CN110051833A - 一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法，属于生物医学领域。所述癌症疫苗包括白血病细胞外泌体致敏的树突状细胞，其中，所述白血病细胞为经CD80和/或CD86过表达基因修饰的白血病细胞。进一步地，所述CD80和/或CD86过表达基因修饰是指利用负载CD80基因和/或CD86基因的慢病毒载体转染白血病细胞。癌症疫苗免疫原性强，比未经修饰的LEX致敏的DC疫苗显著增强。本发明制备一种新型的基于白血病外泌体的树突状细胞癌症疫苗的方法，克服了单用LEX诱导抗白血病效应较弱的缺陷，从而可以开发出更为有效的基于LEX的抗白血病疫苗。

Description

一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体地，涉及一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法。更具体地，涉及一种利用经CD80和/或CD86过表达修饰的白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法。
背景技术
近年来，基于外泌体的免疫治疗在动物模型及临床研究中均得到广泛应用。尽管肿瘤细胞来源的外泌体(Tumor cell derived exosomes，TEX)在动物实验中表现出良好的抗肿瘤效应，在人体临床试验中并未得到满意结果，利用腹水的TEX行结直肠癌免疫治疗的I期临床试验结果显示的抗肿瘤疗效也不理想。
研究显示，单由肿瘤细胞及白血病细胞分泌的外泌体(LEX)所诱导抗肿瘤及抗白血病效应很低，难以达到临床治疗的抗肿瘤强度。另外，近来不断有研究发现，TEX以及LEX中不仅携带有肿瘤细胞相关抗原，还常富集TGF-β1、PD-L1，Fas受体(Fasligand，FasL)等免疫抑制因子，这些抑制因子对体内免疫细胞具有抑制作用。因此，直接应用LEX可能会抑制体内的抗白血病免疫。
发明内容
为了克服LEX上述缺陷，发明人进行了大量的研究探索，意外地发现：首先通过CD80和CD86共刺激分子基因修饰的方法获得过表达CD80和CD86共刺激分子的白血病细胞，进而获得过表达CD80和CD86共刺激分子的LEX。应用此共刺激分子基因修饰的LEX体外靶向结合DC，一方面使得DC细胞获得白细胞细胞抗原，同时进一步增强DC的抗原递呈能力，从而获得了一种新型的DC疫苗，其具有较高的抗白血病免疫效应，从而完成本发明。
本发明一方面提供一种癌症疫苗，包括白血病细胞外泌体致敏的树突状细胞，其中，所述白血病细胞为经CD80和/或CD86过表达基因修饰的白血病细胞。
本发明的第二方面提供一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法，包括利用所述白血病细胞外泌体致敏树突状细胞的步骤，
其中，所述白血病细胞外泌体是经CD80和/或CD86过表达基因修饰的白血病细胞外泌体。
在本发明的一些实施方案中，所述癌症为白血病。
在本发明的另一些实施方案中，所述癌症为恶性肿瘤。
在本发明的实施方案中，所述经CD80和/或CD86过表达基因修饰是指将负载CD80基因和/或CD86基因的载体转染白血病细胞。
在本发明的一些实施方案中，所述载体为慢病毒载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为pLenO-DCE Greenp或LenO-DCEpuro。
在本发明的实施方案中，所述CD80基因是利用具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对扩增得到的。
在本发明的一些实施方案中，所述CD80基因具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
在本发明的实施方案中，所述CD86基因是利用具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的引物对扩增得到的。
在本发明的一些实施方案中，所述CD86基因具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明的癌症疫苗免疫原性高，比未经修饰的LEX致敏的DC疫苗显著增强。
本发明制备癌症疫苗的方法，克服了单用LEX诱导抗肿瘤效应较弱的缺陷。从而可以开发出更强的基于LEX的抗白血病疫苗。
本发明制备癌症疫苗的方法，不仅可以应用于白血病的免疫治疗，还可以推广到所有肿瘤的免疫治疗。
附图说明
图1示出了LEX的特征图：图1A可见电镜下观察的LEX，符合典型的外泌体形态，直径为30～100nm，形态均一，为圆形或椭圆形囊泡结构；通过对所提取的外泌体样品进行western blot蛋白分析可见，所提取的LEX样本均表达外泌体的特征性蛋白CD9、CD63、CD81、HSP70(图1B)。图1C和图1D示出了L1210白血病细胞转染携带共刺激分子的慢病毒载体后，其表面CD80和CD86分子表达水平显著上调。
图2示出了共刺激分子基因修饰的LEX对靶向结合的DC细胞生物特性的影响，由图可见，体外基因修饰的LEX致敏的DC表面CD80、CD86和CD11c分子的表达较普通LEX致敏的DC明显上调(图2A)，同时致敏DC的细胞因子TNF-α、IL-12p70的分泌水平同样较较普通LEX致敏的DC显著升高(图2B、C)。说明共刺激分子基因修饰的LEX的靶向结合促进了DC表型的成熟，进一步增强了其抗原递呈功能。ImDC：未成熟树突状细胞；DCLEX：普通LEX致敏的树突状细胞，作为对照组。
图3示出了共刺激分子基因修饰的LEX靶向结合的DC可诱导更强的抗原特异性CD4+T细胞增殖(图3A)和抗白血病CTL反应(图3B、C、D)，其中DCLEX-CD8086作用最强。**表示p<0.01，*表示p<0.05。
图4示出了共刺激分子基因修饰的LEX致敏DC可有效发挥肿瘤治疗效应。由图4A可见，三组接种了共刺激分子基因修饰的LEX的靶向结合的DC疫苗的荷瘤小鼠，均有不同程度的小鼠肿瘤逐渐消退，肿瘤消退的小鼠分别为(40％，40％和60％)。而且与对照组小鼠相比，肿瘤的生长明显迟缓。同时接种了共刺激分子基因修饰的LEX的靶向结合的DC疫苗的荷瘤小鼠的中位生存期明显长于对照小鼠(4B)。DCLEX：LEXnull致敏的树突状细胞；DCLEX-CD80：LEX-CD80致敏的树突状细胞；DCLEX-CD86：LEX-CD86致敏的树突状细胞；DCLEX-CD8086：LEX-CD8086致敏的树突状细胞。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
实施例1 CD80和CD86过表达的L1210白血病细胞源性外泌体的制备
一、白血病细胞的培养
配置好含有10％胎牛血清的1640完全培养基，所述培养基内含100U/mL青霉素钠和100μg/mL硫酸链霉素，将冻有L1210细胞的冻存管从液氮罐中取出后直接投入37℃温水中，并轻轻摇动使其尽快融化，取出冻存管，用酒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，转移到15mL尖底离心管，并滴加10倍以上的培养液，离心1,200rpm×10min，弃上清，新鲜的完全培养液重悬后接种至培养瓶。
培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱内孵育，细胞呈悬浮生长，每1～2天换液或传代。
二、慢病毒载体的构建
1.慢病毒载体制备
小鼠来源CD80和CD86基因均用PCR方法扩增：
CD80引物设计为：
正向引物：5'-CATAGAAGATTCTAGAATGGCTTGCAATTGTCAGTT-3'(SEQ ID NO.1)；
反向引物：5'-ATTTAAATTCGAATTCCTAAAGGAAGACGGTCTGT-3'(SEQ ID NO.2)。
CD86引物设计为：
正向引物：5'-ATGGACCCCAGATGCACCAT-3'(SEQ ID NO.3)；
反向引物为：5'-TCACTCTGCATTTGGTTTTG-3'(SEQ ID NO.4)。
扩增得到的CD80基因核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.5):
ATGGCTTGCAATTGTCAGTTGATGCAGGATACACCACTCCTCAAGTTTCCATGTCCAAGGCTCATTCTTCTCTTTGTGCTGCTGATTCGTCTTTCACAAGTGTCTTCAGATGTTGATGAACAACTGTCCAAGTCAGTGAAAGATAAGGTATTGCTGCCTTGCCGTTACAACTCTCCTCATGAAGATGAGTCTGAAGACCGAATCTACTGGCAAAAACATGACAAAGTGGTGCTGTCTGTCATTGCTGGGAAACTAAAAGTGTGGCCCGAGTATAAGAACCGGACTTTATATGACAACACTACCTACTCTCTTATCATCCTGGGCCTGGTCCTTTCAGACCGGGGCACATACAGCTGTGTCGTTCAAAAGAAGGAAAGAGGAACGTATGAAGTTAAACACTTGGCTTTAGTAAAGTTGTCCATCAAAGCTGACTTCTCTACCCCCAACATAACTGAGTCTGGAAACCCATCTGCAGACACTAAAAGGATTACCTGCTTTGCTTCCGGGGGTTTCCCAAAGCCTCGCTTCTCTTGGTTGGAAAATGGAAGAGAATTACCTGGCATCAATACGACAATTTCCCAGGATCCTGAATCTGAATTGTACACCATTAGTAGCCAACTAGATTTCAATACGACTCGCAACCACACCATTAAGTGTCTCATTAAATATGGAGATGCTCACGTGTCAGAGGACTTCACCTGGGAAAAACCCCCAGAAGACCCTCCTGATAGCAAGAACACACTTGTGCTCTTTGGGGCAGGATTCGGCGCAGTAATAACAGTCGTCGTCATCGTTGTCATCATCAAATGCTTCTGTAAGCACAGAAGCTGTTTCAGAAGAAATGAGGCAAGCAGAGAAACAAACAACAGCCTTACCTTCGGGCCTGAAGAAGCATTAGCTGAACAGACCGTCTTCCTTTAG。
扩增得到的CD86基因核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO.6):
ATGGACCCCAGATGCACCATGGGCTTGGCAATCCTTATCTTTGTGACAGTCTTGCTGATCTCAGATGCTGTTTCCGTGGAGACGCAAGCTTATTTCAATGGGACTGCATATCTGCCGTGCCCATTTACAAAGGCTCAAAACATAAGCCTGAGTGAGCTGGTAGTATTTTGGCAGGACCAGCAAAAGTTGGTTCTGTACGAGCACTATTTGGGCACAGAGAAACTTGATAGTGTGAATGCCAAGTACCTGGGCCGCACGAGCTTTGACAGGAACAACTGGACTCTACGACTTCACAATGTTCAGATCAAGGACATGGGCTCGTATGATTGTTTTATACAAAAAAAGCCACCCACAGGATCAATTATCCTCCAACAGACATTAACAGAACTGTCAGTGATCGCCAACTTCAGTGAACCTGAAATAAAACTGGCTCAGAATGTAACAGGAAATTCTGGCATAAATTTGACCTGCACGTCTAAGCAAGGTCACCCGAAACCTAAGAAGATGTATTTTCTGATAACTAATTCAACTAATGAGTATGGTGATAACATGCAGATATCACAAGATAATGTCACAGAACTGTTCAGTATCTCCAACAGCCTCTCTCTTTCATTCCCGGATGGTGTGTGGCATATGACCGTTGTGTGTGTTCTGGAAACGGAGTCAATGAAGATTTCCTCCAAACCTCTCAATTTCACTCAAGAGTTTCCATCTCCTCAAACGTATTGGAAGGAGATTACAGCTTCAGTTACTGTGGCCCTCCTCCTTGTGATGCTGCTCATCATTGTATGTCACAAGAAGCCGAATCAGCCTAGCAGGCCCAGCAACACAGCCTCTAAGTTAGAGCGGGATAGTAACGCTGACAGAGAGACTATCAACCTGAAGGAACTTGAACCCCAAATTGCTTCAGCAAAACCAAATGCAGAGTGA。
利用双酶切法将经过PCR扩增的纯化CD80和CD86的cDNA片段分别插入pLenO-DCEGreenp和LenO-DC Epuro质粒的EcoR I和BamH I位点。
2.慢病毒包装及滴度测定
然后重组慢病毒(1.7μg)、pSPAX2(1.13μg)和pMD2G(0.57μg)用LipofiterTM转染试剂共转染293T细胞，转染后48和72h分别两次收集病毒上清，收集后以0.45μm滤器过滤，4℃、72,000g/min离心120min，所得的病毒载体分别被命名为LV-CD80-GFP和LV-CD86-puro，再用新鲜培养液重悬病毒沉淀，经过稀释计数法进行滴度测定得病毒滴度为2×108FU/mL，-80℃保存备用。
三、慢病毒转染L1210细胞及干扰效率测试
选择生长旺盛，处于对数期的L1210细胞，调整细胞浓度为105/mL。预先将细胞铺于96孔板中，100μL/孔，设3个复孔，然后放入37℃、5％CO2培养箱中继续培养。第二天，在各孔中分别加入LV-CD80、LV-CD86，MOI值为100。加入病毒后将细胞置于平板离心机中，以2,000g、4℃条件下平板离心90min。然后置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h后换液，继续培养48h，随后在倒置荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光表达情况。收集细胞，4℃、300g下离心5min，用含有10％FBS的RPMI-1640培养液重悬，继续按照前述培养方法扩大培养。通过流式筛选，获得GFP阳性稳转CD80的L1210细胞；通过puromycin筛选，当对照组细胞完全死亡后，扩增感染组细胞即获得稳转CD86的L1210细胞。按前述感染方法，将稳转CD86的L1210细胞继续感染LV-CD80，观察绿色荧光表达情况，扩大培养后，通过流式和puromycin筛选，即获得稳转CD80和CD86的L1210细胞。
四、CD80和CD86基因修饰的白血病细胞外泌体分离及特征鉴定
1.外泌体提取
1)收集对数期L1210细胞，加入PBS，吹打混匀后1,200rpm离心10min，弃上清。
2)调整细胞密度为5×106/mL，转移至AIM-V无血清培养基中，置于37℃、5％CO2培养箱内孵育36h，离心收集细胞培养上清。
3)收集无血清培养的L1210细胞上清液，800g低温离心(4℃，下同)30min去除细胞取上清液。
4)10,000g低温离心1h去除细胞碎片取上清液。
5)100,000g低温超速离心1h弃上清液。
6)将沉淀悬浮于PBS中，再于4℃下100,000×g超速离心60min，沉淀用适量PBS重悬，获得白血病细胞来源的外泌体，收集并-80℃冻存备用。将来源于L1210、L1210-CD80、L1210-CD86和L1210-CD8086白血病细胞的外泌体分别命名为LEXnull、LEX-CD80、LEX-CD86和LEX-CD8086。
2.LEX的蛋白定量测定(BCA法)
1)将蛋白标准品稀释为0.5mg/mL的工作液，并按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板标准品孔中，用标准品稀释液将每孔补足至20μL。
2)BCA工作液的配置：A液与B液按50:1比例配置成BCA工作液。
3)将用ddH2O稀释1倍后的样品20μL加至96孔板的样品孔。每个样品均做3个复孔。
4)每孔加入提前配置好并避光保存的BCA工作液200μL，用锡箔纸包裹后在37℃烘箱内孵育30min。
5)在波长562nm处测定各孔OD值。
6)制做标准曲线，并计算样品浓度的平均值，由于测定时蛋白样品已经稀释了1倍，因而计算后的样品需要再乘以2，从而确定蛋白样品终浓度。
3.外泌体特征鉴定
投射电镜观察外泌体样本形态特征：
1)用parafilm膜平整粘贴于玻璃表面。
2)将50μL外泌体样本滴于膜上。
3)将带有formvar支持膜的铜网覆盖在样品滴上，使其漂浮(有支持膜的那面朝下)3-10min，使样本吸附到支持膜上。
4)将50μL 2％的磷钨酸染液滴于parafilm膜上。
5)将铜网移离样品液滴，用小片滤纸置于铜网边缘以吸去铜网上液体，再将此吸附有样品的铜网覆盖到2％的磷钨酸染液液滴上漂浮3min，滤纸沿铜网边缘吸干，白炽灯下干燥10min。
6)投射电镜(Phillip CM120)下观察。
如图1a所示，电镜下观察可见LEX为直径在40-100nm的盘状囊泡，符合典型外泌体的形态特征。
Westernblot检测所分离的外泌体中Hsp70、CD9、CD63和CD81表达情况：
1)将裂解液和酶抑制剂以体积比50：1混合，取适量的裂解液混合物加入到外泌体样品沉淀中。
2)冰上放置20min后，4℃，12,000g离心20min。
3)收集上清，Bradford法蛋白质浓度测定。
4)在冰上配制SDS聚丙烯酰胺凝胶(分离胶与浓缩胶)。
5)将冰上配置好的分离胶混匀后缓慢注入两玻璃板之间，异丙醇液封，室温静止30min至胶凝固，小心弃去异丙醇并用蒸馏水清洗，吸干残留。
6)注入SDS-PAGE浓缩胶玻，小心插入齿梳，排净气泡，室温静置直到胶完全凝固。
7)将玻璃板放进电泳槽，用1×电泳缓冲液加满电泳槽，轻轻拔出梳子，每个样品按30μg上样，空置孔加入15μL加样缓冲液。
8)接通电源，调节电压80V，电泳约40min后，当溴酚蓝染料从浓缩胶进入分离胶，调节电压至120V，电泳至溴酚蓝到达凝胶底部停止。
9)剥胶板小心撬开玻板，将胶浸入转膜缓冲液中平衡10min。依据胶的大小裁剪PVDF膜，放入甲醇中浸泡10min后置于转膜缓冲液中平衡2-3min。
10)以转膜架子黑色面为底，依次放置毡垫、3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸、毡垫，驱赶干净气泡，夹紧架子，放入电转仪中。
11)加入转膜缓冲液，放入冰盒，冰浴下恒流200mA，转膜60min，转膜结束后取出杂交膜。
12)将完成蛋白转膜的PVDF膜置于5％TBS配置的脱脂牛奶中于室温摇床上封闭2h。
13)根据抗体说明书，一抗稀释液均按照1:1000稀释一抗(抗Hsp70、抗CD63、抗CD9、抗CD81)。
14)4℃孵育过夜。
15)1×TBST室温洗3次，每次10min。
16)按照一定比例稀释二抗(1:1000)室温孵育1h。
17)1×TBST室温洗3次，每次10min。
18)配制ECL发光显色液，向膜上滴加适量进行化学发光，用Bio-Red ChemiDocTMXRS+化学发光成像系统检测图像。
19)定量使用ImageLab软件测定灰度值。
如图1B所示：在LEXnull、LEX-CD80、LEX-CD86和LEX-CD8086中均能检测出CD9、CD63、CD81与HSP70这些外泌体标志性蛋白，证实发明人所获得的外泌体样本为典型白血病细胞来源的外泌体。
五、CD4+T细胞增殖实验与细胞因子检测
1.CD4+T细胞增殖检测
(1)将L1210细胞设置为特异性靶细胞，p388细胞对照靶细胞，均接受4000rad剂量的照射10分钟，使其失去增殖活性，但保留其抗原性。
(2)经PBS、LEX、LEX-CD80、LEX-CD80与LEX-CD8086免疫的小鼠脾源性CD4+T细胞经上述步骤分离纯化后用含IL-2(20IU/ml)的完全培养基重悬，以2×105/孔的密度铺板，同时加入抗CD3Ab(1μg/mL)，均为3复孔。
(3)随后，每孔中分别加入2×104个经放射灭活的L1210细胞或p388细胞，在37℃，5％CO2浓度下共培养72h。
(4)每孔加入0.5μCi的3H-TdR继续培养16小时后，将细胞用细胞收集器吸附在玻璃纤维滤纸片上，再用生理盐水充分洗涤干净，将游离的3H-TdR洗除；滴加1-2mL的5％三氯醋酸以固定细胞，然后用无水乙醇脱水、脱色,烘干滤纸片后，用镊子分别依次放进装有4mL闪烁液的塑料管里，用β液闪仪检测样品的cpm值，计算本底和样品的平均cpm值。由此计算出CD4+T细胞百分比。
2.ELISA法检测CD4+T分泌的Th1细胞因子
收集获得的细胞上清，通过ELISA法检测其中Th1细胞因子，IFN-γ和IL-2的含量。具体步骤如下：
(1)将IFN-γ和IL-2ELISA试剂盒提前从冰箱中取出，室温下复温；
(2)按如下方法建立标准曲线：将标准品/标本的稀释液1.0mL(1b)加入冻干的标准品(1a)中，待彻底溶解后，静置15分钟后将其充分混匀(浓度为1000pg/mL)。第一孔加入混匀后标准品200μL，用加样枪从第一孔中析出100μL，加入第二孔，如此反复对倍稀释至第7孔，最后从第7孔中吸出100μL弃去，第8孔为空白对照孔；
(3)从恢复至室温的密封袋中取出将所需的板条，除空白孔之外，相应孔中分别加入对应的标本(100μL/孔)，再用封板胶纸封住反应孔，将反应板置于37℃、5％CO2培养箱中培养90分钟；
(4)洗板5次；
(5)除空白孔外，每孔加生物素化抗体工作液100μL，然后将反应孔用封板胶纸封住，于37℃、5％CO2培养箱中培养60分钟；
(6)继续洗板4次；
(7)除空白孔外，每孔再加入酶结合物工作液100μL，然后将反应孔用封板胶纸封住，37℃、5％CO2培养箱孵育30分钟；
(8)继续洗4次板；
(9)每孔加入100μL的显色剂，避光在37℃孵箱中孵育10-15分钟；
(10)每孔加入100μL的终止液，混匀后立刻测量OD450值(5分钟内)。
3检测CD8+T细胞CTL反应
应用CytoTox96细胞毒分析试剂盒，采用LDH法检测CD8+T细胞CTL反应强度。以经上述LEX免疫的小鼠脾脏分离的CD8+T细胞作为效应细胞，经照射灭活的L1210细胞作为特异性靶细胞，p388细胞则作为对照靶细胞。将效/靶比依次设为(E/T)为6.25:1，12.5:1，25:1以及50:1。另设靶细胞自然释放，靶细胞最大释放，效应细胞自然释放孔，每孔设3个复孔。具体操作步骤如下：。
(1)致敏小鼠体内分离纯化得到的CD8+T细胞用PBS+1％FBS洗涤2次后用含IL-2(20IU/mL)的完全培养基重悬，调整细胞浓度至5×106/mL，随后取部分细胞悬液分别稀释至如下浓度：2.5×106/mL，1.25×106/mL，0.625×106/mL，0.3×106/mL；
(2)靶细胞(L1210细胞或p388细胞)用PBS+1％FBS重悬，调整细胞浓度至1×105/mL；
(3)分别在96孔圆底培养板中，每孔加入50μL的效应细胞和50μL的靶细胞、100μL效应细胞、100μL靶细胞，以及100μL的PBS+1％FBS培养液，每孔均设4个复孔；
(4)300g，于室温下，离心4分钟后，37℃、5％CO2培养箱中培养4小时；
(5)在离心前，提前45分钟向靶细胞最大释放孔中加入(10×)10μl裂解液以裂解细胞；
(6)结束培养后，室温下300g离心平板4分钟；
(7)从每一孔中吸取出50μl上清液转移至一个新的96孔板中，并作标记；
(8)融化检测的缓冲液(Assay Buffer)后吸取12mL，将其加入到一瓶SubstrateMix粉末中，轻轻颠倒摇晃使得底物完全溶解，锡箔纸包裹，避免强光直射底物，需立即使用；
(9)向每孔中加入50μl配好的底物混合物，用锡箔纸盖住或将平板放在暗室中以避光，在室温孵育30分钟；
(10)最后，向每孔中加入50μl终止液,尽量避免孔内出现气泡，若有气泡产生可用1mL注射器针头将其戳破。加入终止液后，尽快在490或492nm下测量吸光值；
(11)将所有实验孔、效应细胞、靶细胞自发LDH释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值进行计算；
(12)将靶细胞最大LDH释放对照的吸光值再减去体积校正对照吸光值的均值；
(13)将步骤11和12中获得的经过校正的值代入下列公式，从而计算每个效靶比所产生的细胞毒性百分比。
CD4+T细胞在抗肿瘤免疫中起到重要作用，因而发明人观察了LEX-CD80、LEX-CD80与LEX-CD8086对CD4+T细胞的增殖与其Th1细胞因子释放的影响。如图3A，相较于PBS与LEXnull，LEX-CD80、LEX-CD86、及LEX-CD8086体内致敏的CD4+T细胞在L1210细胞刺激下均可显著增殖。其中以LEX-CD8086致敏的T细胞的增殖效应最为显著，差异具有显著性(p<0.01)。为进一步验证LEX-CD8086对致敏CD4+T细胞的增殖诱导效应具有抗原特异性，发明人利用另一种携带不同抗原的白血病细胞株p388细胞对LEX-CD8086致敏的CD4+T细胞进行刺激，结果显示在p388细胞刺激下，CD4+T细胞几乎无增殖反应，说明LEX-CD8086所诱导的CD4+T细胞增殖效应具有抗原特异性。
发明人进一步检测了LEX-CD8086致敏的CD4+T分泌Th1细胞因子的水平。如图3B、C所示，经L1210细胞作为靶向抗原刺激后，LEX-CD80、LEX-CD86、LEX-CD8086均能有效促进CD4+T细胞分泌Th1型细胞因子(IFN-γ和IL-2)。四组CD4+T细胞(LEXnull、LEX-CD80、LEX-CD86、LEX-CD8086)分泌的IFN-γ分别为45.36±5.37pg/mL，76.13±3.35pg/mL，77.12±3.57pg/mL，116.75±8.97pg/mL，IL-2分别为56.60±4.36pg/mL，64.81±3.76pg/mL，69.62±3.42pg/mL，92.15±8.57pg/mL，其中LEX-CD80、LEX-CD86分别和LEXnull比较(p<0.05)，其中LEX-CD8086组细胞因子分泌最多，和LEXnull比较(p<0.01)，说明共刺激分子基因修饰的LEX-CD80与LEX-CD86以及LEX-CD8086可有效地促进Th1细胞因子分泌，其中双基因修饰的LEX-CD8086刺激作用最强。而在非特异性抗原p388细胞刺激后，LEX-CD8086致敏的CD4+T细胞分泌IFN-γ和IL-2的分泌水平均较低，显著低于L1210特异性抗原刺激后水平，说明共刺激分子基因修饰的LEX所诱导的Th1细胞因子分泌具有抗原特异性。
为研究LEX-CD80、LEX-CD86及LEX-CD8086疫苗可否有效诱导抗原特异性的抗白血病CTL效应，发明人比较了不同效靶比下，各组疫苗诱导的细胞特异性CTL反应强度。如图3所示，经统计分析可见：当效靶比为12.5:以下时，各组间均无统计学差异。当效靶比为等于提高至25:1时，LEX-CD86及LEX-CD8086组的细胞杀伤率明显地高于LEXnull组(p<0.05)，且随着效靶比提高，四组疫苗诱导的CTL杀伤百分数也随之增加。而LEX-CD8086/L1210组在效靶比为25:1，50:1时，其所诱导的CTL细胞毒杀伤率均显著地高于LEX-CD80、LEX-CD86组。说明双共刺激分子基因修饰的LEX(LEX-CD8086)所诱导CD8+TCTL杀伤效应最强。为进一步证实LEX所诱导的CD8+T细胞CTL免疫应答具有抗原特异性，发明人同时比较分析了LEX对/L1210细胞和对p388细胞的杀伤率。结果说明当效靶比为6.25，12.5，25，50时，LEX对p388细胞未表现出杀伤活性。说明LEX-CD8086疫苗所诱导的CD8+CTL效应具有抗原特异性。
实施例2高表达CD80和CD86的L1210白血病细胞外泌体体外靶向结合的树突状细胞疫苗(DCLEX-CD80，DCLEX-CD86，DCLEX-CD8086)的制备和应用。
1.树突状细胞(dendritic cells，DCs)的诱导培养
小鼠骨髓DC的诱导培养：
1)取6～8周小鼠，CO2处死后，75％酒精浸泡1min。
2)剪取其胫骨和股骨，置入培养皿中，去除肌肉等组织，暴露骨端。
3)准备10mL针筒，注满1640培养基剪开股骨两端，用1mL针筒冲洗骨髓腔，可见长条红色骨髓冲出。
4)收集冲洗液入50mL离心管，冲洗培养皿，4℃、1,200rpm离心5min。
5)弃上清，加入3mL红细胞裂解液，裂解4分钟，加入1640培养液终止。4℃、1,200rpm离心5min。
6)弃上清，加入1640洗涤一次，离心，4℃、1,200rpm离心10min，弃上清。
7)配制10％FBS培养液50mL，加入1支GM-CSF(20ng/L)，1支IL-4(20ng/L)。取18mL重悬细胞。接种于6孔板中，每孔3mL，5％CO2培养箱中培养。
8)培养液变微黄，换液：将6孔板稍倾斜，每孔去除2mL液体，加入完全培养液(每孔2mL)，补足细胞因子。
9)培养第六天，收集DC细胞。
10)第6天轻轻吹打收集DC，计数，每1×106个DC分别加入10ug的各种LEX共孵育过夜。
11)收集致敏的DC细胞，备用。这些DC细胞分别称为：DCLEXnull(即没有基因修饰的LEX结合的DC细胞)，DCLEX-CD80(即LEX-CD80结合的DC细胞)，DCLEX-CD86(即LEX-CD86结合的DC细胞)，DCLEX-CD8086(即LEX-CD8086结合的DC细胞)。
2.CD80和CD86过表达修饰的LEX体外靶向结合的DC疫苗诱导抗白血病免疫保护作用
1)6-8周龄DBA/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只；
2)在第0、7、14天给予DBA/2小鼠在大腿内侧皮下分别接种100μL PBS溶液/只、1×106DCLEX/只，1×106DCLEX-CD80/只、1×106DCLEX-CD86/只以及1×106DCLEX-CD8086/只；
3)取对数期生长的L1210白血病细胞，800g离心5分钟，弃上清，无血清DMEM培养基重悬细胞，800g离心5分钟，细胞计数。细胞重悬于PBS中，调整细胞密度至5×106/mL。各组中每只小鼠同侧大腿外侧皮下注射细胞悬液各100μL(含有5×105个细胞)。
4)接种肿瘤细胞后，观察各组小鼠肿瘤生长情况并记录。
由表1可见，经DCLEX-CD80、DCLEX-CD86、DCLEX-CD8086疫苗免疫的小鼠，接种肿瘤后，其肿瘤发生率较DCLEX显著降低，其中DCLEX-CD8086疫苗免疫的小鼠的肿瘤发生率最低，仅有25％。
表1
疫苗 接种肿瘤类型 肿瘤发生率(％)
PBS L1210 100
DC L1210 100
DC<sub>LEX</sub> L1210 60
DC<sub>LEXCD80</sub> L1210 40
DC<sub>LEXCD86</sub> L1210 45
DC<sub>LEXCD8086</sub> L1210 25
3.CD80和CD86过表达修饰的LEX体外靶向致敏的DC对荷瘤小鼠肿瘤的治疗作用
1)6-8周龄的DBA/2雌性小鼠随机分为5组，每组10只。
2)取对数期生长的L1210白血病细胞，800g离心5min弃上清，无血清DMEM培养基重悬细胞，800g离心5min，细胞计数。细胞重悬于PBS中，调整细胞密度至5×106/mL。各组中每只小鼠侧大腿外侧皮下注射细胞悬液各100μL(含有5×105个细胞)。
3)5天后，待大腿皮下可触及米粒大小肿瘤结节时，各组小鼠同侧大腿内侧皮下分别接种100μL PBS及上述DC疫苗。
4)每日观察小鼠肿瘤生长情况(游标卡尺测量小鼠荷瘤直径)，记录小鼠生存率。
由图4可见，三组接种了共刺激分子基因修饰的LEX的靶向结合的DC疫苗的荷瘤小鼠，均有不同程度的小鼠肿瘤逐渐消退，肿瘤消退的小鼠分别为(40％，40％和60％)。而且与对照组小鼠相比，肿瘤的生长明显迟缓(图4A)。同时接种了共刺激分子基因修饰的LEX的靶向结合的DC疫苗的荷瘤小鼠的中位生存期明显长于对照小鼠(图4B)。这说明共刺激分子基因修饰的LEX的靶向结合的DC疫苗完全可以发挥抗白血病的治疗效应。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学医学院附属新华医院
<120> 一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法
<130> XY-2019-1-W-049
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
catagaagat tctagaatgg cttgcaattg tcagtt 36
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttaaattc gaattcctaa aggaagacgg tctgt 35
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggacccca gatgcaccat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcactctgca tttggttttg 20
<210> 5
<211> 921
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggcttgca attgtcagtt gatgcaggat acaccactcc tcaagtttcc atgtccaagg 60
ctcattcttc tctttgtgct gctgattcgt ctttcacaag tgtcttcaga tgttgatgaa 120
caactgtcca agtcagtgaa agataaggta ttgctgcctt gccgttacaa ctctcctcat 180
gaagatgagt ctgaagaccg aatctactgg caaaaacatg acaaagtggt gctgtctgtc 240
attgctggga aactaaaagt gtggcccgag tataagaacc ggactttata tgacaacact 300
acctactctc ttatcatcct gggcctggtc ctttcagacc ggggcacata cagctgtgtc 360
gttcaaaaga aggaaagagg aacgtatgaa gttaaacact tggctttagt aaagttgtcc 420
atcaaagctg acttctctac ccccaacata actgagtctg gaaacccatc tgcagacact 480
aaaaggatta cctgctttgc ttccgggggt ttcccaaagc ctcgcttctc ttggttggaa 540
aatggaagag aattacctgg catcaatacg acaatttccc aggatcctga atctgaattg 600
tacaccatta gtagccaact agatttcaat acgactcgca accacaccat taagtgtctc 660
attaaatatg gagatgctca cgtgtcagag gacttcacct gggaaaaacc cccagaagac 720
cctcctgata gcaagaacac acttgtgctc tttggggcag gattcggcgc agtaataaca 780
gtcgtcgtca tcgttgtcat catcaaatgc ttctgtaagc acagaagctg tttcagaaga 840
aatgaggcaa gcagagaaac aaacaacagc cttaccttcg ggcctgaaga agcattagct 900
gaacagaccg tcttccttta g 921
<210> 6
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggacccca gatgcaccat gggcttggca atccttatct ttgtgacagt cttgctgatc 60
tcagatgctg tttccgtgga gacgcaagct tatttcaatg ggactgcata tctgccgtgc 120
ccatttacaa aggctcaaaa cataagcctg agtgagctgg tagtattttg gcaggaccag 180
caaaagttgg ttctgtacga gcactatttg ggcacagaga aacttgatag tgtgaatgcc 240
aagtacctgg gccgcacgag ctttgacagg aacaactgga ctctacgact tcacaatgtt 300
cagatcaagg acatgggctc gtatgattgt tttatacaaa aaaagccacc cacaggatca 360
attatcctcc aacagacatt aacagaactg tcagtgatcg ccaacttcag tgaacctgaa 420
ataaaactgg ctcagaatgt aacaggaaat tctggcataa atttgacctg cacgtctaag 480
caaggtcacc cgaaacctaa gaagatgtat tttctgataa ctaattcaac taatgagtat 540
ggtgataaca tgcagatatc acaagataat gtcacagaac tgttcagtat ctccaacagc 600
ctctctcttt cattcccgga tggtgtgtgg catatgaccg ttgtgtgtgt tctggaaacg 660
gagtcaatga agatttcctc caaacctctc aatttcactc aagagtttcc atctcctcaa 720
acgtattgga aggagattac agcttcagtt actgtggccc tcctccttgt gatgctgctc 780
atcattgtat gtcacaagaa gccgaatcag cctagcaggc ccagcaacac agcctctaag 840
ttagagcggg atagtaacgc tgacagagag actatcaacc tgaaggaact tgaaccccaa 900
attgcttcag caaaaccaaa tgcagagtga 930

Claims (10)

1.一种癌症疫苗，其特征在于，包括白血病细胞外泌体致敏的树突状细胞，其中，所述白血病细胞为经CD80和/或CD86过表达基因修饰的白血病细胞。
2.一种利用白血病细胞外泌体制备癌症疫苗的方法，其特征在于，包括利用所述白血病细胞外泌体致敏树突状细胞的步骤，
其中，所述白血病细胞外泌体是经CD80和/或CD86过表达基因修饰的白血病细胞外泌体。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症为肿瘤(包括白血病)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症为恶性肿瘤。
5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述经CD80和/或CD86过表达基因修饰是指将负载CD80基因和/或CD86基因的载体转染白血病细胞。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述载体为慢病毒载体。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CD80基因是利用具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的引物对扩增得到的。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CD80基因具有SEQ ID NO.5所示核苷酸序列。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述CD86基因是利用具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的引物对扩增得到的。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述CD86基因具有SEQ ID NO.6所示核苷酸序列。
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