BR112015016433B1 - Uso de um composto de formula (i) para tratar um disturbio associado com a tensão do dobramento incorreto da proteína - Google Patents
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Abstract
USO DE UM COMPOSTO, COMPOSTOS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E COMBINAÇÃO. A presente invenção se refere a um composto de Fórmula (I), ou umtautômero e/ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: R1 é a alquila, Cl, F ou Br; R2 é o H ou F; R3 é selecionado a partir de H e alquila; R4 é selecionado a partir de H e C(O)R6; R5 é o H; ou R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10; R6 é selecionado a partir de R7, OR7 e NR8 R9; R7, R8 e R9 são cada um independentemente selecionados a partir de alquila, cicloalquila, aralquila, cicloalquenila, heterociclila e arila, cada uma opcionalmente é substituída com um ou mais grupos R10; cada R10 é independentemente selecionado a partir de halogênio, OH, CN, NO2, COO-alquila, aralquila, SO2- alquila, SO2-arila, COOH, CO-alquila, CO-arila, NH 2, NH-alquila, N(alquil) 2, CF3, alquila e alcóxi; X e Z são cada um, independentemente, o CR11, e Y é selecionado a partir de CR11 e N; e R11 é o H ou F; para a utilização no tratamento de um distúrbio associado (...).
Description
[001]A presente invenção se refere aos compostos que apresentam aplicações potenciais terapêuticas no tratamento dos distúrbios associados com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas. Em especial, a presente invenção se refere aos compostos que são capazes de exibir um efeito de proteção contra a tensão citotóxica endoplasmática do retículo (ER).
[002] O composto 2-(2,6- diclorobenzilideno)hidrazincarboximidamida, também referido como guanabenzo, é um agonista alfa do tipo alfa-2, que é utilizado como uma droga antiipertensiva. guanabenzo
[003] Diversos derivados de guanabenzo também foram descritos. Por exemplo, a patente US 3.982.020 (Sandoz, Inc.) descreve as hidrazinas substituídas por benzilideno e a sua utilização como agentes hipoglicêmicos- antiiperglicêmico, agentes antiobesidade e agentes antiinflamatórios. A patente US 2004/0.068.017 (Bausch & Lomb Inc.) descreve as hidrazinas substituídas por benzilideno que são capazes de aumentar a atividade da gelatinase A nas células oculares. As moléculas apresentam aplicações no tratamento do glaucoma de ângulo aberto primário. A publicação WO 2008/061647 (Acure Pharma AB) descreve a utilização de N-(2-cloro-3,4,- dimetoxibenzilidenamino)guanidina como um inibidor de VEGFR e suas aplicações associadas com o tratamento ou prevenção da formação de vasos sanguíneos indesejados durante o crescimento do tumor e/ou condições inflamatórias. A publicação WO 2005/031000 (Acadia Pharmaceuticals, Inc.) descreve as hidrazinas substituídas por benzilideno e a sua utilização no tratamento da dor aguda e dor neuropática crônica. Finalmente, a patente EP 1.908.464 (CNRS) descreve o guanabenzo e cloroguanabenzo e a sua utilização no tratamento das doenças associadas com a expansão da poliglutamina, incluindo a doença de Huntington.
[004] Mais recentemente, foi descrito que o guanabenzo possui um potencial terapêutico em uma série de outras áreas. Foi recentemente observado que o guanabenzo possui a atividade anti-prion (D. Tribouillard- Tanvier et al., 2008 PLoS One 3, e1981). Foi descrito que a sua atividade na proteção contra o dobramento incorreto das proteínas é surpreendentemente muito mais amplo e inclui atenuar o acúmulo do mutante de Huntington nas análises com base nas células (publicação WO 2008/041133) e proteger contra os efeitos letais da expressão do mutante Akita de insulina propenso ao dobramento incorreto no retículo endoplasmático (ER) das células beta pancreáticas MIN6 e INS-1 (P. Tsaytler, H.P. Harding, D. Ron e A. Bertolotti, Science, 332, 01 de abril de 2011, 91-94).
[005]Também foi mostrado que o guanabenzo promove a sobrevivência das células HeLa, de outra maneira expostas à tensão citotóxica ER induzida pelo inibidor de tunicamicina de N-glicosilação, em uma maneira dependente da dose (P. Tsaytler, H.P. Harding, D. Ron e A. Bertolotti, Science, 332, 01 de abril de 2011, 91-94). A avaliação quantitativa da viabilidade celular descreveu que o guanabenzo duplicou o número de células sobreviventes da tensão de ER com uma concentração eficaz média de cerca de 0,4 μM. O receptor a2-adrenérgico agonista de clonidina, e o receptor a2-adrenérgico antagonista de efaroxano não protegeram as células da tensão citotóxica de ER e o efaroxano não interferiu com o efeito de proteção do guanabenzo (P. Tsaytler, H.P. Harding, D. Ron e A. Bertolotti, Science, 332, 01 de abril de 2011, 91-94). Estas observações demonstram que o guanabenzo resgata as células da tensão letal de ER através de um mecanismo independente do receptor a2-adrenérgico. O guanabenzo protege as células da acumulação de outra maneira letal de proteínas dobradas erradas através da ligação a uma subunidade reguladora da proteína fosfatase 1, PPP1R15A (GADD34), seletivamente interrompendo a desfosforilação induzida pela tensão da subunidade α do fator 2 de iniciação da tradução (eIF2α). O guanabenzo fixa as taxas de conversão nas células tensionadas a um nível administrável por chaperonas disponíveis, por conseguinte, restaurando a homeostase da proteína. Foi relatado que o guanabenzo não se liga à PPP1R15B constitutiva (CReP) e, por conseguinte, não inibe a tradução nas células não tensionadas. (P. Tsaytler, H.P. Harding, D. Ron e A. Bertolotti, Science, 332, 01 de abril de 2011, 91-94).
[006]A falha em manter a proteostase na ER através da montagem de uma resposta adequada da proteína não dobrada (UPR) é reconhecida como um fator que contribui para muitas condições patológicas. Por conseguinte, as moléculas descritas no presente, que inibem a fosfatase de eIF2α para a síntese da proteína ajustada, podem ser de benefício terapêutico a um grande número de doenças provocadas pela tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas.
[007]A presente invenção procura fornecer os compostos alternativos com base em uma estrutura do núcleo de guanabenzo que apresentam as aplicações potenciais terapêuticas no tratamento dos distúrbios associados com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas.
[008] Um primeiro aspecto da presente invenção se refere a um composto de Fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que: - R1 é alquila, Cl, F ou Br; - R2 é H ou F; - R3 é selecionado a partir de H e alquila; - R4 é selecionado a partir de H e C(O)R6; - R5 é H; - ou R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10; - R6 é selecionado a partir de R7, OR7 e NR8R9; - R7, R8 e R9 são cada um independentemente selecionado a partir de alquila, cicloalquila, aralquila, cicloalquenila, heterociclila e arila, cada uma opcionalmente é substituída com um ou mais grupos R10; - cada R10 é independentemente selecionado a partir de halogênio, OH, CN, COO-alquila, aralquila, SO2-alquila, SO2-arila, COOH, CO- alquila, CO-arila, NH2, NH-alquila, N(alquil)2, CF3, alquila e alcóxi; - X e Z são cada um, independentemente, CR11, e Y é selecionado a partir de CR11 e N; - R11 é H ou F; - para a utilização no tratamento de um distúrbio associado com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas.
[009]Estudos anteriores indicaram que o grupo arila deve ser, pelo menos, dissubstituído para que os compostos apresentem a atividade farmacológica útil (vide, por exemplo, D. Tribouillard-Tanvier et al., PLoS One 3, e1981 (2008) e patente EP 1.908.464A, CNRS). No entanto, contrariamente aos resultados de estudos anteriores, o presente Depositante surpreendentemente descobriu que os derivados de arila mono-substituídos também são ativos.
[010]Além disso, os compostos de Fórmula (I), conforme definido acima, de maneira vantajosa, não exibem nenhuma atividade em relação ao receptor a2-adrenérgico em relação aos compostos da técnica anterior tal como o guanabenzo (Figura 4). Esta perda de atividade de alfa-2 adrenérgico torna os compostos terapeuticamente úteis no tratamento dos distúrbios associados com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas, tais como o Charcot-Marie- Tooth (CMT), doenças da retina, de preferência, a Retinite Pigmentosa (RP), doença de Alzheimer, doença de Parkinson (PD), Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), doença de Huntington, tauopatias, doenças de príon, diabetes, de preferência, diabetes tipo 2 e câncer. A falta da atividade de alfa-2 adrenérgico significa que os compostos de Fórmula (I) podem ser administrados a uma dosagem adequada para o tratamento das doenças mencionadas acima, sem qualquer efeito significativo sobre a pressão sanguínea.
[011] Um segundo aspecto da presente invenção se refere a um composto de Fórmula (II), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que: - R1 é alquila, Cl, F ou Br; - R2 é H ou F; - R3 é selecionado a partir de H e alquila; - R4 é selecionado a partir de H e C(O)R6; - R5 é H; - ou R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10; - R6 é selecionado a partir de R7, OR7 e NR8R9; - R7, R8 e R9 são cada um independentemente selecionado a partir de alquila, cicloalquila, aralquila, cicloalquenila, heterocíclico, arila e heteroarila, cada uma opcionalmente é substituída com um ou mais grupos R10; - cada R10 é independentemente selecionado a partir de halogênio, OH, CN, COO-alquila, aralquila, SO2-alquila, SO2-arila, COOH, CO- alquila, CO-arila, NH2, NH-alquila, N(alquil)2, CF3, alquila e alcóxi; - X e Z são cada um, independentemente, CR11, e Y é N; - R11 é H ou F.
[012] Um terceiro aspecto da presente invenção se refere a um composto de Fórmula (III), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que: - R1 é alquila, Cl, F ou Br; - R2 é H ou F; - R3 é selecionado a partir de H e alquila; - R4 é C(O)R6; - R5 é H; - ou R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10; - R6 é selecionado a partir de R7, OR7 e NR8R9; - R7, R8 e R9 são cada um independentemente selecionado a partir de alquila, cicloalquila, aralquila, cicloalquenila, heterocíclico, arila e heteroarila, cada uma opcionalmente é substituída com um ou mais grupos R10; - cada R10 é independentemente selecionado a partir de halogênio, OH, CN, COO-alquila, aralquila, SO2-alquila, SO2-arila, COOH, CO- alquila, CO-arila, NH2, NH-alquila, N(alquil)2, CF3, alquila e alcóxi; - X e Z são cada um, independentemente, CR11, e Y é selecionado a partir de CR11 e N; e - R11 é H ou F;
[013] Um quarto aspecto da presente invenção se refere a um composto de Fórmula (IV), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que: - R1 é alquila, ou Br; - R2 é H; - R3 é selecionado a partir de H e alquila; - R4 é selecionado a partir de H e C(O)R6; - R5 é H; - ou R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10; - R6 é selecionado a partir de R7, OR7 e NR8R9; - R7, R8 e R9 são cada um independentemente selecionado a partir de alquila, cicloalquila, aralquila, cicloalquenila, heterociclila e arila, cada uma opcionalmente é substituída com um ou mais grupos R10; - cada R10 é independentemente selecionado a partir de halogênio, OH, CN, COO-alquila, aralquila, SO2-alquila, SO2-arila, COOH, CO- alquila, CO-arila, NH2, NH-alquila, N(alquil)2, CF3, alquila e alcóxi; - X e Z são cada CH, e Y é CR11; - R11 é H ou F.
[014] Um outro aspecto da presente invenção se refere às composições farmacêuticas que compreendem um composto de Fórmulas (II), (III) ou (IV) conforme descrito acima, misturado com um diluente, excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável adequado.
[015] Conforme utilizado no presente, o termo “alquila” inclui os grupos saturados alquila de cadeia linear e ramificada que podem ser substituídos (mono- ou poli-) ou não substituídos. De preferência, o grupo alquila é um grupo alquila C1-C20, de maior preferência, um grupo alquila C1-C15, de maior preferência ainda, um grupo alquila C1-C12, de maior preferência ainda, um grupo alquila C1-C6, ainda de maior preferência, um grupo alquila C1C3. Especialmente, os grupos alquila preferidos, por exemplo, incluem a metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, terc-butila, pentila e hexila. Os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10. De preferência, o grupo alquila é não substituído.
[016] Conforme utilizado no presente, o termo “cicloalquila” se refere a um grupo alquila cíclico que pode ser substituído (mono- ou poli-) ou não substituído. De preferência, o grupo cicloalquila é um grupo cicloalquila C3-C12. Os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10.
[017] Conforme utilizado no presente, o termo “alquenila” se refere a um grupo que contém uma ou mais ligações duplas carbono-carbono, que pode ser ramificado ou não ramificado, substituído (mono- ou poli-) ou não substituído. De preferência, o grupo alquenila é um grupo alquenila C2C20, de maior preferência, um grupo alquenila C2-C15, de maior preferência ainda, um grupo alquenila C2-C12 ou, ainda de maior preferência, um grupo alquenila C2-C6, ainda de maior preferência, um grupo alquenila C2-C3. Os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10 conforme definido acima. O termo “alquenila cíclica” deve ser interpretado de acordo.
[018] Conforme utilizado no presente, o termo “arila” se refere a um grupo C6-C12 aromático que pode ser substituído (mono- ou poli-) ou não substituído. Os exemplos típicos incluem a fenila e naftila, e similares. Os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10.
[019] Conforme utilizado no presente, o termo “heterociclo” (também referido no presente como “heterociclila” e “heterocíclico”) se refere a um grupo cíclico (mono- ou poli-) substituído ou não substituído, saturado, insaturado ou parcialmente insaturado que contém um ou mais heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, e que opcionalmente ainda contém um ou mais grupos CO. Os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10. O termo “heterociclo” engloba os grupos heteroarila e grupos heterocicloalquila, conforme definido abaixo.
[020] Conforme utilizado no presente, o termo “heteroarila” se refere a um grupo C2-C12 aromático, substituído (mono- ou poli-) ou não substituído, que compreende um ou mais heteroátomos. De preferência, o grupo heteroarila é um grupo aromático C4-C12 que compreende um ou mais heteroátomos selecionados a partir de N, O e S. Os grupos heteroarila adequados incluem o pirrol, pirazol, pirimidina, pirazina, piridina, quinolina, tiofeno, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, tiazol, oxazol, iso-tiazol, iso-oxazol, imidazol, furano e similares. Novamente, os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10.
[021] Conforme utilizado no presente, o termo “heterocicloalquila” se refere a um grupo alifático cíclico (mono- ou poli-) substituído ou não substituído que contém um ou mais heteroátomos. Os grupos heterocicloalquila preferidos incluem o piperidinil, pirrolidinil, piperazinil, morfolinil e tiomorfolinil. De maior preferência, o grupo heterocicloalquila é selecionado a partir de N- piperidinil, N-pirrolidinil, N-piperazinil, N-tiomorfolinil e N-morfolinil. Novamente, os substituintes adequados, por exemplo, incluem um ou mais grupos R10.
[022] Conforme utilizado no presente, o termo “aralquila” inclui, mas não está limitado a um grupo que possui as funcionalidades arila e alquila. A título de exemplo, o termo inclui os grupos em que um dos átomos de hidrogênio do grupo alquila é substituído por um grupo arila, por exemplo, um grupo fenila que opcionalmente possui um ou mais substituintes tais como o halo, alquila, alcóxi, hidróxi, e similares. Os grupos aralquila típicos incluem a benzila, fenetila e similares.
[023] Em uma realização preferida, R1 é Cl, Br, Me ou F, de maior preferência, Cl. Em uma realização preferida, R2 é H. Em uma realização preferida, Y é CR11. Em uma outra realização preferida, Y é N. Em uma realização preferida, R3 e R4 são ambos H. Em uma realização preferida, R3 é H e R4 é C(O)R6. Em uma realização preferida, R6 é alquila ou alcóxi, de maior preferência, Me ou OMe.
[024] Em uma realização preferida, R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10.
[025] Em uma realização preferida, dito composto é de Fórmula (Ia), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que R1, R2, R3 e R10 são conforme definidos acima.
[026] Em uma realização especialmente preferida, o composto de Fórmula (I) é selecionado a partir do seguinte:
- e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
[027] Em uma realização extremamente preferida, o composto de Fórmula (I) é selecionado a partir dos Exemplos 1, 3, 6 e 15, conforme estabelecido acima.
[028]Ainda de maior preferência, o composto de Fórmula (I) é selecionado a partir do Exemplo 1 e Exemplo 15, de maior preferência, do Exemplo 1, isto é, o composto 1-[(E)-[(2-clorofenil)metilideno]amino]-guanidina.
[029] Um aspecto da presente invenção se refere aos compostos de Fórmulas (II), (III) ou (IV), ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, conforme definido acima. Os aspectos preferidos da presente invenção se aplicam mutatis mutandis. Os compostos especialmente preferidos para este aspecto da presente invenção incluem os Exemplos 7, 8, 9, 13 e 16, conforme descrito no presente.
[030] O Depositante demonstrou que os compostos de Fórmula (I) apresentam aplicações potenciais terapêuticas no tratamento de distúrbios associados com o acúmulo de proteínas dobradas erradas. Em especial, os compostos de Fórmula (I) mostram possuir um efeito de proteção contra a tensão citotóxica endoplasmática do retículo (ER) e distúrbios relacionados com a idade.
[031] Outro aspecto da presente invenção se refere à utilização de um composto de Fórmula (I), conforme definido acima, na preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas.
[032] Conforme utilizada no presente, a frase “preparação de um medicamento” inclui a utilização de um ou mais dos compostos descritos acima diretamente como o medicamento além da sua utilização em um programa de varredura para agentes ativos adicionais ou em qualquer estágio de fabricação de tal medicamento.
[033]Ainda um outro aspecto da presente invenção se refere a um método de tratamento de um distúrbio associado com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas em um indivíduo com necessidade do mesmo, dito método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Fórmula (I), conforme definido acima, para dito indivíduo.
[034] O termo “método” se refere às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para a realização de uma determinada tarefa, incluindo, mas não limitado àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos, conhecidos ou facilmente desenvolvidos a partir das maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por técnicos do assunto químicos, farmacológicos, biológicos, bioquímicos e médicos.
[035] No presente, o termo “tratamento” inclui anular, substancialmente inibir, retardar ou reverter à progressão de uma doença ou distúrbio, substancialmente melhorar os sintomas clínicos de uma doença ou distúrbio ou substancialmente impedir o aparecimento dos sintomas clínicos da doença ou distúrbio.
[036] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere à quantidade do composto a ser administrado que vai aliviar em certa medida um ou mais dos sintomas da doença ou distúrbio a ser tratado.
[037]A resposta da proteína não dobrada (UPR) é um componente do sistema de defesa celular contra proteínas dobradas erradas que se adaptam dobrando no retículo endoplasmático (ER) para as novas condições. A UPR é ativada em resposta a um acúmulo de proteínas não dobradas ou dobradas erradas no lúmen do retículo endoplasmático. Neste cenário, a UPR possui dois objetos principais: (i) restaurar a função normal da célula travando a tradução da proteína, e (ii) ativar as vias de sinalização que conduzem ao aumento da produção de chaperonas moleculares envolvidas no dobramento de proteínas. Se esses objetos não forem alcançados dentro de um determinado período de tempo, ou o rompimento for prolongado, a UPR aponta para o apoptose.
[038] Os componentes a montante da UPR são as proteínas de ER de transmembranas residentes IRE1, ATF6, e PERK, que detectam os defeitos do dobramento para reprogramar a transcrição e tradução de maneira concertada e restaurar a proteostase. A IRE1 e ATF6 ativadas aumentam a transcrição de genes envolvidos na dobragem de ER, tais como aqueles que codificam as chaperonas BiP e GRP94. A PERK ativada atenua a síntese global de proteínas através da fosforilação da subunidade do fator de iniciação da tradução 2 (eIF2α) em Ser51 ao promover a tradução do fator da transcrição ATF4. A última controla a expressão de CHOP, outro fator de transcrição, que por sua vez promove a expressão de PPP1R15A / GADD34. A PPP1R15A, um efetor de um ciclo de comentário negativo que termina a sinalização de UPR, recruta uma subunidade catalítica da proteína fosfatase 1 (PP1c) para desfosforilar a eIF2α, permitindo que síntese de proteínas se recupere. A falha de UPR contribui para muitas condições patológicas que podem ser corrigidas pelo impulso adequado dessa resposta adaptativa. Os inibidores seletivos da fosfatase de eIF2α de PPP1R15A-PP1 induzida por tensão atrasam a desfosforilação de eIF2α e, consequentemente, a síntese da proteína seletivamente nas células tensionadas, sem afetar a síntese de proteínas nas células não tensionadas. Isso prolonga os efeitos benéficos da UPR. Uma redução transitória da síntese de proteínas é benéfica para as células tensionadas uma vez que reduzindo o fluxo de proteínas sintetizadas aumenta a disponibilidade de chaperonas e, por conseguinte, protege contra a tensão do dobramento incorreto (P. Tsaytler, H.P. Harding, D. A. e Ron Bertolotti, Science, 332, 01 de abril de 2011, 91-94). Os inibidores não seletivos da fosfatases 2 eIF2α podem apresentar efeitos indesejáveis, uma vez que a inibição persistente de tradução é prejudicial. Na verdade, a ablação genética de PPP1R15A e PPP1R15B resulta em letalidade embrionária precoce nos camundongos, indicando que a inibição de eIF2α fosfatases de PPP1R15A- PP1 e PPP1R15B-PP1 é prejudicial no contexto do organismo. Em contraste, a ablação genética de PPP1R15A não apresenta nenhuma consequência prejudicial nos camundongos (Harding et al., 2009, Proc Natl Acad Sci EUA, 106, 1.832-1.837). Além disso, os inibidores específicos de PPP1R15A são previstos para serem inertes nas células não tensionadas, á medida que a PPP1R15A não é expressa na ausência de tensão. Por conseguinte, os inibidores seletivos de PPP1R15A são previstos para serem seguros. Os inibidores não seletivos da fosfatases eIF2α também podem ser úteis no tratamento das doenças do dobramento incorreto das proteínas, quando utilizados em doses que resultam em apenas uma inibição parcial das fosfatases.
[039]A citoproteção contra a tensão de ER pode ser medida através de uma análise adequada. Por exemplo, a citoproteção pode ser medida nas células HeLa em que a tensão de ER é induzida pela adição do meio que contém a tunicamicina, uma mistura de antibióticos nucleosídeos homólogos que inibe a UDP-HexNAc: família poliprenol-P HexNAc-1-P das enzimas e é utilizada para induzir a resposta da proteína não dobrada. A viabilidade celular pode ser detectada na presença e ausência dos compostos inibidores após um determinado período de tempo, através da medição da redução de WST-8 em formazano utilizando um conjunto padrão de viabilidade celular (tal como a Contagem da Viabilidade Celular do Conjunto-8 de Dojindo). A citoproteção da tensão de ER é medida em termos de porcentagem de aumento das células viáveis (em relação ao controle) após da tensão de ER. Mais detalhes de uma análise adequada estão apresentados na seção de Exemplos que acompanham.
[040] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) é capaz de prolongar o efeito de proteção da UPR relativa para o controle (isto é, na ausência de composto inibidor) em, pelo menos, 20%, de maior preferência, pelo menos, 30%, de maior preferência ainda, pelo menos, 40%, pelo menos, 50%, pelo menos, 60%, pelo menos, 70%, pelo menos, 80%, ainda de maior preferência, pelo menos, 90%.
[041] O Depositante demonstrou que os compostos de Fórmula (I) são inibidores da interação de PPP1R15A-PP1, que induzem um efeito de proteção. De preferência, o composto exibe um efeito de proteção com EC50 inferior a cerca de 5 μM, de maior preferência, inferior a cerca de 2 μm, de maior preferência ainda, inferior a cerca de 1 μM. O composto, de preferência, deve ser livre da atividade de alfa2-adrenérgico. Por conseguinte, em uma realização preferida, o composto não exibe nenhuma atividade em uma análise de alfa-2-adrenérgico funcional.
[042] O Depositante ainda demonstrou que determinados compostos de Fórmula (I) seletivamente inibem a PPP1R15A-PP1 e, por conseguinte, prolongam o efeito de proteção da UPR, por conseguinte, salvando as células da tensão do dobramento incorreto da proteína. Os inibidores de PPP1R15A-PP1, por conseguinte, apresentam as aplicações terapêuticas no tratamento de uma variedade de doenças associadas com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em particular, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas.
[043] Em uma realização, o composto de Fórmula (I) é capaz de inibir a PPP1R15A e PPP1R15B.
[044] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) é capaz de seletivamente inibir a PPP1R15A em relação à PPP1R15B.
[045] Em uma realização preferida da presente invenção, o composto de Fórmula (I) é para a utilização no tratamento de doenças neurodegenerativas, e mais especificamente, em que o acúmulo de proteínas dobradas erradas está envolvido no modo de ação (Brown et al., 2012, Frontiers in Physiology, 3, artigo 263).
[046] Em uma realização especialmente preferida, o composto de Fórmula (I) deve ser utilizado no tratamento de um distúrbio selecionado a partir de Charcot-Marie-Tooth, síndrome grave de Dejerine-Sottas (Voermans et al., 2012, J peripher New Syst, 17 (2), 223 -5), uma doença da retina (tal como, mas não restrito à retinite pigmentosa, ciliopatias da retina, degeneração macular, retinopatia diabética), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), doença de Huntington, tauopatias, doenças de príon, diabetes tipo 2 e/ou diabetes tipo 1 e câncer, tal como, mas não limitado ao mieloma múltiplo.
[047] Em uma realização, a presente invenção se refere a um composto de Fórmula (I), conforme definido acima, para a utilização no tratamento de um distúrbio associado com a via de fosforilação de eIF2α, em que o acúmulo de proteínas dobradas erradas está envolvido no modo de ação. De preferência, o distúrbio é uma doença ou distúrbio relacionado com a PPP1R15A. Os exemplos de tais distúrbios incluem as doenças do dobramento incorreto da proteína, tais como, mas não limitados à Charcot-Marie-Tooth, síndrome grave de Dejerine-Sottas e retinite pigmentosa.
[048] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um composto de Fórmula (I), conforme definido acima, para a utilização no tratamento de um distúrbio ocasionado por, associado com, ou acompanhado pela fosforilação de eIF2α e/ou atividade de PPP1R15A, em que o acúmulo de proteínas dobradas erradas está envolvido no modo de ação.
[049] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um composto de Fórmula (I), conforme definido acima, para a utilização no tratamento do distúrbio de UPR, tal como, mas não se limitando ao envelhecimento (Naidoo et al., 2008, J. Neurosci, 28, 6.539-48).
[050] Conforme utilizado no presente, “doença ou distúrbio relacionado com a PPP1R15A” se refere a uma doença ou distúrbio caracterizado por uma atividade anormal de PPP1R15A, em que o acúmulo de proteínas dobradas erradas está envolvido no modo de ação. A atividade anormal se refere a: (i) expressão de PPP1R15A nas células que normalmente não expressam a PPP1R15A; (ii) aumento da expressão de PPP1R15A; ou (iii) aumento da atividade de PPP1R15A.
[051] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método de tratamento de um mamífero que apresenta um estado de doença aliviado pela inibição de PP1R15A, em que o acúmulo de proteínas dobradas erradas está envolvido no modo de ação, em que o método compreende a administração a um mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de Fórmula (I), conforme definido acima.
[052] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um inibidor de PPP1R15A de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a utilização no tratamento dos distúrbios associados com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em especial, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas e/ou distúrbios de UPR, em que dito composto não apresenta nenhuma atividade ou atividade agonista potente 2 alfa-adrenérgico reduzida em comparação com o guanabenzo.
[053] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um inibidor de PPP1R15A de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a utilização no tratamento das doenças associadas com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em especial, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas e/ou distúrbios de UPR, em que dito composto não inibe a tradução de proteína nas células não tensionadas que expressam a PPP1R15B.
[054] Em uma outra realização, a presente invenção se refere a um método de tratamento de uma doença caracterizada pela atividade da resposta à tensão de ER, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas, o método compreende a administração a um paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de, pelo menos, um composto de Fórmula (I) em que dito composto modula a resposta da tensão de ER.
[055] Em uma outra realização, a presente invenção se refere ao inibidor de PPP1R15A de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a utilização no tratamento dos distúrbios associados com a tensão do dobramento incorreto e, em especial com um acúmulo de proteínas dobradas erradas e/ou distúrbios de UPR, em que dito composto possui uma seletividade em relação à PPP1R15A-PP1 holofosfatase mas não possui nenhuma atividade ou atividade reduzida em relação à PPP1R15B-PP1 holofosfatase, e em que a proporção (atividade em relação à PPP1R15A-PP1 holofosfatase / atividade em relação à PPP1R15B-PP1) para dito composto é, pelo menos, igual ou superior à proporção (atividade em relação à PPP1R15A- PP1 holofosfatase / atividade em relação à PPP1R15B-PP1) para o guanabenzo.
[056] Em uma outra realização, a presente invenção se refere ao inibidor de PPP1R15A de Fórmula (I) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para a utilização no tratamento dos distúrbios associados com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em especial, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas e/ou distúrbios de UPR, em que: - dito composto possui uma atividade em relação à PPP1R15A- PP1 holofosfatase, mas nenhuma atividade ou atividade reduzida em relação à PPP1R15B-PP1 holofosfatase, e; - em que a proporção (atividade em relação à PPP1R15A-PP1 holofosfatase / atividade em relação à PPP1R15B-PP1) para dito composto é, pelo menos, igual ou superior à proporção (atividade em relação à PPP1R15A- PP1 holofosfatase / atividade em relação à PPP1R15B-PP1) para o guanabenzo; e - em que dito composto não possui nenhuma atividade ou atividade agonista de 2 alfa-adrenérgico potente reduzida em contraste com o guanabenzo.
[057] Conforme utilizado no presente, a doença ou distúrbio caracterizado pela atividade da resposta à tensão de ER, e/ou a doença ou distúrbio associado com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em especial, com um acúmulo de proteínas dobradas erradas e/ou distúrbios de UPR, é selecionado a partir de Charcot-Marie-Tooth, síndrome grave de Dejerine-Sottas (Voermans et al., 2012, J peripher New Syst, 17 (2), 223-5), uma doença da retina (tal como, mas não restrita à retinite pigmentosa, ciliopatias da retina, degeneração macular, retinopatia diabética), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), doença de Huntington, diabetes tal como, mas não limitada à diabetes tipo 2 e/ou e câncer, tal como, mas não limitado ao mieloma múltiplo.
[058] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) é para a utilização no tratamento de Charcot-Marie-Tooth.
[059] Mais de 100 mutações no gene que codifica a proteína de mielina zero (P0), uma proteína transmembranar de passagem única, que é a principal proteína produzida por células mielinizantes de Schwann que provoca a neuropatia de Charcot-Marie-Tooth (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3.241-9). As mutações são predominantemente herdadas e ocasionam a doença através de um ganho de função tóxica (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241-9). A supressão de serina 63 a partir de P0 (P0S63del) ocasiona a neuropatia 1B de Charcot-Marie-Tooth nos seres humanos e uma neuropatia desmielinizante similar nos camundongos transgênicos. A proteína mutante é retida na ER, e induz a UPR (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3.241-9). A ablação genética de CHOP, um gene pró-apoptótico na UPR, restaura a função motora em camundongos de Charcot-Marie-Tooth (Pennuto et al., 2008, Neuron, 57, 393-405). A descoberta de que a inibição PPP1R15A nas células quase abole a expressão CHOP nas células tensionadas por ER indica que a inibição farmacológica ou genética da PPP1R15A deve reduzir a disfunção motora nos camundongos de Charcot-Marie-Tooth. Recentemente, D'Antonio et al. (2013, J. Exp. Med, Volume, páginas 1-18) demonstrou que os camundongos P0S63del tratados com o salubrinal, uma pequena molécula que aumenta a desfosforilação de eIF2alfa (Boyce et al., 2005 Science Vol. 307 páginas 935-939) quase recuperou a capacidade motora normal na análise da haste rotativa (rotarod) e foi acompanhada por um resgate de anormalidades morfológicas e eletrofisiológicas. A acumulação dos mutantes relacionados com o CMT das proteínas ER não é exclusiva para a P0S63del; pelo menos, cinco outros mutantes P0 foram identificados que são retidos na ER e induzem uma UPR (Pennuto et al., 2008 Neuron volume 57, páginas 393-405; Saporta et al., 2012 Brain, volume135, páginas 2.032-2.047). Além disso, o dobramento incorreto da proteína e o acúmulo de proteínas dobradas erradas em ER estão implicados na patogênese de outras neuropatias CMT como resultado das mutações em PMP22 e Cx32 (Colby et al., 2000 Neurobiol. Disease, volume 7, páginas 561-573; Kleopa et al., 2002. J. Neurosci Res volume 68, páginas 522-534;. Yum et al., Neurobiol Dis 2002, volume 11, páginas 43-52). No entanto, o salubrinal é tóxico e não pode ser utilizado para o tratamento em pacientes humanos, D’Antonio et al., (2013, J. Exp. Med, volume, páginas 1-18). Em contraste, os inibidores de PPP1R15A de Fórmula (I) estão previstos para serem seguros e poderiam ser utilizados para o tratamento de CMT-1A e 1B.
[060]A literatura publicada recentemente forneceu as evidências que a UPR está envolvida no desenvolvimento da degeneração da retina: degeneração da retina herdada, tais como as ciliopatias da retina e retinite pigmentosa, degeneração macular, retinopatia da prematuridade, degeneração da retina induzida pela luz, descolamento de retina, retinopatia diabética e glaucoma (para revisão Gorbatyuk et Gorbatyuk de 2013 - Retinal degeneration: Focus on the unfolded protein response, Molecular Vision, volume 19, páginas 1.985-1.998).
[061] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) é para a utilização no tratamento das doenças da retina, de maior preferência, a degeneração da retina herdada, tais como as ciliopatias da retina e a retinite pigmentosa, degeneração macular, retinopatia de prematuridade, degeneração retinal induzida pela luz, descolamento da retina, retinopatia diabética e glaucoma.
[062]As ciliopatias da retina são um grupo de distúrbios genéticos raros originários de um defeito no cílio primário, por conseguinte, induzindo a retinite pigmentosa. Foi relatado que este defeito induz uma tensão de ER devido à acumulação da proteína na parte interna do segmento do fotorreceptor que por sua vez induz a UPR (WO 2013/124484). A degeneração da retina é uma característica muito comum nas ciliopatias que pode ser observada na retinite pigmentosa isolada, tal como a amaurose de Leber congênita ou retinite pigmentosa ligada ao X, ou também em condições sindrômicas, tal como a Síndrome de Bardet-Biedl (BBS) ou a síndrome de Alstrom (ALMS). A ciliopatia da retina é selecionada a partir do grupo que consiste em síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Senior-Loken, síndrome de Joubert, síndrome de Salidono-Mainzer, síndrome de Sensenbrenner, síndrome de Jeune, síndrome de Meckel-Gruder, síndrome de Alstrom, síndrome de MORM, amaurose congênita de Leber ocasionada pela mutação em um gene ciliar e retinite pigmentosa ligada ao X ocasionada pela mutação no gene RPGR.
[063]A retinite pigmentosa é uma doença herdada degenerativa do olho que provoca a deficiência visual grave e muitas vezes a cegueira. É a causa mais comum de cegueira geneticamente determinada. O paciente irá enfrentar um ou mais dos seguintes sintomas: cegueira noturna; visão de túnel (sem visão periférica); visão periférica (sem visão central); visão treliça; aversão ao brilho; ajuste lento do escuro para ambientes de luz e vice-versa; embaçamento da visão; separação fraca de cores; e cansaço extremo.
[064]A evidência emergente suporta um papel da tensão de ER no apoptose da retina e morte celular (Jing et al., 2012, Exp Diabetes Res, 2012, 589-589). A retinite pigmentosa (RP) é a forma mais comum de degeneração retinal hereditária ocasionada por mais de 100 mutações no gene rodopsina (Dryja et al., 1991, Proc Natl Acad Sci EUA, 88, 9.370-4). A rodopsina é um receptor acoplado à proteína G que transduz a luz nos receptores de hastes e consiste em um complexo covalente entre a opsina transmembranar da proteína de 348 aminoácidos, por ligação covalente ao 11- cis-retinal (Palczewski, 2006, Annu Rev Biochem, 75, 743 -67). As mutações da rodopsina ocasionadas por RP principalmente são mutações missenses distribuídas ao longo da proteína (Dryja et al., 1991, Proc Natl Acad Sci EUA, 88, 9.370-4), similar às mutações de SOD1 ocasionadas por ALS (Valentine et al., 2005, Annu Rev Biochem, 74, 563-93). Os mutantes de rodopsina ocasionados por RP foram estudados em diversos sistemas e os resultados da expressão heteróloga de proteínas nas células dos mamíferos, nos camundongos transgênicos e drosofila são consistentes (Griciuc et al., 2011, Trends Mol Med, 17, 442-51). Os mutantes de rodopsina mais predominantes ocasionados por RP são dobrados errados, não se ligam ao 11-cis-retinal, não atingem a superfície da célula, mas são retidos na ER (Griciuc et al., 2011, Trends Mol Med, 17, 442-51). O dobramento incorreto dos mutantes de rodopsina ocasiona a tensão de ER e morte celular da haste (Griciuc et al., 2011, Trends Mol Med, 17, 442-51). Isto fortemente sugere que os inibidores de PPP1R15A, descritos na presente invenção, serão úteis para o tratamento de RP.
[065]A degeneração macular relacionada à idade (AMD) é a principal causa de cegueira legal entre aqueles com mais de 65 anos de idade nos Estados Unidos. Foi relatado que a AMD explica 54% de todos os casos atuais de cegueira entre a população caucasiana nos Estados Unidos. O estudo previu que como resultado da crescente prevalência da AMD, o número de pessoas cegas nos EUA poderia aumentar em até 70% até 2020.
[066]Shen et al., (2011, Effect of Guanabenz on Rat AMD Models and Rabbit Choroidal Blood - volume 5, páginas 27-31) demonstraram que o guanabenzo significativamente protegeu o epitélio pigmentado da retina (RPE) da degeneração induzida por NaIO3, inibiu o desenvolvimento da neovascularização coroidal (CNV) no exemplar AMD de rato induzido por laser e acentuadamente aumentou o fluxo sanguíneo coroidal in vivo.
[067] No entanto, o guanabenzo é um receptor alfa2a adrenérgico devido à sua atividade hipotensiva, não pode ser utilizado para o tratamento da retina e degeneração macular.
[068] Os compostos da presente invenção que são inibidores de PPP1R15A, tal como o guanabenzo mas, que de maneira vantajosa não exibem nenhuma atividade em relação ao receptor alfa2a adrenérgico irão melhorar a retina ou macular.
[069] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) deve ser utilizado no tratamento de uma doença selecionada a partir da doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ALS, doença de Huntington, teopatias e doenças de prion.
[070] Devido ao acúmulo de proteínas dobradas erradas ser uma indicação de diversas doenças e terem mostrado que o composto de Fórmula (I) reduz a acumulação de 4 proteínas que ocasionam as doenças e dobramento incorreto não relacionados (Figuras de 4 a 6), o composto de Fórmula (I) também será útil para o tratamento de outras doenças neurodegenerativas ocasionadas pelo acúmulo de proteínas dobradas erradas. Além disso, uma vez que a UPR é uma indicação destas doenças ocasionadas pelo acúmulo de proteínas dobradas erradas, o composto de Fórmula (I) será útil para o tratamento destas doenças (Scheper e Hoozemans, 2009; Kim et al,. 2008).
[071] O guanabenzo reduz os sintomas de príon nos camundongos infectados (D. Tribouuillard-Tanvier et al,. 2008 PLoS One 3, e1981). No entanto, o guanabenzo não é útil para as doenças do dobramento incorreto das proteínas humanas devido à sua atividade hipotensiva. Em contraste, sem a atividade de alfa2a adrenérgico, e descrito na presente invenção poderia ser útil no tratamento das doenças de príon.
[072] O salubrinal inibe a desfosforilação mediada por PPP1R15A de eIF2 alfa (Boyce et al., 2005 Science, volume 307, páginas 935-939). Recentemente, Colla et al., (J. of Neuroscience 2012 Vol. 32, número 10, páginas 3.306-3.320) demonstraram que o Salubrinal significativamente atenua as manifestações da doença em dois exemplares animais de alfa- sinucleinopatia.
[073]Sem estar vinculado por uma teoria, espera-se que os compostos da presente invenção que são inibidores de PPP1R15A irão melhorar as manifestações da doença de alfa-sincleinopatias tal como a doença de Parkinson.
[074]Saxena et al., (Nature Neuroscience 2009, volume 12, páginas 627-636) demonstraram que o Salubrinal estende a vida útil do exemplar de rato transgênico G93A-SOD1 da doença do neurônio motor. Sem estar vinculado por uma teoria, espera-se que os compostos da presente invenção que são inibidores de PPP1R15A irão melhorar as manifestações da doença de ALS com a mutação G93A-SOD1. Uma quantidade superior a 140, na maioria missense, mutações Mais de 140, a maioria missense, mutações do gene SOD1 ocasiona a agregação da proteína afetada em formas familiares da esclerose lateral amiotrófica (ASL). Uma vez que diversos mutantes SOD1 compartilham defeitos comuns (Munch et al. 2010), aceita-se que diversos mutantes SOD1 ocasionam a ALS através de um mecanismo comum. Além disso, as manifestações clínicas são compartilhadas entre as formas esporádicas e familiares de doenças, e que, no momento é bem reconhecido que o dobramento incorreto de proteínas desempenha um papel central na ALS esporádica e familiar. Por conseguinte, os compostos de Fórmula (I) podem ser utilizados para o tratamento das formas familiares e esporádicas de ALS.
[075] O Depositante descobriu que a atividade citoprotetora de guanabenzo na tensão do dobramento incorreto da proteína é surpreendentemente ampla, uma vez que o guanabenzo também reduz o acúmulo de Huntington mutante nas células (WO 2008/041133). Esta descoberta é inesperada uma vez que o Huntington mutante é citosólico ou nuclear. No entanto, existem evidências que o metabolismo de Huntington mutante tenha sido previamente ligado à resposta da tensão de ER (Nishitoh et al., 2002, Genes Dev, 16, 1.345-1.355; Rousseau et al., 2004, Proc Natl Acad Sci, EUA, 101, 9.648-53; Duennwald e Lindquist, 2008, Genes Dev, 22, 3.308-19). As conclusões do Depositante de que o guanabenzo protege as células da tensão citotóxica de ER e reduz o acúmulo de Huntington mutante apoia ainda mais a ideia de que podem existir aspectos da resposta da tensão de ER que o impacto sobre o acúmulo de Huntington mutante. Além disso, a disfunção da resposta da tensão de ER está envolvida em uma variedade de patologias, incluindo a diabetes tipo 2 e neurodegeneração (Scheper e Hoozemans, 2009, Curr Med Chem, 16, 615-26). Por conseguinte, sem pretender estar vinculado por uma teoria, acredita-se que o guanabenzo e os seus compostos relacionados, tais como os compostos da presente invenção apresentem um efeito de proteção contra os distúrbios de UPR secundários, isto é, os distúrbios devido a um acúmulo de uma proteína dobrada errada residente não ER, que induz a UPR.
[076] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) deve ser utilizado no tratamento de diabetes tipo 2.
[077] As células β secretoras de insulina no pâncreas possuem uma carga pesada biossintética e firmemente regulada que consiste na secreção de insulina. Por conseguinte, estas células possuem uma necessidade importante de manter a homeostase de ER (Back e Kaufman, 2012, Annu Rev Biochem, 81, 767-93). A diabetes tipo 2 se manifesta através de um aumento dos níveis de glicose no sangue devido à resistência à insulina no tecido adiposo, fígado e músculo e/ou a secreção deficiente de insulina a partir das células β pancreáticas. Em resposta, a massa das células β aumenta e a sua função é intensificada. Eventualmente, a carga nas células β é muito elevada conduzindo ao seu declínio progressivo e morte. As evidências crescentes descrevem que a morte das células β resulta da tensão de ER (Back e Kaufman, 2012, Annu Rev Biochem, 81, 767-93). De maneira importante, a eliminação de CHOP aprimora a função das células β em diversos exemplares de diabetes (Song et al., 2008, J Clin Invest, 118, 3.378-89). Sem se pretender estar vinculado por uma teoria, acredita-se que os inibidores de PPP1R15A-PP1 irão aprimorar a função das células β na diabetes tipo 2, uma vez a inibição da PPP1R15A-PP1 reduz os níveis da proteína CHOP pró-apoptótica durante a tensão de ER (Tsaytler et al., 2011, Science, 332, 91-4).
[078] Em uma realização preferida, o composto de Fórmula (I) deve ser utilizado no tratamento de câncer.
[079] As células cancerosas apresentam elevada exigência metabólica e a sua proliferação se baseia na síntese eficiente de proteínas. A iniciação de tradução desempenha um papel crucial no controle da homeostase, diferenciação, proliferação e transformação maligna da proteína. O aumento da iniciação da tradução contribui para a iniciação do câncer e, inversamente, reduzindo a iniciação da tradução pode reduzir o crescimento do tumor (Donze et al., 1995, EMBO J., 14, 3.828-34;. Pervin et al., 2008, Cancer Res, 68, 4.862-74; Chen et al., 2011, Nat Chem Biol, 7, 610-6). Sem se pretender estar vinculado por uma teoria, acredita-se que a inibição da PPP1R15A seletivamente pode reduzir a tradução nas células tumorais e, por conseguinte, reduzir o crescimento do tumor.
[080] O envelhecimento é conhecido por prejudicar as respostas de tensão e, em especial, a UPR é prejudicada com a idade (Naidoo et al., 2008, J. Neurosci, 28, 6.539-48). Por conseguinte, prolongar o efeito benéfico da UPR por inibição da fosfatase eIF2α poderia melhorar os distúrbios relacionadas com a idade.
[081] Para a utilização, de acordo com a presente invenção, os compostos ou sais fisiologicamente aceitáveis, ésteres ou outros derivados fisiologicamente funcionais, descritos no presente, podem ser apresentados como uma formulação farmacêutica, que compreende os compostos ou sal fisiologicamente aceitável, éster ou outro seu derivado fisiologicamente funcional, em conjunto com um ou mais de seus veículos farmaceuticamente aceitáveis e opcionalmente outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos. O(s) veículo(s) deve(m) ser aceitável(is) no sentido de ser(em) compatível(is) com os outros ingredientes da formulação e não prejudicial(is) para o seu beneficiário. As composições farmacêuticas podem ser para a utilização humana ou animal na medicina humana e veterinária.
[082] Os exemplos de tais excipientes adequados para as diversas formas diferentes das composições farmacêuticas descritas no presente podem ser encontrados no “Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2a edição, (1994), Editado por A Wade e PJ Weller.
[083] Os veículos ou diluentes aceitáveis para a utilização terapêutica são bem conhecidos no estado da técnica farmacêutica, e estão descritos, por exemplo, em Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, edição 1985).
[084] Os exemplos de veículos adequados incluem a lactose, amido, glicose, metilcelulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e similares. Os exemplos de diluentes adequados incluem o etanol, glicerol e água.
[085] A seleção do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada tendo em vista a via pretendida de administração e prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como, ou além, veículo, excipiente ou diluente qualquer aglutinante(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s), tampão(ões), agente(s) aromatizante(s), agente(s) tensoativo(s), agente(s) espessante(s), conservante(s) adequado(s) (incluindo os antioxidantes) e similares, e as substâncias incluídas com o propósito de tornar a formulação isotônica com o sangue do beneficiário pretendido.
[086] Os exemplos de aglutinantes adequados incluem o amido, gelatina, açúcares naturais tais como a glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como a acácia, tragacanto ou alginato de sódio, celulose de carboximetila e polietileno glicol.
[087] Os exemplos de lubrificantes adequados incluem o oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e similares.
[088] Os conservantes, estabilizantes, corantes e até mesmo os agentes aromatizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Os exemplos de conservantes incluem o benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico. Os antioxidantes e agentes de suspensão também podem ser utilizados.
[089] As formulações farmacêuticas incluem aquelas adequadas para a administração oral, tópica (incluindo a dérmica, bucal, ocular e sublingual), retal ou parentérica (incluindo a subcutânea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), nasal, intraocular e pulmonar, por exemplo, a administração através da inalação. A formulação, quando adequada, pode ser convenientemente apresentada em unidades de dosagem discretas e pode ser preparada através de qualquer um dos métodos bem conhecidos no estado da técnica de farmácia. Todos os métodos incluem a etapa de colocar em associação um composto ativo com os veículos líquidos ou os veículos sólidos finamente divididos ou os dois e, em seguida, caso necessário, moldando o produto na formulação desejada.
[090] As formulações farmacêuticas adequadas para a administração oral em que o veículo é um sólido, de maior preferência, são apresentadas como formulações de dose unitária tais como o bolo, cápsulas ou comprimidos, cada uma contém uma quantidade predeterminada do composto ativo. Um comprimido pode ser preparado através da compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos prensados podem ser preparados através da compressão em uma máquina adequada de um composto ativo em uma forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos opcionalmente misturado com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, agente lubrificante, agente tensoativo ou agente dispersante. Os comprimidos moldados podem ser preparados através da moldagem de um composto ativo com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem ser opcionalmente revestidos e, se não revestidos, opcionalmente, podem ser marcados. As cápsulas podem ser preparadas através do enchimento de um composto ativo, isoladamente ou em mistura com um ou mais ingredientes acessórios, nos invólucros das cápsulas e, em seguida, selando na maneira habitual. As hóstias são análogas às cápsulas em que um composto ativo em conjunto com qualquer ingrediente(s) acessório(s) é selado em um envelope de papel de arroz. Um composto ativo também pode ser formulado como grânulos dispersíveis que, por exemplo, podem ser suspensos em água antes da administração, ou polvilhados sobre a comida. Os grânulos podem ser embalados, por exemplo, em um sachê. As formulações adequadas para a administração oral, em que o veículo é um líquido, podem ser apresentadas como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida de óleo em água.
[091] As formulações para a administração oral incluem as formas de dosagem de liberação controlada, por exemplo, os comprimidos, em que um composto ativo é formulado em uma matriz de liberação adequada controlada, ou é revestida com um filme de liberação adequada controlada. Tais formulações podem ser especialmente convenientes para a utilização profilática.
[092] As formulações farmacêuticas adequadas para a administração retal em que o veículo é um sólido, de maior preferência, são apresentadas como supositórios de dose unitária. Os veículos adequados incluem a manteiga de cacau e outros materiais normalmente utilizados no estado da técnica. Os supositórios convenientemente podem ser formados através da mistura de um composto ativo com o(s) veículo(s) amolecido(s) ou derretido(s) seguidos por resfriamento e moldagem em moldes.
[093] As formulações farmacêuticas adequadas para a administração parentérica incluem as soluções ou suspensões estéreis de um composto ativo em veículos aquosos ou oleaginosos.
[094] As formulações farmacêuticas da presente invenção são adequadas para a administração oftalmológica, em especial, para a administração ocular, intraocular, tópica ou periocular, de maior preferência, para a administração ocular ou periocular tópica.
[095] As preparações injetáveis podem ser adaptadas para injeção do bolo ou infusão contínua. Essas preparações são convenientemente apresentadas em recipientes de dose unitária ou doses múltiplas que são selados após a introdução da formulação até serem necessárias para a utilização. De maneira alternativa, um composto ativo pode estar na forma de pó, que é constituído com um veículo adequado, tal como a água estéril livre de pirogênios, antes da utilização.
[096] Um composto ativo também pode ser formulado como preparações de depósito de ação prolongada, que pode ser administrado através da injeção intramuscular ou através da implantação, por exemplo, de maneira subcutânea ou intramuscular. As preparações de depósito podem incluir, por exemplo, os materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados, ou as resinas de troca iônica. Tais formulações de ação prolongada são especialmente convenientes para a utilização profilática.
[097] As formulações adequadas para a administração pulmonar por meio da cavidade bucal são apresentadas de tal maneira que as partículas que contêm um composto ativo e, de maneira desejável, possuem um diâmetro no intervalo de 0,5 a 7 micra são entregues na árvore brônquica do destinatário. Como uma possibilidade, tais formulações estão na forma de pós finamente triturados que convenientemente podem ser apresentados em uma cápsula perfurável, de maneira adequada, por exemplo, de gelatina, para a utilização em um dispositivo de inalação, ou de maneira alternativa como uma formulação autopropulsora que compreende um composto ativo, um propulsor líquido ou gasoso adequado e opcionalmente outros ingredientes tais como um agente tensoativo e/ou um diluente sólido. Os propulsores líquidos adequados incluem o propano e os clorofluorocarbonetos, e os propulsores gasosos adequados incluem o dióxido de carbono. As formulações autopropulsoras também podem ser empregadas, em que um composto ativo é dispensado sob a forma de gotículas de solução ou suspensão.
[098] Tais formulações autopropulsoras são análogas àquelas conhecidas no estado da técnica e podem ser preparadas através dos procedimentos estabelecidos. De maneira adequada, são apresentadas em um recipiente fornecido com uma válvula manualmente operável ou automaticamente em funcionamento que apresenta as características de pulverização desejadas; de maneira vantajosa a válvula é do tipo dosador que fornece um volume fixo, por exemplo, 25 a 100 microlitros, após cada operação da mesma.
[099] Como uma possibilidade adicional, um composto ativo pode estar na forma de uma solução ou suspensão para a utilização em um atomizador ou nebulizador em que uma corrente de ar acelerada ou agitação ultrassônica é empregada para a produção de uma névoa de gotículas finas para a inalação.
[0100]As formulações adequadas para a administração nasal incluem as preparações, em geral, similares àquelas descritas acima para a administração pulmonar. Quando dispensadas, tais formulações de maneira desejável, devem possuir um diâmetro de partícula no intervalo de 10 a 200 micra para permitir a retenção na cavidade nasal; isto pode ser alcançado, caso adequado, através da utilização de um pó com um tamanho de partícula adequado ou através da seleção de uma válvula adequada. Outras formulações adequadas incluem os pós grossos que possuem um diâmetro de partícula no intervalo de 20 a 500 micra, para a administração através da inalação rápida através da passagem nasal a partir de um recipiente mantido próximo do nariz, e as gotas nasais que compreendem de 0,2% a 5% em p/v de um composto ativo na solução ou suspensão aquosa ou oleosa.
[0101]Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos técnicos do assunto e incluem, mas não estão limitados a 0,1 M e, de preferência, 0,05 M do tampão de fosfato ou 0,8% de salino. De maneira adicional, tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser as soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas. Os exemplos de solventes não aquosos são o propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como o óleo de oliva, e os ésteres orgânicos injetáveis tal como oleato de etila. Os veículos aquosos incluem a água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas / aquosas, incluindo os meios salinos e tamponados. Os veículos parentéricos incluem a solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, lactato de Ringer ou óleos fixos. Os conservantes e outros aditivos também podem estar presentes, tais como, por exemplo, os antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e similares.
[0102]As formulações adequadas para a formulação tópica podem ser fornecidas, por exemplo, como cremes, géis ou pomadas. Tais preparações podem ser aplicadas, por exemplo, a uma ferida ou úlcera diretamente espalhada sobre a superfície da ferida ou úlcera ou transportado sobre um suporte adequado tal como um curativo, gaze, malha ou similar, que pode ser aplicado para e através da área a ser tratada.
[0103]As formulações líquidas ou em pó também podem ser fornecidas, que podem ser diretamente pulverizadas ou polvilhadas sobre o local a ser tratado, por exemplo, uma ferida ou úlcera. De maneira alternativa, um veículo, tal como um a curativo, gaze, malha ou similar pode ser pulverizado ou polvilhado com a formulação e, em seguida, aplicado ao local a ser tratado.
[0104]De acordo com um outro aspecto da presente invenção, é fornecido um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou veterinária, conforme descrito acima, que compreende o processo da colocação do(s) composto(s) ativo(s) em associação com o veículo, por exemplo, através da mistura.
[0105]Em geral, as formulações são preparadas por uniformemente e intimamente colocar em associação o agente ativo com os veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou os dois, e, em seguida, caso necessário, moldando o produto. A presente invenção também se refere aos métodos para a preparação de uma composição farmacêutica que compreende colocar um composto de Fórmula (I) em conjunto ou associação com um veículo ou transportador farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.
[0106]Os compostos da presente invenção podem estar presentes como sais ou ésteres, em especial os sais ou ésteres farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis.
[0107]Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente invenção incluem os seus sais de adição de ácido ou de base adequados. Uma revisão dos sais farmacêuticos adequados pode ser encontrada em Berge et al., J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977). Os sais são formados, por exemplo, com os ácidos inorgânicos fortes tais como os ácidos minerais, por exemplo, os ácidos hidroálico tais como o cloridrato, bromidrato e iodidrato, ácido sulfúrico, sulfato de ácido fosfórico, bissulfato, hemissulfato, tiocianato, persulfato e ácidos sulfônicos; com os ácidos carboxílicos orgânicos fortes, tais como os ácidos alcanocarboxílicos com de 1 a 4 átomos de carbono que são não substituídos ou substituídos (por exemplo, por halogênio), tais como o ácido acético; com os ácidos dicarboxílicos saturados ou insaturados, por exemplo, o ácido oxálico, malônico, succínico, maleico, fumárico, ftálico ou tetraftálico; com os ácidos hidroxicarboxílicos, por exemplo, o ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico ou cítrico; com os amino ácidos, por exemplo, o ácido aspártico ou glutâmico; com o ácido benzóico; ou com os ácidos orgânicos sulfônicos, tais como os ácidos sulfônicos de alquila (C1-C4) ou arila que são não substituídos ou substituídos (por exemplo, por um halogênio), tais como o ácido metano- ou p-tolueno sulfônico. Os sais que não são farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis, ainda podem ser valiosos como intermediários.
[0108]Os sais preferidos, por exemplo, incluem o acetato, trifluoroacetato, lactato, gluconato, citrato, tartarato, maleato, malato, pantotenato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, digluconato, ciclopentanato, glucoheptanato, glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato, fumarato, nicotinato, palmoato, pectinato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, proprionato, tartarato, lactobionato, pivolato, canforato, undecanoato e succinato, os ácidos sulfônicos orgânicos, tais como o metanossulfonato, etanossulfonato, sulfonato de 2-hidroxietano, canforssulfonato, 2-naftalenossulfonato, benzenossulfonato, p- clorobenzenossulfonato e p-toluenossulfonato; e os ácidos inorgânicos tais como o cloridrato, bromidrato, iodidrato, sulfato, bissulfato, hemissulfato, tiocianato, persulfato, os ácidos fosfóricos e sulfônicos.
[0109]Os ésteres são formados com os ácidos orgânicos ou álcoois / hidróxidos, dependendo do grupo funcional a ser esterificado. Os ácidos orgânicos incluem os ácidos carboxílicos, tais como os ácidos alcanocarboxílicos com de 1 a 12 átomos de carbono que são não substituídos ou substituídos (por exemplo, por halogênio), tal como o ácido acético; com o ácido dicarboxilico saturado ou insaturado, por exemplo, o ácido oxálico, malônico, succínico, maleico, fumárico, ftálico ou tetraftálico; com os ácidos hidroxicarboxílicos, por exemplo, o ácido ascórbico, glicólico, láctico, málico, tartárico ou cítrico; com os amino ácidos, por exemplo, o ácido aspártico ou glutâmico; com o ácido benzóico; ou com os ácidos orgânicos sulfônicos, tais como os ácidos sulfônicos de alquila (C1-C4) ou arila que são não substituídos ou substituídos (por exemplo, por um halogênio), tais como o ácido sulfônico de metano- ou p-tolueno. Os hidróxidos adequados incluem os hidróxidos inorgânicos, tais como o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de alumínio. Os álcoois incluem os alcanoálcoois de 1 a 12 átomos de carbono que podem ser não substituídos ou substituídos, (por exemplo, por um átomo de halogênio).
[0110]Em todos os aspectos da presente invenção anteriormente discutidos, a presente invenção inclui, quando adequado, todos os enantiômeros, diastereoisômeros e tautômeros dos compostos da presente invenção. O técnico do assunto irá reconhecer que os compostos possuem propriedades óticas (um ou mais átomos de carbono quirais) ou características tautoméricas. Os enantiômeros e/ou tautômeros correspondentes podem ser isolados / preparados através dos métodos conhecidos no estado da técnica. Os enantiômeros são caracterizados pela configuração absoluta dos seus centros quirais e descritos pelas regras de sequenciação R e S de Cahn, Ingold e Prelog. Estas convenções são bem conhecidas no estado da técnica (vide, por exemplo, “Advanced Organic Chemistry”, 3a edição, edição de March, J., John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1985).
[0111]Os compostos de Fórmula (I), por conseguinte, também incluem as formas tautoméricas de Fórmula:
[0112] Como um exemplo ilustrativo, uma forma tautomérica do Exemplo 1 é:
[0113]Os compostos da presente invenção que contém um centro quiral podem ser utilizados como uma mistura racêmica, uma mistura enantiomericamente enriquecida, ou a mistura racêmica pode ser separada utilizando as técnicas bem conhecidas e um enantiômero individual pode ser utilizado isoladamente.
[0114]Alguns dos compostos da presente invenção podem existir como estereoisômeros e/ou isômeros geométricos - por exemplo, eles podem possuir um ou mais centros assimétricos e/ou geométricos e, por conseguinte, podem existir em duas ou mais formas estereoisoméricas e/ou geométricas. A presente invenção contempla a utilização de todos os estereoisômeros e isômeros geométricos individuais daqueles agentes inibidores e suas misturas. Os termos utilizados nas reivindicações abrangem estas formas, desde que ditas formas retenham a atividade funcional adequada (embora não necessariamente no mesmo grau).
[0115]A presente invenção também inclui todas as variações isotópicas adequadas do agente ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Uma variação isotópica de um agente da presente invenção ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo é definida como aquela em que, pelo menos, um átomo é substituído por um átomo que possui o mesmo número atômico mas uma massa atômica diferente da massa atômica normalmente encontrada na natureza. Os exemplos de isótopos que podem ser incorporados no agente e seus sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os isótopos de hidrogênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flúor e cloro, tais como o 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F e 36Cl, respectivamente. Determinadas variações isotópicas do agente e seus sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, aqueles em que um isótopo radioativo tal como o 3H ou 14C, é incorporado, são úteis nos estudos de distribuição de tecido de substrato e/ou drogas. Os isótopos tritiados, isto é, o 3H, e carbono-14, isto é, o 14C, são especialmente preferidos pela sua facilidade de preparação e detectabilidade. Além disso, a substituição com os isótopos tal como o deutério, isto é, o 2H, pode produzir determinadas vantagens terapêuticas resultantes da maior estabilidade metabólica, por exemplo, o aumento na semivida in vivo ou requisitos de dosagem reduzidos e, por conseguinte, podem ser preferidos em algumas circunstâncias. Por exemplo, a presente invenção inclui os compostos de Fórmula (I) em que qualquer átomo de hidrogênio foi substituído por um átomo de deutério. As variações isotópicas do agente da presente invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção, em geral, podem ser preparados através dos processos convencionais utilizando as variações isotópicas adequadas de reagentes adequados.
[0116]A presente invenção ainda inclui os compostos da presente invenção sob a forma de prodroga, isto é, os compostos covalentemente ligados que liberam a droga inicial ativa, de acordo com a Fórmula (I), in vivo. Tais prodrogas, em geral, são os compostos da presente invenção em que um ou mais grupos adequados foram modificados de maneira que a alteração pode ser revertida após a administração a um indivíduo humano ou mamífero. A reversão, em geral, é realizada por uma enzima naturalmente presente em tais indivíduos, embora seja possível que um segundo agente seja administrado em conjunto com tal prodroga, para realizar a reversão in vivo. Os exemplos de tais modificações incluem o éster (por exemplo, qualquer um dos descritos acima), em que a reversão pode ser realizada para ser uma esterase e similares. Outros tais sistemas serão bem conhecidos dos técnicos do assunto.
[0117]A presente invenção também inclui as formas de solvato dos compostos da presente invenção. Os termos utilizados nas reivindicações abrangem estas formas.
[0118]A presente invenção ainda se refere aos compostos da presente invenção nas suas diversas formas cristalinas, formas polimórficas e formas (an)hidratadas. Está bem estabelecido na indústria farmacêutica que os compostos químicos podem ser isolados em qualquer uma destas formas ligeiramente variando o método de purificação e/ou isolamento a partir dos solventes utilizados na preparação sintética de tais compostos.
[0119]As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser adaptadas para a administração retal, nasal, intrabrônquica, tópica (incluindo a administração bucal, sublingual e oftálmica, em especial, para a administração intraocular, tópica ocular ou periocular), vaginal ou parentérica (incluindo a subcutânea, intramuscular, intravenosa, intra-arterial e intradérmica), intraperitoneal ou intratecal. De preferência, a formulação é uma formulação administrada oralmente. As formulações convenientemente podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária, isto é, na forma de porções discretas que contém a uma dose unitária, ou uma subunidade múltipla de uma dose unitária. A título de exemplo, as formulações podem estar na forma de comprimidos e cápsulas de liberação sustentada, e podem ser preparadas através de qualquer método bem conhecido no estado da técnica da farmácia.
[0120]As formulações para a administração oral na presente invenção podem ser apresentadas como: unidades discretas, tais como as cápsulas, cápsulas gelatinosas, gotas, hóstias, pílulas ou comprimidos cada um contém uma quantidade predeterminada do agente ativo; como um pó ou grânulos; como uma solução, emulsão ou suspensão do agente ativo em um líquido aquoso ou em um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsão líquida de água em óleo; ou como um bolo, e similares. De preferência, estas composições contêm a partir de 1 a 250 mg e, de maior preferência, a partir de 10 a 100 m, de ingrediente ativo por dose.
[0121]Para as composições para a administração oral (por exemplo, os comprimidos e cápsulas), o termo “veículo aceitável” inclui os veículos tais como os excipientes comuns, por exemplo, os agentes de ligação, por exemplo, o xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (Povidona), metilcelulose, etilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropilmetilcelulose, sacarose e amido; cargas e veículos, por exemplo, o amido de milho, gelatina, lactose, sacarose, celulose microcristalina, caulino, manitol, fosfato de dicálcico, cloreto de sódio e ácido algínico; e os lubrificantes, tais como o estearato de magnésio, estearato de sódio e outros esteacamundongos metálicos, o ácido esteárico de estearato de glicerol, fluido de silicone, ceras de talco, óleos e sílica coloidal. Os agentes aromatizantes, tais como a hortelã-pimenta, óleo de gaultéria, aroma de cereja e similares, também podem ser utilizados. Pode ser desejável adicionar um agente corante para tornar a forma de dosagem prontamente identificável. Os comprimidos também podem ser revestidos através dos métodos bem conhecidos no estado da técnica.
[0122]Um comprimido pode ser preparado através da compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos prensados podem ser preparados através da compressão, em uma máquina adequada, do agente ativo em uma forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente, misturados com um aglutinante, lubrificante, diluente inerte, conservante, agente de superfície ativa ou de dispersão. Os comprimidos moldados podem ser preparados através da moldagem em uma máquina adequada de uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos, opcionalmente, podem ser revestidos ou marcados e podem ser formulados de maneira a fornecer a liberação lenta ou controlada do agente ativo.
[0123]Outras formulações adequadas para a administração oral incluem as pastilhas que compreendem o agente ativo em uma base aromatizada, normalmente a sacarose e acácia ou tragacanto; as pastilhas que compreendem o agente ativo em uma base inerte tal como a gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e enxaguantes bucais que compreendem o agente ativo em um veículo líquido adequado.
[0124]Outras formas de administração compreendem as soluções ou emulsões que podem ser injetadas intravenosamente, intra- arterialmente, intratecalmente, subcutaneamente, intradermicamente, intraperitonealmente ou intramuscularmente, e que são preparadas a partir das soluções estéreis ou esterilizáveis. As formas injetáveis normalmente contêm entre 10 e 1.000 mg, de maior preferência, entre 10 a 250 mg do ingrediente ativo por dose.
[0125]As composições farmacêuticas da presente invenção também podem estar na forma de pessários, supositórios, suspensões, emulsões, loções, pomadas, cremes, géis, aerossóis, soluções ou pós polvilháveis.
[0126]Um meio alternativo de administração transdérmica é pela utilização de um emplastro para a pele. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser incorporado em um creme que consiste em uma emulsão aquosa de polietileno glicóis ou parafina líquida. O ingrediente ativo também pode ser incorporado, a uma concentração de entre 1 e 10% em peso em um unguento que consiste em uma cera branca ou base de parafina mole branca em conjunto com estabilizantes e conservantes conforme possa ser exigido.
[0127]Um técnico regular do assunto facilmente pode determinar uma dose adequada de uma das composições da presente invenção para administrar a um indivíduo, sem experimentação indevida. Normalmente, um médico irá determinar a dosagem real que será mais adequada para um paciente individual e irá depender de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, a estabilidade metabólica e a duração da ação desse composto, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de drogas, gravidade da condição especial, e a terapia corrente do indivíduo. As dosagens descritas no presente são exemplares do caso médio. Naturalmente, não pode ser casos individuais em que os intervalos de dosagem mais elevados ou mais baixos são merecidos e estes estão dentro do âmbito da presente invenção.
[0128]De acordo com a presente invenção, uma quantidade eficaz de um composto de Fórmula (I) pode ser administrada para alcançar uma condição ou doença especial. Naturalmente, esta quantidade de dosagem ainda será modificada de acordo com o tipo de administração do composto. Por exemplo, para alcançar uma “quantidade eficaz” para a terapia aguda, a administração parentérica de um composto de Fórmula (I) é a preferida. Uma infusão intravenosa do composto em dextrose a 5% em água ou solução salina normal, ou uma formulação similar com excipientes adequados, é a mais eficaz, embora uma injeção do bolo intramuscular também seja útil. Normalmente, a dose parentérica será de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg; de preferência, entre 0,1 e 20 mg/kg, de maneira a manter a concentração da droga no plasma em uma concentração eficaz para inibir a PPP1R15A-PP1. Os compostos podem ser administrados de uma a quatro vezes diariamente a um nível para se alcançar uma dose diária total de cerca de 0,4 a cerca de 400 mg/kg/dia. A quantidade precisa de um composto da presente invenção que é terapeuticamente eficaz, e a via em que tal composto é melhor administrado, é prontamente determinada por um técnico regular do assunto através da comparação do nível sanguíneo do agente com a concentração necessária para apresentar um efeito terapêutico.
[0129]Os compostos da presente invenção também podem ser administrados oralmente ao paciente, de uma maneira tal que a concentração da droga é suficiente para se alcançar uma ou mais das indicações terapêuticas descritas no presente. Normalmente, uma composição farmacêutica que contém o composto é administrada em uma dose oral de entre cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg de uma maneira consistente com a condição do paciente. De preferência, a dose oral seria de cerca de 0,1 a cerca de 20 mg/kg.
[0130]Nenhum efeito toxicológico inaceitável é esperado quando os compostos da presente invenção são administrados, de acordo com a presente invenção. Os compostos da presente invenção, que podem possuir uma boa biodisponibilidade, podem ser testados em uma de diversas análises biológicas para determinar a concentração de um composto que é necessária para apresentar um efeito farmacológico determinado.
[0131] Em uma realização especialmente preferida, um ou mais compostos da presente invenção são administrados em combinação com um ou mais agentes ativos adicionais, por exemplo, as drogas existentes disponíveis no mercado. Em tais casos, os compostos da presente invenção podem ser administrados consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com um ou mais agentes ativos adicionais.
[0132] As drogas, em geral, são mais eficazes quando utilizadas em combinação. Em especial, a terapia de combinação é desejada, para evitar uma sobreposição de toxicidades principais, mecanismos de ação e resistência mecanismo(s). Além disso, também é desejado administrar a maioria das drogas nas suas doses máximas toleradas com intervalos de tempo mínimo entre tais doses. As principais vantagens da combinação de drogas é que pode promover os efeitos aditivos ou sinérgicos possíveis através de interações bioquímicas e também pode reduzir o aparecimento de resistência.
[0133]As combinações benéficas podem ser sugeridas estudando a atividade inibidora dos compostos de teste com os agentes conhecidos ou suspeitos de serem valiosos no tratamento de um distúrbio especial. Este procedimento também pode ser utilizado para determinar a ordem de administração dos agentes, isto é, antes, simultaneamente, ou após a entrega. Tal programação pode ser uma característica de todos os agentes ativos identificados no presente.
[0134]Um aspecto adicional da presente invenção se refere à utilização de um composto, conforme descrito acima, em uma análise para identificar outros compostos candidatos capazes de inibir a PPP1R15A-PP1.
[0135] De preferência, a análise é uma análise de ligação competitiva.
[0136] De maior preferência, a análise de ligação competitiva compreende o contato de um composto da presente invenção com a PPP1R15A-PP1 e um composto candidato e a detecção de qualquer alteração na interação entre o composto, de acordo com a presente invenção, e a PPP1R15A-PP1.
[0137] De preferência, o composto candidato é gerado pela alteração SAR convencional de um composto da presente invenção.
[0138] Conforme utilizado no presente, o termo “alteração de SAR convencional” se refere aos métodos padrão conhecidos no estado da técnica para variar um composto determinado por meio de derivatização química.
[0139] Por conseguinte, em um aspecto, o composto identificado pode atuar como um modelo (por exemplo, um molde) para o desenvolvimento de outros compostos. Os compostos empregados em tal teste podem estar livres em solução, afixado a um suporte sólido, apresentado por uma superfície celular ou localizado intracelularmente. A supressão da atividade ou a formação dos complexos de ligação entre o composto e o agente a ser testado pode ser medida.
[0140]A análise da presente invenção pode ser uma tela, em que uma série de agentes são testados. Em um aspecto, o método de análise da presente invenção é uma tela de transferência elevada.
[0141]A presente invenção também contempla a utilização das análises de varredura das drogas competitivas em que os anticorpos neutralizantes capazes de ligarem um composto especificamente competem com um composto de teste através da ligação a um composto.
[0142] Outra técnica para a varredura fornece uma varredura de transferência elevada (HTS) dos agentes com afinidade de ligação adequada para as substâncias e se baseia no método descrito em detalhes na publicação WO 1984/03564.
[0143]Espera-se que os métodos da análise da presente invenção serão adequados para a varredura de escala pequena e grande dos compostos da análise, por conseguinte, bem como nas análises quantitativas.
[0144] De preferência, a análise de ligação competitiva compreende o contato de um composto da presente invenção com a PPP1R15A-PP1 na presença de um substrato conhecido da PPP1R15A-PP1 e a detecção de qualquer alteração na interação entre dita PPP1R15A-PP1 e dito substrato conhecido.
[0145] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um método para detectar a ligação de um ligante de PPP1R15A-PP1, dito método compreende as etapas: (i) do contato de um ligante com a PPP1R15A-PP1 na presença de um substrato conhecido; (ii) da detecção de qualquer alteração na interação entre a PPP1R15A-PP1 e dito substrato conhecido; - e em que dito ligante é um composto da presente invenção.
[0146] Um aspecto da presente invenção se refere a um processo que compreende as etapas: (a) da realização de um método da análise descrito acima; (b) da identificação de um ou mais ligantes capazes de se ligar a um domínio de ligação do ligante; e (c) da preparação de uma quantidade de dito um ou mais ligantes.
[0147] Outro aspecto da presente invenção se refere a um processo que compreende as etapas: (a) da realização de um método da análise descrito acima; (b) da identificação de um ou mais ligantes capazes de se ligar a um domínio de ligação ao ligante; e (c) da preparação de uma composição farmacêutica que compreende dito um ou mais ligantes.
[0148] Outro aspecto da presente invenção proporciona um processo que compreende as etapas de: (a) da realização de um método da análise descrito acima; (b) da identificação de um ou mais ligantes capazes de se ligar a um domínio de ligação ao ligante; (c) da alteração de dito um ou mais ligantes capazes de se ligar a um domínio de ligação ao ligante; (d) da realização do método da análise descrito acima; (e) opcionalmente, da preparação uma composição farmacêutica que compreende dito um ou mais ligantes.
[0149]A presente invenção também se refere a um ligante identificado através do método descrito acima no presente.
[0150]Ainda um outro aspecto da presente invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um ligante identificado através do método descrito acima no presente.
[0151] Outro aspecto da presente invenção se refere à utilização de um ligante identificado através do método descrito acima na preparação de uma composição farmacêutica para a utilização no tratamento de um distúrbio associado com o acúmulo de proteínas dobradas erradas, conforme definido acima.
[0152]Os métodos mencionados acima podem ser utilizados para a varredura de um ligante útil como um inibidor de PPP1R15A-PP1.
[0153] Os compostos de Fórmula (I) são úteis como ferramentas laboratoriais e como agentes terapêuticos. No laboratório, determinados compostos da presente invenção são úteis para estabelecer se uma quinase conhecida ou recém descoberta contribui com uma função bioquímica crítica ou, pelo menos, significativa durante o estabelecimento ou progressão de um estado da doença, um processo normalmente referido como “validação alvo”.
[0154]A presente invenção ainda é descrito com referência às Figuras seguintes, em que:
[0155]A Figura 1 mostra a dose de proteção dependente das células HeLa através do Composto de Fórmula (I), o Exemplo 1 da presente invenção, a partir da tensão de ER induzida durante 6 horas de exposição à tunicamicina. Vide a descrição do Teste 1.
[0156]A Figura 2 mostra que o Composto de Fórmula (I), o Exemplo 1 da presente invenção adia a recuperação da tradução nas células tensionadas. Mais especificamente, a Figura 2 mostra que a tradução é atenuada 2 horas, seguida pela adição de tunicamicina. A recuperação da tradução apenas é observada nas células tratadas com a tunicamicina. O Exemplo 1 prolonga a atenuação da tradução nas células tratadas com a tunicamicina. Vide a descrição do Teste 3.
[0157]A Figura 3 mostra que o Composto de Fórmula (I), o Exemplo 1 da presente invenção, ao contrário de guanabenzo, não apresenta nenhuma atividade em relação ao receptor adrenérgico a2A conforme medido através de uma análise funcional para o receptor adrenérgico a2A. Vide a descrição do teste 5.
[0158]A Figura 4 mostra que um Composto de Fórmula (I), o Exemplo 1 da presente invenção impede a retenção de ER de P0S63del, a proteína mutante associada com Charcot-Marie-Tooth 1. Eixo Y: número de células. UT: não tratado.
[0159]A Figura 5 mostra que um Composto de Fórmula (I), o Exemplo 1 da presente invenção reduz a acumulação de duas proteínas dobradas erradas que ocasionam as doenças não relacionadas: fragmento amino-terminal de Huntington mutante (Htt48Q) associado com a doença de Huntington e mutante SOD1 (A4V), associado com a esclerose lateral amiotrófica. Eixo Y: porcentagem de acumulação da proteína, em relação às células não tratadas. UT: não tratado.
[0160]A Figura 6 mostra que um Composto de Fórmula (I), o Exemplo 1 da presente invenção reduz a acumulação de rodopsina P23H mutante associada à retinite pigmentosa. Eixo Y: número de células. UT: não tratado.
[0161]A presente invenção ainda é descrita com referência aos Exemplos não limitantes seguintes.
[0162] Os reagentes e os compostos comerciais foram adquiridos de Acros Organics, Sigma-Aldrich. Os compostos, de acordo com a presente invenção, podem ser preparados de acordo com o seguinte procedimento geral: PROCEDIMENTO GERAL A
[0163]A uma solução de benzaldeído (1 equivalente) em etanol (300 mL) foram sequencialmente adicionados o cloridrato de aminoguanidina (1 equivalente) e o acetato de sódio (1 equivalente) A 25° C. A mistura de reação resultante foi aquecida a 80° C durante as próximas cerca de 6 horas. A conclusão da reação foi monitorada por TLC utilizando o diclorometano / metanol (8/2) como fase móvel. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi deixada resfriar até 25° C e despejada na solução saturada de NaHCO3 (700 mL). O precipitado resultante foi removido por filtração sob vácuo e lavado com água (100 mL). O material sólido resultante foi triturado com o éter de dietila (2 x 25 mL) e secado sob vácuo, para fornecer o derivado de aminoguanidina substituído desejado.
[0164]Os seguintes compostos foram preparados de acordo com o procedimento geral A:
[0165]Preparado seguindo o procedimento geral A a partir de 2- clorobenzaldeído. NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) 5,61 (brs, 2H); 6,06 (s, 2H); de 7,22 a 7,32 (m, 2H); 7,40 (dd, 1H); 8,15 (dd, 1H); 8,28 (s, 1H); MS (ESI +): m/z = 215,1 [M + H]+.
[0166]Preparado seguindo o procedimento geral A a partir de 2- fluorobenzaldeído.
[0167]Preparado seguindo o procedimento geral A a partir de 2- cloro-4-fluorobenzaldeído em 67% de rendimento. NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) 5,80 (brs, 2H); 5,84 (brs, 2H); de 7,19 a 7,34 (m, 4H); 8,16 (s, 1H); MS (ESI +): m/z = 215,1 [M + H]+.
[0168]Preparado seguindo o procedimento geral A a partir de 3- cloroisonicotinaldeído em 50% de rendimento. NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) 6,01 (brs, 2H); 6,33 (brs, 2H); 8,10 (d, 1H); 8,14 (s, 1H); 8,37 (dd, 1H); 8,52 (s, 1H); MS (ESI +): m/z = 198,4 [M + H]+.
[0169]Preparado seguindo o procedimento geral A a partir de 2- cloronicotinaldeído em 56% de rendimento. NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) 5,84 (brs, 2H); 5,88 (brs, 2H); de 7,18 a 7,35 (m, 3H); 8,16 (s, 1H); MS (ESI +): m/z = 215,4 [M + H]+.
[0170]A uma solução agitada de N,N-di-isopropilamina (0,864 g, 0,006690 mol) em THF (6 mL) foi adicionado o n-BuLi (1,6 M em hexano) (7,6 mL, 0,012164 mol) gota a gota ao longo de um período de 15 minutos a -78° C. A mistura de reação resultante foi agitada a -78° C durante 15 minutos e, em seguida, foi deixada a aquecer a 0° C, em que ainda foi agitada durante 1 hora. A mistura de reação resultante foi novamente resfriada a -78° C e uma solução de 3-cloro-5-fluoropiridina (0,8 g, 0,006082mol) em THF (6 mL) foi adicionada gota a gota durante um período de 10 minutos. A mistura de reação resultante foi agitada a -78° C durante 1 hora, em seguida, o formato de metila (0,73 g, 0,012164 mol) foi adicionado gota a gota a -78° C. A mistura da reação resultante ainda foi agitada a -78° C durante 1 hora adicional. A reação foi monitorada por TLC utilizando o hexano: etilaceato (5:5) como fase móvel. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi despejada em uma solução saturada de NH4Cl (50 mL) e extraída com o acetato de etila (4 x 25 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com água desmineralizada (50 mL), salmoura (25 mL), secado sobre sulfato de sódio e concentrado sob vácuo. A destilação da camada orgânica forneceu o aldeído desejado (0,6 g, 61,85% de rendimento) na forma bruta. Este composto bruto foi diretamente utilizado para a etapa seguinte sem qualquer outro tratamento.
[0171] Preparado seguindo o procedimento geral A a partir de 3- cloro-5-fluoroisonicotinaldeído em 14% de rendimento. NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) de 5,95 a 6,30 (m, 4H); 8,10 (s, 1H); de 8,46 a 8,52 (m, 2H); MS (ESI +): m/z = 216,0 [M + H]+. EXEMPLO 8 - N-{N-[(E)-[(2- clorofenil)metilideno]amino]carbamimidoil}acetamida
[0172]A uma solução de 1-[(E)-[(2-clorofenil)metilideno]amino]- guanidina (0,50 g, 0,002543 mol) em DMSO (10 mL) foi adicionado o anidrido acético (0,26 g, 0,002543 mol) a 25° C. A mistura de reação resultante foi agitada a 25° C durante as próximas 15 horas. A conclusão da reação foi monitorada por TLC utilizando o diclorometano / metanol (9,5 / 0,5) como fase móvel. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi despejada em água (100 mL) e extraída com o acetato de etila (2 x 150 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura (100 mL), secado sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado sob vácuo. O material bruto resultante ainda foi purificado por cromatografia de modo flash utilizando o diclorometano:metanol como fase móvel através de que o produto desejado eluiu a cerca de 1,0% de metanol em diclorometano. A destilação das frações do produto puro forneceu a N-{N-[(E)-[(2- clorofenil)metilideno]amino]carbamimidoilo}acetamida (0,080 g, 13% de rendimento). NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) 2,97 (s, 3H); de 7,25 a 7,41 (m, 3H); de 7,42 a 7,53 (m, 1H); 7,79 (brs, 1H); de 8,22 a 8,29 (m, 1H); 8,48 (s, 1H); 10,58 (brs, 1H); MS (ESI +): m/z = 239,2 [M + H]+. EXEMPLO 9 -N-{N-[(E)-[(2- clorofenil)metilideno]amino]carbamimidoil}carbamato de metila
[0173]A uma suspensão de 1-[(E)-[(2- clorofenil)metilideno]amino]-guanidina (0,15 g, 0,000762 mol) em diclorometano (5 mL) foi adicionada a trietilamina (0,32 mL, 0,002288 mol) a 25° C. A mistura de reação resultante foi resfriada para 0° C utilizando um banho de gelo / sal; em seguida, o metilcloroformato (0,09 mL, 0,001144mol) foi adicionado à mistura de reação a 0° C. A mistura de reação resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 15 horas. A conclusão da reação foi monitorada por TLC utilizando o diclorometano / metanol (9/1) como fase móvel. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi despejada em uma solução saturada de NaHCO3 (20 mL) e extraída com o diclorometano (3 x 25 mL). O extrato orgânico combinado foi lavado com água D.M. (20 mL), salmoura (20 mL), secado sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado in vácuo. O material bruto resultante ainda foi purificado por cromatografia em coluna flash utilizando o diclorometano:metanol como fase móvel através de que o produto desejado eluiu a cerca de 1,0% de metanol em diclorometano. A destilação das frações do produto puro forneceu o N-{N-[(E)-[(2- clorofenil)metilideno]amino]carbamimidoilo}carbamato de metila (0,065 g, 37% de rendimento). NMR 1H (DMSO-d6): δ (ppm) 3,60 (s, 3H); de 7,34 a 7,43 (m, 2H); de 7,45 a 7,52 (m, 1H); 7,67 (brs, 1H); 7,92 (brs, 1H); de 8,22 a 8,30 (m, 1H); 8,44 (s, 1H); 11,02 (brs, 1H); MS (ESI +): m/z = 255,4 [M + H]+.
[0174]Os compostos selecionados, de acordo com a presente invenção estão apresentados na Tabela 1 abaixo.
[0175] Em algumas das experiências abaixo, um sal destes compostos pode ser utilizado; por exemplo, pode ser utilizado o sal de acetato do Exemplo 1 formado com o ácido acético.
[0176]As células HeLa foram cultivadas em meios de Dulbecco Modificado de Eagle (DMEM) suplementado com a penicilina, estreptomicina, que contém o soro fetal de bovino a 5% (FBS), a 37° C em atmosfera de CO2 a 5%. As células foram plaqueadas em placas de 24 cavidades a uma densidade de 15.000 células/mL, 24 horas antes do tratamento. A tensão de ER foi provocada através da adição de meio fresco que contém 2,5 μg/mL de tunicamicina (Sigma-Aldrich), em conjunto com os inibidores de fosfatases eIF2α (de 0,2 a 5 μM). Os meios foram alterados 6 h mais tarde, com os meios frescos que contêm os inibidores de fosfatase (de 0,2 a 5 μM). Os inibidores foram dissolvidos em DMSO (50 mM) e o DMSO foi utilizado como um tratamento simulado. A viabilidade celular foi avaliada através da medição da redução de WST-8 [2-(2-metoxi- 4-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-dissulfofenil)-2H-tetrazólio] em formazano utilizando a Contagem da Viabilidade Celular do Conjunto-8 (Dojindo) de acordo com a recomendação do fornecedor, 48 h após o tratamento de tunicamicina. A citoproteção da tensão de ER é medida em termos de porcentagem de aumento de células viáveis (em relação ao controle) após a tensão de ER. O resultado para o Exemplo 1 da presente invenção é mostrado na Figura 1.
[0177]As células HeLa (80,000 células/mL) foram plaqueadas em placas de 12 cavidades 24 h antes de cada experiência e não tratadas ou tratadas com os compostos (50 μM) durante 0,5, 1, 2,5, 5 e 7,5 h. No final de cada ponto de tempo, 30,6 μCi/mL de 35S-metionina (EasyTag, Perkin Elmer) foram adicionados ao meio de cultura durante 10 min a 37° C. Após a marcação, as células foram lavadas com o PBS gelado e lisadas em 75 μl de tampão Laemmli. Os lisados foram sonicados, cozidos a 95° C durante 5 minutos e ressolvidos em NuPAGE de 4 a 12% de géis de gradiente. Os géis, em seguida, foram corados com Azul Brilhante de Coomassie R-250 e analisados por imagiologia com fósforo.
[0178]Os tratamentos foram realizados como para medir a tradução nas células não tensionadas, exceto que a tunicamicina (2,5 μg/mL) foi adicionada em conjunto com os compostos. O resultado para o Exemplo 1 da presente invenção é mostrado na Figura 3.
[0179]As células HeLa (80.000 células/mL) foram plaqueadas no dia anterior dos tratamentos indicados, transfectadas com os plasmídeos de expressão GFP-PPP1R15A ou FLAG-PPP1R15B utilizando a Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o procedimento do fabricante. Dois dias após a transfecção, as células foram tratadas durante 6 h com os compostos (50 μM) e, em seguida, lavadas em o PBS e lisadas em tampão IP (Tris a 50 mM, pH 7,4, NaCl a 150 mM, 0,2% de Triton X- 100, 10% de glicerol, e coquetel do inibidor da protease livre de EDTA). Os lisados foram clarificados através da centrifugação a 15.000 g durante 15 min a 4° C e preclareados nas esferas G da proteína durante 1 hora a 4° C. As proteínas foram imunoprecipitadas com o anticorpo GFP a 1,5 μl (JL-8, Clontech, 632.380), vinculado a 20 μl de esferas proteínas-G-sefarose (GE Healthcare, 17-0618-01). As esferas, em seguida, foram lavadas três vezes com o tampão frio de IP e fervidas em 50 μl de tampão Laemmli (25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, DTT a 25 mM, 7,5% de glicerol, 0,05% de azul de bromofenol). Os complexos de proteínas imunoprecipitadas (17 μl) foram separados em géis de gradiente de 4 a 12% de NuPAGE (Invitrogen), transferidos para a membrana Optitran BA-S 83 reforçado de nitrocelulose e reveladas com anticorpos GFP e PP1 (sc-7482, Santa Cruz).
[0180]As células CHO-K1 que coexpressam a apoaequorina mitocondrila, Gα16 e receptor adrenérgico a2A humano recombinante cultivadas em meio de cultura a meados da fase log sem antibióticos foram destacadas com a PBS-EDTA, centrifugadas e ressuspensas em DMEM / F12 de HAM com HEPES, sem o vermelho de fenol + 0,1% de tampão livre de BSA de protease a uma concentração de 1 x 106 células/mL. As células foram incubadas à temperatura ambiente durante, pelo menos, 4 horas com a coelenterazina h. Em cada dia do teste, o agonista de referência (UK14304) foi testado para avaliar o desempenho da análise e determinar o EC50. Em seguida, 50 μl de suspensão de células foram misturados com 50 μL de agonista de teste em uma placa de 96 cavidades. A emissão resultante da luz foi gravada utilizando o luminômetro 6.000 do Sistema de Varredura de Drogas Funcional Hamamatsu. Para padronizar a emissão de luz registrada (determinação do “sinal de 100%”) ao longo da placa e em diferentes experiências, algumas das cavidades continham a digitonina 100 μM ou uma concentração saturante de EM (20 μM).
[0181]Os dados de dose-resposta a partir dos compostos de teste foram analisados com o software XLfit (IDBS) utilizando a regressão não linear aplicada a um modelo de dose-resposta sigmoidal.
[0182]O resultado para o Exemplo 1 da presente invenção é mostrado na Figura 4. De maneira vantajosa, em contraste com o guanabenzo, o Exemplo 1 não é considerado como sendo um agonista de alfa-2 potente. Esta perda de atividade de alfa-2 adrenérgico torna o composto terapeuticamente útil no tratamento dos distúrbios reivindicados no presente. A falta de atividade de alfa-2 adrenérgico significa que o composto pode ser administrado a uma dosagem adequada para tratar os distúrbios reivindicados no presente, mas sem qualquer efeito significativo sobre a pressão sanguínea, por conseguinte, evitando a necessidade para coadministrar com um antagonista alfa-2 adrenérgico conhecido (um bloqueador alfa).
[0183]A seletividade foi inferida a partir dos resultados dos Testes 1, 2, 3, 4 e 5.
[0184] Um inibidor seletivo de PPP1R15A deve proteger as células da tensão de ER (Teste 1), não inibir a tradução nas células não tensionadas (Teste 2), prolongar a atenuação da tradução após a tunicamicina (Teste 3), e seletivamente dissociar a PPP1R15A-PP1 holofosfatase mas não a PPP1R15b-PP1 holofosfatase (Teste 4).
[0185]Os resultados dos Testes de 1 a 4 para os compostos selecionados da presente invenção são mostrados abaixo na Tabela 1. TABELA 1 a inferida a partir de uma tradução na inibição / células não tensionadas b confirma a seletividade em relação à PPP1R15A-PP1 ou a sua falta.
[0186]As células de cultura e as células Reagentes 293T foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com soro fetal bovino a10% e transfetadas em placas de 6 ou 12 cavidades utilizando o método de fosfato de cálcio que normalmente conduz a 70% de eficiência de transfecção. De maneira rotineira, 45.000 células / mL foram plaqueadas antes da transfecção, conforme descrito em Rousseau et al., 2009. A construção mielina P0S63del-DsRed foi descrita em Pennuto et al., 2008, a construção Huntington foi descrita em Rousseau et al., 2009, a construção SOD1A4V está descrita em Munch et al., 2011 e a construção P23H está descrita em Mendes e Cheetham 2008.
[0187]As células transfectadas foram fixadas com paraformaldeído a 4% e marcadas com os anticorpos indicados. As micrografias foram tiradas com uma ampliação de 100 X de um microscópio confocal Leica TCS SP2AOBS ou microscópio de fluorescência Leica DMRB.
[0188] De maneira rotineira, 70% de células confluentes a partir de uma cavidade de uma placa de 12 cavidades foram lisadas em 140 μl de tampão Laemmli ebuliente (25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 1% de SDS, 25 mM de ditiotreitol, 7,5% de glicerol, 0,05% de azul de bromofenol) para a análise de imunotransferência. 18 μl de extratos de proteína foram carregados em de 2 a 12% de gel NuPAGE e transferidos para a membrana reforçada de nitrocelulose Optitran BA-S 83 (Whatman e Schleicher & Schuell). O carregamento igual de extratos de proteína analisado através da imunotransferência foi controlado através de coloração de Ponceau e vimentina (dados não mostrados). As membranas foram saturadas em 5% de leite desnatado em pó em solução salina tamponada com fosfato e sondadas com o anticorpo 2B4 Htt ou HA para revelar a SOD1 marcada com o HA. O anticorpo secundário adequado acoplado à peroxidase foi revelada utilizando o conjunto SuperSignal West Pico Chemiluminescent (Pierce). As imagens quimioluminescentes foram adquiridas utilizando o Chemi-Smart 5000 (Vilber-Lourmat) permitindo a detecção quantitativa de quimioluminescentes. Os sinais de interesse foram quantificados utilizando a ImageJ.
[0189] A supressão de serina 63 a partir de P0 (P0S63del) ocasiona a neuropatia de Charcot-Marie-Tooth 1B nos seres humanos e uma neuropatia desmielinizante similar nos camundongos transgênicos. Os dobramentos incorretos das proteínas mutantes acumulam na ER, induzem a UPR e não devem ser incorporados na mielina (D'Antonio et al., 2009, J Neurosci Res, 87, 3241 -9). As células 293T foram transfectadas com P0S63 del marcadas - P0S63del-DsRed - e analisadas através da microscopia confocal, 48 h pós-transfecção na presença ou ausência do composto de Fórmula (I). De acordo com a metodologia descrita em Pennuto et al., 2008, as células P0S63del-DsRed retidas em ER foram avaliadas. A Figura 4 mostra que, nas células não tratadas, a P0S63del acumula em ER, mas, o Exemplo 1 impede esta acumulação.
[0190] Uma vez que o acúmulo de P0 dobradas erradas provoca a CMT-1B e mostrou que o Exemplo 1 reduz a acumulação da proteína que provoca a doença, o composto de Fórmula (I) deve ser útil para o tratamento da CMT-1 B, bem como outras formas de CMT, em que a proteína que provoca as doenças é dobrada errada e é retida na ER.
[0191]A acumulação de um fragmento amino-terminal de mutante de Huntington (Htt48Q) associada com a doença de Huntington e mutante SOD1 (A4V), associado com a esclerose lateral amiotrófica foram testados.
[0192] Utilizou-se um método previamente descrito na publicação WO/2008/041133. As células 293T foram transfectadas com os plasmídeos que codificam para Htt48 ou SOD1A4V e tratadas com o Exemplo 1 em DMSO ou DMSO isoladamente 4 h pós-transfecção. Os lisados de SDS coletados 48 h após a transfecção foram analisados em um NuPAGE seguido por imunotransferência com o anticorpo de Huntington (2B4) ou HA (SOD1). A Figura 5 mostra as quantificações do sinal em imunotransferências, normalizadas para as células não tratadas. O Exemplo 1 reduz a acumulação das duas proteínas. Tendo mostrado que o Exemplo 1 reduz a acumulação de proteínas que provoca a doença de Huntington e esclerose lateral amiotrófica, o composto de Fórmula (I) deve ser útil para o tratamento de tais doenças, bem como outras doenças neurodegenerativas causadas através do acúmulo de proteínas dobradas erradas.
[0193]A agregação de rodopsina associada com a retinite pigmentosa foi testada, conforme descrito (Mendes & Cheetham 2008).
[0194]As células 293T foram transfectadas com o plasmídeo que codifica o mutante P23H da rodopsina e tratadas com o Exemplo 1 em DMSO ou DMSO isoladamente 4 h pós-transfecção. As células foram analisadas por microscopia. A Figura 6 mostra as células com ou sem agregados.
[0195] O Exemplo 1 reduz os agregados. Uma vez que o acúmulo de rodopsina dobrada errada provoca a RP e tendo mostrado que o Exemplo 1 reduz a acumulação de proteína que provoca a doença, o composto de Fórmula (I) deve ser útil para o tratamento da retinite pigmentosa.
[0196] Os Exemplos 1 e 6 são inibidores seletivos confirmados de PPP1R15A.
[0197] Os Exemplos 2, 4, 7, 8 inibem a PPP1R15A e a B. Diversas modificações e variações da presente invenção serão evidentes para os técnicos do assunto sem se afastar do âmbito e espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em ligação com realizações preferidas específicas, deverá ser entendido que a presente invenção, conforme reivindicada não deverá ser indevidamente limitada a tais realizações específicas. Na verdade, diversas modificações dos modos descritos para realizar a presente invenção que são evidentes para os técnicos nos campos relevantes se destinam a ser abrangidas pela presente invenção.
Claims (9)
1. USO DE UM COMPOSTO, de fórmula (I), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que: - R1 é alquila, Cl, F ou Br; - R2 é H ou F; - R3 é selecionado a partir de H e alquila; - R4 é selecionado a partir de H e C(O)R6; - R5 é H; - ou R4 e R5 estão ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10; - R6 é selecionado a partir de R7, OR7 e NR8R9; - R7, R8 e R9 são cada um, independentemente, selecionado a partir de alquila, cicloalquila, aralquila, cicloalquenila, heterociclila e arila, cada uma opcionalmente é substituída com um ou mais grupos R10; - cada R10 é, independentemente, selecionado a partir de halogênio, OH, NO2, CN, COO-alquila, aralquila, SO2-alquila, SO2-arila, COOH, CO-alquila, CO-arila, NH2, NH-alquila, N(alquil)2, CF3, alquila e alcóxi; - X e Z são cada um, independentemente, CR11, e Y é selecionado a partir de N e CR11; - R11 é H ou F; em que alquila é um grupo alquila C1-C6; cicloalquila é um grupo cicloalquila C3-C12; heterociclo ou heterocíclico define um grupo cíclico C3-C12 (mono- ou poli-) substituído ou não substituído, saturado, insaturado ou parcialmente insaturado que contém um ou mais heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, e que opcionalmente ainda contém um ou mais grupos CO; aralquila define um grupo arila-alquila em que arila é um grupo aromático C6C12 e alquila é um grupo alquila C1-C6; cicloalquenila define um grupo alquenila C3-C15 cíclico; arila é um grupo aromático C6-C12; alcóxi define um grupo alquila -O-C1-6; caracterizado por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado com a tensão do dobramento incorreto da proteína e, em especial, com o acúmulo de proteínas dobradas erradas, selecionado a partir de neuropatia de Charcot-Marie-Tooth; síndrome grave de Dejerine-Sottas; doenças da retina, de preferência, retinite pigmentosa, ciliopatias da retina, degeneração macular ou retinopatia diabética; doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ALS; diabetes tipo 2; câncer, de preferência, mieloma múltiplo.
2. USO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: - R1 ser Cl, Br, Me ou F, de maior preferência, Cl; - R2 ser H; - Y ser CR11; - Y ser N; - R3 e R4 serem ambos H; - R3 ser H, e R4 ser C(O)R6; - R6 ser Me ou OMe; ou - R4 e R5 estarem ligados para formar um grupo heterocíclico, que opcionalmente é substituído com um ou mais grupos R10.
3. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo dito composto ser de Fórmula (Ia), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, - em que R1, R2, R3 e R10 são conforme definidos na reivindicação 1.
4. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo composto ser selecionado a partir do seguinte:
- ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos.
5. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo composto ser selecionado a partir do Composto 1, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
6. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo composto ser o Composto 15 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
7. USO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo composto ser o Composto 16 ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
8. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo distúrbio ser neuropatia de Charcot-Marie-Tooth.
9. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo distúrbio ser ALS.
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