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体には、GALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、または腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0154】
「癌ワクチン」は、癌に関連した特異的標的に対する免疫反応を開始する免疫系を刺激するように設計された物質である。免疫治療および癌ワクチンの一般的な概要については、Old L.J.,Scientific American,1996年9月発行を参照されたい。
【0155】
癌ワクチンは、予防型であっても、治療型であってもよい。典型的には、予防型ワクチン(例えば、インフルエンザワクチン)は、一般的にワクチンの標的と戦う細胞および/または他の物質(例えば、抗体)を生成するための免疫系を刺激するポリペプチドの一部分を含む。予防型ワクチンは、標的を攻撃することができる免疫細胞および物質を活性化および製造するのに十分な時間を免疫系に与えるために、標的(例えば、インフルエンザウイルス)に暴露する前に投与しなければならない。予防型ワクチンは、何年もの間、または個体の一生の間継続できる免疫反応を刺激する。
【0156】
治療型ワクチンは、既存の疾病の治療に使用される。したがって、治療型癌ワクチンの目標は、単に疾病を予防することではなく、むしろ免疫系を刺激して存在する癌細胞を攻撃することである。とりわけ、癌の種類が多いこと、および誰が癌にかかるか予測できないことが多いことから、現在開発されている癌ワクチンは治療型である。以下でさらに述べるように、既存の癌と戦うのが困難であるために、ほとんどのワクチンを、免疫反応を刺激するのに役立ち、および/または通常の癌治療と関連して使用される、サイトカインまたは補助剤と組み合わせて使用する。
【0157】
免疫系は、正常細胞を容認し、且つ異常細胞を認識および攻撃することができなければならない。免疫系に対しては、癌細胞は、正常細胞とはほんの少ししか相違しない。したがって、免疫系は、癌細胞を攻撃せずに容認し、その結果として癌が成長し、且つ広がることがある。したがって、癌ワクチンは、免疫反応を誘発するだけでなく、この容認を克服するのに十分な強さで免疫系を刺激しなければならない。最も有効な抗腫瘍免疫反応は、腫瘍細胞を直接認識し且つ殺すことができる、T細胞を刺激することによりなされることができる。したがって、最新の癌ワクチンは、T細胞を直接活性化しようとしたり、T細胞を活性化するために抗原提供細胞(APC)を得ようとしたり、これらの両方を試みる。例えば、研究者は、通常APC上にのみ存在する分子が腫瘍細胞上に存在するように腫瘍細胞を変更し、分子がT細胞に、最初の腫瘍細胞よりも強い活性化シグナルを与えることにより、およびサイトカインおよび補助剤を評価して必要としている領域にAPCを呼び寄せるのにはどれが最良であるかを決定することにより、T細胞の活性化を高めることを試みている。
【0158】
癌ワクチンは、腫瘍細胞全体または腫瘍により含まれる物質(例えば、抗原)から得ることができる。全細胞ワクチンについては、腫瘍細胞を、患者(一人または複数人)から取り出し、実験室で成長させ、処理することにより、確実にもはや増殖したり、患者に感染できないようにする。全腫瘍細胞をヒトに注射するとき、腫瘍細胞の抗原に対する免疫反応がおきる。2種類の全細胞癌ワクチンがある:1)患者自身の全不活性化腫瘍細胞を用いて調製した自己全細胞ワクチン;および2)別の個体の全不活性化腫瘍細胞(またはいくつかの個体からの腫瘍細胞)を用いて調製した同種異系全細胞ワクチン。抗原ワクチンは、全細胞からは調製されず、腫瘍により含まれた一種以上の抗原から調製する。ある種の抗原は、特定の種類の全ての癌に共通であり、あるものは、一つの個体に特有である。少数の抗原が、異なる種類の癌腫瘍の間で共有されている。
【0159】
抗原ワクチンにおける抗原は、いくつかの方法で送達されることができる。例えば、腫瘍細胞からのタンパク質またはそのフラグメントは、ワクチンとして直接投与できる。これらのタンパク質をコードしている核酸を投与してもよい(例えば、RNAワクチンまたはDNAワクチン)。さらに、ウイルスベクターを、これらがヒト細胞に感染し、細胞がその表面で腫瘍抗原を製造および表示するように設計できる。ウイルスベクターは、免疫反応を開始するが、ヒトを病気にするには十分でない少数のヒト細胞のみに感染できなければならない。また、ウイルスは、サイトカインを製造したり、それらの表面上でタンパク質を表示する(免疫細胞の活性化に役立つ)ように設計してもよい。これらは、単独で投与またはワクチンとともに投与して、免疫反応に役立てることができる。最後に、抗体自体を、ワクチン(抗イディオタイプワクチン)において抗原として使用できる。このように、腫瘍抗原に対する抗体を投与した後、B細胞は、腫瘍細胞も認識する、抗体に対する抗体を製造する。
【0160】
癌ワクチンは、免疫反応を高めるのに役立つ成分を含有することが多い。他の免疫細胞を攻撃の部位に集め、キラーT細胞がそれらの機能を果たすのに役に立つ化学的メッセンジャーであるサイトカイン(例えば、IL−2)が、しばしば用いられる。同様に、バクテリアなどの多様なソースから得た物質である補助剤により、それらを必要としている領域に免疫細胞が引き出されることが判明している。ある場合には、サイトカインと補助剤を癌ワクチン混合物に添加し、他の場合においては、これらを別個に投与する。
【0161】
癌ワクチンは、細胞表面(例えば、膜結合受容体またはそれらのサブパート)で通常発現される腫瘍抗原を標的とするように開発されることが最も多い。しかしながら、癌ワクチンは、細胞表面上に腫瘍特異的な様式で露出する細胞内抗原に対して有効なものとしてもよい。多くの腫瘍抗原は、例えば、HLAと複合体化した、細胞表面上で分解され、且つ発現される細胞内タンパク質である。これらの抗原は、細胞表面上にまばらに分散しているので、抗体治療で攻撃することが困難であることが多い。しかしながら、癌ワクチンは、実行できる別の治療法である。
【0162】
癌ワクチンは、外科手術、放射線または化学療法で原発性腫瘍を減少または除去した後に癌が再発するのを防止するのに、最も有用である。
【0163】
「免疫アッセイ」という用語は、抗体と抗原との間の結合相互作用を利用するアッセイである。典型的には、免疫アッセイでは、特定の抗体の特異的結合特性を使用して、抗原の単離、標的化、および/または定量が行なわれる。
【0164】
あるタンパク質またはペプチドに関連して、抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「と特異的に(または選択的に)免疫反応する」という表現は、タンパク質および他の生物物質の不均一な集団において前記タンパク質が存在することを示す結合反応を意味する。したがって、指定の免疫アッセイ条件下では、特定の抗体が、バックグラウンドの少なくとも2倍のレベルで特定のタンパク質と結合し、且つ試料に存在する他のタンパク質には顕著な量では実質的に結合しない。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択される抗体が必要なことがある。例えば、特定のガラニン、GALR2、GALR3のペプチドまたはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドに対する抗体が、それぞれガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドと特異的に免疫反応するが、特異的ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドの多型変異体、オーソログおよび対立遺伝子を除いて、他のタンパク質とは免疫反応しない抗体のみを得るために選択できる。さらに、特定のガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドオーソログに対する抗体が、それぞれガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドオーソログと特異的に免疫反応するが、そのガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドオーソログの多型変異体、突然変異体および対立遺伝子を除いて、他のオーソログタンパク質とは免疫反応しない抗体のみを得るために選択できる。この選択は、必要に応じて所望のガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の分子と交差反応する抗体を差し引くことによりおこなうことができる。種々の免疫アッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイを、通常の方法で使用して、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択する。免疫アッセイフォーマット、および特異的免疫反応性を測定するのに使用できる条件については、例えば、HarlowおよびLane,Antibodies,A Laboratory Manual,1988を参照のこと。
【0165】
「と選択的に関連する」という表現は、核酸が上記で定義したように別の核酸と、「選択的にハイブリダイゼーションする」能力、または抗体が上記で定義したようにタンパク質に「選択的に(または特異的に)結合する」能力を意味する。
【0166】
「siRNA」は、干渉を生じることができ、且つ細胞中、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中、および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において、特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じることができる小干渉RNAを意味し、これには、短ヘアピンRNA(shRNA)(Paddision等、Genes&Dev.16:948−958,2002)も含まれる。RNA干渉の現象は、Bass,Nature,411:428−29,2001;Elbashir等、Nature,411:494−98,2001;およびFire等、Nature,391:806−11,1998に記載され、考察がなされている。これらの文献では、干渉RNAの製造方法についても考察されている。本明細書に開示されている配列に基づくsiRNA(例えば、GALR3mRNA配列についてのGenBank寄託番号NM_003614)は、典型的には長さおよび構成が100塩基対(「bp」)未満、好ましくは約30bp以下であり、相補的DNA鎖または合成法の使用を含む当技術分野において公知の方法により製造できる。siRNAは、干渉を生じることができ、且つ細胞中、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中、および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じることができる。本発明による例示的なsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの周囲もしくはこれらの間のいずれかの数の塩基対を有する。
【0167】
「導入遺伝子」という用語は、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドのうちの一つまたはそのアンチセンス転写物をコードしている核酸配列であって、導入するトランスジェニック動物または細胞とは部分的または全体的に異種、すなわち、外来であるか、または導入するトランスジェニック動物または細胞の内在性遺伝子に対して相同であるが、挿入される細胞のゲノムを変更するように動物のゲノムに挿入されるように設計されるか、または挿入される(例えば、天然遺伝子とは異なる位置に挿入するか、またはその挿入がノックアウトを生じる)、核酸配列を意味する。導入遺伝子は、一つ以上の転写調節配列および他の核酸(例えば、イントロン)(選択された核酸の最適な発現に必要なことがある)を、含むことができる。
【0168】
「トランスジェニック動物」は、キメラであり、ほとんどの脊椎動物種で可能である、いずれかの動物、好ましくは非ヒト哺乳動物を意味する。このような種には、以下の非ヒト哺乳動物が含まれるが、これらには限定されない:げっ歯類、例えば、マウスおよびラット;ウサギ;鳥類または両生類;ヒツジ類、例えば、ヒツジおよびヤギ;ブタ類、例えば、ブタ;およびウシ類、例えば、ウシおよび水牛。上記動物の細胞の一つ以上は、人工的介入、例えば、当技術分野において周知の遺伝子組み換え法により導入された異種の核酸を含有する。核酸は、慎重な遺伝子操作、例えば、マイクロインジェクションまたは組み換えウイルスの感染により細胞の前駆体に導入することにより、直接的または間接的に細胞に導入される。「遺伝子操作」という用語は、古典的な交差ブリーディングまたは性的受精を含まず、組み換えDNA分子の導入を対象としている。この分子は、染色体に組み込まれてもよいし、または染色体外でDNAを複製してもよい。本明細書に記載の典型的なトランスジェニック動物では、導入遺伝子は、細胞に、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質のうちの一つの組み換え形態、例えば、アゴニスト形態またはアンタゴニスト形態を発現させる。しかしながら、組み換えガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も考えられる。さらに、「トランスジェニック動物」には、一つ以上のガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の遺伝子破壊が、組み換え法およびアンチセンス法の両方を含む人工的介入により生じる組み換え動物も含まれる。導入遺伝子は、体細胞に限定してもよいし、または生殖系に配置してもよい。
【0169】
トランスジェニック動物を得る方法は、例えば、Puhler,A.編、「Genetic Engineering of Animals(動物の遺伝子工学)」、VCH社、1993;MurphyおよびCarter編、「Transgenesis Techniques:Principles and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.18)(トランスジェネシス法:原理およびプロトコール(分子生物学における方法、第18巻))」、1993;並びにPinkert,CA編、「Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook(トランスジェニック動物技術:実験ハンドブック)」、Academic Press社、1994に記載されている。
【0170】
「ノックアウト構築物」という用語は、哺乳動物の一つ以上の細胞における内在性遺伝子によりコードされているポリペプチドの発現を減少または抑制するように設計されるヌクレオチド配列を意味する。ノックアウト構築物として使用されるヌクレオチド配列は、典型的には(1)抑制されるべき内在性遺伝子のある一部分(一つ以上のエクソン配列、イントロン配列および/またはプロモーター配列)からのDNA、および(2)細胞におけるノックアウト構築物の存在を検出するのに使用されるマーカー配列から構成されている。ノックアウト構築物は、ノックアウトされるべき内在性遺伝子を含有する細胞に挿入することができる。次に、ノックアウト構築物は、内在性遺伝子(例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子)の対立遺伝子の一方または両方に組み込むことができ、ノックアウト構築物のこのような組込みにより、全長内在性遺伝子の転写を防止または遮断することができる。細胞染色体DNAへのノックアウト構築物の組込みは、典型的には相同組み換えによりおこなわれる(すなわち、内在性DNA配列に相同的または相補的であるノックアウト構築物の領域は、ノックアウト構築物が細胞に挿入されたときに互いにハイブリダイゼーションできる;次に、これらの領域を組み換えて、ノックアウト構築物が内在性DNAの対応の位置に組み込まれるようにすることができる)。
【0171】
「トランスジェニック」とは、細胞に挿入され、且つその細胞から発生する動物のゲノムの一部分となる核酸配列を含むいずれかの哺乳動物を意味する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して部分的または全体的に異種であることができる。
【0172】
したがって、例えば、天然のガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子を第二の種からの遺伝子に置き換えると、第二の種の受容体を産生する動物が得られる。天然の遺伝子を突然変異を有する遺伝子に置き換えると、突然変異受容体を産生する動物が得られる。ヒト由来のガラニン、GALR2またはGALR3の受容体を担持しているトランスジェニックマウスは、マウス由来のガラニン、GALR2またはGALR3のサブユニットをヒト由来の遺伝子に直接的に置き換えることによって作出することができる。これらのトランスジェニック動物は、ヒトの疾病のため、およびそれぞれの遺伝子に関連する障害または疾病の最終的な治療のための動物モデルについての薬剤アンタゴニストの研究に極めて重要である。これらの突然変異を担持するトランスジェニックマウスは、この疾病を研究するのに極めて有用である。
【0173】
ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の「ノックアウト」を担持しているトランスジェニック動物は、このような受容体が関与する疾病のための非ヒトモデルの確立のため、および生体内系における異なるガラニン、GALR2またはGALR3の受容体の活性を区別するのに有用であろう。「ノックアウトマウス」は、相同組み換えにより、天然または内在性のガラニン、GALR2またはGALR3の対立遺伝子(単一または複数)が破壊され、且つそれら自身の機能的なガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を産生しないマウスを意味する。ノックアウトマウスは、当技術分野において公知の方法にしたがって得ることができる(例えば、Thomas等、Immunol,163:978−84,1999;Kanakaraj等、J Exp Med,187:2073−9,1998;またはYeh等、Immunity,7:715−725,1997)。
【0174】
GALR3:
ヒトガラニン受容体3(GALR3)(GenBank寄託番号NM_003614.GALR3についてのUnigeneクラスターは、寄託番号BF116239およびBF512731である2ESTを含有するHs.158353である)は、ヒト肺腫瘍の25%およびヒト乳腫瘍の50%において増幅されるアンプリコンの中心点であると考えられる。このことは、該遺伝子が重要な生物学的機能を有し、腫瘍形成中に、遺伝子DNAコピーが増加するように選択されることを意味する。また、GALR3遺伝子は、ヒト肺癌においてしばしば過剰発現する。
【0175】
ヒト肺腫瘍のゲノムにおける増幅領域の探索において最初になされた試みは、cDNAマイクロアレイハイブリダイゼーション法によるものであった。例えば、米国特許第6,232,068号明細書;Pollack等、Nat.Genet.23(1):41−46,(1999)および当技術分野において公知の他の方法を参照のこと。次に、マイクロアレイ解析において、染色体長さ22アームバンド−q13−でのEST W69399が、肺腫瘍試料LU84で増幅することが判明した。W69399を含む領域をさらに解析したところ、GALR3が増幅領域の中心点であることを示す確証が得られた。
【0176】
GALR2:
ヒト癌においてしばしば増幅される上述の本発明によるGALR3の他に、本発明者等は、他の2つの公知のガラニン受容体、すなわち、GALR2およびGALR1(GALR3とのアミノ酸同一性は、それぞれ58%および36%である)について検討した。GALR2のみが、増加したGALR3遺伝子コピー数も含む同じ肺腫瘍で増幅することが判明した(表1および表2参照)。また、GALR2が、増加したGALR3遺伝子コピー数を含む同じ乳腫瘍で増幅することも分かった(表3参照)。DNAコピー数は、定量的PCR法を用いて測定した。
【0177】
ガラニン:
ガラニンは、ガラニン受容体に対するリガンドである(GenBank寄託番号A28025、ヒトプレプロガラニンcDNA配列[ガラニンについてのUnigeneクラスターは、Hs.1907、ヒトガラニンである];GenBank寄託番号CAA01907、ヒトプレプロガラニンのアミノ酸配列;およびGenBank寄託番号AAB20740、ヒトガラニンペプチド配列)。ガラニンは、増幅され、且つ過剰発現されたガラニン受容体を含有する肺腫瘍において、しばしば増幅され(70%超、試験試料54/77)、過剰発現する(78%、試験試料39/50)(表7参照)。このことは、該遺伝子が重要な生物学的機能を有し、腫瘍形成中に、遺伝子DNAコピーが増加するように選択されることを意味する。ガラニンは、ヒト肺腫瘍の70%超において増幅するアンプリコンの中心点にあると思われる(図3参照)。したがって、ガラニン遺伝子とその発現タンパク質産物を、癌治療について、診断または標的として使用でき、また、腫瘍および癌(例えば、肺癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定するのにも使用できる。
【0178】
腫瘍におけるGALR2およびGALR3の遺伝子の増幅:
腫瘍において増幅された標的遺伝子の存在を、標的遺伝子のコピー数、すなわち、標的タンパク質をコードする細胞におけるDNA配列の数を測定することにより評価する。一般的に、正常2倍体細胞は、一定の常染色体遺伝子の2つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は、例えば、癌細胞における遺伝子増幅または重複により増加したり、欠失により減少したりすることがある。特定の遺伝子のコピー数の評価方法は、当技術分野において周知であり、とりわけハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイが挙げられる。
【0179】
【表1】
【0180】
【表2】
【0181】
【表3】
【0182】
多数のハイブリダイゼーションに基づくアッセイのうちのいずれかを使用して、生物学的試料の細胞におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数を検出することができる。このような方法の一つに、サザンブロッティングがある(上記したAusubel等またはSambrook等参照)。この方法では、ゲノムDNAを、典型的には断片化し、電気泳動で分離し、膜に移し、次に、ガラニン、GALR2またはGALR3の特異的プローブにハイブリダイゼーションさせる。標的領域についてのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、同じゲノムにおける正常非増幅単一コピーゲノムDNAの領域からの対照プローブからのシグナルとを比較すると、特異的使用プローブに対応する相対的なガラニン、GALR2またはGALR3のコピー数の推定値が得られる。対照と比較してシグナルが増加した場合に、増幅があったことを示す。
【0183】
試料中のガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数を測定する方法として、インサイチュハイブリダイゼーション、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)がある(Angerer,1987 Meth.Enzymol.,152:649参照)。一般的に、インサイチュハイブリダイゼーションは、主に以下の工程を含んでなる:(1)分析される組織または生物学的構造体を固定する工程;(2)生物学的構造体をプレハイブリダイゼーション処理して、標的DNAの接近性を増加し、且つ非特異的結合を低減する工程;(3)生物学的構造体または組織の中の核酸に対して核酸混合物をハイブリダイゼーションさせる工程;(4)ハイブリダイゼーション後に洗浄して、ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸フラグメントを除去する工程;(5)ハイブリダイゼーションした核酸フラグメントを検出する工程。このような用途に用いられるプローブは、典型的には、例えば、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識される。好ましいプローブは、ストリンジェント条件下で標的核酸(単一または複数)と特異的にハイブリダイゼーションするのに十分な長さ(例えば、約50、100または200ヌクレオチド〜約1000ヌクレオチド以上)を有する。
【0184】
DNAコピー数を測定する他の方法は、比較ゲノムハイブリダイゼーション法(CGH)である。比較ゲノムハイブリダイゼーション法では、核酸の「試験」採集物を第一標識で標識し、第二採集物(例えば、正常な細胞または組織からのもの)を第二標識で標識する。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイにおける各ファイバーに結合している第一標識と第二標識との比により求める。例えば、試験採集物における遺伝子増幅による2つの標識からのシグナルの比の差を検出する。この比により、特異的使用プローブに相当するガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子コピー数の指標が得られる。DNAコピー数変化の細胞遺伝的表示は、CGHによりなすことができる。CGHでは、異なるように標識した試験ゲノムDNAおよび基準ゲノムDNAからの染色体の長さに沿った蛍光比が得られる。
【0185】
本発明による方法において使用するのに好適なハイブリダイゼーションプロトコールは、例えば、Albertson(1984)EMBO J.3:1227−1234;Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9138−9142;EPO Pub.No.430:402;Methods in Molecular Biology、第33巻:In Situ Hybridization Protocols,Choo編、Humana Press社、Totowa,NJ(1994)に記載されている。
【0186】
増幅に基づくアッセイを使用して、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数を測定することもできる。このようなアッセイでは、対応のガラニン、GALR2またはGALR3の核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、PCR)におけるテンプレートとしての役割を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量は、オリジナル試料におけるテンプレートの量に比例する。適切な対照との比較により、上述の原理にしたがった特異的使用プローブに相当するガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数の指標が得られる。TaqManプローブを用いたリアルタイム定量的PCRの方法は、当技術分野において周知である。リアルタイム定量的PCRについてのプロトコルの詳細は、例えば、RNAについては、Gibson等、1996、「A novel method for real time quantitative RT−PCR(リアルタイム定量的RT−PCRの新規な方法)」、Genome Res.,10:995−1001;およびDNAについては、Heid等、1996、「Real time quantitative PCR(リアルタイム定量的PCR)」、Genome Res.,10:986−994、に記載されている。
【0187】
Taqmanに基づくアッセイは、ガラニン、GALR2またはGALR3のポリヌクレオチドを定量するのにも使用できる。TaqManに基づくアッセイでは、5’蛍光染料と3’クエンチ剤とを含有する蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、PCR産物にハイブリダイゼーションするが、それ自体は、3’端にブロック剤があるために延長されることはない。PCR産物を、続いてのサイクルで増幅するときに、ポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性、例えば、AmpliTaqにより、TaqManプローブが切断される。この切断により、5’蛍光染料と3’クエンチ剤が分離され、これにより増幅との相関において蛍光が増加する(例えば、http://www2.perkin−elmer.com参照)。
【0188】
他の好適な増幅法には、リガーゼ連鎖反応(LCR)(WuおよびWallace,Genomics,4:560,1989;Landegren等、Science,241:1077,1988;およびBarringer等、Gene,89:117,1990参照)、転写増幅 (Kwoh等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173,1989)、自立した配列複製(Guatelli等、Proc Nat Acad Sci,USA 87:1874,1990)、ドットPCRおよびリンクアダプターPCR等があるが、これらには限定されない。
【0189】
DNAコピー数を測定するための一つの強力な方法は、マイクロアレイに基づくプラットホームを使用するものである。マイクロアレイ法は、高解像度が得られるので、使用可能である。例えば、従来のCGHは、一般的に20Mbの限定されたマッピング解像度であるのに対して、マイクロアレイに基づくCGHでは、異なるように標識した試験ゲノムDNAおよび基準ゲノムDNAの蛍光比により、DNAコピー数変化の遺伝子座ごとの指標が得られ、これによりマッピング解像度が増加する。種々のマイクロアレイ法の詳細が、文献に記載されている。例えば、米国特許第6,232,068号明細書;Pollack等、Nat.Genet.,23(1):41−46(1999)等を参照のこと。
【0190】
本明細書に記載の実施例から明らかなように、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子は、しばしば一定の癌(特に乳癌)において増幅され、増幅された染色体領域の中心点に存在する。また、表5および表7においてガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子の増幅を示す全ての試料は、ガラニン、GALR2およびGALR3のmRNAの過剰発現が生じたことを示している。ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子は、これらの過剰発現、増幅およびこれらの2つの間の相関の特徴を有しており、これらの特徴は、他の十分に研究された癌遺伝子と共通している(Yoshimoto等、JPN J Cancer Res,77(6):540−5,1986;Knuutila等、Am.J.Pathol.,152(5):1107−23,1998)。したがって、ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子は、本発明において癌の診断および治療の標的として使用される。
【0191】
腫瘍におけるガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子の頻発過剰発現:
腫瘍細胞におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の発現レベルを、調査した。以下の実施例で明らかにされるように、GALR3遺伝子は、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌において過剰発現する。ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の発現の検出および定量は、直接ハイブリダイゼーションに基づくアッセイまたは増幅に基づくアッセイにより実施できる。遺伝子転写物を測定するためのハイブリダイゼーションに基づく方法は、当業者には公知である(Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Press社、NY、1989)。例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の有無または量を評価する一つの方法に、ノーザンブロッティング法がある。一定の生物学的試料から単離したmRNAを、電気泳動してmRNA種を分離し、ゲルから、ニトロセルロースまたはナイロンフィルター等の膜に転写する。次に、標識したガラニン、GALR2またはGALR3のプローブを、膜にハイブリダイゼーションさせてそれぞれのmRNAを同定および定量する。増幅に基づくアッセイの例としては、当技術分野において周知のRT−PCRなどがある(Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,1995年増補版)。好ましくは、定量的RT−PCRを使用して異なる試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のmRNAのそれぞれのレベルの数値を比較する。
【0192】
ガラニン、GALR2、GALR3およびGALR2−GALR3ヘテロ複合体を用いた癌の診断、治療およびワクチン:
【0193】
A.ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子の過剰発現および増幅:
ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子およびそれらの発現されたタンパク質産物は、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の診断、予後診断、合理的薬剤設計および他の治療上の診療のために使用できる。
【0194】
患者から採取した生物学的試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の増幅および/または過剰発現の検出および測定から、患者が腫瘍を発現したかどうかが分かる。特に、増幅ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAが存在すると、高い精度の確率で、それぞれ癌状態または前癌状態、例えば、in、GALR2またはGALR3はGALR2−GALR3ヘテロ複合体肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断となる。したがって、本発明の一態様によれば、疑いのある組織から採取した試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のmRNA発現のレベルを測定し、ガラニン、GALR2またはGALR3がその組織で過剰発現したかどうかを決定することによる、哺乳動物の組織における癌または腫瘍を診断または特徴付けする方法が提供される。mRNAレベルを測定および評価するための、ハイブリダイゼーションに基づく方法および増幅に基づく方法を含む種々の方法が、上記したように本明細書において開示されている。また、本発明の別の態様によれば、疑いのある組織から採取した試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピーの数を測定し、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子が組織において増幅したかどうかを決定することによる、哺乳動物組織における癌または腫瘍を診断する方法が提供される。DNAコピー数を測定および評価するためのハイブリダイゼーションに基づく方法および増幅に基づく方法を含む種々の方法が、上記したように本明細書で開示されている。したがって、本発明によれば、DNAレベルでの増幅遺伝子およびRNAレベルでの発現の増加を検出する方法であって、これらの結果の両方とも、腫瘍の進行を示している、方法が提供される。
【0195】
B.ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の検出:
本発明によれば、生物学的検体におけるガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のレベルの増加が検出された場合も、試料の組織ソースが前癌状態または癌状態にあることを示唆することができる。腫瘍および癌の診断および予後診断のためのタンパク質の検出は、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の標的に対する抗体を用いて、免疫アッセイにより実施できる。タンパク質の検出および定量のための当技術分野において公知である方法、とりわけ電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ハイパーディフュージョンクロマトグラフィー、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット等を、本発明の方法に使用できる。分析すべき種類の組織または細胞から、タンパク質を、例えば、HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:実験マニュアル)(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor,N.Y.1988)に記載のような標準的な方法を用いて単離できる。
【0196】
本発明において有用な抗体(またはそのフラグメント)は、さらに標的遺伝子ペプチドのインサイチュ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法と同様に組織学的に用いることができる。インサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、それに本発明の標識した抗体を適用することによりおこなうことができる。抗体(またはそのフラグメント)は、標識した抗体(またはフラグメント)を生物学的試料上にのせることにより適用するのが好ましい。このような手順を用いることにより、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の標的遺伝子産物の存在だけでなく、試験した組織の分布も測定できる。本発明を使用して、当業者は、多種多様な組織学的方法(例えば、染色法)のいずれかを改変してこのようなインサイチュ検出をおこなうことができることが、容易に理解できるであろう。
【0197】
タンパク質の検出に附する生物学的試料を、固相支持体または担体、例えば、ニトロセルロース、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定することができる他の固体支持体と接触させて、そこに固定化することができる。次に、支持体を、好適な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識されたフィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理することができる。次に、固相支持体を、緩衝液で二回目の洗浄をおこなって未結合抗体を除去することができる。次に、固体支持体に結合した標識の量を、通常の手段で検出できる。
【0198】
一つの態様によれば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体等の標的産物特異的抗体を、酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはグルコアミラーゼに結合させ、それを酵素免疫アッセイ(EIA)に使用することにより検出可能に標識できる(例えば、Voller,A.,1978,「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(酵素結合免疫吸着アッセイ)」、Diagnostic Horizons,2:1−7;Voller等、J.Clin.Pathol.,31:507−520,1978;Butler,J.E.,Meth.Enzymol.,73:482−523,1981;Maggio,E.編、Enzyme Immunoassay,CRC Press社、Boca Raton,Fla.,1980;並びにIshikawa等編、Enzyme Immunoassay,工学書院、東京、1981参照)。抗体に結合した酵素は、好適な基質、好ましくは色素産生基質と反応して、例えば、分光光度的手段もしくは蛍光定量的手段によるか、または外観検査により検出できる化学的部分を生成する。
【0199】
したがって、本発明の関連した態様によれば、癌の診断および診療におけるガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体の使用が提供される。ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質およびポリペプチドに特異的に結合する抗体は、種々の方法により産生できる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントなどがあるが、これらには限定されない。
【0200】
このような抗体は、例えば、標的遺伝子、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質、または生理学的または病理学的に重要なことがある特定の生物学的経路に関与しているフィンガープリントまたは経路遺伝子の検出に使用することができる。また、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体は、それぞれガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を阻害する方法にも使用できる。したがって、このような抗体は、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の治療に使用できる。また、このような抗体は、診断法に使用することにより、患者は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体にそれぞれ関連するガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質および/またはフィンガープリントまたは経路遺伝子タンパク質のレベルが異常でないかとか、このようなタンパク質が異常な形態でないかについて、試験されることができる。
【0201】
ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質に対する抗体を産生するために、宿主動物を、タンパク質またはその一部分で免疫化する。このような宿主動物には、ウサギ、マウスおよびラットなどがあるが、これらには限定されない。種々の補助剤を、宿主種に応じて免疫反応を増加するのに使用できる。補助剤には、フロイント(完全および不完全)、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン(KLH)、ジニトロフェノール(DNP)および有用である可能性のあるヒト補助剤、例えば、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)および瘡プロピオンバクテリウムなどがあるが、これらには限定されない。
【0202】
本発明におけるようなガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、培養における連続細胞系による抗体分子の産生のための方法により得ることができる。これらには、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ法(Nature,256:495−497,1975;および米国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kosbor等、Immunology Today,4:72,1983;Cole等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026−2030,1983)およびBVハイブリドーマ法(Cole等、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Alan R.Liss社、1985)、第77〜96頁)などがあるが、これらには限定されない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含むいずれかの免疫グロブリンおよびそのいずれかのサブクラスに属するものでよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマを、試験管内または生体内で培養できる。生体内での高力価のmAbの産生できるので、これは、現在の好ましい産生方法である。
【0203】
さらに、「キメラ抗体」の産生用に開発された方法では、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、スプライシングできる(Morrison等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855,1984;Neuberger等、Nature,312:604−608,1984;Takeda等、Nature,314:452−454,1985;および米国特許第4,816,567号参照)。キメラ抗体は、異なるタンパク質が異なる動物種由来のもの、例えば、マウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン由来のコンテナ領域を有するものである分子である。
【0204】
別法として、一本鎖抗体の産生について記載されている方法(例えば、米国特許第4,946,778号;Bird,Science,242:423−426,1988;Huston等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879−5883,1988;およびWard等、Nature,334:544−546,1989)およびヒト化モノクローナル抗体の製造について記載されている方法(米国特許第5,225,539号)を使用して、抗ディファレンシャル発現または抗経路遺伝子産物抗体を産生することができる。
【0205】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の方法により生成できる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により生成することができるF(ab’)2フラグメント、およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成することができるFabフラグメントなどがあるが、これらには限定されない。別法として、Fab発現ライブラリーを構築して(Huse等、Science,246:1275−1281,1989)、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速且つ容易に同定できる。
【0206】
C.癌診断におけるガラニン、GALR2、GALR3およびGALR2−GALR3ヘテロ複合体のモジュレータの使用:
本発明の別の態様によれば、抗体の他に、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と相互作用する他の分子および化合物の、診断および治療への利用が提供される。具体的には、このような化合物として、標的の膜貫通型タンパク質の細胞外部分を含んでなるタンパク質またはペプチド(もしこれらが存在するならば)などを挙げることができるが、これらには限定されない。典型的なペプチドには、可溶性ペプチド、例えば、Igテールド融合ペプチドなどがある。このような化合物は、D−および/またはL−立体配置アミノ酸、ホスホペプチド(ランダムまたは部分的縮重ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含むがこれらには限定されない;例えば、Songyang等、Cell,72:767−778,1993参照)および小有機分子または小無機分子から作製したランダムペプチドライブラリー(例えば、Lam等,Nature,354:82−84,1991;Houghton等,Nature,354:84−86,1991参照)の生成およびスクリーニングにより得ることもできる。本発明のこの態様によれば、標的、すなわち、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質に結合するか、または標的と相互作用することができる細胞タンパク質に結合する化合物、および標的と他の細胞タンパク質との相互作用妨害することができる化合物をアッセイまたは同定する、多数の方法および手順が提供される。
【0207】
標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と特異的に結合する化合物を同定できる試験管内アッセイ系が提供される。これらのアッセイでは、全て、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の標的遺伝子産物と、試験化合物との反応混合物の調製がおこなわれる。この調製は、これらの2つの化合物が相互作用し且つ結合するのに十分な条件および時間で実施することにより、反応混合物において除去および/または検出できる複合体を形成する。これらのアッセイは、種々の方法でおこなうことができる。例えば、一つの方法では、標的タンパク質または試験物質を固相に固定し、標的タンパク質(反応の終わりで固相に固定された試験化合物複合体)を検出する。このような方法の一つの態様では、標的タンパク質を、固体表面上に固定でき、固定されない試験化合物を、直接または間接的に標識できる。実際に、マイクロタイタープレートを、固相として使用できる。固定された成分は、非共有または共有結合により固定化できる。非共有結合は、固体表面にタンパク質溶液を塗布し、乾燥することにより簡単におこなうことができる。別法として、固定化されるべきタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固体表面に固定できる。表面は、事前に調製し、保存できる。
【0208】
アッセイをおこなうために、非固定化成分を、固定した成分を含有する塗布面に添加する。反応完了後、未反応成分を、例えば、洗浄により除去し、固体表面に固定された複合体を、検出する。事前に固定化した成分を前標識する場合、表面に固定化された標識が検出された場合、複合体が形成されたことを示す。事前に非固定化された成分が前標識されない場合、間接的な標識を使用して、表面上に固定した複合体を、例えば、固定化した成分に特異的な標識抗体(この抗体は、次に標識抗Ig抗体で直接的または間接的に標識できる)を用いて検出できる。別法として、反応を液相でおこない、反応生成物を未反応成分から分離し、例えば、標的遺伝子または試験化合物に特異的な固定化抗体を用いて溶液において形成された複合体を固定し、可能性のある複合体の他の成分に特異的な標識した抗体を使用して固定複合体を検出することにより、複合体を検出することができる。
【0209】
また、標的タンパク質、すなわち、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質と相互作用することのできるいずれかの細胞タンパク質を同定するためのアッセイも、提供される。タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに好適な方法を使用して、標的タンパク質と細胞または細胞外タンパク質との間の新規な相互作用を同定することができる。これらの細胞または細胞外タンパク質は、一定の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌に関与することがあり、標的、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3を含む一定の発癌性経路を示す。したがって、これらは、経路遺伝子と呼ばれることがある。
【0210】
勾配またはクロマトグラフィーカラムを用いた共免疫沈降および共精製等の方法を使用して、標的タンパク質が関与したタンパク質−タンパク質相互作用を同定できる。標的タンパク質、すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質またはその一部分のアミノ酸配列は、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質と相互作用する経路遺伝子産物または他のタンパク質を同定するのに有用である。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列または公表されているデータベースの記録(SWISS−PROT、PIR、EMBL)から得ることができる。また、アミノ酸配列は、当業者に周知の方法、例えば、Edman分解法(例えば、Creighton,「Proteins:Structures and Molecular Principles(タンパク質:構造および分子の原理)」、1983,W.H.Freeman&Co.社、N.Y.,34−49参照)を用いて確認することもできる。標的遺伝子、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3のヌクレオチドサブ配列を、反応混合物に使用して、経路遺伝子配列についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、標準的なハイブリダイゼーションまたはPCR法によりおこなうことができる。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングについての方法は、周知である(例えば、上記したAusubelのものおよびInnis等(編者)、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(PCRプロトコール:方法および用途ガイド)」、1990,Academic Press社、ニューヨーク参照)。
【0211】
例えば、生体内でのタンパク質の相互作用を検出するのにしばしば使用される酵母2ハイブリッド系が、ここで検討されている。Chien等は、あるバージョンの酵母2ハイブリッド系の使用を報告した(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88:9578−9582)。これは、Clontech社(カリフォルニア州Palo Altoに所在)から、市販されている。簡単に述べると、このような系を用いて、2ハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築する:第一ハイブリッドタンパク質は、公知のタンパク質、この場合腫瘍または癌に関与していることが知られているタンパク質に融合した転写因子、例えば、活性化タンパク質のDNA結合ドメインを含んでなり、第二ハイブリッドタンパク質は、cDNAライブラリーの一部分としてこのプラスミドに組み換えられたcDNAによりコードされている未知のタンパク質に融合している転写因子活性化ドメインを含んでなる。プラスミドを、発現が転写因子の結合部位により調節されているレポーター遺伝子、例えば、lacZを含有する酵母の菌株サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に形質転換する。いずれのハイブリッドタンパク質は単独では、レポーター遺伝子の転写を活性化できない。DNA結合ハイブリッドタンパク質は、活性化ドメイン機能を提供しないので、転写を活性化できない。活性化ドメインハイブリッドタンパク質は、その標的部位への結合に必要とするドメインを欠いているので転写を活性化できない。すなわち、活性化ドメインハイブリッドタンパク質は、転写活性化剤タンパク質の結合部位に局在化できない。DNA結合ハイブリッドタンパク質とライブラリーコードタンパク質との間の相互作用により、機能性転写因子を再構築され、レポーター遺伝子の発現を生じる。レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子産物用アッセイにより検出される。
【0212】
2ハイブリッド系または類似の方法を使用して、公知の「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質用活性化ドメインライブラリーをスクリーニングすることができる。多数の腫瘍および癌に関与しているガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子産物は、このような本発明によるベイトである。総ゲノムまたはcDNA配列を、活性化ドメインをコードしているDNAに融合する。このライブラリーと、DNA結合ドメインに融合したベイト遺伝子産物、すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質またはポリペプチドのハイブリッドをコードしているプラスミドを、酵母レポーター菌株に共形質転換され、得られた形質転換体を、レポーター遺伝子を発現するものについて、スクリーニングする。例えば、ベイト遺伝子ガラニン、GALR2またはGALR3を、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードしているDNAに翻訳融合されるようにベクターにクローニングできる。コロニーを精製し、レポーター遺伝子発現に関与している(ライブラリー)プラスミドを単離する。プラスミドにおけるインサートを配列決定して、cDNAまたはゲノムDNAによりコードされているタンパク質を同定する。
【0213】
ベイト遺伝子産物、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3と相互作用すると予想されるタンパク質を発現する細胞または組織ソースのcDNAライブラリーは、当技術分野において通常実施されている方法を用いて調製できる。ここに記載の特定の系によれば、cDNAフラグメントを、これらがGAL4の活性化ドメインに翻訳融合するようにベクターに挿入することにより、ライブラリーを生成する。このライブラリーを、ベイト遺伝子−GAL4融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターにより発現が制御されるlacZ遺伝子を含む酵母菌株に共形質転換できる。ベイト遺伝子産物と相互作用するGAL4活性化ドメインに融合したcDNAコードタンパク質は、活性GAL4転写因子を再構築し、これによりlacZ遺伝子の発現を促進する。lacZを発現するコロニーは、X−galの存在下でそれらのブルー色により検出できる。このようなブルーコロニーからのcDNA含有プラスミドは、次に精製し、使用して、当技術分野において通常実施されている方法を用いて、ガラニン、GALR2またはGALR3相互作用タンパク質を産生および単離できる。
【0214】
また、本発明の別の態様によれば、標的ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質が関与する遺伝子と細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物のアッセイが提供される。標的遺伝子タンパク質、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質は、生体内で、一つ以上の細胞または細胞外マクロ分子、例えば、タンパク質および核酸分子と相互作用することができる。このような細胞または細胞外マクロ分子は、「結合パートナー」と称される。このような相互作用を破壊する化合物を使用して、標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質、とりわけ突然変異標的遺伝子産物の活性を調節できる。このような化合物として、抗体、ペプチドおよび他の化学化合物等の分子を挙げることができるが、これらには限定されない。
【0215】
アッセイ系では、全て、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質および結合パートナーを含有する反応混合物の調製を、これらの2つの産物が相互作用し且つ結合して複合体を形成するのに十分な条件および時間で実施する。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を、試験化合物の存在下および不存在下で調製する。試験化合物を、最初に反応混合物に含ませるか、または標的遺伝子産物およびその細胞または細胞外結合パートナーの添加に続いて添加することができる。対照反応混合物を、試験化合物を使用しないか、プラシーボとともにインキュベーションする。次に、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と、細胞または細胞外結合パートナーとの間の複合体の形成を、検出する。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応において複合体が形成された場合、化合物が標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質とインタラクティブ結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物と正常標的遺伝子産物を含有する反応混合物内の複合体形成を、試験化合物と突然変異標的遺伝子産物を含有する反応混合物内の複合体の形成と比較できる。この比較は、正常標的遺伝子産物ではなく突然変異体の相互作用を破壊する化合物を同定するのが望ましい状況では、重要なことがある。
【0216】
アッセイは、不均一または均一フォーマットでおこなうことができる。不均一アッセイでは、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質または結合パートナーを、固相に固定し、上記したように反応の終わりで固相に固定した複合体を検出する。不均一アッセイでは、反応全体を、以下で説明するように、液相で実施する。いずれの方法でも、反応剤の添加の順序を変えて、試験化合物についての異なる情報を得ることができる。例えば、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と結合パートナーとの間の相互作用を、例えば、競合により妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応をおこなうこと、すなわち、試験物質を反応混合物に、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質およびインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーの前または同時に添加することにより同定できる。別法として、予め形成した複合体を破壊する試験化合物、例えば、複合体からの成分の一つを置き換えるより高い結合定数を有する化合物は、試験化合物を、反応混合物に、複合体が形成された後に添加することにより試験することができる。
【0217】
均一アッセイでは、標的遺伝子産物とインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナー産物との予備形成複合体を、調製する。この場合、標的遺伝子産物またはそれらの結合パートナーを標識するが、標識により生成されるシグナルは、複合体の形成によりクエンチされる(例えば、Rubensteinによる米国特許第4,109,496号参照)。予備形成した複合体から種の一つと競合し且つ置き換わる試験物質を添加すると、バックグラウンドより大きいシグナルが生成する。このようにして、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と細胞または細胞外結合パートナーとの間の相互作用を破壊する試験物質を、同定できる。
【0218】
一つの態様によれば、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質を調製し、組み換えDNA法を用いて固定化できる。例えば、標的ガラニン、GALR2またはGALR3遺伝子コード領域を、pGEX−5X−1等の融合ベクターを用いて、その結合活性が得られた融合産物において維持されるようにして、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子に融合できる。インタラクティブ細胞または細胞外結合パートナー産物を、精製し、使用して、当技術分野において通常実施されている方法を用いてモノクローナル抗体を得る。この抗体に、放射性同位体125Iを、例えば、当技術分野において通常実施されている方法により標識できる。
【0219】
不均一アッセイでは、GST−標的遺伝子融合産物を、例えば、グルタチオン−アガロースビーズに固定する。次に、インタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーを、相互作用と結合が生じるように、試験化合物の存在下または不存在下で添加する。反応時間の終わりに、未結合物質を洗浄して除去し、標識したモノクローナル抗体を、この系に添加して、複合化成分に結合させることができる。標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質とインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーとの間の相互作用を、グルタチオン−アガロースビーズと関連して残存する対応の放射能の量を測定することにより検出する。試験化合物による相互作用の阻害がうまくいくと放射能の測定値が減少する。別法として、GST−標的遺伝子融合産物とインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーを、固体グルタチオン−アガロースビーズの不存在下、液体中で一緒に混合することができる。結合パートナーを相互作用させている間またはその後に、試験化合物を添加する。次に、この混合物を、グルタチオン−アガロースビーズに添加し、未結合物質を洗浄除去する。ここでも、結合パートナーの相互作用の阻害の程度は、標識抗体を添加し、ビーズに関連した放射能を測定することにより、検出できる。
【0220】
本発明の別の態様によれば、全長産物の一つまたは両方の代わりに、標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の結合ドメインに相当するペプチドフラグメント、およびインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナー(結合パートナーが産物の場合)を用いて、これらの同じ方法が用いられる。当技術分野において通常実施されている多数の方法を使用して、タンパク質の結合部位を同定および単離することができる。これらの方法には、産物の一つをコードしている遺伝子の一つの突然変異誘発、および共免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングなどがあるが、これらには限定されない。
【0221】
さらに、複合体における第二種をコードしている遺伝子における補正突然変異(compensating mutations)を選択することができる。それぞれの産物をコードしている遺伝子の配列解析により、インタラクティブ結合に関与している産物の領域に相当する突然変異が明らかとなる。別法として、一つの産物を、上記した方法を用いて固体表面に固定し、タンパク質分解酵素、例えば、トリプシンで処理したその標識した結合パートナーと相互作用させ且つ結合できる。洗浄後、結合ドメインを含んでなる短鎖標識ペプチドは固体物質と結合したままであるため、これを単離すること、およびアミノ酸配列決定によりこれを同定することができる。また、細胞または細胞外結合パートナー産物をコードしている遺伝子がいったん得られると、短遺伝子セグメントを、産物のペプチドフラグメントを発現するようにした後、結合活性について試験し、精製または合成されことができる。
【0222】
D.ガラニン、GALR2およびGALR3のモジュレータを用いた癌の治療法:
本発明の別の態様によれば、癌または腫瘍およびそれと関連した症状を治療または制御する方法が提供される。結合化合物、例えば、上記したアッセイ系において同定されたもののいずれかを、腫瘍および癌(例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣癌)の症状を予防および/または改善する能力について試験できる。本明細書で使用される用語である阻害、制御、改善、予防、治療および抑制は、まとめておよび相互に交換可能に、癌の形成、進行または成長を停止または遅くすること、および癌の症状を無くすか、減少させることを意味する。本発明によれば、腫瘍および癌の症状を予防および/または改善する試験化合物の能力を評価するための、細胞系および動物モデルに基づくトライアルシステムを使用する。
【0223】
例えば、細胞系システムを、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣の腫瘍または癌の症状を改善する可能性のある化合物に暴露することができる。この場合、濃度と暴露の時間は、暴露された細胞においてそのような改善を引き出すのに十分な濃度と時間である。暴露後、細胞を、一つ以上の腫瘍または癌の表現型がより多くの正常またはより多くの野生型非癌状態表現型に似るように変更されたかどうかについて調べる。さらに、これらの細胞内のガラニン、GALR2またはGALR3のmRNA発現およびDNA増幅のレベルを、上記に記載した方法によって測定してもよい。発現および増幅の測定レベルが減少した場合には、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の診療がある程度うまくいっていることを示している。
【0224】
さらに、動物モデルを、腫瘍および癌の症状を治療または抑制できる薬剤および医薬として使用するための化合物を同定するために使用できる。例えば、動物モデルを、試験化合物に、暴露された動物においてこのような改善を引き出すのに十分な濃度および時間で暴露できる。この暴露に対する動物の反応は、腫瘍または癌と関連した症状の逆転を評価したり、DNAコピー数およびガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子のmRNA発現のレベルの変化を評価することにより、モニタリングすることができる。腫瘍および癌の症状を逆転および/または標的ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の過剰発現および増幅の減少を生じる治療は、ヒトにおける治療に使用できる候補と考えることができる。試験薬剤の投与量は、用量−応答曲線を得ることにより求めることができる。
【0225】
さらに、フィンガープリントパターンまたは遺伝子、遺伝子発現プロフィールを、細胞系および/または動物系モデルシステム内で、公知の細胞状態、例えば、正常または公知の前腫瘍性、腫瘍性または転移状態について特徴付けることができる。続いて、これらの公知のフィンガープリントパターンを比較して、このようなフィンガープリントパターンを修正したり、パターンを正常フィンガープリントパターンにさらに似るようにさせる、試験化合物の能力を確認することができる。例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子発現および増幅と相互作用し且つそれらに影響を及ぼす化合物を投与することにより、癌状態のモデルシステムのフィンガープリントパターンを、対照正常系により似るようにさせることができる。したがって、このような化合物は、癌の治療に利用できる。他の状況では、化合物を投与することにより、対照システムのフィンガープリントパターンを、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)に似はじめさせることができる。したがって、このような化合物は、発癌剤としての役割を果たし、ひいては、癌およびその診断の治療診療の標的としての役割を果たすことができる。
【0226】
E.癌治療の有効性のモニタリング方法:
本発明のさらなる態様によれば、癌の治療上の処置計画の有効性のモニタリング方法、および腫瘍の阻害についての臨床試験における化合物の有効性をモニタリングする方法が提供される。癌の治療または臨床試験のための処置計画の適用の過程の最中での種々の時点で患者から採取した生物学的試料において、ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の発現または増幅の変化レベルを検出および測定することにより、モニタリングをおこなうことができる。より前の日よりも、治療または臨床試験の後の時点で採取された試料において発現および/または増幅のレベルが低い場合には、処置計画が、患者における癌を制御するのに有効であるか、または化合物が腫瘍を阻害するのに有効であることを示している。時間的経過の検討は、処置計画または化合物がその効果を示すのに十分な時間がとれるように設計する必要がある。
【0227】
したがって、腫瘍および癌に対する化合物の影響は、臨床試験および基本的な薬剤スクリーニングの両方においてモニタリングできる。臨床試験では、例えば、腫瘍細胞を、外科手術で取り出した肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣の腫瘍から単離し、RNAを調製し、本明細書に記載のようなノーザンブロッティング分析またはTaqmanRT−PCRによるか、産生したタンパク質の量を測定することにより、分析できる。このようにして得られたフィンガープリント発現プロフィールは、肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣の腫瘍または癌のための推定バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。特に、ガラニン、GALR2またはGALR3の発現は、一つのこのようなバイオマーカーとしての役割を果たす。したがって、ガラニン、GALR2またはGALR3等の異なる形で発現された遺伝子または過剰発現した遺伝子の発現レベルをモニタリングすることにより、好適な化学療法抗癌剤を用いて、効果的な治療プロトコールを開発できる。
【0228】
F.癌治療におけるガラニン、GALR2またはGALR3のヌクレオチドに対するモジュレータの使用:
本発明のさらなる態様によれば、腫瘍の治療のためのさらなる化合物および方法が提供される。腫瘍および癌の症状は、例えば、標的遺伝子のモジュレーションによるか、および/または前癌状態または癌状態の細胞の枯渇により制御できる。標的遺伝子のモジュレーションは、標的が、遺伝子(例えば、発癌性)または腫瘍抑制遺伝子(例えば、腫瘍抑制性)に似ているかどうかによって、負または正であることができる。すなわち、癌遺伝子様標的遺伝子の阻害、すなわち、負のモジュレーション、または腫瘍サプレッサ様標的遺伝子の刺激、すなわち、正のモジュレーションは、標的遺伝子が関与する腫瘍または癌を制御または改善する。すなわち、「負のモジュレーション」は、モジュレーション処理の不存在下での標的遺伝子産物のレベルおよび/または活性に対しての、標的遺伝子またはその産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のレベルおよび/または活性の減少を意味する。「正のモジュレーション」は、モジュレーション処理の不存在下での標的遺伝子またはその産物のレベルおよび/または活性に対しての、標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のレベルおよび/または活性の増加を意味する。特に、ガラニン、GALR2またはGALR3は、上記で説明した周知の癌遺伝子と数多くの特徴が共通であるので、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子、そのタンパク質またはその活性の阻害により、癌状態、例えば、肺癌および/または脳腫瘍および/または乳癌および/または結腸癌および/または前立腺癌および/または卵巣癌が制御または改善される。
【0229】
本発明によれば、癌に関与しているガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子を阻害または抑制するための方法、すなわち、負のモジュレーション法が提供される。例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対して負のモジュレーション活性を示す化合物を本発明に使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の症状を予防および/または改善できる。このような分子として、ペプチド、ホスホペプチド、小分子(分子量:約500未満)、大分子(分子量:約500超)または抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体並びにFab、F(ab’)2およびFab発現ライブラリーフラグメントおよびそれらのエピトープ結合フラグメントを含む)、並びにガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の複製、転写または翻訳を妨害する核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子、siRNA、三重らせん形成分子、およびリボザイム(これらは、単独で使用しても、組み合わせて使用してもよい))を挙げることができるが、これらには限定されない。
【0230】
ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、siRNAおよびリボザイム分子は、標的遺伝子およびその産物の機能的活性のレベルを減少、例えば、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の触媒能力を減少できる。また、関連する三重らせん形成分子も、標的遺伝子の活性のレベルを減少するのに使用できる。これらの分子は、野生型または適切な場合は突然変異標的遺伝子活性を低減または阻害するように設計できる。
【0231】
例えば、アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAへのハイブリダイゼーション、およびタンパク質の翻訳の防止により、mRNAの翻訳を直接ブロッキングするように作用する。アンチセンスDNAについては、例えば、意図する標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10〜+10の領域の間の翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが、好ましい。
【0232】
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することができる酵素RNA分子である。これについては、Rossi,Current Biology,4:469−471(1994)において、検討されている。リボザイムの作用機構では、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション後に、内ヌクレオチド結合分解性切断がおこなわれる。リボザイム分子の組成には、標的遺伝子mRNAに相補的な一つ以上の配列が含まれ、且つmRNA切断を生じさせる周知の触媒配列が含まれなければならない(米国特許第5,093,246号明細書)。ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的タンパク質をコードしているRNA配列の内部切断を特異的且つ効率的に触媒することができる、人工的に作り出されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子を、本発明にしたがって癌診療に使用することができる。
【0233】
いずれかの可能性のあるRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、最初に意図する分子、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3のRNAを、以下の配列、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位についてスキャンニングすることにより、同定される。切断部位を含むガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の領域に相当する15〜20リボヌクレオチドの一旦同定された短RNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適当にすることがある二次構造等の予測構造特徴について評価することができる。候補配列の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接近性を試験することにより、評価することができる。
【0234】
また、ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子配列を、RNA干渉において用いることができる。RNA干渉の現象は、Bass,Nature,411:428−29(2001);Elbashir等、Nature,411:494−98(2001);およびFire等、Nature,391:806−11(1998)に記載され、考察されている。これらの文献では、干渉RNAの製造方法についても考察されている。本明細書に開示されている配列に基づくsiRNA(例えば、それぞれガラニン、GALR2およびGALR3のmRNA配列についてのGenBank寄託番号NM_003857およびNM_003614)は、典型的には長さおよび構成が100塩基対(「bp」)未満、好ましくは約30bp以下であり、相補的DNA鎖または合成法の使用を含む当技術分野において公知の方法により製造できる。干渉を生じることができるRNAは、小干渉RNA(「siRNA」)と称することができ、且つ細胞中、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中、および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内で特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じることができる。本発明による典型的なsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの周囲もしくはこれらの間のいずれかの数の塩基対を有する。
【0235】
三重鎖形態(三重らせん)において一緒に会合でき、これにより標的遺伝子の転写を阻害するのに使用できる核酸分子は、デオキシヌクレオチドからなる単一らせんでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、一般的に二本鎖のうちの一つの鎖上のプリンまたはピリミジンのかなり大きな伸長を必要とする、Hoogsteen塩基対合則により三重らせん形成を促進するように設計しなければならない。ヌクレオチド配列は、得られた三重らせんの3つの関連した鎖にわたってTATおよびCGCトリプレットを生じる、ピリミジン系であることができる。ピリミジンリッチ分子により、鎖に対して平行に配列した二本鎖のうちの一つの鎖のプリンリッチ領域に相補的な塩基が得られる。さらに、プリンリッチ、例えば、長く伸びたG残基を含む、核酸分子を選択できる。これらの分子は、プリン残基の大部分は、標的二本鎖のうちの一つの鎖上に位置しているGC対リッチであるDNA二本鎖とともに三重らせんを形成して、三重らせんにおける3つの鎖にわたってGGCトリプレットを生じる。別法として、三重らせん形成について標的とすることができる可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより増加できる。スイッチバック分子は、これらの分子が、二本鎖のうちの一つの鎖と塩基対を形成後、他の鎖と塩基対を形成するように、交互5’−3’、3’−5’法で合成して、二本鎖のうちの一つの鎖上のプリンまたはピリミジンのかなり大きな伸長の必要性をなくす。
【0236】
本明細書に記載されているアンチセンス、リボザイム、siRNAおよび三重らせん形成分子を使用して突然変異遺伝子発現を低減または阻害する場合には、正常標的遺伝子対立遺伝子により産生されるmRNAの転写(例えば、三重らせんを用いて)および/または翻訳(例えば、アンチセンス、リボザイム分子を用いて)を効果的に低減または阻害することもできる。これらの状況は、細胞または組織における正常レベルを、突然変異体が阻害されている状態で維持する必要がある腫瘍抑制遺伝子に関連している。これをするために、使用されるいずれかのアンチセンス、リボザイムまたは三重らせん形成分子による阻害に対して耐性があり、且つ正常標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし且つ発現する核酸分子を、遺伝子治療法により細胞に導入できる。別法として、標的遺伝子は、細胞外タンパク質をコードしているとき、正常標的遺伝子タンパク質を細胞または組織に共投与して細胞または組織標的遺伝子活性の必要レベルを維持するのが好ましいことがある。これに対して、ガラニン、GALR2またはGALR3等の癌遺伝子様標的遺伝子の場合には、抑制される必要のある、それぞれ正常野生型ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子およびそのタンパク質である。したがって、ガラニン、GALR2またはGALR3の機能を欠くか、またはその正常機能を妨害するか、完全に取り除く突然変異体または変異体が、癌治療には望ましい。したがって、正常遺伝子対立遺伝子を保護するための上記したのと同じ方法を、本発明に使用して、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん処理の適用において標的遺伝子の突然変異体を保護することができる。
【0237】
本発明によるアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイムおよび三重らせん形成分子は、DNA分子およびRNA分子の合成についての当技術分野において公知の標準的な方法により調製できる。これらには、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成等の当技術分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための方法などがある。別法として、RNA分子を、アンチセンスRNA分子をコードしているDNA配列の試験管内および生体内転写により生成できる。このようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーター等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターも含む多種多様なベクターに組み込むことができる。別法として、使用されるプロモーターに応じてアンチセンスRNAを構成的または誘発的に合成するアンチセンスcDNA構築物を、安定的に細胞系に導入できる。DNA分子に対する種々の周知の修飾を、細胞内安定性および半減期を増加するための手段として導入できる。可能な修飾として、分子の5’端および/または3’端へのリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2’O−メチルの使用などが挙げられるが、これらには限定されない。
【0238】
さらに、本発明のこの態様によれば、抗体を用いた負のモジュレーション法が提供される。両方とも標的遺伝子産物に特異的であるとともに、標的遺伝子産物活性を減少する抗体を、生成できる。これらは、負のモジュレーション法が、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の治療のためのガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体の場合において、腫瘍および癌の治療に適当であるときに、投与できる。
【0239】
抗体が指向している標的遺伝子タンパク質が細胞内のものであり、且つ抗体全体を使用する場合には、内在化抗体が好ましい。しかしながら、リポフェクチンまたはリポソームを使用して、抗体または標的遺伝子エピトープに結合するFab領域のフラグメントを、細胞に送達できる。抗体のフラグメントを使用する場合、タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に特異的に結合する抗体の可変領域のドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドを使用できる。このようなペプチドは、化学的に合成したり、当技術分野において周知の組み換えDNA法により製造できる(例えば、上記したCreighton,1983;および上記したSambrook等、1989参照)。別法として、細胞内標的遺伝子産物エピトープに結合する一本鎖中和抗体を、投与することもできる。このような一本鎖抗体は、例えば、Marasco等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:7889−7893(1993)に記載されているような方法を用いることにより、例えば、標的細胞集団内の一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を発現させることにより、投与できる。標的遺伝子タンパク質が細胞外であるか、または膜貫通型タンパク質である場合には、ペプチド投与に適切である当技術分野において公知の投与方法のいずれかを使用して、阻害標的遺伝子抗体を、それらの作用部位に効果的に投与できる。投与方法および医薬製剤については、以下に説明する。
【0240】
G.ガラニン、GALR2またはGALR3を用いた癌ワクチン:
本発明の一つの態様によれば、抗体および/またはT細胞免疫応答を生じさせて卵巣癌などの癌から哺乳動物を保護するのに十分なガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドまたはそのフラグメントを哺乳動物に接種することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を誘発する方法が提供される。
【0241】
本発明の別の態様によれば、ガラニン、GALR2またはGALR3のアミノ酸配列(例えば、配列番号8、配列番号4または配列番号2)に由来のペプチドが提供される。この態様から、当業者は、本発明によるペプチドまたはその類似体は、種々の製造業者により販売されている自動機器により合成でき、商業的に特注および作製されることができ、または上記したような好適な発現ベクターから発現できることを認識するであろう。「アミノ酸類似体」という用語は、すでに本明細書中で説明した。本発明によるペプチドを説明する目的では、類似体は、さらに分岐または非線状ペプチドをも含むことができる。
【0242】
したがって、本発明によれば、ワクチンおよび免疫療法に使用される、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、それに由来するタンパク質またはペプチドを含んでなる、医薬組成物が提供される。癌から哺乳動物を保護するためのワクチンとして使用するときには、前記医薬組成物は、免疫原として、組み換え発現ベクター、または発現されたタンパク質を含有する培養上清でトランスフェクションした細胞からの細胞溶菌液を含んでなることができる。別法として、免疫原は、部分的または実質的に精製された組み換えタンパク質または合成ペプチドである。
【0243】
ワクチン接種は、通常の方法によりおこなうことができる。例えば、免疫原を、生理食塩水もしくは水等の好適な希釈剤または完全もしくは不完全アジュバントに添加して使用できる。さらに、免疫原を、担体に結合してタンパク質免疫原性としてもよいし、しなくてもよい。このような担体分子としては、例えば、牛血清アルブミン(BSA)、スカシガイヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド等があるが、これらには限定されない。免疫原は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等の抗体の産生に好適な経路により投与できる。免疫原は、一度に投与してもよいし、または抗ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体の顕著な力価が得られるまで、定期的に投与してもよい。抗体は、免疫アッセイを用いて血清において検出できる。
【0244】
本発明の別の態様によれば、ガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質の宿主生体合成、またはガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質配列に由来するペプチドの宿主生体合成を導くことのできる核酸配列を含んでなる医薬組成物が提供される。このような核酸配列は、当業者に公知の方法により好適な発現ベクターに挿入することができる。生体内で高効率遺伝子転写を生じるために好適な発現ベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターなどがあるが、これらには限定されない。このような発現ベクターの作動要素は、本明細書において上記で開示してあり、且つ当業者には公知である。このような発現ベクターは、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口投与できる。
【0245】
免疫原が、ガラニン、GALR2、GALR3もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、それに由来するタンパク質、ペプチド、またはそれに由来するガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質またはペプチドの宿主生体合成を導くことができる核酸配列であるか否かにかかわらず、免疫原は、予防目的または治療目的で投与できる。このような予防目的での使用は、例えば、特定の癌に対する遺伝的素因を有する個体について好適なことがある。予防目的の場合には、免疫原は、癌の前または癌による症状がでる前に投与される。免疫原の予防投与は、続いての癌の兆候を予防したり、弱めたりする。治療目的では、免疫原を、癌の兆候または癌に関連した症状があった時点、または直後に投与する。
【0246】
さらに、本発明によれば、薬学的に許容される担体中に、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、タンパク質、またはガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質の宿主生体合成を導くことができる発現ベクターを含んでなる、哺乳動物、例えば、ヒトを免疫化するための癌ワクチンが提供される。
【0247】
ワクチンとして使用する他に、および免疫療法において、上記組成物を使用してガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する抗体を調製できる。抗体を調製するために、宿主動物を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、それに由来するタンパク質もしくはペプチド、またはそれに由来するガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質もしくはペプチドを発現できる上記した発現ベクターを用いて免疫化する。宿主の血清または血漿を、好適な時間間隔で採集して、ウイルス粒子と反応性の抗体を含んでなる組成物を得る。例えば、飽和硫酸アンモニウムもしくはDEAE Sephadexまたは当業者に公知の他の方法を用いて、ガンマグロブリン画分またはIgG抗体を得ることができる。抗体は、薬剤等の他の抗ウイルス剤と関連することがある副作用の多くを実質的に伴わない。
【0248】
可能性のある不都合な免疫系応答を最小限とすることにより、抗体組成物の宿主系との適合性をさらに高めることができる。これは、外来種抗体のFc部分の全てまたは一部を除去するか、宿主動物と同じ種の抗体、例えば、ヒト/ヒトハイブリドーマからの抗体を使用することにより達成できる。ヒト化抗体(すなわち、ヒトにおける非免疫原性)が、例えば、非ヒト抗体の免疫原性部分を対応するが非免疫原性である部分(すなわち、キメラ抗体)と置き換えることにより産生されることができる。このようなキメラ抗体は、一つの種からの抗体の反応性または抗原結合部分および異なる種からの抗体(非免疫原性)のFc部分を含んでいてもよい。キメラ抗体としては、例えば、非ヒト哺乳動物−ヒトキメラ、げっし類−ヒトキメラ、マウス−ヒトおよびラット−ヒトキメラなどがあるが、これらには限定されない(Cabilly等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439,1987;Nishimura等、Cancer Res.,47:999,1987;Wood等、Nature,314:446,1985;Shaw等、J.Natl.Cancer Inst.,80:15553,1988)。「ヒト化」キメラ抗体についての一般的な検討が、Morrison S.,Science,229:1202,1985およびOi等、BioTechniques,4:214,1986になされている。
【0249】
あるいは、抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体は、免疫原として抗イディオタイプ抗体を投与することにより誘発できる。上記した精製された抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体標本を使用して、宿主動物における抗イディオタイプ抗体を誘発するのが都合がよい。組成物は、好適な希釈剤に添加して宿主動物に投与される。投与、通常反復投与の後、宿主は、抗イディオタイプ抗体を産生する。Fc領域に対する免疫原性反応をなくするために、宿主動物と同じ種により産生された抗体を使用するか、投与抗体のFc領域を除去できる。宿主動物における抗イディオタイプ抗体の誘発の後、血清または血漿を除去して抗体組成物を得る。組成物は、上記したように、抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体について精製するか、アフィニティーマトリックスに結合した抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィー により精製できる。産生した抗イディオタイプ抗体は、コンフォメーションにおいて真正なガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗原と似ており、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を用いるよりもワクチンを調製するのに使用できる。
【0250】
動物において抗ガラニン、抗GALR2、抗GALR3または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体を誘発する手段として使用する場合、抗体を注射する方法は、補助剤を添加して、またはこれを添加せずに、生理的に好適な希釈剤に効果的な濃度で添加して、ワクチン接種の目的での使用と同様に、すなわち、筋肉内、腹腔内、皮下等で注射する。一回以上のブースタ注射をおこなうのが、望ましい。
【0251】
ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する抗体および抗イディオタイプ抗体の両方を生体内で使用する場合および診断に使用する場合、モノクローナル抗体を使用することが好ましいことがある。モノクローナル抗ガラニン、抗GALR2、抗GALR3または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体または抗イディオタイプ抗体は、当業者において公知の方法により産生できる(Goding,J.W.1983.「Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(モノクローナル抗体:原理および実際)」,Pladermic Press社NY、ニューヨーク、第56〜97頁)。ヒト−ヒトハイブリドーマを生成するために、ヒトリンパ球ドナーを選択する。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗原を有することが知られているドナーは、好適なリンパ球ドナーとしての役割を果たすことができる。リンパ球は、末梢血試料から単離することができる。またはドナーが脾臓摘出を受ける場合には、脾臓細胞を使用してもよい。エプスタイン‐バーウイルス(EBV)を使用して、ヒトリンパ球を不死化することができ、またはヒト融合パートナーを使用してヒト−ヒトハイブリドーマを生成できる。ペプチドでの一次試験管内免疫化を、ヒトモノクローナル抗体の生成に使用することもできる。
【0252】
H.化合物の医薬用途:
ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定された化合物を、腫瘍または癌を予防、治療または制御するために治療的に有効な投与量で患者に投与できる。治療的に有効な量とは、癌またはその症状の測定可能な程度の減少または解消を生じさせるのに十分である化合物の量を意味する。
【0253】
このような化合物の毒性および治療上の有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により、例えば、LD50(集団の50%を致死にいたらせる投与量)およびED50(集団の50%に治療的に有効な投与量)を求めることにより、決定できる。毒性作用と治療効果との間の投与量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用するとき、このような化合物を、罹患組織の部位を標的として正常細胞への損傷を最小限とし、これにより副作用を減少させる送達系を設計するときに、注意を払わなければならない。
【0254】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータを使用して、ヒトに使用するための投与量範囲を決定できる。このような化合物の投与量は、好ましくはほとんど毒性を有しないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形および投与経路に応じてこの範囲内で異なることができる。本発明の方法に使用される化合物については、治療に有効な投与量は、細胞培養アッセイから最初に推定できる。投与量は、動物モデルにおいて、細胞培養において測定されるIC50(症状の50%阻害が得られる試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲が得られるように決定することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定できる。
【0255】
本発明に使用される医薬組成物は、一種以上の生物学的に許容される担体または賦形剤を用いて標準的な方法により配合できる。化合物並びにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、配合し、例えば、経口、口内、直腸、非経口、外表皮、局所、経皮、皮下、筋肉内、鼻腔内、舌下、硬膜内、眼内、呼吸器官内、静脈内、腹腔内、鞘内、粘膜、経口吸入、鼻吸入または直腸投与等で投与できる。
【0256】
経口投与の場合、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤、例えば、前ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース;充填剤、例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム;滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ;崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンやナトリウムデンプングリコレート;または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを用いた通常の手段により調製した錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法により塗布できる。経口投与用の液剤は、溶液、シロップまたは懸濁剤の形態をとることができるし、またはこれらを、乾燥製品として供給して、使用前に水または他の好適なビヒクルを用いて構成することもできる。このような液剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂;乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシア;非水性ビヒクル、例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコールまたは分別植物油;および保存剤、例えば、メチル−p−ヒドロキシベンゾエート、プロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を用いて通常の手段により調製できる。また、製剤は、必要に応じて緩衝塩、矯味・矯臭剤、着色剤および/または甘味剤を含有してもよい。経口投与用製剤は、好適には活性化合物が制御されて放出されるように配合することができる。
【0257】
吸入投与の場合、化合物を、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用した加圧パックまたは噴霧器からエアゾールスプレー供給の形態で送達させるのが都合がよい。加圧エアゾールの場合、一回あたりの投与量は、計量した量を送達するためのバルブを設けることにより決定できる。吸入器またはインサフレーターに使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジ(化合物と好適な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有)を、配合できる。
【0258】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続点滴による非経口投与のために配合できる。注射用の配合は、保存剤を添加した、単位投与量の形態、例えば、アンプルまたは多投与コンテナーで供給できる。組成物は、油状または水性ビヒクルを用いた懸濁剤、溶液または乳剤のような形態をとることができ、処方剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、粉末状として、使用前に好適なビヒクル、例えば、無菌無ピロゲン水を用いて構成できる。また、化合物は、直腸組成物、例えば、通常の坐剤基剤、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含有する座剤または停留浣腸に配合できる。
【0259】
さらに、化合物は、デポー製剤として配合することもできる。このような長時間作用配合物は、移植(例えば、皮下または筋肉内)によるか、または筋肉内注射により投与できる。したがって、例えば、化合物を、好適な高分子または疎水性物質(例えば、許容できる油における乳剤として)またはイオン交換樹脂と配合したり、またはやや溶け難い誘導体、例えば、やや溶け難い塩として配合できる。
【0260】
必要に応じて、組成物は、活性成分を含有する一つ以上の単位投与量形態を含むことができるパックまたはディスペンサ装置で供給できる。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えば、ブリスターパックを含んでなることができる。パックまたはディスペンサ装置には、投与のための説明書をつけることができる。
【0261】
I.siRNA/shRNAの投与:
本発明には、siRNAを、それを必要としている患者に投与する方法が包含される。この方法では、siRNA/shRNA分子を、裸オリゴヌクレオチドの形態で送達するか、または本明細書に記載の発現ベクターを介して送達される。
【0262】
本発明によれば、裸DNA、または標的遺伝子と相互作用し、細胞、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じる、本明細書に記載のsiRNA/shRNAを含むベクター(例えば、例IX参照)を投与することによる、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の生体内発現をブロックする方法が提供される。
【0263】
また、本発明によれば、本発明による裸DNAまたはベクターを投与することによる、生体外での細胞の処理方法が提供される。
【0264】
その生体内または生体外治療用途においては、トランスフェクションまたは感染により細胞に入るウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いてsiRNA/shRNAを投与するのが適当である。特に、本発明による治療用品として、ベクターは、アデノウイルス等の欠損ウイルスベクター、またはマウスレトロウイルス等の欠損レトロウイルスベクターであることができる。
【0265】
本発明による遺伝子構築物をその標的に運搬するのに使用されるベクターは、借物キャプシドにより組み換え構築物を運搬し、遺伝物質を宿主細胞のDNAに挿入する、レトロウイルスベクターであることができる。
【0266】
遺伝物質を標的細胞に運搬するベクター、特にウイルスベクター(レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス)を使用する方法を用いて、遺伝的修飾を種々の体組織、例えば、乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、脳細胞、前立腺細胞または卵巣細胞に導入できる。
【0267】
遺伝物質を輸送するのにレトロウイルスベクターを使用するには、一方では、組み換えレトロウイルスの遺伝的構築を実施すること、および他方では、輸送されるべき遺伝物質の包膜機能を提供する有効な細胞系を有することが必要である:
【0268】
i.第一段階において、遺伝子工学の手法により、マウスレトロウイルス、例えば、モロニーウイルス(マウス白血病ウイルス群に属するマウスレトロウイルス(Reddy等、Science,214:445−450(1981))のゲノムを可能にする。レトロウイルスゲノムを、プラスミドベクターにクローニングし、次にそこから構造タンパク質をコードする全てのウイルス配列(遺伝子:Gag、Env)だけでなく、酵素活性をコードしている配列(遺伝子:Pol)も、欠失させる。その結果、複製、転写および組み込みに必要な配列「in cis」のみが、保持される(2つのLTR領域、包膜シグナルおよびプライマー結合シグナルに相当する配列)。欠失された遺伝子配列は、非ウイルス遺伝子、例えば、ネオマイシンに対する耐性用遺伝子(真核細胞用選択抗生物質)によるか、レトロウイルスベクターにより輸送されるべき遺伝子(例えば、本明細書で記載されているようなガラニンおよび/またはGALR2および/またはGALR3のsiRNAにより置き換えることができる。
【0269】
ii.第二段階において、得られたプラスミド構築物を、トランスフェクションにより包膜細胞に導入する。これらの細胞は、構成的にGag、PolおよびEnvウイルスタンパク質を発現するが、これらのタンパク質をコードするRNAは、その包膜化に必要とするシグナルを欠いている。その結果、RNAは、包膜化してウイルス粒子が形成することができない。トランスフェクションしたレトロウイルス構築物から生じる組み換えRNAのみが、包膜シグナルを備え、包膜される。この系により産生したレトロウイルス粒子は、標的細胞(例えば、CD34+細胞)の感染、およびこれらの細胞への意図する遺伝子の永久的組み込み、例えば、本明細書に記載されているガラニンおよび/またはGALR2および/またはGALR3のsiRNA、に必要な全ての要素を含む。Gag、PolおよびEnv遺伝子が存在しないと、系が増殖し続けることが防止される。
【0270】
アデノウイルス等のDNAウイルスも、この方法に適している。但し、この場合、自立レプリコンの形態でのエピソーム状態でDNAを維持する可能性が、最も高い。
【0271】
アデノウイルスは、いくつかの有利な特性を有している。特に、アデノウイルスは、宿主範囲がかなり広く、静止細胞に感染することができ、且つ感染細胞のゲノムに組み込まれない。これらのことから、アデノウイルスは、既に生体内での遺伝子の導入に使用されている。この目的のために、種々の遺伝子を組み込んだ、アデノウイルス由来の種々のベクターが調製された(ベータ−gal、OTC、アルファ−1At、サイトカイン等)。増殖の危険と、生体内での感染粒子の生成を制限するために、使用されるアデノウイルスは、一般的に、それらが感染細胞において複製できないように修飾される。したがって、使用されるアデノウイルスでは、一般的に、E1(E1aおよび/またはE1b)およびおそらくE3領域が欠失状態とされる。
【0272】
本発明による欠損組み換えアデノウイルスは、当業者おいて公知のいずれかの方法により調製できる(Levrero等、Gene,101:195(1991),EP185573;Graham,EMBO J.3:2917(1984))。特に、これらは、好適な細胞系においてアデノウイルスとプラスミドとの間の相同的組み換えにより調製できる。
【0273】
本発明によれば、外来DNA配列、例えば、本明細書に記載のガラニンおよび/またはGALR2および/またはGALR3のsiRNAは、欠損組み換えアデノウイルスのゲノムに挿入される。
【0274】
上記したような欠損組み換え体等の一つ以上のウイルスベクターを含んでなる医薬組成物は、局所的、経口的、非経口的、鼻腔内的、静脈内的、筋肉内的、皮下的、眼内的等の投与目的のために配合することができる。好ましくは、これらの組成物は、投与可能な製剤について薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に等張無菌生理食塩水(リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等またはこのような塩の混合物のもの)、または必要に応じて滅菌水または生理食塩水を添加すると特定の注射可能溶液を調製できる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。
【0275】
注射用の欠損組み換えウイルスの投与量は、種々のパラメータ、特に使用される投与形態、問題の病状、発現されるべき遺伝子、または所望の治療期間にしたがって適合させることができる。一般的に、本発明による組み換えアデノウイルスを、104〜1014pfu/ml、好ましくは106〜1010pfu/mlの投与形態で配合および投与できる。用語pfu(「プラーク形成単位」)は、ウイルスの溶液の感染力に相当し、好適な細胞培養の感染、および感染細胞のプラークの数を一般的に48時間後に測定することにより測定される。ウイルス溶液のpfu力価の測定法は、文献に詳細に記載されている。
【0276】
修飾遺伝物質を輸送するためのシャトル系として遺伝子組み換えウイルスを使用すると、遺伝物質が、借物ウイルスキャプシドを使用する手段によりレシピエント細胞に入ることができるだけでなく、多数の細胞を同時且つ短時間で処理でき、治療的処置を全身に適用できる。
【0277】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
【実施例】
【0278】
例I:肺腫瘍および肺癌細胞系におけるGALR3遺伝子の増幅:
表4において、原発性肺癌試料におけるDNAコピー数を、Taqman7700および7900Sequence Detectorを用いて測定した。ゲノムDNAを、肺腫瘍および肺癌細胞系から単離した。合計76の原発性肺癌細胞系および16の肺癌細胞系を、標的を表す同様のGALR3およびGALR2 Taqmanプローブ並びにゲノムにおける正常非増幅単一コピー領域を表す標準プローブとともに、製造業者のプロトコールに準じて、TaqMan7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)により分析した。76の試験原発性肺腫瘍のうち、21および18が、それぞれGALR3およびGALR2について5倍以上高かった。カットオフとして2.5倍を用いたところ、試料76のうち34が、GALR2およびGALR3の両方についてコピー数の増加を示した。16の試験肺癌細胞系のうち、colo699が、GALR3遺伝子について2.5倍超増幅した唯一のものであった。機器の検出限界のため、2.5倍に等しいか、それを超えるGALR3遺伝子コピー数を有する試料のみが増幅されたとみなされる。しかしながら、検出された場合には、2.5倍未満のGALR3遺伝子コピー数の増加は、まだ遺伝子の増幅として考えることができる。
【0279】
【表4】
【0280】
例II:肺腫瘍および癌細胞系におけるGALR3およびGALR2遺伝子の過剰発現:
逆転写酵素(RT)指向定量PCRを、TaqMan7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)を用いておこない、各試料におけるGALR3およびGALR2mRNAレベルを測定した。ヒトベータアクチンmRNAを、対照として使用した。
【0281】
総RNAを、Trizol試薬(Invitrogen社)を用いてヒト肺腫瘍および肺腫瘍細胞系から単離し、DNAase(Ambion社)で処理してゲノムDNAを除去した。逆転写酵素反応(48℃で30分間)を、製造業者(Perkin Elmer社/Applied Biosystems社)の説明書にしたがって1チューブフォーマットでcDNAコピー数の定量的PCR測定と結合させた。試料中のGALR3およびGALR2発現レベルを、ヒトβ−アクチンを用いて標準化し、腫瘍試料におけるGALR3およびGALR2の発現と正常試料におけるGALR3およびGALR2の発現を比較することにより、過剰発現倍率を算出した。GALR3およびGALR2のヌクレオチド配列を使用して、GenBank寄託番号NM_003614(GALR3)およびNM_003857(GALR2)の配列に基づく好適なTaqmanプローブを設計する。各原発性腫瘍試料および腫瘍細胞系試料のmRNAレベルの測定値を、それぞれの正常肺組織および正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞系におけるmRNAレベルに標準化した。mRNAレベルの相対数値を、表5および表6に示す。表5に示す試験した10の肺腫瘍の全てが、GALR3遺伝子増幅を欠く試料LU44を含む、異なる程度でGALR3およびGALR2を過剰発現する。11の肺癌細胞系の試験(表6)のうち、11の全てが、GALR3を過剰発現し、11のうちの7が、5倍以上でGALR2を過剰発現する。遺伝子の増幅を付随せずGALRメッセージが過剰発現するのは、癌遺伝子、例えばc−myc(Yoshimoto等、Jpn.J.Cancer Res.77,540−545(1986))およびAIB1(Anzick等、Science 277,965−968(1997))の特質によく似ている。
【0282】
【表5】
【0283】
【表6】
【0284】
例III:ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子およびGALR3遺伝子を含有するアンプリコンの物理的地図:
癌細胞系または原発性腫瘍を、遺伝子のDNAコピー数およびGALR3、GALR2およびガラニン付近のマーカーについて調査して増幅領域の境界についての地図を作成した。GALR3、GALR2およびガラニンが、増幅領域の中心点に位置していることが明らかである(図1、図2および図3)。
【0285】
DNAを、腫瘍細胞系または原発性腫瘍から精製した。各試料における各マーカーのDNAコピー数を、PCRおよび蛍光標識プローブを用いて直接測定した。種々の濃度での試料腫瘍DNA標本および一連の正常ヒトDNA標本における、Ct値としても知られている設定しきい値を超えるのに必要とするPCRサイクル数を、標的プローブおよび公知の単一コピーDNAプローブの両方について、Applied Biosystems7700TaqMan機械を用いて測定した。次に、各試料における単一コピープローブに対する標的配列の相対的存在度を、未知の試料のCt値の統計的解析、および種々の濃度での正常ヒトDNA標本から得た標準曲線により算出した。
【0286】
遺伝子の各々についてのDNAコピー数を測定するために、各マーカーに対応するプローブを、PrimerExpress1.0(Applied Biosystems社)を用いて設計し、Operon Technologiesにより合成した。続いて、標的プローブ(マーカーを表す)、標準プローブ(ゲノムにおける正常非増幅単一コピー領域を表す)および腫瘍ゲノムDNA(10ng)を、製造業者のプロトコールに準じて、Applied Biosystems7700TaqMan Sequence Detectorにより、解析した。各試料についての、DNAコピーの数は、図1、図2および図3において対応のマーカーに対してプロットした。図は、GALR3、GALR2およびガラニン遺伝子座を含む、22q13、17q25および11q13アンプリコンの中心点マッピングを示す。各試料についてのDNAコピー数を、Y軸上にプロットする。X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【0287】
図1(GALR3)において、Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づく、3つのヒトゲノムDNAクローンを示す(Z83844、Z97630およびAL022311)。但し、図示してあるのは、実際のクローンサイズのスケールではない。これらの3つのゲノム配列を有するサイズが約200kbである中心点が、完全に含まれている。7つのマーカーを、X軸上に等間隔(実際の距離のスケールではない)で配置して観察できるようにしている。
WA3(ゲノムDNAクローンAL022315の塩基643〜714);WA2(ゲノムDNAクローンZ83844の塩基488〜562);WA17(ゲノムDNAクローンZ83844の塩基65146〜65214);WA12(Z83844の塩基131949〜132033);WA15(Z97630の塩基31437〜31502);WA16(AL022311の塩基16961〜17057);WA4(AL022311の塩基69682〜69745)。
【0288】
図2(GALR2)において、Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づく、3つのヒトゲノムDNAクローンを示す(AC021162、AC040980およびAC015801)。但し、図示してあるのは、実際のクローンサイズのスケールではない。GALR2遺伝子は、矢印で示されている。GA4B(ヒトゲノムDNAクローン寄託番号AC021162の塩基10540〜10640);GA3B(AC021162の塩基196815〜196875);GALR2(AC040980の塩基131772〜131823);GALR2B(AC040980の塩基130310〜130362);GA2B(AC040980の塩基4642〜4706);GA1(AC015801の塩基171〜245)。
【0289】
図3に、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づく、ガラニン遺伝子を含む11q13での中心点を示す。各試料についてのDNAコピー数を、Y軸上にプロットする。X軸は、ヌクレオチド位置に対応する。サイズが約150kbの中心点が、点線で示す3つのオーバーラップヒトゲノムDNAクローン内に含まれる(左から右方向へ:AP001075、AP001788、AP003732)。14のマーカーには、以下のものが含まれる(左から右方向へ):GR4(100kb);GR21(200kb);GR3(295kb);GR1(365kb);GR22(395kb);GR7(425kb);GR8(428kb);GR9(432kb);GAA(435kb);GR5(490kb);GR24(560kb);GR24A(570kb);GR6(740kb);GR25(750kb)。
【0290】
例IV:肺腫瘍におけるガラニン遺伝子の増幅および過剰発現:
遺伝子増幅用ゲノムを調査するためのDNAマイクロアレイに基づくCGHに基づいて、ガラニン遺伝子が、腫瘍組織において高い頻度で増幅することが判明した。
【0291】
ゲノムDNAを、腫瘍試料から単離した。これらを、標的を表す同様のガラニンTaqManプローブおよびゲノムにおける正常非増幅単一コピー領域を表す標準プローブとともに、製造業者のプロトコールに準じて、TaqMan7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)により分析した。77の試験原発性肺腫瘍のうち、54が、ガラニンについてコピー数の増加を示すことが判明した。
【0292】
総RNAを、Trizol試薬(Invitrogen社)を用いてヒト肺腫瘍および肺腫瘍細胞系から単離し、DNAase(Ambion社)で処理してゲノムDNAを除去した。逆転写酵素反応(48℃で30分間)を、製造業者(Perkin Elmer社/Applied Biosystems社)の説明書にしたがって1チューブフォーマットでcDNAコピー数の定量的PCR測定と結合させた。試料中のガラニン発現レベルを、ヒトβ−アクチンを用いて標準化し、腫瘍試料におけるガラニンの発現と正常試料におけるガラニンの発現を比較することにより、過剰発現倍率を算出した。ガラニンのヌクレオチド配列を使用して、GenBank寄託番号A28025の配列に基づく好適なTaqmanプローブを設計する。各原発性腫瘍試料および腫瘍細胞系試料のmRNAレベルの測定値を、それぞれの正常肺組織および正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞系におけるmRNAレベルに標準化した。mRNAレベルの相対数値を、表7に示す。表5に示す試験した10の肺腫瘍の全てが、GALR3遺伝子増幅を欠く試料LU44を含む、異なる程度でGALR3およびGALR2を過剰発現する。50の試験試料(表7参照)のうち、39が、ガラニンを過剰発現する。遺伝子の増幅を付随せずガラニンメッセージが過剰発現するのは、癌遺伝子、例えばc−myc(Yoshimoto等、Jpn.J.Cancer Res.77,540−545(1986))およびAIB1(Anzick等、Science 277,965−968(1997))の特質によく似ている。
【0293】
【表7】
【0294】
例V:ガラニン遺伝子用動物腫瘍形成性アッセイ:
ガラニン前駆体または空きベクター(pLPC)を、レトロウイルスを介してげっし類C8細胞にトランスフェクションした(図4参照)。薬剤選択後、細胞を集め、5匹の裸胸腺欠損マウスに注射して腫瘍形成について観察した(マウス1匹あたり細胞250,000個)。C8細胞由来腫瘍増殖の明瞭な増加が、ガラニントランスフェクション体において検出された。35日目での後注射により、ガラニンC8細胞を有する5匹全てのマウスが腫瘍を生じた(図4B参照)のに対して、ベクターC8細胞を注射したマウス5匹のうち2匹だけが、腫瘍を生じた(図4A参照)。得られた結果は、ガラニンC8トランスフェクション体は、動物における腫瘍形成性を高めることを示している。また、得られた結果から、ガラニンの過剰発現は、動物における宿主細胞の腫瘍形成性を高めることが分かり、このことは、ガラニンが癌遺伝子であることを示している。
【0295】
例VI:結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍におけるガラニン/GALR2/GALR3遺伝子の増幅および過剰発現:
表8において、原発性の結腸癌試料、前立腺癌試料および卵巣癌試料におけるDNAコピー数を、Taqman7700および7900Sequence Detectorを用いて測定した。ゲノムDNAを、結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍から単離した。原発性の結腸腫瘍試料、前立腺腫瘍試料および卵巣腫瘍試料を、標的を表す上記したガラニンまたはGALR2もしくはGALR3 Taqmanプローブセット並びにゲノムにおける正常非増幅領域を表す標準プローブとともに、製造業者のプロトコールに準じて、Taqman7700または7900Sequence Detectorにより分析した。ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子およびGALR3遺伝子についてのコピー数の増加が、試験した原発性の結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍にみられた(表8参照)。
【0296】
総RNAを、Trizol試薬(Gibco社)を用いて、ヒトの結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍から単離した。培養正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞系(Clonetics社)のRNAを、Trizol試薬を用いて調製した。逆転写酵素(RT)指向定量PCRを、Taqman7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)を用いておこない、各試料におけるガラニン、GALR2およびGALR3mRNAレベルを測定した。ヒトベータアクチンmRNAを、対照として使用した。ガラニン、GALR2およびGALR3のヌクレオチド配列を使用して、本明細書にあげた配列に基づく好適なTaqmanプローブを設計した。各原発性腫瘍および腫瘍細胞系試料のmRNAレベルの測定値を、正常な結腸組織、前立腺組織および卵巣組織およびNHBEにおけるそれぞれのmRNAレベルに標準化した。ガラニン、GALR2およびGALR3の過剰発現が、試験した原発性の結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍において検出された(表8参照)。
【0297】
【表8】
【0298】
例VII:ヒト肺癌細胞系であるEPLC−272Hの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)分析:
ヒト肺癌細胞系であるEPLC−272HのFISH分析を、当技術分野において周知の方法を用いておこなって(例えば、Heng等、Cytogenetic Cell Genet,93:195,2001;Angerer,Meth.Enzymol.,152:649,1987参照)プレプロガラニン遺伝子の増幅を測定した。相間染色体スライドを、通常の方法により調製した(例えば、HengおよびTsui,Chromosoma 102:325,1993参照)。複数の陽性シグナルを、ヒトプレプロガラニン遺伝子を含有するBACクローンであるプローブ2007L18を用いて検出した。ヒトゲノムの未増幅領域を表す対照プローブ282H10の場合、中性シグナルがみられた。細胞系EPLC−272HのFISH分析により、プレプロガラニン遺伝子が増幅したことが分かった。
【0299】
例VIII:プレプロガラニンの過剰発現が、ヌードマウスにおけるEPLC−272H細胞の腫瘍形成性を高める:
プレプロガラニンを過剰発現するEPLC−272H細胞のレトロウイルストランスフェクション体を、生成した。5百万個の細胞を、5匹の胸腺欠損ヌードマウスの各々に皮下移植した。14日目での後注射で、プレプロガラニン遺伝子を有する5匹全てのマウスが、種々のサイズの腫瘍が生じた。14日目に達する前に、1匹のマウスが死亡した。一方、14日目で、対照細胞(ベクター−EPLC−272H)(表9参照)を注射した5匹のマウスには、目にみえる腫瘍は検出されなかった。これらの結果から、プレプロガラニン−EPLC−272Hトランスフェクション体がヌードマウスの腫瘍形成性を高めることが明らかである。得られた結果から、ガラニンの過剰発現により、動物における宿主細胞の腫瘍形成性が高まることも明らかである。このことは、ガラニンが癌遺伝子であることを示している。
【0300】
【表9】
【0301】
例IX:小干渉RNA(siRNA):
センスおよびアンチセンスsiRNA二本鎖は、本明細書に開示されているDNA配列の標的領域(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号7またはそのフラグメント)に基づいて作製され、典型的には長さおよびコンスティチュエンシーが100塩基対(「bp」)未満であり、好ましくは約30bp以下であり、相補的DNA鎖を使用することを含む当技術分野において公知の方法または合成方法により作製する。ペプチド核酸等のポリ核酸修飾法を用いたsiRNA誘導体も、本発明により用いることができる。siRNAは、妨害を生じることができ、細胞、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において、特定遺伝子の後転写抑制を生じることがある。本発明による典型的なsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpを有する。
【0302】
標的領域は、DNA配列(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号7またはそのフラグメント)から選択される。標的領域の選択およびsiRNAオリゴ、例えば、5’または3’UTRの設計に、種々の方法を利用でき、開始コドンの近くの領域は、これらが調節タンパク質結合部位においてより含量が多い場合があるので、避けなければならない。設計された配列は、好ましくはAA−(N27以下のヌクレオチド)−TTを含み、G/C含量が約30%〜70%である。好適な配列がみられない場合には、フラグメントサイズを、配列AA(N29ヌクレオチド)に延長する。センスsiRNAの配列は、それぞれ例えば、(N27ヌクレオチド)−TTまたはN29ヌクレオチドに相当する。後者の場合、センスsiRNAの3’端を、TTに転化する。この配列を転化する理由は、センスおよびアンチセンス3’オーバーハングの配列組成に関して対称的な二本鎖を生成することにある。対称的3’オーバーハングにより、センスとアンチセンスの標的RNA切断siRNPがほぼ等しい比で形成される、小干渉リボヌクレオタンパク質粒子(siRNP)が確実に形成されやすくなると思われる(Elbashir等、Genes&Dev.15:188−200,2001)。
【0303】
GALR3siRNA:センスまたはアンチセンスsiRNAを、本明細書に開示されているDNA配列(配列番号1参照)の標的領域に基づいて合成する。これらのsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpのフラグメントを含む。例えば、29bpのsiRNAには、
【0304】
標的領域(塩基位置番号2〜30、配列番号10)
5’−TGGCTGATGCCCAGAACATTTCACTGGAC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号11)
5’−UGGCUGAUGCCCAGAACAUUUCACUGGAC−3’;
標的領域(塩基位置番号3〜31、配列番号12)
5’−GGCTGATGCCCAGAACATTTCACTGGACA−3’および
対応センスsiRNA(配列番号13)
5’−GGCUGAUGCCCAGAACAUUUCACUGGACA−3’;
標的領域(塩基位置番号4〜32、配列番号14)
5’−GCTGATGCCCAGAACATTTCACTGGACAG−3’および
対応センスsiRNA(配列番号15)
5’−GCUGAUGCCCAGAACAUUUCACUGGACAG−3’;およびこの連鎖で、GALR3コード配列の終わりまで継続する、例えば、
標的領域(塩基位置番号1071〜1099、配列番号16)
5’−CGTCCACGGCGGAGAGGCTGCCCGAGGAC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号17)
5’−CGUCCACGGCGGAGAGGCUGCCCGAGGAC−3’;並びに本明細書に記載されているもの等
が含まれる。
【0305】
GALR2siRNA:センスまたはアンチセンスsiRNAを、本明細書に開示されているDNA配列(配列番号3参照)の標的領域に基づいて合成する。これらのsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpのフラグメントを含む。例えば、29bpのsiRNAには、
【0306】
標的領域(塩基位置番号2〜30、配列番号18)
5’−TGAACGTCTCGGGCTGCCCAGGGGCCGGG−3’および
対応センスsiRNA(配列番号19)
5’−UGAACGUCUCGGGCUGCCCAGGGGCCGGG−3’;
標的領域(塩基位置番号3〜31、配列番号20)
5’−GAACGTCTCGGGCTGCCCAGGGGCCGGGA−3’および
対応センスsiRNA(配列番号21)
5’−GAACGUCUCGGGCUGCCCAGGGGCCGGGA−3’;
標的領域(塩基位置番号4〜32、配列番号22)
5’−AACGTCTCGGGCTGCCCAGGGGCCGGGAA−3’および
対応センスsiRNA(配列番号23)
5’−AACGUCUCGGGCUGCCCAGGGGCCGGGAA−3’;およびこの連鎖で、GALR2コード配列の終わりまで継続する、例えば、
標的領域(塩基位置番号1132〜1160、配列番号24)
5’−GGCGACAGCATCCTGACGGTTGATGTGGC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号25)
5’−GGCGACAGCAUCCUGACGGUUGAUGUGGC−3’;並びに本明細書に記載されているもの等
が含まれる。
【0307】
ガラニンsiRNA:センスまたはアンチセンスsiRNAを、本明細書に開示されているDNA配列(配列番号7参照)の標的領域に基づいて合成する。これらのsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpのフラグメントを含む。例えば、29bpのsiRNAには、
【0308】
標的領域(塩基位置番号15〜43、配列番号26)
5’−TGGCCCGAGGCAGCGCCCTCCTGCTCGCC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号27)
5’−UGGCCCGAGGCAGCGCCCUCCUGCUCGCC−3’;
標的領域(塩基位置番号16〜44、配列番号28)
5’−GGCCCGAGGCAGCGCCCTCCTGCTCGCCT−3’および
対応センスsiRNA(配列番号29)
5’−GGCCCGAGGCAGCGCCCUCCUGCUCGCCU−3’;
標的領域(塩基位置番号17〜45、配列番号30)
5’−GCCCGAGGCAGCGCCCTCCTGCTCGCCTC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号31)
5’−GCCCGAGGCAGCGCCCUCCUGCUCGCCUC−3’;およびこの連鎖で、ガラニンコード配列の終わりまで継続する、例えば、
標的領域(塩基位置番号353〜381、配列番号32)
5’−GCAGCCTCCTCAGAAGACATCGAGCGGTC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号33)
5’−GCAGCCUCCUCAGAAGACAUCGAGCGGUC−3’;並びに本明細書に記載されているもの等
が含まれる。
【0309】
本明細書に記載されているように、GALR3、GALR2およびガラニンのオリゴは、設定基準に基づいて設計することもできる。3’端に「C」を含む29bp「センス」配列(例えば、GALR3コード配列の塩基位置番号2で開始する標的領域)は、GALR3コード配列(配列番号1)から選択されることができる。終止配列(例えば、AAAAAA、配列番号34)、GALR3アンチセンス配列、ループ(例えば、GAAGCTTG、配列番号35)および逆プライマー(例えば、U6逆プライマー、GGTGTTTCGTCCTTTCCACAA、配列番号36)を、続いて29bpセンス鎖に付加してGALR3 PCRプライマーを構築することができる(例えば、Paddison等、Genes&Dev.16:948−958,2002参照)。勿論、他のセンスおよびアンチセンス配列を、標的分子から選択してその分子についてのsiRNAを構築できる。
【0310】
典型的な実施態様を示しながらの説明、具体的な実施例およびデータは、説明のために示したものであり、本発明を限定するものではない。本発明の範囲内の種々の変化および修正は、本明細書に含まれる考察、開示およびデータから当業者には明らかであり、本発明の一部分と考えられる。
【0311】
配列情報
【表10】
【図面の簡単な説明】
【0312】
【図1】図1は、GALR3の遺伝子座を含む、ヒト染色体領域22q13アンプリコンの中心点マップを示す。各試料についてのDNAコピー数がY軸上にプロットされており、X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【図2】図2は、GALR2の遺伝子座を含む、ヒト染色体領域17q25アンプリコンの中心点マップを示す。各試料についてのDNAコピー数がY軸上にプロットされており、X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【図3】図3は、ガラニンの遺伝子座を含む、ヒト染色体領域11q13アンプリコンの中心点マップを示す。各試料についてのDNAコピー数がY軸上にプロットされており、X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【図4】図4は、ガラニン遺伝子についての動物の腫瘍形成性アッセイを示す。図4Aは、ベクターC8細胞を用いた対照実験についてのものであり、図4Bは、ガラニンC8細胞を有するマウスの結果を示したものである。ガラニンC8細胞を有する5匹全てのマウスにおいて腫瘍が生じた。
【0001】
1.発明の分野
本発明は、癌遺伝子並びに癌の診断および治療に関する。より詳細には、本発明は、一定の種類の癌に関与する、増幅および過剰発現したガラニン遺伝子、ガラニン受容体2(GALR2)遺伝子およびガラニン受容体3(GALR3)遺伝子に関する。また、本発明は、腫瘍形成中の機能的に重要なGALR2−GALR3ヘテロ複合体の形成に関する。本発明は、増幅した遺伝子、それらのコードされたタンパク質、および抗体、インヒビター、活性化剤等、並びに乳癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌を含む癌の診断、ワクチンおよび抗癌療法におけるそれらの使用に関する。
【0002】
2.発明の背景
癌および遺伝子の増幅:
癌は、米国において、心疾患に続く第二位の死亡原因であり(Boring等、CA Cancer J.Clin.,43:7,1993)、アメリカ人の3人に1人が発病する。アメリカ人の4人に1人が癌で死亡する。癌の特徴は、細胞の増殖が無制御状態で生じ、これにより、正常組織の局部的な浸潤または異常増殖の全身的広がりが生じる。特定の種類の癌または特定の段階の癌の発病は、これらの両方を含むことがある。
【0003】
生体において機能している種々の組織における細胞の分裂または増殖は、通常は秩序正しく、且つ、制御された方法で生じる。これは、とりわけ、接触、シグナル伝達、および隣接細胞間の他のコミュニケーションを含む、繊細な増殖制御機構により可能となる。機能する組織においては、通常、成長シグナル(促進または阻害)が細胞間で交換される。細胞は、通常、促進シグナルの不存在下では分裂せず、阻害シグナルが優位となったときに分裂が停止する。しかしながら、このようなシグナル伝達またはコミュニケーションは、癌細胞では不良であるか、完全に停止する。その結果、細胞は分裂し続け、隣接する構造体に侵入し、最初の腫瘍塊から独立し、身体の他の部分で新たな増殖をおこなう。悪性疾患における後者の進行は、「転移」と称される。
【0004】
癌は、一般的に、良性腫瘍ではなく悪性腫瘍と称される。良性腫瘍細胞は、正常な周囲細胞に類似している。これらの種類の腫瘍は、ほとんど常に線維性被膜に封入されており、身体の他の部分に転移する可能性がない。これらの腫瘍は、局所器官に影響を及ぼすが、これらの器官を破壊はしない。これらは、通常、長年の間、症状なしで小さいままの状態で存在する。治療は、腫瘍が他の器官を妨害する程度に大きく成長したときにのみ必要となる。これに対して、悪性腫瘍は、良性腫瘍の増殖速度よりも速く成長し、局所組織に浸透してこれを破壊する。ある種の悪性腫瘍は、血液またはリンパ系を通って体全体に広がることがある。予測ができず、且つ、無制御の増殖のため、悪性腫瘍は危険であり、多くの場合に致命的結果を生じる。これらの腫瘍は、形態学的に最初の組織に典型的なものではなく、封入もされていない。悪性腫瘍は、一般的に外科的切除の後に再発する。
【0005】
したがって、治療は、通常、悪性癌または悪性腫瘍を対象とする。悪性増殖に介入することは、癌の成長の初期の段階では最も効果的である。したがって、癌形成の早期の症状に対して感受性のあるマーカーを見出すこと、およびそれに関連した強力な成長抑制剤を同定することが、非常に重要である。このような診断剤および治療剤を開発するには、特に腫瘍形成性との関連における、細胞分裂および分化についての遺伝子制御機構の理解が必要となる。癌は、細胞内での正常な機能を有し、且つ、一度の突然変異または異常レベルでの発現により癌を誘発するか、またはその一因となる癌遺伝子における先天的または後天的な突然変異により生じる。十分に検討されているある腫瘍は、活性化癌遺伝子および不活性化腫瘍抑制遺伝子を含む、数種の異なる独立的に突然変異した遺伝子を有している。これらの各突然変異は、全体として、完全な新生物の表現型を表す形質の一部を付与する役割を果たすと思われる(Land等、Science,222:771,1983;Ruley、Nature,4:602,1983;Hunter、Cell,64:249,1991)。
【0006】
一つのこのような突然変異は、遺伝子増幅である。遺伝子増幅には、DNAコピー数が相対的に増加する特定の遺伝子を含む染色体領域が関与し、これにより、存在するいずれかの遺伝子のコピー数が増加する。一般的に、遺伝子増幅により、転写および翻訳のレベルが増加して、対応する遺伝子mRNAおよびタンパク質の産生量が増加する。遺伝子の増幅により悪影響が生じ、これが癌の形成および増殖の一因となる(Lengauer等、Nature,396:643−649,1999)。
【0007】
遺伝子の全集合体は、種々の異なる種類の腫瘍細胞において、明らかに過剰発現するか、または違った形で発現することが、癌の研究者により一般的に理解されている。さらに、これらの過剰発現した遺伝子の極めて少数だけが、癌表現型に原因として関与していると思われる。残りの過剰発現した遺伝子は、DNAの複製に関与するより多くの基本的な一次的事象、例えば、一群の遺伝子の過剰発現、による二次的な結果であると思われる。一方、遺伝子の増幅は、固形腫瘍における重要な遺伝的変更であることが定説となっている(Knuutila等、Am.J.Pathol.,152(5):1107−23,1998;Knuutila等、Cancer Genet.Cytogenet.,100(1):25−30,1998)。
【0008】
ある種の周知の遺伝子、例えば、c−mycの過剰発現が、遺伝子増幅の不存在下でかなりの高レベルで観察された(Yoshimoto等、JPN J.Cancer Res.,77(6):540−5,1986)。しかしながら、これらの遺伝子は、しばしば増幅され(Knuutila等,Am.J.Pathol.,152(5):1107−23,1998)、これにより活性化される。このような特性は、癌遺伝子の顕著な特徴であると考えられる。増幅の不存在下での過剰発現は、これらの状況でのより高い転写効率により生じることがある。c−mycの場合、例えば、Yoshimoto等は、その転写速度は、試験した腫瘍細胞系で大きく増加することを明らかにした。したがって、癌組織における遺伝子の過剰発現および増幅の特性および相互作用は、癌の発生における遺伝子の役割の重要な目安となる。すなわち、腫瘍における所定の遺伝子のDNAコピーの増加は、その過剰発現の他、およびそれを越えて、腫瘍形成および進行におけるそれらの機能を示すことがある。
【0009】
過剰発現と増幅とは同じ現象ではないことに留意しなければならない。過剰発現は、単一の未増幅遺伝子から得ることができ、増幅された遺伝子は、必ずしもmRNAおよびタンパク質の発現レベルの増加にはつながらない。したがって、一方の現象が他方の現象を生じるか否か、または関連しているか否かを予測することはできない。しかしながら、遺伝子の増幅と遺伝子産物の過剰発現の両方が、前癌状態または癌状態にある細胞または組織で生じる状況では、その遺伝子とその産物から、介入のための診断標的および治療の適時の情報の両方が得られる。一部の遺伝子は、その位置が真の癌遺伝子に隣接していることによって増幅されることがあるので、腫瘍パネルにおける近位遺伝子のDNAコピー数を測定することにより、増幅ユニットの中心点にある増幅遺伝子を、より重要な他の増幅遺伝子に近接しているために増幅されることがある増幅遺伝子から区別できるようにすることも有益である。
【0010】
したがって、増幅された癌遺伝子を見出すことおよびその特徴付けは、それらの過剰発現またはディファレンシャル発現の特徴とともに、およびそれらに加えて、診断、ワクチンおよび治療用途のための新規な目的につながる有望な手段となる。さらに、ヒトゲノムの作業草案の完了およびそれと並行したゲノム技術における進歩により、有効な癌マーカーの同定および抗癌剤における新たな期待が生まれる。ハイスループットのマイクロアレイ検出およびスクリーニング技術、コンピュータによる遺伝子およびゲノム解析ツール並びにマルチプラットホーム機能性ゲノムおよびプロテオミクスバリデーションシステムは、その全てが、癌研究および発見における用途に役立つ。現代の配列決定技術およびゲノム解析の出現とともに、数多くの未知の遺伝子および未知または部分的に公知の機能を有する遺伝子を、明らかにすることができる。
【0011】
ガラニンおよびガラニン受容体:
最近の発明まで、ガラニン、GALR2およびGALR3は、癌と関連していると考えられていたが、その単離および特徴付けに成功していなかったため、腫瘍発生におけるそれらの役割を理解することはできなかった。
【0012】
ガラニンは、痛みのプロセッシングにおいて複雑な役割を有する、アミノ酸29個または30個の神経ペプチドである。いくつかのガラニン受容体亜型が、異なる分布で、後根神経節および脊髄に存在する。ガラニン受容体1型(GALR1)は、主に基底前脳、視床下部だけでなく、脊髄においても発現されることが知られている。一方、ガラニン受容体2型(GALR2)は、脳において広く分布していることが判明しており、下垂体および抹消組織にも存在する(Depczynski等、Annals of the New York Academy of Sciences、1998年12月21日、863pp.120−128、米国)。最近、GALR2は、G(q)タンパク質、G(i)タンパク質およびG(12)タンパク質へのカップリングにより、小細胞肺癌細胞における複数のシグナル伝達経路を開始することが判明している(Wittau等、Oncogene 19(37):4199−209,(2000))。
【0013】
SethiおよびRozengurtは、ガラニンが、小細胞肺癌細胞において、Ca2+可動化、イノシトールホスフェートの蓄積およびクローンの増殖を促進するということを開示することにより、GALR3が癌に関与していると報告している(Cancer Res.51,1674−1679(1991))。神経ペプチドであるガラニンを、蛍光Ca2+インジケータであるフラ−2−テトラアセトキシメチルエステルを含んだ小細胞肺癌(SCLC)細胞に添加すると、細胞内濃度が迅速かつ一時的に増加する。ガラニンがCa2+([Ca2+]i)を増加し、その後同種脱感作が生じる。ガラニンは、濃度に依存して[Ca2+]iを増加させ、このときのハーフマキシマム効果(EC50)は、H69およびH510 SCLC細胞において、20〜22nMである。ガラニンの[Ca2+]iへの効果は細胞外Ca2+のキレート化によりブロックされないので、ガラニンは、細胞内貯蔵からCa2+を可動化する。百日咳毒素での前処理(200ng/mlで4時間)を行なった場合には、ガラニン誘起Ca2+可動化は防止されない。これに対して、タンパク質キナーゼCをホルボールエステルで直接活性化すると、ガラニンにより誘起されるCa2+応答が減衰する。ガラニンの効果は、膜ポテンシャルにおける変化と分離して考えることができる。ガラニンは、ビス(1,3−ジエチルチオバルビツレート)−トリメチンオキソノールを含んだSCLC細胞における膜のポテンシャルを増加させず、脱分極SCLC細胞、すなわち、Na+の代わりに145mMのK+を含有する溶液に懸濁した細胞においてCa2+可動化を誘起する。また、ガラニンは、時間および投与量に依存してイノシトールホスフェートの形成の増加を生じる(EC50 10nM)。イノシトールトリスホスフェート画分が急速に増加した後、イノシトールモノホスフェート画分がゆっくりと増加する。ガラニンは、半固形(アガロース含有)培地において、H69およびH510細胞の両方のクローン成長を促進する。この成長促進効果は、ガラニン濃度(EC50 20nM)にはっきりと依存しており、最近同定された広域スペクトル神経ペプチド拮抗剤である[Arg6,D−Trp7,9,Mephe8]P物質により著しく阻害される。得られた結果から、ガラニン受容体が、SCLC細胞中でイノシトールホスフェートおよび[Ca2+]i応答と結びついており、特に、この神経ペプチドが、これらのヒト癌細胞についての直接の成長因子としての役割を果たすことができることが分かる。
【発明の概要】
【0014】
本発明は、癌における、増幅された遺伝子などの遺伝子の単離、特徴付け、過剰発現および影響、並びに哺乳動物、例えばヒト、における腫瘍および癌、例えば、乳癌、肺癌、脳腫瘍、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌の診断、ワクチン、予防および治療に使用するための方法および組成物に関する。本発明は、ガラニン遺伝子、ガラニン受容体2(GALR2)遺伝子およびガラニン受容体3(GALR3)遺伝子の新規な特質を見出したことに基づくものである。また、本発明は、腫瘍形成に関与するGALR2−GALR3の機能的に重要なヘテロ複合体に関する。
【0015】
ガラニン受容体に対するリガンドであるガラニンは、増幅され且つ過剰発現されたガラニン受容体を含有する肺腫瘍において、しばしば増幅され且つ過剰発現される。このことは、ガラニン自己分泌ループは、過剰表現される肺癌における遺伝的圧力下にあり、ガラニンおよびその受容体が肺癌において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【0016】
本明細書において実証されているように、ガラニンは、ヒト肺腫瘍の70%超において増幅されるアンプリコンの中心点にあると思われる。このことは、その遺伝子が重要な生物学的機能を有しており、腫瘍形成中に、該遺伝子のDNAコピーの増加が選択されるようになっていることを示している。本明細書において実証されているように、ガラニン遺伝子は、ヒト肺癌においてもしばしば増幅および過剰発現する。したがって、本明細書に開示されているように、ガラニン遺伝子およびその発現されたタンパク質産物は、癌治療のための診断に使用することができ、癌治療のための標的として使用することもできる。また、これらを使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定および設計できる。
【0017】
GALR2は、同じヒトの肺、乳房、結腸、前立腺および卵巣の原発性腫瘍において、しばしばGALR3とともに共増幅される。このことは、GALR2とGALR3の両方が腫瘍形成中に選択され、GALR2−GALR3の機能的に重要なヘテロ複合体が存在すると思われることを意味している。GALR2およびGALR1は、GALR3と、それぞれアミノ酸の相同性が58%および36%であり、GALR2のみが、増加したGALR3遺伝子コピー数をも含む同じ肺腫瘍において増幅することが判明した。
【0018】
GALR3は、ガラニンが小細胞肺癌細胞におけるCa2+可動化、イノシトールホスフェートの蓄積およびクローンの成長を促進することから、癌に関与している。本明細書により初めて開示されるように、GALR3は、ヒトの肺腫瘍、乳腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍の50%において増幅するアンプリコンの中心点にあると思われる。このことは、その遺伝子が重要な生物学的機能を有しており、腫瘍形成中に、該遺伝子のDNAコピーの増加が選択されるようになっていることを示している。GALR3遺伝子は、ヒト肺癌においてもしばしば過剰発現する。したがって、GALR3遺伝子およびその発現されたタンパク質産物は、癌治療のための診断に使用することができ、癌治療のための標的として使用することもできる。また、これらを使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定および設計できる。
【0019】
本発明の一つの態様によれば、遺伝子治療、アンチセンス核酸および小干渉RNA(siRNA)の開発、並びに免疫診断または免疫療法の開発における、ガラニン、GALR2および/またはGALR3の使用が提供される。また、本発明には、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体と特異的に結合する抗体、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体および人工的に作り出された抗体(ヒト化抗体等)およびフラグメントの製造および使用が含まれる。また、本発明によれば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の機能または活性の一つ以上を阻害することができる、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の拮抗剤(アンタゴニスト)およびインヒビターが提供される。好適な拮抗剤として、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質を結合および妨害または中和し、また、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質または後者の機能のためのGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と天然において相互作用するタンパク質との結合について、天然型のガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と競合する、、小分子(分子量:約500未満)、大分子(分子量:約500超)、フラグメントおよび一本鎖抗体などの抗体、およびガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の転写を妨害する核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子、リボザイムおよび小干渉RNA(siRNA))を挙げることができる。ガラニン、GALR2またはGALR3の一定の突然変異体を誘起することにより、ガラニン、GALR2またはGALR3の活性を弱めるものである有用なアゴニストとしても、小分子、大分子、および「中和」抗体以外の抗体が挙げられる。
【0020】
さらに、本発明によれば、ガラニン活性、GALR2活性またはGALR3活性のインヒビターであって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体である、インヒビターが提供される。
【0021】
また、本発明によれば、ガラニン活性、GALR2活性またはGALR3活性のインヒビターであって、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質またはGALR3タンパク質を過剰発現している細胞に結合することにより、細胞の抑制または死滅を生じる抗体である、インヒビターが提供される。
【0022】
さらに、本発明によれば、転写または翻訳に影響を及ぼすことにより、ガラニン、GALR2またはGALR3の発現を減少させることができる分子が提供される。小分子(分子量:約500未満)、大分子(分子量:約500超)、並びに核酸分子、例えば、リボザイム、siRNAおよびアンチセンス分子、例えば、アンチセンスRNA、アンチセンスDNAまたはDNAデコイもしくはデコイ(おとり)分子(例えば、Morishita等、Ann.NY Acad.Sci.,947:294−301,2001;Andratschke等、Anticancer Res.,21:(5)3541−3550,2001)はいずれも、発現または増幅を阻害するのに利用できる。
【0023】
上述のように、ガラニン遺伝子配列、GALR2遺伝子配列およびGALR3遺伝子配列を、RNA干渉において用いることもできる。RNA干渉の現象については、Bass,Nature,411:428−29(2001);Elbashir等,Nature,411:494−98(2001);およびFire等、Nature,391:806−11(1998)に記載され、考察されている。これらにおいては、干渉RNAの製造方法についても考察されている。
【0024】
本発明の一つの態様によれば、哺乳動物における癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断方法であって、例えば、前癌状態または癌状態の疑いのある組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;正常な哺乳動物における前記組織または他の組織における領域から生物学的対照試料を得る工程と;生物学的試験試料と生物学的対照試料との両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のメッセンジャーRNA転写物のレベルを検出する工程とを含んでなり、生物学的検体における転写物レベルが、生物学的対照試料における転写物レベルよりも高い場合に、組織に癌が存在することが示される前記方法が提供される。他の態様によれば、生物学的対照試料は、異なる個体から得てもよいし、集団でみられるベースライン値を基準とした標準化値であってもよい。
【0025】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断方法であって、例えば、前癌状態または癌状態の疑いのある組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;生物学的検体におけるガラニンDNAコピー数、GALR2DNAコピー数またはGALR3DNAコピー数を検出することにより、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子が生物学的試験検体において増幅されているかどうかを決定する工程とを含んでなり、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の増幅が、組織に癌が存在することを示す前記方法が提供される。
【0026】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物における癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断方法であって、例えば、前癌状態または癌状態の疑いのある組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;前記試料を、抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体または抗GALR3抗体と接触させる工程と;生物学的検体におけるガラニン遺伝子発現レベル、GALR2遺伝子発現レベルまたはGALR3遺伝子発現レベルをそれぞれ検出する工程とを含んでなり、生物学的検体におけるガラニン遺伝子発現レベル、GALR2遺伝子発現レベルまたはGALR3遺伝子発現レベルが、生物学的対照試料におけるものよりも高い場合に、組織に癌が存在することが示される前記方法が提供される。他の態様によれば、生物学的対照試料は、異なる個体から得てもよいし、集団でみられるベースライン値を基準とした標準化値であってもよい。
【0027】
本発明のさらに別の態様によれば、データを比較および編集するための方法であって、該データが電子フォーマットまたは紙フォーマットに保存される前記方法が提供される。電子フォーマットは、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーなどからなる群から選択されるものであり、データは、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションによるか、または上記の保存フォーマットのいずれかを用いることにより、表示、送信または解析される。ここで、データは、試料を採取する部位、または上記のプロセスに続いてデータを輸送する位置において、比較および編集される。
【0028】
本発明のさらに別の態様によれば、肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣のような哺乳動物の器官および組織における癌の増殖を予防、制御または抑制する方法であって、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のインヒビターを、上記器官または組織に投与することにより、ガラニンタンパク質活性、GALR2タンパク質活性、GALR3タンパク質活性またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体活性を阻害することを含む前記方法が提供される。このようなインヒビターは、とりわけ、ガラニンタンパク質に対する抗体、GALR2タンパク質に対する抗体、GALR3タンパク質に対する抗体もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する抗体または上記タンパク質もしくは複合体のポリペプチド部分に対する抗体、ガラニンタンパク質に対する拮抗剤、GALR2タンパク質に対する拮抗剤、GALR3タンパク質に対する拮抗剤、GALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する拮抗剤または他の小分子に対する拮抗剤とすることができる。
【0029】
本発明のさらなる態様によれば、肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣のような哺乳動物の器官および組織における癌の増殖を予防、制御または抑制する方法であって、上記器官または組織に、ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAまたはRNAと相互作用することのできるヌクレオチド分子を投与し、これによりそれぞれガラニン遺伝子の機能、GALR2遺伝子の機能またはGALR3遺伝子の機能をブロックまたは妨害することを含んでなる前記方法が提供される。このようなヌクレオチド分子は、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子のアンチセンスヌクレオチド、ガラニンRNA、GALR2RNAまたはGALR3RNAのリボザイム、小干渉RNA(siRNA)であってもよく、またはガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子と三重らせんを形成することができるものであってもよい。
【0030】
本発明のさらなる態様によれば、患者の癌、例えば、肺癌および脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を治療するための治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のメッセンジャーRNA転写物のレベルを検出する工程とを含んでなり、前記第二試料における転写物レベルが、前記第一試料におけるものよりも低い場合に、前記処置計画が前記患者に有効であることが示される前記方法が提供される。
【0031】
本発明の別の態様によれば、臨床試験において、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を抑制する化合物の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のメッセンジャーRNA転写物のレベルを検出する工程とを含んでなり、前記第二試料における転写物レベルが、前記第一試料におけるものよりも低い場合に、前記化合物がこのような癌を抑制するのに有効であることが示される前記方法が提供される。
【0032】
本発明の別の態様によれば、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を治療するための治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数を検出することにより、前記第一試料および前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子増幅状態を調べる工程とを含んでなり、前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数が、前記第一試料におけるものよりも少ない場合には、増幅されたガラニン、GALR2および/またはGALR3を有する細胞が除去または抑制されているため、前記処置計画が有効であることが示される前記方法が提供される。
【0033】
本発明のさらに別の態様によれば、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を治療するための治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;前記試料を抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体または抗GALR3抗体と接触させる工程と;前記第一試料と前記第二試料の両方において、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子発現レベルを検出する工程とを含んでなる前記方法が提供される。前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子発現レベルが、前記第一試料におけるものよりも低い場合には、前記処置計画が前記患者に有効であることが示される。
【0034】
本発明のさらに別の態様によれば、例えば臨床試験において、患者の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌を抑制するための化合物の有効性をモニタリングする方法であって、前記患者から癌細胞の第一試料を得る工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記患者から、所定の時間の経過後に癌細胞の第二試料を得る工程と;第一試料および第二試料の両方において、ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数を検出することにより、前記第一試料および前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子増幅状態を調べる工程とを含んでなり、前記第二試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピー数が、前記第一試料におけるものよりも少ない場合には、増幅されたガラニン、GALR2および/またはGALR3を有する細胞が除去または抑制されているため、前記化合物が有効であることが示される前記方法が提供される。
【0035】
本発明の一つの態様によれば、哺乳動物における癌の診断方法であって、前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルを測定し、これにより試験レベルについてのデータを得る工程と;前記試験レベルを、対照レベルについてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照レベルに対して前記生物学的検体の試験レベルが上昇している場合に、前記哺乳動物に癌が存在することが示される前記方法が提供される。
【0036】
本発明の別の態様によれば、患者における治療処置計画の有効性をモニタリングする方法であって、患者から得た癌細胞の第一試料におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを測定する工程と;前記患者に前記処置計画を適用する工程と;前記処置計画の適用の所定の時間後に得た前記患者からの癌細胞の第二試料におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを測定する工程と;前記第一試料と前記第二試料におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを比較する工程とを含んでなり、前記第二試料におけるレベルのデータが前記第一試料におけるものよりも減少している場合に、前記処置計画が前記患者に有効であることが示される前記方法が提供される。
【0037】
本発明の別の態様によれば、哺乳動物組織における癌の増殖を阻害する方法であって、前記組織をGALR2−GALR3ヘテロ複合体のインヒビターと接触させる工程を含んでなり、該インヒビターが、GALR2−GALR3ヘテロ複合体に結合する抗体、またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する拮抗剤、例えば、小分子である前記方法が提供される。
【0038】
本発明のさらに別の態様によれば、医薬組成物の製造方法であって、a)GALR2−GALR3ヘテロ複合体のモジュレータである化合物を同定する工程と;b)前記化合物を合成する工程と;c)必要に応じて前記化合物を好適な添加物と混合する工程とを含んでなる前記方法が提供される。
【0039】
本発明のさらに別の態様によれば、GALR2−GALR3ヘテロ複合体またはそのフラグメントを含んでなる医薬組成物が提供され、前記フラグメントは、GALR2−GALR3ヘテロ複合体の機能的特徴を有するものである。
【0040】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により製造される医薬組成物であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0041】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の方法により製造される医薬組成物であって、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質またはGALR3タンパク質を過剰発現する細胞に結合し、これにより前記細胞を死滅させる抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0042】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン由来、GALR2由来またはGALR3由来のポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは突然変異体を含んでなり、前記ポリペプチドが、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする阻害活性を有するものである、医薬組成物が提供される。
【0043】
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物における免疫応答を誘起する方法であって、前記哺乳動物をガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと接触させる工程を含んでなり、前記免疫応答により、抗体および/またはT細胞免疫応答が生じ、これにより前記哺乳動物が卵巣癌などの癌から保護される、前記方法が提供される。
【0044】
本発明の別の態様によれば、癌の診断および/または癌治療の有効性のモニタリングに用いられる、単離されたガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子アンプリコンであって、例えば、前癌状態または癌状態にあると疑われる組織における領域から生物学的試験試料を得る工程と;正常な哺乳動物における前記組織または他の組織における領域から生物学的対照試料を得る工程と;生物学的試験試料と生物学的対照試料との両方において、それぞれの遺伝子アンプリコンレベルを検出する工程とを含んでなり、生物学的検体における増幅レベルが、生物学的対照試料におけるものよりも高い場合に、前記組織が前癌状態または癌状態にあることが示される、前記遺伝子アンプリコンが提供される。他の態様によれば、生物学的対照試料は、異なる個体から得てもよいし、集団でみられるベースライン値を基準とした標準化値、例えば細胞1個あたり2個の遺伝子コピー、としてもよい。
【0045】
本発明の別の態様によれば、単離されたガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子アンプリコンであって、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子と少なくとも約90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド、例えば、配列番号1に記載のもの、配列番号2に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記配列番号1のポリヌクレオチドもしくは前記配列番号2に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約90%の配列同一性を有する、腫瘍細胞中で過剰発現するポリヌクレオチドなどの、それぞれの遺伝子の完全または部分的に増幅された産生物を含んでなる、前記アンプリコンが提供される。
【0046】
本発明のさらに別の態様によれば、前癌状態または癌状態にあると疑われる領域からの生物学的検体を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質のモジュレータと接触させることにより、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を調節する方法が提供され、前記モジュレータは、例えば、小分子である。
【0047】
本発明のさらに別の態様によれば、前癌状態または癌状態にあると疑われる領域からの生物学的検体を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質のモジュレータと接触させることにより、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を調節する方法であって、前記モジュレータが、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の転写を部分的または完全に阻害するものである前記方法が提供される。
【0048】
本発明の別の態様によれば、医薬組成物の製造方法であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性などの、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性のインヒビターである化合物を同定する工程と;前記化合物を合成する工程と;必要に応じて前記化合物を好適な添加物と混合する工程とを含んでなる前記方法が提供される。
【0049】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0050】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質を過剰発現する細胞に結合し、これにより前記細胞を死滅させる抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【0051】
本発明のさらに別の態様によれば、本明細書に記載の方法により得ることができる医薬組成物であって、ガラニン由来、GALR2由来、GALR3由来またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体由来のポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは突然変異体を含んでなり、前記ポリペプチドが、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする阻害活性を有するものである、医薬組成物が提供される。
【0052】
本発明のさらに別の態様によれば、哺乳動物における免疫応答を誘起する方法であって、前記哺乳動物をガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはそのフラグメントと接触させる工程を含んでなり、前記免疫応答により、抗体および/またはT細胞免疫応答が生じ、これにより前記哺乳動物が、乳癌、結腸癌、前立腺癌および/または卵巣癌などの癌から保護される、前記方法が提供される。
【0053】
本発明の別の態様によれば、siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子が裸オリゴヌクレオチド、センス分子、アンチセンス分子、デコイDNA分子またはベクターの形態で供給され、前記siRNAがガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子またはその転写物と相互作用するものであり、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであり、前記ウイルスが、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたは他の好適なウイルスベクターである、前記方法が提供される。
【0054】
本発明のさらに別の態様によれば、デコイ分子をそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記分子が裸オリゴヌクレオチド、センス分子、アンチセンス分子、デコイDNA分子またはベクターの形態で供給され、前記分子がガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子と相互作用するものであり、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであり、前記ウイルスが、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたは他の好適なウイルスベクターである、前記方法が提供される。
【0055】
本発明のさらなる態様によれば、ガラニンデコイ、GALR2デコイ、GALR3デコイ、アンチセンス、三重らせん形成分子およびリボザイムを、いずれかの割合で、同時または連続して投与でき;上記のうちの2つだけを、いずれかの割合で同時または連続して投与でき;またはそれらを単独で投与できる(すなわち、デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスまたはリボザイムが、ガラニン、GALR2またはGALR3のうちの一つだけを標的とする)。さらに、異なる配列を有するが、所定の標的(すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3)に対して指向したデコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスまたはリボザイムを、等モル割合などのいずれかの割合で同時または連続して投与できる。したがって、本明細書における記載を参照することにより当業者には明らかであるように、2種の異なるガラニンデコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスおよび/またはリボザイム、1種のGALR2デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンス、リボザイムおよび/または3種の異なるGALR3デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスおよび/またはリボザイムをいずれかの割合、例えば、等モル割合を選択して投与できる。当然のことながら、当業者は、他の順列および割合を用いることができる。
【0056】
本発明の別の態様によれば、ガラニン−siRNAおよび/またはGALR2−siRNAおよび/またはGALR3−siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子の1種以上のものが、裸オリゴヌクレオチド、センス分子、アンチセンス分子またはベクターの形態で供給され、前記siRNA(単一または複数)がガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性と相互作用し、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであり、前記ウイルスが、例えば、レトロウイルス、アデノウイルスまたは他の好適なウイルスベクターである、前記方法が提供される。換言すれば、ガラニン−siRNA、GALR2−siRNAおよびGALR3−siRNAを、いずれかの割合で、同時または連続して投与でき;上記のうちの2つだけを、いずれかの割合で同時または連続して投与でき;またはそれらを単独で投与できる(すなわち、siRNAは、ガラニン、GALR2またはGALR3のうちの一つだけを標的とする)。さらに、異なる配列を有するが、所定の標的(すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3)に対して指向したsiRNAを、等モル割合などのいずれかの割合で同時または連続して投与できる。したがって、本明細書における記載を参照することにより当業者には明らかであるように、2種の異なるガラニンsiRNA、1種のGALR2siRNAおよび3種の異なるGALR3siRNAを、いずれかの割合、例えば、等モル割合を選択して投与できる。当然のことながら、当業者は、他の順列および割合を用いることができる。さらに、siRNAは、デコイ、三重らせん形成分子、アンチセンスおよびリボザイムのうちの一種以上とともに、用いることができる。
【0057】
本発明の別の態様によれば、ガラニンsiRNAおよび/またはGALR2siRNAおよび/またはGALR3siRNAを含むベクターを投与することにより、遺伝子の生体内発現をブロックする方法であって、前記siRNAがガラニンの活性および/またはGALR2の活性および/またはGALR3の活性と相互作用するものであり、前記siRNAが、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞において、ガラニン遺伝子および/またはGALR2遺伝子および/またはGALR3遺伝子の転写後発現抑制を生じるものである、前記方法が提供される。
【0058】
さらに、本発明の別の態様によれば、本明細書に記載されているベクターを投与することにより、生体外で細胞を処理する方法であって、前記ベクターが、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルス、例えば、レトロウイルスまたはアデノウイルスである、前記方法が提供される。
【0059】
その生体内または生体外治療用途では、トランスフェクションまたは感染により細胞内に入るウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いて、siRNA/shRNA/デコイ分子を投与することが好適である。特に、本発明による治療薬としてのベクターは、不完全ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、または不完全レトロウイルスベクター、例えば、マウスレトロウイルスとすることができる。
【0060】
本発明の別の態様によれば、ガラニン拮抗活性、GALR2拮抗活性、GALR3拮抗活性またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、前記分子を癌細胞と接触させる工程と;前記細胞におけるガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルを測定することにより、試験レベルについてのデータを得る工程と;前記試験レベルを対照レベルと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記細胞中のガラニン、GALR2、GALR3および/またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルが減少している場合に、前記試験分子がガラニン拮抗活性、GALR2拮抗活性、GALR3拮抗活性および/またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性を有することが示される、前記方法が提供され、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルは、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、ノーザンハイブリダイゼーションまたはマイクロアレイ分析により測定される。
【0061】
本発明の別の態様によれば、ガラニン拮抗活性、GALR2拮抗活性、GALR3拮抗活性またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、前記分子を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体と接触させる工程と;ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する前記試験分子の影響を測定する工程とを含んでなる前記方法が提供され、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベル、前記影響は、結合アッセイにより測定される。
【0062】
特に示さない限り、本明細書において種々の文法的形態で使用されている全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用できるが、以下で、好ましい方法および材料を説明する。矛盾のある場合には、定義を含む本明細書を優先とする。さらに、材料、方法および例は、説明の目的のみで挙げられており、本発明を限定するものではない。
【0063】
本発明のさらなる特徴、目的および利点は、請求の範囲および以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すが、説明の目的でのみ挙げられており、本発明の精神および範囲内で種々の変更および修正ができることは、当業者にはこの詳細な説明から明らかであろう。
【発明の具体的説明】
【0064】
本発明によれば、哺乳動物、例えばヒト、における腫瘍および癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断、予防および治療のための、方法および組成物が提供される。本発明は、ガラニン遺伝子、ガラニン受容体2(GALR2)遺伝子およびガラニン受容体3(GALR3)遺伝子の新規な特質を見出したことに基づくものである。したがって、ガラニン、GALR3および/またはGALR2の遺伝子並びにそれらの発現されたタンパク質産物を診断に使用することができ、治療のための標的として使用することもできる。また、これらを使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定することもできる。
【0065】
本発明では、ガラニンおよびGALR3が、ヒト肺の原発性腫瘍においてしばしば増幅および過剰発現されることが示される。また、本発明では、第二ガラニン受容体(GALR2)が、同じヒトの肺腫瘍、脳腫瘍、乳腫瘍、結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍においてしばしばGALR3とともに共増幅されることが示される。このことは、GALR2とGALR3の両方が腫瘍形成中に選択され、且つGALR2−GALR3の機能的に重要なヘテロ複合体が存在することを意味している。
【0066】
また、本発明では、ガラニン受容体に対するリガンドであるガラニンが、増幅され且つ過剰発現されたガラニン受容体を含有する肺腫瘍においてしばしば増幅(70%超、54/77試験試料)および過剰発現(78%、39/50試験試料)されることも示される。これらの知見は、ガラニン自己分泌ループが過剰表現される肺癌における遺伝的圧力下にあり、ガラニンおよびその受容体が肺癌において重要な役割を果たしていることを示唆している。
【0067】
定義:
動物における「癌」とは、発癌細胞に典型的な特徴、例えば、無制御増殖、特殊化した機能の損失、不死、顕著な転移の可能性、抗アポトーシス活性の顕著な増加、高成長および増殖速度並びに一定の特徴的なモルホロジーおよび細胞マーカー、を有する細胞が存在することを意味する。ある状況では、癌細胞は、腫瘍の形態であり、このような細胞は、動物内に局部的に存在したり、独立した細胞、例えば、白血病細胞として血流で循環することがある。
【0068】
「癌を検出する」または「癌の診断をする」という表現は、動物が癌状態または前癌状態にあるか否かを決定することを意味する。また、「癌を検出する」とは、動物に前癌細胞または癌細胞が存在する可能性についての間接的な証拠を得たり、患者が癌にかかりやすいかどうかを評価することをも意味する。癌は、本発明による方法を単独で用いるか、他の方法と組み合わせて用いるか、動物の健康の状態についての他の情報を考慮にいれて用いることにより検出することができる。
【0069】
本明細書で使用される「腫瘍」とは、悪性であるか良性であるか、並びに全てが前癌状態細胞および癌状態細胞並びに前癌状態組織および癌状態組織であるか否かとは無関係に、全ての新生物細胞の成長および増殖を意味する。
【0070】
「前癌状態」という用語は、悪性疾患または癌を生じる可能性のある変化に関する特徴を有する細胞または組織を意味する。この例として、乳房組織における腺腫様成長、または、例えば、ディスプラスチックニーバス症候群、皮膚の悪性黒色腫の前兆等の状態などがある。さらなる例として、ディスプラスチックニーバス症候群、ポリポシス症候群、前立腺形成異常および他のこのような新生物の他に、異常新生物などが挙げられる。これは、前癌病変が、臨床的に同定できるか否かには無関係である。
【0071】
本明細書で使用される「異なった形で発現された遺伝子転写物」という用語は、健康な生体における同じ組織の細胞または同じ生体における同じ組織の細胞にみられる遺伝子転写物のコピー数または状態と比較して、腫瘍または癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌および卵巣癌を有する生体の異なる種類の細胞または組織において異なるコピー数でみられる、癌遺伝子等の遺伝子の転写物を意味する。遺伝子転写物の複数のコピーが、腫瘍または癌を有する生体にみられる場合があるのに対して、同じ生物における同じ組織の健康な生体または健康な細胞では同じ遺伝子転写物のコピー数が少ないか、またはこの逆であることがある。
【0072】
「異なる形で発現された遺伝子」は、標的遺伝子、フィンガープリント遺伝子または経路遺伝子であることができる。例えば、本明細書で使用される「フィンガープリント遺伝子」という用語は、発現パターンを、腫瘍および癌を評価するための予後マーカーまたは診断マーカーとして使用することができる異なる形で発現された遺伝子、または腫瘍および癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣癌の治療に有用な化合物を同定するのに使用できる異なる形で発現された遺伝子を意味する。例えば、腫瘍および癌と関連して通常示されるフィンガープリント遺伝子発現パターンに対する化合物の影響を利用して、腫瘍治療剤および癌治療剤としての化合物の効力を評価したり、または腫瘍および癌の治療のための臨床評価を受けている患者のモニタリングをおこなうことができる。
【0073】
本明細書で使用される「フィンガープリントパターン」という用語は、一連(2〜一定の状態で存在する全てのフィンガープリント遺伝子の範囲であることができる)のフィンガープリント遺伝子の発現パターンを測定するときに生成されるパターンを意味する。フィンガープリントパターンは、「発現プロフィール」と称されることもある。フィンガープリントパターンまたは発現プロフィールは、単一のフィンガープリント遺伝子の発現と同じ診断、予後および化合物同定法に使用することができる。
【0074】
本明細書で使用される「標的遺伝子」という用語は、遺伝子発現レベルまたは遺伝子産物活性レベルをモジュレーションすることにより、腫瘍および癌、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣癌、の症状を予防および/または改善する、異なる形で発現された遺伝子を意味する。したがって、標的遺伝子の発現、標的遺伝子、または標的遺伝子産物の活性をモジュレーションする化合物を、腫瘍および癌の診断、治療または予防に使用できる。本発明の特定の標的遺伝子は、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子である。
【0075】
一般的に、「遺伝子」は、調節機能、触媒機能を有し、および/またはタンパク質をコードしているRNAに転写されることができるゲノム上の領域である。真核遺伝子は、別のバージョンの成熟タンパク質をコードする異なるRNAスプライス変異体を産生するように組織化することがある、イントロンとエクソンを典型的に有する。当業者には、本発明に、別のプロモーター部位または別のポリアデニル化部位のために生じる、スプライス変異体、対立遺伝子変異体および転写物を含む、観察される全てのガラニンコード転写物、GALR2コード転写物およびGALR3コード転写物が含まれることは明らかであろう。「全長」遺伝子またはそのRNAには、天然のスプライス変異体、対立遺伝子変異体、他の別の転写物や、天然の変異体および得られるRNA分子と同じ機能を有する、組み換え技術により生成したスプライス変異体が含まれる。癌遺伝子を含む遺伝子の「フラグメント」は、機能ドメイン、例えば、触媒ドメイン、DNA結合ドメイン等を表すか、表さない遺伝子からのいずれかの部分であることができる。フラグメントは、好ましくは連続する少なくとも25個のアミノ酸、好ましくは連続する少なくとも約30個、40個、50個、60個、65個、70個、75個もしくはそれ以上、またはそれらの周囲またはそれらの間の整数のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0076】
本明細書で使用される「経路遺伝子」という用語は、腫瘍および癌に関与する他の遺伝子産物と相互作用する、タンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子である。また、経路遺伝子は、標的遺伝子および/またはフィンガープリント遺伝子特性を示すものでもよい。
【0077】
本明細書で使用される「検出可能な」RNA発現レベルとは、当技術分野において現在公知の標準的手法または将来のある時点で標準となる手法により検出されることのできるレベルを意味する。これらの手法には、例えば、ディファレンシャルディスプレイ、RT(逆転写酵素)結合ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ノーザンブロットおよび/またはRNA分解酵素保護分析などがある。必要とする発現レベルにおける差の程度は、標準的特徴付け法により可視化または測定できる程度であればよい。
【0078】
本明細書で使用される「形質転換細胞」という用語は、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子を、細胞(またはその原種)に、例えば、組み換えDNA法またはウイルスにより導入したものを意味する。
【0079】
本発明による核酸分子、例えば、ガラニン遺伝子またはそのサブ配列を、インサートの発現を容易にする、以下で説明するベクターに挿入することができる。核酸分子、およびそれらがコードするポリペプチドを、診断剤もしくは治療剤として直接使用してもよいし、または治療剤もしくは診断剤として臨床的に有用である抗体を生成するのに使用できる(ポリペプチドの場合は直接、または核酸分子の場合には間接的に)。従って、本発明による核酸を含有するベクター、これらのベクターでトランスフェクションされた細胞、発現されたポリペプチド、およびポリペプチド全体またはその抗原フラグメントに対して生成された抗体は、本発明の態様に含まれる。
【0080】
「構造遺伝子」とは、メッセンジャーRNA(mRNA)に転写され、次に特異的ポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳される、DNA配列である。
【0081】
「単離されたDNA分子」とは、生体の染色体またはゲノムDNAから分離されたDNAのフラグメントである。また、単離は、オリジナルソースまたはその周囲からのある程度の分離の意味も含むものと定義される。例えば、アビジン遺伝子をコードするクローンDNA分子は、単離DNA分子である。単離DNA分子の別の例として、生体のゲノムDNAに組み込まれていない、化学合成DNA分子または酵素的に産生したcDNAが挙げられる。単離したDNA分子は、当技術分野において公知の方法で処理して汚染物を除去することにより、DNA分子が精製されてより均一な状態になったとみなされるようにすることができる。
【0082】
しばしば「コピーDNA」と称される「相補的DNA」(cDNA)は、逆転写酵素によりmRNAテンプレートから形成される一本鎖DNA分子である。典型的には、mRNAの部分に相補的なプライマーを用いて、逆転写を開始する。また、当業者は、「cDNA」という用語を、このような一本鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖を含む二本鎖DNA分子を指すのにも使用する。
【0083】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場合、発現は、構造遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAの一つ以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【0084】
「増幅」という用語は、生体内または生体外での核酸または遺伝子を増幅、重複、増殖または多発現により、約2.5倍以上のコピーを生じることを意味する。例えば、2.5以上のコピー数を生じるガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の増幅は、増幅されたとみなされる。しかしながら、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子コピー数の増加が、2.5倍未満であっても、遺伝子の増幅として考えることができる。2.5倍という数字は、生物学的状態というよりは現在の検出限界によるものである。
【0085】
「アンプリコン」という用語は、前癌状態または癌状態の細胞または組織から単離することができる、一つ以上の遺伝子を含有する増幅産物を意味する。ガラニンアンプリコン、GALR2アンプリコンまたはGALR3アンプリコンは、生体内または生体外での核酸または遺伝子の増幅、重複、増殖または多発現の結果得られるものである。また、ここで定義される「アンプリコン」には、完全または部分的に増幅されたガラニン遺伝子および/またはGALR2遺伝子および/またはGALR3遺伝子も含まれる。例えば、アンプリコンは、配列番号1またはその識別できるフラグメントに対して配列が少なくとも約90%同一であるポリヌクレオチドを含んでなる。
【0086】
「クローニングベクター」は、宿主細胞において自己複製能を有する、核酸分子、例えば、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージである。クローニングベクターは、典型的には(i)外来DNA配列を、ベクターの実質的な生物学的機能を損なうことなく、測定可能な方法で挿入することができる、一つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、および(ii)クローニングベクターで形質転換した細胞の同定および選択に使用するのに好適であるマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子には、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を付与する遺伝子などがある。
【0087】
「発現ベクター」は、宿主細胞における特定の遺伝子の転写を可能にする一連の特定核酸要素を有する組み換え的または合成的に生成する核酸構築物である。典型的には、遺伝子発現を、構成または誘導プロモーター、組織に好ましい調節要素およびエンハンサーを含む、一定の調節要素の制御下に配置する。
【0088】
「組み換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含むいずれかの原核細胞または真核細胞でよい。また、この用語には、宿主細胞の染色体またはゲノムにおけるクローン遺伝子(単一または複数)を含むように遺伝子的に設計された、原核細胞または真核細胞を含む。
【0089】
「アンチセンスRNA」:真核生物において、RNAポリメラーゼは、構造遺伝子の転写を触媒してmRNAを産生する。DNA分子を、RNA転写物が好ましいmRNAの配列に相補的である配列を有するRNAポリメラーゼテンプレートを含むように設計することができる。RNA転写物は、「アンチセンスRNA」と称される。アンチセンスRNA分子は、mRNA発現を阻害することができる(例えば、Rylova等、Cancer Res,62(3):801−8,2002;Shim等、Int.J.Cancer,94(1):6−15,2001)。
【0090】
「アンチセンスDNAまたはDNAデコイまたはデコイ分子」:第一核酸分子に関して、相補的配列であるか、第一分子の相補配列またはその一部に相同である配列で生成される第二DNA分子または第二キメラ核酸分子は、第一分子の「アンチセンスDNAまたはDNAデコイまたはデコイ分子」と称される。また、「デコイ分子」という用語には、DNAまたはPNA(ペプチド核酸)(Mischiati等、Int.J.Mol.Med.,9(6):633−9,2002)を含んでなり、且つタンパク質結合部位、好ましくは調節タンパク質の結合部位、より好ましくは転写因子の結合部位の配列を含む、一本鎖または二本鎖であることができる、核酸分子なども含まれる。アンチセンスDNA分子およびデコイDNA分子を含むアンチセンス核酸分子の用途は、当技術分野において公知であり、例えば、Morishita等、Ann.N Y Acad.Sci.,947:294−301,2001;Andratschke等、Anticancer Res,21:(5)3541−3550,2001に記載されている。アンチセンスDNAまたはPNA分子は、ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子またはGALR3遺伝子の機能および/または発現を、阻害、ブロックまたは調節することができる。
【0091】
「動作可能に連結された」という用語は、調節要素と遺伝子またはそのコード領域との間の接続を説明するのに使用される。すなわち、遺伝子発現は、典型的に構成または誘導プロモーター、組織特異的調節要素およびエンハンサーを含む、一定の調節要素の制御下に置かれる。このような遺伝子領域またはコード領域は、調節要素「に動作可能に連結された」または「に動作可能となるように連結された」と言われ、遺伝子またはコード領域が調節要素により制御されるか、影響されることを意味する。
【0092】
「配列の相同性」は、2つ以上の核酸、ポリヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドの間の配列関係を説明するのに使用され、(a)基準配列、(b)比較ウィンドウ、(c)配列の同一性、(d)配列の同一性の割合(%)、(e)実質的同一性または「相同性」などの用語との関連において理解される。
【0093】
(a)「基準配列」は、配列の比較の基礎として使用される定義された配列である。基準配列は、特定配列の一部または全体、例えば、全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメント、または完全cDNAまたは遺伝子配列であることができる。ポリペプチドについて、基準ポリペプチド配列の長さは、一般的に少なくとも約16個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約20個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約25個のアミノ酸、最も好ましくは約35個のアミノ酸、約50個のアミノ酸または約100個のアミノ酸である。核酸については、基準核酸配列の長さは、一般的に少なくとも約50個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約60個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約75個のヌクレオチド、最も好ましくは約100個のヌクレオチドもしくは約300個のヌクレオチドまたはそれらの付近またはそれらの間の整数のヌクレオチドである。
【0094】
(b)「比較ウィンドウ」には、ポリヌクレオチド配列を基準配列と比較でき、且つ比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、2つの配列の最適整列についての基準配列(付加、置換または欠失を含まない)と比較して付加、置換または欠失(すなわち、ギャップ)を含む、ポリヌクレオチド配列の連続および特定セグメントを参照することが含まれる。一般的に、比較ウィンドウは、長さが少なくとも20個の連続ヌクレオチドであり、必要に応じて30個、40個、50個、100個またはそれ以上であることができる。当業者には、ポリヌクレオチド配列にギャップが含まれていることによる基準配列に対して誤解を招くような高い類似性がでるのを回避するために、ギャップペナルティーが典型的に導入され、且つマッチ数から差し引くことは、分かるであろう。
【0095】
比較のための配列の整列法は、当技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、ローカル相同性アルゴリズム(SmithおよびWaterman,Adv.Appl.Math.,2:482(1981));相同性整列アルゴリズム(NeedlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970));類似性法についてのサーチ(PearsonおよびLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8:2444(1988));PC/GeneプログラムのCLUSTAL(カリフォルニア州Mountain ViewにあるIntelligenetics社)およびGAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA(米国ウィスコンシン州Madison、Science Dr.7にあるGenetics Computer Group(GCG))のWisconsin Genetics Software Packageを含むがこれらには限定されない、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(CLUSTALプログラムは、HigginsおよびSharp、Gene,73:237−244,1988;Corpet等、Nucleic Acids Research,16:881−90,1988;Huang等、Computer Applications in the Biosciences,8:1−6,1992;およびPearson等、Methods in Molecular Biology,24:7−331,1994により十分に記載されている)によりおこなうことができる。データベース類似性サーチに使用することができるプログラムのBLASTに属するものには、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのBLASTN;タンパク質データベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのBLASTX;タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのBLASTP;ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列のためのTBLASTN;およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列のためのTBLASTXなどがある。Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学における現在のプロトコール)、第19章、Ausubel等編、Greene Publishing and Wiley−Interscience社、New York,1995参照。上記プログラムの新しいバージョンまたは新しいプログラムは全て、将来入手可能となることは疑いなく、本発明に使用できる。
【0096】
特に示さない限り、ここで記載の配列同一性/類似性値は、デフォルトパラメータを用いて、プログラムのBLAST2.0パッケージソフトまたはそれらの後継ソフトを用いて得た値を意味する(Altschul等、Nucleic Acids Res,2:3389−3402,1997)。これらのパラメータのデフォルト設定値は、将来必要に応じて容易に変更できる。
【0097】
当業者には、BLASTサーチは、タンパク質をランダム配列としてモデル化できることが理解できるであろう。しかしながら、実在する数多くのタンパク質は、一つ以上のアミノ酸に濃化したホモポリマートラクト、短期リピートまたは領域であることができる非ランダム配列の領域を含んでなる。このような低複雑領域は、たとえタンパク質の他の領域が全く異なるとしても、無関係なタンパク質の間に整列できる。多数の低複雑性フィルタープログラムを用いて、このような低複雑整列を減少させることができる。例えば、SEG(WootenおよびFederhen,Comput.Chem.,17:149−163,1993)およびXNU(ClaverieおよびStates,Comput.Chem.,17:191−1,1993)低複雑フィルターは、単独または組み合わせて用いることができる。
【0098】
(c)2つの核酸配列またはポリペプチド配列における「配列の同一性」または「同一性」は、特定比較ウィンドウで最大の一致について整列したときに同一である2つの配列における残基を参照することを含み、付加、欠失および置換を考慮することができる。配列の同一性の割合(%)をタンパク質に関連して使用するとき、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によりしばしば異なり、アミノ酸残基が、同様の化学的性質(例えば、電荷または疎水性)を有する他のアミノ酸残基の代わりに置き換わり、したがって、分子の機能性を変化させないことが分かる。配列が、保存的置換で異なる場合、配列の同一性(%)を、上方向に調整して、置換の保存性について修正できる。このような保存的置換により異なる配列は、配列の類似性を有すると言われる。この調整をする方法は、当業者には周知である。典型的には、これには、全ミスマッチではなく一部分としての保存的置換のスコアリングをすることにより、配列の同一性(%)を増加させることを含む。すなわち、例えば、同一のアミノ酸にスコア1、非保存的置換にスコアゼロを付与する場合には、保存的置換には、0と1との間のスコアが付与される。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムPC/GENE(米国カリフォルニア州Mountain ViewにあるIntelligenetics社製)において実行されるような、例えば、MeyersおよびMiller,Computer Applic.Biol.Sci.,4:11−17,1988のアルゴリズムにしたがって算出される。
【0099】
(d)「配列の同一性の割合(%)」は、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、2つの配列の最適な整列についての基準配列(付加、置換または欠失を含まない)と比較して、付加、置換または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでいてよい、比較ウィンドウについて2つの最適に整列された配列を比較することにより求められた値を意味する。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に生じる位置の数を求めて整合位置の数を得ること、整合位置数を比較のウィンドウの位置の総数で割り、そして得られた結果に100をかけて配列の同一性の割合(%)を得ることにより、算出される。
【0100】
(e)(i)それらの種々の文法的な形態における「実質的同一性」または「相同性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的パラメータを用いて記載されている整列プログラムの一つを用いて基準配列と比較したときに、所望の同一性、例えば、少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも70%の配列の同一性、より好ましくは少なくとも80%の同一性、さらに好ましくは少なくとも90%の同一性、最も好ましくは少なくとも95%の同一性を有する配列を含んでなることを意味する。当業者には、これらの値は、コドンの縮重、アミノ酸の類似性、リーディングフレーム位置等を考慮することにより、2つのヌクレオチド配列によりコードされた対応するタンパク質の同一性を求めるために適切に調整できることは分かるであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は、通常少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、80%、90%、最も好ましくは少なくとも95%の配列同一性を意味する。
【0101】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の目安は、2つの分子がストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションするか否かにある。しかしながら、ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションしない核酸であっても、これらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には、依然として実質的に同一である。このことは、例えば、核酸のコピーを、遺伝子コードにより許される最大のコドン縮重を用いて作製するときに生じることがある。2つの核酸配列が実質的に同一であることの一つの目安は、第一核酸がコードするポリペプチドが、第二核酸によりコードされているポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。ただし、このような交差反応性は、2つのポリペプチドが実質的に同一であると思われる場合には、必要としない。
【0102】
(e)(ii)ペプチドに関連して種々の文法的形態で使用される「実質的な同一性」または「相同性」という用語は、ペプチドが、特定の比較ウィンドウについて、所望の同一性、例えば、基準配列に対して少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも70%の配列の同一性、基準配列に対してさらに好ましくは80%の配列の同一性、さらに好ましくは85%の配列の同一性、最も好ましくは少なくとも90%または95%の配列の同一性を有する配列を含んでなることを示す。好ましくは、最適な整列は、NeedlemanおよびWunsch,J.Mol.Biol.,48:443,1970の相同性整列アルゴリズムを用いておこなわれる。2つのペプチド配列が実質的に同一であることの目安は、一つのペプチドが第二ペプチドに対する抗体と免疫学的に反応性があることである。ただし、このような交差反応性は、2つのポリペプチドが実質的に同一であると思われるときには必要としない。したがって、例えば、2つのペプチドが、保存的置換によってのみ異なる場合、ペプチドは、第二ペプチドと実質的に同一である。「実質的に類似している」ペプチドは、同一でない残基位置が保存的アミノ酸変化により異なることがあることを除いて、上記したように、配列を共有している。保存的置換は、典型的には以下の基内の置換を含むが、これらには限定されない:グリシンおよびアラニン;バリン、イソロイシンおよびロイシン;アスパラギン酸およびグルタミン酸;アスパラギンおよびグルタミン;セリンおよびトレオニン;リジンおよびアルギニン;並びにフェニルアラニンおよびチロシン、並びに当業者に公知のもの。
【0103】
「ガラニン」という用語は、ガラニン核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号A28025、ヒトプレプロガラニンcDNA配列である配列番号1[UnigeneクラスターID(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/):Hs.1907,Human Galanin.]のヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするアミノ酸配列GenBank寄託番号CAA01907、ヒトプレプロガラニンアミノ酸配列である配列番号2と実質的な配列の相同性;または(iii)コードしているアミノ酸配列GenBank寄託番号AAB20740、ヒトガラニンペプチド配列である配列番号3と実質的な配列の相同性を有する)を意味する。
【0104】
ガラニンポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。「ガラニンポリヌクレオチド」および「ガラニンポリペプチド」は、天然、組み換えまたは合成(例えば、化学合成により得た)物であることができる。
【0105】
「GALR2」という用語は、GALR2核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003857、ヒトガラニン受容体2(GALR2)のヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするアミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号043603。UnigeneクラスターGALR2はHs.158351である]と実質的な配列の相同性を有する)を意味する。
【0106】
GALR2ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。「GALR2ポリヌクレオチド」および「GALR2ポリペプチド」は、天然、組み換えまたは合成(例えば、化学合成により得た)物であることができる。
【0107】
「GALR3」という用語は、GALR3核酸(DNAおよびRNA)、タンパク質(またはポリペプチド)、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003614、ヒトガラニン受容体3(GALR3)のヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするアミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号060755。UnigeneクラスターGALR3はHs.158353であり、寄託番号BF116239およびBF512731の2ESTを含む]と実質的な配列の相同性を有する)を意味する。
【0108】
GALR3ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。「GALR3ポリヌクレオチド」および「GALR3ポリペプチド」は、天然、組み換えまたは合成(例えば、化学合成により得た)物であることができる。
【0109】
「GALR2−GALR3ヘテロ複合体」という用語は、GALR2およびGALR3タンパク質もしくはポリペプチド、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003614、ヒトガラニン受容体3(GALR3)のGALR3ヌクレオチド配列またはGenBank寄託番号NM_003857、ヒトガラニン受容体2(GALR2)のGALR2ヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするGALR3アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号060755。UnigeneクラスターGALR3はHs.158353であり、寄託番号BF116239およびBF512731の2ESTを含む]またはGALR2アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号043603。UnigeneクラスターGALR2はHs.158351である]と実質的な配列の相同性を有する)の複合体、混合物または組み合わせを意味する。また、「GALR2−GALR3ヘテロ複合体」は、個々または転写もしくは翻訳融合としてタンパク質またはポリペプチド、それらの多型変異体、対立遺伝子、突然変異体および種間ホモログ((i)GenBank寄託番号NM_003614、ヒトガラニン受容体3(GALR3)のGALR3ヌクレオチド配列またはGenBank寄託番号NM_003857、ヒトガラニン受容体2(GALR2)のGALR2ヌクレオチド配列と実質的なヌクレオチド配列の相同性;または(ii)コードするGALR3アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号060755。UnigeneクラスターGALR3はHs.158353であり、寄託番号BF116239およびBF512731の2ESTを含む]またはGALR2アミノ酸配列[SWISS−PROT寄託番号043603。UnigeneクラスターGALR2はHs.158351である]と実質的な配列の相同性を有する)を発現する、構築物または発現ベクターにおける、GALR2核酸とGALR3核酸(DNAもしくはRNAまたはそれらのフラグメント)の混合物または組み合わせから得ることもできる。
【0110】
GALR2−GALR3ヘテロ複合体は、典型的にはヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジを含むが、これらには限定されない哺乳動物、すなわち、いずれかの哺乳動物からのものである。
【0111】
本明細書で使用される「生物学的検体」という用語は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体の核酸またはポリペプチドを含有しているか、または含有している疑いのある、生体内またはインサイチュで得られたり、到達したり、または採取された標的生物学的目標物を意味する。生物学的検体は、典型的には真核性のもの、例えば、昆虫類、原性動物、鳥類、魚類、は虫類、好ましくは哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギ、最も好ましくは霊長類、例えば、チンパンジーまたはヒト、例えば、診断検査、治療および/または治療のモニタリングを必要とする患者からのものである。
【0112】
本明細書で使用される「生物学的試料」という用語は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体の核酸またはポリペプチドを含有しているか、または含有している疑いのある、生体内またはインサイチュで得られたり、到達したり、または採取された生物学的組織または流体オリジンの試料を含む、生物学的検体から得られる試料を意味する。このような試料には、患者等のヒト、マウスおよびラットなどの哺乳動物から単離した器官、組織、画分および細胞などがあるが、これらには限定されない。また、生物学的試料には、組織、例えば、組織学的研究の目的のために採取された凍結切片などの、生物学的試料の切片も含まれる。生物学的試料は、典型的には真核生物起源のもの、例えば、昆虫類、原性動物、鳥類、魚類、は虫類、好ましくは哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウシ、イヌ、モルモットまたはウサギ、最も好ましくは霊長類、例えば、チンパンジーまたはヒトからのものである。
【0113】
「生物学的検体または試料を得る」とは、本発明に記載の方法に使用するための組織または細胞試料を含む、生体内またはインサイチュでの生物学的検体を得ることを意味する。これは、動物から細胞の試料を取り除くことによりおこなうことが最も多いが、生体内もしくはインサイチュまたは以前に単離した細胞(例えば、別の人から、別の時間で、および/または別の目的で単離したもの)を用いることによっておこなうこともできる。
【0114】
「対照試料」は、健康で癌のない動物を代表する生物学的材料の試料を意味する。対照試料におけるガラニン、GALR2、GALR3もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルまたはコードする対応遺伝子コピー数は、同じ種の正常で癌のない動物の一般的な集団の代表であることが望ましい。この試料は、本発明に記載の方法で使用される目的のための動物から採取することもできるし、あるいは、他の理由により採取されたものであるが、本発明による方法に使用するのに好適である、正常で癌のない動物を代表する生物学的材料であることもできる。また、対照試料は、癌を有するか、癌を有する疑いのある動物の正常組織から得ることもできる。また、対照試料は、正常で癌のない動物からの測定に基づいて以前に確立された、癌のない集団を代表する一定レベルのガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を意味することもできる。また、生物学的対照試料は、異なる個体から得られる試料を意味してもよいし、または集団から得られたベースラインデータに基づいた標準化値であることもできる。さらに、対照試料を、特定の年齢、性別、民族性または他の人口統計学的パラメータによって定義することもできる。ある状況では、対照は、特定の測定においては潜在的である。潜在的な対照の一例として、正常で癌のない動物の代表的なレベルよりも高いレベルが存在するときにのみ、検出法により、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体または対応の遺伝子コピー数が検出可能である場合が挙げられる。遺伝子の典型的な対照レベルは、細胞1個あたりのコピー数が2である。別の例は、アッセイの対照レベルが既知である場合の免疫組織化学的アッセイに関連するものである。このような対照の他の例は、当業者の知識の範囲内である。
【0115】
「データ」は、診断、予防、モニタリングまたは治療用の試験レベルを生成するのに適用される、上記したような「生物学的試料」または「対照試料」に関して得られる情報を含むが、これらには限定されない。本発明は、電子フォーマットまたは紙フォーマットに保存されているデータを比較および編集するための方法に関する。電子フォーマットは、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーなどからなる群から選択されることができ、データは、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションによるか、または上記の保存フォーマットのいずれかを用いることにより、表示、送信または解析される。ここで、データは、試料を採取する部位、または上記したプロセスに続いてデータを輸送する位置で、比較および編集される。
【0116】
ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子もしくはGALR3遺伝子の「過剰発現」、またはガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリヌクレオチドもしくはタンパク質またはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体の「増加した」または「上昇した」レベルは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の対照レベルと比較してそれぞれ高く検出される、ガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはGALR2−GALR3タンパク質ヘテロ複合体のレベルを意味する。発現の数値測定値について統計的解析により比較してもよいし、または適任の研究者により実験結果を目視により調査することにより比較してもよい。
【0117】
対照試料において「予測される」ガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルは、典型的な癌のない試料を表すレベルであり、且つそこからガラニン、GALR2もしくはGALR3のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドまたはGALR2−GALR3ヘテロ複合体が上昇または診断レベルで存在することが識別できるレベルを意味する。好ましくは、「予測」レベルは、その哺乳動物の年齢、性別、病歴等の因子だけでなく、試験される特定の生物学的検体について制御される。
【0118】
ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性をモジュレーションする化合物を試験するためのアッセイ(単一または複数)と関連して用いられる「機能的効果」という表現には、間接的または直接的にガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の影響下にあるいずれかのパラメータ、例えば、機能的、物理的または化学的効果、例えば、プロテアーゼ活性、癌細胞において遺伝子増幅または過剰発現を誘発する能力、および癌細胞増殖を悪化させる能力の測定が含まれる。「機能的効果」には、試験管内活性、生体内活性および生体外活性などが含まれる。
【0119】
「機能性効果を測定する」は、間接的または直接的にガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の影響下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的および化学的効果を増加または減少させる化合物についてアッセイすることを意味する。このような機能的効果は、当業者に公知のいずれかの手段、例えば、タンパク質についての分光特性(例えば、蛍光、吸光度、屈折率)、流体力学的性質(例えば、形状)、クロマトグラフィー特性または溶解度特性の変化、ガラニン、GALR2またはGALR3の誘導可能なマーカーまたは転写活性化の測定;結合活性の測定、または結合アッセイ、例えば、基質結合のアッセイおよび細胞増殖の測定;シグナル伝達の測定;細胞形質転換の測定等により、測定できる。
【0120】
「インヒビター」、「活性化剤」、「モジュレータ」および「調節因子」は、同定された機能を活性化、阻害、モジュレーション、調節および/またはブロックする分子を意味する。例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性について、このような分子は、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の試験管内アッセイおよび生体内アッセイを用いて確認できる。インヒビターは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を部分的または完全にブロックしたり、その活性化を減少、防止または遅延させたり、その細胞応答感度を減少させる化合物である。これは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質に、直接または受容体等の他の中間分子を介して結合することによりなされうる。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性の阻害を含む、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性をブロックする拮抗剤または抗体は、このようなインヒビターであると考えられる。活性化剤は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質に、直接またはそれらの受容体等の他の中間分子を介して結合することにより、その活性を増加させたり、高めたり、その活性化を促進したり、加速したり、またはその細胞応答を増感させたりする化合物である。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のアゴニストは、このような活性化剤であると考えられる。モジュレータは、インヒビターまたは活性化剤であることができる。モジュレータは、ガラニン、GALR2、GALR3もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体またはそれらの受容体を直接結合しても、しなくてもよい。モジュレータは、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性または活性化、またはガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する細胞感度に影響を及ぼしたり、変更したりする。また、モジュレータは、ガラニン、GALR2またはGALR3のmRNAの転写を阻害する小分子等の化合物であってもよい。ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の調節因子には、ガラニン、GALR2もしくはGALR3の遺伝子またはそのコード領域の転写/発現に影響を及ぼすおよび/またはそれを制御するいずれかの要素、例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド核酸等がある。
【0121】
また、本発明によるインヒビター、活性化剤、モジュレータおよび調節因子の群には、遺伝学的に修飾された種類のガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、例えば、活性を変更した種類も含まれる。したがって、この群には、天然のタンパク質だけでなく、合成リガンド、拮抗剤、アゴニスト、抗体、小化学分子等が含まれる。
【0122】
「インヒビター、活性化剤またはモジュレータのアッセイ」は、例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を試験管内、細胞において発現させ、推定インヒビター化合物、活性化化合物、モジュレータ化合物または調節因子化合物を適用した後、上述のようにしてガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性または転写に対する機能的効果を測定することを含む、実験手順を意味する。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を含有するか、含有する疑いのある試料を、可能性のある活性化剤、インヒビターまたはモジュレータで処理する。活性化、阻害または変化の程度は、意図する試料についての活性の測定値を対照試料と比較することにより調べられる。しきい値レベルを設定して、活性化または阻害を評価する。例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドの阻害は、対照に対するガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性値が80%以下であるときに得られると考えられる。同様に、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドの活性化は、対照に対するガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性値が2倍以上高いときに得られると考えられる。
【0123】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態でみられるときに通常ともなう成分が、その状態とは異なる程度まで少なくなっている物質を意味する。「単離する」とは、最初のソースまたは環境からのある程度までの分離を意味する。「精製する」とは、単離以上の高い程度にまで浄化することを意味する。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、他の物質が十分に不存在の状態であり、いずれの不純物も、タンパク質の生物学的性質に顕著に影響したり、不都合な結果を生じないような状態を意味する。すなわち、本発明による核酸またはペプチドは、細胞物質、ウイルス物質、または組み換えDNA法により産生したときには培地、または化学的前駆体もしくは化学的に合成したときには他の化学物質を実質的に含まないときには、精製されている。純度および均質性は、典型的には分析化学的方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて測定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて実質的に一つのバンドを生じることを示すことがある。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に附することができるタンパク質については、異なる修飾は、異なる分離タンパク質を生じることがあり、これらは、別個に精製できる。種々のレベルの純度は、本明細書に記載の種々の方法において本発明により必要に応じて適用できる。標準が特記されていない場合には、当技術分野において公知である通常の純度標準を使用できる。
【0124】
「単離された核酸分子」とは、状況に応じて、生体の天然ゲノムにおいて連続する遺伝子または遺伝子フラグメントの5’および3’コード配列から分離される核酸分子を意味することがある。また、「単離された核酸分子」という用語には、天然でない核酸分子、例えば、組み換えDNA法により生成した核酸分子も含まれる。
【0125】
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびその一本鎖または二本鎖の形態のポリマーを意味する。この用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、且つ基準ヌクレオチドと同様な方法で代謝される、合成、天然および非天然である、公知のヌクレオチド類似体または修正主鎖残基もしくは結合を含む核酸を含む。このような類似体としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2−o−メチルリボヌクレオチドおよびペプチド核酸(PNA)などがあるが、これらには限定されない。
【0126】
特に示さない限り、特定の核酸配列は、黙示的に、はっきりと明示された配列だけでなく、その保存的に修正した変異体(例えば、縮重コドンの置換)および相補的配列をも含む。具体的には、縮重コドンの置換は、一つ以上の選択された(または全ての)コドンの第三の位置が好適な混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置き換わった配列を生成することによりなされる(Batzer等、Nucleic Acid Res,19:081,1991;Ohtsuka等、J.Biol.Chem.,260:2600−2608,1985;Rossolini等、Mol.Cell Probes,8:91−98,1994)。「核酸」という用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと同じ意味で使用できる。
【0127】
「宿主細胞」は、発現ベクターを含み、且つ発現ベクターの複製または発現を支持する天然細胞または形質転換細胞である。宿主細胞は、培養細胞、外植片、生体内細胞等であることができる。宿主細胞は、原核細胞、例えば、大腸菌(E.coli)または真核細胞、例えば、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物細胞、例えば、CHO、HeLa等であってよい。
【0128】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸だけでなく、天然アミノ酸と同様な方法で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体をも意味する。天然アミノ酸は、遺伝子コードによりコードされているものだけでなく、後で修正されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびo−ホスホセリン、ホスホトレオニンでもよい。「アミノ酸類似体」は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造、すなわち、水素に結合している炭素、カルボキシル基、アミノ基およびR基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを有する化合物を意味する。このような類似体は、修正R基(例えば、ノルロイシン)または修正ペプチド主鎖を有するが、天然のアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。「アミノ酸模擬体」とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なるが、天然のアミノ酸と類似の方法で機能する構造を有する化学的化合物を意味する。アミノ酸および類似体は、当技術分野において周知である。
【0129】
アミノ酸は、それらの公知の3つの文字記号、またはIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推奨されている一文字記号により表すことができる。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般的に受け入れられている一文字コードにより表されることができる。
【0130】
「保存的に修飾した変異体」は、アミノ酸と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列について、保存的に修正された変異体は、同一または類似のアミノ酸配列をコードし、且つ縮重配列を含む、核酸を意味する。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUの全ては、アラニンをコードしている。したがって、アラニンが特定されている全てのアミノ酸の位置で、これらのコドンのいずれかが同じ意味で使用されて対応のヌクレオチド配列を構築することができる。得られる核酸変異体は、これらが同じタンパク質をコードするので、保存的に修正された変異体である(配列の改変のみであることを前提として)。当業者には、AUG(メチオニンについての唯一のコドン)およびUGG(トリプトファン)を除いて、核酸における各コドンを、保存的に修正して機能的に同一のペプチドまたはタンパク質分子を得ることができることが分かるであろう。
【0131】
アミノ酸配列に関して、当業者には、単一のアミノ酸または少数(典型的には約10より少ない)のアミノ酸を変更、付加または欠失する、ポリペプチドもしくはタンパク質配列に対する置換、欠失、または付加は、その改変により、アミノ酸が化学的に類似したアミノ酸に置き換えられる場合に「保存的に修正された変異体」であることは明らかであろう。保存的置換(同類置換)は、当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへの変更;アルギニンからリジンへの変更;アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへの変更;アスパルテートからグルタメートへの変更;システインからセリンへの変更;グルタミンからアスパラギンへの変更;グルタメートからアスパルテートへの変更;グリシンからプロリンへの変更;ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへの変更;イソロイシンからロイシンまたはバリンへの変更;ロイシンからバリンまたはイソロイシンへの変更;リジンからアルギニン、グルタミンまたはグルタメートへの変更;メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへの変更;フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニンへの変更;セリンからトレオニンへの変更;トレオニンからセリンへの変更;トリプトファンからチロシンへの変更;チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへの変更;バリンからイソロイシンまたはロイシンへの変更などがある。他の保存的および半保存的置換は当技術分野において周知であり、本発明の実施に用いることができる。
【0132】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、長さまたは翻訳後修正(例えば、グリコシル化またはリン酸化)とは無関係に、アミノ酸の鎖を説明するのに使用される。したがって、これらの用語は、本明細書において交換可能に使用してアミノ酸残基のポリマーを表すことができる。また、これらの用語は、一つ以上のアミノ酸残基が、対応の天然アミノ酸の人工の化学的模擬体である、アミノ酸ポリマーに適用される。したがって、「ポリペプチド」という用語には、全長天然タンパク質だけでなく、全長天然タンパク質または天然タンパク質の特定のドメインもしくは一部分に相当する組み換えまたは合成により生成したポリペプチドが含まれる。この用語は、アミノ末端メチオニンを付加して原核細胞における発現を容易にする、成熟タンパク質も含む。
【0133】
本発明によるポリペプチドは、化学的な合成または組み換えDNA法により合成できる。また、本発明によるポリペプチドは、これらが精製の標準的な生化学的方法により自然に発現される組織から精製できる。
【0134】
また、本発明には、本発明によるタンパク質またはポリペプチドの生物学的機能または活性の一つ以上を有する「機能性ポリペプチド」も含まれる。これらの機能または活性には、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質に通常結合するタンパク質の一部または全てを結合する能力が含まれる。
【0135】
機能性ポリペプチドは、本明細書に記載のガラニン、GALR2またはGALR3の標準配列であると考えられるものから修正された一次アミノ酸配列を含むことがある。好ましくは、これらの修正は、本明細書に記載の保存的なアミノ酸置換である。
【0136】
「標識」または「検出可能な部分」は、意図する核酸またはタンパク質分子と連結したときに、分光的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的または化学的手段により検出できるようになる組成物である。例えば、有用な標識としては、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素(例えば、ELISAにおいて一般的に使用されているもの)、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンなどがある。「標識核酸またはオリゴヌクレオチドプローブ」は、リンカーもしくは化学結合により共有的にか、またはイオン結合、ファンデルワールス力、静電気引力、疎水性相互作用、または水素結合により非共有的に、核酸またはプローブの存在が、核酸またはプローブに結合した標識の存在を検出することにより、標識に結合されるものである。
【0137】
本明細書で使用される「核酸またはオリゴヌクレオチドプローブ」という用語は、一種以上の化学結合、通常は相補塩基対形成、通常は水素結合形成により、相補配列の標的核酸に結合できる核酸として定義される。本明細書で使用される「プローブ」という用語には、天然(すなわち、A、G、CまたはT)または修正塩基(7−デアザグアノシン、イノシン等)が含まれる。さらに、プローブにおける塩基は、ハイブリダイゼーションを阻害しない限りは、ホスホジエステル結合以外の結合により接合できる。当業者には、プローブが、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じてプローブ配列との完全相補性を欠く標的配列を結合できることが分かるであろう。プローブは、好ましくは同位体、例えば、発色団、発光団、色原体で直接的に、またはストレプトアビジン複合体が後で結合できるビオチンで間接的に標識される。プローブの有無についてアッセイすることにより、意図する標的遺伝子の有無を検出できる。
【0138】
「に選択的に(または特異的に)ハイブリダイゼーションする」という表現は、配列が複合体混合物(例えば、総細胞またはライブラリーDNAまたはRNA)に存在するときに、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下に特定のヌクレオチド配列にのみへの分子の結合、デュープレキシングまたはハイブリダイゼーションを意味する。
【0139】
「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という表現は、プローブが、その標的相補配列に、典型的には核酸複合混合物においてハイブリダイゼーションするが他の配列にはハイブリダイゼーションしない条件を意味する。ストリンジェント条件は、配列依存性であり且つ環境依存性であり、例えば、配列が長いほど、より高い温度での特異性でハイブリダイゼーションすることができる。核酸のハイブリダイゼーションに対する指針が、Tijssen,Techniques in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Probes、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイのストラテジーの概要)」、(1993)に広範に記載されている。本明細書で使用される本発明との関連で使用される「ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションする」という用語は、互いに少なくとも60%相同であるヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリダイゼーションしたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明するために使用される。好ましくは、少なくとも約65%、より好ましくは少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約75%以上が互いに相同である配列が、典型的に互いにハイブリダイゼーションしたままである条件である。
【0140】
一般的には、ストリンジェント条件は、定義されたイオン強度pHでの特異的配列についての融点(Tm)よりも約5〜10℃低いように選択される。Tmは、標的に相補のプローブの50%が、平衡(標的配列がTmで過剰に存在すると、プローブの50%が平衡で占有される)で標的配列にハイブリダイゼーションする温度(定義されたイオン強度、pHおよび核酸濃度下)である。ストリンジェント条件は、塩濃度が、pH7.0〜8.3で約1.0M未満のナトリウムイオン、典型的には約0.01〜1.0Mナトリウムイオン濃度(または他の塩)であり、温度が、短いプローブ(例えば、10〜50ヌクレオチド)については少なくとも約30℃および長いプローブ(例えば、50ヌクレオチド超)のついては少なくとも約60℃である条件である。また、ストリンジェント条件は、脱安定化剤、例えば、ホルムアミドを添加することにより得ることもできる。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについては、陽性シグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも10倍である。
【0141】
例示的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、例えば、以下の条件であることができる:ホルムアミド50%、5xSSCおよび1%SDSにおいて42℃でインキュベーション、または5xSSCおよび1%SDSにおいて、65℃でインキュベーション、0.2xSSCおよび0.1%SDSにおいて、65℃で洗浄。別の条件には、例えば、少なくとも68℃で20時間のハイブリダイゼーションした後2xSSC、0.1%SDSにおいて55℃で30分間2回洗浄および60℃で15分間3回洗浄と同じストリンジェント条件が含まれる。別の代替条件として、6xSSCにおいて約45℃でのハイブリダイゼーション後、0.2xSSC、0.1%SDSにおいて50〜65℃で1回以上の洗浄がある。PCRについては、約36℃の温度が、低ストリンジェンシー増幅について典型である。ただし、アニーリング温度は、プライマー長さに応じて約32℃〜48℃で異なることができる。高ストリンジェンシーPCR増幅については、約62℃の温度が典型的であるが、高ストリンジェンシーアニーリング温度は、プライマーの長さおよび特異性に応じて約50℃〜約65℃の範囲であることができる。高ストリンジェンシー増幅および低ストリンジェンシー増幅の両方について典型的なサイクル条件として、90℃〜95℃で30秒間〜2分間の変性段階、30秒〜2分のアニーリング段階、約72℃で1〜2分間の伸長段階が挙げられる。
【0142】
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイゼーションしない核酸は、これらをコードしているポリペプチドが実質的に同一である場合には、依然として実質的に同一である。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードにより許される最大コドン縮重を用いて形成されるときに生じる。このような場合において、核酸は、典型的には、中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイゼーションする。例示的な「中程度のストリンジェントハイブリダイゼーション条件」としては、ホルムアミド40%、1M NaCl、1%SDSからなる緩衝液中、37℃でのハイブリダイゼーションおよび1xSSC、45℃での洗浄が挙げられる。陽性ハイブリダイゼーションは、バックグラウンドの少なくとも2倍である。当業者には、同様なストリンジェンシー条件とするのに、別のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用できることは、容易に分かるであろう。
【0143】
数値および範囲との関連で使用される「約」または「おおよそ」という用語は、本明細書に含まれる教示から当業者には明らかであるように、反応混合物に所望量の核酸またはポリペプチドを有するなど、本発明を意図したように実施できるような、近似するか、または挙げられた値または範囲に近い値または範囲を意味する。これは、少なくとも部分的には、核酸組成物、年齢、人種、性別が異なること、並びに生物系の解剖的変異、生理学的変異および不正確性によるものである。したがって、これらの用語は、統計誤差から生じる以上の値を含む。
【0144】
「抗体」は、抗原を特異的に結合し且つ認識する免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメントによりコードされているフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミューの定常領域遺伝子だけでなく、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子などが含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類される。重鎖は、それぞれ免疫グロブリンの種類であるIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEを定義する、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類される。典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含んでなる。各四量体は2つの同一のポリペプチド鎖対からなる。各対は、一つの「軽」鎖(約2kDa)と一つの「重」鎖(約70kDa以下)を有する。抗体は、例えば、無傷免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化により生成される多数の十分に特徴付けされたフラグメントとして存在する。種々の抗体フラグメントは、無傷抗体の消化の観点から定義されるが、当業者には、このようなフラグメントは、デノボ化学法または組み換えDNA法により合成できることが十分分かるであろう。したがって、本明細書で使用される用語「抗体」には、例えば、抗体全体の修正により生成される抗体フラグメント、組み換えDNA法を用いてデノボ合成したもの(例えば、一本鎖Fv)、ヒト化抗体、およびフェーズ表示ライブラリーを用いて同定されたものなども含まれる(例えば、Knappik等、J.Mol.Biol.,296:57−86,2000;McCafferty等、Nature、348:2−4,1990参照)。抗体(組み換え抗体、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体)の調製について、当技術分野において公知の手法を、本発明とともに使用できる(例えば、KohlerおよびMilstein,Nature,256(5517):495−497,1975;Kozbor等、Immunology Today,4:72,1983;Cole等、Monoclonal Antibodies and Cancer Theraphy,Alan R.Liss社、第77−96頁、1998参照)。
【0145】
一本鎖抗体の産生についての方法(米国特許第4,946,778号明細書参照)は、本発明によるポリペプチドに対する抗体を産生するのに適合させることができる。トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば、他の哺乳動物を使用して、ヒト化抗体を発現することができる。また、ファージ提示法を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックFabフラグメントを同定することもできる(例えば、McCafferty等,Nature,348:2−4,1990;Marks等、Biotechnology,10(7):779−783,1992参照)。
【0146】
「抗体」という用語は、アゴニスト抗体、アンタゴニスト抗体およびブロッキング抗体または中和抗体を含む、最も広義の意味で使用される。
【0147】
「ブロッキング抗体」は、上記したように、抗原の生物学的活性を特異的に結合およびブロックする、免疫グロブリン遺伝子またはそのフラグメント、相同体、類似体または模擬体によりコードされている可変およびフレームワーク領域を含んでなるポリペプチドを意味する一種の抗体である。例として、ガラニン、GALR2またはGALR3に対するブロッキング抗体は、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする。ブロッキング抗体は、ポリペプチドの臨界領域に結合し、これによりその機能を阻害する。臨界領域には、タンパク質−タンパク質相互作用部位、例えば、活性部位、機能ドメイン、リガンド結合部位および認識部位などが含まれる。ブロッキング抗体は、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて、抗原を少量(強い過敏性反応を生じない程度の少量)反復注射することにより、誘発させることができる(Bellanti JA,Immunology,WB Saunders社、第131−368頁(1971)参照)。ブロッキング抗体は、マーカータンパク質の機能のブロッキングおよび発癌性増殖の阻害に重要な役割を果たす。例えば、Jopling等、J.Biol.Chem.,277(9):6864−73(2002);Drebin等、Cell,41(3):697−706(1985);Drebin等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(23):9129−33(1986)参照。
【0148】
本明細書において、抗ガラニン、抗GALR2、抗GALR3または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体のブロッキング抗体による「腫瘍細胞の殺生」という用語は、機能または結合をブロッキングして腫瘍細胞増殖に関連した経路をブロッキングすることによる腫瘍細胞の増殖の阻害を意味する。例えば、抗表皮細胞成長因子受容体モノクローナル抗体は、自己分泌経路をブロッキングすることによりA431腫瘍細胞増殖を阻害する。Mendelsohn等、Trans Assoc Am Physicians,100:173−8(1987);Masui等、Cancer Res,44(3):1002−7(1984)参照。
【0149】
本明細書において、「ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用ブロッキング抗体」という用語は、ガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体との相互作用により、タンパク質の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害したり、腫瘍細胞殺生機構を介在したり、腫瘍細胞の増殖を阻害したりする、抗ヒトガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体を意味する。ガラニン、GALR2またはGALR3を発現する腫瘍細胞に単に結合するだけの抗体に対して、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対するブロッキング抗体は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性に関連する機構による腫瘍細胞殺生を介在する。腫瘍発生成長の阻害については、Drebin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(23):9129−33(1986)、および抗体介在抗増殖活性の例については、Mendelsohn等,Trans Assoc Am Physicians,100:173−8(1987)参照のこと。
【0150】
「抗ガラニン」抗体は、ガラニン遺伝子、cDNAまたはそのサブ配列によりコードされているポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。また、抗ガラニン抗体には、ガラニンの発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0151】
「抗GALR2」抗体は、GALR2遺伝子、cDNAまたはそのサブ配列によりコードされているポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。また、抗GALR2抗体には、GALR2の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0152】
「抗GALR3」抗体は、GALR3遺伝子、cDNAまたはそのサブ配列によりコードされているポリペプチドを特異的に結合する、抗体または抗体フラグメントである。また、抗GALR3抗体には、GALR3の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0153】
「抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体」抗体は、GALR2−GALR3ヘテロ複合体またはそのフラグメントを特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体には、GALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性を阻害するか、または腫瘍細胞増殖に対する抗増殖活性を介在するブロッキング抗体も含まれる。
【0154】
「癌ワクチン」は、癌に関連した特異的標的に対する免疫反応を開始する免疫系を刺激するように設計された物質である。免疫治療および癌ワクチンの一般的な概要については、Old L.J.,Scientific American,1996年9月発行を参照されたい。
【0155】
癌ワクチンは、予防型であっても、治療型であってもよい。典型的には、予防型ワクチン(例えば、インフルエンザワクチン)は、一般的にワクチンの標的と戦う細胞および/または他の物質(例えば、抗体)を生成するための免疫系を刺激するポリペプチドの一部分を含む。予防型ワクチンは、標的を攻撃することができる免疫細胞および物質を活性化および製造するのに十分な時間を免疫系に与えるために、標的(例えば、インフルエンザウイルス)に暴露する前に投与しなければならない。予防型ワクチンは、何年もの間、または個体の一生の間継続できる免疫反応を刺激する。
【0156】
治療型ワクチンは、既存の疾病の治療に使用される。したがって、治療型癌ワクチンの目標は、単に疾病を予防することではなく、むしろ免疫系を刺激して存在する癌細胞を攻撃することである。とりわけ、癌の種類が多いこと、および誰が癌にかかるか予測できないことが多いことから、現在開発されている癌ワクチンは治療型である。以下でさらに述べるように、既存の癌と戦うのが困難であるために、ほとんどのワクチンを、免疫反応を刺激するのに役立ち、および/または通常の癌治療と関連して使用される、サイトカインまたは補助剤と組み合わせて使用する。
【0157】
免疫系は、正常細胞を容認し、且つ異常細胞を認識および攻撃することができなければならない。免疫系に対しては、癌細胞は、正常細胞とはほんの少ししか相違しない。したがって、免疫系は、癌細胞を攻撃せずに容認し、その結果として癌が成長し、且つ広がることがある。したがって、癌ワクチンは、免疫反応を誘発するだけでなく、この容認を克服するのに十分な強さで免疫系を刺激しなければならない。最も有効な抗腫瘍免疫反応は、腫瘍細胞を直接認識し且つ殺すことができる、T細胞を刺激することによりなされることができる。したがって、最新の癌ワクチンは、T細胞を直接活性化しようとしたり、T細胞を活性化するために抗原提供細胞(APC)を得ようとしたり、これらの両方を試みる。例えば、研究者は、通常APC上にのみ存在する分子が腫瘍細胞上に存在するように腫瘍細胞を変更し、分子がT細胞に、最初の腫瘍細胞よりも強い活性化シグナルを与えることにより、およびサイトカインおよび補助剤を評価して必要としている領域にAPCを呼び寄せるのにはどれが最良であるかを決定することにより、T細胞の活性化を高めることを試みている。
【0158】
癌ワクチンは、腫瘍細胞全体または腫瘍により含まれる物質(例えば、抗原)から得ることができる。全細胞ワクチンについては、腫瘍細胞を、患者(一人または複数人)から取り出し、実験室で成長させ、処理することにより、確実にもはや増殖したり、患者に感染できないようにする。全腫瘍細胞をヒトに注射するとき、腫瘍細胞の抗原に対する免疫反応がおきる。2種類の全細胞癌ワクチンがある:1)患者自身の全不活性化腫瘍細胞を用いて調製した自己全細胞ワクチン;および2)別の個体の全不活性化腫瘍細胞(またはいくつかの個体からの腫瘍細胞)を用いて調製した同種異系全細胞ワクチン。抗原ワクチンは、全細胞からは調製されず、腫瘍により含まれた一種以上の抗原から調製する。ある種の抗原は、特定の種類の全ての癌に共通であり、あるものは、一つの個体に特有である。少数の抗原が、異なる種類の癌腫瘍の間で共有されている。
【0159】
抗原ワクチンにおける抗原は、いくつかの方法で送達されることができる。例えば、腫瘍細胞からのタンパク質またはそのフラグメントは、ワクチンとして直接投与できる。これらのタンパク質をコードしている核酸を投与してもよい(例えば、RNAワクチンまたはDNAワクチン)。さらに、ウイルスベクターを、これらがヒト細胞に感染し、細胞がその表面で腫瘍抗原を製造および表示するように設計できる。ウイルスベクターは、免疫反応を開始するが、ヒトを病気にするには十分でない少数のヒト細胞のみに感染できなければならない。また、ウイルスは、サイトカインを製造したり、それらの表面上でタンパク質を表示する(免疫細胞の活性化に役立つ)ように設計してもよい。これらは、単独で投与またはワクチンとともに投与して、免疫反応に役立てることができる。最後に、抗体自体を、ワクチン(抗イディオタイプワクチン)において抗原として使用できる。このように、腫瘍抗原に対する抗体を投与した後、B細胞は、腫瘍細胞も認識する、抗体に対する抗体を製造する。
【0160】
癌ワクチンは、免疫反応を高めるのに役立つ成分を含有することが多い。他の免疫細胞を攻撃の部位に集め、キラーT細胞がそれらの機能を果たすのに役に立つ化学的メッセンジャーであるサイトカイン(例えば、IL−2)が、しばしば用いられる。同様に、バクテリアなどの多様なソースから得た物質である補助剤により、それらを必要としている領域に免疫細胞が引き出されることが判明している。ある場合には、サイトカインと補助剤を癌ワクチン混合物に添加し、他の場合においては、これらを別個に投与する。
【0161】
癌ワクチンは、細胞表面(例えば、膜結合受容体またはそれらのサブパート)で通常発現される腫瘍抗原を標的とするように開発されることが最も多い。しかしながら、癌ワクチンは、細胞表面上に腫瘍特異的な様式で露出する細胞内抗原に対して有効なものとしてもよい。多くの腫瘍抗原は、例えば、HLAと複合体化した、細胞表面上で分解され、且つ発現される細胞内タンパク質である。これらの抗原は、細胞表面上にまばらに分散しているので、抗体治療で攻撃することが困難であることが多い。しかしながら、癌ワクチンは、実行できる別の治療法である。
【0162】
癌ワクチンは、外科手術、放射線または化学療法で原発性腫瘍を減少または除去した後に癌が再発するのを防止するのに、最も有用である。
【0163】
「免疫アッセイ」という用語は、抗体と抗原との間の結合相互作用を利用するアッセイである。典型的には、免疫アッセイでは、特定の抗体の特異的結合特性を使用して、抗原の単離、標的化、および/または定量が行なわれる。
【0164】
あるタンパク質またはペプチドに関連して、抗体に「特異的に(または選択的に)結合する」または「と特異的に(または選択的に)免疫反応する」という表現は、タンパク質および他の生物物質の不均一な集団において前記タンパク質が存在することを示す結合反応を意味する。したがって、指定の免疫アッセイ条件下では、特定の抗体が、バックグラウンドの少なくとも2倍のレベルで特定のタンパク質と結合し、且つ試料に存在する他のタンパク質には顕著な量では実質的に結合しない。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択される抗体が必要なことがある。例えば、特定のガラニン、GALR2、GALR3のペプチドまたはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドに対する抗体が、それぞれガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドと特異的に免疫反応するが、特異的ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドの多型変異体、オーソログおよび対立遺伝子を除いて、他のタンパク質とは免疫反応しない抗体のみを得るために選択できる。さらに、特定のガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドオーソログに対する抗体が、それぞれガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドオーソログと特異的に免疫反応するが、そのガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のポリペプチドオーソログの多型変異体、突然変異体および対立遺伝子を除いて、他のオーソログタンパク質とは免疫反応しない抗体のみを得るために選択できる。この選択は、必要に応じて所望のガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の分子と交差反応する抗体を差し引くことによりおこなうことができる。種々の免疫アッセイフォーマットを使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイを、通常の方法で使用して、タンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択する。免疫アッセイフォーマット、および特異的免疫反応性を測定するのに使用できる条件については、例えば、HarlowおよびLane,Antibodies,A Laboratory Manual,1988を参照のこと。
【0165】
「と選択的に関連する」という表現は、核酸が上記で定義したように別の核酸と、「選択的にハイブリダイゼーションする」能力、または抗体が上記で定義したようにタンパク質に「選択的に(または特異的に)結合する」能力を意味する。
【0166】
「siRNA」は、干渉を生じることができ、且つ細胞中、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中、および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において、特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じることができる小干渉RNAを意味し、これには、短ヘアピンRNA(shRNA)(Paddision等、Genes&Dev.16:948−958,2002)も含まれる。RNA干渉の現象は、Bass,Nature,411:428−29,2001;Elbashir等、Nature,411:494−98,2001;およびFire等、Nature,391:806−11,1998に記載され、考察がなされている。これらの文献では、干渉RNAの製造方法についても考察されている。本明細書に開示されている配列に基づくsiRNA(例えば、GALR3mRNA配列についてのGenBank寄託番号NM_003614)は、典型的には長さおよび構成が100塩基対(「bp」)未満、好ましくは約30bp以下であり、相補的DNA鎖または合成法の使用を含む当技術分野において公知の方法により製造できる。siRNAは、干渉を生じることができ、且つ細胞中、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中、および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じることができる。本発明による例示的なsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの周囲もしくはこれらの間のいずれかの数の塩基対を有する。
【0167】
「導入遺伝子」という用語は、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドのうちの一つまたはそのアンチセンス転写物をコードしている核酸配列であって、導入するトランスジェニック動物または細胞とは部分的または全体的に異種、すなわち、外来であるか、または導入するトランスジェニック動物または細胞の内在性遺伝子に対して相同であるが、挿入される細胞のゲノムを変更するように動物のゲノムに挿入されるように設計されるか、または挿入される(例えば、天然遺伝子とは異なる位置に挿入するか、またはその挿入がノックアウトを生じる)、核酸配列を意味する。導入遺伝子は、一つ以上の転写調節配列および他の核酸(例えば、イントロン)(選択された核酸の最適な発現に必要なことがある)を、含むことができる。
【0168】
「トランスジェニック動物」は、キメラであり、ほとんどの脊椎動物種で可能である、いずれかの動物、好ましくは非ヒト哺乳動物を意味する。このような種には、以下の非ヒト哺乳動物が含まれるが、これらには限定されない:げっ歯類、例えば、マウスおよびラット;ウサギ;鳥類または両生類;ヒツジ類、例えば、ヒツジおよびヤギ;ブタ類、例えば、ブタ;およびウシ類、例えば、ウシおよび水牛。上記動物の細胞の一つ以上は、人工的介入、例えば、当技術分野において周知の遺伝子組み換え法により導入された異種の核酸を含有する。核酸は、慎重な遺伝子操作、例えば、マイクロインジェクションまたは組み換えウイルスの感染により細胞の前駆体に導入することにより、直接的または間接的に細胞に導入される。「遺伝子操作」という用語は、古典的な交差ブリーディングまたは性的受精を含まず、組み換えDNA分子の導入を対象としている。この分子は、染色体に組み込まれてもよいし、または染色体外でDNAを複製してもよい。本明細書に記載の典型的なトランスジェニック動物では、導入遺伝子は、細胞に、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質のうちの一つの組み換え形態、例えば、アゴニスト形態またはアンタゴニスト形態を発現させる。しかしながら、組み換えガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子がサイレントであるトランスジェニック動物も考えられる。さらに、「トランスジェニック動物」には、一つ以上のガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の遺伝子破壊が、組み換え法およびアンチセンス法の両方を含む人工的介入により生じる組み換え動物も含まれる。導入遺伝子は、体細胞に限定してもよいし、または生殖系に配置してもよい。
【0169】
トランスジェニック動物を得る方法は、例えば、Puhler,A.編、「Genetic Engineering of Animals(動物の遺伝子工学)」、VCH社、1993;MurphyおよびCarter編、「Transgenesis Techniques:Principles and Protocols(Methods in Molecular Biology,Vol.18)(トランスジェネシス法:原理およびプロトコール(分子生物学における方法、第18巻))」、1993;並びにPinkert,CA編、「Transgenic Animal Technology:A Laboratory Handbook(トランスジェニック動物技術:実験ハンドブック)」、Academic Press社、1994に記載されている。
【0170】
「ノックアウト構築物」という用語は、哺乳動物の一つ以上の細胞における内在性遺伝子によりコードされているポリペプチドの発現を減少または抑制するように設計されるヌクレオチド配列を意味する。ノックアウト構築物として使用されるヌクレオチド配列は、典型的には(1)抑制されるべき内在性遺伝子のある一部分(一つ以上のエクソン配列、イントロン配列および/またはプロモーター配列)からのDNA、および(2)細胞におけるノックアウト構築物の存在を検出するのに使用されるマーカー配列から構成されている。ノックアウト構築物は、ノックアウトされるべき内在性遺伝子を含有する細胞に挿入することができる。次に、ノックアウト構築物は、内在性遺伝子(例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子)の対立遺伝子の一方または両方に組み込むことができ、ノックアウト構築物のこのような組込みにより、全長内在性遺伝子の転写を防止または遮断することができる。細胞染色体DNAへのノックアウト構築物の組込みは、典型的には相同組み換えによりおこなわれる(すなわち、内在性DNA配列に相同的または相補的であるノックアウト構築物の領域は、ノックアウト構築物が細胞に挿入されたときに互いにハイブリダイゼーションできる;次に、これらの領域を組み換えて、ノックアウト構築物が内在性DNAの対応の位置に組み込まれるようにすることができる)。
【0171】
「トランスジェニック」とは、細胞に挿入され、且つその細胞から発生する動物のゲノムの一部分となる核酸配列を含むいずれかの哺乳動物を意味する。このような導入遺伝子は、トランスジェニック動物に対して部分的または全体的に異種であることができる。
【0172】
したがって、例えば、天然のガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子を第二の種からの遺伝子に置き換えると、第二の種の受容体を産生する動物が得られる。天然の遺伝子を突然変異を有する遺伝子に置き換えると、突然変異受容体を産生する動物が得られる。ヒト由来のガラニン、GALR2またはGALR3の受容体を担持しているトランスジェニックマウスは、マウス由来のガラニン、GALR2またはGALR3のサブユニットをヒト由来の遺伝子に直接的に置き換えることによって作出することができる。これらのトランスジェニック動物は、ヒトの疾病のため、およびそれぞれの遺伝子に関連する障害または疾病の最終的な治療のための動物モデルについての薬剤アンタゴニストの研究に極めて重要である。これらの突然変異を担持するトランスジェニックマウスは、この疾病を研究するのに極めて有用である。
【0173】
ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の「ノックアウト」を担持しているトランスジェニック動物は、このような受容体が関与する疾病のための非ヒトモデルの確立のため、および生体内系における異なるガラニン、GALR2またはGALR3の受容体の活性を区別するのに有用であろう。「ノックアウトマウス」は、相同組み換えにより、天然または内在性のガラニン、GALR2またはGALR3の対立遺伝子(単一または複数)が破壊され、且つそれら自身の機能的なガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を産生しないマウスを意味する。ノックアウトマウスは、当技術分野において公知の方法にしたがって得ることができる(例えば、Thomas等、Immunol,163:978−84,1999;Kanakaraj等、J Exp Med,187:2073−9,1998;またはYeh等、Immunity,7:715−725,1997)。
【0174】
GALR3:
ヒトガラニン受容体3(GALR3)(GenBank寄託番号NM_003614.GALR3についてのUnigeneクラスターは、寄託番号BF116239およびBF512731である2ESTを含有するHs.158353である)は、ヒト肺腫瘍の25%およびヒト乳腫瘍の50%において増幅されるアンプリコンの中心点であると考えられる。このことは、該遺伝子が重要な生物学的機能を有し、腫瘍形成中に、遺伝子DNAコピーが増加するように選択されることを意味する。また、GALR3遺伝子は、ヒト肺癌においてしばしば過剰発現する。
【0175】
ヒト肺腫瘍のゲノムにおける増幅領域の探索において最初になされた試みは、cDNAマイクロアレイハイブリダイゼーション法によるものであった。例えば、米国特許第6,232,068号明細書;Pollack等、Nat.Genet.23(1):41−46,(1999)および当技術分野において公知の他の方法を参照のこと。次に、マイクロアレイ解析において、染色体長さ22アームバンド−q13−でのEST W69399が、肺腫瘍試料LU84で増幅することが判明した。W69399を含む領域をさらに解析したところ、GALR3が増幅領域の中心点であることを示す確証が得られた。
【0176】
GALR2:
ヒト癌においてしばしば増幅される上述の本発明によるGALR3の他に、本発明者等は、他の2つの公知のガラニン受容体、すなわち、GALR2およびGALR1(GALR3とのアミノ酸同一性は、それぞれ58%および36%である)について検討した。GALR2のみが、増加したGALR3遺伝子コピー数も含む同じ肺腫瘍で増幅することが判明した(表1および表2参照)。また、GALR2が、増加したGALR3遺伝子コピー数を含む同じ乳腫瘍で増幅することも分かった(表3参照)。DNAコピー数は、定量的PCR法を用いて測定した。
【0177】
ガラニン:
ガラニンは、ガラニン受容体に対するリガンドである(GenBank寄託番号A28025、ヒトプレプロガラニンcDNA配列[ガラニンについてのUnigeneクラスターは、Hs.1907、ヒトガラニンである];GenBank寄託番号CAA01907、ヒトプレプロガラニンのアミノ酸配列;およびGenBank寄託番号AAB20740、ヒトガラニンペプチド配列)。ガラニンは、増幅され、且つ過剰発現されたガラニン受容体を含有する肺腫瘍において、しばしば増幅され(70%超、試験試料54/77)、過剰発現する(78%、試験試料39/50)(表7参照)。このことは、該遺伝子が重要な生物学的機能を有し、腫瘍形成中に、遺伝子DNAコピーが増加するように選択されることを意味する。ガラニンは、ヒト肺腫瘍の70%超において増幅するアンプリコンの中心点にあると思われる(図3参照)。したがって、ガラニン遺伝子とその発現タンパク質産物を、癌治療について、診断または標的として使用でき、また、腫瘍および癌(例えば、肺癌)の診断、予防および治療に有用な化合物を同定するのにも使用できる。
【0178】
腫瘍におけるGALR2およびGALR3の遺伝子の増幅:
腫瘍において増幅された標的遺伝子の存在を、標的遺伝子のコピー数、すなわち、標的タンパク質をコードする細胞におけるDNA配列の数を測定することにより評価する。一般的に、正常2倍体細胞は、一定の常染色体遺伝子の2つのコピーを有する。しかしながら、コピー数は、例えば、癌細胞における遺伝子増幅または重複により増加したり、欠失により減少したりすることがある。特定の遺伝子のコピー数の評価方法は、当技術分野において周知であり、とりわけハイブリダイゼーションおよび増幅に基づくアッセイが挙げられる。
【0179】
【表1】
【0180】
【表2】
【0181】
【表3】
【0182】
多数のハイブリダイゼーションに基づくアッセイのうちのいずれかを使用して、生物学的試料の細胞におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数を検出することができる。このような方法の一つに、サザンブロッティングがある(上記したAusubel等またはSambrook等参照)。この方法では、ゲノムDNAを、典型的には断片化し、電気泳動で分離し、膜に移し、次に、ガラニン、GALR2またはGALR3の特異的プローブにハイブリダイゼーションさせる。標的領域についてのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルの強度と、同じゲノムにおける正常非増幅単一コピーゲノムDNAの領域からの対照プローブからのシグナルとを比較すると、特異的使用プローブに対応する相対的なガラニン、GALR2またはGALR3のコピー数の推定値が得られる。対照と比較してシグナルが増加した場合に、増幅があったことを示す。
【0183】
試料中のガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数を測定する方法として、インサイチュハイブリダイゼーション、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)がある(Angerer,1987 Meth.Enzymol.,152:649参照)。一般的に、インサイチュハイブリダイゼーションは、主に以下の工程を含んでなる:(1)分析される組織または生物学的構造体を固定する工程;(2)生物学的構造体をプレハイブリダイゼーション処理して、標的DNAの接近性を増加し、且つ非特異的結合を低減する工程;(3)生物学的構造体または組織の中の核酸に対して核酸混合物をハイブリダイゼーションさせる工程;(4)ハイブリダイゼーション後に洗浄して、ハイブリダイゼーションにおいて結合しなかった核酸フラグメントを除去する工程;(5)ハイブリダイゼーションした核酸フラグメントを検出する工程。このような用途に用いられるプローブは、典型的には、例えば、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識される。好ましいプローブは、ストリンジェント条件下で標的核酸(単一または複数)と特異的にハイブリダイゼーションするのに十分な長さ(例えば、約50、100または200ヌクレオチド〜約1000ヌクレオチド以上)を有する。
【0184】
DNAコピー数を測定する他の方法は、比較ゲノムハイブリダイゼーション法(CGH)である。比較ゲノムハイブリダイゼーション法では、核酸の「試験」採集物を第一標識で標識し、第二採集物(例えば、正常な細胞または組織からのもの)を第二標識で標識する。核酸のハイブリダイゼーションの比は、アレイにおける各ファイバーに結合している第一標識と第二標識との比により求める。例えば、試験採集物における遺伝子増幅による2つの標識からのシグナルの比の差を検出する。この比により、特異的使用プローブに相当するガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子コピー数の指標が得られる。DNAコピー数変化の細胞遺伝的表示は、CGHによりなすことができる。CGHでは、異なるように標識した試験ゲノムDNAおよび基準ゲノムDNAからの染色体の長さに沿った蛍光比が得られる。
【0185】
本発明による方法において使用するのに好適なハイブリダイゼーションプロトコールは、例えば、Albertson(1984)EMBO J.3:1227−1234;Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9138−9142;EPO Pub.No.430:402;Methods in Molecular Biology、第33巻:In Situ Hybridization Protocols,Choo編、Humana Press社、Totowa,NJ(1994)に記載されている。
【0186】
増幅に基づくアッセイを使用して、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数を測定することもできる。このようなアッセイでは、対応のガラニン、GALR2またはGALR3の核酸配列は、増幅反応(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわち、PCR)におけるテンプレートとしての役割を果たす。定量的増幅では、増幅産物の量は、オリジナル試料におけるテンプレートの量に比例する。適切な対照との比較により、上述の原理にしたがった特異的使用プローブに相当するガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子のコピー数の指標が得られる。TaqManプローブを用いたリアルタイム定量的PCRの方法は、当技術分野において周知である。リアルタイム定量的PCRについてのプロトコルの詳細は、例えば、RNAについては、Gibson等、1996、「A novel method for real time quantitative RT−PCR(リアルタイム定量的RT−PCRの新規な方法)」、Genome Res.,10:995−1001;およびDNAについては、Heid等、1996、「Real time quantitative PCR(リアルタイム定量的PCR)」、Genome Res.,10:986−994、に記載されている。
【0187】
Taqmanに基づくアッセイは、ガラニン、GALR2またはGALR3のポリヌクレオチドを定量するのにも使用できる。TaqManに基づくアッセイでは、5’蛍光染料と3’クエンチ剤とを含有する蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用する。このプローブは、PCR産物にハイブリダイゼーションするが、それ自体は、3’端にブロック剤があるために延長されることはない。PCR産物を、続いてのサイクルで増幅するときに、ポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性、例えば、AmpliTaqにより、TaqManプローブが切断される。この切断により、5’蛍光染料と3’クエンチ剤が分離され、これにより増幅との相関において蛍光が増加する(例えば、http://www2.perkin−elmer.com参照)。
【0188】
他の好適な増幅法には、リガーゼ連鎖反応(LCR)(WuおよびWallace,Genomics,4:560,1989;Landegren等、Science,241:1077,1988;およびBarringer等、Gene,89:117,1990参照)、転写増幅 (Kwoh等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:1173,1989)、自立した配列複製(Guatelli等、Proc Nat Acad Sci,USA 87:1874,1990)、ドットPCRおよびリンクアダプターPCR等があるが、これらには限定されない。
【0189】
DNAコピー数を測定するための一つの強力な方法は、マイクロアレイに基づくプラットホームを使用するものである。マイクロアレイ法は、高解像度が得られるので、使用可能である。例えば、従来のCGHは、一般的に20Mbの限定されたマッピング解像度であるのに対して、マイクロアレイに基づくCGHでは、異なるように標識した試験ゲノムDNAおよび基準ゲノムDNAの蛍光比により、DNAコピー数変化の遺伝子座ごとの指標が得られ、これによりマッピング解像度が増加する。種々のマイクロアレイ法の詳細が、文献に記載されている。例えば、米国特許第6,232,068号明細書;Pollack等、Nat.Genet.,23(1):41−46(1999)等を参照のこと。
【0190】
本明細書に記載の実施例から明らかなように、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子は、しばしば一定の癌(特に乳癌)において増幅され、増幅された染色体領域の中心点に存在する。また、表5および表7においてガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子の増幅を示す全ての試料は、ガラニン、GALR2およびGALR3のmRNAの過剰発現が生じたことを示している。ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子は、これらの過剰発現、増幅およびこれらの2つの間の相関の特徴を有しており、これらの特徴は、他の十分に研究された癌遺伝子と共通している(Yoshimoto等、JPN J Cancer Res,77(6):540−5,1986;Knuutila等、Am.J.Pathol.,152(5):1107−23,1998)。したがって、ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子は、本発明において癌の診断および治療の標的として使用される。
【0191】
腫瘍におけるガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子の頻発過剰発現:
腫瘍細胞におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の発現レベルを、調査した。以下の実施例で明らかにされるように、GALR3遺伝子は、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌および卵巣癌において過剰発現する。ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の発現の検出および定量は、直接ハイブリダイゼーションに基づくアッセイまたは増幅に基づくアッセイにより実施できる。遺伝子転写物を測定するためのハイブリダイゼーションに基づく方法は、当業者には公知である(Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Press社、NY、1989)。例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の有無または量を評価する一つの方法に、ノーザンブロッティング法がある。一定の生物学的試料から単離したmRNAを、電気泳動してmRNA種を分離し、ゲルから、ニトロセルロースまたはナイロンフィルター等の膜に転写する。次に、標識したガラニン、GALR2またはGALR3のプローブを、膜にハイブリダイゼーションさせてそれぞれのmRNAを同定および定量する。増幅に基づくアッセイの例としては、当技術分野において周知のRT−PCRなどがある(Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,1995年増補版)。好ましくは、定量的RT−PCRを使用して異なる試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のmRNAのそれぞれのレベルの数値を比較する。
【0192】
ガラニン、GALR2、GALR3およびGALR2−GALR3ヘテロ複合体を用いた癌の診断、治療およびワクチン:
【0193】
A.ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子の過剰発現および増幅:
ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子およびそれらの発現されたタンパク質産物は、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の診断、予後診断、合理的薬剤設計および他の治療上の診療のために使用できる。
【0194】
患者から採取した生物学的試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の増幅および/または過剰発現の検出および測定から、患者が腫瘍を発現したかどうかが分かる。特に、増幅ガラニン、GALR2またはGALR3のDNAが存在すると、高い精度の確率で、それぞれ癌状態または前癌状態、例えば、in、GALR2またはGALR3はGALR2−GALR3ヘテロ複合体肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の診断となる。したがって、本発明の一態様によれば、疑いのある組織から採取した試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のmRNA発現のレベルを測定し、ガラニン、GALR2またはGALR3がその組織で過剰発現したかどうかを決定することによる、哺乳動物の組織における癌または腫瘍を診断または特徴付けする方法が提供される。mRNAレベルを測定および評価するための、ハイブリダイゼーションに基づく方法および増幅に基づく方法を含む種々の方法が、上記したように本明細書において開示されている。また、本発明の別の態様によれば、疑いのある組織から採取した試料におけるガラニン、GALR2またはGALR3のDNAコピーの数を測定し、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子が組織において増幅したかどうかを決定することによる、哺乳動物組織における癌または腫瘍を診断する方法が提供される。DNAコピー数を測定および評価するためのハイブリダイゼーションに基づく方法および増幅に基づく方法を含む種々の方法が、上記したように本明細書で開示されている。したがって、本発明によれば、DNAレベルでの増幅遺伝子およびRNAレベルでの発現の増加を検出する方法であって、これらの結果の両方とも、腫瘍の進行を示している、方法が提供される。
【0195】
B.ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の検出:
本発明によれば、生物学的検体におけるガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のレベルの増加が検出された場合も、試料の組織ソースが前癌状態または癌状態にあることを示唆することができる。腫瘍および癌の診断および予後診断のためのタンパク質の検出は、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の標的に対する抗体を用いて、免疫アッセイにより実施できる。タンパク質の検出および定量のための当技術分野において公知である方法、とりわけ電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ハイパーディフュージョンクロマトグラフィー、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロット等を、本発明の方法に使用できる。分析すべき種類の組織または細胞から、タンパク質を、例えば、HarlowおよびLane,Antibodies:A Laboratory Manual(抗体:実験マニュアル)(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor,N.Y.1988)に記載のような標準的な方法を用いて単離できる。
【0196】
本発明において有用な抗体(またはそのフラグメント)は、さらに標的遺伝子ペプチドのインサイチュ検出のために、免疫蛍光または免疫電子顕微鏡法と同様に組織学的に用いることができる。インサイチュ検出は、患者から組織学的標本を取り出し、それに本発明の標識した抗体を適用することによりおこなうことができる。抗体(またはそのフラグメント)は、標識した抗体(またはフラグメント)を生物学的試料上にのせることにより適用するのが好ましい。このような手順を用いることにより、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の標的遺伝子産物の存在だけでなく、試験した組織の分布も測定できる。本発明を使用して、当業者は、多種多様な組織学的方法(例えば、染色法)のいずれかを改変してこのようなインサイチュ検出をおこなうことができることが、容易に理解できるであろう。
【0197】
タンパク質の検出に附する生物学的試料を、固相支持体または担体、例えば、ニトロセルロース、または細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定することができる他の固体支持体と接触させて、そこに固定化することができる。次に、支持体を、好適な緩衝液で洗浄した後、検出可能に標識されたフィンガープリント遺伝子特異的抗体で処理することができる。次に、固相支持体を、緩衝液で二回目の洗浄をおこなって未結合抗体を除去することができる。次に、固体支持体に結合した標識の量を、通常の手段で検出できる。
【0198】
一つの態様によれば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体等の標的産物特異的抗体を、酵素、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはグルコアミラーゼに結合させ、それを酵素免疫アッセイ(EIA)に使用することにより検出可能に標識できる(例えば、Voller,A.,1978,「The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(酵素結合免疫吸着アッセイ)」、Diagnostic Horizons,2:1−7;Voller等、J.Clin.Pathol.,31:507−520,1978;Butler,J.E.,Meth.Enzymol.,73:482−523,1981;Maggio,E.編、Enzyme Immunoassay,CRC Press社、Boca Raton,Fla.,1980;並びにIshikawa等編、Enzyme Immunoassay,工学書院、東京、1981参照)。抗体に結合した酵素は、好適な基質、好ましくは色素産生基質と反応して、例えば、分光光度的手段もしくは蛍光定量的手段によるか、または外観検査により検出できる化学的部分を生成する。
【0199】
したがって、本発明の関連した態様によれば、癌の診断および診療におけるガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体の使用が提供される。ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質およびポリペプチドに特異的に結合する抗体は、種々の方法により産生できる。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(mAbs)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fab発現ライブラリーにより産生されるフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Id)抗体、および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントなどがあるが、これらには限定されない。
【0200】
このような抗体は、例えば、標的遺伝子、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質、または生理学的または病理学的に重要なことがある特定の生物学的経路に関与しているフィンガープリントまたは経路遺伝子の検出に使用することができる。また、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体は、それぞれガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の活性を阻害する方法にも使用できる。したがって、このような抗体は、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の治療に使用できる。また、このような抗体は、診断法に使用することにより、患者は、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体にそれぞれ関連するガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質および/またはフィンガープリントまたは経路遺伝子タンパク質のレベルが異常でないかとか、このようなタンパク質が異常な形態でないかについて、試験されることができる。
【0201】
ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質に対する抗体を産生するために、宿主動物を、タンパク質またはその一部分で免疫化する。このような宿主動物には、ウサギ、マウスおよびラットなどがあるが、これらには限定されない。種々の補助剤を、宿主種に応じて免疫反応を増加するのに使用できる。補助剤には、フロイント(完全および不完全)、ミネラルゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン(KLH)、ジニトロフェノール(DNP)および有用である可能性のあるヒト補助剤、例えば、BCG(カルメット‐ゲラン杆菌)および瘡プロピオンバクテリウムなどがあるが、これらには限定されない。
【0202】
本発明におけるようなガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の特定の抗原に対する抗体の均一な集団であるモノクローナル抗体は、培養における連続細胞系による抗体分子の産生のための方法により得ることができる。これらには、KohlerおよびMilsteinのハイブリドーマ法(Nature,256:495−497,1975;および米国特許第4,376,110号)、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(Kosbor等、Immunology Today,4:72,1983;Cole等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026−2030,1983)およびBVハイブリドーマ法(Cole等、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Alan R.Liss社、1985)、第77〜96頁)などがあるが、これらには限定されない。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDを含むいずれかの免疫グロブリンおよびそのいずれかのサブクラスに属するものでよい。本発明のmAbを産生するハイブリドーマを、試験管内または生体内で培養できる。生体内での高力価のmAbの産生できるので、これは、現在の好ましい産生方法である。
【0203】
さらに、「キメラ抗体」の産生用に開発された方法では、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、スプライシングできる(Morrison等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851−6855,1984;Neuberger等、Nature,312:604−608,1984;Takeda等、Nature,314:452−454,1985;および米国特許第4,816,567号参照)。キメラ抗体は、異なるタンパク質が異なる動物種由来のもの、例えば、マウスmAb由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン由来のコンテナ領域を有するものである分子である。
【0204】
別法として、一本鎖抗体の産生について記載されている方法(例えば、米国特許第4,946,778号;Bird,Science,242:423−426,1988;Huston等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879−5883,1988;およびWard等、Nature,334:544−546,1989)およびヒト化モノクローナル抗体の製造について記載されている方法(米国特許第5,225,539号)を使用して、抗ディファレンシャル発現または抗経路遺伝子産物抗体を産生することができる。
【0205】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の方法により生成できる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により生成することができるF(ab’)2フラグメント、およびF(ab’)2フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成することができるFabフラグメントなどがあるが、これらには限定されない。別法として、Fab発現ライブラリーを構築して(Huse等、Science,246:1275−1281,1989)、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速且つ容易に同定できる。
【0206】
C.癌診断におけるガラニン、GALR2、GALR3およびGALR2−GALR3ヘテロ複合体のモジュレータの使用:
本発明の別の態様によれば、抗体の他に、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と相互作用する他の分子および化合物の、診断および治療への利用が提供される。具体的には、このような化合物として、標的の膜貫通型タンパク質の細胞外部分を含んでなるタンパク質またはペプチド(もしこれらが存在するならば)などを挙げることができるが、これらには限定されない。典型的なペプチドには、可溶性ペプチド、例えば、Igテールド融合ペプチドなどがある。このような化合物は、D−および/またはL−立体配置アミノ酸、ホスホペプチド(ランダムまたは部分的縮重ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含むがこれらには限定されない;例えば、Songyang等、Cell,72:767−778,1993参照)および小有機分子または小無機分子から作製したランダムペプチドライブラリー(例えば、Lam等,Nature,354:82−84,1991;Houghton等,Nature,354:84−86,1991参照)の生成およびスクリーニングにより得ることもできる。本発明のこの態様によれば、標的、すなわち、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質に結合するか、または標的と相互作用することができる細胞タンパク質に結合する化合物、および標的と他の細胞タンパク質との相互作用妨害することができる化合物をアッセイまたは同定する、多数の方法および手順が提供される。
【0207】
標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と特異的に結合する化合物を同定できる試験管内アッセイ系が提供される。これらのアッセイでは、全て、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質等の標的遺伝子産物と、試験化合物との反応混合物の調製がおこなわれる。この調製は、これらの2つの化合物が相互作用し且つ結合するのに十分な条件および時間で実施することにより、反応混合物において除去および/または検出できる複合体を形成する。これらのアッセイは、種々の方法でおこなうことができる。例えば、一つの方法では、標的タンパク質または試験物質を固相に固定し、標的タンパク質(反応の終わりで固相に固定された試験化合物複合体)を検出する。このような方法の一つの態様では、標的タンパク質を、固体表面上に固定でき、固定されない試験化合物を、直接または間接的に標識できる。実際に、マイクロタイタープレートを、固相として使用できる。固定された成分は、非共有または共有結合により固定化できる。非共有結合は、固体表面にタンパク質溶液を塗布し、乾燥することにより簡単におこなうことができる。別法として、固定化されるべきタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固体表面に固定できる。表面は、事前に調製し、保存できる。
【0208】
アッセイをおこなうために、非固定化成分を、固定した成分を含有する塗布面に添加する。反応完了後、未反応成分を、例えば、洗浄により除去し、固体表面に固定された複合体を、検出する。事前に固定化した成分を前標識する場合、表面に固定化された標識が検出された場合、複合体が形成されたことを示す。事前に非固定化された成分が前標識されない場合、間接的な標識を使用して、表面上に固定した複合体を、例えば、固定化した成分に特異的な標識抗体(この抗体は、次に標識抗Ig抗体で直接的または間接的に標識できる)を用いて検出できる。別法として、反応を液相でおこない、反応生成物を未反応成分から分離し、例えば、標的遺伝子または試験化合物に特異的な固定化抗体を用いて溶液において形成された複合体を固定し、可能性のある複合体の他の成分に特異的な標識した抗体を使用して固定複合体を検出することにより、複合体を検出することができる。
【0209】
また、標的タンパク質、すなわち、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体のタンパク質と相互作用することのできるいずれかの細胞タンパク質を同定するためのアッセイも、提供される。タンパク質−タンパク質相互作用を検出するのに好適な方法を使用して、標的タンパク質と細胞または細胞外タンパク質との間の新規な相互作用を同定することができる。これらの細胞または細胞外タンパク質は、一定の癌、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌に関与することがあり、標的、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3を含む一定の発癌性経路を示す。したがって、これらは、経路遺伝子と呼ばれることがある。
【0210】
勾配またはクロマトグラフィーカラムを用いた共免疫沈降および共精製等の方法を使用して、標的タンパク質が関与したタンパク質−タンパク質相互作用を同定できる。標的タンパク質、すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質またはその一部分のアミノ酸配列は、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質と相互作用する経路遺伝子産物または他のタンパク質を同定するのに有用である。アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列または公表されているデータベースの記録(SWISS−PROT、PIR、EMBL)から得ることができる。また、アミノ酸配列は、当業者に周知の方法、例えば、Edman分解法(例えば、Creighton,「Proteins:Structures and Molecular Principles(タンパク質:構造および分子の原理)」、1983,W.H.Freeman&Co.社、N.Y.,34−49参照)を用いて確認することもできる。標的遺伝子、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3のヌクレオチドサブ配列を、反応混合物に使用して、経路遺伝子配列についてスクリーニングすることができる。スクリーニングは、例えば、標準的なハイブリダイゼーションまたはPCR法によりおこなうことができる。オリゴヌクレオチド混合物の生成およびスクリーニングについての方法は、周知である(例えば、上記したAusubelのものおよびInnis等(編者)、「PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(PCRプロトコール:方法および用途ガイド)」、1990,Academic Press社、ニューヨーク参照)。
【0211】
例えば、生体内でのタンパク質の相互作用を検出するのにしばしば使用される酵母2ハイブリッド系が、ここで検討されている。Chien等は、あるバージョンの酵母2ハイブリッド系の使用を報告した(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88:9578−9582)。これは、Clontech社(カリフォルニア州Palo Altoに所在)から、市販されている。簡単に述べると、このような系を用いて、2ハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築する:第一ハイブリッドタンパク質は、公知のタンパク質、この場合腫瘍または癌に関与していることが知られているタンパク質に融合した転写因子、例えば、活性化タンパク質のDNA結合ドメインを含んでなり、第二ハイブリッドタンパク質は、cDNAライブラリーの一部分としてこのプラスミドに組み換えられたcDNAによりコードされている未知のタンパク質に融合している転写因子活性化ドメインを含んでなる。プラスミドを、発現が転写因子の結合部位により調節されているレポーター遺伝子、例えば、lacZを含有する酵母の菌株サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に形質転換する。いずれのハイブリッドタンパク質は単独では、レポーター遺伝子の転写を活性化できない。DNA結合ハイブリッドタンパク質は、活性化ドメイン機能を提供しないので、転写を活性化できない。活性化ドメインハイブリッドタンパク質は、その標的部位への結合に必要とするドメインを欠いているので転写を活性化できない。すなわち、活性化ドメインハイブリッドタンパク質は、転写活性化剤タンパク質の結合部位に局在化できない。DNA結合ハイブリッドタンパク質とライブラリーコードタンパク質との間の相互作用により、機能性転写因子を再構築され、レポーター遺伝子の発現を生じる。レポーター遺伝子の発現は、レポーター遺伝子産物用アッセイにより検出される。
【0212】
2ハイブリッド系または類似の方法を使用して、公知の「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質用活性化ドメインライブラリーをスクリーニングすることができる。多数の腫瘍および癌に関与しているガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子産物は、このような本発明によるベイトである。総ゲノムまたはcDNA配列を、活性化ドメインをコードしているDNAに融合する。このライブラリーと、DNA結合ドメインに融合したベイト遺伝子産物、すなわち、ガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質またはポリペプチドのハイブリッドをコードしているプラスミドを、酵母レポーター菌株に共形質転換され、得られた形質転換体を、レポーター遺伝子を発現するものについて、スクリーニングする。例えば、ベイト遺伝子ガラニン、GALR2またはGALR3を、GAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードしているDNAに翻訳融合されるようにベクターにクローニングできる。コロニーを精製し、レポーター遺伝子発現に関与している(ライブラリー)プラスミドを単離する。プラスミドにおけるインサートを配列決定して、cDNAまたはゲノムDNAによりコードされているタンパク質を同定する。
【0213】
ベイト遺伝子産物、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3と相互作用すると予想されるタンパク質を発現する細胞または組織ソースのcDNAライブラリーは、当技術分野において通常実施されている方法を用いて調製できる。ここに記載の特定の系によれば、cDNAフラグメントを、これらがGAL4の活性化ドメインに翻訳融合するようにベクターに挿入することにより、ライブラリーを生成する。このライブラリーを、ベイト遺伝子−GAL4融合プラスミドとともに、GAL4活性化配列を含むプロモーターにより発現が制御されるlacZ遺伝子を含む酵母菌株に共形質転換できる。ベイト遺伝子産物と相互作用するGAL4活性化ドメインに融合したcDNAコードタンパク質は、活性GAL4転写因子を再構築し、これによりlacZ遺伝子の発現を促進する。lacZを発現するコロニーは、X−galの存在下でそれらのブルー色により検出できる。このようなブルーコロニーからのcDNA含有プラスミドは、次に精製し、使用して、当技術分野において通常実施されている方法を用いて、ガラニン、GALR2またはGALR3相互作用タンパク質を産生および単離できる。
【0214】
また、本発明の別の態様によれば、標的ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質が関与する遺伝子と細胞タンパク質との相互作用を妨害する化合物のアッセイが提供される。標的遺伝子タンパク質、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質は、生体内で、一つ以上の細胞または細胞外マクロ分子、例えば、タンパク質および核酸分子と相互作用することができる。このような細胞または細胞外マクロ分子は、「結合パートナー」と称される。このような相互作用を破壊する化合物を使用して、標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質、とりわけ突然変異標的遺伝子産物の活性を調節できる。このような化合物として、抗体、ペプチドおよび他の化学化合物等の分子を挙げることができるが、これらには限定されない。
【0215】
アッセイ系では、全て、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質および結合パートナーを含有する反応混合物の調製を、これらの2つの産物が相互作用し且つ結合して複合体を形成するのに十分な条件および時間で実施する。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を、試験化合物の存在下および不存在下で調製する。試験化合物を、最初に反応混合物に含ませるか、または標的遺伝子産物およびその細胞または細胞外結合パートナーの添加に続いて添加することができる。対照反応混合物を、試験化合物を使用しないか、プラシーボとともにインキュベーションする。次に、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と、細胞または細胞外結合パートナーとの間の複合体の形成を、検出する。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応において複合体が形成された場合、化合物が標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質とインタラクティブ結合パートナーとの相互作用を妨害することを示す。さらに、試験化合物と正常標的遺伝子産物を含有する反応混合物内の複合体形成を、試験化合物と突然変異標的遺伝子産物を含有する反応混合物内の複合体の形成と比較できる。この比較は、正常標的遺伝子産物ではなく突然変異体の相互作用を破壊する化合物を同定するのが望ましい状況では、重要なことがある。
【0216】
アッセイは、不均一または均一フォーマットでおこなうことができる。不均一アッセイでは、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質または結合パートナーを、固相に固定し、上記したように反応の終わりで固相に固定した複合体を検出する。不均一アッセイでは、反応全体を、以下で説明するように、液相で実施する。いずれの方法でも、反応剤の添加の順序を変えて、試験化合物についての異なる情報を得ることができる。例えば、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と結合パートナーとの間の相互作用を、例えば、競合により妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応をおこなうこと、すなわち、試験物質を反応混合物に、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質およびインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーの前または同時に添加することにより同定できる。別法として、予め形成した複合体を破壊する試験化合物、例えば、複合体からの成分の一つを置き換えるより高い結合定数を有する化合物は、試験化合物を、反応混合物に、複合体が形成された後に添加することにより試験することができる。
【0217】
均一アッセイでは、標的遺伝子産物とインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナー産物との予備形成複合体を、調製する。この場合、標的遺伝子産物またはそれらの結合パートナーを標識するが、標識により生成されるシグナルは、複合体の形成によりクエンチされる(例えば、Rubensteinによる米国特許第4,109,496号参照)。予備形成した複合体から種の一つと競合し且つ置き換わる試験物質を添加すると、バックグラウンドより大きいシグナルが生成する。このようにして、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質と細胞または細胞外結合パートナーとの間の相互作用を破壊する試験物質を、同定できる。
【0218】
一つの態様によれば、標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質を調製し、組み換えDNA法を用いて固定化できる。例えば、標的ガラニン、GALR2またはGALR3遺伝子コード領域を、pGEX−5X−1等の融合ベクターを用いて、その結合活性が得られた融合産物において維持されるようにして、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)遺伝子に融合できる。インタラクティブ細胞または細胞外結合パートナー産物を、精製し、使用して、当技術分野において通常実施されている方法を用いてモノクローナル抗体を得る。この抗体に、放射性同位体125Iを、例えば、当技術分野において通常実施されている方法により標識できる。
【0219】
不均一アッセイでは、GST−標的遺伝子融合産物を、例えば、グルタチオン−アガロースビーズに固定する。次に、インタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーを、相互作用と結合が生じるように、試験化合物の存在下または不存在下で添加する。反応時間の終わりに、未結合物質を洗浄して除去し、標識したモノクローナル抗体を、この系に添加して、複合化成分に結合させることができる。標的遺伝子産物ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質とインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーとの間の相互作用を、グルタチオン−アガロースビーズと関連して残存する対応の放射能の量を測定することにより検出する。試験化合物による相互作用の阻害がうまくいくと放射能の測定値が減少する。別法として、GST−標的遺伝子融合産物とインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナーを、固体グルタチオン−アガロースビーズの不存在下、液体中で一緒に混合することができる。結合パートナーを相互作用させている間またはその後に、試験化合物を添加する。次に、この混合物を、グルタチオン−アガロースビーズに添加し、未結合物質を洗浄除去する。ここでも、結合パートナーの相互作用の阻害の程度は、標識抗体を添加し、ビーズに関連した放射能を測定することにより、検出できる。
【0220】
本発明の別の態様によれば、全長産物の一つまたは両方の代わりに、標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質の結合ドメインに相当するペプチドフラグメント、およびインタラクティブ細胞または細胞外結合パートナー(結合パートナーが産物の場合)を用いて、これらの同じ方法が用いられる。当技術分野において通常実施されている多数の方法を使用して、タンパク質の結合部位を同定および単離することができる。これらの方法には、産物の一つをコードしている遺伝子の一つの突然変異誘発、および共免疫沈降アッセイにおける結合の破壊についてのスクリーニングなどがあるが、これらには限定されない。
【0221】
さらに、複合体における第二種をコードしている遺伝子における補正突然変異(compensating mutations)を選択することができる。それぞれの産物をコードしている遺伝子の配列解析により、インタラクティブ結合に関与している産物の領域に相当する突然変異が明らかとなる。別法として、一つの産物を、上記した方法を用いて固体表面に固定し、タンパク質分解酵素、例えば、トリプシンで処理したその標識した結合パートナーと相互作用させ且つ結合できる。洗浄後、結合ドメインを含んでなる短鎖標識ペプチドは固体物質と結合したままであるため、これを単離すること、およびアミノ酸配列決定によりこれを同定することができる。また、細胞または細胞外結合パートナー産物をコードしている遺伝子がいったん得られると、短遺伝子セグメントを、産物のペプチドフラグメントを発現するようにした後、結合活性について試験し、精製または合成されことができる。
【0222】
D.ガラニン、GALR2およびGALR3のモジュレータを用いた癌の治療法:
本発明の別の態様によれば、癌または腫瘍およびそれと関連した症状を治療または制御する方法が提供される。結合化合物、例えば、上記したアッセイ系において同定されたもののいずれかを、腫瘍および癌(例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣癌)の症状を予防および/または改善する能力について試験できる。本明細書で使用される用語である阻害、制御、改善、予防、治療および抑制は、まとめておよび相互に交換可能に、癌の形成、進行または成長を停止または遅くすること、および癌の症状を無くすか、減少させることを意味する。本発明によれば、腫瘍および癌の症状を予防および/または改善する試験化合物の能力を評価するための、細胞系および動物モデルに基づくトライアルシステムを使用する。
【0223】
例えば、細胞系システムを、乳癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、前立腺癌または卵巣の腫瘍または癌の症状を改善する可能性のある化合物に暴露することができる。この場合、濃度と暴露の時間は、暴露された細胞においてそのような改善を引き出すのに十分な濃度と時間である。暴露後、細胞を、一つ以上の腫瘍または癌の表現型がより多くの正常またはより多くの野生型非癌状態表現型に似るように変更されたかどうかについて調べる。さらに、これらの細胞内のガラニン、GALR2またはGALR3のmRNA発現およびDNA増幅のレベルを、上記に記載した方法によって測定してもよい。発現および増幅の測定レベルが減少した場合には、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の診療がある程度うまくいっていることを示している。
【0224】
さらに、動物モデルを、腫瘍および癌の症状を治療または抑制できる薬剤および医薬として使用するための化合物を同定するために使用できる。例えば、動物モデルを、試験化合物に、暴露された動物においてこのような改善を引き出すのに十分な濃度および時間で暴露できる。この暴露に対する動物の反応は、腫瘍または癌と関連した症状の逆転を評価したり、DNAコピー数およびガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子のmRNA発現のレベルの変化を評価することにより、モニタリングすることができる。腫瘍および癌の症状を逆転および/または標的ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の過剰発現および増幅の減少を生じる治療は、ヒトにおける治療に使用できる候補と考えることができる。試験薬剤の投与量は、用量−応答曲線を得ることにより求めることができる。
【0225】
さらに、フィンガープリントパターンまたは遺伝子、遺伝子発現プロフィールを、細胞系および/または動物系モデルシステム内で、公知の細胞状態、例えば、正常または公知の前腫瘍性、腫瘍性または転移状態について特徴付けることができる。続いて、これらの公知のフィンガープリントパターンを比較して、このようなフィンガープリントパターンを修正したり、パターンを正常フィンガープリントパターンにさらに似るようにさせる、試験化合物の能力を確認することができる。例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子発現および増幅と相互作用し且つそれらに影響を及ぼす化合物を投与することにより、癌状態のモデルシステムのフィンガープリントパターンを、対照正常系により似るようにさせることができる。したがって、このような化合物は、癌の治療に利用できる。他の状況では、化合物を投与することにより、対照システムのフィンガープリントパターンを、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)に似はじめさせることができる。したがって、このような化合物は、発癌剤としての役割を果たし、ひいては、癌およびその診断の治療診療の標的としての役割を果たすことができる。
【0226】
E.癌治療の有効性のモニタリング方法:
本発明のさらなる態様によれば、癌の治療上の処置計画の有効性のモニタリング方法、および腫瘍の阻害についての臨床試験における化合物の有効性をモニタリングする方法が提供される。癌の治療または臨床試験のための処置計画の適用の過程の最中での種々の時点で患者から採取した生物学的試料において、ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の発現または増幅の変化レベルを検出および測定することにより、モニタリングをおこなうことができる。より前の日よりも、治療または臨床試験の後の時点で採取された試料において発現および/または増幅のレベルが低い場合には、処置計画が、患者における癌を制御するのに有効であるか、または化合物が腫瘍を阻害するのに有効であることを示している。時間的経過の検討は、処置計画または化合物がその効果を示すのに十分な時間がとれるように設計する必要がある。
【0227】
したがって、腫瘍および癌に対する化合物の影響は、臨床試験および基本的な薬剤スクリーニングの両方においてモニタリングできる。臨床試験では、例えば、腫瘍細胞を、外科手術で取り出した肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣の腫瘍から単離し、RNAを調製し、本明細書に記載のようなノーザンブロッティング分析またはTaqmanRT−PCRによるか、産生したタンパク質の量を測定することにより、分析できる。このようにして得られたフィンガープリント発現プロフィールは、肺、脳、乳房、結腸、前立腺または卵巣の腫瘍または癌のための推定バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。特に、ガラニン、GALR2またはGALR3の発現は、一つのこのようなバイオマーカーとしての役割を果たす。したがって、ガラニン、GALR2またはGALR3等の異なる形で発現された遺伝子または過剰発現した遺伝子の発現レベルをモニタリングすることにより、好適な化学療法抗癌剤を用いて、効果的な治療プロトコールを開発できる。
【0228】
F.癌治療におけるガラニン、GALR2またはGALR3のヌクレオチドに対するモジュレータの使用:
本発明のさらなる態様によれば、腫瘍の治療のためのさらなる化合物および方法が提供される。腫瘍および癌の症状は、例えば、標的遺伝子のモジュレーションによるか、および/または前癌状態または癌状態の細胞の枯渇により制御できる。標的遺伝子のモジュレーションは、標的が、遺伝子(例えば、発癌性)または腫瘍抑制遺伝子(例えば、腫瘍抑制性)に似ているかどうかによって、負または正であることができる。すなわち、癌遺伝子様標的遺伝子の阻害、すなわち、負のモジュレーション、または腫瘍サプレッサ様標的遺伝子の刺激、すなわち、正のモジュレーションは、標的遺伝子が関与する腫瘍または癌を制御または改善する。すなわち、「負のモジュレーション」は、モジュレーション処理の不存在下での標的遺伝子産物のレベルおよび/または活性に対しての、標的遺伝子またはその産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のレベルおよび/または活性の減少を意味する。「正のモジュレーション」は、モジュレーション処理の不存在下での標的遺伝子またはその産物のレベルおよび/または活性に対しての、標的遺伝子産物、例えば、ガラニンタンパク質、GALR2タンパク質、GALR3タンパク質またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のレベルおよび/または活性の増加を意味する。特に、ガラニン、GALR2またはGALR3は、上記で説明した周知の癌遺伝子と数多くの特徴が共通であるので、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子、そのタンパク質またはその活性の阻害により、癌状態、例えば、肺癌および/または脳腫瘍および/または乳癌および/または結腸癌および/または前立腺癌および/または卵巣癌が制御または改善される。
【0229】
本発明によれば、癌に関与しているガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子を阻害または抑制するための方法、すなわち、負のモジュレーション法が提供される。例えば、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対して負のモジュレーション活性を示す化合物を本発明に使用して、腫瘍および癌(例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌)の症状を予防および/または改善できる。このような分子として、ペプチド、ホスホペプチド、小分子(分子量:約500未満)、大分子(分子量:約500超)または抗体(例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗イディオタイプ抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体並びにFab、F(ab’)2およびFab発現ライブラリーフラグメントおよびそれらのエピトープ結合フラグメントを含む)、並びにガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の複製、転写または翻訳を妨害する核酸分子(例えば、アンチセンス核酸分子、siRNA、三重らせん形成分子、およびリボザイム(これらは、単独で使用しても、組み合わせて使用してもよい))を挙げることができるが、これらには限定されない。
【0230】
ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、siRNAおよびリボザイム分子は、標的遺伝子およびその産物の機能的活性のレベルを減少、例えば、それぞれガラニン、GALR2またはGALR3の触媒能力を減少できる。また、関連する三重らせん形成分子も、標的遺伝子の活性のレベルを減少するのに使用できる。これらの分子は、野生型または適切な場合は突然変異標的遺伝子活性を低減または阻害するように設計できる。
【0231】
例えば、アンチセンスRNAおよびDNA分子は、標的mRNAへのハイブリダイゼーション、およびタンパク質の翻訳の防止により、mRNAの翻訳を直接ブロッキングするように作用する。アンチセンスDNAについては、例えば、意図する標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10〜+10の領域の間の翻訳開始部位に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが、好ましい。
【0232】
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することができる酵素RNA分子である。これについては、Rossi,Current Biology,4:469−471(1994)において、検討されている。リボザイムの作用機構では、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション後に、内ヌクレオチド結合分解性切断がおこなわれる。リボザイム分子の組成には、標的遺伝子mRNAに相補的な一つ以上の配列が含まれ、且つmRNA切断を生じさせる周知の触媒配列が含まれなければならない(米国特許第5,093,246号明細書)。ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的タンパク質をコードしているRNA配列の内部切断を特異的且つ効率的に触媒することができる、人工的に作り出されたハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子を、本発明にしたがって癌診療に使用することができる。
【0233】
いずれかの可能性のあるRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、最初に意図する分子、例えば、ガラニン、GALR2またはGALR3のRNAを、以下の配列、GUA、GUUおよびGUCを含むリボザイム切断部位についてスキャンニングすることにより、同定される。切断部位を含むガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の領域に相当する15〜20リボヌクレオチドの一旦同定された短RNA配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適当にすることがある二次構造等の予測構造特徴について評価することができる。候補配列の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する接近性を試験することにより、評価することができる。
【0234】
また、ガラニン、GALR2およびGALR3の遺伝子配列を、RNA干渉において用いることができる。RNA干渉の現象は、Bass,Nature,411:428−29(2001);Elbashir等、Nature,411:494−98(2001);およびFire等、Nature,391:806−11(1998)に記載され、考察されている。これらの文献では、干渉RNAの製造方法についても考察されている。本明細書に開示されている配列に基づくsiRNA(例えば、それぞれガラニン、GALR2およびGALR3のmRNA配列についてのGenBank寄託番号NM_003857およびNM_003614)は、典型的には長さおよび構成が100塩基対(「bp」)未満、好ましくは約30bp以下であり、相補的DNA鎖または合成法の使用を含む当技術分野において公知の方法により製造できる。干渉を生じることができるRNAは、小干渉RNA(「siRNA」)と称することができ、且つ細胞中、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中、および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内で特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じることができる。本発明による典型的なsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの周囲もしくはこれらの間のいずれかの数の塩基対を有する。
【0235】
三重鎖形態(三重らせん)において一緒に会合でき、これにより標的遺伝子の転写を阻害するのに使用できる核酸分子は、デオキシヌクレオチドからなる単一らせんでなければならない。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、一般的に二本鎖のうちの一つの鎖上のプリンまたはピリミジンのかなり大きな伸長を必要とする、Hoogsteen塩基対合則により三重らせん形成を促進するように設計しなければならない。ヌクレオチド配列は、得られた三重らせんの3つの関連した鎖にわたってTATおよびCGCトリプレットを生じる、ピリミジン系であることができる。ピリミジンリッチ分子により、鎖に対して平行に配列した二本鎖のうちの一つの鎖のプリンリッチ領域に相補的な塩基が得られる。さらに、プリンリッチ、例えば、長く伸びたG残基を含む、核酸分子を選択できる。これらの分子は、プリン残基の大部分は、標的二本鎖のうちの一つの鎖上に位置しているGC対リッチであるDNA二本鎖とともに三重らせんを形成して、三重らせんにおける3つの鎖にわたってGGCトリプレットを生じる。別法として、三重らせん形成について標的とすることができる可能性のある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を作製することにより増加できる。スイッチバック分子は、これらの分子が、二本鎖のうちの一つの鎖と塩基対を形成後、他の鎖と塩基対を形成するように、交互5’−3’、3’−5’法で合成して、二本鎖のうちの一つの鎖上のプリンまたはピリミジンのかなり大きな伸長の必要性をなくす。
【0236】
本明細書に記載されているアンチセンス、リボザイム、siRNAおよび三重らせん形成分子を使用して突然変異遺伝子発現を低減または阻害する場合には、正常標的遺伝子対立遺伝子により産生されるmRNAの転写(例えば、三重らせんを用いて)および/または翻訳(例えば、アンチセンス、リボザイム分子を用いて)を効果的に低減または阻害することもできる。これらの状況は、細胞または組織における正常レベルを、突然変異体が阻害されている状態で維持する必要がある腫瘍抑制遺伝子に関連している。これをするために、使用されるいずれかのアンチセンス、リボザイムまたは三重らせん形成分子による阻害に対して耐性があり、且つ正常標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし且つ発現する核酸分子を、遺伝子治療法により細胞に導入できる。別法として、標的遺伝子は、細胞外タンパク質をコードしているとき、正常標的遺伝子タンパク質を細胞または組織に共投与して細胞または組織標的遺伝子活性の必要レベルを維持するのが好ましいことがある。これに対して、ガラニン、GALR2またはGALR3等の癌遺伝子様標的遺伝子の場合には、抑制される必要のある、それぞれ正常野生型ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子およびそのタンパク質である。したがって、ガラニン、GALR2またはGALR3の機能を欠くか、またはその正常機能を妨害するか、完全に取り除く突然変異体または変異体が、癌治療には望ましい。したがって、正常遺伝子対立遺伝子を保護するための上記したのと同じ方法を、本発明に使用して、アンチセンス、リボザイムおよび三重らせん処理の適用において標的遺伝子の突然変異体を保護することができる。
【0237】
本発明によるアンチセンスRNAおよびDNA、リボザイムおよび三重らせん形成分子は、DNA分子およびRNA分子の合成についての当技術分野において公知の標準的な方法により調製できる。これらには、例えば、固相ホスホルアミダイト化学合成等の当技術分野において周知のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成するための方法などがある。別法として、RNA分子を、アンチセンスRNA分子をコードしているDNA配列の試験管内および生体内転写により生成できる。このようなDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーター等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターも含む多種多様なベクターに組み込むことができる。別法として、使用されるプロモーターに応じてアンチセンスRNAを構成的または誘発的に合成するアンチセンスcDNA構築物を、安定的に細胞系に導入できる。DNA分子に対する種々の周知の修飾を、細胞内安定性および半減期を増加するための手段として導入できる。可能な修飾として、分子の5’端および/または3’端へのリボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴデオキシリボヌクレオチド主鎖内のホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは2’O−メチルの使用などが挙げられるが、これらには限定されない。
【0238】
さらに、本発明のこの態様によれば、抗体を用いた負のモジュレーション法が提供される。両方とも標的遺伝子産物に特異的であるとともに、標的遺伝子産物活性を減少する抗体を、生成できる。これらは、負のモジュレーション法が、例えば、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌の治療のためのガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体の場合において、腫瘍および癌の治療に適当であるときに、投与できる。
【0239】
抗体が指向している標的遺伝子タンパク質が細胞内のものであり、且つ抗体全体を使用する場合には、内在化抗体が好ましい。しかしながら、リポフェクチンまたはリポソームを使用して、抗体または標的遺伝子エピトープに結合するFab領域のフラグメントを、細胞に送達できる。抗体のフラグメントを使用する場合、タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に特異的に結合する抗体の可変領域のドメインに相当するアミノ酸配列を有するペプチドを使用できる。このようなペプチドは、化学的に合成したり、当技術分野において周知の組み換えDNA法により製造できる(例えば、上記したCreighton,1983;および上記したSambrook等、1989参照)。別法として、細胞内標的遺伝子産物エピトープに結合する一本鎖中和抗体を、投与することもできる。このような一本鎖抗体は、例えば、Marasco等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:7889−7893(1993)に記載されているような方法を用いることにより、例えば、標的細胞集団内の一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を発現させることにより、投与できる。標的遺伝子タンパク質が細胞外であるか、または膜貫通型タンパク質である場合には、ペプチド投与に適切である当技術分野において公知の投与方法のいずれかを使用して、阻害標的遺伝子抗体を、それらの作用部位に効果的に投与できる。投与方法および医薬製剤については、以下に説明する。
【0240】
G.ガラニン、GALR2またはGALR3を用いた癌ワクチン:
本発明の一つの態様によれば、抗体および/またはT細胞免疫応答を生じさせて卵巣癌などの癌から哺乳動物を保護するのに十分なガラニン、GALR2またはGALR3のポリペプチドまたはそのフラグメントを哺乳動物に接種することを含んでなる、哺乳動物において免疫学的応答を誘発する方法が提供される。
【0241】
本発明の別の態様によれば、ガラニン、GALR2またはGALR3のアミノ酸配列(例えば、配列番号8、配列番号4または配列番号2)に由来のペプチドが提供される。この態様から、当業者は、本発明によるペプチドまたはその類似体は、種々の製造業者により販売されている自動機器により合成でき、商業的に特注および作製されることができ、または上記したような好適な発現ベクターから発現できることを認識するであろう。「アミノ酸類似体」という用語は、すでに本明細書中で説明した。本発明によるペプチドを説明する目的では、類似体は、さらに分岐または非線状ペプチドをも含むことができる。
【0242】
したがって、本発明によれば、ワクチンおよび免疫療法に使用される、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、それに由来するタンパク質またはペプチドを含んでなる、医薬組成物が提供される。癌から哺乳動物を保護するためのワクチンとして使用するときには、前記医薬組成物は、免疫原として、組み換え発現ベクター、または発現されたタンパク質を含有する培養上清でトランスフェクションした細胞からの細胞溶菌液を含んでなることができる。別法として、免疫原は、部分的または実質的に精製された組み換えタンパク質または合成ペプチドである。
【0243】
ワクチン接種は、通常の方法によりおこなうことができる。例えば、免疫原を、生理食塩水もしくは水等の好適な希釈剤または完全もしくは不完全アジュバントに添加して使用できる。さらに、免疫原を、担体に結合してタンパク質免疫原性としてもよいし、しなくてもよい。このような担体分子としては、例えば、牛血清アルブミン(BSA)、スカシガイヘモシアニン(KLH)、破傷風トキソイド等があるが、これらには限定されない。免疫原は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下等の抗体の産生に好適な経路により投与できる。免疫原は、一度に投与してもよいし、または抗ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体の顕著な力価が得られるまで、定期的に投与してもよい。抗体は、免疫アッセイを用いて血清において検出できる。
【0244】
本発明の別の態様によれば、ガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質の宿主生体合成、またはガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質配列に由来するペプチドの宿主生体合成を導くことのできる核酸配列を含んでなる医薬組成物が提供される。このような核酸配列は、当業者に公知の方法により好適な発現ベクターに挿入することができる。生体内で高効率遺伝子転写を生じるために好適な発現ベクターには、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターおよびワクシニアウイルスベクターなどがあるが、これらには限定されない。このような発現ベクターの作動要素は、本明細書において上記で開示してあり、且つ当業者には公知である。このような発現ベクターは、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内または経口投与できる。
【0245】
免疫原が、ガラニン、GALR2、GALR3もしくはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、それに由来するタンパク質、ペプチド、またはそれに由来するガラニン、GALR2もしくはGALR3のタンパク質またはペプチドの宿主生体合成を導くことができる核酸配列であるか否かにかかわらず、免疫原は、予防目的または治療目的で投与できる。このような予防目的での使用は、例えば、特定の癌に対する遺伝的素因を有する個体について好適なことがある。予防目的の場合には、免疫原は、癌の前または癌による症状がでる前に投与される。免疫原の予防投与は、続いての癌の兆候を予防したり、弱めたりする。治療目的では、免疫原を、癌の兆候または癌に関連した症状があった時点、または直後に投与する。
【0246】
さらに、本発明によれば、薬学的に許容される担体中に、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、タンパク質、またはガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質の宿主生体合成を導くことができる発現ベクターを含んでなる、哺乳動物、例えば、ヒトを免疫化するための癌ワクチンが提供される。
【0247】
ワクチンとして使用する他に、および免疫療法において、上記組成物を使用してガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する抗体を調製できる。抗体を調製するために、宿主動物を、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体、それに由来するタンパク質もしくはペプチド、またはそれに由来するガラニン、GALR2またはGALR3のタンパク質もしくはペプチドを発現できる上記した発現ベクターを用いて免疫化する。宿主の血清または血漿を、好適な時間間隔で採集して、ウイルス粒子と反応性の抗体を含んでなる組成物を得る。例えば、飽和硫酸アンモニウムもしくはDEAE Sephadexまたは当業者に公知の他の方法を用いて、ガンマグロブリン画分またはIgG抗体を得ることができる。抗体は、薬剤等の他の抗ウイルス剤と関連することがある副作用の多くを実質的に伴わない。
【0248】
可能性のある不都合な免疫系応答を最小限とすることにより、抗体組成物の宿主系との適合性をさらに高めることができる。これは、外来種抗体のFc部分の全てまたは一部を除去するか、宿主動物と同じ種の抗体、例えば、ヒト/ヒトハイブリドーマからの抗体を使用することにより達成できる。ヒト化抗体(すなわち、ヒトにおける非免疫原性)が、例えば、非ヒト抗体の免疫原性部分を対応するが非免疫原性である部分(すなわち、キメラ抗体)と置き換えることにより産生されることができる。このようなキメラ抗体は、一つの種からの抗体の反応性または抗原結合部分および異なる種からの抗体(非免疫原性)のFc部分を含んでいてもよい。キメラ抗体としては、例えば、非ヒト哺乳動物−ヒトキメラ、げっし類−ヒトキメラ、マウス−ヒトおよびラット−ヒトキメラなどがあるが、これらには限定されない(Cabilly等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3439,1987;Nishimura等、Cancer Res.,47:999,1987;Wood等、Nature,314:446,1985;Shaw等、J.Natl.Cancer Inst.,80:15553,1988)。「ヒト化」キメラ抗体についての一般的な検討が、Morrison S.,Science,229:1202,1985およびOi等、BioTechniques,4:214,1986になされている。
【0249】
あるいは、抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体は、免疫原として抗イディオタイプ抗体を投与することにより誘発できる。上記した精製された抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体標本を使用して、宿主動物における抗イディオタイプ抗体を誘発するのが都合がよい。組成物は、好適な希釈剤に添加して宿主動物に投与される。投与、通常反復投与の後、宿主は、抗イディオタイプ抗体を産生する。Fc領域に対する免疫原性反応をなくするために、宿主動物と同じ種により産生された抗体を使用するか、投与抗体のFc領域を除去できる。宿主動物における抗イディオタイプ抗体の誘発の後、血清または血漿を除去して抗体組成物を得る。組成物は、上記したように、抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体について精製するか、アフィニティーマトリックスに結合した抗ガラニン抗体、抗GALR2抗体、抗GALR3抗体または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィー により精製できる。産生した抗イディオタイプ抗体は、コンフォメーションにおいて真正なガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗原と似ており、ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体を用いるよりもワクチンを調製するのに使用できる。
【0250】
動物において抗ガラニン、抗GALR2、抗GALR3または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体を誘発する手段として使用する場合、抗体を注射する方法は、補助剤を添加して、またはこれを添加せずに、生理的に好適な希釈剤に効果的な濃度で添加して、ワクチン接種の目的での使用と同様に、すなわち、筋肉内、腹腔内、皮下等で注射する。一回以上のブースタ注射をおこなうのが、望ましい。
【0251】
ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する抗体および抗イディオタイプ抗体の両方を生体内で使用する場合および診断に使用する場合、モノクローナル抗体を使用することが好ましいことがある。モノクローナル抗ガラニン、抗GALR2、抗GALR3または抗GALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗体または抗イディオタイプ抗体は、当業者において公知の方法により産生できる(Goding,J.W.1983.「Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(モノクローナル抗体:原理および実際)」,Pladermic Press社NY、ニューヨーク、第56〜97頁)。ヒト−ヒトハイブリドーマを生成するために、ヒトリンパ球ドナーを選択する。ガラニン、GALR2、GALR3またはGALR2−GALR3ヘテロ複合体の抗原を有することが知られているドナーは、好適なリンパ球ドナーとしての役割を果たすことができる。リンパ球は、末梢血試料から単離することができる。またはドナーが脾臓摘出を受ける場合には、脾臓細胞を使用してもよい。エプスタイン‐バーウイルス(EBV)を使用して、ヒトリンパ球を不死化することができ、またはヒト融合パートナーを使用してヒト−ヒトハイブリドーマを生成できる。ペプチドでの一次試験管内免疫化を、ヒトモノクローナル抗体の生成に使用することもできる。
【0252】
H.化合物の医薬用途:
ガラニン、GALR2またはGALR3等の標的遺伝子の発現、合成および/または活性を阻害する同定された化合物を、腫瘍または癌を予防、治療または制御するために治療的に有効な投与量で患者に投与できる。治療的に有効な量とは、癌またはその症状の測定可能な程度の減少または解消を生じさせるのに十分である化合物の量を意味する。
【0253】
このような化合物の毒性および治療上の有効性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により、例えば、LD50(集団の50%を致死にいたらせる投与量)およびED50(集団の50%に治療的に有効な投与量)を求めることにより、決定できる。毒性作用と治療効果との間の投与量比は、治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が、好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用するとき、このような化合物を、罹患組織の部位を標的として正常細胞への損傷を最小限とし、これにより副作用を減少させる送達系を設計するときに、注意を払わなければならない。
【0254】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータを使用して、ヒトに使用するための投与量範囲を決定できる。このような化合物の投与量は、好ましくはほとんど毒性を有しないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用される剤形および投与経路に応じてこの範囲内で異なることができる。本発明の方法に使用される化合物については、治療に有効な投与量は、細胞培養アッセイから最初に推定できる。投与量は、動物モデルにおいて、細胞培養において測定されるIC50(症状の50%阻害が得られる試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲が得られるように決定することができる。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な投与量をより正確に決定できる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により測定できる。
【0255】
本発明に使用される医薬組成物は、一種以上の生物学的に許容される担体または賦形剤を用いて標準的な方法により配合できる。化合物並びにそれらの生理学的に許容される塩および溶媒和物を、配合し、例えば、経口、口内、直腸、非経口、外表皮、局所、経皮、皮下、筋肉内、鼻腔内、舌下、硬膜内、眼内、呼吸器官内、静脈内、腹腔内、鞘内、粘膜、経口吸入、鼻吸入または直腸投与等で投与できる。
【0256】
経口投与の場合、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、例えば、結合剤、例えば、前ゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース;充填剤、例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム;滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ;崩壊剤、例えば、ジャガイモデンプンやナトリウムデンプングリコレート;または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを用いた通常の手段により調製した錠剤またはカプセルの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法により塗布できる。経口投与用の液剤は、溶液、シロップまたは懸濁剤の形態をとることができるし、またはこれらを、乾燥製品として供給して、使用前に水または他の好適なビヒクルを用いて構成することもできる。このような液剤は、薬学的に許容される添加剤、例えば、懸濁剤、例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素添加食用脂;乳化剤、例えば、レシチンまたはアカシア;非水性ビヒクル、例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコールまたは分別植物油;および保存剤、例えば、メチル−p−ヒドロキシベンゾエート、プロピル−p−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を用いて通常の手段により調製できる。また、製剤は、必要に応じて緩衝塩、矯味・矯臭剤、着色剤および/または甘味剤を含有してもよい。経口投与用製剤は、好適には活性化合物が制御されて放出されるように配合することができる。
【0257】
吸入投与の場合、化合物を、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガスを使用した加圧パックまたは噴霧器からエアゾールスプレー供給の形態で送達させるのが都合がよい。加圧エアゾールの場合、一回あたりの投与量は、計量した量を送達するためのバルブを設けることにより決定できる。吸入器またはインサフレーターに使用するための、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジ(化合物と好適な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含有)を、配合できる。
【0258】
化合物は、注射、例えば、ボーラス注射または持続点滴による非経口投与のために配合できる。注射用の配合は、保存剤を添加した、単位投与量の形態、例えば、アンプルまたは多投与コンテナーで供給できる。組成物は、油状または水性ビヒクルを用いた懸濁剤、溶液または乳剤のような形態をとることができ、処方剤、例えば、懸濁化剤、安定化剤および/または分散剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、粉末状として、使用前に好適なビヒクル、例えば、無菌無ピロゲン水を用いて構成できる。また、化合物は、直腸組成物、例えば、通常の坐剤基剤、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含有する座剤または停留浣腸に配合できる。
【0259】
さらに、化合物は、デポー製剤として配合することもできる。このような長時間作用配合物は、移植(例えば、皮下または筋肉内)によるか、または筋肉内注射により投与できる。したがって、例えば、化合物を、好適な高分子または疎水性物質(例えば、許容できる油における乳剤として)またはイオン交換樹脂と配合したり、またはやや溶け難い誘導体、例えば、やや溶け難い塩として配合できる。
【0260】
必要に応じて、組成物は、活性成分を含有する一つ以上の単位投与量形態を含むことができるパックまたはディスペンサ装置で供給できる。パックは、例えば、金属またはプラスチック箔、例えば、ブリスターパックを含んでなることができる。パックまたはディスペンサ装置には、投与のための説明書をつけることができる。
【0261】
I.siRNA/shRNAの投与:
本発明には、siRNAを、それを必要としている患者に投与する方法が包含される。この方法では、siRNA/shRNA分子を、裸オリゴヌクレオチドの形態で送達するか、または本明細書に記載の発現ベクターを介して送達される。
【0262】
本発明によれば、裸DNA、または標的遺伝子と相互作用し、細胞、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において特定の遺伝子の転写後発現抑制を生じる、本明細書に記載のsiRNA/shRNAを含むベクター(例えば、例IX参照)を投与することによる、ガラニン、GALR2またはGALR3の遺伝子の生体内発現をブロックする方法が提供される。
【0263】
また、本発明によれば、本発明による裸DNAまたはベクターを投与することによる、生体外での細胞の処理方法が提供される。
【0264】
その生体内または生体外治療用途においては、トランスフェクションまたは感染により細胞に入るウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いてsiRNA/shRNAを投与するのが適当である。特に、本発明による治療用品として、ベクターは、アデノウイルス等の欠損ウイルスベクター、またはマウスレトロウイルス等の欠損レトロウイルスベクターであることができる。
【0265】
本発明による遺伝子構築物をその標的に運搬するのに使用されるベクターは、借物キャプシドにより組み換え構築物を運搬し、遺伝物質を宿主細胞のDNAに挿入する、レトロウイルスベクターであることができる。
【0266】
遺伝物質を標的細胞に運搬するベクター、特にウイルスベクター(レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス)を使用する方法を用いて、遺伝的修飾を種々の体組織、例えば、乳房細胞、結腸細胞、肺細胞、脳細胞、前立腺細胞または卵巣細胞に導入できる。
【0267】
遺伝物質を輸送するのにレトロウイルスベクターを使用するには、一方では、組み換えレトロウイルスの遺伝的構築を実施すること、および他方では、輸送されるべき遺伝物質の包膜機能を提供する有効な細胞系を有することが必要である:
【0268】
i.第一段階において、遺伝子工学の手法により、マウスレトロウイルス、例えば、モロニーウイルス(マウス白血病ウイルス群に属するマウスレトロウイルス(Reddy等、Science,214:445−450(1981))のゲノムを可能にする。レトロウイルスゲノムを、プラスミドベクターにクローニングし、次にそこから構造タンパク質をコードする全てのウイルス配列(遺伝子:Gag、Env)だけでなく、酵素活性をコードしている配列(遺伝子:Pol)も、欠失させる。その結果、複製、転写および組み込みに必要な配列「in cis」のみが、保持される(2つのLTR領域、包膜シグナルおよびプライマー結合シグナルに相当する配列)。欠失された遺伝子配列は、非ウイルス遺伝子、例えば、ネオマイシンに対する耐性用遺伝子(真核細胞用選択抗生物質)によるか、レトロウイルスベクターにより輸送されるべき遺伝子(例えば、本明細書で記載されているようなガラニンおよび/またはGALR2および/またはGALR3のsiRNAにより置き換えることができる。
【0269】
ii.第二段階において、得られたプラスミド構築物を、トランスフェクションにより包膜細胞に導入する。これらの細胞は、構成的にGag、PolおよびEnvウイルスタンパク質を発現するが、これらのタンパク質をコードするRNAは、その包膜化に必要とするシグナルを欠いている。その結果、RNAは、包膜化してウイルス粒子が形成することができない。トランスフェクションしたレトロウイルス構築物から生じる組み換えRNAのみが、包膜シグナルを備え、包膜される。この系により産生したレトロウイルス粒子は、標的細胞(例えば、CD34+細胞)の感染、およびこれらの細胞への意図する遺伝子の永久的組み込み、例えば、本明細書に記載されているガラニンおよび/またはGALR2および/またはGALR3のsiRNA、に必要な全ての要素を含む。Gag、PolおよびEnv遺伝子が存在しないと、系が増殖し続けることが防止される。
【0270】
アデノウイルス等のDNAウイルスも、この方法に適している。但し、この場合、自立レプリコンの形態でのエピソーム状態でDNAを維持する可能性が、最も高い。
【0271】
アデノウイルスは、いくつかの有利な特性を有している。特に、アデノウイルスは、宿主範囲がかなり広く、静止細胞に感染することができ、且つ感染細胞のゲノムに組み込まれない。これらのことから、アデノウイルスは、既に生体内での遺伝子の導入に使用されている。この目的のために、種々の遺伝子を組み込んだ、アデノウイルス由来の種々のベクターが調製された(ベータ−gal、OTC、アルファ−1At、サイトカイン等)。増殖の危険と、生体内での感染粒子の生成を制限するために、使用されるアデノウイルスは、一般的に、それらが感染細胞において複製できないように修飾される。したがって、使用されるアデノウイルスでは、一般的に、E1(E1aおよび/またはE1b)およびおそらくE3領域が欠失状態とされる。
【0272】
本発明による欠損組み換えアデノウイルスは、当業者おいて公知のいずれかの方法により調製できる(Levrero等、Gene,101:195(1991),EP185573;Graham,EMBO J.3:2917(1984))。特に、これらは、好適な細胞系においてアデノウイルスとプラスミドとの間の相同的組み換えにより調製できる。
【0273】
本発明によれば、外来DNA配列、例えば、本明細書に記載のガラニンおよび/またはGALR2および/またはGALR3のsiRNAは、欠損組み換えアデノウイルスのゲノムに挿入される。
【0274】
上記したような欠損組み換え体等の一つ以上のウイルスベクターを含んでなる医薬組成物は、局所的、経口的、非経口的、鼻腔内的、静脈内的、筋肉内的、皮下的、眼内的等の投与目的のために配合することができる。好ましくは、これらの組成物は、投与可能な製剤について薬学的に許容されるビヒクルを含有している。これらは、特に等張無菌生理食塩水(リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等またはこのような塩の混合物のもの)、または必要に応じて滅菌水または生理食塩水を添加すると特定の注射可能溶液を調製できる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。
【0275】
注射用の欠損組み換えウイルスの投与量は、種々のパラメータ、特に使用される投与形態、問題の病状、発現されるべき遺伝子、または所望の治療期間にしたがって適合させることができる。一般的に、本発明による組み換えアデノウイルスを、104〜1014pfu/ml、好ましくは106〜1010pfu/mlの投与形態で配合および投与できる。用語pfu(「プラーク形成単位」)は、ウイルスの溶液の感染力に相当し、好適な細胞培養の感染、および感染細胞のプラークの数を一般的に48時間後に測定することにより測定される。ウイルス溶液のpfu力価の測定法は、文献に詳細に記載されている。
【0276】
修飾遺伝物質を輸送するためのシャトル系として遺伝子組み換えウイルスを使用すると、遺伝物質が、借物ウイルスキャプシドを使用する手段によりレシピエント細胞に入ることができるだけでなく、多数の細胞を同時且つ短時間で処理でき、治療的処置を全身に適用できる。
【0277】
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
【実施例】
【0278】
例I:肺腫瘍および肺癌細胞系におけるGALR3遺伝子の増幅:
表4において、原発性肺癌試料におけるDNAコピー数を、Taqman7700および7900Sequence Detectorを用いて測定した。ゲノムDNAを、肺腫瘍および肺癌細胞系から単離した。合計76の原発性肺癌細胞系および16の肺癌細胞系を、標的を表す同様のGALR3およびGALR2 Taqmanプローブ並びにゲノムにおける正常非増幅単一コピー領域を表す標準プローブとともに、製造業者のプロトコールに準じて、TaqMan7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)により分析した。76の試験原発性肺腫瘍のうち、21および18が、それぞれGALR3およびGALR2について5倍以上高かった。カットオフとして2.5倍を用いたところ、試料76のうち34が、GALR2およびGALR3の両方についてコピー数の増加を示した。16の試験肺癌細胞系のうち、colo699が、GALR3遺伝子について2.5倍超増幅した唯一のものであった。機器の検出限界のため、2.5倍に等しいか、それを超えるGALR3遺伝子コピー数を有する試料のみが増幅されたとみなされる。しかしながら、検出された場合には、2.5倍未満のGALR3遺伝子コピー数の増加は、まだ遺伝子の増幅として考えることができる。
【0279】
【表4】
【0280】
例II:肺腫瘍および癌細胞系におけるGALR3およびGALR2遺伝子の過剰発現:
逆転写酵素(RT)指向定量PCRを、TaqMan7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)を用いておこない、各試料におけるGALR3およびGALR2mRNAレベルを測定した。ヒトベータアクチンmRNAを、対照として使用した。
【0281】
総RNAを、Trizol試薬(Invitrogen社)を用いてヒト肺腫瘍および肺腫瘍細胞系から単離し、DNAase(Ambion社)で処理してゲノムDNAを除去した。逆転写酵素反応(48℃で30分間)を、製造業者(Perkin Elmer社/Applied Biosystems社)の説明書にしたがって1チューブフォーマットでcDNAコピー数の定量的PCR測定と結合させた。試料中のGALR3およびGALR2発現レベルを、ヒトβ−アクチンを用いて標準化し、腫瘍試料におけるGALR3およびGALR2の発現と正常試料におけるGALR3およびGALR2の発現を比較することにより、過剰発現倍率を算出した。GALR3およびGALR2のヌクレオチド配列を使用して、GenBank寄託番号NM_003614(GALR3)およびNM_003857(GALR2)の配列に基づく好適なTaqmanプローブを設計する。各原発性腫瘍試料および腫瘍細胞系試料のmRNAレベルの測定値を、それぞれの正常肺組織および正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞系におけるmRNAレベルに標準化した。mRNAレベルの相対数値を、表5および表6に示す。表5に示す試験した10の肺腫瘍の全てが、GALR3遺伝子増幅を欠く試料LU44を含む、異なる程度でGALR3およびGALR2を過剰発現する。11の肺癌細胞系の試験(表6)のうち、11の全てが、GALR3を過剰発現し、11のうちの7が、5倍以上でGALR2を過剰発現する。遺伝子の増幅を付随せずGALRメッセージが過剰発現するのは、癌遺伝子、例えばc−myc(Yoshimoto等、Jpn.J.Cancer Res.77,540−545(1986))およびAIB1(Anzick等、Science 277,965−968(1997))の特質によく似ている。
【0282】
【表5】
【0283】
【表6】
【0284】
例III:ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子およびGALR3遺伝子を含有するアンプリコンの物理的地図:
癌細胞系または原発性腫瘍を、遺伝子のDNAコピー数およびGALR3、GALR2およびガラニン付近のマーカーについて調査して増幅領域の境界についての地図を作成した。GALR3、GALR2およびガラニンが、増幅領域の中心点に位置していることが明らかである(図1、図2および図3)。
【0285】
DNAを、腫瘍細胞系または原発性腫瘍から精製した。各試料における各マーカーのDNAコピー数を、PCRおよび蛍光標識プローブを用いて直接測定した。種々の濃度での試料腫瘍DNA標本および一連の正常ヒトDNA標本における、Ct値としても知られている設定しきい値を超えるのに必要とするPCRサイクル数を、標的プローブおよび公知の単一コピーDNAプローブの両方について、Applied Biosystems7700TaqMan機械を用いて測定した。次に、各試料における単一コピープローブに対する標的配列の相対的存在度を、未知の試料のCt値の統計的解析、および種々の濃度での正常ヒトDNA標本から得た標準曲線により算出した。
【0286】
遺伝子の各々についてのDNAコピー数を測定するために、各マーカーに対応するプローブを、PrimerExpress1.0(Applied Biosystems社)を用いて設計し、Operon Technologiesにより合成した。続いて、標的プローブ(マーカーを表す)、標準プローブ(ゲノムにおける正常非増幅単一コピー領域を表す)および腫瘍ゲノムDNA(10ng)を、製造業者のプロトコールに準じて、Applied Biosystems7700TaqMan Sequence Detectorにより、解析した。各試料についての、DNAコピーの数は、図1、図2および図3において対応のマーカーに対してプロットした。図は、GALR3、GALR2およびガラニン遺伝子座を含む、22q13、17q25および11q13アンプリコンの中心点マッピングを示す。各試料についてのDNAコピー数を、Y軸上にプロットする。X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【0287】
図1(GALR3)において、Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づく、3つのヒトゲノムDNAクローンを示す(Z83844、Z97630およびAL022311)。但し、図示してあるのは、実際のクローンサイズのスケールではない。これらの3つのゲノム配列を有するサイズが約200kbである中心点が、完全に含まれている。7つのマーカーを、X軸上に等間隔(実際の距離のスケールではない)で配置して観察できるようにしている。
WA3(ゲノムDNAクローンAL022315の塩基643〜714);WA2(ゲノムDNAクローンZ83844の塩基488〜562);WA17(ゲノムDNAクローンZ83844の塩基65146〜65214);WA12(Z83844の塩基131949〜132033);WA15(Z97630の塩基31437〜31502);WA16(AL022311の塩基16961〜17057);WA4(AL022311の塩基69682〜69745)。
【0288】
図2(GALR2)において、Human Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づく、3つのヒトゲノムDNAクローンを示す(AC021162、AC040980およびAC015801)。但し、図示してあるのは、実際のクローンサイズのスケールではない。GALR2遺伝子は、矢印で示されている。GA4B(ヒトゲノムDNAクローン寄託番号AC021162の塩基10540〜10640);GA3B(AC021162の塩基196815〜196875);GALR2(AC040980の塩基131772〜131823);GALR2B(AC040980の塩基130310〜130362);GA2B(AC040980の塩基4642〜4706);GA1(AC015801の塩基171〜245)。
【0289】
図3に、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づく、ガラニン遺伝子を含む11q13での中心点を示す。各試料についてのDNAコピー数を、Y軸上にプロットする。X軸は、ヌクレオチド位置に対応する。サイズが約150kbの中心点が、点線で示す3つのオーバーラップヒトゲノムDNAクローン内に含まれる(左から右方向へ:AP001075、AP001788、AP003732)。14のマーカーには、以下のものが含まれる(左から右方向へ):GR4(100kb);GR21(200kb);GR3(295kb);GR1(365kb);GR22(395kb);GR7(425kb);GR8(428kb);GR9(432kb);GAA(435kb);GR5(490kb);GR24(560kb);GR24A(570kb);GR6(740kb);GR25(750kb)。
【0290】
例IV:肺腫瘍におけるガラニン遺伝子の増幅および過剰発現:
遺伝子増幅用ゲノムを調査するためのDNAマイクロアレイに基づくCGHに基づいて、ガラニン遺伝子が、腫瘍組織において高い頻度で増幅することが判明した。
【0291】
ゲノムDNAを、腫瘍試料から単離した。これらを、標的を表す同様のガラニンTaqManプローブおよびゲノムにおける正常非増幅単一コピー領域を表す標準プローブとともに、製造業者のプロトコールに準じて、TaqMan7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)により分析した。77の試験原発性肺腫瘍のうち、54が、ガラニンについてコピー数の増加を示すことが判明した。
【0292】
総RNAを、Trizol試薬(Invitrogen社)を用いてヒト肺腫瘍および肺腫瘍細胞系から単離し、DNAase(Ambion社)で処理してゲノムDNAを除去した。逆転写酵素反応(48℃で30分間)を、製造業者(Perkin Elmer社/Applied Biosystems社)の説明書にしたがって1チューブフォーマットでcDNAコピー数の定量的PCR測定と結合させた。試料中のガラニン発現レベルを、ヒトβ−アクチンを用いて標準化し、腫瘍試料におけるガラニンの発現と正常試料におけるガラニンの発現を比較することにより、過剰発現倍率を算出した。ガラニンのヌクレオチド配列を使用して、GenBank寄託番号A28025の配列に基づく好適なTaqmanプローブを設計する。各原発性腫瘍試料および腫瘍細胞系試料のmRNAレベルの測定値を、それぞれの正常肺組織および正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞系におけるmRNAレベルに標準化した。mRNAレベルの相対数値を、表7に示す。表5に示す試験した10の肺腫瘍の全てが、GALR3遺伝子増幅を欠く試料LU44を含む、異なる程度でGALR3およびGALR2を過剰発現する。50の試験試料(表7参照)のうち、39が、ガラニンを過剰発現する。遺伝子の増幅を付随せずガラニンメッセージが過剰発現するのは、癌遺伝子、例えばc−myc(Yoshimoto等、Jpn.J.Cancer Res.77,540−545(1986))およびAIB1(Anzick等、Science 277,965−968(1997))の特質によく似ている。
【0293】
【表7】
【0294】
例V:ガラニン遺伝子用動物腫瘍形成性アッセイ:
ガラニン前駆体または空きベクター(pLPC)を、レトロウイルスを介してげっし類C8細胞にトランスフェクションした(図4参照)。薬剤選択後、細胞を集め、5匹の裸胸腺欠損マウスに注射して腫瘍形成について観察した(マウス1匹あたり細胞250,000個)。C8細胞由来腫瘍増殖の明瞭な増加が、ガラニントランスフェクション体において検出された。35日目での後注射により、ガラニンC8細胞を有する5匹全てのマウスが腫瘍を生じた(図4B参照)のに対して、ベクターC8細胞を注射したマウス5匹のうち2匹だけが、腫瘍を生じた(図4A参照)。得られた結果は、ガラニンC8トランスフェクション体は、動物における腫瘍形成性を高めることを示している。また、得られた結果から、ガラニンの過剰発現は、動物における宿主細胞の腫瘍形成性を高めることが分かり、このことは、ガラニンが癌遺伝子であることを示している。
【0295】
例VI:結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍におけるガラニン/GALR2/GALR3遺伝子の増幅および過剰発現:
表8において、原発性の結腸癌試料、前立腺癌試料および卵巣癌試料におけるDNAコピー数を、Taqman7700および7900Sequence Detectorを用いて測定した。ゲノムDNAを、結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍から単離した。原発性の結腸腫瘍試料、前立腺腫瘍試料および卵巣腫瘍試料を、標的を表す上記したガラニンまたはGALR2もしくはGALR3 Taqmanプローブセット並びにゲノムにおける正常非増幅領域を表す標準プローブとともに、製造業者のプロトコールに準じて、Taqman7700または7900Sequence Detectorにより分析した。ガラニン遺伝子、GALR2遺伝子およびGALR3遺伝子についてのコピー数の増加が、試験した原発性の結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍にみられた(表8参照)。
【0296】
総RNAを、Trizol試薬(Gibco社)を用いて、ヒトの結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍から単離した。培養正常ヒト気管支上皮(NHBE)細胞系(Clonetics社)のRNAを、Trizol試薬を用いて調製した。逆転写酵素(RT)指向定量PCRを、Taqman7700Sequence Detector(Applied Biosystems社製)を用いておこない、各試料におけるガラニン、GALR2およびGALR3mRNAレベルを測定した。ヒトベータアクチンmRNAを、対照として使用した。ガラニン、GALR2およびGALR3のヌクレオチド配列を使用して、本明細書にあげた配列に基づく好適なTaqmanプローブを設計した。各原発性腫瘍および腫瘍細胞系試料のmRNAレベルの測定値を、正常な結腸組織、前立腺組織および卵巣組織およびNHBEにおけるそれぞれのmRNAレベルに標準化した。ガラニン、GALR2およびGALR3の過剰発現が、試験した原発性の結腸腫瘍、前立腺腫瘍および卵巣腫瘍において検出された(表8参照)。
【0297】
【表8】
【0298】
例VII:ヒト肺癌細胞系であるEPLC−272Hの蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)分析:
ヒト肺癌細胞系であるEPLC−272HのFISH分析を、当技術分野において周知の方法を用いておこなって(例えば、Heng等、Cytogenetic Cell Genet,93:195,2001;Angerer,Meth.Enzymol.,152:649,1987参照)プレプロガラニン遺伝子の増幅を測定した。相間染色体スライドを、通常の方法により調製した(例えば、HengおよびTsui,Chromosoma 102:325,1993参照)。複数の陽性シグナルを、ヒトプレプロガラニン遺伝子を含有するBACクローンであるプローブ2007L18を用いて検出した。ヒトゲノムの未増幅領域を表す対照プローブ282H10の場合、中性シグナルがみられた。細胞系EPLC−272HのFISH分析により、プレプロガラニン遺伝子が増幅したことが分かった。
【0299】
例VIII:プレプロガラニンの過剰発現が、ヌードマウスにおけるEPLC−272H細胞の腫瘍形成性を高める:
プレプロガラニンを過剰発現するEPLC−272H細胞のレトロウイルストランスフェクション体を、生成した。5百万個の細胞を、5匹の胸腺欠損ヌードマウスの各々に皮下移植した。14日目での後注射で、プレプロガラニン遺伝子を有する5匹全てのマウスが、種々のサイズの腫瘍が生じた。14日目に達する前に、1匹のマウスが死亡した。一方、14日目で、対照細胞(ベクター−EPLC−272H)(表9参照)を注射した5匹のマウスには、目にみえる腫瘍は検出されなかった。これらの結果から、プレプロガラニン−EPLC−272Hトランスフェクション体がヌードマウスの腫瘍形成性を高めることが明らかである。得られた結果から、ガラニンの過剰発現により、動物における宿主細胞の腫瘍形成性が高まることも明らかである。このことは、ガラニンが癌遺伝子であることを示している。
【0300】
【表9】
【0301】
例IX:小干渉RNA(siRNA):
センスおよびアンチセンスsiRNA二本鎖は、本明細書に開示されているDNA配列の標的領域(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号7またはそのフラグメント)に基づいて作製され、典型的には長さおよびコンスティチュエンシーが100塩基対(「bp」)未満であり、好ましくは約30bp以下であり、相補的DNA鎖を使用することを含む当技術分野において公知の方法または合成方法により作製する。ペプチド核酸等のポリ核酸修飾法を用いたsiRNA誘導体も、本発明により用いることができる。siRNAは、妨害を生じることができ、細胞、例えば、哺乳動物細胞(ヒト細胞を含む)中および体内、例えば、哺乳動物(ヒトを含む)の体内において、特定遺伝子の後転写抑制を生じることがある。本発明による典型的なsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpを有する。
【0302】
標的領域は、DNA配列(例えば、配列番号1、配列番号3、配列番号7またはそのフラグメント)から選択される。標的領域の選択およびsiRNAオリゴ、例えば、5’または3’UTRの設計に、種々の方法を利用でき、開始コドンの近くの領域は、これらが調節タンパク質結合部位においてより含量が多い場合があるので、避けなければならない。設計された配列は、好ましくはAA−(N27以下のヌクレオチド)−TTを含み、G/C含量が約30%〜70%である。好適な配列がみられない場合には、フラグメントサイズを、配列AA(N29ヌクレオチド)に延長する。センスsiRNAの配列は、それぞれ例えば、(N27ヌクレオチド)−TTまたはN29ヌクレオチドに相当する。後者の場合、センスsiRNAの3’端を、TTに転化する。この配列を転化する理由は、センスおよびアンチセンス3’オーバーハングの配列組成に関して対称的な二本鎖を生成することにある。対称的3’オーバーハングにより、センスとアンチセンスの標的RNA切断siRNPがほぼ等しい比で形成される、小干渉リボヌクレオタンパク質粒子(siRNP)が確実に形成されやすくなると思われる(Elbashir等、Genes&Dev.15:188−200,2001)。
【0303】
GALR3siRNA:センスまたはアンチセンスsiRNAを、本明細書に開示されているDNA配列(配列番号1参照)の標的領域に基づいて合成する。これらのsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpのフラグメントを含む。例えば、29bpのsiRNAには、
【0304】
標的領域(塩基位置番号2〜30、配列番号10)
5’−TGGCTGATGCCCAGAACATTTCACTGGAC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号11)
5’−UGGCUGAUGCCCAGAACAUUUCACUGGAC−3’;
標的領域(塩基位置番号3〜31、配列番号12)
5’−GGCTGATGCCCAGAACATTTCACTGGACA−3’および
対応センスsiRNA(配列番号13)
5’−GGCUGAUGCCCAGAACAUUUCACUGGACA−3’;
標的領域(塩基位置番号4〜32、配列番号14)
5’−GCTGATGCCCAGAACATTTCACTGGACAG−3’および
対応センスsiRNA(配列番号15)
5’−GCUGAUGCCCAGAACAUUUCACUGGACAG−3’;およびこの連鎖で、GALR3コード配列の終わりまで継続する、例えば、
標的領域(塩基位置番号1071〜1099、配列番号16)
5’−CGTCCACGGCGGAGAGGCTGCCCGAGGAC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号17)
5’−CGUCCACGGCGGAGAGGCUGCCCGAGGAC−3’;並びに本明細書に記載されているもの等
が含まれる。
【0305】
GALR2siRNA:センスまたはアンチセンスsiRNAを、本明細書に開示されているDNA配列(配列番号3参照)の標的領域に基づいて合成する。これらのsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpのフラグメントを含む。例えば、29bpのsiRNAには、
【0306】
標的領域(塩基位置番号2〜30、配列番号18)
5’−TGAACGTCTCGGGCTGCCCAGGGGCCGGG−3’および
対応センスsiRNA(配列番号19)
5’−UGAACGUCUCGGGCUGCCCAGGGGCCGGG−3’;
標的領域(塩基位置番号3〜31、配列番号20)
5’−GAACGTCTCGGGCTGCCCAGGGGCCGGGA−3’および
対応センスsiRNA(配列番号21)
5’−GAACGUCUCGGGCUGCCCAGGGGCCGGGA−3’;
標的領域(塩基位置番号4〜32、配列番号22)
5’−AACGTCTCGGGCTGCCCAGGGGCCGGGAA−3’および
対応センスsiRNA(配列番号23)
5’−AACGUCUCGGGCUGCCCAGGGGCCGGGAA−3’;およびこの連鎖で、GALR2コード配列の終わりまで継続する、例えば、
標的領域(塩基位置番号1132〜1160、配列番号24)
5’−GGCGACAGCATCCTGACGGTTGATGTGGC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号25)
5’−GGCGACAGCAUCCUGACGGUUGAUGUGGC−3’;並びに本明細書に記載されているもの等
が含まれる。
【0307】
ガラニンsiRNA:センスまたはアンチセンスsiRNAを、本明細書に開示されているDNA配列(配列番号7参照)の標的領域に基づいて合成する。これらのsiRNAは、最大で29bp、25bp、22bp、21bp、20bp、15bp、10bp、5bpまたはこれらの付近もしくは間のいずれかの整数のbpのフラグメントを含む。例えば、29bpのsiRNAには、
【0308】
標的領域(塩基位置番号15〜43、配列番号26)
5’−TGGCCCGAGGCAGCGCCCTCCTGCTCGCC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号27)
5’−UGGCCCGAGGCAGCGCCCUCCUGCUCGCC−3’;
標的領域(塩基位置番号16〜44、配列番号28)
5’−GGCCCGAGGCAGCGCCCTCCTGCTCGCCT−3’および
対応センスsiRNA(配列番号29)
5’−GGCCCGAGGCAGCGCCCUCCUGCUCGCCU−3’;
標的領域(塩基位置番号17〜45、配列番号30)
5’−GCCCGAGGCAGCGCCCTCCTGCTCGCCTC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号31)
5’−GCCCGAGGCAGCGCCCUCCUGCUCGCCUC−3’;およびこの連鎖で、ガラニンコード配列の終わりまで継続する、例えば、
標的領域(塩基位置番号353〜381、配列番号32)
5’−GCAGCCTCCTCAGAAGACATCGAGCGGTC−3’および
対応センスsiRNA(配列番号33)
5’−GCAGCCUCCUCAGAAGACAUCGAGCGGUC−3’;並びに本明細書に記載されているもの等
が含まれる。
【0309】
本明細書に記載されているように、GALR3、GALR2およびガラニンのオリゴは、設定基準に基づいて設計することもできる。3’端に「C」を含む29bp「センス」配列(例えば、GALR3コード配列の塩基位置番号2で開始する標的領域)は、GALR3コード配列(配列番号1)から選択されることができる。終止配列(例えば、AAAAAA、配列番号34)、GALR3アンチセンス配列、ループ(例えば、GAAGCTTG、配列番号35)および逆プライマー(例えば、U6逆プライマー、GGTGTTTCGTCCTTTCCACAA、配列番号36)を、続いて29bpセンス鎖に付加してGALR3 PCRプライマーを構築することができる(例えば、Paddison等、Genes&Dev.16:948−958,2002参照)。勿論、他のセンスおよびアンチセンス配列を、標的分子から選択してその分子についてのsiRNAを構築できる。
【0310】
典型的な実施態様を示しながらの説明、具体的な実施例およびデータは、説明のために示したものであり、本発明を限定するものではない。本発明の範囲内の種々の変化および修正は、本明細書に含まれる考察、開示およびデータから当業者には明らかであり、本発明の一部分と考えられる。
【0311】
配列情報
【表10】
【図面の簡単な説明】
【0312】
【図1】図1は、GALR3の遺伝子座を含む、ヒト染色体領域22q13アンプリコンの中心点マップを示す。各試料についてのDNAコピー数がY軸上にプロットされており、X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【図2】図2は、GALR2の遺伝子座を含む、ヒト染色体領域17q25アンプリコンの中心点マップを示す。各試料についてのDNAコピー数がY軸上にプロットされており、X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【図3】図3は、ガラニンの遺伝子座を含む、ヒト染色体領域11q13アンプリコンの中心点マップを示す。各試料についてのDNAコピー数がY軸上にプロットされており、X軸は、ヒトゲノムプロジェクト作業草案配列(http://genome.ucsc.edu/goldenPath/aug2001Tracks.html)に基づくヌクレオチド位置に対応する。
【図4】図4は、ガラニン遺伝子についての動物の腫瘍形成性アッセイを示す。図4Aは、ベクターC8細胞を用いた対照実験についてのものであり、図4Bは、ガラニンC8細胞を有するマウスの結果を示したものである。ガラニンC8細胞を有する5匹全てのマウスにおいて腫瘍が生じた。
Claims (130)
- 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるガラニン遺伝子コピー数を測定し、これにより試験遺伝子コピー数についてのデータを得る工程と、
b)前記試験遺伝子コピー数を、対照遺伝子コピー数についてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記生物学的検体における遺伝子が増幅されていた場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照遺伝子コピー数が、細胞1個あたり2個である、請求項1に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項1に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項3に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項3に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、ガラニンDNAまたはRNAと相互作用することにより、ガラニン遺伝子機能を阻害するインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、デコイ分子またはデコイDNAである、請求項6に記載の方法。
- 前記インヒビターがヌクレオチドを含有し、且つ前記インヒビターの長さが約100bp未満である、請求項6に記載の方法。
- 前記インヒビターが、リボザイムである、請求項6に記載の方法。
- 前記インヒビターが、小分子である、請求項6に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、ガラニンタンパク質のインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、ガラニンタンパク質に結合する抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記インヒビターが、ガラニンタンパク質に結合する小分子である、請求項11に記載の方法。
- 前記インヒビターが、ガラニンの発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体である、請求項11に記載の方法。
- 前記インヒビターが、ガラニンタンパク質を過剰発現している細胞に結合する抗体である、請求項11に記載の方法。
- 単離されたガラニン遺伝子アンプリコンであって、以下のポリヌクレオチドからなる群から選択されるものの複数のコピーを含んでなる、アンプリコン:
a)配列番号8または配列番号9に記載されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b)配列番号7に記載のポリヌクレオチド;および
c)前記a)またはb)のポリヌクレオチドと少なくとも約90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド。 - 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるガラニンのレベルを測定し、これにより試験レベルについてのデータを得る工程と、
b)前記試験レベルを、対照レベルについてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照レベルに対して前記生物学的検体の試験レベルが上昇している場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照レベルが、正常な生物学的検体において検出されたガラニンレベルのデータベースから得られるものである、請求項17に記載の方法。
- 前記データベースが、人口統計学的に多様な集団から得られる対照レベルを含むものである、請求項18に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項17に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項20に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項20に記載の方法。
- siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子が裸オリゴヌクレオチドの形態またはベクターの形態で供給され、前記siRNAがガラニン遺伝子またはガラニン転写物と相互作用する、方法。
- 前記siRNAがベクターとして供給され、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスである、請求項23に記載の方法。
- 前記ベクターが、レトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである、請求項23に記載の方法。
- ガラニンsiRNAをコードするベクターを投与することにより、遺伝子の生体内発現をブロックする方法。
- 前記siRNAがガラニン活性を妨害するものである、請求項26に記載の方法。
- 前記siRNAが、哺乳動物細胞においてガラニン遺伝子の転写後発現抑制を生じるものである、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項28に記載の方法。
- ガラニン拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子を癌細胞と接触させる工程と、
b)前記細胞中のガラニンレベルを測定することにより、試験レベルについてのデータを得る工程と、
c)前記試験レベルを対照レベルと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記細胞中のガラニンレベルが減少していた場合に、前記試験分子がガラニン拮抗活性を有することが示される、方法。 - ガラニンレベルが、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により測定される、請求項30に記載の方法。
- ガラニンレベルが、ノーザンハイブリダイゼーションにより測定される、請求項30に記載の方法。
- 前記試験分子が、抗体、ヌクレオチドまたは小分子である、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌から得られるものである、請求項30に記載の方法。
- ガラニン拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子をガラニンと接触させる工程と、
b)ガラニンに対する前記試験分子の影響を測定する工程と、
を含んでなる、方法。 - 前記影響が、結合アッセイにより測定される、請求項35に記載の方法。
- 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR2遺伝子コピー数を測定し、これにより試験遺伝子コピー数についてのデータを得る工程と、
b)前記試験遺伝子コピー数を、対照遺伝子コピー数についてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記生物学的検体における遺伝子が増幅されている場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照遺伝子コピー数が、細胞1個あたり2個である、請求項37に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項37に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項39に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項39に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、GALR2DNAまたはRNAと相互作用することにより、GALR2遺伝子機能を阻害するインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、デコイ分子またはデコイDNAである、請求項42に記載の方法。
- 前記インヒビターがヌクレオチドを含有し、且つ前記インヒビターの長さが約100bp未満である、請求項42に記載の方法。
- 前記インヒビターが、リボザイムである、請求項42に記載の方法。
- 前記インヒビターが、小分子である、請求項42に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、GALR2タンパク質のインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、GALR2タンパク質に結合する抗体である、請求項47に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR2タンパク質に結合する小分子である、請求項47に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR2の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体である、請求項47に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR2タンパク質を過剰発現している細胞に結合する抗体である、請求項47に記載の方法。
- 単離されたGALR2遺伝子アンプリコンであって、以下のポリヌクレオチドからなる群から選択されるものの複数のコピーを含んでなる、アンプリコン:
a)配列番号4に記載されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b)配列番号3に記載のポリヌクレオチド;および
c)前記a)またはb)のポリヌクレオチドと少なくとも約90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド。 - 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR2のレベルを測定し、これにより試験レベルについてのデータを得る工程と、
b)前記試験レベルを、対照レベルについてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照レベルに対して前記生物学的検体の試験レベルが上昇している場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照レベルが、正常な生物学的検体において検出されたGALR2レベルのデータベースから得られるものである、請求項53に記載の方法。
- 前記データベースが、人口統計学的に多様な集団から得られる対照レベルを含むものである、請求項54に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項53に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項56に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項56に記載の方法。
- siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子が裸オリゴヌクレオチドの形態またはベクターの形態で供給され、前記siRNAがGALR2遺伝子またはGALR2転写物と相互作用する、方法。
- 前記siRNAがベクターとして供給され、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスである、請求項59に記載の方法。
- 前記ベクターが、レトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである、請求項59に記載の方法。
- GALR2siRNAをコードするベクターを投与することにより、遺伝子の生体内発現をブロックする方法。
- 前記siRNAがGALR2活性を妨害するものである、請求項62に記載の方法。
- 前記siRNAが、哺乳動物細胞においてGALR2遺伝子の転写後発現抑制を生じるものである、請求項62に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項64に記載の方法。
- GALR2拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子を癌細胞と接触させる工程と、
b)前記細胞中のGALR2レベルを測定することにより、試験レベルについてのデータを得る工程と、
c)前記試験レベルを対照レベルと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記細胞中のGALR2レベルが減少していた場合に、前記試験分子がGALR2拮抗活性を有することが示される、方法。 - GALR2レベルが、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により測定される、請求項66に記載の方法。
- GALR2レベルが、ノーザンハイブリダイゼーションにより測定される、請求項66に記載の方法。
- 前記試験分子が、抗体、ヌクレオチドまたは小分子である、請求項66に記載の方法。
- 前記細胞が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌から得られるものである、請求項66に記載の方法。
- GALR2拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子をGALR2と接触させる工程と、
b)GALR2に対する前記試験分子の影響を測定する工程と、
を含んでなる、方法。 - 前記影響が、結合アッセイにより測定される、請求項71に記載の方法。
- 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR3遺伝子コピー数を測定し、これにより試験遺伝子コピー数についてのデータを得る工程と、
b)前記試験遺伝子コピー数を、対照遺伝子コピー数についてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記生物学的検体における遺伝子が増幅されている場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照遺伝子コピー数が、細胞1個あたり2個である、請求項73に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項73に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項75に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項75に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、GALR3DNAまたはRNAと相互作用することにより、GALR3遺伝子機能を阻害するインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、デコイ分子またはデコイDNAである、請求項78に記載の方法。
- 前記インヒビターがヌクレオチドを含有し、且つ前記インヒビターの長さが約100bp未満である、請求項78に記載の方法。
- 前記インヒビターが、リボザイムである、請求項78に記載の方法。
- 前記インヒビターが、小分子である、請求項78に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、GALR3タンパク質のインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、GALR3タンパク質に結合する抗体である、請求項83に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR3タンパク質に結合する小分子である、請求項83に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR3の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体である、請求項83に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR3タンパク質を過剰発現している細胞に結合する抗体である、請求項83に記載の方法。
- 単離されたGALR3遺伝子アンプリコンであって、以下のポリヌクレオチドからなる群から選択されるものの複数のコピーを含んでなる、アンプリコン:
a)配列番号2に記載されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド;
b)配列番号1に記載のポリヌクレオチド;および
c)前記a)またはb)のポリヌクレオチドと少なくとも約90%の配列同一性を有するポリヌクレオチド。 - 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR3のレベルを測定し、これにより試験レベルについてのデータを得る工程と、
b)前記試験レベルを、対照レベルについてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照レベルに対して前記生物学的検体の試験レベルが上昇している場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照レベルが、正常な生物学的検体において検出されたGALR3レベルのデータベースから得られるものである、請求項89に記載の方法。
- 前記データベースが、人口統計学的に多様な集団から得られる対照レベルを含むものである、請求項90に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項89に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項92に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項92に記載の方法。
- siRNAをそれを必要としている患者に投与する方法であって、前記siRNA分子が裸オリゴヌクレオチドの形態またはベクターの形態で供給され、前記siRNAがGALR3遺伝子またはGALR3転写物と相互作用する、方法。
- 前記siRNAがベクターとして供給され、前記ベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスである、請求項95に記載の方法。
- 前記ベクターが、レトロウイルスまたはアデノウイルスに基づくベクターである、請求項95に記載の方法。
- GALR3siRNAをコードするベクターを投与することにより、遺伝子の生体内発現をブロックする方法。
- 前記siRNAがGALR3活性を妨害するものである、請求項98に記載の方法。
- 前記siRNAが、哺乳動物細胞においてGALR3遺伝子の転写後発現抑制を生じるものである、請求項98に記載の方法。
- 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項100に記載の方法。
- GALR3拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子を癌細胞と接触させる工程と、
b)前記細胞中のGALR3レベルを測定することにより、試験レベルについてのデータを得る工程と、
c)前記試験レベルを対照レベルと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記細胞中のGALR3レベルが減少していた場合に、前記試験分子がGALR3拮抗活性を有することが示される、方法。 - GALR3レベルが、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により測定される、請求項102に記載の方法。
- GALR3レベルが、ノーザンハイブリダイゼーションにより測定される、請求項102に記載の方法。
- 前記試験分子が、抗体、ヌクレオチドまたは小分子である、請求項102に記載の方法。
- 前記細胞が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌から得られるものである、請求項102に記載の方法。
- GALR3拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子をGALR3と接触させる工程と、
b)GALR3に対する前記試験分子の影響を測定する工程と、
を含んでなる、方法。 - 前記影響が、結合アッセイにより測定される、請求項107に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、GALR2−GALR3ヘテロ複合体DNAまたはRNAと相互作用することにより、GALR2−GALR3ヘテロ複合体遺伝子機能を阻害するインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、siRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、デコイ分子またはデコイDNAである、請求項109に記載の方法。
- 前記インヒビターがヌクレオチドを含有し、且つ前記インヒビターの長さが約100bp未満である、請求項109に記載の方法。
- 前記インヒビターが、リボザイムである、請求項109に記載の方法。
- 前記インヒビターが、小分子である、請求項109に記載の方法。
- 哺乳動物組織における癌増殖または前癌増殖を阻害する方法であって、前記組織を、GALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質のインヒビターと接触させることを含んでなる、方法。
- 前記インヒビターが、GALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質に結合する抗体である、請求項114に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質に結合する小分子である、請求項114に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR2−GALR3ヘテロ複合体の発癌作用または抗アポトーシス活性をブロックする抗体である、請求項114に記載の方法。
- 前記インヒビターが、GALR2−GALR3ヘテロ複合体タンパク質を過剰発現している細胞に結合する抗体である、請求項114に記載の方法。
- 哺乳動物における癌の診断方法であって、
a)前癌状態または癌状態にあると疑われる前記哺乳動物の領域から得た生物学的検体におけるGALR2−GALR3ヘテロ複合体のレベルを測定し、これにより試験レベルについてのデータを得る工程と、
b)前記試験レベルを、対照レベルについてのデータと比較する工程とを含んでなり、前記対照レベルに対して前記生物学的検体の試験レベルが上昇している場合に、前記哺乳動物に前癌性病変または癌が存在することが示される、方法。 - 前記対照レベルが、正常な生物学的検体において検出されたGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルのデータベースから得られるものである、請求項119に記載の方法。
- 前記データベースが、人口統計学的に多様な集団から得られる対照レベルを含むものである、請求項120に記載の方法。
- 前記データが、電子フォーマットに保存される、請求項119に記載の方法。
- 前記電子フォーマットが、電子メール、ディスク、コンパクトディスク(CD)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、メモリーカード、メモリーチップ、ROMまたはRAM、磁気光学ディスク、テープ、ビデオ、ビデオクリップ、マイクロフィルム、インターネット、共有ネットワークおよび共有サーバーからなる群から選択されるものである、請求項122に記載の方法。
- 前記データが、電送、ビデオ表示またはテレコミュニケーションにより、表示、送信または解析される、請求項122に記載の方法。
- GALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子を癌細胞と接触させる工程と、
b)前記細胞中のGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルを測定することにより、試験レベルについてのデータを得る工程と、
c)前記試験レベルを対照レベルと比較する工程とを含んでなり、前記対照に対して前記細胞中のGALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルが減少していた場合に、前記試験分子がGALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性を有することが示される、方法。 - GALR2−GALR3ヘテロ複合体レベルが、ノーザンハイブリダイゼーションにより測定される、請求項125に記載の方法。
- 前記試験分子が、抗体、ヌクレオチドまたは小分子である、請求項125に記載の方法。
- 前記細胞が、肺癌、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、前立腺癌または卵巣癌から得られるものである、請求項125に記載の方法。
- GALR2−GALR3ヘテロ複合体拮抗活性について試験分子をスクリーニングする方法であって、
a)前記分子をGALR2−GALR3ヘテロ複合体と接触させる工程と、
b)GALR2−GALR3ヘテロ複合体に対する前記試験分子の影響を測定する工程と、
を含んでなる、方法。 - 前記影響が、結合アッセイにより測定される、請求項129に記載の方法。
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