DE60129222T2

DE60129222T2 - Heterocyclischen inhibitoren von glycogen synthase kinase gsk-3

Info

Publication number: DE60129222T2
Application number: DE60129222T
Authority: DE
Inventors: Ana Martinez Gil; Ana Castro Morera; Maria Concepción Perez Martin; Mercedes Alonso Cascon; Isabel Dorronsoro Diaz; Francisco Jose Moreno Munoz; Jurado Francisco Wandosell
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Autonoma de Madrid
Priority date: 2000-05-11
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2021-05-12
Also published as: CZ296087B6; RU2294931C2; MXPA02011079A; CN1568310A; US20080033012A1; KR100812407B1; DK1286964T3; IL152721A0; CZ20023692A3; AU5498101A; BR0110734A; ATE366238T1; US7781463B2; CA2408747C; US7666885B2; EP1286964B1; HUP0302002A3; WO2001085685A1; KR20030025919A; US6872737B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind heterocyclische Inhibitoren der Glykogensynthase-Kinase GSK-3 und ihre Anwendung zur Behandlung einer Erkrankung, an der GSK-3 beteiligt ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Alzheimer-Krankheit (AK) stellt einen neurodegenerativen Prozess dar, der durch kognitive Störungen, die von einer progressiven Verschlechterung der cholinergen Funktion begleitet sind, und neuropathologische Läsionen in der Form seniler Plaques, die vom fibrillären β-Amyloid gebildet werden, und neurofibrilläre Tangles, Bündel aus gepaarten helikalen Filamenten, gekennzeichnet ist.
Allgemein gesprochen ist die AK auf die Altersgruppen über 60 Jahre beschränkt und stellt die häufigste Ursache der Demenz unter der älteren Bevölkerung dar. Derzeit sind 23 Millionen Menschen weltweit von der AK betroffen. Mit zunehmender Langlebigkeit wird sich bis zum Jahr 2050 die Anzahl der AK-Fälle schätzungsweise mehr als verdreifachen [Amaduci, L.; Fratiglioni, L. „Epidemiology of AD: Impact an the treatment", in Alzheimer Disease: Therapeutic Strategies, E. Giacobini und R. Becker, Hrsg., Birhäuser, EEUU, 1994, S. 8].
Bei der AK werden im Gehirn zwei von Neuronenverlust begleitete bedeutende histologische Läsionen beobachtet: neurofibrilläre Tangles und senile Plaques auf intrazellulärer bzw. extrazellulärer Ebene [„Alzheimer Disease: From molecular biology to therapy”, E. Giacobini und R. Becker, Hrsg., Birhäuser, EEUU, 1996].
Neurofibrilläre Tangles stellen Strukturen dar, die durch gepaarte helikale Filamente (PHF) gebildet werden. Sie bestehen hauptsächlich aus dem mit den Mikrotubuli assoziierten Protein (MAP) Tau in einem abnorm hyperphosphorylierten Zustand [Grundke-Iqbal, I.; Iqbal, K.; Tung, Y. C.; Quinlan, M.; Wisniewski, H. M.; Binder, L. I., „Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau in Alzheimer cytoskeletal pathology", Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1986, 83, 4913-4917; Grundke-Iqbal, I.; Iqbal, K.; Quinlan, M.; Tung, Y. C.; Zaidi, M. S.; Wisniewski, H. M., „Microtubule-associated protein tau. A component of the Alzheimer paired helical filaments", J. Biol. Chem., 1986, 261, 6084-6089; Greenberg, S. G.; Davies, P.; Schein, J. D.; Binder, L. I., „Hydrofluoric acid-treated tau PHF proteins display the same biochemical properties as normal tau.", J. Biol. Chem., 1992, 267, 564-569]. Eine derartig aberrante Phosphorylierung von Tau, die mittels der Wirkungen von verschiedenen Proteinkinasen und -phosphatasen bestimmt wird, scheint seine Fähigkeit zu beeinträchtigen, an Mikrotubuli zu binden und sie zu stabilisieren, und dies kann zur Pathologie der AK beitragen [Moreno, F. J.; Medina, M.; Perez, M.; Montejo de Garcini, E.; Avila, J., „Glycogen synthase kinase 3 phosphorylation of different residues in the presence of different factors: Analysis an tau protein", FEBS Lett., 1995, 372, 65-68]. Folglich könnte es sich bei der Blockade dieses Hyperphosphorylierungsschrittes um ein Haupttarget zur Unterbrechung der pathogenen Kaskade handeln. Die selektiven Inhibitoren der Tau-Kinasen könnten neue wirksame Arzneimittel zur Behandlung der AK darstellen.
Die Suche nach Tau-Kinaseinhibitoren stellt ein Gebiet von großem Interesse dar. Tau kann von mehreren Prolin-gelenkten Proteinkinasen (PDK) und Nicht-PDK phosphoryliert werden. Bei der AK wird jedoch die genaue Rolle von jedweder dieser Kinasen bei der abnormen Hyperphosphorylierung von Tau noch nicht verstanden, und bisher wurde nicht gefunden, dass die Aktivität dieser Kinasen upreguliert wird.
Es besteht kein Zweifel, dass es sich bei der Glykogensynthase-Kinase-3β (GSK-3β) um eine in vivo-Tau-Kinase im Gehirn handelt [Lovestone, S.; Hartley, C. L.; Pearce, J.; Anderton, B. H., „Phosphorylation of tau by glycogen synthase-3 in intact mammalian cells: the effects an the organization and stability of microtubules", Neuroscience, 1996, 73, 1145-1157; Wagner, U.; Utton, M.; Gallo, J. M.; Miller, C. C., „Cellular phosphorylation of tau by GSK-3β influences tau binding to microtubules and microtubule Organisation", J. Cell. Sci., 1996, 109, 1537-1543; Ledesma, M.; Moreno, F. J.; Perez, M. M.; Avila, J., „Binding of apolipoprotein E3 to tau protein: effects an tau glycation, tau phosphorylation and taumicrotubule binding, in vitro", Alzheimer Res., 1996, 2, 85-88]. Diese Befunde öffnen die Tür für die Anwendung von GSK-3β-Inhibitoren als Therapeutika in der Behandlung der AK. Zurzeit sind wenige Verbindungen mit dieser enzymatischen Inhibitionseigenschaft bekannt.
Lithium verhalt sich wie ein spezifischer Inhibitor der GSK-3-Familie von Proteinkinasen in vitro und in intakten Zellen [Munoz-Montan ~o, J. R; Moreno, F. J.; Avila, J.; Diaz-Nido, J., „Lithium inhibits Alzheimer's disease-like tau protein phosphorylation in neurons", FEBS Lett., 1997, 411, 183-188]. Martinez et al. [Bioorganica + Medicinal Chemistry 5, 1275-1283, 1997] beziehen sich auf Arylimino-1,2,4-thiadiazolidinone, eine neue Familie von Kaliumkanalöffnern.
Letztendlich wird beobachtet, dass Insulin GSK-3 inaktiviert, und es wird gezeigt, dass sich der nicht insulinabhängige Diabetes mellitus mithilfe der Aktivierung dieses Enzyms entwickelt. Folglich würden die GSK-3-Inhibitoren eine neue Therapie für den nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus darstellen.
Unsere Arbeitsgruppe hat vor kurzem eine neue Familie kleiner heterocyclischer Moleküle mit GSK-3β-Inhibitionseigenschaften in mikromolarer Konzentration entdeckt.
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (II).
worin:
R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Haloalkyl, Aryl, -(Z)_n-Aryl, Heteroaryl, -OR³, -C(O)R³, -C(O)OR³, -(Z)_n-C(O)OR³ und -S(O)_t-;
Z unabhängig ausgewählt ist aus: -C(R³)(R⁴)-, -C(O)-, -O-, -C(=NR³)-, -S(O)_t- und -N(R³)-;
n für null, eins oder zwei steht;
t für null, eins oder zwei steht;
R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Akyl, Aryl und einem Heterocyclus;
X und Y unabhängig ausgewählt sind aus: =O, =S, =N(R³) und =C(R¹)(R²); und
R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff Alkyl, Cycloalkyl, Haloalkyl, Aryl, -(Z)_nAryl, Heteroaryl, -OR³, -C(O)R³, -C(O)OR³, -(Z)_n-C(O)OR³ und -S(O)_t;
bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, an der GSK-3 beteiligt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (II) an einen Menschen mit Bedarf an einer solchen Behandlung umfasst.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie in dieser Beschreibung und in den anhängenden Ansprüchen verwendet und sofern nichts Gegenteiliges angegeben ist, haben die folgenden Begriffe die angezeigte Bedeutung:

„Alkyl" verweist auf einen gerad- oder verzweigtkettigen Kohlenwasserstoffrest, der aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen besteht, der keine Sättigung enthält, mit einem bis acht Kohlenstoffatom(en), und der durch eine Einfachbindung an den Rest des Moleküls angelagert ist, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl usw. Alkylreste können optional durch einen oder mehr Substituenten substituiert werden, der/die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus einem Halo, Hydroxy, Alkoxy, Carboxy, Cyano, Carbonyl, Acyl, Alkoxycarbonyl, Amino, Nitro, Mercapto und Alkylthio.
„Alkoxy" verweist auf einen Rest der Formel -OR_a, worin R_a einen Alkylrest, wie vorstehend definiert ist, darstellt, wie zum Beispiel Methoxy, Ethoxy, Propoxy usw.
„Alkoxycarbonyl" verweist auf einen Rest der Formel -C(O)OR_a, worin R_a einen Alkylrest, wie vorstehend definiert ist, darstellt, wie zum Beispiel Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Propoxycarbonyl usw.
„Alkylthio" verweist auf einen Rest der Formel -SR_a, worin R_a einen Alkylrest, wie vorstehend definiert ist, darstellt, wie zum Beispiel Methylthio, Ethylthio, Propylthio usw.
„Amin" verweist auf einen Rest der Formel -NH₂.
„Aryl" verweist auf einen Phenyl- oder Naphthylrest, bevorzugt einen Phenylrest. Der Arylrest kann optional durch einen oder mehr Substituenten substituiert werden, der/die aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus Hydroxy, Mercapto, Halo, Alkyl, Phenyl, Alkoxy, Haloalkyl, Nitro, Cyano, Dialkylamino, Aminoalkyl, Acyl und Alkoxycarbonyl, wie hierin definiert ist.
„Aralkyl" verweist auf eine Arylgruppe, die mit einer Alkylgruppe verknüpft ist. Bevorzugte Beispiele schließen Benzyl und Phenethyl ein.
„Acyl" verweist auf einen Rest der Formel -C(O)-R_c und -C(O)-R_d, worin R_c einen Alkylrest, wie vorstehend definiert ist, darstellt, und R_d einen Acylrest, wie vorstehend definiert ist, darstellt, wie zum Beispiel Acetyl, Propionyl, Benzoyl und dergleichen.
„Aroylalkyl" verweist auf eine Alkylgruppe, die mit -C(O)-R_d substituiert ist. Bevorzugte Beispiele schließen Benzoylmethyl ein.
„Carboxy" verweist auf einen Rest der Formel -C(O)OH.
„Cyano" verweist auf einen Rest der Formel -CN.
„Cycloalkyl” verweist auf einen stabilen 3- bis 10-gliedrigen monocyclischen oder bicyclischen Rest, der gesättigt oder teilweise gesättigt ist, und der lediglich aus Kohlenstoff- und Wasserstoffatomen besteht. Sofern nicht anderweitig spezifisch in der Beschreibung angegeben ist, versteht man unter dem Begriff „Cycloalkyl", dass er Cycloalkylreste einschließt, die optional durch einen oder mehr Substituenten substituiert sind, der/die unabhängig aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus Alkyl, Halo, Hydroxy, Amino, Cyano, Nitro, Alkoxy, Carboxy und Alkoxycarbonyl.
„Kondensiertes Aryl" verweist auf eine Arylgruppe, besonders auf eine Phenyl- oder Heteroarylgruppe, die an den fünfgliedrigen Ring kondensiert ist.
„Halo" verweist auf Bromo, Chloro, Iodo oder Fluoro.
„Haloalkyl" verweist auf einen Alkylrest, der – wie vorstehend definiert ist – durch einen oder mehr Halorest(e) substituiert ist, wie z. B. Trifluormethyl, Trichlormethyl, 2,2,2-Trifluorethyl, 1-Fluormethyl-2-fluorethyl und dergleichen.
„Heterocyclus" verweist auf einen Heterocyclylrest. Der Heterocyclus verweist auf einen stabilen 3- bis 15-gliedrigen Ring, der aus Kohlenstoffatomen und aus einem bis fünf Heteroatom(en) besteht, das/die aus der Gruppe ausgewählt ist/sind, bestehend aus Stickstoff Sauerstoff und Schwefel, bevorzugt einem 4- bis 8-gliedrigen Ring mit einem oder mehr Heteroatom(en), bevorzugter einem 5- oder 6-gliedrigen Ring mit einem oder mehr Heteroatom(en). Für die erfindungsgemäßen Zwecke kann der Heterocyclus ein monocyclisches, bicyclisches oder tricyclisches Ringsystem darstellen, das kondensierte Ringssysteme einschließen kann; und die Stickstoff-, Kohlenstoff- oder Schwefelatome im Heterocyclylrest können optional oxidiert sein; das Stickstoffatom kann optional quaternisiert sein; und der Heterocyclylrest kann teilweise oder vollständig gesättigt oder aromatisch sein. Beispiele solcher Heterocyclen schließen folgende ein, sind aber nicht beschränkt auf Azepine, Benzimidazol, Benzothiazol, Furan, Isothiazol, Imidazol, Indol, Piperidin, Piperazin, Purin, Chinolin, Thiadiazol und Tetrahydrofuran. Der Heterocyclus kann optional durch R³ und R⁴, wie vorstehend in der „Zusammenfassung der Erfindung" definiert ist, substituiert werden.
„Heteroaryl" verweist auf einen aromatischen Heterocyclus.
„Mercapto" verweist auf einen Rest der Formel -SH.
„Nitro" verweist auf einen Rest der Formel -NO₂.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Krankheit, an der GSK-3 beteiligt ist, um die Alzheimer-Krankheit oder um den nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus. Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die Krankheit eine hyperproliferative Krankheit, wie zum Beispiel Krebs, Gewebsdysplasien oder -metaplasien, Psoriasis, Arteriosklerose oder Restenose dar.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden in der Formel (II) X und Y bevorzugt ausgewählt aus: Sauerstoff Schwefel und -NR³-, worin R³ heterocyclisch ist, besonders einen 6-gliedrigen Heterocyclus darstellt, der ein Heteroatom aufweist, das Stickstoff darstellt, das optional aromatisch und optional oxidiert oder quaternisiert ist. X stellt bevorzugt Sauerstoff dar, bevorzugter stellen sowohl X als auch Y beide Sauerstoff dar.
Bevorzugt sind R^a und R^b unabhängig ausgewählt aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), C(R³)(R⁴)-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional mit einer Gruppe substituiert ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -OR³, -C(O)OR³ und -C(R³)(R⁴)-C(O)OR³, und R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl und einem Heterocyclus.
Bevorzugter sind R^a und R^b unabhängig ausgewählt aus: Alkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -CH₂-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional mit einer Gruppe substituiert ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), und -CH₂-C(O)OR³, worin R³ Wasserstoff oder Alkyl darstellt.
Noch bevorzugter sind R^a und R^b unabhängig ausgewählt aus: Methyl, Ethyl, Propyl, Benzyl, Phenyl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Methyl, Fluoro, Chloro, Bromo und Methoxy ausgewählt ist) und -CH₂-C(O)O-Ethyl.
Eine andere bevorzugte Gruppe von Verbindungen stellen die dar, worin R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -C(R³)(R⁴)-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional substituiert mit einer Gruppe ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -OR³, -C(O)OR³ und -C(R³)(R⁴)-C(O)OR³, worin R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl und einem Heterocyclus, und X und Y unabhängig ausgewählt sind aus: =O, =S und =NR³.
Bevorzugt sind R^a und R^b unabhängig ausgewählt aus: Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -C(R³)(R⁴)-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional substituiert mit einer Gruppe ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -OR³, -C(O)OR³ und -C(R³)(R⁴)-C(O)OR³, worin R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff und Alkyl und X für =O steht.
Bevorzugter sind R^a und R^b unabhängig ausgewählt aus: Methyl, Ethyl, Propyl, Benzyl, Phenyl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Methyl, Fluoro, Chloro, Bromo und Methoxy ausgewählt ist) und -CH₂-C(O)O-Ethyl; worin X für =O steht und Y für =O steht.
In einer bevorzugten Ausführungsform passt die Verbindung der Formel (II) zu einer der folgenden Möglichkeiten:
Bevorzugtere Verbindunen der Formel (II) stellen die in der folgenden Gruppe dar:

R^a R^b X Y

CH₂Ph Me O O

Et Me O O

Ph Me O O

CH₂CO₂Et Me O O

4-OMePh Me O O

4-MePh Me O O

4-BrPh Me O O

4-FPh Me O O

4-ClPh Me O O

CH₂Ph CH₂Ph O S

Ph Ph O S
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt eine pharmazeutische Formulierung dar, die als Wirkstoff eine Verbindung der Formel (II), wie vorstehend definiert ist, enthält.
In einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt wird auf eine Verbindung der Formel (II) als auf eine verwiesen, worin die Verbindung eine der folgenden darstellt:

R^a R^b X Y

CH₂Ph Me O O

CH₂CO₂Et Me O O

4-OMePh Me O O

4-MePh Me O O

4-BrPh Me O O
SYNTHESE DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN VERBINDUNGEN:
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mittels verfügbarer Verfahren synthetisiert werden.
Für bevorzugte Verbindungen der Formel (II) steht ein allgemeines Verfahren zur Verfügung [Martinez, A.; Castro, A.; Cardelús L., Llenas, J.; Palacios, J. M Bioorg. Med Chem., 1997, 5, 1275-1283].
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (II) und in Tabelle I aufgelistet wurden konkret unter Befolgung des in Schema 1 erläuterten Syntheseverfahrens und unter Verwendung der Reaktivität von N-Alkyl-S-[N'-chlorcarbamoyl)amino]isothiocarbamoylchloriden mit verschiedenen Alkylisocyanaten hergestellt. Die Chlorierung der Isothiocyanate wird durch Zufügen einer äquimolaren Menge an Chlor über eine Hexanlösung des erwähnten Isothiocyanats bei –15 °C durchgeführt. Die Reaktion des mit Alkyl oder Arylisocyanat unter inerter Atmosphäre und sich anschließender Hydrolyse gebildeten Iminochloralkylsulfenylchlorids ergab die in der Tabelle I beschriebenen Thiadiazolidindione.
SCHEMA 1
Die erfindungsgemäßen typischen Verbindungen inhibieren selektiv GSK-3β ohne Inhibition anderer Proteinkinasen, wie zum Beispiel PKA, PKC, CK-2 und CdK2, welche die weit verbreiteten Wirkungen eliminieren könnten. GSK-3β ist an der Ätiopathogenese der AK beteiligt und ist für die abnorme Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins verantwortlich. Die hier offenbarten selektiven Inhibitoren können bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, die mit der Pathologie des Tau-Proteins assoziiert sind, insbesondere für die AK, die einen erfindungsgemäßen Teil bildet, verwendet werden. Die Inhibitionswirkung dieser Verbindungen gegen GSK-3β führt zum Design von Arzneimitteln, die zum Anhalten der Bildung neurofibrillärer Tangles, einem der bei diesem neurodegenerativen Prozess vorliegenden Kennzeichen, fähig ist.
Diese Verbindungen können bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung anderer Pathologien, an denen die GSK-3β beteiligt ist, wie zum Beispiel dem nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus, nützlich sein.
Diese Verbindungen können aufgrund ihrer Inhibition des Zellzyklus, der einen erfindungsgemäßen Teil bildet, außerdem bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung hyperproliferativer Erkrankungen, wie zum Beispiel Gewebsdysplasien und -metaplasien, Psoriasis, Arteriosklerose, Restenose und Krebs, nützlich sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß weiter die Bereitstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder einem Verdünnungsmittel umfassen. Geeignete Dosierungsformen und Dosierungsraten können gemäß der üblichen praktischen Ausführung ausgearbeitet und übernommen werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1. – ENZYMATISCHE INHIBITION DER ERFINDUNGSGEMÄSSEN VERBINDUNGEN
GSK-3β-Inhibition: Die GSK-3-Aktivität wurde mittels Inkubation eines Gemischs von GSK-3-Enzym (Sigma), einer Phosphatquelle und einem GSK-3-Substrat in An- und Abwesenheit der entsprechenden Testverbindung und durch Messen der GSK-3-Aktivität dieses Gemischs bestimmt.
Die GSK-3-Aktivität wird konkret mittels Inkubieren des Enzyms während 20 Minuten bei 37 °C in einem Endvolumen von 12 µl Puffer (50 mM Tris, pH = 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, 10 mM Cl₂Mg), supplementiert mit 15 µM (Endkonzentration) des synthetischen Peptids GS 1 [Woodgett, J. R. „Use of peptides for affinity purification of protein-serine kinases", Anal. Biochem., 1989, 180, 237-241] als Substrat, 15 µM ATP, 0,2 µC_i [γ-³²P]ATP und verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung bestimmt. Die Reaktion wird durch Zufügen eines Aliquots des Reaktionsgemischs im P81 Phosphocellulose-Papier gequencht.
Dieses Papier wurde dreimal mit 1 %iger Phosphorsäure gewaschen und die in das GS 1-Peptid inkorporierte Radioaktivität wird in einem Flüssigkeitszintillationszähler gemessen.
Die in Tabelle I gezeigten Verbindungen sind repräsentativ für die GSK-3-Inhibitionsaktivität des erfindungsgemäßen Gegenstandes. Die IC₅₀-Werte (die Konzentration, bei der eine 50 %ige Inhibition gezeigt wird) werden in der nachstehenden Tabelle 3 aufgelistet. TABELLE 3
GSK-3-Inhibition: Die Inhibitionsexperimente wurden auch bei variablen ATP-Konzentrationen (bis zu 50 µM) durchgeführt, und in allen Fällen wurde der gleiche IC₅₀-Wert erhalten. Folglich könnte dies darauf hindeuten, dass Thiadiazolindione nicht mit ATP um die Bindung an GSK-3 konkurrieren.
Die ersten vier Verbindungen wurden auf Inhibition mittels anderer Enzyme getestet.
Proteinkinase A-Inhibition (PKA-Inhibition): Die potenzielle Inhibition dieses Enzyms wurde mittels der Bestimmung der Phosphorylierung von Stathmin durch die Proteinkinase A (PKA) bestimmt. Das Stathmin wurde nach dem von Belmont und Mitchinson (Belmont, L. D.; Mitchinson, T. J. „Identification of a protein that interacts with tubulin dimers and increases the catastrophe rate of microtubule", Cell, 1996, 84, 623-631) beschriebenen Verfahren gereinigt.
Es wurde konkret gereinigte PKA (Sigma, katalytische Untereinheit aus dem Rinderherz (p 2645)) und 10-15 µg Substrat (Stathmin) in einer Pufferlösung mit einem Gesamtvolumen von 25 µl, enthaltend 20 µM (γ-³²P)ATP gereinigt. Die Reaktion mit cAMP-Kinaseprotein (100 ng) wurde in 50 µl von 25 mM HEPES, pH 7,4, 20 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 2 mM Dithiothreitol und 0,5 mM Na₃VO₄ durchgeführt. Nach Ablauf der Reaktion wurde ein Quenchpuffer zugefügt, das Reaktionsgemisch wurde während 5 Minuten bei 100 °C gekocht und das phosphorylierte Protein wurde mittels Gelelektrophorese charakterisiert und mittels Autoradiographie quantifiziert.
Unter diesen Bedingungen zeigte keine der getesteten Verbindungen eine PKA-Inhibition.
Proteinkinase C (PKC)-Inhibition: Die potenzielle Inhibition dieses Enzyms wird durch Bestimmung der Phosphorylierung des Peptids PANKTPPKSPGEPAK (Woodgett, J. R. „Use of peptides for affinity purification of protein-serine kinases", Anal. Biochem., 1989, 180, 237-241) durch die Proteinkinase C (PKC) unter Verwendung von Phosphatidylserin als Stimulationsmittel bewertet. Bei dem befolgten Verfahren handelt es sich um das gleiche wie um das vorstehend für GSK-3 beschriebene.
Es wurde konkret gereinigte PKC aus dem Rattenhirn unter Befolgung des von Walsh (Walsh, M. P.; Valentine, K. A.; Nagi, P. K.; Corruthers, C. A.; Hollenberg, M. D. Biochem. J., 1984, 224, 117-127) beschriebenen Verfahrens und 1-10 mM Substrat in einem Gesamtvolumen von 25 µl angemessener Pufferlösung, enthaltend 10 µM (γ-³²P)ATP, verwendet.
Unter diesen Bedingungen zeigte keine der getesteten Verbindungen jedwede Inhibition von PKC.
Caseinkinase-2-Inhibition (CK-2-Inhibition): Die Phosphorylierungsaktivität dieses Enzyms gegen Stathmin wurde unter Verwendung von gereinigter CK-2 aus dem Rinderhirn, unter Befolgung des von Alcazar (Alcazar, A.; Marín, E.; Lopez-Fando, J.; Salina, M. „An improved purification procedure and properties of casein kinase II from brain", Neurochem. Res., 1988, 13, 829-836) beschriebenen Verfahrens, mit 3,6 µM Substrat in einem Gesamtvolumen von 25 µl einer angemessenen Pufferlösung, enthaltend 20 µM (γ³²P)ATP, gemessen. Die CK-2-Assays wurden mit Stathmin als Substrat (siehe PKA-Bestimmung) in 50 µl 25 mM HEPES, pH 7,4, 20 mM MgCl₂, 2 mM EGTA, 2 mM Dithiothreitol, 0,5 mM Na₃VO₄ und 100 ng gereinigtem CK-2 durchgeführt. Nachdem die Reaktion abgelaufen war, wurde das gleiche wie für PKA beschriebene Verfahren befolgt.
Unter diesen Bedingungen zeigte keine der getesteten Verbindungen jedwede CK-2-Inhibition.
Cyclin-abhängige Proteinkinase 2-Inhibition (Cdc2-Inhibition): Die Phosphorylierungsaktivität dieses Enzyms gegen Histon H1 wurde unter Verwendung von Cdc2 (Calbiochem) unter Befolgung des von Kobayashi (Kobayashi, H.; Stewart, E.; Poon, R. Y.; Hunt, T. „Cyclin A and cyclin B dissociate from p34cdc2 with half-times of 4 and 15 h, respectively, regardless of the Phase of the cell cycle", J. Biol. Chem., 1994, 269, 29153-29160) beschriebenen Verfahrens, mit 1 µg/µl Substrat in einem Gesamtvolumen von 25 µl der angemessenen Pufferlösung, enthaltend 20 µM (γ-³²P)ATP gemessen. Die Cdc2-Assays wurden mit Histon H1 als Substrat (siehe PKA-Bestimmung) in 50 µl Puffer pH 7,5, 50 mM Tris-HCl, 10 mM Cl₂Mg, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 100 µM ATP, 0,01 % BRIJ-35 durchgeführt. Nachdem die Reaktion abgelaufen war, wurde das gleiche wie für PKA beschriebene Verfahren befolgt.
Unter diesen Bedingungen zeigte keine der getesteten Verbindungen jedwede Cdc2-Inhibition.
BEISPIEL 2. – ANALYSE DES NEURITENWACHSTUMS NACH DER ARZNEIMITTELBEHANDLUNG
Die Zellen wurden in einem Dulbecco-Medium (DEMEM) mit einem 10 %igen fetalen Rinderserum, Glutamin (2 mM) und Antibiotika aufrechterhalten. Für die Analyse der potenziellen GSK-3-Inhibition in vivo, wurden Maus-Neuroblastom-Kulturen (N₂A-Kulturen) (Garcia-Perez, J.; Avila, J.; Diaz-Nido, J. „Lithium induces morphological differentiation of mouse neuroblastoma", J. Neurol Res., 1999, 57, 261-270) verwendet. Die Testverbindungen wurden diesen Zellkulturen zugefügt. Diese Zelllinie weist die Eigenheit der Expression einer bestimmten Art des Neuronenphänotyps (Neuritenausläufer) nach dem Zufügen von Lithiumchlorid (10 mM), einem bekannten GSK-3-Inhibitor, auf. Nach 2- bis 3 tägiger Kultur wurde die Wirkung der in Tabelle I aufgelisteten getesteten Verbindungen überprüft. Es wurde die Generierung von Neuritenausläufern im gleichen Ausmaß beobachtet, wie wenn Lithium zugefügt worden wäre. Diese Tatsache bestätigt die GSK-3-Inhibition der erfindungsgemäßen Verbindungen in vivo.
BEISPIEL 3. – BLOCKADE DES ZELLZYKLUS
Parallel laufend wurde das potenzielle Eingreifen dieser Verbindungen in den Zellzyklus auf N₂A-Zellen untersucht. Die Zellkultur wurde in einem Dulbecco-Medium (DEMEM) mit einem 10 %igen fetalen Rinderserum, Glutamin (2 mM) und Antibiotika aufrechterhalten.
Die in Tabelle 3 aufgelisteten ersten vier Verbindungen der allgemeinen Formel (II) wurden unter den beschriebenen Bedingungen getestet und wiesen eine Fähigkeit zur Hemmung des Zellzyklus bei einer Inhibitor-Konzentration auf, die zwischen 100 nM und 1 µM umfasste. Die Zellblockade wurde initial bei Konzentrationen beobachtet, die zwischen 100 und 200 nM umfassten und die bei 1 µM vollkommen wirksam war.
Die getesteten Verbindungen waren in der stationären Fibroblastenkultur MRC-5 nach einer 10-tägigen ständigen Exposition gegenüber den Inhibitoren nicht toxisch.
BEISPIEL 4. – BLOCKADE DES ZELLZYKLUS

Die IC₅₀ für einige der in N₂A-Zellkulturen getesteten Verbindungen sind nachstehend in Tabelle 5 aufgelistet.

TABELLE 5

R^a	R^b	X	Y	IC₅₀(µM)
CH₂Ph	Me	O	O	4-8
Et	Me	O	O	40-100
Et	nPr	O	O	5-10
Et	Cyclohexyl	O	O	6-9
Ph	Me	O	O	4-7
CH₂CO₂Et	Me	O	O	1-2
4-OMePh	Me	O	O	1-2
CH₂Ph	Et	O	O	4-7
CH₂Ph	CH₂Ph	O	O	2-3
Et	Et	O	O	30-80
CH₂Ph	CH₂Ph	O	S	1-2
Ph	Ph	O	S	4-8

Claims

Verwendung einer Verbindung mit der allgemeinen Formel (II):
worin: R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Haloalkyl, Aryl, -(Z)_n-Aryl, Heteroaryl, -OR³, -C(O)R³, -C(O)OR³ und -(Z)_n-C(O)OR³; Z unabhängig ausgewählt ist aus: -C(R³)(R⁴)-, -C(O)-, -O-, -C(=NR³)-, -S(O)_t- und -N(R³)-; n für null, eins oder zwei steht; t für null, eins oder zwei steht; R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind am: Wasserstoff, Akyl, Aryl und einem Heterocyclus; X und Y unabhängig ausgewählt sind aus: =O, =S, =N(R³) und =C(R¹)(R²); und R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff Cycloalkyl, Haloalkyl, Aryl, -(Z)_n-Aryl, Heteroaryl, -OR³, -C(O)R³, -C(O)OR³ und -(Z)_n-C(O)OR³; bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit, an der GSK-3 beteiligt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der Formel (II) an einen Menschen mit Bedarf an einer solchen Behandlung umfasst.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Krankheit aus der Alzheimer-Krankheit und dem nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, worin die Krankheit eine hyperproliferative Krankheit, wie zum Beispiel Krebs, Gewebsdysplasien oder -metaplasien, Psoriasis, Arteriosklerose oder Restenose darstellt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin in der Verbindung der Formel (II) R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff Cycloalkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -C(R³)(R⁴)-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional mit einer Gruppe substituiert ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -OR³, -C(O)OR³ und -C(R³)(R⁴)-C(O)OR³, und R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl und einem Heterocyclus.
Verwendung nach Anspruch 4, worin in der Verbindung der Formel (II) R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Alkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -CH₂-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional mit einer Gruppe substituiert ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), und -CH₂-C(O)OR³, und R³ Wasserstoff oder Alkyl darstellt.
Verwendung nach Anspruch 5, worin in der Verbindung der Formel (II) R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Methyl, Ethyl, Propyl, Benzyl, Phenyl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Methyl, Fluoro, Chloro, Bromo und Methoxy ausgewählt ist) und CH₂-C(O)O-Ethyl.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin in der Verbindung der Formel (II) X und Y unabhängig ausgewählt sind aus: =O, =S und NR³ (worin R³ heterocyclisch ist).
Verwendung nach Anspruch 7, worin in der Verbindung der Formel (II) X für =O steht.
Verwendung nach Anspruch 8, worin in der Verbindung der Formel (II) X für =O und Y für steht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, worin: R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff Cycloalkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -C(R³)(R⁴)-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional substituiert mit einer Gruppe ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -OR³, -C(O)OR³ und -C(R³)(R⁴)-C(O)OR³, R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff und einem Heterocyclus, und X und Y unabhängig ausgewählt sind aus: =O, =S und =NR³.
Verwendung nach Anspruch 10, worin: R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -C(R³)(R⁴)-Aryl (wobei der Aryl-Teil optional substituiert mit einer Gruppe ist, die aus Alkyl, Halo und Alkoxy ausgewählt ist), -OR³, -C(O)OR³ und -C(R³)(R⁴)-C(O)OR³, R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff und Alkyl; und X für =O steht.
Verwendung nach Anspruch 11, worin: R^a und R^b unabhängig ausgewählt sind aus: Methyl, Ethyl, Propyl, Benzyl, Phenyl (optional substituiert mit einer Gruppe, die aus Methyl, Fluoro, Chloro, Bromo und Methoxy ausgewählt ist) und -CH₂-C(O)O-Ethyl; X für =O steht; und Y für =O steht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Verbindung der Formel (II) mit einer der folgenden Möglichkeiten zusammenpasst:
Verwendung nach Anspruch 13, worin die Verbindung der Formel (II) mit einer der folgenden Möglichkeiten zusammenpasst: R^a R^b X Y CH₂Ph Me O O Et Me O O Ph Me O O CH₂CO₂Et Me O O 4-OMePh Me O O 4-MePh Me O O 4-BrPh Me O O 4-FPh Me O O 4-ClPh Me O O CH₂Ph CH₂Ph O S Ph Ph O S
Pharmazeutische Formulierung, enthaltend als Wirkstoff eine Verbindung der Formel (II) wie nach Ansprüchen 1 bis 14.
Verbindung mit der allgemeinen Formel (II):
worin die Verbindung eine der folgenden darstellt: R^a R^b X Y CH₂Ph Me O O CH₂CO₂Et Me O O 4-OMePh Me O O 4-MePh Me O O 4-BTPh Me O O