CN116966163A - 一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 - Google Patents
一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116966163A CN116966163A CN202310961101.4A CN202310961101A CN116966163A CN 116966163 A CN116966163 A CN 116966163A CN 202310961101 A CN202310961101 A CN 202310961101A CN 116966163 A CN116966163 A CN 116966163A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipid
- nucleic acid
- polypeptide
- solution
- preparing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 149
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 149
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 139
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 135
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 135
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 102
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 claims abstract description 191
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 57
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 56
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 51
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 20
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 75
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 62
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 41
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 37
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 36
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 34
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 26
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 5
- NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC NRJAVPSFFCBXDT-HUESYALOSA-N 0.000 claims description 3
- SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxy-butyl Chemical group [CH2]CCCO SXIFAEWFOJETOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HSBMBJDVXFRTTD-UHFFFAOYSA-N C(CCCCC)C(C(=O)OCCCCCCOC(C(CCCCCCCC)CCCCCC)=O)CCCCCCCC Chemical compound C(CCCCC)C(C(=O)OCCCCCCOC(C(CCCCCCCC)CCCCCC)=O)CCCCCCCC HSBMBJDVXFRTTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 102000020313 Cell-Penetrating Peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108010051109 Cell-Penetrating Peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 claims description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 claims description 2
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 claims description 2
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 claims description 2
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 19
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 abstract description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 abstract description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 abstract 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 108
- 239000002539 nanocarrier Substances 0.000 description 52
- -1 lipid nucleic acid Chemical class 0.000 description 47
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 33
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 24
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 16
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 16
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 13
- 108010026389 Gramicidin Proteins 0.000 description 13
- 229960004905 gramicidin Drugs 0.000 description 13
- ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N gramicidina Chemical group C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C4=CC=CC=C4NC=3)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC=O)C(C)C)CC(C)C)C(=O)NCCO)=CNC2=C1 ZWCXYZRRTRDGQE-SORVKSEFSA-N 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 108700021021 mRNA Vaccine Proteins 0.000 description 3
- 229940126582 mRNA vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001478 Bacitracin Proteins 0.000 description 1
- SQRDXGHYNZDIBW-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCNC(C)=O Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCNC(C)=O SQRDXGHYNZDIBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229960003071 bacitracin Drugs 0.000 description 1
- 229930184125 bacitracin Natural products 0.000 description 1
- CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N bacitracin A Chemical compound C1SC([C@@H](N)[C@@H](C)CC)=N[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]1C(=O)N[C@H](CCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2N=CNC=2)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCCCC1 CLKOFPXJLQSYAH-ABRJDSQDSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000002676 xenobiotic agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
- A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
- A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
- A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明公开了一种核酸与多肽的制剂及其制备方法,所述核酸与多肽的制剂具体为一种多肽/脂质体组装的纳米核酸载体,其中脂质部分包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG‑脂质。该纳米核酸载体的具体制备方法:首先将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG‑脂质混合均匀,与不含核酸的水相缓冲溶液通过微流控法制备超滤成无乙醇的空载纳米颗粒,然后将多肽与核酸静置复合,最后将复合物与空载脂质体通过静电作用结合从而组装成纳米核酸载体。该载体的优势是利用人体相容性较好的多肽与较低剂量的脂质构建出能够保护核酸,并通过脂质体融膜作用和多肽穿膜机制之间的协同作用突破细胞膜进入细胞,在细胞质内释放出核酸。同时通过改变多肽的种类,使用具备靶向功能的多肽使该纳米核酸载体可以进入特定的靶向细胞进行核酸的递送。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域,具体涉及一种核酸与多肽的制剂及其制备方法。
背景技术
2020年两款mRNA疫苗的上市宣告以mRNA为代表的核酸技术正式进入商业化时代,mRNA疫苗有可能解决传统疫苗技术无法解决的许多未满足的医疗需求,因其技术优势可广泛应用于预防疫苗、治疗疫苗、治疗药物等诸多领域。mRNA理论上能够表达任何蛋白质,可以防治多种疾病,因此以mRNA为代表的核酸药物可以作为一种极具潜力的通用技术平台。而mRNA的脆弱性使得递送成为关键问题。
目前已上市的两款mRNA疫苗:Moderna和BioNTech/辉瑞的新冠疫苗分别需要在-15~-25℃和-60~-90℃环境中储存,这严重阻碍了疫苗的流通和临床使用。主要原因是环境中的RNA酶导致了核酸的降解。为了突破这一技术瓶颈,本发明利用将核酸在使用前加入的方式,减少核酸接触环境中的RNA酶,降低核酸药物的降解,而脂质对存储环境要求较低,实现了将药物在4℃冷藏的突破。
而多肽,特别是短杆菌肽在核酸递送领域是极具潜力的递送载体,将多肽与脂质组合递送核酸药物是当前生物技术领域的热门方向。但在核酸药物制备过程中,最后超滤会影响核酸分子的稳定性,降低整个系统的递送效率,成为阻碍新型多肽脂质递送系统研究领域的一大技术障碍。本发明利用将多肽与核酸在使用前加入的方式,避免了多肽及核酸在超滤工艺过程中的损失,保证了转染的可靠性,并且加入多肽能够提高递送效率及降低细胞毒性。同时选用超滤工艺除醇,相比常规的透析除醇速度快,且易大量制备。能够实现粒径分布的均一性,保证了制剂的稳定性和较高的包封率。
发明内容
要解决的技术问题:本发明的目的在于克服现有多肽递送系统制备技术中的不足,提供一种脂质与多肽复合递送核酸的制备方法。该制备方法可以有效检验多肽或核酸的体内外有效性,简化了筛选过程,提高了制剂制备的可靠性,该技术可用于体外细胞或体内转染等应用场景。
技术方案:一种核酸与多肽的制剂的制备方法,包括以下步骤:
S1.空载脂质纳米颗粒的制备:将各种脂质体分别溶解于醇溶液中,混合均匀得到有机相溶液,再与不含核酸的水相缓冲溶液通过微流控混合,得到混合溶液,然后向混合物中加入超滤缓冲液,接着采用中空纤维切向流过滤或离心机对混合溶液进行超滤(超滤孔径小于100KD)除醇,使制备后的脂质纳米颗粒乙醇含量降至0.5%以下,再经过0.22μm滤膜过滤,得到空载脂质纳米颗粒;
S2.纳米核酸载体的制备:将多肽与核酸静置复合不少于10min,得到多肽与核酸的复合物,然后将此复合物与空载脂质纳米颗粒混合均匀,复合不少于10min,利用静电作用使多肽/脂质/核酸组装成均匀稳定的纳米颗粒,即得到纳米核酸载体。
优选的,所述步骤S1中脂质体包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质,其中辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱或DOPE中的任意一种或两种,可电离脂质为(4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC0315)、PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC0159)或PEG2000-DMG中的任意一种或多种。优选的,所述步骤S1中醇溶液为甲醇或乙醇中的任意一种;超滤缓冲液为0.1~1M磷酸盐缓冲液、0.1~1MHEPES缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或DEPC水中的任意一种。
优选的,所述步骤S1中水相缓冲溶液为浓度10-100mM的柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液中的任意一种,所述缓冲溶液的pH值为4.0-6.5。
优选的,所述步骤S1中微流控混合速率为3-200mL/min,水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比(Vol水相/Vol有机相)为(3~15):1,混合溶液中的总脂质浓度(脂质质量/混合溶液总体积)为0.9375~20mg/mL。
优选的,所述步骤S2中多肽为细胞穿膜肽、抗菌肽、靶向肽、内涵体逃逸肽和天然环肽中的任意一种或多种。
优选的,所述步骤S2中核酸是指mRNA、DNA、siRNA、shRNA或microRNA中的任意一种。
优选的,所述步骤S2中核酸与多肽的质量比为1:(0.0625~2),脂质与核酸的N/P比为(2~6):1。
进一步的,所述脂质体中的可电离脂质:辅助脂质:胆固醇:PEG-脂质的摩尔比率范围为40-85:5-20:30-55:0.5-3。
进一步的,所述水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比为(3~15):1或微流控混合速率为3-200mL/min时,核酸与多肽的制剂的粒径可达到50~250nm,粒径分散度小于0.2。
有益效果:
1、与传统的脂质体制备相比,预先制备空载脂质纳米颗粒悬浮液,核酸、多肽临用现配的方法,既保证了不同批次间的稳定性,也减少了核酸降解的风险;
2、预先制备不同粒径分布的空载脂质纳米颗粒悬浮液,可以满足不同粒径分布的多肽/脂质核酸载体需求。简化实验流程及快速制备,使最终的制剂产品达到更好的粒径控制;3、将空载脂质纳米颗粒提前超滤,降低了在超滤过程中多肽损失的风险以及核酸降解的风险,为提高脂质/多肽/核酸的递送体系提供了一种可靠的制剂制备方法,多肽的加入也提高了体内细胞递送水平。
附图说明
图1为实施例1-2经超滤除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的包封率;
图2为对比例1-2经透析除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的包封率;
图3为实施例2经超滤除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的粒径图;
图4为对比例2经透析除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的粒径图;
图5为实施例3中空载脂质纳米颗粒提前超滤的HPLC图;
图6为对比例3中多肽脂质纳米颗粒经超滤后的HPLC图;
图7为空载脂质与多肽核酸纳米载体的转染效果图,其中空载+mRNA为对比例4中脂质核酸纳米载体,空载+mRNA+多肽为实施例4中多肽/脂质核酸纳米载体;
图8为空载脂质与多肽核酸纳米载体的细胞毒性图,其中空载+mRNA为对比例5中脂质核酸纳米载体,空载+mRNA+多肽为实施例5中多肽/脂质核酸纳米载体。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述,以下实施例是对本发明的解释而本发明不局限于以下实施例:
本发明涉及一种多功能多肽/脂质组装的纳米核酸载体,所述纳米核酸载体由辅助脂质、可电离脂质、胆固醇和PEG-脂质混合制备而成。优选的方案,所述辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱,所述可电离脂质为(4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC0315),所述PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC0159),所述多肽为短杆菌肽。
实施例1:本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速12mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的DEPC水加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液;将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照5.67的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例2:本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速12mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液;将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照5.67的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例3:本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:9,流速12mL/min,得到脂质混合液,静置10min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液;将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照2的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例4:本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:15,流速10mL/min,得到脂质混合液,静置10min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3000g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液;将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照3的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例5:本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:15,流速12mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在2500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液;将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例6:本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速30mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液,进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体,进行粒径的性能测试。
实施例7:本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为10mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速25mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液,进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体,进行粒径的性能测试。
实施例8:本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为25mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速20mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液,进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体,进行粒径的性能测试。
实施例9:本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为25mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速15mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液,进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体,进行粒径的性能测试。
实施例10:本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG-脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液,控制总脂浓度为25mg/mL;将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合,控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3,流速10mL/min,得到脂质混合液,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,离心结束后将脂质混合液全部取出,得到空载脂质纳米颗粒悬浮液,进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀,室温静置10min,得到核酸多肽混合溶液;将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合,静置15min,得到多肽/脂质核酸纳米载体,进行粒径的性能测试。
对比例1:
本对比例与实施例1的不同之处在于,将25倍脂质混合液体积的DEPC水加入静置后的脂质混合液中,注入透析袋中,4℃透析24h,得空载脂质纳米颗粒悬浮液
对比例2:
本对比例与实施例2的不同之处在于,将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,注入透析袋中,4℃透析24h,得空载脂质纳米颗粒悬浮液。
对比例3:
本对比例与实施例3的不同之处在于,将核酸多肽混合溶液提前与有机相溶液按照2的N/P通过微流控混合,静置得到核酸多肽/脂质混合液,接着将25倍核酸多肽/脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的核酸多肽/脂质混合液中,经超滤离心,得到多肽/脂质核酸纳米载体。
对比例4:
本对比例与实施例4的不同之处在于,不添加任何多肽,将空载脂质纳米颗粒悬浮液直接与萤火虫荧光素酶mRNA按照3的N/P混合,静置15min,得到脂质核酸纳米载体。
对比例5:
本对比例与实施例5的不同之处在于,不添加任何多肽,将空载脂质纳米颗粒悬浮液直接与萤火虫荧光素酶mRNA按照6的N/P混合,静置15min,得到脂质核酸纳米载体。
对比例6:
将摩尔比率为可电离脂质47.3%、辅助脂质9.6%、胆固醇41.4%、PEG脂质1.7%的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀,控制总脂浓度为10mg/mL;将萤火虫荧光素酶mRNA溶于柠檬酸缓冲溶液中,控制有机相溶液与水相缓冲溶液比例1:3,流速分别设置为30mL/min,得到脂质纳米载体,静置15min;将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中,全部转移至30KD孔径的超滤管中,在3500g的离心速度下离心20min,得到脂质核酸纳米载体。
性能测试1:多功能多肽/脂质核酸纳米载体的包封率检测:
包封率的测定使用1×TE(5%X-100)溶液进行实施例1-2和对比例1-2中样品的裂解,使用标准品进行标曲的制备。具体的取出试剂盒内的标准品分别进行游离、裂解两个标准曲线的配制,同步进行样品的配制。其中样品的稀释:游离样品应使用1×TE进行稀释;裂解样品应使用1×TE、1×TE(10%X-100)进行稀释,使最终样品的终浓度为1×TE(5%X-100)。标准曲线及样品配制完成后,各取100μL,加入黑色96孔板中,平行两组。然后在每孔加入100μL配制好的0.5%浓度的Ribogreen溶液,放入酶标仪。在仪器内震荡、静置后进行检测。如图1所示,实施例1-2中经超滤除醇多肽/脂质核酸纳米载体的包封率都在80%以上。如图2所示,对比例1-2中经透析除醇的多肽/脂质核酸纳米载体包封率为60%左右,说明经超滤除醇的多肽/脂质核酸纳米载体能够有效包裹更多的核酸。
性能测试2:多功能多肽/脂质核酸纳米载体的粒径检测:
采用欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪测定实施例2和对比例2中纳米载体的粒径:设定温度25℃,折射介质为水,折射率为1.33,粘度为0.8872cP,测定3次,取光强平均值作图。如图3所示实施例2中经柠檬酸缓冲液超滤除醇的多肽/脂质核酸纳米载体粒径为111.5nm,样品的多分散系数为0.086,图4为对比例2中经柠檬酸缓冲液透析除醇的多肽/脂质核酸纳米载体粒径为141.8nm,样品的多分散系数为0.224。相对比透析除醇,经超滤除醇的样品更均一,粒径更小。
性能测试3:HPLC(高效液相色谱法)分析多肽/脂质核酸纳米载体实验:
通过HypersilGOLDTMC18的色谱柱、配制0.1%TFA水溶液作为流动相A,0.1%TFA甲醇溶液作为流动相B,配制0.1%TFA乙腈溶液作为流动相D,检测超滤过程多肽的损失情况。图5为实施例3中多肽脂质纳米颗粒经超滤后的HPLC图,图6为对比例3空载脂质纳米颗粒提前超滤的HPLC图。通过对比结果得出,超滤过程会损失多肽含量,而提前超滤得到空载脂质纳米颗粒不会对多肽产生影响。空载脂质纳米颗粒提前超滤,降低了在超滤过程中多肽损失的风险以及核酸降解的风险,为提高脂质/多肽/核酸的递送体系提供了一种可靠的制剂制备方法。
性能测试4:多功能多肽/脂质核酸纳米载体的293T细胞萤光素酶转染效果:
在96孔板中加入3×104cell/100μL/well的细胞,放入细胞培养箱中(5%CO2,37℃)过夜生长。将Lipo3000和mRNA分别用optiMEM培养基(或无血清DMEM培养基)进行稀释,混合均匀后室温孵育10min;根据mRNA浓度加入所需体积的实施例4和对比例4中的样品,溶解于培养基中,过夜培养的细胞弃去培养基后,每孔加入100μL稀释好的样品,过夜培养24h后用于检测。从培养箱中取出经过24h培养的已转染的细胞,室温平衡30min,吸取100μL化学发光检测试剂避光加入100μL待测细胞中,放入酶标仪,进行检测。经超滤除醇的多肽/脂质核酸纳米载体的细胞转染效果图见图7。如图7所示,多肽/脂质核酸纳米载体能够携带mRNA进入细胞,相比不加多肽的脂质核酸纳米颗粒,细胞转染荧光表达值增加一倍左右,表明多肽/脂质核酸纳米载体能够提高细胞递送效果。
性能测试5:多功能多肽/脂质核酸纳米载体的细胞毒性实验:
在白色96孔板中每孔加入1×104cell/100μL的细胞,放入细胞培养箱中(5%CO2,37℃)过夜生长。加入实施例5和对比例5中经超滤制备的多肽/脂质核酸纳米载体及脂质核酸纳米载体200μl,继续培养24h,向96孔板加入20μL的CCK8试剂,避光孵育3h,放入酶标仪,进行检测。细胞存活率百分比是以测试样品的吸光度相比正常细胞的吸光度值表示。由图8可以看出,空载脂质核酸纳米载体的细胞存活率在60%左右,而多肽/脂质核酸纳米载体的细胞存活率在80%左右,说明多肽的加入能够降低细胞毒性。
性能测试6:空载脂质纳米颗粒悬浮液的粒径检测:
采用欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪分别测定实施例6-10中空载脂质纳米颗粒和多肽/脂质核酸纳米载体的平均粒径:设定温度25℃,折射介质为水,折射率为1.33,粘度为0.8872cP,测定3次。从表1可以看出,通过控制微流控混合速率的大小,能够得到不同粒径分布的空载脂质纳米颗粒,从而满足不同粒径分布的多肽/脂质核酸纳米载体需求,且随着微流控混合速率的减小,空载脂质纳米颗粒和多肽/脂质核酸纳米载体的平均粒径呈现出逐渐增大趋势;另外,通过实施例6和对比例6的对比可以看出,先制备空载脂质纳米颗粒悬浮液粒径较小,常规方法制备出的样品粒径偏大。
表1样品的平均粒径
综上所述,本发明用有穿透细胞膜功能的短杆菌肽和可电离脂质包裹核酸递送核酸药物。同时利用可电离脂质和短杆菌肽穿过细胞膜与内涵体膜从而进入细胞浆中。多肽脂质核酸纳米载体的优势是利用人体安全性更好的生物材料来构建多肽核酸递送单元,再利用少量脂质体包裹递送,提高了单脂质体递送系统的递送效果,同时减少脂质的用量,从而降低递送系统整体毒性。该载体的具体构建方法:首先制备目标粒径的空载脂质体,超滤除醇后待用。将多肽与核酸共混室温孵育,再加入空载脂质体进行自组装,利用可电离脂质的阳离子吸附核酸阴离子,在室温下空载脂质体通过不断地吸附、融合以包裹在核酸多肽复合物的外层,从而组装成可以在体内长效循环,并通过多肽穿膜能力以及脂质体融膜作用顺利突破细胞膜与内涵体膜进入细胞,在酸性细胞环境下释放核酸,同时自身被及时代谢。由于脂质体是已经被大规模成熟应用的药用载体,而所用的多肽是人体可接受的药用材料,所以该载体具有药用的潜质。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1.空载脂质纳米颗粒的制备:将各种脂质体分别溶解于醇溶液中,混合均匀得到有机相溶液,再与不含核酸的水相缓冲溶液通过微流控混合,得到混合溶液,然后采用中空纤维切向流过滤或离心机对混合溶液进行超滤除醇,再经过0.22μm滤膜过滤,得到空载脂质纳米颗粒;
S2.纳米核酸载体的制备:将多肽与核酸静置复合不少于10min,得到多肽与核酸的复合物,然后将此复合物与空载脂质纳米颗粒混合均匀,复合不少于10min,利用静电作用使多肽/脂质/核酸组装成均匀稳定的纳米颗粒,即得到纳米核酸载体。
2.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S1中脂质体包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质,其中辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱或DOPE中的任意一种或两种,可电离脂质为(4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺或PEG2000-DMG中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S1中醇溶液为甲醇或乙醇中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S1中水相缓冲溶液为浓度10-100mM的柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液中的任意一种,所述缓冲溶液的pH值为4.0-6.5。
5.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S1中微流控混合速率为3-200mL/min,水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比为(3~15):1,混合溶液中的总脂质浓度为0.9375~20mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S2中多肽为细胞穿膜肽、抗菌肽、靶向肽、内涵体逃逸肽或天然环肽中的任意一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S2中核酸是指mRNA、DNA、siRNA、shRNA或microRNA中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述步骤S2中核酸与多肽的质量比为1:(0.0625~2),脂质与核酸的N/P比为(2~6):1。
9.根据权利要求2所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述脂质体中的可电离脂质:辅助脂质:胆固醇:PEG-脂质的摩尔比率范围为40-85:5-20:30-55:0.5-3。
10.根据权利要求5所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法,其特征在于:所述水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比为(3~15):1或微流控混合速率为3-200mL/min时,核酸与多肽的制剂的粒径可达到50~250nm,粒径分散度小于0.2。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310961101.4A CN116966163A (zh) | 2023-08-02 | 2023-08-02 | 一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310961101.4A CN116966163A (zh) | 2023-08-02 | 2023-08-02 | 一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN116966163A true CN116966163A (zh) | 2023-10-31 |
Family
ID=88484644
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310961101.4A Pending CN116966163A (zh) | 2023-08-02 | 2023-08-02 | 一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN116966163A (zh) |
-
2023
- 2023-08-02 CN CN202310961101.4A patent/CN116966163A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hettich et al. | Encapsulation of hydrophilic compounds in small extracellular vesicles: loading capacity and impact on vesicle functions | |
CN114099533A (zh) | 核酸药物递送系统、制备方法、药物组合物和应用 | |
CN110974954A (zh) | 一种用于增强核酸疫苗免疫效果的脂质纳米颗粒及其制备方法 | |
Wang et al. | Aptamer-based erythrocyte-derived mimic vesicles loaded with siRNA and doxorubicin for the targeted treatment of multidrug-resistant tumors | |
JP2007112768A (ja) | 肝指向性リポソーム組成物 | |
Zeng et al. | Exosomes as carriers for drug delivery in cancer therapy | |
WO1995016437A1 (en) | Method of transmitting a biologically active material to a cell | |
CN118203546A (zh) | 生产脂质体的方法 | |
US20200237678A1 (en) | Lipid nanoparticle membrane composition | |
KR101689787B1 (ko) | 입자 조성물 및 이를 가진 의약 조성물 | |
Dreaden et al. | RNA‐peptide nanoplexes drug DNA damage pathways in high‐grade serous ovarian tumors | |
CN113842960B (zh) | 一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法 | |
CN114469864A (zh) | Sting激动剂脂质体-温敏凝胶及其制备方法和应用 | |
CN109091468B (zh) | 一种抗体、多肽和核酸组合治疗靶向载体及制法和用途 | |
CN113941011A (zh) | 一种含可离子化阳离子脂质的纳米脂质体颗粒及制备方法 | |
CN116549667B (zh) | 一种pas修饰的脂质纳米粒、包含其的药物制剂,及其制备方法和用途 | |
CN113648289A (zh) | 一种肺癌细胞膜包裹精氨酸脱亚胺酶脂质纳米粒及其制备方法 | |
CN115998714B (zh) | 一种脂质纳米颗粒、递送系统及递送系统的制备方法 | |
CN116966163A (zh) | 一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 | |
CN112138166A (zh) | 一种纳米药物、其制备方法及用途 | |
CN108721643B (zh) | 一种用于免疫化疗的pH敏感脂质体 | |
CN114306244B (zh) | 一种微米级脂质复合物及其制备和应用 | |
CN118252815A (zh) | 一种细胞膜包被核酸脂质复合物纳米粒及其制备方法和应用 | |
CN102188379A (zh) | 载药脂质体的制备方法 | |
JP2023039115A (ja) | 物質送達キャリア及び組成物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |