TW202111115A - 免疫療法疫苗的製造方法 - Google Patents
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Abstract
提供一種疫苗用於癌症免疫療法的方法。如果將外泌體在室溫下放置一定時間或更長時間，則無法將其與樹突狀細胞融合。因此，有必要在保持外泌體膜結構的同時促進蛋白質的肽化條件下進行熱處理，該條件為56℃以下且30分鐘以下。在較高溫度條件下，蛋白質會變性並且無法保持抗原性。因此，將從癌症患者的癌細胞或體液(例如血液中分離出的外泌體)，在56℃以下加熱30分鐘以下以促進外泌體中蛋白質酶的失活，使蛋白水解酶和脂解酶失活。接下來，將該外泌體引入或共培養到源自癌症患者或健康受試者的血液的樹突狀細胞中。
Description
本發明涉及使用癌細胞外泌體和樹狀細胞用於製造免疫療法的樹狀細胞疫苗。
免疫療法可分為兩種。一種是以癌細胞的特定蛋白質為標記來提示特異性抗體，以產生攻擊癌細胞之免疫細胞(CTL)的方法(獲得免疫)。另一種是識別外源蛋白質並消除異物的方法(自然免疫)。現今的免疫療法將從患者血液單核細胞中分離誘導出的樹狀細胞(DC：樹狀細胞)與從患者得來的癌細胞(包括癌前趨細胞)進行融合得到融合細胞，將此融合細胞通過皮下注射單獨給藥或與刺激細胞傷害性T細胞反應和體液免疫反應的細胞因子一起給藥。
現今的免疫療法中，樹狀細胞與癌細胞的融合效率低，僅約10%，所製成的疫苗抗原效率不佳。另一方面，將外泌體導入DC的方法中，對一劑疫苗所需的105DC而言，製備108至109個外泌體並不困難，並且絕大多數的DC都能成功攝入外泌體。
此外，從正常成熟的樹狀細胞分泌的外泌體和自然殺手細胞(Natural killer cell,NK細胞)NK細胞分泌的外泌體可抑制癌細胞增殖、抑制調節性T細胞(Treg)、抑制MDSC和抑制血管生成等因而具有破壞癌組織的作
用。因此，從成熟的樹狀細胞分泌的外泌體和NK細胞分泌的外泌體一直被用於癌症治療。
另一方面，癌細胞分泌的外泌體有加劇癌細胞惡化並使其基因突變的趨勢。另外，癌細胞分泌的外泌體可導致抑制癌細胞生長的免疫細胞失活。在這種情況下，癌細胞對疫苗中樹狀細胞的抗原呈遞功能產生免疫，融合細胞扮演抗原呈遞細胞(APC)，細胞傷害性T細胞(CTL)和自然手細胞(NK)即使被誘導，CTL活性和NK活性也會喪失抗癌活性。也就是說，癌細胞為了逃避免疫療法而釋放外泌體，使癌細胞的基因經常突變，並使免疫細胞失去活性，至今尚未找到有效對策。
專利文獻1已經提出樹狀細胞和癌細胞融合效率低的解決方法。在專利文獻1中，將癌細胞釋放的外泌體以電氣穿孔的方式導入樹狀細胞和T細胞等免疫細胞中，並將電氣穿孔處理過的細胞(疫苗)接種到患者體內，進行給藥。
根據專利文獻1，癌細胞的基因不斷變化，並且當癌細胞的基因發生突變時，癌細胞所表達的蛋白質也會隨之發生變化並造成抗原逃脫。外泌體與分泌它們的細胞一樣，擁有相同的蛋白質和功能。癌細胞分泌的外泌體並非正常的成熟樹突細胞或NK細胞分泌的外泌體，也含有與分泌源癌細胞相同的蛋白質，即帶有抗原。也就是說，當使用源自癌細胞的外泌體時，即使癌細胞發生基因突變，源自突變癌細胞的外泌體也具有與該突變癌細胞相同的抗原。亦即，如果以癌細胞分泌的外泌體用作抗原，即使癌細胞基因發生突變而導致蛋白質發生突變，該癌細胞分泌之外泌體所表達的蛋白質也與其癌細胞來源的蛋白質相同，因此癌細胞無法逃脫抗原呈
遞。
另外，在非專利文獻1和非專利文獻2中，公開了將癌細胞分泌的外泌體脈衝導入樹狀細胞中，樹狀細胞誘導患者的T細胞產生自體腫瘤細胞活性的觀察。
此外，非專利文獻3描述了以白血病細胞分泌的外泌體來激活樹狀細胞誘導出對白血病細胞有免疫反應的細胞傷害性淋巴T細胞的現象。
現有技術文獻
專利文獻1：日本專利公開號2013-523824
非專利文獻1：日本外科學會雜誌，2005年，第106卷，臨時增刊號，第195頁，摘要編號SF2309-2
非專利文獻2：Biotherapy，2004年，第18卷，Suppl.1，第116頁，摘要編號p-27
非專利文獻3：PLOS ONE，2004年，第9卷，第3期，e91463，第1-7頁。
如果將癌細胞分泌的外泌體與樹狀細胞(DC)融合，並將融合後的細胞作為疫苗對患者投藥，則即使癌細胞基因發生突變，該疫苗也不會失去其作為抗原呈遞細胞(APC)的功能。因此，現有技術文獻中公開的方法是有效的。
抗原呈遞的機制是具癌細胞特異的蛋白質在細胞內被分解成胜肽鏈，該胜肽鏈與癌細胞表面的MHC分子結合成呈遞抗原胜肽，細胞傷害性T細胞(CTL)針對該抗原胜肽進行識別並進而攻擊癌細胞。
但是，外泌體中的蛋白質分解成胜肽鏈需要花費時間，且免疫反應也不易發生。換句話說，存在著癌細胞分泌的外泌體與樹狀細胞融合以用作疫苗發揮效果是需要花費時間的。
此外，還有外泌體不能長時間保存的問題。外泌體和樹狀細胞融合成顆粒時必須保持膜結構才行。但是，膜結構在室溫下經過一定時間後會崩解，因此無法長期保存。
如果在-96℃的極低溫下保存，則可以長期保存，但是在疫苗製造的過程中不得不將外泌體解凍，反覆冷凍解凍將會破壞膜的完整性以致粒子結構可能無法保持完整。此外，亦可保存於約4℃的低溫下而不是使用冷凍保存。然而，如同其他具有膜結構的病毒顆粒(流感，副流感，皰疹病毒)等一樣，約一個月左右失去活性(99%)，顆粒被破壞，抗原呈遞效率變差，則會停止製造蛋白。
隨著癌細胞惡性增加，外泌體可攜帶與其母細胞相同的抗原。因此，它保有針對突變抗原呈遞的特性。根據本發明製備的免疫療法疫苗的製造方法包括從癌細胞(包括癌幹細胞)的培養上清液或體液(例如，癌症患者的血液和腹水等體液中)分離出外泌體通過加熱處理使外泌體失活，並將此失活的外泌體導入樹狀細胞中加以融合。
如上所述，將外泌體在室溫下放置一定時間後，其膜結構會崩解而無法將其與樹狀細胞融合。因此，必需進行加熱處理以促進蛋白質降解為胜肽鏈結構，以及保持外泌體膜結構完整性，該條件為56℃以下且30分鐘以下。在較高的溫度條件下，蛋白質會變性而無法保持抗原性。
本發明免疫療法疫苗的製造方法中，將從患者癌細胞或體液中分
離得來的外泌體導入樹狀細胞，包括電氣穿孔融合法、PEG(聚乙二醇)方法和仙台病毒融合方法。
當使用電氣穿孔融合法時，外泌體瞬間被融入樹狀細胞，並且在末期癌症患者的血清中，1ml血清就存在109個或更多的外泌體顆粒，因此樹狀細胞的外泌體攝取率被推測為90%以上。因此，將電氣穿孔融合法與樹狀細胞和癌細胞的常規融合法相比，能大幅增加抗原呈遞細胞(APC)的數量。
外泌體不僅可以從癌症患者的血液中獲得，也可以從尿液和腹水等體液中分離獲得。
根據本發明，抗原呈遞功能得到增強。如上所述，癌細胞特異性蛋白質(外泌體中的蛋白質)被降解成胜肽鏈，胜肽鏈與MHC分子結合作為抗原胜肽呈遞給細胞傷害性T細胞(CTL)。一般而言，蛋白質為了維持生理活性，不要成為蛋白酶、脂肪酶等蛋白水解酶和脂解酶的攻擊目標，因而以三級立體結構呈現。本發明中的加熱處理並不會破壞蛋白質的三級立體結構，僅造成活性基團改變而使酵素活性喪失。而且，癌細胞特異性蛋白質更容易被分解成胜肽鏈並與MHC分子結合。因此，增強了對細胞傷害性T細胞(CTL)的抗原呈遞功能。
作為本發明的附加價值，加熱處理使蛋白質水解酶和脂解酶失去活性將更可以保持外泌體顆粒的穩定性，以利長期保存。此外，加熱處理外泌體可能會增加熱休克蛋白質(HSP)的數量。這些HSP被認為具有增強整體免疫系統的功能。
如上所述，除了激活整體的免疫系統外，HSP本質上是一種耐熱
蛋白，經過加熱處理非但不會失去活性反而能被激發活性。這點也意味著將加熱處理過的外泌體作為抗原使用是有意義的。
圖1係為加熱條件為56℃，30分鐘時外泌體的顯微鏡照片。
圖2係為加熱條件為56℃，30分鐘時外泌體的顯微鏡照片。
圖3係為加熱條件為56℃，30分鐘時外泌體的顯微鏡照片。
圖4係為將加熱處理後的外泌體經過熱處理的時間與細胞傷害性(細胞溶解百分比)進行比較的結果。
圖5係為導入外泌體的樹狀細胞(DC)的蛋白質螢光(綠色螢光和紅色螢光)以及一般明亮視野的顯微鏡照片，上排顯示了利用電氣穿孔法導入未經加熱處理的外泌體樹狀細胞(DC)，中排是以本發明的條件，將加熱處理過的外泌體以共培養的方式導入樹狀細胞(DC)，下排是以本發明條件，將加熱處理過的外泌體以電氣穿孔法導入的樹狀細胞(DC)。
下面將描述本發明的實施例。本發明的權利範圍不受以下實施例限制。
(A)從細胞培養上清液中提取外泌體：
步驟1：以零外泌體的FCS培養基培養2天後，從培養上清液中提取新生成的外泌體。利用miRCURY Exosome Cell/Urine/CSF Kit(Takara Bio Cat.300102)用作外泌體分離試劑盒。
步驟2：對步驟1中提取的外泌體顆粒數量進行計數。
步驟3：通過進行加熱處理(56℃，30分鐘)使外泌體失活。
外泌體的細胞膜很容易因為加熱處理而崩解。若細胞膜崩解，則不能與樹狀細胞有效融合，因此，通過改變加熱條件來確定加熱處理的溫度上限和時間上限。通過從每種條件下的顯微鏡照片中觀察外泌體的膜結構來決定加熱處理條件。
在圖1至圖3的所有圖當中，都選擇56℃和30分鐘的加熱條件。在每個圖中，圓形的深色部分是膜結構保持完整的外泌體，大於深色部分的圓形白色部分是膜結構塌陷的外泌體。在保持膜結構的外泌體中看不到核結構，可以證實外泌體是從細胞質中分泌出來的。在一些膜結構已經崩解的外泌體中，核結構消失的情況也有發生。
當溫度條件低於56℃，例如37℃(體溫)時，不算加熱處理，是酵素的活性基團沒有變性的正常外泌體。當溫度超過56℃時，膜結構崩解的外泌體數量增加。處理時間條件也有一樣的趨勢，從顯微鏡照片可以清楚看出，在56℃30分鐘的情況下膜結構崩解的外泌體與膜結構完整的外泌體體混合存在。相反的，這也提供了膜結構沒有崩解的外泌體以及其內的酵素正在變性反應的證據。因此，在56℃以下，30分鐘以下的條件內，儘可能接近56℃30分鐘的條件進行熱處理是為理想條件。
(B)活化的細胞傷害性T細胞(CTL)對腫瘤細胞的殺傷力
步驟1：從健康的人採集血液後，將外周血單核細胞進行分化誘導以得到樹狀細胞。採集外周血(50ml)然後離心(c.f.g. 1800xg，15分鐘)，收集在中間層的細胞。之後，用PBS洗滌細胞兩次(c.f.g 1200r.p.m. 5分鐘)，
計算細胞數，並將細胞重懸於CTS AIM V培養基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)中，至2×106/ml的細胞密度。利用24孔培養平板並於每孔接種1ml，在37℃，5%CO2的培養箱中培養2小時。然後，除去漂浮細胞，將含有樹狀細胞的培養液(含有細胞因子的AIM V培養基(10ng/ml的GM-CSF和IL-4，Miltenyi Biotec)和2%的自體血漿，添加入每個孔中含有1ml的細胞進行培養。此後，將500ul新鮮的樹狀細胞培養基添加到孔中，並添加用於誘導樹狀細胞成熟的細胞因子(最終濃度為10ng/ml TNF-α，Miltenyi Biotec)。
步驟2：針對樹狀細胞的抗原刺激進行以下測試(1)至(3)。
(1)DC和腫瘤細胞的PEG(聚乙二醇)細胞融合法
(2)DC和外泌體的電氣穿孔細胞融合法
(3)DC與外泌體的共培養
步驟3：進行上述測試(1)至(3)中活化的樹狀細胞與細胞傷害性T細胞(CTL)的共培養。
步驟4：進行上述共培養的細胞傷害性T細胞(CTL)和腫瘤細胞共培養。
通過MTT測定法，觀察到細胞傷害性T細胞(CTL)的細胞毒性。結果如圖4和5所示。圖4表示標的細胞與效應子的比例和細胞傷害性T細胞的細胞毒性(細胞溶解度，Lysis)的關係，利用本發明的方法對進行加熱處理的外泌體與DC細胞進行電氣穿孔融合法，對細胞傷害性T細胞進行抗原呈遞與傳統的PEG(聚乙二醇)細胞融合法或共培養法一樣，細胞傷害性T細胞(CTL)都顯示出細胞傷害活性。特別是關於標的細胞與效應子的比
例(水平軸)，當效應子增加時，加熱處理的外泌體與DC細胞進行電氣穿孔融合法造成的細胞傷害活性(細胞溶解度，Lysis)高於PEG(聚乙二醇)細胞融合法和共培養法。
此外，從圖5可以看出，因為加熱處理的外泌體而導致的蛋白質表現有增加的現象。因此，利用本發明的方法獲得的疫苗對於免疫療法是有效的。
本發明的疫苗，亦即利用電氣穿孔法將加熱處理過的外泌體導入DC(樹狀細胞)具有抗原呈遞細胞(APC)的作用。當利用皮下注射等方法將該抗原呈遞細胞(APC)施打入患者體內時，抗原呈遞細胞(APC)會移動至淋巴結，對淋巴結中的T細胞進行教育，使之成為細胞傷害性T細胞(CTL)。如上所述，由於外泌體的數量與DC相比非常多，所以成功攝入外泌體的DC的數量也會變多。當此類DC的數量增加時，抗原呈遞細胞(APC)的數量也增加，細胞傷害性T細胞(CTL)的數量也會增加，從而導致更好的免疫效果。
另外，也可以使用將導入了外泌體的DC(樹狀細胞)與T細胞進一步共培養而形成細胞傷害性T細胞(CTL)的疫苗。
任務：提供了一種用於癌症免疫療法疫苗的製造方法。解決方法：如果將外泌體置於室溫一段時間，其膜構造會崩解而無法與樹狀細胞融合。因此，需要在促進蛋白質降解成胜肽鏈結構並且保持外泌體膜結構的條件下進行加熱處理，該條件為56℃以下且30分鐘以下。在較56℃更高溫的條件下，蛋白質會變性而無法保持抗原性。因此，對由癌症患者的癌細胞或如血液等體液分離而來的外泌體進行56℃以下且30分鐘以下的條件的加熱
處理會促進外泌體中的蛋白質酵素失活，使蛋白質水解酶和脂解酶失活。接下來，將該外泌體導入由癌症患者或健康人血液中分化誘導而取得的樹狀細胞或與之共培養。
Claims (3)
- 一種免疫療法疫苗的製造方法，其包括：提供一從癌症患者癌細胞或體液中分離出來的一外泌體，將該外泌體進行56℃與30分鐘的加熱處理，以促進該外泌體中蛋白質水解酶的失活，再將此加熱處理過的該外泌體加入由癌症患者或健康人的血液等分化誘導而來的一樹突細胞，或與一樹狀細胞共培養以製成抗原呈遞細胞。
- 如申請範圍第1項所述之製造方法，其包括：通過加熱處理使蛋白質水解酶和脂解酶失活，維持外泌體的顆粒穩定性。
- 如申請範圍第1項所述之製造方法，其包括：將其中所述該樹突細胞與T細胞共培養，從而得到細胞傷害性T細胞。
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