CN103088103A - 活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物 - Google Patents

活化辅助t细胞的方法以及用于该方法的组合物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了：用于活化辅助T细胞的方法，其包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞以活化该辅助T细胞的步骤，其中所述的WT1肽能够与选自HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中的任一个结合；在该方法中应用的组合物；通过活化辅助T细胞治疗和/或预防癌症的方法；在所述治疗和/或预防方法中使用的药物组合物；等等。

Description

活化辅助T细胞的方法以及用于该方法的组合物
本申请为申请号为200880006096.5的分案申请，要求2007年2月27日的的优先权。
技术领域
本发明涉及用于活化辅助T细胞的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并由此活化辅助T细胞，其中所述WT1肽具有结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个的能力，以及用于其的组合物，用于通过活化辅助T细胞治疗和/预防癌症的药物组合物等等。
背景技术
WT1基因(维耳姆斯瘤1基因(Wilms′tumor 1 gene))被认为是导致维耳姆斯瘤(其为儿童肾癌)的基因(非专利文献1和2)。WT1是具有锌指结构的转录因子。最初，WT1基因被认为是肿瘤抑制基因。然而，随后的研究(非专利文献3、4、5和6)显示WT 1基因在造血肿瘤和实体癌中起着癌基因的作用。
已显示可通过用WT1肽体外刺激外周血单核细胞而诱导WT1肽特异性T淋巴细胞(CTL)，并且此类CTL损伤内源表达WT1的癌细胞，诸如造血肿瘤细胞和实体癌细胞。该CTL识别复合物的形式的WT1肽，在所述复合物中，该WT1肽与MHC I类分子结合。因此，此类WT1肽取决于MHC I类分子亚型而不同(专利文献1、非专利文献7、以及专利文献2、3和4)。
存在对癌抗原特异的辅助T细胞对有效诱导CTL是很重要的(非专利文献8)。通过识别MHC II类分子和抗原递呈细胞上的抗原肽的复合物诱导和活化辅助T细胞。活化的辅助T细胞产生诸如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6或干扰素的细胞因子以帮助B细胞的生长、分化或成熟。活化的辅助T细胞还具有促进其它T细胞亚类(例如，Tc和TD细胞)的生长、分化或成熟的功能。因此，活化的辅助T细胞具有通过促进B细胞或T细胞的生长或活化从而活化免疫系统的功能。因此，在癌免疫治疗中通过MHC II类结合的抗原肽(辅助肽)提高辅助T细胞的功能以增加癌疫苗的效果被认为是有用的(非专利文献9)。目前，仅发现与HLA-DRB1*0401分子结合的肽(非专利文献10)、与HLA-DRB1*0405分子结合的肽和与HLA-DRB1*1502分子结合的肽(专利文献5)是WT1的辅助肽。因此，需要发现各自与HLA-DRB1*1501、HLA-DPB1*0901或HLA-DPB1*0501分子结合的肽。
此外，已显示在辅助肽中，存在能够与多个MHC II类分子结合并诱导辅助T细胞的混杂辅助肽(非专利文献11和12)。然而，非常难以鉴定与三或更多类MHC II类分子结合并发挥足够功能的混杂辅助肽。
专利文献1：WO 2003/106682
专利文献2：WO 2005/095598
专利文献3：WO 2007/097358
专利文献4：国际专利申请号PCT/JP2007/074146
专利文献5：WO 2005/045027
非专利文献1：Daniel A.Haber等，Cell.1990Jun 29；61(7)：1257-69.
非专利文献2：Call KM等，Cell.1990Feb 9；60(3)：509-20.
非专利文献3：Menke AL等，Int Rev Cytol.1998；181：151-212.综述
非专利文献4：Yamagami T等，Blood.1996 Apr 1；87(7)：2878-84.
非专利文献5：Inoue K等，Blood.1998 Apr 15；91(8)：2969-76.
非专利文献6：Tsuboi A等，Leuk Res.1999 May；23(5)：499-505.
非专利文献7：Oka Y等，Immunogenetics.2000 Feb；51(2)：99-107.
非专利文献8：Gao FG等，Cancer Res.2002 Nov15；62(22)：6438-41.
非专利文献9：Zeng G，J Immunother.2001 May；24(3)：195-204
非专利文献10：Knights AJ等，Cancer Immunol Immunother.2002Jul；51(5)：271-81.
非专利文献11：Sotiriadou R等，Br J Cancer.2001 Nov16；85(10)：1527-34.
非专利文献12：Hural JA等，J Immunol.2002 Jul 1；169(1)：557-65.
发明内容
发明解决的问题
本发明所要解决的问题是提供用WT1肽活化辅助T细胞的方法，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子结合的能力，和用于其的组合物，以及用于通过活化辅助T细胞治疗和/预防癌症的药物组合物等等。
解决问题的手段
考虑到上述情况进行深入研究，结果本发明人发现在与HLA-DRB1*0405分子和HLA-DRB1*1502分子结合的WT1肽当中，具有氨基酸序列Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His SerArg Lys His的WT1肽还与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子结合。因此，本发明得以完成。
本发明提供了：
(1)用于活化辅助T细胞的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并且由此活化辅助T细胞，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
(2)根据(1)的方法，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子中的至少两个结合的能力。
(3)根据(1)或(2)的方法，其中所述WT1肽还具有与HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力。
(4)根据(1)-(3)任一项的方法，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DRB1*0405分子和HLA-DRB1*1502分子结合的能力。
(5)根据(1)-(4)任一项的方法，其中所述的WT1肽是包含氨基酸序列：Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His(SEQ ID No：2)的肽。
(6)根据(1)-(5)任一项的方法，其中通过添加WT1肽、添加包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体或添加包括该表达载体的细胞实现将WT1肽添加到抗原递呈细胞。
(7)用于通过添加WT1肽至抗原递呈细胞从而活化辅助T细胞的组合物，其包含WT1肽，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
(8)在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并且由此活化辅助T细胞，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
(9)用于通过添加WT1肽至抗原递呈细胞来活化辅助T细胞从而治疗或预防癌症的药物组合物，其包含WT1肽，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
(10)特异性结合WT1肽的抗体，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
(11)在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性和HLA-DPB1*0501阳性受试者的任一中测定WT1肽的存在或量的方法，其包括：
(a)使抗-WT1抗体与来自所述受试者的样品反应；以及
(b)测定与所述样品中含有的WT1肽特异性结合的抗-WT1抗体的存在或量。
(12)治疗或预防癌症的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并由此活化辅助T细胞，以及将所述活化的辅助T细胞施与受试者，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子结合的能力。
(13)用于治疗或预防癌症的药物组合物，包括用WT1肽活化的辅助T细胞，其中所述WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
(14)在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性和HLA-DPB1*0501阳性受试者的任一中测定WT1-特异性辅助T细胞的存在或量的方法，其包括：
(a)使WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物与来自所述受试者的样品反应；以及
(b)测定样品中包含的识别复合物的辅助T细胞的存在或量。
(15)在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性、HLA-DPB1*0501阳性、HLA-DRB1*0405阳性或HLA-DRB1*1502阳性受试者中测定WT1-特异性辅助T细胞的存在或量的方法，其包括：
(a)用WT1肽刺激外周血单核细胞、侵袭性淋巴细胞(invasivelymphocyte)、肿瘤细胞、腹水中的细胞、胸水中的细胞、脑脊髓液中的细胞、骨髓细胞或淋巴结细胞；以及
(b)测定细胞因子的产生或辅助T细胞的反应，
其中细胞因子产生或辅助T细胞反应的存在或量的升高表明WT1特异性辅助T细胞的存在或量。
本发明的效果
本发明提供了用WT1肽活化辅助T细胞的方法，其中所述WT1肽与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子，HLA-DPB1*0501分子、HLA-DRB1*0405分子和HLA-DRB1*1502分子结合，和用于其的组合物，以及用于通过活化辅助T细胞治疗和/或预防癌症的药物组合物等等。因此，能够在体内和体外活化具有任何此类MHC II类分子的受试者的辅助T细胞，治疗和预防癌症等。由于约90％的日本人均被该五类MHC II类亚类所覆盖，可在非常宽范围的受试者中活化辅助T细胞以治疗和/或预防癌症。
附图简述：
图1是表示由TA28.1细胞产生的IFN-γ的量的图。在图中，纵轴表示IFN-γ的浓度(pg/ml)。该图从左边开始，分别相应于“在不存在WT1肽的情况下培养来自HLA-DRB1*1501阳性受试者的外周血单核细胞的情况”、“在WT1肽的存在下培养TA28.1细胞的情况(黑色)”、“在不存在WT1肽的情况下培养来自HLA-DRB1*1501阴性受试者的外周血单核细胞的情况”、“在WT1肽的存在下培养来自HLA-DRB1*1501阴性受试者的外周血单核细胞的情况”。
图2是表示由TA28.1细胞产生的IFN-γ、IL-4和IL-10量的图。在该图中，纵轴表示浓度(pg/ml)。从左边开始，所述图对应于IFN-γ、IL-4和IL-10的值。
图3是表示由E15.2细胞产生的IFN-γ、IL-4和IL-10量的图。在该图中，纵轴表示浓度(pg/ml)。从左边开始，所述图对应于IFN-γ、IL-4和IL-10的值。
图4表示由HLA-DPB1*0501/*0501阳性单核细胞产生IFN-γ和IL-17。在该图中，横轴表示IFN-γ，且纵轴表示IL-17。图4a表示没有用WT1肽刺激的细胞，以及图4b表示用WT1肽刺激的细胞。
图5是表示TA28.1细胞生长的图。在该图中，纵轴表示cpm(x104)。该图从左边开始，分别相应于“用没有加WT1肽的外周血单核细胞共培养TA28.1细胞的情况”、“用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养TA28.1细胞的情况(黑色)”、“在抗-MHC I类抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞培养TA28.1细胞的情况”、“在抗-HLA-DR抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养TA28.1细胞的情况(阴影)”、“在抗-HLA-DQ抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养TA28.1细胞的情况”、“在抗-HLA-DP抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养TA28.1细胞的情况”。
图6是表示E15.2细胞生长的图。在该图中，纵轴表示cpm(x104)。该图从左边开始，分别相应于“用没有加WT1肽的来自HLA-DPB1*0901阳性受试者的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况”、“用加了WT1肽的来自HLA-DPB1*0901阳性受试者的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况(黑色)”、“用没有加WT1肽的来自HLA-DPB1*0901阴性受试者的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况”、“用加了WT1肽的来自HLA-DPB1*0901阴性受试者的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况”。
图7是表示E15.2细胞生长的图。在该图中，纵轴表示cpm。该图从左边开始，分别相应于“用没有加WT1肽的外周血单核细胞共培养E 15.2细胞的情况”、“用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况(黑色)”、“在抗-MHC I类抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况”、“在抗-HLA-DR抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况”、“在抗-HLA-DQ抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况”、和“在抗-HLA-DP抗体存在下，用加了WT1肽的外周血单核细胞共培养E15.2细胞的情况(阴影)”。
图8是表示HLA-DPB1*0501/*0501阳性单核细胞生长的图。在图中，纵轴表示cpm。该图从左边开始，分别对应于“没有用WT1肽刺激的情况”和“用WT1肽刺激的情况”。
图9表示通过抗HLA-DP抗体抑制HLA-DPB1*0501/*0501阳性单核细胞的生长。图中，纵轴表示cpm。该图从左边开始，分别对应于“没有用WT1肽刺激的情况”、“用来自HIV的对照肽刺激的情况”、“用WT1肽刺激的情况”、“在抗HLA-DR抗体的存在下用WT1肽刺激的情况”、“在抗HLA-DQ抗体的存在下用WT1肽刺激的情况”以及“在抗HLA-DP抗体的存在下用WT1肽刺激的情况”。
图10是表示用不同浓度的WT1肽的情况下E15.2细胞生长的图。图中，纵轴表示cpm(x104)，并且横轴表示WT1肽的浓度。
实施本发明的最佳模式
一方面，本发明涉及用于活化辅助T细胞的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并由此活化辅助T细胞，其中所述WT1肽具有结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个的能力。在本发明中，WT1肽是指由SEQ ID No：1所示人WT1蛋白的部分氨基酸序列组成的肽；在所述氨基酸序列上具有一至若干个氨基酸替换、修饰或缺失、并具有结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个的能力的肽；或这样的肽，其中各种物质诸如氨基酸、肽或其类似物可能附着于该肽的N端和/或C端。所述物质例如可以通过活体内的酶或通过诸如细胞内加工的过程而被加工，并且最终所述WT1肽变成可结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个的形式。所述物质可以是调节本发明WT1肽溶解度、或增加其稳定性(抵抗蛋白酶等)的物质。备选地，其可以是将本发明的WT1肽特异性地递送至例如特定组织或器官，或增加抗原递呈细胞摄入效率的物质等。备选地，其可以为限制为与和抗原递呈细胞来源的受试者相同类型的MHC I类分子的WT1肽。
本发明的WT1肽具有结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个的能力。因此，所述WT1肽可以是具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中至少两个结合的能力的肽，或具有与HLA-DRB1*1501分子和/或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和除了上述分子外的HLA II类分子结合的能力的肽，例如，具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力的肽；具有与HLA-DPB1*0901分子、HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力的肽；具有与HLA-DPB1*0501分子、HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力的肽；或具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力的肽。由于具有氨基酸序列Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln MetHis Ser Arg Lys His(SEQ ID No：2)的WT 1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子、HLA-DPB1*0501分子、HLA-DRB1*0405分子和HLA-DRB1*1502分子结合的能力，具有此类氨基酸序列的WT1肽是优选的。一般而言，与MHC II类结合的肽由10-25个氨基酸组成。因此，WT1肽优选具有由10-25个氨基酸组成的氨基酸序列。
可通过本领域通用的方法或其变形合成本发明的WT1肽。此类方法例如描述于Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；TheProteins，卷2，Academic Press Inc.，New York，1976；Peptide-Gosei，Maruzen Co.，Ltd.，1975；Peptide-Gosei No Kiso To Jikken，Maruzen Co.，Ltd.，1985；和Iyakuhin No Kaihatsu(Zoku)，卷14，Peptide-Gosei，Hirokawa-Book store，1991。
还可基于编码WT1肽的核苷酸序列信息应用基因工程技术制备本发明的WT1肽。此类基因工程技术是本领域技术人员公知的。
抗原递呈细胞是指诸如树状细胞的、能将WT1肽与MHC II类分子一起递呈给辅助T细胞等的细胞。因此，抗原递呈细胞来源的受试者必须具有与所加入的WT1肽结合的MHC II类亚类相同的MHC II类亚类(例如，HLA-DRB1*1501、HLA-DPB1*0901、HLA-DPB1*0501、HLA-DRB1*0405或HLA-DRB1*1502)。
一般而言，辅助T细胞通过所述T细胞表面的TCR-CD3复合物通过抗原递呈细胞表面上MHC II类分子识别抗原肽，并且通过抗原递呈细胞表面的整联蛋白配体刺激T细胞表面的整联蛋白而被活化。在本发明中，辅助T细胞的活化不仅包括辅助T细胞的活化，还包括辅助T细胞的诱导与生长。如上所述，经活化的辅助T细胞具有通过增加B细胞或T细胞的诱导、生长或活化而活化免疫系统的功能。因此，本发明用于活化辅助T细胞的方法可用作癌症等治疗中的辅助治疗。备选地，应用本发明的方法体外活化的辅助T细胞可以用于治疗或预防癌症等，或可用作用于其的辅助治疗。可通过测量细胞因子诸如干扰素和白介素等的产量和分泌量而确定辅助T细胞的活化。
可直接通过添加WT1肽、或间接通过添加包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体、或添加包含该表达载体的细胞而实现将WT1肽添加至抗原递呈细胞。可通过本领域技术人员的公知方法制备包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的细胞。
在另一方面，本发明涉及用于通过将WT1肽添加至抗原递呈细胞而活化辅助T细胞的组合物，其包括WT1肽，其中所述的WT1肽具有结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个的能力。当将本发明的组合物施与HLA-DRB1*1501、HLA-DPB1*0901或HLA-DPB1*0501阳性受试者时，该受试者的免疫系统通过受试者的辅助T细胞的活化而被活化。在许多癌症和肿瘤中WT1基因都以高水平表达，所述癌症和肿瘤包括造血肿瘤，诸如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤；以及实体癌，诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌。因此，本发明的组合物可以用作治疗或预防癌症的辅助治疗。备选地，应用本发明的组合物活化的辅助T细胞例如可用作癌症治疗中的佐药。
如上所述，本发明的WT1肽可以是具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中至少两个结合的能力的肽，或具有与HLA-DRB1*1501分子和/或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和其他MHC II类分子结合的能力的肽。因此，只要抗原递呈细胞来源的受试者对于本发明的WT1肽能与其结合的MHC II类亚类是阳性的，即可以得到本发明组合物活化辅助T细胞的效果。
除了WT1肽外，本发明的组合物还可以包含例如载体、赋形剂、添加剂等。因为本发明组合物中包含的WT1肽活化对该WT1肽特异的辅助T细胞，因此该组合物可以包含MHC I类限制性WT1肽，或其可与该肽一起使用。
可依据诸如辅助T细胞的期望活化、抗原递呈细胞的状态的条件合适地选择应用本发明组合物的方法。此类方法的实例包括，但不限于真皮内施用、皮下施用、肌内施用、静脉内施用、鼻内施用和口服施用，以及添加至抗原递呈细胞的培养基中。可依据诸如辅助T细胞的期望活化、抗原递呈细胞的状态的条件合适地选择本发明组合物中包含的WT1肽的量、以及本发明组合物的形式、使用次数等。
在其它方面，本发明涉及通过将WT1肽添加至抗原递呈细胞活化辅助T细胞的组合物，其包含包含编码所述WT1肽的多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。包含编码所述WT1肽的多核苷酸的表达载体和包含该表达载体的细胞描述如上。
另一方面，本发明涉及包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞在制备组合物中的应用。
在其它方面，本发明涉及用于通过将WT1肽添加至抗原递呈细胞活化辅助T细胞的试剂盒，其包含WT1肽，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。优选在用于活化辅助T细胞的方法中使用该试剂盒。除了所述WT 1肽之外，本发明的试剂盒还可以包含例如获得抗原递呈细胞的工具、检测辅助T细胞活性的工具等。一般而言，所述试剂盒附有说明书手册。通过应用本发明的试剂盒，可有效地诱导辅助T细胞。
在另一方面，本发明涉及用于通过将WT1肽添加至抗原递呈细胞活化辅助T细胞的试剂盒，其包含包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
在其它方面，本发明涉及用于在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并由此活化辅助T细胞，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。本发明的方法是这样的方法，其中通过活化辅助T细胞而活化受试者中的免疫系统，并且治疗或预防了该受试者的癌症。可直接通过添加WT1肽、或间接通过添加包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体、或添加包含该表达载体的细胞而实现添加WT1肽至抗原递呈细胞。
如上所述，辅助T细胞识别任何一个MHC II类分子、尤其是HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501与WT1肽的复合物。因此，所述受试者是具有与WT1肽结合的MHC II类分子的受试者，例如HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性、或HLA-DPB1*0501阳性受试者。如上所述，本发明的WT1肽可以是具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子中的至少两个结合的能力的肽，或具有与HLA-DRB1*1501分子和/或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和除了它们外的MHC II类分子结合的能力的肽。因此，在这种情况下，能够在对于本发明的WT1肽能结合的MHCII类亚类而言阳性的受试者中治疗或预防癌症。待治疗或预防的癌症可以是任意一个，并且其实例包括造血肿瘤，诸如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤；以及实体癌，诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌。此外，本发明的方法可与用MHC I类分子限制性WT1肽治疗或预防癌症的方法或用于其的药物组合物一起应用。
另一方面，本发明涉及用于通过将WT1肽添加至抗原递呈细胞活化辅助T细胞从而在受试者中治疗或预防癌症的药物组合物，其包含WT1肽，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。所述WT1基因在许多癌症和肿瘤中以高水平表达，所述癌症和肿瘤包括造血肿瘤，诸如白血病、骨髓增生异常综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤；以及实体癌，诸如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胚细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌。因此，本发明的药物组合物可用于治疗或预防癌症。
如上所述，本发明的WT1肽可以是具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子中的至少两个结合的能力的肽，或具有与HLA-DRB1*1501分子和/或HLA-DPB1*0901分子和/或HLA-DPB1*0501分子、和除了它们外的MHC II类分子结合的能力的肽。因此，只要该抗原递呈细胞来源自对于本发明的WT1肽能与其结合的MHC II类亚类而言阳性的受试者，则本发明的药物组合物可用于治疗或预防癌症。
当将本发明的药物组合物例如施用于HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性或HLA-DPB1*0501阳性受试者时，可通过该药物组合物中包含的WT1肽活化辅助T细胞从而活化受试者的免疫系统，由此治疗或预防癌症。因此，本发明的药物组合物可与治疗或预防癌症的方法或用于其的药物组合物一起使用。
除了作为活性组分的WT1肽之外，本发明的药物组合物还可以包含例如载体、赋形剂等。本发明药物组合物中包含的WT1肽与抗原递呈细胞表面的MHC II类分子结合，并且活化辅助T细胞。因此，本发明的药物组合物还可以包含辅助T细胞的活化剂、生长因子、诱导剂等，或可以包含MHC I类限制性WT1肽。
可以依据诸如疾病类型、受试者的状况或靶部位等条件而适当地选择施用本发明药物组合物的方法。此类方法的实例包括但不限于：真皮内施用、皮下施用、肌内施用、静脉内施用、鼻内施用和口服施用。可以依据诸如疾病类型、受试者的状况或靶部位等条件而适当地选择本发明药物组合物中所包含的肽的量、以及本发明药物组合物的剂型、施用的次数等。肽的单剂量一般为0.0001mg-1000mg，优选0.001mg-1000mg。
在其它方面，本发明涉及用于通过将WT1肽添加至抗原递呈细胞活化辅助T细胞从而在受试者中治疗或预防癌症的药物组合物，其包含包含编码所述WT1肽的多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
在其它方面，本发明涉及WT1肽、包含编码所述WT1肽的多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞在制备药物组合物中的用途。
另一方面，本发明涉及与WT1肽特异性结合的抗体，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。可通过本领域技术人员公知的手段或方法制备本发明的抗体。本发明的抗体可用于各种癌症的诊断、其预后等。
另一方面，本发明涉及用于确定HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性或HLA-DPB1*0501阳性受试者中WT1肽的存在或量的方法，其包括：
(a)使抗-WT 1抗体与来自所述受试者的样品反应；以及
(b)测定与所述样品中含有的WT1肽特异性结合的抗-WT1抗体的存在或量。例如，可以通过将抗-WT1抗体与来自HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性或HLA-DPB1*0501阳性受试者的样品温育，或将该抗-WT1抗体施用于HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性或HLA-DPB1*0501阳性受试者，并确定例如其位置、部位或量从而诊断癌症或其预后等。本发明的抗-WT1抗体是指可特异性识别本发明WT1肽的抗体。抗-WT1抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。抗-WT1抗体可以是经标记的。可应用已知的标记，诸如荧光标记或放射性标记用作标记。通过标记抗体，可以容易且快速地确定WT1肽的存在或量。
另一方面，本发明涉及确定WT1肽的存在或量的试剂盒，其包含作为基本组分的抗-WT1抗体。
此外，在WT1肽的存在或量的确定中，当所述WT1肽具有与HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力，可在具有此类MHC II类亚类的受试者中确定WT1肽的存在或量。
另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的药物组合物，其包含用WT1肽活化的辅助T细胞，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。通过活化的辅助T细胞诱导、生长或活化B细胞或T细胞而治疗或预防癌症。因此，本发明这一方面的药物组合物可与治疗或预防癌症的另一方法或用于其的药物组合物一起使用。用WT1肽活化辅助T细胞不仅包括用WT1肽直接活化，还包括用包含编码WT1肽的多核苷酸的表达载体或包含该表达载体的细胞间接活化。
除了作为活性组分的经活化的辅助T细胞外，本发明的药物组合物还可以包含例如载体、赋形剂等。可以依据诸如疾病类型、受试者的状况或靶部位等条件而适当地选择施用本发明药物组合物的方法。此类方法的实例包括但不限于：真皮内施用、皮下施用、肌内施用、静脉内施用、鼻内施用和口服施用。可以依据诸如疾病类型、受试者的状况或靶部位等条件而适当地选择本发明药物组合物中所包含的辅助T细胞量、以及本发明药物组合物的剂型、施用的次数等。
另一方面，本发明涉及用于治疗或预防癌症的方法，包括将WT1肽添加至抗原递呈细胞，并由此活化辅助T细胞，并将该活化的辅助T细胞施用于受试者，其中所述的WT1肽具有与HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子和HLA-DPB1*0501分子中任一个结合的能力。
另一方面，本发明涉及WT1肽在制备包含经活化的辅助T细胞的药物组合物中的用途。
在其它方面，本发明涉及在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性和HLA-DPB1*0501阳性受试者的任一中测定WT1-特异性辅助T细胞的存在或量的方法，其包括：
(a)使WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物与来自所述受试者的样品反应；以及
(b)测定样品中包含的识别复合物的辅助T细胞的存在或量。来自受试者的样品可以是任何的样品，只要其可能含有淋巴细胞。此类样品的实例包括体液，诸如血液或淋巴，以及组织。可应用本领域技术人员公知的方法，诸如生物素-抗生蛋白链菌素方法，制备例如作为四聚体或五聚体的WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物。可通过本领域技术人员公知的方法测量识别此类复合物的辅助T细胞的存在或量。在本发明的这一方面，该复合物可以是经标记的。可应用已知的标记，诸如荧光标记或放射性标记用作标记。通过标记它，可容易或快速地确定辅助T细胞的存在或量。本发明这一方面的方法可用于诊断癌症或其预后等。
因此，本发明还提供了用于在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性和HLA-DPB1*0501阳性受试者的任一中确定辅助T细胞的存在或量的组合物，其包含WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物。
此外，本发明还提供了用于在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性或HLA-DPB1*0501阳性受试者中确定辅助T细胞的存在或量的试剂盒，其包含WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物。
此外，在辅助T细胞的存在或量的确定中，当该WT1肽具有与HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502结合的能力时，能够在具有此类MHC II类亚类的受试者中确定辅助T细胞的存在或量。在这种情况下，应用WT1肽与能和该WT1肽结合的MHC II类分子的复合物。
在其它方面，本发明涉及应用WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物获得辅助T细胞的方法，其包括：
(a)使样品和该复合物反应；以及
(b)获得样品中所含有的识别该复合物的辅助T细胞。该复合物如上所述。样品可以是任何样品，只要其可能含有淋巴细胞。此类样品的实例包括来自受试者的样品，诸如血液，以及细胞培养物。可应用本领域技术人员公知的方法，诸如FACS或MACS获得识别该复合物的辅助T细胞。本发明允许培养所获得的辅助T细胞并将其用于治疗或预防各种癌症。
因此，本发明还涉及可通过应用WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物获得辅助T细胞的方法获得的辅助T细胞。
此外，本发明还涉及获得辅助T细胞的试剂盒，其包含WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物。
此外，在辅助T细胞的获得中，当该WT1肽具有与HLA-DRB1*0405分子和/或HLA-DRB1*1502分子结合的能力时，可能获得识别此类MHC II类亚类和WT1肽的复合物的辅助T细胞。在这种情况下，应用WT1肽和与其结合的MHC II类分子的复合物。
另一方面，本发明涉及在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性、HLA-DPB1*0501阳性、HLA-DRB1*0405阳性或HLA-DRB1*1502阳性受试者中测定WT1-特异性辅助T细胞的存在或量的方法，其包括：
(a)用WT1肽刺激外周血单核细胞、侵袭性淋巴细胞、肿瘤细胞、腹水中的细胞、胸水中的细胞、脑脊髓液中的细胞、骨髓细胞或淋巴结细胞；以及
(b)测定细胞因子的产生或辅助T细胞的反应，
其中细胞因子产生或辅助T细胞反应的存在或量的升高表明WT1特异性辅助T细胞的存在或量。在本发明该方法中应用的诸如外周血单核细胞、侵袭性淋巴细胞、肿瘤细胞、腹水中的细胞、胸水中的细胞、脑脊髓液中的细胞、骨髓细胞或淋巴结细胞的细胞可以来源自健康受试者或癌症患者。通过应用来自健康受试者的细胞，能够确定该受试者是否患有癌症，该受试者是否具有其的易感性等。通过应用来自癌症患者的细胞，能够预测WT1免疫治疗是否对该癌症患者具有效果，等等。用WT1肽刺激细胞可在体外或体内实施。由于其容易性，优选在体外刺激。可通过已知的方法确定细胞因子产生或辅助T细胞反应的存在，或细胞因子产生或辅助T细胞反应的量。
以下实施例更详细地阐明了本发明，但是不能将其理解为对本发明范围的限制。
实施例
1.制备抗原递呈细胞
从收集自健康供血者(HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性或HLA-DPB1*0501阳性)的外周血中分离外周血单核细胞(PBMCs)。在1％AB血清(Nabi，Miami，FL)、X-VIVO 15培养基(Cambrex)中以1×107细胞/孔的密度将PBMCs接种于6孔塑料板中，并培养2小时。培养后，移除悬浮细胞，并在1000IU/ml IL-4(PeproTech)、1000IU/ml GM-CSF(PeproTech)，1％AB血清和X-VIVO 15培养基中培养剩下的贴壁细胞。在第2和第4天，更换培养基，并加入IL-4和GM-CSF。第6天，将100IU/ml TNF-α加入到成熟的抗原递呈细胞。
2.WT1肽特异性CD4阳性T细胞的诱导
应用用于分离CD4阳性T细胞的RosetteSep(StemCell)从来源自相同供体中的血液分离CD4阳性T细胞。将该CD4阳性T细胞(3×106细胞)添加至24孔板的每一个孔。用加了20μg/ml WT1肽(SEQ ID No：2)的自体抗原递呈细胞(3×105细胞)刺激它们，并用25Gy放射辐射。在刺激后次日，加入20IU/ml IL-2。类似地，每隔一周应用加了20μg/ml WT1肽的抗原递呈细胞刺激经刺激的CD4阳性T细胞。此外，在第二次刺激后，每隔一天将培养基更换为含有IL-2的培养基。将通过总共3次刺激诱导的CD4阳性T细胞(分别将HLA-DRB1*1501和HLA-DPB1*0901阳性T细胞限定为TA28.1细胞和E 15.2细胞)用于以下实验。
3.IFN-γ的测量
在20μg/ml WT1肽的存在下培养TA28.1细胞和外周血单核细胞24小时，其中所述的外周血单核细胞来自该TA28.1细胞来源的受试者。培养后，应用EILISA试剂盒量化上清液中的IFN-γ的量。作为对照，应用了来自HLA-DRB1*1501阴性受试者的外周血单核细胞。结果如图1所示。其证实了TA28.1细胞识别对HLA-DRB1*1501分子特异的WT1肽，以增加IFN-γ的产量(即，活化)。
此外，应用ELISA试剂盒，证实了TA28.1细胞和E15.2细胞不产生IL-4和IL-10。结果如图2和3所示。其证实了TA28.1细胞和E15.2细胞是Th1细胞。
应用HLA-DPB1*0501/*0501阳性单核细胞进行以下实验。将细胞悬浮于X-VIVO(1％AB血清)，并加入20μg/ml WT1肽、10μg/ml布雷菲德菌素A和0.5μg/ml CD28/49d。在5％CO2下在37℃温育4小时。作为对照，应用没有添加WT1肽温育的细胞。在用缓冲液洗涤后，加入抗-CD3-perCP抗体和抗-CD4-APC抗体，并将其在4℃温育30分钟。用缓冲液洗涤后，应用BD Cytofix/Cytoperm固定细胞和透化处理(4℃，20分钟)。用BD perm/wash缓冲液洗涤后，加入抗-INF-γ-FITC(BD，克隆：B27)和抗-IL-17-PE(eBioscience，克隆：eBio64DEC17)，并在4℃温育30分钟。用缓冲液洗涤后，用FACSAria分析细胞。结果如图4所示。其证实了HLA-DPB1*0501阳性单核细胞生长，并产生IFN-γ和IL-17。
4.生长测试
通过[3H]-胸苷掺入方法进行生长测试。在96孔板中共培养TA28.1细胞(3×104细胞)和加了WT1肽并辐射过的外周血单核细胞(HLA-DRB1*1501阳性；1×105细胞)。共培养80小时后，加入37kBq/孔[3H]-胸苷(Amersham Biosciences)。再温育16小时，并应用β-闪烁计数器测量。作为计数/分钟(cpm)表示测量结果。作为对照，应用没有加肽的外周血单核细胞。此外，为了证实该活化信号对HLA-DRB1*1501分子是特异的，应用了抗-MHC I类抗体、抗-HLA-DR抗体、抗-HLA-DQ抗体和抗-HLA-DP抗体。结果如图5所示，其证实了TA28.1细胞被通过WT1肽和HLA-DRB1*1501的信号活化，并生长。其还证实该生长对HLA-DRB1*1501是特异的，因为其被抗-HLA-DR抗体抑制。
类似地，应用E15.2细胞进行生长测试。作为附加对照，应用了来自HLA-DPB1*0901阴性受试者的外周血单核细胞。结果如图6和7所示。其证实了E15.2细胞被通过WT1肽和HLA-DPB1*0901的信号活化，并生长。其还证实了该生长对HLA-DPB1*0901是特异的，因为其被抗-HLA-DP抗体抑制。
此外，还应用HLA-DPB1*0501/*0501阳性单核细胞进行生长测试。作为对照，还应用了来自HLA-DPB1*0501阴性受试者的外周血单核细胞。结果如图8和9所示。其证实了HLA-DPB1*0501/*0501阳性单核细胞被通过WT1肽和HLA-DPB1*0501的信号活化，并生长。其还证实了该生长对HLA-DPB1*0501是特异的，因为其被抗-HLA-DP抗体抑制。
此外，还用各种浓度的WT1肽进行了E15.2细胞的生长测试。应用的WT1肽的浓度为0.08、0.4、2、10、50、100或150μg/ml。结果如图10所示。其证实了WT1肽以浓度依赖的方式使E15.2细胞生长。
工业实用性
本发明提供了用WT1肽活化辅助T细胞的方法，其中所述WT1肽具有结合HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的能力，并提供了用于其的组合物，以及提供了用于通过活化辅助T细胞治疗和/或预防癌症的药物组合物等。因此，本发明可用于医药等领域，例如，应用于开发和制备用于预防或治疗高水平表达WT1基因的各种造血肿瘤和实体癌的药物组合物领域。
Figure IDA00002724507600011
Figure IDA00002724507600021
Figure IDA00002724507600031

Claims (1)

1.WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物在制备用于在HLA-DRB1*1501阳性、HLA-DPB1*0901阳性和HLA-DPB1*0501阳性受试者的任一中测定WT1-特异性辅助T细胞的存在或量的试剂中的用途，所述WT1肽由选自(1)-(2)的氨基酸序列组成：
(1)氨基酸序列Lys ArgTyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln MetHis Ser ArgLys His(SEQ ID No:2)；和
(2)包含氨基酸序列(1)的由10-25个氨基酸组成的氨基酸序列，
并且所述测定包括：
(a)使WT1肽和HLA-DRB1*1501分子、HLA-DPB1*0901分子或HLA-DPB1*0501分子的复合物与来自所述受试者的样品反应；以及
(b)测定样品中包含的识别该复合物的辅助T细胞的存在或量。
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