JP2023547789A - 全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用 - Google Patents
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Abstract
免疫療法の技術分野に関する、全細胞画分が担持された標的送達システムである。当該標的送達システムは、表面にターゲットヘッドを有するナノスケールサイズ又はミクロスケールサイズの粒子であり、また前記粒子には、がん細胞又はがん組織の全細胞画分を担持させ、前記全細胞画分は、細胞又は組織中の全細胞の水溶性成分と非水溶性成分であり、前記非水溶性成分は可溶化剤により溶解でき、前記ターゲットヘッドは、特定の細胞又は組織の表面上の分子と結合することにより、前記粒子が細胞又は組織に入るのを助ける。当該標的送達システムは、特定の可溶化剤を用いて非水溶性成分を可溶化させて水溶液に溶解できるようにすることで、がん細胞又は組織中の水溶性成分と非水溶性成分の全細胞抗原を組み合わせてがんワクチンを製造し、同時に抗原提示細胞を標的とすることができるターゲットヘッドを付加してアクティブターゲットの方式で抗原提示細胞の貪食を効率化させ、さらにがんの予防又は治療効果を高める。
Description
本出願は、2020年10月23日に中国特許庁に出願された、出願番号が202011146241.9、発明の名称が「全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容全体が引用により本出願に組み込まれる。
[技術分野]
[技術分野]
本発明は、免疫療法の技術分野に関し、具体的には全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用に関する。
[背景技術]
免疫は人体の生理機能であり、人体はこの機能を利用して「自己」と「非自己」の成分を識別し、人体に侵入した抗原物質(ウイルスや細菌など)、又は人体自身によって生成された損傷細胞及び腫瘍細胞などを破壊し、拒絶し、人体の健康を維持する。近年、免疫学的技術は極めて急速に発展しており、特にがん免疫療法の分野では顕著である。がんに対する認識が継続的に向上するにつれて、人体の免疫システムとさまざまな免疫細胞ががんの発生と進行を抑制する上で重要な役割を果たしていることがわかってきた。
免疫は人体の生理機能であり、人体はこの機能を利用して「自己」と「非自己」の成分を識別し、人体に侵入した抗原物質(ウイルスや細菌など)、又は人体自身によって生成された損傷細胞及び腫瘍細胞などを破壊し、拒絶し、人体の健康を維持する。近年、免疫学的技術は極めて急速に発展しており、特にがん免疫療法の分野では顕著である。がんに対する認識が継続的に向上するにつれて、人体の免疫システムとさまざまな免疫細胞ががんの発生と進行を抑制する上で重要な役割を果たしていることがわかってきた。
近年、がん免疫療法は急速に発展しており、がんワクチンはがんの免疫療法や予防のための重要な方法の一つである。効果的ながんワクチンは、がん特異的な抗原を担持する必要があり、これらの担持された抗原を効率的に抗原提示細胞に送達することで、体の免疫システムのがん細胞に対する認識と攻撃を活性化する。現在、科学者は、がん患者の腫瘍細胞分析からがん特異的又はがん関連の抗原ポリペプチドを特定し、in vitroで人工的に合成して、がん治療用のがんワクチンを製造している。当該方法は、がん患者の臨床試験で所定の有効性を示している。しかし、このような方法で発見できるがん抗原の数は限られており、時間と手間がかかり、費用が高く、得られたポリペプチドワクチンは抗原提示細胞を標的とする能力がない。
ワクチンとして機能するためには、先ずは抗原を抗原提示細胞に送達され、次に抗原提示細胞ががん抗原を処理して抗原提示細胞の表面に提示し、T細胞と相互作用してがん細胞に対するT細胞の免疫認識を活性化することが必要である。T細胞が、特定のがん抗原を認識できるようになると、そのがん抗原を含むがん細胞を認識し、殺傷するようになる。
さらに、現在の技術では限られた数の抗原しか使用できず、患者の体内にある大部分のがん抗原をカバーすることはできない。がん細胞抗原の多様性やがん変異の多様性により、同じがん患者でもがん細胞抗原は異なる。そのため、限られた数のがん抗原から、ほとんどの人が使用できるがんワクチンを製造することは困難である。がん細胞や患者からの腫瘍組織には、それぞれに固有のがん抗原や突然変異が含まれているため、個別化抗原に属し、作製されたがんワクチンも個別化ワクチンに属す。しかし、腫瘍組織にはさまざまながん抗原が含まれており、がん組織やがん細胞の全細胞画分をワクチンとして抗原提示細胞に届けることができれば、ワクチンはがんに対して優れた予防効果と治療効果を有する。しかし、現在の技術的手段の制限により、研究者は水溶性成分に研究の焦点を当てており、非水溶性成分を効果的に適用することができず、これは現在の全細胞画分の使用における困難である。
さらに、ワクチンとして機能するためには、先ずは、抗原を抗原提示細胞に送達され、次に、抗原提示細胞ががん抗原を処理して抗原提示細胞の表面に提示し、T細胞と相互作用してがん細胞に対するT細胞の免疫認識を活性化することが必要である。T細胞が、特定のがん抗原を認識できるようになると、そのがん抗原を含むがん細胞を認識し、殺傷するようになる。現在、粒径によって抗原提示細胞を標的にすることは、パッシブターゲティングと呼ばれている。しかし、パッシブターゲティングだけでは、抗原提示細胞の表面に効率的に提示してT細胞と相互作用することはできない。300nmのナノ粒子を例とすると、それは樹状細胞やB細胞などの抗原提示細胞によって貪食される場合があり、線維芽細胞などの他の細胞によって貪食される場合もある。
[発明内容]
これを考慮して、本発明の目的は、全細胞画分が担持された標的送達システムを提供して、前記標的送達システムがアクティブターゲティングの方式でがん細胞又は組織の水溶性及び非水溶性成分を含む全細胞画分を抗原提示細胞に提示し、腫瘍の予防及び治療効果を向上させることである。
これを考慮して、本発明の目的は、全細胞画分が担持された標的送達システムを提供して、前記標的送達システムがアクティブターゲティングの方式でがん細胞又は組織の水溶性及び非水溶性成分を含む全細胞画分を抗原提示細胞に提示し、腫瘍の予防及び治療効果を向上させることである。
本発明のもう一つの目的は、がんの予防及び/又は治療のためのワクチンの製造における、上記標的送達システムの使用を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供する。
表面にターゲットヘッドを有するナノスケールサイズ又はミクロスケールサイズの粒子であって、前記粒子にはがん細胞又はがん組織の全細胞画分が担持され、前記非水溶性成分は可溶化剤によって溶解され、前記全細胞画分は細胞又は組織中の全細胞の水溶性成分及び非水溶性成分であり、前記ターゲットヘッドは特定の細胞又は組織の表面の分子と結合して前記粒子の細胞又は組織への進入を助ける、全細胞画分が担持された標的送達システムである。
本発明では、がん細胞又は組織を溶解させた後、まず純水又は可溶化剤を含まない水溶液に可溶な水溶性成分を得、その後、特定の可溶化剤を含む可溶化水溶液で水不溶性成分を可溶化剤に溶解させて、すべての細胞画分を水溶液に溶解できる成分に変換し、ナノ粒子又はミクロ粒子の内側と外側に担持させて標的送達システムを製造することができ、これにより、製造された標的送達システムにほとんどの抗原性物質が担持されることが保証する。実際の使用では、細胞又は組織を溶解させた後、水溶性成分及び非水溶性成分を別々にせずに、可溶化剤を含む可溶化水溶液を直接に使用して全細胞画分を溶解させて、可溶化水溶液に溶解された全細胞画分を使用して標的送達システムを製造することができる。
がん細胞又は腫瘍組織における細胞画分の水溶性成分及び非水溶性成分は、細胞全体の成分及び画分を包含する。その中で、正常な細胞と同じ成分の突然変異していないタンパク質、ポリペプチドと遺伝子は、自己免疫システムの発達プロセスで生成される免疫寛容があるため免疫反応を起こさないが、がんに起因する遺伝子、タンパク質とポリペプチドの突然変異は、自己免疫システムの発達プロセスで生成される免疫寛容がないため免疫原性があり、がん細胞に対する体の免疫反応を活性化させる。全細胞画分における疾患の突然変異によって産生されるこれらのがん細胞特異的免疫原性を有する物質を使用して、がんの予防及び治療に使用することができる。
本発明記載の標的送達システムにおいて、前記全細胞画分は、純水又は可溶化剤を含まない水溶液への溶解度に応じて、水溶性成分と非水溶性成分の二つの部分に分けることができる。前記水溶性成分は、純水又は可溶化剤を含まない水溶液に可溶な元の水溶性部分であり、前記非水溶性成分は、純水に不溶な元の非水溶性部分であり、適切な可溶化方法を使用して純水又は可溶化剤を含まない水溶液に不溶であることから、可溶化剤を含む水溶液に可溶な部分になるようにする。前記全細胞画分の水溶性部分及び非水溶性部分は、可溶化剤を含む可溶化水溶液によって溶解されることができる。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記可溶化剤は、尿素、塩酸グアニジン、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、グリセロール、pH7超のアルカリ溶液、pH7未満の酸性溶液、各種タンパク質分解酵素、アルブミン、レシチン、高濃度無機塩、トリトン(Triton)、トウェイン、DMSO、アセトニトリル、エタノール、メタノール、DMF、プロパノール、イソプロパノール、酢酸、コレステロール、アミノ酸、グルコシド、コリン、BrijTM-35、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル(Octaethylene glycol monododecyl ether)、CHAPS、デジトニン(Digitonin)、ラウリルジメチルアミンオキシド(lauryldimethylamine oxide)、IGEPAL(登録商標) CA-630、DMSO、アセトニトリル、エタノール、メタノール、DMF、イソプロパノール、プロパノール、ジクロロメタンと酢酸エチルなどが含まれるが、これらに限定されなく、それらの中から一つ又は複数を選択することができる。
前記非水溶性成分は、タンパク質及びポリペプチド断片を可溶化できる他の方法によって、純水に不溶から可溶に変えることもできる。ただし、本発明の具体的な実施プロセスでは、尿素、塩酸グアニジン、SDS、デオキシコール酸ナトリウム又はグリセロールの効果は、PEGなどの他の可溶化剤よりも明らかに優れている。好ましくは、本発明は、尿素又は塩酸グアニジンを含む可溶化溶液を直接使用して、細胞又は組織を直接溶解させ、全細胞画分を直接溶解させる。本発明で挙げられた実施例では、8M尿素と6M塩酸グアニジン水溶液を用いて腫瘍組織又はがん細胞の非水溶性成分を溶解させるが、実際の使用では、SDS及びグリセロールなど、全細胞画分の非水溶性成分を可溶化できる他の可溶化溶液を使用することができる。
ミクロ粒子又はナノ粒子には、抗原提示細胞を標的とするための最適な粒径を有しているが、異なる材料から製造されたナノ粒子又はミクロ粒子の最適なサイズは異なる場合がある。例えば、現在、カチオン性リポソームの最適なサイズは約50~150nmであり、PLGAで製造されたナノ粒子は約200~500nmである可能性があると考えられている。そしてミクロ粒子は理論的には1.5~5μmが最適であると考えられている。この最適なサイズは、粒子の材質によって異なる。粒径による抗原提示細胞を標的にすることは、パッシブターゲティングと呼ばれている。
本発明はパッシブターゲティングに加えて、さらにアクティブターゲティング戦略を使用し、即ち、ナノ粒子又はミクロ粒子の外側に特定の細胞を標的とすることができるターゲットヘッド分子を接続させる。これにより、ナノ粒子又はミクロ粒子を特定の細胞又は組織の表面に直接標的とし、リガンド受容体との結合する方法により前記粒子の細胞又は組織への進入を助けることができる。これらの細胞には、白血球中の樹状細胞、マクロファージ、B細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、好中球、好酸球、好塩基球が含まれるが、これらに限定されなく、前記ターゲットヘッドが標的とすることができる組織には、リンパ節、胸腺、脾臓、骨髄が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、パッシブターゲティングのみに依存する場合、300nmのナノ粒子は、樹状細胞、B細胞などの抗原提示細胞によって貪食される可能性があるが、線維芽細胞などの他の細胞によって貪食される可能性もある。アクティブターゲティング戦略が使用される場合、最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞によってのみ貪食されるように指示することができる。本発明の列挙された実施例では、マンノース(即ち、ターゲットヘッド)で修飾されたナノ粒子又はミクロ粒子は樹状細胞を標的とし、実際の使用では、樹状細胞を標的とすることができる任意のターゲットヘッド又は他のタイプを標的とする特定の細胞又は組織を使用することができる。
ナノワクチン又はミクロワクチンの粒径はナノスケール又はミクロスケールであり、ワクチンが抗原提示細胞によって貪食されることを保証でき、貪食効率を向上させるために、粒子サイズは適切な範囲内にある必要がある。本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記ナノスケールサイズ粒子の粒径は、1nm~1000nmである。いくつかの実施形態において、前記ナノサイズ粒子の粒径は、30nm~800nmである。さらに、いくつかの実施形態において、前記ナノサイズ粒子の粒径は、50nm~600nmである。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記ミクロスケールサイズ粒子の粒径は、1μm~1000μmである。いくつかの実施形態において、前記ミクロサイズ粒子の粒径は、1μm~100μmである。いくつかの実施形態において、前記ミクロサイズ粒子の粒径は、1μm~10μmである。さらに、いくつかの実施形態において、前記ミクロサイズ粒子の粒径は、1μm~5μmである。
本発明に記載の送達システムにおいて、前記ナノサイズの粒子又はミクロサイズの粒子の表面は電気的に中性であってもよく、負に帯電又は正に帯電することができる。
標的送達システムの免疫原性及び効果を高めるために、所定の免疫調節機能を有する免疫アジュバントを添加することもでき、例えば、パターン認識受容体アゴニスト、BCG細胞壁骨格、BCGメタノール抽出残留物、BCGムラミルジペプチド、マイコバクテリウムフレイ、ポリアクチンA、鉱油、ウイルス様粒子、免疫増強再構成インフルエンザウイルス粒子、コレラ・エンテロトキシン、サポニン及びその誘導体、レジキモド(Resiquimod)、チモシン、新生ウシ肝活性ペプチド、ミキモド(Miquimod)、多糖類、クルクミン、免疫アジュバントポリICLC、コリンバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum vaccine)、溶血性レンサ球菌製剤、コエンザイムQ10、レバミソール、ポリシチジル酸、インターロイキン、インターフェロン、ポリイノシン酸、ポリアデニル酸、ミョウバン、リン酸アルミニウム、ラノリン、植物油、エンドトキシン、リポソームアジュバント、GM-CSF、MF59、二本鎖RNA、二本鎖DNA、水酸化アルミニウム、CAF01、人参(Ginseng)、レンゲなどの漢方薬の有効成分であり、それらの一つ又は複数を選択できる。本発明に記載の免疫アジュバントを添加する方法は、ナノ粒子又はミクロ粒子内に担持させ、又はナノ粒子又はミクロ粒子の表面に担持さで、又はナノ粒子又はミクロ粒子内及びナノ粒子又はミクロ粒子の表面に一緒に担持させることを含む。好ましくは、免疫アジュバントは全細胞画分に添加される。
本発明の具体的な実施形態において、ポリイノシン-ポリシチジル酸(Polyinosinic-polycytidylic acid)(ポリ(I:C))、カルメット・ゲラン菌(BCG)又はCpGが免疫アジュバントとして使用され、がん細胞ライセート又は腫瘍組織ライセートを含有する水溶性成分及び可溶化剤に可溶な元の非水溶性成分に添加され、ポリ(I:C)、BCG又はCpGの濃度は、好ましくは1ng/mLより大きい。
標的送達システムの標的化及び効果を改善するために、本発明はまた、粒子の外側にPEG保護膜を添加することを含む。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記ナノスケールサイズ又はミクロスケールサイズの粒子の製造材料は、有機合成高分子材料、天然高分子材料、無機材料、細菌又はウイルスの中の一つ又は複数である。
ここで、前記有機合成高分子材料は、生体適合性又は分解性の高分子材料であり、PLGA、PLA、PGA、ポロキサマー(Poloxamer)、PEG、PCL、PEI、PVA、PVP、PTMC、ポリアンハイドライド(polyanhydride)、PDON、PPDO、PMMA、ポリアミノ酸、合成ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
前記天然高分子材料は、生体適合性又は分解性の高分子材料であり、リン脂質、コレステロール、デンプン、糖類、ポリペプチド、アルギン酸ナトリウム、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、細胞膜成分が含まれるが、これらに限定されない。
前記無機材料は、非明示的な生体毒性材料であり、三酸化二鉄、四酸化三鉄、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムが含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載の送達システムの形状は、任意の一般的な形状であり、球形、楕円形、樽形、多角形、棒状、シート状、線状、ウォーム状、方形、三角形、蝶形又は円盤状が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記担持方法は、全細胞の水溶性成分と非水溶性成分とが別々に又は一緒に粒子内部に担持され、及び/又は別々に又は一緒に粒子表面に担持されることである。水溶性成分が一緒に粒子中に、及び粒子表面に担持されること、非水溶性成分が一緒に粒子中に、及び粒子表面に担持されること、水溶性成分が粒子中に担持され、非水溶性成分が粒子表面に担持されること、非水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分が粒子表面に担持されること、水溶性成分と非水溶性成分が粒子中に担持され、非水溶性成分のみが粒子表面に担持されること、水溶性成分と非水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分のみが粒子表面に担持されること、水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子表面に担持されること、非水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子表面に担持されること、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子中に担持され、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子表面に担持されることが含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載の全細胞画分の送達システムの構造の模式図は図2~図17に示される通りである。実際の使用プロセスでは、その中の特定の構造を有するナノ粒子又はミクロ粒子を一つだけ使用することができ、又は異なる構造を有するナノ粒子又はミクロ粒子複数を同時に使用することができる。
本発明に記載の標的送達システムは、ナノサイズ粒子及びミクロサイズ粒子の既に開発された任意の製造方法に従って製造することができ、一般的な溶媒蒸発法、透析法、押出法、ホットメルト法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記送達システムは、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法によって製造される。
本発明に記載の全細胞画分の標的送達システムは、担持された全細胞画分を関連する免疫細胞に送達し、担持された成分の免疫原性を通じてがん細胞に対する自己免疫システムの殺傷効果を活性化及び増強することができる。したがって、本発明はまた、がんを予防及び/又は治療するためのワクチンの製造における前記全細胞画分の標的送達システムの使用を提供する。
ここで、前記がんは固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、内分泌系腫瘍、神経系腫瘍、生殖器系腫瘍、消化器系腫瘍、泌尿器系腫瘍、免疫系腫瘍、循環器系腫瘍、呼吸器系腫瘍、血液系腫瘍、皮膚系腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
がんを予防及び治療するためのがんワクチンとして使用する場合、本発明に記載の標的送達システムは、がんの発生前又はがんの発生後に複数回投与して体の免疫系を活性化させ、それによってがんの進行を遅らせ、がんを治療し、又はがんの再発を予防することができる。
上記の技術的解決策から分かるように、本発明は、特定の可溶化剤を含む水溶液を使用することで、細胞中の純水又は可溶化剤を含まない水溶液に不溶である成分を可溶に変換し、ナノ粒子及びミクロ粒子を製造するために使用することができ、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される抗原性物質又は成分の包括性と免疫原性を改善する。同時に、抗原提示細胞を標的とすることができるターゲットヘッドを追加して、アクティブターゲティングの方式で抗原提示細胞の貪食効率を改善し、それによってがんの予防又は治療効果を改善する。
[図面説明]
図1は、本発明に記載のワクチンの製造プロセス及び使用分野の模式図であり、a:水溶性成分と非水溶性成分からそれぞれナノワクチン又はミクロワクチンを収集・製造する模式図であり、b:可溶化剤を含む可溶化液を用いて全細胞画分を溶解させ、及びナノワクチン又はミクロワクチンを製造する模式図である。
図1は、本発明に記載のワクチンの製造プロセス及び使用分野の模式図であり、a:水溶性成分と非水溶性成分からそれぞれナノワクチン又はミクロワクチンを収集・製造する模式図であり、b:可溶化剤を含む可溶化液を用いて全細胞画分を溶解させ、及びナノワクチン又はミクロワクチンを製造する模式図である。
図2~図12は、水溶性及び非水溶性細胞成分を担持させたナノサイズ粒子又はミクロサイズ粒子の構造の模式図であり、ここで、1:細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、2、細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、3、免疫アジュバントであり、4、ナノ粒子又はミクロ粒子であり、5:ナノ粒子中の内核部分であり、6:特定の細胞又は組織を標的にすることができるターゲットヘッドである。図2~図3では、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面と内部に免疫アジュバントが含まれている。図4~図5では、免疫アジュバントはナノ粒子又はミクロ粒子の内部にのみ分布している。図6~図7では、ナノ粒子又はミクロ粒子は外側表面のみに免疫アジュバントを含む。図8~図9では、ナノ粒子又はミクロ粒子の内部及び外側表面のいずれにも免疫アジュバントが含まれていない。図10では、細胞画分及び/又は免疫アジュバントはナノ粒子又はミクロ粒子の内部にのみ分布している。図11では、細胞画分及び/又は免疫アジュバントはナノ粒子又はミクロ粒子の外部にのみ分布している。図12では、細胞画分及び免疫アジュバントはそれぞれナノ粒子又はミクロ粒子の内部又は外部に分布している。
図2~9において、図2の2.a~2.i、図4の6.a~6.i、図6の10.a~10.i、及び図8の14.a~14.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に分布している場合、明確な内核を形成しない。図2の3.a~3.i、図4の7.a~7.i、図6の11.a~11.i、及び図8の15.a~15.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の一つの内核部分に分布している。図3の4.a~4.i、図5の8.a~8.i、図7の12.a~12.i、及び図9の16.a~16.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の複数の内核部分に分布している。図3の5.a~5.i、図5の9.a~9.i、図7の13.a~13.i、及び図9の17.a~17.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に形成される内核の外層に分布している。a:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部と表面に担持されるのは細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、b:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部と表面に担持されるのは細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、c:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に担持されるのは細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、表面に担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、d:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に担持されるのは細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、表面に担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、e:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面にも細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持され、f:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分がに一緒に担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の水溶性成分のみが担持され、g:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分がに一緒に担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の非水溶性成分のみが担持され、h:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の非水溶性成分のみが担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持され、i:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分のみが担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持される。
図10~12において、a、b及びcにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に分布している場合、明確な内核を形成しない。d、e及びfにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の一つの内核部分に分布している。g、h及びiにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の複数の内核部分に分布している。j、k及びlにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に形成される内核の外層に分布している。a、d、g及びjにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の水溶性成分である。b、e、h及びkにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の非水溶性成分である。c、f、i及びlにおけるナノ粒子又はミクロ粒子は一緒に細胞又は組織画分中の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させる。
図13~19は、実施例1~7において、腫瘍組織又はがん細胞の全細胞画分が標的ナノ粒子又はミクロ粒子に担持される場合における、がんの治療及び予防に使用される結果である。a、腫瘍組織又はがん細胞の全細胞画分中の水溶性成分/又は一緒に非水溶性成分を担持させた標的ナノ粒子又はミクロ粒子の構造である。b、腫瘍組織又はがん細胞の全細胞画分中の非水溶性成分を担持させた標的ナノ粒子又はミクロ粒子の構造である。c、腫瘍増殖阻害に対する標的ナノワクチン又はミクロワクチンの実験結果である。d、マウスの生存期実験の結果である。実験結果において、腫瘍増殖阻害実験グラフの各データポイントは、平均値±標準誤差(mean±SEM)である。腫瘍増殖阻害実験及びマウス生存期実験ではn=10である。図cの腫瘍増殖阻害実験における有意差は、ANOVA法によって分析される。図dの有意差はKaplan-Meier及びlog-rank testによって分析される。*は当該群がPBS対照群と比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。☆は当該群がブランクナノ粒子又はブランクミクロ粒子対照群と比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。
は当該群がPEG保護層を含まないナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。★は当該群がPEG可溶化非水溶性成分により製造されるナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。
は当該群がPEG保護層を含まないナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。★は当該群がPEG可溶化非水溶性成分により製造されるナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。
[具体的な実施方式]
本発明の実施例は、全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用を開示する。当業者は、本明細書の内容を参照して、プロセスパラメータを適切に改善して実現することができる。すべての類似の置換及び変更は当業者には自明であり、それらは本発明に含まれるとみなされることを特に指摘しておくべきである。本発明に記載の標的送達システム及びその使用は、好ましい実施例を通じて説明されたが、関係者は、本発明の内容、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の標的送達システム及びその使用に対して変更又は適切な変更及び組み合わせを行って本発明を実現し、使用することができることは明らかである。
本発明の実施例は、全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用を開示する。当業者は、本明細書の内容を参照して、プロセスパラメータを適切に改善して実現することができる。すべての類似の置換及び変更は当業者には自明であり、それらは本発明に含まれるとみなされることを特に指摘しておくべきである。本発明に記載の標的送達システム及びその使用は、好ましい実施例を通じて説明されたが、関係者は、本発明の内容、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の標的送達システム及びその使用に対して変更又は適切な変更及び組み合わせを行って本発明を実現し、使用することができることは明らかである。
本発明に記載の全細胞画分の送達システムは、がんの予防及び/又は治療のためのワクチンの製造に用いることができ、その製造プロセス及び使用分野は図1に示される通りである。製造において細胞又は組織を溶解させた後、まず水溶性成分及び水不溶性成分をそれぞれ収集し、それぞれナノワクチン又はミクロワクチンを製造することができ、又は、可溶化剤を含む可溶化溶液を直接使用して細胞又は組織を直接溶解させ、全細胞画分を溶解させて、ナノワクチン又はミクロワクチンを製造することもできる。
本発明に記載の標的送達システム(ナノワクチン又はミクロワクチンとも呼ばれる)の製造方法は、一般的な製造方法である。いくつかの実施形態において、ナノワクチンの製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されるナノ粒子製造材料は、有機高分子ポリ乳酸-グリコール酸コポリマー(PLGA)及びポリ乳酸(PLA)である。使用される免疫アジュバントは、ポリ(I:C)、カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)又はCpGである。当業者は、実際の使用プロセスにおいて、当業者が特定の条件に従って、製造方法、製造プロセス、使用されるナノ粒子製造材料、免疫アジュバントの種類及び濃度などを適切に調整できることが理解できる。
いくつかの実施形態において、本発明で採用されるダブルエマルション法の具体的な製造方法は下記の通りである。
ステップ1:第1所定体積の第1所定濃度を含有する水相溶液を、第2所定体積の第2所定濃度の医療用高分子材料を含有する有機相に添加する。
いくつかの実施形態において、水相溶液は、がん細胞ライセート中の各画分及び免疫増強アジュバントであるポリ(I:C)、BCG又はCpGを含み、がん細胞ライセート中の各画分は、製造時にそれぞれ水溶性成分又は8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分である。水相溶液に含まれるがん細胞由来の水溶性成分の濃度又はがん細胞由来の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分の濃度、すなわち第1所定濃度は、タンパク質ポリペプチドの濃度含有量が1ng/mLを超える必要があり、このような濃度を選択する理由は、一般に、使用される細胞ライセートの水溶液の濃度が高いほど、製造されたナノ粒子に担持される様々ながん抗原が多くなり、製造されたタンパク質ポリペプチドの濃度が1ng/mLを超える場合、即ち、第1所定濃度が1ng/mLを超える場合、十分ながん抗原を担持できて関連する免疫応答を活性化することができることを発明者が多量の実験を通じて発見したためである。最初の水相における免疫アジュバントの濃度は、0.01ng/mLより高い。また、第1所定体積は600μLである。
いくつかの実施形態において、水相溶液は、腫瘍組織ライセート中の各画分及び免疫増強アジュバントであるポリ(I:C)、BCG又はCpGを含み、腫瘍組織ライセート中の各画分は、製造時にそれぞれ水溶性成分又は8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分である。水相溶液に含まれる腫瘍組織由来の水溶性成分の濃度又は腫瘍組織由来の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分の濃度、即ち、第1所定濃度は、タンパク質ポリペプチドの濃度含有量が1ng/mLを超える必要があり、このような濃度を選択する理由は、一般に、使用される腫瘍組織ライセートの水溶液の濃度が高いほど、製造されたナノ粒子に担持される様々ながん抗原が多くなり、製造されたタンパク質ポリペプチドの濃度が1ng/mLを超える場合、即ち、第1所定濃度が1ng/mLを超える場合、十分ながん抗原を担持できて関連する免疫応答を活性化することができることを発明者が多量の実験を通じて発見したためである。最初の水相における免疫アジュバントの濃度は、0.01ng/mLより高い。また、第1所定体積は600μLである。
本発明では、医療用高分子材料を有機溶媒に溶解させて、第2所定体積の第2所定濃度の医療用高分子材料を含有する有機相を得る。いくつかの実施形態において、医療用高分子材料は、ターゲットヘッドに修飾されるPLGA、PLGAとPLAの混合物であり、有機溶媒はジクロロメタンを選択し、得られた有機相の体積、即ち、第2所定体積は2mLである。さらに、いくつかの実施形態において、医療用高分子材料の第2所定濃度の範囲は0.5mg/mL~5000mg/mLであり、好ましくは100mg/mLである。
本発明において、PLGAとターゲットヘッドに修飾されるPLGAを選択する理由は、当該材料が生分解性材料であり、FDAによって薬物ドレッシングとしての使用が承認されているからであり、実際の使用では、ナノサイズの粒子又はミクロサイズの粒子を製造するために使用できる他の材料とターゲットヘッド修飾材料の混合物も選択できる。
実際には、有機相の第2所定体積は、水相の第1所定体積に対する比率に従って設定され、本発明において、水相の第1所定体積と有機相の第2所定体積との比率範囲は1:1.1~1:5000であり、好ましくは1:10である。具体的な実施プロセスでは、第1所定体積、第2所定体積、及び第1所定体積と第2所定体積との比率を必要に応じて調節することより、製造されたナノ粒子のサイズを調節することができる。
ステップ2:ステップ1で得られた混合溶液を2秒を超える超音波処理又は1分を超える攪拌を行う。
当該ステップの目的は、ナノメータ化を行うためであり、超音波時間の長さ又は攪拌速度と時間は、製造されたナノ粒子のサイズを制御でき、長すぎるか短すぎると、粒子サイズが変化するため、適切な超音波時間を選択する必要がある。本発明において、超音波時間は2秒を超え、攪拌速度は50rpmを超え、攪拌時間は1分を超える。
ステップ3:ステップ2の処理後に得られた混合物を、第3所定体積の第3所定濃度の乳化剤を含有する水溶液に添加し、2秒を超える超音波処理又は1分を超える攪拌を行う。
当該ステップでは、ステップ2で得られた混合物を乳化剤水溶液に加えて、続いて超音波処理又は攪拌してナノメータ化させる。
本発明において、乳化剤水溶液はポリビニルアルコール(PVA)水溶液であり、第3所定体積は5mLであり、第3所定濃度は20mg/mLである。第3所定体積は、第2所定体積に対する比率に従って調節される。本発明において、第2所定体積と第3所定体積との比率範囲は1:1.1~1:1000に設定され、好ましくは2:5であってもよい。具体的な実施プロセスでは、ナノ粒子のサイズを制御するために、第2所定体積と第3所定体積との比率を調節することができる。
同様に、当該ステップにおける超音波時間又は攪拌時間、乳化剤水溶液の体積及び濃度は、いずれも適切なサイズのナノ粒子を得るための値を取る。
ステップ4:ステップ3の処理後の液体を、第4所定体積の第4所定濃度の乳化剤水溶液に添加し、所定の攪拌条件が満たされるまで攪拌する。
当該ステップでは、乳化剤水溶液は依然としてPVAであり、第4所定体積は50mLを超える。
第4所定濃度は5mg/mLであり、第4所定濃度は、適切なサイズのナノ粒子を得ることができる値を選択する。第4所定体積の選択は、第3所定体積と第4所定体積との比率に従って決定される。本発明において、第4所定体積と第3所定体積との比率の範囲は1:1.5~1:2000であり、好ましくは1:10である。具体的な実施プロセスでは、ナノ粒子のサイズを制御するために、第3所定体積と第4所定体積との比率を調節することができる。
本発明において、本ステップにおける所定の攪拌条件は、有機溶媒の揮発が完了するまで、即ち、ステップ1におけるジクロロメタンの揮発が完了するまでである。
ステップ5:ステップ4に処理された所定の撹拌条件を満たす混合液を、100RPMを超える回転速度で1分以上遠心分離した後、上清液を除去し、残りの沈殿物を第5所定体積の第5所定濃度の凍結乾燥保護剤を含有する水溶液又は第6所定体積のPBS(又は生理食塩水)に再懸濁させる。
本発明のいくつかの実施形態において、ステップ5で得られた沈殿は、第6所定体積のPBS(又は生理食塩水)に再懸濁させる場合に凍結乾燥する必要はなく、その後のナノ粒子の表面へのがん細胞ライセートの吸着に関連する実験を直接行うことができる。
本発明のいくつかの実施形態において、ステップ5で得られた沈殿は、凍結乾燥保護剤を含有する水溶液に再懸濁させる場合に凍結乾燥する必要があり、凍結乾燥の後、ナノ粒子の表面へのがん細胞ライセートの吸着に関連する実験を行う。
本発明において、前記凍結乾燥保護剤は、トレハロース(Trehalose)を選択する。
本発明において、当該ステップにおける凍結乾燥保護剤の第5所定体積は20mLであり、第5所定濃度は4質量%であり、この設定の理由は、その後の凍結乾燥を行う際の凍結乾燥効果に影響を与えないようにするためである。
ステップ6:ステップ5で得られた凍結乾燥保護剤を含む懸濁液を凍結乾燥処理した後、凍結乾燥物を使用のために保存する。
ステップ7:第6所定体積のステップ5で得られたPBS(又は生理食塩水)中に再懸濁させたナノ粒子を含有する懸濁液、又は第6所定体積のPBS(又は生理食塩水)を用いてステップ6で得られた凍結乾燥後のナノ粒子と凍結乾燥保護剤を含有する凍結乾燥物を再懸濁させ、第7所定体積の水溶性成分又は8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分と混合した後、0.1分以上静置することでナノワクチン又はミクロワクチンを得る。
本発明において、第六所定体積と第七所定体積との体積比は、1:10000~10000:1であり、好ましい体積比は1:100~100:1であり、最適な体積比は1:30~30:1である。
いくつかの実施形態において、前記再懸濁させたナノ粒子懸濁液の体積は10mLであり、がん細胞ライセートを含む、又は腫瘍組織ライセートを含む水溶性成分又は8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分の体積は1mLである。
いくつかの実施形態において、図2に示されるように、本発明は、最初に細胞画分中の純水に可溶な水溶性部分又は(及び)非水溶性部分を可溶化剤によって可溶化させた後でナノ粒子又はミクロ粒子内に担持させ、一緒に免疫増強剤を担持させ;次に細胞画分の水溶性部分又は(及び)非水溶性部分をナノ粒子の表面に吸着させ、一緒に免疫増強剤を吸着させる。このようにして、ナノ粒子又はミクロ粒子中の細胞の水溶性成分又は非水溶性成分の負荷容量を最大化することができる。実際の使用プロセスにおいて、可溶化剤を含む可溶化溶液(8M尿素水溶液又は6M塩酸グアニジン水溶液)を直接使用して、細胞又は組織を直接溶解させ、全細胞画分を直接溶解させてから、ナノワクチン又はミクロワクチンを製造することもできる。
以下は、本発明によって提供される全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用をさらに説明する。
実施例1、黒色腫腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがん細胞モデルとした。本実施例では、マウス黒色腫腫瘍組織の溶解成分をナノ粒子の内部及び表面に担持させてナノワクチンを製造した。まず、マウス黒色腫腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分及び8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)及びPLAをナノ粒子骨格材料とし、CpGを免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。その後、当該ナノワクチンを使用して、黒色腫担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
各C57BL/6マウスの背部に150000個のB16F10黒色腫細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し;得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を治療するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
各C57BL/6マウスの背部に150000個のB16F10黒色腫細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し;得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を治療するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたPLAの分子量は10KDaであった。非修飾PLGA、マンノースで修飾されたPLGA及びPLAの質量比は8:1:2であった。使用された免疫アジュバントはCpGであり、またCpGはナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約280nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたCpG免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約240nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のCpGを含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたPLAの分子量は10KDaであった。非修飾PLGA、マンノースで修飾されたPLGA及びPLAの質量比は8:1:2であった。使用された免疫アジュバントはCpGであり、またCpGはナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約280nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたCpG免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約240nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のCpGを含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
本研究で使用される実験群は下記のように設定された:ナノワクチン群、PBS対照群、ブランクナノ粒子+細胞ライセート群。
本研究で使用される実験群は下記のように設定された:ナノワクチン群、PBS対照群、ブランクナノ粒子+細胞ライセート群。
6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して黒色腫担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子と200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子を皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
ブランクナノ粒子+組織ライセート対照群:0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ同量の腫瘍組織ライセート中の水溶性成分、同量のライセート中の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分、及び同量のCpGを担持させたがライセート成分を担持させていない4mgのPLGAブランクナノ粒子を皮下注射した。ブランクナノ粒子の表面に遊離のライセートが吸着するのを避けるために、上記の3つを別々に投与して異なる部位に注射する必要がある。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。動物実験における倫理的な理由から、マウスの生存期試験では、マウスの腫瘍体積が2000mm3を超えた場合、マウスは死亡したとみなされ、マウスを安楽死させた。
(4)実験結果
図13に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒することができることが分かった。
図13に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒することができることが分かった。
実施例2、黒色腫腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたミクロ粒子の内部及び表面に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがんモデルとし、ミクロワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形は状況に応じて調節できる。
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがんモデルとし、ミクロワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形は状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス黒色腫腫瘍組織のすべての溶解成分をミクロ粒子の内部及び表面に一緒に担持させてミクロワクチンを製造した。まず、マウス黒色腫腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分及び8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、ポリ(I:C)を免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を一緒に担持させたミクロワクチンを製造した。その後、当該ミクロワクチンを使用して、黒色腫担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
処理方法は実施例1と同様である。
処理方法は実施例1と同様である。
(2)ミクロワクチンの製造
本実施例において、ミクロワクチン及び対照としてのブランクミクロ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたミクロ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はミクロ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りであり、水溶性成分と非水溶性成分は同じミクロ粒子に一緒に担持された。本実施例では、全細胞画分をミクロ粒子の内部と表面に一緒に担持させた。全細胞画分がミクロ粒子表面に担持される場合、全細胞画分が担持されたミクロ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ミクロ粒子の平均粒径は約2.0μmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-17mVであった。PLGAミクロ粒子1mgあたり70μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAミクロ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクミクロ粒子の粒径は約1.8μmであり、ブランクミクロ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ミクロワクチン及び対照としてのブランクミクロ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたミクロ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はミクロ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りであり、水溶性成分と非水溶性成分は同じミクロ粒子に一緒に担持された。本実施例では、全細胞画分をミクロ粒子の内部と表面に一緒に担持させた。全細胞画分がミクロ粒子表面に担持される場合、全細胞画分が担持されたミクロ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ミクロ粒子の平均粒径は約2.0μmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-17mVであった。PLGAミクロ粒子1mgあたり70μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAミクロ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクミクロ粒子の粒径は約1.8μmであり、ブランクミクロ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)がん治療にミクロワクチンを使用
本研究の実験群は下記のように設定された:ミクロワクチン群、PBS対照群、ブランクミクロ粒子+細胞ライセート群。6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して黒色腫担がんマウスを製造した。
本研究の実験群は下記のように設定された:ミクロワクチン群、PBS対照群、ブランクミクロ粒子+細胞ライセート群。6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して黒色腫担がんマウスを製造した。
ミクロワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ400μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分と非水溶性成分を一緒に担持させた4mgPLGAミクロワクチンを皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
ブランクミクロ粒子+細胞ライセート対照群:0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ同量のがん細胞ライセート中の水溶性成分+非水溶性成分及び同量のポリ(I:C)を担持させたが細胞ライセート成分を担持させていない4mgのPLGAブランクナノ粒子を皮下注射した。ブランクミクロ粒子の表面に遊離の細胞ライセートが吸着するのを避けるために、上記の二つを別々に投与して異なる部位に注射する必要がある。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図14に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクミクロ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ミクロワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたミクロワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒させることができることが分かった。
図14に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクミクロ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ミクロワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたミクロワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒させることができることが分かった。
実施例3、黒色腫腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部及び表面に担持されてがん予防に使用される
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとし、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとし、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがん細胞モデルとした。本実施例では、マウス黒色腫腫瘍組織の溶解成分をナノ粒子の内部及び表面に担持させてナノワクチンを製造した。まず、マウス黒色腫腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分及び8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、ポリ(I:C)を免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。その後、当該ナノワクチンを使用して、黒色腫担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
方法は実施例1と同様である。
方法は実施例1と同様である。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGAとマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。本実施例では、全細胞画分がナノ粒子の内部と表面に一緒に担持させることを除いて、製造方法は上記の通りである。全細胞画分をナノ粒子表面に担持させる場合、全細胞画分が担持されたナノ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGAとマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。本実施例では、全細胞画分がナノ粒子の内部と表面に一緒に担持させることを除いて、製造方法は上記の通りである。全細胞画分をナノ粒子表面に担持させる場合、全細胞画分が担持されたナノ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)がん予防にナノワクチンを使用
6~8週齢のメスC57BL/6を選択して黒色腫担がんマウスを製造した。B16F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンと200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンを皮下注射した。ナノワクチンの最終注射から14日後に、各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、当該日を腫瘍細胞接種の0日目に設定した。本実験では、PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。B16-F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種した。
6~8週齢のメスC57BL/6を選択して黒色腫担がんマウスを製造した。B16F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンと200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンを皮下注射した。ナノワクチンの最終注射から14日後に、各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、当該日を腫瘍細胞接種の0日目に設定した。本実験では、PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。B16-F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種した。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図15に示されるように、PBS対照群と比較して、ナノワクチン予防群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載の樹状細胞ターゲティング能を有する、がん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して予防効果があることが分かった。
図15に示されるように、PBS対照群と比較して、ナノワクチン予防群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載の樹状細胞ターゲティング能を有する、がん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して予防効果があることが分かった。
実施例4、肺がん腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されて肺がん予防に使用される
本実施例では、マウス肺がんをがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して肺がんを予防する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス肺がんをがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して肺がんを予防する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、LLCマウス肺がんをがん細胞モデルとした。本実施例では、マウス肺がん腫瘍組織の溶解成分をナノ粒子の内部及び表面に担持させてナノワクチンを製造した。まず、マウス肺がん腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、ポリ(I:C)を免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。その後、当該ナノワクチンを使用して、肺がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
各C57BL/6マウスの側腹部に1000000個のLLC黒色腫細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し、得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を治療するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
各C57BL/6マウスの側腹部に1000000個のLLC黒色腫細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し、得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を治療するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)肺がん予防にナノワクチンを使用
6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して肺がん担がんマウスを製造した。
6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して肺がん担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。腫瘍細胞の接種前の-49日目、-42日目、-35日目、-28日目、及び-14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンと200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンを皮下注射した。PBS対照群は対応する日に400~200μLのPBSを注射した。0日目に各マウスの背部右下に1000000個のLLC肺がん細胞を皮下接種した。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図16に示されように、PBSブランク対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、肺がんに対して予防効果があることが分かった。
図16に示されように、PBSブランク対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、肺がんに対して予防効果があることが分かった。
実施例5、乳がん細胞の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、マウスの乳がんの治療を使用して、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
本実施例では、マウスの乳がんの治療を使用して、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)がん細胞の溶解及び各画分の収集
定量の4T1細胞を収集し、培地を除去して-20℃~-273℃で凍結させ、所定量の超純水を加えて3回以上凍結融解を繰り返し、溶解細胞を破壊するために超音波を伴ってもよい。細胞溶解後、ライセートを100g以上の回転速度で1分以上遠心分離し、上清液即ち4T1中の純水に可溶な水溶性成分を取り、得られた沈殿部分に8M尿素を加えて沈殿部分を溶解させ、4T1中の純水に不溶の非水溶性分を8M尿素水溶液に可溶化させた。前記得られたがん細胞ライセート由来の水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん治療用ナノワクチンを製造するための原料源であった。
定量の4T1細胞を収集し、培地を除去して-20℃~-273℃で凍結させ、所定量の超純水を加えて3回以上凍結融解を繰り返し、溶解細胞を破壊するために超音波を伴ってもよい。細胞溶解後、ライセートを100g以上の回転速度で1分以上遠心分離し、上清液即ち4T1中の純水に可溶な水溶性成分を取り、得られた沈殿部分に8M尿素を加えて沈殿部分を溶解させ、4T1中の純水に不溶の非水溶性分を8M尿素水溶液に可溶化させた。前記得られたがん細胞ライセート由来の水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん治療用ナノワクチンを製造するための原料源であった。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例4と同様であり、違いはLLC細胞を4T1細胞に、アジュバントをBCGアジュバントに置き換えたことである。
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例4と同様であり、違いはLLC細胞を4T1細胞に、アジュバントをBCGアジュバントに置き換えたことである。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ200μLの内部と表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバント、及び200μLの内部と表面に8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバントを皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
ブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群:0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれがん細胞ライセート中の水溶性成分、がん細胞ライセート中の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分、同量のBCG及び4mgのPLGAブランクナノ粒子を皮下注射した。ブランクナノ粒子の表面に遊離の細胞ライセートが吸着するのを避けるために、上記の3つを別々に投与して異なる部位に注射する必要がある。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。マウスの生存期試験では、マウスの腫瘍体積が2000mm3を超えた場合、マウスは死亡したとみなされ、マウスを安楽死させた。
(4)実験結果
図17に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ナノワクチン投与群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、乳がんに対して治療効果があることが分かった。
図17に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ナノワクチン投与群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、乳がんに対して治療効果があることが分かった。
実施例6、乳がん細胞の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)がん細胞の溶解及び各画分の収集
製造方法は実施例5と同様である。
製造方法は実施例5と同様である。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。なお、PEG保護膜を含有するワクチン群では、製造時にPLGA有機相に3.5%のPEG-PLGA(PEGの部分子量は5000であり、PLAGの部分子量は25000である)を加えた。
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。なお、PEG保護膜を含有するワクチン群では、製造時にPLGA有機相に3.5%のPEG-PLGA(PEGの部分子量は5000であり、PLAGの部分子量は25000である)を加えた。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
PEG保護膜を含有するナノワクチン群及びPEG保護膜を含有しないナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ200μLの水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバント、及び200μLの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバントを皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図18に示されるように、PBSブランク対照群とPEG保護膜を含有しないナノワクチン群と比較して、PEG保護膜を含有するナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、PEG保護膜は、ナノ粒子が樹状細胞以外の細胞によって貪食されるのを防ぎ、体内のナノ粒子の循環時間を延長させ、それによってナノワクチンの標的化と有効性を改善することが分かった。
図18に示されるように、PBSブランク対照群とPEG保護膜を含有しないナノワクチン群と比較して、PEG保護膜を含有するナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、PEG保護膜は、ナノ粒子が樹状細胞以外の細胞によって貪食されるのを防ぎ、体内のナノ粒子の循環時間を延長させ、それによってナノワクチンの標的化と有効性を改善することが分かった。
実施例7:非水溶性成分に対する異なる可溶化剤の溶解度
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。それぞれ6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)を使用して非水溶性成分を溶解させた。次に、PLGA(50:50)及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料としてナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。それぞれ6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)を使用して非水溶性成分を溶解させた。次に、PLGA(50:50)及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料としてナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)がん細胞の溶解及び各画分の収集
製造方法は実施例5と同様である。違いは、本実施例では、6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)をそれぞれ使用して、溶解されたがん細胞中の非水溶性成分を溶解させることである。6M塩酸グアニジンの非水溶性成分に対する可溶化能はPEG(5000KD)よりも明らかに強く、非水溶性成分を可溶化する6M塩酸グアニジンの濃度は80mg/mLに達することができるが、PEG(5000KD)は非水溶性成分を1mg/mLまでしか可溶化できない。
製造方法は実施例5と同様である。違いは、本実施例では、6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)をそれぞれ使用して、溶解されたがん細胞中の非水溶性成分を溶解させることである。6M塩酸グアニジンの非水溶性成分に対する可溶化能はPEG(5000KD)よりも明らかに強く、非水溶性成分を可溶化する6M塩酸グアニジンの濃度は80mg/mLに達することができるが、PEG(5000KD)は非水溶性成分を1mg/mLまでしか可溶化できない。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。さらに、非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造する場合、6M塩酸グアニジンによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は60mg/mLであり、PEGによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は1mg/mLであった。したがって、製造したナノワクチンを6M塩酸グアニジンで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり70μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させ、PEGで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり2μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させた。
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。さらに、非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造する場合、6M塩酸グアニジンによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は60mg/mLであり、PEGによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は1mg/mLであった。したがって、製造したナノワクチンを6M塩酸グアニジンで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり70μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させ、PEGで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり2μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させた。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
6~8週齢のメスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
6~8週齢のメスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。腫瘍細胞の接種前の-49日目、-42日目、-35日目、-28日目、及び-14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子(0.5mgのBCGアジュバント)と200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子(0.5mgのBCGアジュバント)を皮下注射した。PBS対照群は対応する日に400μLのPBSを注射した。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種した。実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は実施例1と同様に算出された。
(4)実験結果
図19に示されるように、PBSブランク対照群及びPEGで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群と比較して、6M塩酸グアニジンで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、可溶化溶液と方法がナノワクチンの効果を改善するために重要であることが分かった。
図19に示されるように、PBSブランク対照群及びPEGで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群と比較して、6M塩酸グアニジンで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、可溶化溶液と方法がナノワクチンの効果を改善するために重要であることが分かった。
以上では、本発明の方法及びその核となる考えを理解するためのものであり、当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、本発明を改良及び変更でき、これらの改良及び変更も本発明の保護範囲内に入ることを指摘しておく。
本出願は、2020年10月23日に中国特許庁に出願された、出願番号が202011146241.9、発明の名称が「全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用」である中国特許出願の優先権を主張し、その内容全体が引用により本出願に組み込まれる。
[技術分野]
[技術分野]
本発明は、免疫療法の技術分野に関し、具体的には全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用に関する。
[背景技術]
免疫は人体の生理機能であり、人体はこの機能を利用して「自己」と「非自己」の成分を識別し、人体に侵入した抗原物質(ウイルスや細菌など)、又は人体自身によって生成された損傷細胞及び腫瘍細胞などを破壊し、拒絶し、人体の健康を維持する。近年、免疫学的技術は極めて急速に発展しており、特にがん免疫療法の分野では顕著である。がんに対する認識が継続的に向上するにつれて、人体の免疫システムとさまざまな免疫細胞ががんの発生と進行を抑制する上で重要な役割を果たしていることがわかってきた。
免疫は人体の生理機能であり、人体はこの機能を利用して「自己」と「非自己」の成分を識別し、人体に侵入した抗原物質(ウイルスや細菌など)、又は人体自身によって生成された損傷細胞及び腫瘍細胞などを破壊し、拒絶し、人体の健康を維持する。近年、免疫学的技術は極めて急速に発展しており、特にがん免疫療法の分野では顕著である。がんに対する認識が継続的に向上するにつれて、人体の免疫システムとさまざまな免疫細胞ががんの発生と進行を抑制する上で重要な役割を果たしていることがわかってきた。
近年、がん免疫療法は急速に発展しており、がんワクチンはがんの免疫療法や予防のための重要な方法の一つである。効果的ながんワクチンは、がん特異的な抗原を担持する必要があり、これらの担持された抗原を効率的に抗原提示細胞に送達することで、体の免疫システムのがん細胞に対する認識と攻撃を活性化する。現在、科学者は、がん患者の腫瘍細胞分析からがん特異的又はがん関連の抗原ポリペプチドを特定し、in vitroで人工的に合成して、がん治療用のがんワクチンを製造している。当該方法は、がん患者の臨床試験で所定の有効性を示している。しかし、このような方法で発見できるがん抗原の数は限られており、時間と手間がかかり、費用が高く、得られたポリペプチドワクチンは抗原提示細胞を標的とする能力がない。
ワクチンとして機能するためには、先ずは抗原を抗原提示細胞に送達され、次に抗原提示細胞ががん抗原を処理して抗原提示細胞の表面に提示し、T細胞と相互作用してがん細胞に対するT細胞の免疫認識を活性化することが必要である。T細胞が、特定のがん抗原を認識できるようになると、そのがん抗原を含むがん細胞を認識し、殺傷するようになる。
さらに、現在の技術では限られた数の抗原しか使用できず、患者の体内にある大部分のがん抗原をカバーすることはできない。がん細胞抗原の多様性やがん変異の多様性により、同じがん患者でもがん細胞抗原は異なる。そのため、限られた数のがん抗原から、ほとんどの人が使用できるがんワクチンを製造することは困難である。がん細胞や患者からの腫瘍組織には、それぞれに固有のがん抗原や突然変異が含まれているため、個別化抗原に属し、作製されたがんワクチンも個別化ワクチンに属す。しかし、腫瘍組織にはさまざまながん抗原が含まれており、がん組織やがん細胞の全細胞画分をワクチンとして抗原提示細胞に届けることができれば、ワクチンはがんに対して優れた予防効果と治療効果を有する。しかし、現在の技術的手段の制限により、研究者は水溶性成分に研究の焦点を当てており、非水溶性成分を効果的に適用することができず、これは現在の全細胞画分の使用における困難である。
さらに、ワクチンとして機能するためには、先ずは、抗原を抗原提示細胞に送達され、次に、抗原提示細胞ががん抗原を処理して抗原提示細胞の表面に提示し、T細胞と相互作用してがん細胞に対するT細胞の免疫認識を活性化することが必要である。T細胞が、特定のがん抗原を認識できるようになると、そのがん抗原を含むがん細胞を認識し、殺傷するようになる。現在、粒径によって抗原提示細胞を標的にすることは、パッシブターゲティングと呼ばれている。しかし、パッシブターゲティングだけでは、抗原提示細胞の表面に効率的に提示してT細胞と相互作用することはできない。300nmのナノ粒子を例とすると、それは樹状細胞やB細胞などの抗原提示細胞によって貪食される場合があり、線維芽細胞などの他の細胞によって貪食される場合もある。
[発明内容]
これを考慮して、本発明の目的は、全細胞画分が担持された標的送達システムを提供して、前記標的送達システムがアクティブターゲティングの方式でがん細胞又は組織の水溶性及び非水溶性成分を含む全細胞画分を抗原提示細胞に提示し、腫瘍の予防及び治療効果を向上させることである。
これを考慮して、本発明の目的は、全細胞画分が担持された標的送達システムを提供して、前記標的送達システムがアクティブターゲティングの方式でがん細胞又は組織の水溶性及び非水溶性成分を含む全細胞画分を抗原提示細胞に提示し、腫瘍の予防及び治療効果を向上させることである。
本発明のもう一つの目的は、がんの予防及び/又は治療のためのワクチンの製造における、上記標的送達システムの使用を提供することである。
上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供する。
表面にターゲットヘッドを有するナノスケールサイズ又はミクロスケールサイズの粒子であって、前記粒子にはがん細胞又はがん組織の全細胞画分が担持され、前記非水溶性成分は可溶化剤によって溶解され、前記全細胞画分は細胞又は組織中の全細胞の水溶性成分及び非水溶性成分であり、前記ターゲットヘッドは特定の細胞又は組織の表面の分子と結合して前記粒子の細胞又は組織への進入を助ける、全細胞画分が担持された標的送達システムである。
本発明では、がん細胞又は組織を溶解させた後、まず純水又は可溶化剤を含まない水溶液に可溶な水溶性成分を得、その後、特定の可溶化剤を含む可溶化水溶液で水不溶性成分を可溶化剤に溶解させて、すべての細胞画分を水溶液に溶解できる成分に変換し、ナノ粒子又はミクロ粒子の内側と外側に担持させて標的送達システムを製造することができ、これにより、製造された標的送達システムにほとんどの抗原性物質が担持されることが保証する。実際の使用では、細胞又は組織を溶解させた後、水溶性成分及び非水溶性成分を別々にせずに、可溶化剤を含む可溶化水溶液を直接に使用して全細胞画分を溶解させて、可溶化水溶液に溶解された全細胞画分を使用して標的送達システムを製造することができる。
がん細胞又は腫瘍組織における細胞画分の水溶性成分及び非水溶性成分は、細胞全体の成分及び画分を包含する。その中で、正常な細胞と同じ成分の突然変異していないタンパク質、ポリペプチドと遺伝子は、自己免疫システムの発達プロセスで生成される免疫寛容があるため免疫反応を起こさないが、がんに起因する遺伝子、タンパク質とポリペプチドの突然変異は、自己免疫システムの発達プロセスで生成される免疫寛容がないため免疫原性があり、がん細胞に対する体の免疫反応を活性化させる。全細胞画分における疾患の突然変異によって産生されるこれらのがん細胞特異的免疫原性を有する物質を使用して、がんの予防及び治療に使用することができる。
本発明記載の標的送達システムにおいて、前記全細胞画分は、純水又は可溶化剤を含まない水溶液への溶解度に応じて、水溶性成分と非水溶性成分の二つの部分に分けることができる。前記水溶性成分は、純水又は可溶化剤を含まない水溶液に可溶な元の水溶性部分であり、前記非水溶性成分は、純水に不溶な元の非水溶性部分であり、適切な可溶化方法を使用して純水又は可溶化剤を含まない水溶液に不溶であることから、可溶化剤を含む水溶液に可溶な部分になるようにする。前記全細胞画分の水溶性部分及び非水溶性部分は、可溶化剤を含む可溶化水溶液によって溶解されることができる。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記可溶化剤は、尿素、塩酸グアニジン、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、グリセロール、pH7超のアルカリ溶液、pH7未満の酸性溶液、各種タンパク質分解酵素、アルブミン、レシチン、高濃度無機塩、トリトン(Triton)、トウェイン、DMSO、アセトニトリル、エタノール、メタノール、DMF、プロパノール、イソプロパノール、酢酸、コレステロール、アミノ酸、グルコシド、コリン、BrijTM-35、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル(Octaethylene glycol monododecyl ether)、CHAPS、デジトニン(Digitonin)、ラウリルジメチルアミンオキシド(lauryldimethylamine oxide)、IGEPAL(登録商標) CA-630、DMSO、アセトニトリル、エタノール、メタノール、DMF、イソプロパノール、プロパノール、ジクロロメタンと酢酸エチルなどが含まれるが、これらに限定されなく、それらの中から一つ又は複数を選択することができる。
前記非水溶性成分は、タンパク質及びポリペプチド断片を可溶化できる他の方法によって、純水に不溶から可溶に変えることもできる。ただし、本発明の具体的な実施プロセスでは、尿素、塩酸グアニジン、SDS、デオキシコール酸ナトリウム又はグリセロールの効果は、PEGなどの他の可溶化剤よりも明らかに優れている。好ましくは、本発明は、尿素又は塩酸グアニジンを含む可溶化溶液を直接使用して、細胞又は組織を直接溶解させ、全細胞画分を直接溶解させる。本発明で挙げられた実施例では、8M尿素と6M塩酸グアニジン水溶液を用いて腫瘍組織又はがん細胞の非水溶性成分を溶解させるが、実際の使用では、SDS及びグリセロールなど、全細胞画分の非水溶性成分を可溶化できる他の可溶化溶液を使用することができる。
ミクロ粒子又はナノ粒子には、抗原提示細胞を標的とするための最適な粒径を有しているが、異なる材料から製造されたナノ粒子又はミクロ粒子の最適なサイズは異なる場合がある。例えば、現在、カチオン性リポソームの最適なサイズは約50~150nmであり、PLGAで製造されたナノ粒子は約200~500nmである可能性があると考えられている。そしてミクロ粒子は理論的には1.5~5μmが最適であると考えられている。この最適なサイズは、粒子の材質によって異なる。粒径による抗原提示細胞を標的にすることは、パッシブターゲティングと呼ばれている。
本発明はパッシブターゲティングに加えて、さらにアクティブターゲティング戦略を使用し、即ち、ナノ粒子又はミクロ粒子の外側に特定の細胞を標的とすることができるターゲットヘッド分子を接続させる。これにより、ナノ粒子又はミクロ粒子を特定の細胞又は組織の表面に直接標的とし、リガンド受容体との結合する方法により前記粒子の細胞又は組織への進入を助けることができる。これらの細胞には、白血球中の樹状細胞、マクロファージ、B細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、好中球、好酸球、好塩基球が含まれるが、これらに限定されなく、前記ターゲットヘッドが標的とすることができる組織には、リンパ節、胸腺、脾臓、骨髄が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞及び組織を標的とすることができる分子には、マンノース、マンナン、CD32抗体、CD11c抗体、BDCA-1抗体、CD141抗体、CD123抗体、CD14抗体、CD19抗体、CD20抗体、CD103抗体、CD11b抗体、CD33抗体、CD40抗体、CD40L抗体、CD80抗体、CD86抗体が含まれるが、これらに限定されない。
例えば、パッシブターゲティングのみに依存する場合、300nmのナノ粒子は、樹状細胞、B細胞などの抗原提示細胞によって貪食される可能性があるが、線維芽細胞などの他の細胞によって貪食される可能性もある。アクティブターゲティング戦略が使用される場合、最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞によってのみ貪食されるように指示することができる。本発明の列挙された実施例では、マンノース(即ち、ターゲットヘッド)で修飾されたナノ粒子又はミクロ粒子は樹状細胞を標的とし、実際の使用では、樹状細胞を標的とすることができる任意のターゲットヘッド又は他のタイプを標的とする特定の細胞又は組織を使用することができる。
ナノワクチン又はミクロワクチンの粒径はナノスケール又はミクロスケールであり、ワクチンが抗原提示細胞によって貪食されることを保証でき、貪食効率を向上させるために、粒子サイズは適切な範囲内にある必要がある。本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記ナノスケールサイズ粒子の粒径は、1nm~1000nmである。いくつかの実施形態において、前記ナノサイズ粒子の粒径は、30nm~800nmである。さらに、いくつかの実施形態において、前記ナノサイズ粒子の粒径は、50nm~600nmである。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記ミクロスケールサイズ粒子の粒径は、1μm~1000μmである。いくつかの実施形態において、前記ミクロサイズ粒子の粒径は、1μm~100μmである。いくつかの実施形態において、前記ミクロサイズ粒子の粒径は、1μm~10μmである。さらに、いくつかの実施形態において、前記ミクロサイズ粒子の粒径は、1μm~5μmである。
本発明に記載の送達システムにおいて、前記ナノサイズの粒子又はミクロサイズの粒子の表面は電気的に中性であってもよく、負に帯電又は正に帯電することができる。
標的送達システムの免疫原性及び効果を高めるために、所定の免疫調節機能を有する免疫アジュバントを添加することもでき、例えば、パターン認識受容体アゴニスト、BCG細胞壁骨格、BCGメタノール抽出残留物、BCGムラミルジペプチド、マイコバクテリウムフレイ、ポリアクチンA、鉱油、ウイルス様粒子、免疫増強再構成インフルエンザウイルス粒子、コレラ・エンテロトキシン、サポニン及びその誘導体、レジキモド(Resiquimod)、チモシン、新生ウシ肝活性ペプチド、ミキモド(Miquimod)、多糖類、クルクミン、免疫アジュバントポリICLC、コリンバクテリウム・パルバム(corynebacterium parvum vaccine)、溶血性レンサ球菌製剤、コエンザイムQ10、レバミソール、ポリシチジル酸、インターロイキン、インターフェロン、ポリイノシン酸、ポリアデニル酸、ミョウバン、リン酸アルミニウム、ラノリン、植物油、エンドトキシン、リポソームアジュバント、GM-CSF、MF59、二本鎖RNA、二本鎖DNA、水酸化アルミニウム、CAF01、人参(Ginseng)、レンゲなどの漢方薬の有効成分であり、それらの一つ又は複数を選択できる。本発明に記載の免疫アジュバントを添加する方法は、ナノ粒子又はミクロ粒子内に担持させ、又はナノ粒子又はミクロ粒子の表面に担持さで、又はナノ粒子又はミクロ粒子内及びナノ粒子又はミクロ粒子の表面に一緒に担持させることを含む。好ましくは、免疫アジュバントは全細胞画分に添加される。
本発明の具体的な実施形態において、ポリイノシン-ポリシチジル酸(Polyinosinic-polycytidylic acid)(ポリ(I:C))、カルメット・ゲラン菌(BCG)又はCpGが免疫アジュバントとして使用され、がん細胞ライセート又は腫瘍組織ライセートを含有する水溶性成分及び可溶化剤に可溶な元の非水溶性成分に添加され、ポリ(I:C)、BCG又はCpGの濃度は、好ましくは1ng/mLより大きい。
標的送達システムの標的化及び効果を改善するために、本発明はまた、粒子の外側にPEG保護膜を添加することを含む。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記ナノスケールサイズ又はミクロスケールサイズの粒子の製造材料は、有機合成高分子材料、天然高分子材料、無機材料、細菌又はウイルスの中の一つ又は複数である。
ここで、前記有機合成高分子材料は、生体適合性又は分解性の高分子材料であり、PLGA、PLA、PGA、ポロキサマー(Poloxamer)、PEG、PCL、PEI、PVA、PVP、PTMC、ポリアンハイドライド(polyanhydride)、PDON、PPDO、PMMA、ポリアミノ酸、合成ポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
前記天然高分子材料は、生体適合性又は分解性の高分子材料であり、リン脂質、コレステロール、デンプン、糖類、ポリペプチド、アルギン酸ナトリウム、アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、細胞膜成分が含まれるが、これらに限定されない。
前記無機材料は、非明示的な生体毒性材料であり、三酸化二鉄、四酸化三鉄、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムが含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載の送達システムの形状は、任意の一般的な形状であり、球形、楕円形、樽形、多角形、棒状、シート状、線状、ウォーム状、方形、三角形、蝶形又は円盤状が含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載の標的送達システムにおいて、前記担持方法は、全細胞の水溶性成分と非水溶性成分とが別々に又は一緒に粒子内部に担持され、及び/又は別々に又は一緒に粒子表面に担持されることである。水溶性成分が一緒に粒子中に、及び粒子表面に担持されること、非水溶性成分が一緒に粒子中に、及び粒子表面に担持されること、水溶性成分が粒子中に担持され、非水溶性成分が粒子表面に担持されること、非水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分が粒子表面に担持されること、水溶性成分と非水溶性成分が粒子中に担持され、非水溶性成分のみが粒子表面に担持されること、水溶性成分と非水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分のみが粒子表面に担持されること、水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子表面に担持されること、非水溶性成分が粒子中に担持され、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子表面に担持されること、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子中に担持され、水溶性成分と非水溶性成分が一緒に粒子表面に担持されることが含まれるが、これらに限定されない。
本発明に記載の全細胞画分の送達システムの構造の模式図は図2~図17に示される通りである。実際の使用プロセスでは、その中の特定の構造を有するナノ粒子又はミクロ粒子を一つだけ使用することができ、又は異なる構造を有するナノ粒子又はミクロ粒子複数を同時に使用することができる。
本発明に記載の標的送達システムは、ナノサイズ粒子及びミクロサイズ粒子の既に開発された任意の製造方法に従って製造することができ、一般的な溶媒蒸発法、透析法、押出法、ホットメルト法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記送達システムは、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法によって製造される。
本発明に記載の全細胞画分の標的送達システムは、担持された全細胞画分を関連する免疫細胞に送達し、担持された成分の免疫原性を通じてがん細胞に対する自己免疫システムの殺傷効果を活性化及び増強することができる。したがって、本発明はまた、がんを予防及び/又は治療するためのワクチンの製造における前記全細胞画分の標的送達システムの使用を提供する。
ここで、前記がんは固形腫瘍又は血液系腫瘍であり、内分泌系腫瘍、神経系腫瘍、生殖器系腫瘍、消化器系腫瘍、泌尿器系腫瘍、免疫系腫瘍、循環器系腫瘍、呼吸器系腫瘍、血液系腫瘍、皮膚系腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。
がんを予防及び治療するためのがんワクチンとして使用する場合、本発明に記載の標的送達システムは、がんの発生前又はがんの発生後に複数回投与して体の免疫系を活性化させ、それによってがんの進行を遅らせ、がんを治療し、又はがんの再発を予防することができる。
上記の技術的解決策から分かるように、本発明は、特定の可溶化剤を含む水溶液を使用することで、細胞中の純水又は可溶化剤を含まない水溶液に不溶である成分を可溶に変換し、ナノ粒子及びミクロ粒子を製造するために使用することができ、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される抗原性物質又は成分の包括性と免疫原性を改善する。同時に、抗原提示細胞を標的とすることができるターゲットヘッドを追加して、アクティブターゲティングの方式で抗原提示細胞の貪食効率を改善し、それによってがんの予防又は治療効果を改善する。
[図面説明]
図1は、本発明に記載のワクチンの製造プロセス及び使用分野の模式図であり、a:水溶性成分と非水溶性成分からそれぞれナノワクチン又はミクロワクチンを収集・製造する模式図であり、b:可溶化剤を含む可溶化液を用いて全細胞画分を溶解させ、及びナノワクチン又はミクロワクチンを製造する模式図である。
図1は、本発明に記載のワクチンの製造プロセス及び使用分野の模式図であり、a:水溶性成分と非水溶性成分からそれぞれナノワクチン又はミクロワクチンを収集・製造する模式図であり、b:可溶化剤を含む可溶化液を用いて全細胞画分を溶解させ、及びナノワクチン又はミクロワクチンを製造する模式図である。
図2~図12は、水溶性及び非水溶性細胞成分を担持させたナノサイズ粒子又はミクロサイズ粒子の構造の模式図であり、ここで、1:細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、2、細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、3、免疫アジュバントであり、4、ナノ粒子又はミクロ粒子であり、5:ナノ粒子中の内核部分であり、6:特定の細胞又は組織を標的にすることができるターゲットヘッドである。図2~図3では、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面と内部に免疫アジュバントが含まれている。図4~図5では、免疫アジュバントはナノ粒子又はミクロ粒子の内部にのみ分布している。図6~図7では、ナノ粒子又はミクロ粒子は外側表面のみに免疫アジュバントを含む。図8~図9では、ナノ粒子又はミクロ粒子の内部及び外側表面のいずれにも免疫アジュバントが含まれていない。図10では、細胞画分及び/又は免疫アジュバントはナノ粒子又はミクロ粒子の内部にのみ分布している。図11では、細胞画分及び/又は免疫アジュバントはナノ粒子又はミクロ粒子の外部にのみ分布している。図12では、細胞画分及び免疫アジュバントはそれぞれナノ粒子又はミクロ粒子の内部又は外部に分布している。
図2~9において、図2の2.a~2.i、図4の6.a~6.i、図6の10.a~10.i、及び図8の14.a~14.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に分布している場合、明確な内核を形成しない。図2の3.a~3.i、図4の7.a~7.i、図6の11.a~11.i、及び図8の15.a~15.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の一つの内核部分に分布している。図3の4.a~4.i、図5の8.a~8.i、図7の12.a~12.i、及び図9の16.a~16.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の複数の内核部分に分布している。図3の5.a~5.i、図5の9.a~9.i、図7の13.a~13.i、及び図9の17.a~17.iでは、ナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に形成される内核の外層に分布している。a:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部と表面に担持されるのは細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、b:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部と表面に担持されるのは細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、c:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に担持されるのは細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、表面に担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、d:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に担持されるのは細胞又は組織画分中の水溶性成分であり、表面に担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の非水溶性成分であり、e:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面にも細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持され、f:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分がに一緒に担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の水溶性成分のみが担持され、g:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分がに一緒に担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の非水溶性成分のみが担持され、h:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の非水溶性成分のみが担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持され、i:ナノ粒子又はミクロ粒子の内部に細胞又は組織画分中の水溶性成分のみが担持され、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面に細胞又は組織画分中の水溶性成分と非水溶性成分が一緒に担持される。
図10~12において、a、b及びcにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に分布している場合、明確な内核を形成しない。d、e及びfにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の一つの内核部分に分布している。g、h及びiにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部の複数の内核部分に分布している。j、k及びlにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持される細胞又は組織画分中の水溶性成分又は非水溶性成分がナノ粒子又はミクロ粒子の内部に形成される内核の外層に分布している。a、d、g及びjにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の水溶性成分である。b、e、h及びkにおけるナノ粒子又はミクロ粒子によって担持されるのはいずれも細胞又は組織画分中の非水溶性成分である。c、f、i及びlにおけるナノ粒子又はミクロ粒子は一緒に細胞又は組織画分中の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させる。
図13~19は、実施例1~7において、腫瘍組織又はがん細胞の全細胞画分が標的ナノ粒子又はミクロ粒子に担持される場合における、がんの治療及び予防に使用される結果である。a、腫瘍組織又はがん細胞の全細胞画分中の水溶性成分/又は一緒に非水溶性成分を担持させた標的ナノ粒子又はミクロ粒子の構造である。b、腫瘍組織又はがん細胞の全細胞画分中の非水溶性成分を担持させた標的ナノ粒子又はミクロ粒子の構造である。c、腫瘍増殖阻害に対する標的ナノワクチン又はミクロワクチンの実験結果である。d、マウスの生存期実験の結果である。実験結果において、腫瘍増殖阻害実験グラフの各データポイントは、平均値±標準誤差(mean±SEM)である。腫瘍増殖阻害実験及びマウス生存期実験ではn=10である。図cの腫瘍増殖阻害実験における有意差は、ANOVA法によって分析される。図dの有意差はKaplan-Meier及びlog-rank testによって分析される。*は当該群がPBS対照群と比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。☆は当該群がブランクナノ粒子又はブランクミクロ粒子対照群と比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。
は当該群がPEG保護層を含まないナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。★は当該群がPEG可溶化非水溶性成分により製造されるナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。
は当該群がPEG保護層を含まないナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。★は当該群がPEG可溶化非水溶性成分により製造されるナノワクチンと比較してp<0.05であり、有意差があることを示す。
[具体的な実施方式]
本発明の実施例は、全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用を開示する。当業者は、本明細書の内容を参照して、プロセスパラメータを適切に改善して実現することができる。すべての類似の置換及び変更は当業者には自明であり、それらは本発明に含まれるとみなされることを特に指摘しておくべきである。本発明に記載の標的送達システム及びその使用は、好ましい実施例を通じて説明されたが、関係者は、本発明の内容、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の標的送達システム及びその使用に対して変更又は適切な変更及び組み合わせを行って本発明を実現し、使用することができることは明らかである。
本発明の実施例は、全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用を開示する。当業者は、本明細書の内容を参照して、プロセスパラメータを適切に改善して実現することができる。すべての類似の置換及び変更は当業者には自明であり、それらは本発明に含まれるとみなされることを特に指摘しておくべきである。本発明に記載の標的送達システム及びその使用は、好ましい実施例を通じて説明されたが、関係者は、本発明の内容、精神、及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の標的送達システム及びその使用に対して変更又は適切な変更及び組み合わせを行って本発明を実現し、使用することができることは明らかである。
本発明に記載の全細胞画分の送達システムは、がんの予防及び/又は治療のためのワクチンの製造に用いることができ、その製造プロセス及び使用分野は図1に示される通りである。製造において細胞又は組織を溶解させた後、まず水溶性成分及び水不溶性成分をそれぞれ収集し、それぞれナノワクチン又はミクロワクチンを製造することができ、又は、可溶化剤を含む可溶化溶液を直接使用して細胞又は組織を直接溶解させ、全細胞画分を溶解させて、ナノワクチン又はミクロワクチンを製造することもできる。
本発明に記載の標的送達システム(ナノワクチン又はミクロワクチンとも呼ばれる)の製造方法は、一般的な製造方法である。いくつかの実施形態において、ナノワクチン又はミクロワクチンの製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されるナノ粒子又はミクロ粒子の製造材料は、有機高分子ポリ乳酸-グリコール酸コポリマー(PLGA)及びポリ乳酸(PLA)である。使用される免疫アジュバントは、ポリ(I:C)、カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)又はCpGである。当業者は、実際の使用プロセスにおいて、当業者が特定の条件に従って、製造方法、製造プロセス、使用されるナノ粒子又はミクロ粒子の製造材料、免疫アジュバントの種類及び濃度などを適切に調整できることが理解できる。
いくつかの実施形態において、本発明で採用されるダブルエマルション法の具体的な製造方法は下記の通りである。
ステップ1:第1所定体積の第1所定濃度を含有する水相溶液を、第2所定体積の第2所定濃度の医療用高分子材料を含有する有機相に添加する。
いくつかの実施形態において、水相溶液は、がん細胞ライセート中の各画分及び免疫増強アジュバントであるポリ(I:C)、BCG又はCpGを含み、がん細胞ライセート中の各画分は、製造時にそれぞれ水溶性成分又は8M尿素もしくは他の可溶化剤に溶解させた元の非水溶性成分である。水相溶液に含まれるがん細胞由来の水溶性成分の濃度又はがん細胞由来の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分の濃度、すなわち第1所定濃度は、タンパク質ポリペプチドの濃度含有量が1ng/mLを超える必要があり、このような濃度を選択する理由は、一般に、使用される細胞ライセートの水溶液の濃度が高いほど、製造されたナノ粒子又はミクロ粒子に担持される様々ながん抗原が多くなり、製造されたタンパク質ポリペプチドの濃度が1ng/mLを超える場合、即ち、第1所定濃度が1ng/mLを超える場合、十分ながん抗原を担持できて関連する免疫応答を活性化することができることを発明者が多量の実験を通じて発見したためである。最初の水相における免疫アジュバントの濃度は、0.01ng/mLより高い。また、第1所定体積は600μLである。
いくつかの実施形態において、水相溶液は、腫瘍組織ライセート中の各画分及び免疫増強アジュバントであるポリ(I:C)、BCG又はCpGを含み、腫瘍組織ライセート中の各画分は、製造時にそれぞれ水溶性成分又は8M尿素もしくは他の可溶化剤に溶解させた元の非水溶性成分である。水相溶液に含まれる腫瘍組織由来の水溶性成分の濃度又は腫瘍組織由来の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分の濃度、即ち、第1所定濃度は、タンパク質ポリペプチドの濃度含有量が1ng/mLを超える必要があり、このような濃度を選択する理由は、一般に、使用される腫瘍組織ライセートの水溶液の濃度が高いほど、製造されたナノ粒子又はミクロ粒子に担持される様々ながん抗原が多くなり、製造されたタンパク質ポリペプチドの濃度が1ng/mLを超える場合、即ち、第1所定濃度が1ng/mLを超える場合、十分ながん抗原を担持できて関連する免疫応答を活性化することができることを発明者が多量の実験を通じて発見したためである。最初の水相における免疫アジュバントの濃度は、0.01ng/mLより高い。また、第1所定体積は600μLである。
本発明では、医療用高分子材料を有機溶媒に溶解させて、第2所定体積の第2所定濃度の医療用高分子材料を含有する有機相を得る。いくつかの実施形態において、医療用高分子材料は、ターゲットヘッドに修飾されるPLGA、PLGAとPLAの混合物であり、有機溶媒はジクロロメタンを選択し、得られた有機相の体積、即ち、第2所定体積は2mLである。さらに、いくつかの実施形態において、医療用高分子材料の第2所定濃度の範囲は0.5mg/mL~5000mg/mLであり、好ましくは100mg/mLである。
本発明において、PLGAとターゲットヘッドに修飾されるPLGAを選択する理由は、当該材料が生分解性材料であり、FDAによって薬物ドレッシングとしての使用が承認されているからであり、実際の使用では、ナノサイズの粒子又はミクロサイズの粒子を製造するために使用できる他の材料とターゲットヘッド修飾材料の混合物も選択できる。
実際には、有機相の第2所定体積は、水相の第1所定体積に対する比率に従って設定され、本発明において、水相の第1所定体積と有機相の第2所定体積との比率範囲は1:1.1~1:5000であり、好ましくは1:10である。具体的な実施プロセスでは、第1所定体積、第2所定体積、及び第1所定体積と第2所定体積との比率を必要に応じて調節することより、製造されたナノ粒子又はミクロ粒子のサイズを調節することができる。
ステップ2:ステップ1で得られた混合溶液を2秒を超える超音波処理又は1分を超える攪拌を行う。
当該ステップの目的は、ナノメータ化又はミクロ化を行うためであり、超音波時間の長さ又は攪拌速度と時間は、製造されたナノ粒子のサイズを制御でき、長すぎるか短すぎると、粒子サイズが変化するため、適切な超音波時間を選択する必要がある。本発明において、超音波時間は2秒を超え、攪拌速度は50rpmを超え、攪拌時間は1分を超える。
ステップ3:ステップ2の処理後に得られた混合物を、第3所定体積の第3所定濃度の乳化剤を含有する水溶液に添加し、2秒を超える超音波処理又は1分を超える攪拌を行う。
当該ステップでは、ステップ2で得られた混合物を乳化剤水溶液に加えて、続いて超音波処理又は攪拌してナノメータ化又はミクロ化させる。
本発明において、乳化剤水溶液はポリビニルアルコール(PVA)水溶液であり、第3所定体積は5mLであり、第3所定濃度は20mg/mLである。第3所定体積は、第2所定体積に対する比率に従って調節される。本発明において、第2所定体積と第3所定体積との比率範囲は1:1.1~1:1000に設定され、好ましくは2:5であってもよい。具体的な実施プロセスでは、ナノ粒子のサイズを制御するために、第2所定体積と第3所定体積との比率を調節することができる。
同様に、当該ステップにおける超音波時間又は攪拌時間、乳化剤水溶液の体積及び濃度は、いずれも適切なサイズのナノ粒子又はミクロ粒子を得るための値を取る。
ステップ4:ステップ3の処理後の液体を、第4所定体積の第4所定濃度の乳化剤水溶液に添加し、所定の攪拌条件が満たされるまで攪拌する。
当該ステップでは、乳化剤水溶液は依然としてPVAであり、第4所定体積は50mLを超える。
第4所定濃度は5mg/mLであり、第4所定濃度は、適切なサイズのナノ粒子又はミクロ粒子を得ることができる値を選択する。第4所定体積の選択は、第3所定体積と第4所定体積との比率に従って決定される。本発明において、第4所定体積と第3所定体積との比率の範囲は1:1.5~1:2000であり、好ましくは1:10である。具体的な実施プロセスでは、ナノ粒子又はミクロ粒子のサイズを制御するために、第3所定体積と第4所定体積との比率を調節することができる。
本発明において、本ステップにおける所定の攪拌条件は、有機溶媒の揮発が完了するまで、即ち、ステップ1におけるジクロロメタンの揮発が完了するまでである。
ステップ5:ステップ4に処理された所定の撹拌条件を満たす混合液を、100RPMを超える回転速度で1分以上遠心分離した後、上清液を除去し、残りの沈殿物を第5所定体積の第5所定濃度の凍結乾燥保護剤を含有する水溶液又は第6所定体積のPBS(又は生理食塩水)に再懸濁させる。
本発明のいくつかの実施形態において、ステップ5で得られた沈殿は、第6所定体積のPBS(又は生理食塩水)に再懸濁させる場合に凍結乾燥する必要はなく、その後のナノ粒子又はミクロ粒子の表面へのがん細胞ライセートの吸着に関連する実験を直接行うことができる。
本発明のいくつかの実施形態において、ステップ5で得られた沈殿は、凍結乾燥保護剤を含有する水溶液に再懸濁させる場合に凍結乾燥する必要があり、凍結乾燥の後、ナノ粒子又はミクロ粒子の表面へのがん細胞ライセートの吸着に関連する実験を行う。
本発明において、前記凍結乾燥保護剤は、トレハロース(Trehalose)を選択する。
本発明において、当該ステップにおける凍結乾燥保護剤の第5所定体積は20mLであり、第5所定濃度は4質量%であり、この設定の理由は、その後の凍結乾燥を行う際の凍結乾燥効果に影響を与えないようにするためである。
ステップ6:ステップ5で得られた凍結乾燥保護剤を含む懸濁液を凍結乾燥処理した後、凍結乾燥物を使用のために保存する。
ステップ7:第6所定体積のステップ5で得られたPBS(又は生理食塩水)中に再懸濁させたナノ粒子(又はミクロ粒子)を含有する懸濁液、又は第6所定体積のPBS(又は生理食塩水)を用いてステップ6で得られた凍結乾燥後のナノ粒子(又はミクロ粒子)と凍結乾燥保護剤を含有する凍結乾燥物を再懸濁させ、第7所定体積の水溶性成分又は8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分と混合した後、0.1分以上静置することでナノワクチン又はミクロワクチンを得る。
本発明において、第六所定体積と第七所定体積との体積比は、1:10000~10000:1であり、好ましい体積比は1:100~100:1であり、最適な体積比は1:30~30:1である。
いくつかの実施形態において、前記再懸濁させたナノ粒子又はミクロ粒子の懸濁液の体積は10mLであり、がん細胞ライセートを含む、又は腫瘍組織ライセートを含む水溶性成分又は8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分の体積は1mLである。
いくつかの実施形態において、図2に示されるように、本発明は、最初に細胞画分中の純水に可溶な水溶性部分又は(及び)非水溶性部分を可溶化剤によって可溶化させた後でナノ粒子又はミクロ粒子内に担持させ、一緒に免疫増強剤を担持させ;次に細胞画分の水溶性部分又は(及び)非水溶性部分をナノ粒子又はミクロ粒子の表面に吸着させ、一緒に免疫増強剤を吸着させる。このようにして、ナノ粒子又はミクロ粒子中の細胞の水溶性成分又は非水溶性成分の負荷容量を最大化することができる。実際の使用プロセスにおいて、可溶化剤を含む可溶化溶液(8M尿素水溶液又は6M塩酸グアニジン水溶液)を直接使用して、細胞又は組織を直接溶解させ、全細胞画分を直接溶解させてから、ナノワクチン又はミクロワクチンを製造することもできる。
以下は、本発明によって提供される全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用をさらに説明する。
実施例1、黒色腫腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがん細胞モデルとした。本実施例では、マウス黒色腫腫瘍組織の溶解成分をナノ粒子の内部及び表面に担持させてナノワクチンを製造した。まず、マウス黒色腫腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分及び8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)及びPLAをナノ粒子骨格材料とし、CpGを免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。その後、当該ナノワクチンを使用して、黒色腫担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
各C57BL/6マウスの背部に150000個のB16F10黒色腫細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し;得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を治療するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
各C57BL/6マウスの背部に150000個のB16F10黒色腫細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し;得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を治療するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたPLAの分子量は10KDaであった。非修飾PLGA、マンノースで修飾されたPLGA及びPLAの質量比は8:1:2であった。使用された免疫アジュバントはCpGであり、またCpGはナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約280nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたCpG免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約240nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のCpGを含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたPLAの分子量は10KDaであった。非修飾PLGA、マンノースで修飾されたPLGA及びPLAの質量比は8:1:2であった。使用された免疫アジュバントはCpGであり、またCpGはナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約280nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたCpG免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約240nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のCpGを含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
本研究で使用される実験群は下記のように設定された:ナノワクチン群、PBS対照群、ブランクナノ粒子+組織ライセート群。
本研究で使用される実験群は下記のように設定された:ナノワクチン群、PBS対照群、ブランクナノ粒子+組織ライセート群。
6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して黒色腫担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子と200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子を皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
ブランクナノ粒子+組織ライセート対照群:0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ同量の腫瘍組織ライセート中の水溶性成分、同量のライセート中の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分、及び同量のCpGを担持させたがライセート成分を担持させていない4mgのPLGAブランクナノ粒子を皮下注射した。ブランクナノ粒子の表面に遊離のライセートが吸着するのを避けるために、上記の3つを別々に投与して異なる部位に注射する必要がある。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。動物実験における倫理的な理由から、マウスの生存期試験では、マウスの腫瘍体積が2000mm3を超えた場合、マウスは死亡したとみなされ、マウスを安楽死させた。
(4)実験結果
図13に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+組織ライセート対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒することができることが分かった。
図13に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+組織ライセート対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒することができることが分かった。
実施例2、黒色腫腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたミクロ粒子の内部及び表面に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがんモデルとし、ミクロワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形は状況に応じて調節できる。
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがんモデルとし、ミクロワクチンを使用して黒色腫を治療する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形は状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス黒色腫腫瘍組織のすべての溶解成分をミクロ粒子の内部及び表面に一緒に担持させてミクロワクチンを製造した。まず、マウス黒色腫腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分及び8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)をミクロ粒子骨格材料とし、ポリ(I:C)を免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を一緒に担持させたミクロワクチンを製造した。その後、当該ミクロワクチンを使用して、黒色腫担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
処理方法は実施例1と同様である。
処理方法は実施例1と同様である。
(2)ミクロワクチンの製造
本実施例において、ミクロワクチン及び対照としてのブランクミクロ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたミクロ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はミクロ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りであり、水溶性成分と非水溶性成分は同じミクロ粒子に一緒に担持された。本実施例では、全細胞画分をミクロ粒子の内部と表面に一緒に担持させた。全細胞画分がミクロ粒子表面に担持される場合、全細胞画分が担持されたミクロ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ミクロ粒子の平均粒径は約2.0μmであり、ミクロ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-17mVであった。PLGAミクロ粒子1mgあたり70μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAミクロ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクミクロ粒子の粒径は約1.8μmであり、ブランクミクロ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ミクロワクチン及び対照としてのブランクミクロ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたミクロ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)の質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はミクロ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りであり、水溶性成分と非水溶性成分は同じミクロ粒子に一緒に担持された。本実施例では、全細胞画分をミクロ粒子の内部と表面に一緒に担持させた。全細胞画分がミクロ粒子表面に担持される場合、全細胞画分が担持されたミクロ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ミクロ粒子の平均粒径は約2.0μmであり、ミクロ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-17mVであった。PLGAミクロ粒子1mgあたり70μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAミクロ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクミクロ粒子の粒径は約1.8μmであり、ブランクミクロ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)がん治療にミクロワクチンを使用
本研究の実験群は下記のように設定された:ミクロワクチン群、PBS対照群、ブランクミクロ粒子+細胞ライセート群。6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して黒色腫担がんマウスを製造した。
本研究の実験群は下記のように設定された:ミクロワクチン群、PBS対照群、ブランクミクロ粒子+細胞ライセート群。6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して黒色腫担がんマウスを製造した。
ミクロワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ400μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分と非水溶性成分を一緒に担持させた4mgPLGAミクロワクチンを皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
ブランクミクロ粒子+細胞ライセート対照群:0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれ同量のがん細胞ライセート中の水溶性成分+非水溶性成分及び同量のポリ(I:C)を担持させたが細胞ライセート成分を担持させていない4mgのPLGAブランクナノ粒子を皮下注射した。ブランクミクロ粒子の表面に遊離の細胞ライセートが吸着するのを避けるために、上記の二つを別々に投与して異なる部位に注射する必要がある。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図14に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクミクロ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ミクロワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたミクロワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒させることができることが分かった。
図14に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクミクロ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ミクロワクチン群におけるマウス腫瘍体積増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたミクロワクチンは、黒色腫に対して治療効果があり、黒色腫を部分的に治癒させることができることが分かった。
実施例3、黒色腫腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部及び表面に担持されてがん予防に使用される
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとし、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を予防する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス黒色腫をがんモデルとし、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して黒色腫を予防する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、B16-F10マウス黒色腫をがん細胞モデルとした。本実施例では、マウス黒色腫腫瘍組織の溶解成分をナノ粒子の内部及び表面に担持させてナノワクチンを製造した。まず、マウス黒色腫腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分及び8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、ポリ(I:C)を免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。その後、当該ナノワクチンを使用して、黒色腫担がんマウス体内における腫瘍を予防した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
方法は実施例1と同様である。
方法は実施例1と同様である。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGAとマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。本実施例では、全細胞画分がナノ粒子の内部と表面に一緒に担持させることを除いて、製造方法は上記の通りである。全細胞画分をナノ粒子表面に担持させる場合、全細胞画分が担持されたナノ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGAとマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。本実施例では、全細胞画分がナノ粒子の内部と表面に一緒に担持させることを除いて、製造方法は上記の通りである。全細胞画分をナノ粒子表面に担持させる場合、全細胞画分が担持されたナノ粒子と細胞成分を10:1の体積比で混合した後、15分間静置してもよい。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)がん予防にナノワクチンを使用
6~8週齢のメスC57BL/6を選択して黒色腫担がんマウスを製造した。B16F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンと200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンを皮下注射した。ナノワクチンの最終注射から14日後に、各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、当該日を腫瘍細胞接種の0日目に設定した。本実験では、PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。B16-F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種した。
6~8週齢のメスC57BL/6を選択して黒色腫担がんマウスを製造した。B16F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンと200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンを皮下注射した。ナノワクチンの最終注射から14日後に、各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種し、当該日を腫瘍細胞接種の0日目に設定した。本実験では、PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。B16-F10がん細胞の接種前42日目、35日目、28日目、21日目、及び14日目にそれぞれ400μLのPBSを皮下注射した。0日目に各マウスの背部右下に150000個のB16-F10細胞を皮下接種した。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図15に示されるように、PBS対照群と比較して、ナノワクチン予防群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載の樹状細胞ターゲティング能を有する、がん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して予防効果があることが分かった。
図15に示されるように、PBS対照群と比較して、ナノワクチン予防群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載の樹状細胞ターゲティング能を有する、がん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、黒色腫に対して予防効果があることが分かった。
実施例4、肺がん腫瘍組織の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されて肺がん予防に使用される
本実施例では、マウス肺がんをがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して肺がんを予防する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、マウス肺がんをがんモデルとして、腫瘍組織の全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して肺がんを予防する方法を説明した。実際の使用では、具体的な剤形、アジュバント、投与時間、投与回数、投与方法は、状況に応じて調節できる。
本実施例では、LLCマウス肺がんをがん細胞モデルとした。本実施例では、マウス肺がん腫瘍組織の溶解成分をナノ粒子の内部及び表面に担持させてナノワクチンを製造した。まず、マウス肺がん腫瘍塊を入手し、溶解させ、腫瘍塊組織の水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を製造した。次に、PLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、ポリ(I:C)を免疫アジュバントとし、溶媒揮発法を採用して腫瘍組織ライセートの水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。その後、当該ナノワクチンを使用して、肺がん担がんマウス体内における腫瘍を予防した。
(1)腫瘍組織の溶解及び各画分の収集
各C57BL/6マウスの側腹部に1000000個のLLC細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し、得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を予防するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
各C57BL/6マウスの側腹部に1000000個のLLC細胞を皮下接種し、各マウスの接種された腫瘍がそれぞれ400mm3から1500mm3の体積に成長した時にマウスを殺して腫瘍組織を採取した。腫瘍組織を切って研磨し、セルストレーナーを通して適量の純水を加え、凍結融解と超音波処理を少なくとも5回繰り返した。腫瘍組織部位の細胞が溶解された後、腫瘍塊組織の細胞ライセートを12000RPMを超える回転速度で5分間遠心分離して、上清液即ち腫瘍塊組織中の純水に可溶な水溶性成分を取得し、得られた沈殿部分に8M尿素水溶液を加えて沈殿部分を溶解させることで、純水に不溶な元の非水溶性成分を8M尿素水溶液に可溶に変換することができた。前記得られた腫瘍組織ライセートの水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん細胞を予防するためのナノワクチンを製造するための原料源であった。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
本実施例において、ナノワクチン及び対照としてのブランクナノ粒子の製造は、溶媒蒸発法におけるダブルエマルション法を採用し、使用されたナノ粒子製造材料PLGAの分子量は24KDa~38KDaであり、使用されたマンノースで修飾されたPLGAの分子量は24KDa~38KDaであった。非修飾PLGA及びマンノースで修飾されたPLGAの質量比は10:1であった。使用された免疫アジュバントはポリ(I:C)であり、またポリ(I:C)はナノ粒子内部に分布した。製造方法は上記の通りである。ナノ粒子の平均粒径は約300nmであり、ナノ粒子の平均表面電位Zeta potentialは約-8mVであった。PLGAナノ粒子1mgあたり60μgのタンパク質又はポリペプチド画分を担持させ、PLGAナノ粒子1mgあたりの内側と外側で使用されたポリ(I:C)免疫アジュバントは0.01mgで、内側と外側は半分ずつであった。ブランクナノ粒子の粒径は約260nmであり、ブランクナノ粒子の製造において、同量のポリ(I:C)を含む純水又は8M尿素をそれぞれ使用して、対応する水溶性成分と非水溶性成分を置換した。
(3)肺がん予防にナノワクチンを使用
6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して肺がん担がんマウスを製造した。
6~8週齢のメスC57BL/6をモデルマウスとして選択して肺がん担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。腫瘍細胞の接種前の-49日目、-42日目、-35日目、-28日目、及び-14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンと200μLの内部及び表面に8M尿素に溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノワクチンを皮下注射した。PBS対照群は対応する日に400μLのPBSを注射した。0日目に各マウスの背部右下に1000000個のLLC肺がん細胞を皮下接種した。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図16に示されように、PBSブランク対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、肺がんに対して予防効果があることが分かった。
図16に示されように、PBSブランク対照群と比較して、ナノワクチン群におけるマウス腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、肺がんに対して予防効果があることが分かった。
実施例5、乳がん細胞の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、マウスの乳がんの治療を使用して、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
本実施例では、マウスの乳がんの治療を使用して、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)がん細胞の溶解及び各画分の収集
定量の4T1細胞を収集し、培地を除去して-20℃~-273℃で凍結させ、所定量の超純水を加えて3回以上凍結融解を繰り返し、溶解細胞を破壊するために超音波を伴ってもよい。細胞溶解後、ライセートを100g以上の回転速度で1分以上遠心分離し、上清液即ち4T1中の純水に可溶な水溶性成分を取り、得られた沈殿部分に8M尿素を加えて沈殿部分を溶解させ、4T1中の純水に不溶の非水溶性分を8M尿素水溶液に可溶化させた。前記得られたがん細胞ライセート由来の水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん治療用ナノワクチンを製造するための原料源であった。
定量の4T1細胞を収集し、培地を除去して-20℃~-273℃で凍結させ、所定量の超純水を加えて3回以上凍結融解を繰り返し、溶解細胞を破壊するために超音波を伴ってもよい。細胞溶解後、ライセートを100g以上の回転速度で1分以上遠心分離し、上清液即ち4T1中の純水に可溶な水溶性成分を取り、得られた沈殿部分に8M尿素を加えて沈殿部分を溶解させ、4T1中の純水に不溶の非水溶性分を8M尿素水溶液に可溶化させた。前記得られたがん細胞ライセート由来の水溶性成分と8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分は、がん治療用ナノワクチンを製造するための原料源であった。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例4と同様であり、違いはLLC細胞を4T1細胞に、アジュバントをBCGアジュバントに置き換えたことである。
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例4と同様であり、違いはLLC細胞を4T1細胞に、アジュバントをBCGアジュバントに置き換えたことである。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ200μLの内部と表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバント、及び200μLの内部と表面に8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバントを皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
ブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群:0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目、及び20日目にそれぞれがん細胞ライセート中の水溶性成分、がん細胞ライセート中の8M尿素に溶解させた元の非水溶性成分、同量のBCG及び4mgのPLGAブランクナノ粒子を皮下注射した。ブランクナノ粒子の表面に遊離の細胞ライセートが吸着するのを避けるために、上記の3つを別々に投与して異なる部位に注射する必要がある。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。マウスの生存期試験では、マウスの腫瘍体積が2000mm3を超えた場合、マウスは死亡したとみなされ、マウスを安楽死させた。
(4)実験結果
図17に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ナノワクチン投与群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、乳がんに対して治療効果があることが分かった。
図17に示されるように、PBSブランク対照群及びブランクナノ粒子+細胞ライセート対照群と比較して、ナノワクチン投与群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、本発明に記載のがん細胞の水溶性成分と非水溶性成分を担持させたナノワクチンは、乳がんに対して治療効果があることが分かった。
実施例6、乳がん細胞の全細胞画分が、マンノースで修飾されたナノ粒子内部に担持されてがん治療に使用される
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。次に、PLGA及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料とし、溶媒蒸発法を採用して4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して、4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)がん細胞の溶解及び各画分の収集
製造方法は実施例5と同様である。
製造方法は実施例5と同様である。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。なお、PEG保護膜を含有するワクチン群では、製造時にPLGA有機相に3.5%のPEG-PLGA(PEGの部分子量は5000であり、PLGAの部分子量は25000である)を加えた。
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。なお、PEG保護膜を含有するワクチン群では、製造時にPLGA有機相に3.5%のPEG-PLGA(PEGの部分子量は5000であり、PLGAの部分子量は25000である)を加えた。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
6~8週齢のオスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
PEG保護膜を含有するナノワクチン群及びPEG保護膜を含有しないナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ200μLの水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバント、及び200μLの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子+0.5mgのBCGアジュバントを皮下注射した。
PBSブランク対照群の方案は下記の通りであった。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種し、4日目、7日目、10日目、15日目及び20日目に、それぞれ400μLのPBSを皮下注射した。
実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は、式v=0.52*a*b2を使用して計算され、ここで、vは腫瘍体積であり、aは腫瘍の長さであり、bは腫瘍の幅である。
(4)実験結果
図18に示されるように、PBSブランク対照群とPEG保護膜を含有しないナノワクチン群と比較して、PEG保護膜を含有するナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、PEG保護膜は、ナノ粒子が樹状細胞以外の細胞によって貪食されるのを防ぎ、体内のナノ粒子の循環時間を延長させ、それによってナノワクチンの標的化と有効性を改善することが分かった。
図18に示されるように、PBSブランク対照群とPEG保護膜を含有しないナノワクチン群と比較して、PEG保護膜を含有するナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、PEG保護膜は、ナノ粒子が樹状細胞以外の細胞によって貪食されるのを防ぎ、体内のナノ粒子の循環時間を延長させ、それによってナノワクチンの標的化と有効性を改善することが分かった。
実施例7:非水溶性成分に対する異なる可溶化剤の溶解度
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。それぞれ6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)を使用して非水溶性成分を溶解させた。次に、PLGA(50:50)及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料としてナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
本実施例では、マウスの乳がんの治療で、全細胞画分が担持されたナノワクチンを製造し、当該ワクチンを使用して乳がんを治療する方法を説明した。本実施例では、4T1マウストリプルネガティブ乳がん細胞をがん細胞モデルとした。まず4T1細胞を溶解させて、4T1細胞の水溶性成分及び非水溶性成分を製造した。それぞれ6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)を使用して非水溶性成分を溶解させた。次に、PLGA(50:50)及びマンノースで修飾されたPLGA(50:50)をナノ粒子骨格材料としてナノワクチンを製造した。カルメット・ゲラン菌ワクチン(BCG)アジュバントを免疫アジュバントとし、当該ナノワクチンを使用して4T1乳がん担がんマウス体内における腫瘍を治療した。
(1)がん細胞の溶解及び各画分の収集
製造方法は実施例5と同様である。違いは、本実施例では、6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)をそれぞれ使用して、溶解されたがん細胞中の非水溶性成分を溶解させることである。6M塩酸グアニジンの非水溶性成分に対する可溶化能はPEG(5000KD)よりも明らかに強く、非水溶性成分を可溶化する6M塩酸グアニジンの濃度は80mg/mLに達することができるが、PEG(5000KD)は非水溶性成分を1mg/mLまでしか可溶化できない。
製造方法は実施例5と同様である。違いは、本実施例では、6M塩酸グアニジンとPEG(5000KD)をそれぞれ使用して、溶解されたがん細胞中の非水溶性成分を溶解させることである。6M塩酸グアニジンの非水溶性成分に対する可溶化能はPEG(5000KD)よりも明らかに強く、非水溶性成分を可溶化する6M塩酸グアニジンの濃度は80mg/mLに達することができるが、PEG(5000KD)は非水溶性成分を1mg/mLまでしか可溶化できない。
(2)ナノワクチンの製造
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。さらに、非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造する場合、6M塩酸グアニジンによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は60mg/mLであり、PEGによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は1mg/mLであった。したがって、製造したナノワクチンを6M塩酸グアニジンで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり70μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させ、PEGで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり2μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させた。
本実施例におけるナノワクチンの製造方法、使用された材料などは、基本的に実施例5と同様であり、全細胞画分はナノ粒子の内部にのみ担持された。さらに、非水溶性成分を担持させたナノワクチンを製造する場合、6M塩酸グアニジンによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は60mg/mLであり、PEGによって可溶化された元の非水溶性成分の濃度は1mg/mLであった。したがって、製造したナノワクチンを6M塩酸グアニジンで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり70μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させ、PEGで可溶化した後の非水溶性成分を担持させたナノ粒子には、PLGAナノ粒子1mgあたり2μgのタンパク質/ポリペプチド成分を担持させた。
(3)がん治療にナノワクチンを使用
6~8週齢のメスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
6~8週齢のメスBALB/cマウスを選択して4T1担がんマウスを製造した。
ナノワクチン群の投与方案は下記の通りであった。腫瘍細胞の接種前の-49日目、-42日目、-35日目、-28日目、及び-14日目にそれぞれ200μLの内部及び表面にがん細胞ライセート中の水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子(0.5mgのBCGアジュバント)と200μLの内部及び表面に6M塩酸グアニジン又はPEGに溶解させたの元の非水溶性成分を担持させた2mgのPLGAナノ粒子(0.5mgのBCGアジュバント)を皮下注射した。PBS対照群は対応する日に400μLのPBSを注射した。0日目に各マウスの背部右下に400000個の4T1細胞を皮下接種した。実験では、6日目から3日ごとにマウスの腫瘍体積のサイズを記録した。腫瘍体積は実施例1と同様に算出された。
(4)実験結果
図19に示されるように、PBSブランク対照群及びPEGで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群と比較して、6M塩酸グアニジンで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、可溶化溶液と方法がナノワクチンの効果を改善するために重要であることが分かった。
図19に示されるように、PBSブランク対照群及びPEGで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群と比較して、6M塩酸グアニジンで非水溶性成分を可溶化して製造されたナノワクチン群における腫瘍増殖速度は有意に遅くなり(p<0.05)、またマウスの生存期間は有意に延長された(p<0.05)。これから、可溶化溶液と方法がナノワクチンの効果を改善するために重要であることが分かった。
以上では、本発明の方法及びその核となる考えを理解するためのものであり、当業者にとって、本発明の原理から逸脱することなく、本発明を改良及び変更でき、これらの改良及び変更も本発明の保護範囲内に入ることを指摘しておく。
Claims (10)
- 表面にターゲットヘッドを有するナノスケールサイズ又はミクロスケールサイズの粒子であって、前記粒子にはがん細胞又はがん組織の全細胞画分が担持され、前記非水溶性成分は可溶化剤によって溶解され、前記全細胞画分は細胞又は組織中の全細胞の水溶性成分及び非水溶性成分であり、前記ターゲットヘッドは特定の細胞又は組織の表面の分子に結合して、前記粒子の細胞又は組織への進入を助けることを特徴とする、全細胞画分が担持された標的送達システム。
- 前記可溶化剤は、尿素、塩酸グアニジン、デオキシコール酸ナトリウム、SDS、グリセロール、pH7超のアルカリ溶液、pH7未満の酸性溶液、各種タンパク質分解酵素、アルブミン、レシチン、高濃度無機塩、トリトン、トウェイン、DMSO、アセトニトリル、エタノール、メタノール、DMF、プロパノール、イソプロパノール、酢酸、コレステロール、アミノ酸、グルコシド、コリン、Brij-35、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、CHAPS、デジトニン、ラウリルジメチルアミンオキシド、IGEPAL(登録商標) CA-630、DMSO、アセトニトリル、エタノール、メタノール、DMF、イソプロパノール、プロパノール、ジクロロメタン、酢酸エチルの中の一つ又は複数であることを特徴とする、請求項1に記載の標的送達システム。
- 前記ターゲットヘッドはマンノースであることを特徴とする、請求項1に記載の標的送達システム。
- 前記特定の細胞又は組織は、樹状細胞、マクロファージ、B細胞、T細胞、NK細胞、NKT細胞、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ節、胸腺、脾臓、骨髄の一つ又は複数であることを特徴とする、請求項1に記載の標的送達システム。
- 前記ナノスケールサイズ粒子の粒径は1nm~1000nmであり、前記ミクロスケールサイズ粒子の粒径は1μm~1000μmであることを特徴とする、請求項1に記載の標的送達システム。
- 前記ナノスケールサイズの粒子又はミクロスケールサイズの粒子の製造材料は、有機合成高分子材料、天然高分子材料、無機材料、細菌又はウイルスの中の一つ又は複数である、請求項1又は5に記載の標的送達システム。
- 形状は、球形、楕円形、樽形、多角形、棒状、シート状、線状、ウォーム状、方形、三角形、蝶形又は円盤状であることを特徴とする、請求項1に記載の標的送達システム。
- 免疫アジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項1に記載の標的送達システム。
- 粒子の外部にPEG保護膜が添加されることをさらに含むことを特徴とする請求項1~8のいずれか一項に記載の標的送達システム。
- がんの予防及び/又は治療のためのワクチンの製造における、請求項1~9のいずれか一項に記載の標的送達システムの使用。
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