CN116966163A - 一种核酸与多肽的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种核酸与多肽的制剂及其制备方法，所述核酸与多肽的制剂具体为一种多肽/脂质体组装的纳米核酸载体，其中脂质部分包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG‑脂质。该纳米核酸载体的具体制备方法：首先将可电离脂质、辅助脂质、胆固醇、PEG‑脂质混合均匀，与不含核酸的水相缓冲溶液通过微流控法制备超滤成无乙醇的空载纳米颗粒，然后将多肽与核酸静置复合，最后将复合物与空载脂质体通过静电作用结合从而组装成纳米核酸载体。该载体的优势是利用人体相容性较好的多肽与较低剂量的脂质构建出能够保护核酸，并通过脂质体融膜作用和多肽穿膜机制之间的协同作用突破细胞膜进入细胞，在细胞质内释放出核酸。同时通过改变多肽的种类，使用具备靶向功能的多肽使该纳米核酸载体可以进入特定的靶向细胞进行核酸的递送。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种核酸与多肽的制剂及其制备方法。
背景技术
2020年两款mRNA疫苗的上市宣告以mRNA为代表的核酸技术正式进入商业化时代，mRNA疫苗有可能解决传统疫苗技术无法解决的许多未满足的医疗需求，因其技术优势可广泛应用于预防疫苗、治疗疫苗、治疗药物等诸多领域。mRNA理论上能够表达任何蛋白质，可以防治多种疾病，因此以mRNA为代表的核酸药物可以作为一种极具潜力的通用技术平台。而mRNA的脆弱性使得递送成为关键问题。
目前已上市的两款mRNA疫苗：Moderna和BioNTech/辉瑞的新冠疫苗分别需要在-15～-25℃和-60～-90℃环境中储存，这严重阻碍了疫苗的流通和临床使用。主要原因是环境中的RNA酶导致了核酸的降解。为了突破这一技术瓶颈，本发明利用将核酸在使用前加入的方式，减少核酸接触环境中的RNA酶，降低核酸药物的降解，而脂质对存储环境要求较低，实现了将药物在4℃冷藏的突破。
而多肽，特别是短杆菌肽在核酸递送领域是极具潜力的递送载体，将多肽与脂质组合递送核酸药物是当前生物技术领域的热门方向。但在核酸药物制备过程中，最后超滤会影响核酸分子的稳定性，降低整个系统的递送效率，成为阻碍新型多肽脂质递送系统研究领域的一大技术障碍。本发明利用将多肽与核酸在使用前加入的方式，避免了多肽及核酸在超滤工艺过程中的损失，保证了转染的可靠性，并且加入多肽能够提高递送效率及降低细胞毒性。同时选用超滤工艺除醇，相比常规的透析除醇速度快，且易大量制备。能够实现粒径分布的均一性，保证了制剂的稳定性和较高的包封率。
发明内容
要解决的技术问题：本发明的目的在于克服现有多肽递送系统制备技术中的不足，提供一种脂质与多肽复合递送核酸的制备方法。该制备方法可以有效检验多肽或核酸的体内外有效性，简化了筛选过程，提高了制剂制备的可靠性，该技术可用于体外细胞或体内转染等应用场景。
技术方案：一种核酸与多肽的制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.空载脂质纳米颗粒的制备：将各种脂质体分别溶解于醇溶液中，混合均匀得到有机相溶液，再与不含核酸的水相缓冲溶液通过微流控混合，得到混合溶液，然后向混合物中加入超滤缓冲液，接着采用中空纤维切向流过滤或离心机对混合溶液进行超滤(超滤孔径小于100KD)除醇，使制备后的脂质纳米颗粒乙醇含量降至0.5％以下，再经过0.22μm滤膜过滤，得到空载脂质纳米颗粒；
S2.纳米核酸载体的制备：将多肽与核酸静置复合不少于10min，得到多肽与核酸的复合物，然后将此复合物与空载脂质纳米颗粒混合均匀，复合不少于10min，利用静电作用使多肽/脂质/核酸组装成均匀稳定的纳米颗粒，即得到纳米核酸载体。
优选的，所述步骤S1中脂质体包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质，其中辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱或DOPE中的任意一种或两种，可电离脂质为(4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC0315)、PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC0159)或PEG2000-DMG中的任意一种或多种。优选的，所述步骤S1中醇溶液为甲醇或乙醇中的任意一种；超滤缓冲液为0.1～1M磷酸盐缓冲液、0.1～1MHEPES缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液或DEPC水中的任意一种。
优选的，所述步骤S1中水相缓冲溶液为浓度10-100mM的柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液中的任意一种，所述缓冲溶液的pH值为4.0-6.5。
优选的，所述步骤S1中微流控混合速率为3-200mL/min，水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比(Vol水相/Vol有机相)为(3～15):1，混合溶液中的总脂质浓度(脂质质量/混合溶液总体积)为0.9375～20mg/mL。
优选的，所述步骤S2中多肽为细胞穿膜肽、抗菌肽、靶向肽、内涵体逃逸肽和天然环肽中的任意一种或多种。
优选的，所述步骤S2中核酸是指mRNA、DNA、siRNA、shRNA或microRNA中的任意一种。
优选的，所述步骤S2中核酸与多肽的质量比为1:(0.0625～2)，脂质与核酸的N/P比为(2～6)：1。
进一步的，所述脂质体中的可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：PEG-脂质的摩尔比率范围为40-85：5-20：30-55：0.5-3。
进一步的，所述水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比为(3～15):1或微流控混合速率为3-200mL/min时，核酸与多肽的制剂的粒径可达到50～250nm，粒径分散度小于0.2。
有益效果：
1、与传统的脂质体制备相比，预先制备空载脂质纳米颗粒悬浮液，核酸、多肽临用现配的方法，既保证了不同批次间的稳定性，也减少了核酸降解的风险；
2、预先制备不同粒径分布的空载脂质纳米颗粒悬浮液，可以满足不同粒径分布的多肽/脂质核酸载体需求。简化实验流程及快速制备，使最终的制剂产品达到更好的粒径控制；3、将空载脂质纳米颗粒提前超滤，降低了在超滤过程中多肽损失的风险以及核酸降解的风险，为提高脂质/多肽/核酸的递送体系提供了一种可靠的制剂制备方法，多肽的加入也提高了体内细胞递送水平。
附图说明
图1为实施例1-2经超滤除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的包封率；
图2为对比例1-2经透析除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的包封率；
图3为实施例2经超滤除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的粒径图；
图4为对比例2经透析除醇制备的空载脂质与多肽核酸纳米载体的粒径图；
图5为实施例3中空载脂质纳米颗粒提前超滤的HPLC图；
图6为对比例3中多肽脂质纳米颗粒经超滤后的HPLC图；
图7为空载脂质与多肽核酸纳米载体的转染效果图，其中空载+mRNA为对比例4中脂质核酸纳米载体，空载+mRNA+多肽为实施例4中多肽/脂质核酸纳米载体；
图8为空载脂质与多肽核酸纳米载体的细胞毒性图，其中空载+mRNA为对比例5中脂质核酸纳米载体，空载+mRNA+多肽为实施例5中多肽/脂质核酸纳米载体。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述，以下实施例是对本发明的解释而本发明不局限于以下实施例：
本发明涉及一种多功能多肽/脂质组装的纳米核酸载体，所述纳米核酸载体由辅助脂质、可电离脂质、胆固醇和PEG-脂质混合制备而成。优选的方案，所述辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱，所述可电离脂质为(4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC0315)，所述PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺(ALC0159)，所述多肽为短杆菌肽。
实施例1：本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速12mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的DEPC水加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液；将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照5.67的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例2：本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速12mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液；将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照5.67的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例3：本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:9，流速12mL/min，得到脂质混合液，静置10min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液；将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照2的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例4：本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:15，流速10mL/min，得到脂质混合液，静置10min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3000g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液；将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照3的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例5：本实施例涉及多功能多肽/脂质核酸纳米载体的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:15，流速12mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在2500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液；将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体。
实施例6：本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速30mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液，进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体，进行粒径的性能测试。
实施例7：本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为10mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速25mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液，进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体，进行粒径的性能测试。
实施例8：本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为25mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速20mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液，进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体，进行粒径的性能测试。
实施例9：本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为25mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速15mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液，进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体，进行粒径的性能测试。
实施例10：本实施例涉及空载脂质纳米颗粒悬浮液的制备方法：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG-脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀得到有机相溶液，控制总脂浓度为25mg/mL；将有机相溶液与100mMpH4的柠檬酸缓冲溶液通过微流控混合，控制有机相溶液与柠檬酸缓冲溶液比例1:3，流速10mL/min，得到脂质混合液，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，离心结束后将脂质混合液全部取出，得到空载脂质纳米颗粒悬浮液，进行粒径的性能测试。将萤火虫荧光素酶mRNA与短杆菌肽按照质量比1:2的比例混合均匀，室温静置10min，得到核酸多肽混合溶液；将此核酸多肽混合溶液与空载脂质纳米颗粒悬浮液按照6的N/P混合，静置15min，得到多肽/脂质核酸纳米载体，进行粒径的性能测试。
对比例1：
本对比例与实施例1的不同之处在于，将25倍脂质混合液体积的DEPC水加入静置后的脂质混合液中，注入透析袋中，4℃透析24h，得空载脂质纳米颗粒悬浮液
对比例2：
本对比例与实施例2的不同之处在于，将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，注入透析袋中，4℃透析24h，得空载脂质纳米颗粒悬浮液。
对比例3：
本对比例与实施例3的不同之处在于，将核酸多肽混合溶液提前与有机相溶液按照2的N/P通过微流控混合，静置得到核酸多肽/脂质混合液，接着将25倍核酸多肽/脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的核酸多肽/脂质混合液中，经超滤离心，得到多肽/脂质核酸纳米载体。
对比例4：
本对比例与实施例4的不同之处在于，不添加任何多肽，将空载脂质纳米颗粒悬浮液直接与萤火虫荧光素酶mRNA按照3的N/P混合，静置15min，得到脂质核酸纳米载体。
对比例5：
本对比例与实施例5的不同之处在于，不添加任何多肽，将空载脂质纳米颗粒悬浮液直接与萤火虫荧光素酶mRNA按照6的N/P混合，静置15min，得到脂质核酸纳米载体。
对比例6：
将摩尔比率为可电离脂质47.3％、辅助脂质9.6％、胆固醇41.4％、PEG脂质1.7％的脂质在无水乙醇溶液中混合均匀，控制总脂浓度为10mg/mL；将萤火虫荧光素酶mRNA溶于柠檬酸缓冲溶液中，控制有机相溶液与水相缓冲溶液比例1:3，流速分别设置为30mL/min，得到脂质纳米载体，静置15min；将25倍脂质混合液体积的柠檬酸缓冲溶液加入静置后的脂质混合液中，全部转移至30KD孔径的超滤管中，在3500g的离心速度下离心20min，得到脂质核酸纳米载体。
性能测试1：多功能多肽/脂质核酸纳米载体的包封率检测：
包封率的测定使用1×TE(5％X-100)溶液进行实施例1-2和对比例1-2中样品的裂解，使用标准品进行标曲的制备。具体的取出试剂盒内的标准品分别进行游离、裂解两个标准曲线的配制，同步进行样品的配制。其中样品的稀释：游离样品应使用1×TE进行稀释；裂解样品应使用1×TE、1×TE(10％X-100)进行稀释，使最终样品的终浓度为1×TE(5％X-100)。标准曲线及样品配制完成后，各取100μL，加入黑色96孔板中，平行两组。然后在每孔加入100μL配制好的0.5％浓度的Ribogreen溶液，放入酶标仪。在仪器内震荡、静置后进行检测。如图1所示，实施例1-2中经超滤除醇多肽/脂质核酸纳米载体的包封率都在80％以上。如图2所示，对比例1-2中经透析除醇的多肽/脂质核酸纳米载体包封率为60％左右，说明经超滤除醇的多肽/脂质核酸纳米载体能够有效包裹更多的核酸。
性能测试2：多功能多肽/脂质核酸纳米载体的粒径检测：
采用欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪测定实施例2和对比例2中纳米载体的粒径：设定温度25℃，折射介质为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，测定3次，取光强平均值作图。如图3所示实施例2中经柠檬酸缓冲液超滤除醇的多肽/脂质核酸纳米载体粒径为111.5nm，样品的多分散系数为0.086，图4为对比例2中经柠檬酸缓冲液透析除醇的多肽/脂质核酸纳米载体粒径为141.8nm，样品的多分散系数为0.224。相对比透析除醇，经超滤除醇的样品更均一，粒径更小。
性能测试3：HPLC(高效液相色谱法)分析多肽/脂质核酸纳米载体实验：
通过HypersilGOLDTMC18的色谱柱、配制0.1％TFA水溶液作为流动相A，0.1％TFA甲醇溶液作为流动相B，配制0.1％TFA乙腈溶液作为流动相D，检测超滤过程多肽的损失情况。图5为实施例3中多肽脂质纳米颗粒经超滤后的HPLC图，图6为对比例3空载脂质纳米颗粒提前超滤的HPLC图。通过对比结果得出，超滤过程会损失多肽含量，而提前超滤得到空载脂质纳米颗粒不会对多肽产生影响。空载脂质纳米颗粒提前超滤，降低了在超滤过程中多肽损失的风险以及核酸降解的风险，为提高脂质/多肽/核酸的递送体系提供了一种可靠的制剂制备方法。
性能测试4：多功能多肽/脂质核酸纳米载体的293T细胞萤光素酶转染效果：
在96孔板中加入3×104cell/100μL/well的细胞，放入细胞培养箱中(5％CO2，37℃)过夜生长。将Lipo3000和mRNA分别用optiMEM培养基(或无血清DMEM培养基)进行稀释，混合均匀后室温孵育10min；根据mRNA浓度加入所需体积的实施例4和对比例4中的样品，溶解于培养基中，过夜培养的细胞弃去培养基后，每孔加入100μL稀释好的样品，过夜培养24h后用于检测。从培养箱中取出经过24h培养的已转染的细胞，室温平衡30min，吸取100μL化学发光检测试剂避光加入100μL待测细胞中，放入酶标仪，进行检测。经超滤除醇的多肽/脂质核酸纳米载体的细胞转染效果图见图7。如图7所示，多肽/脂质核酸纳米载体能够携带mRNA进入细胞，相比不加多肽的脂质核酸纳米颗粒，细胞转染荧光表达值增加一倍左右，表明多肽/脂质核酸纳米载体能够提高细胞递送效果。
性能测试5：多功能多肽/脂质核酸纳米载体的细胞毒性实验：
在白色96孔板中每孔加入1×104cell/100μL的细胞，放入细胞培养箱中(5％CO2，37℃)过夜生长。加入实施例5和对比例5中经超滤制备的多肽/脂质核酸纳米载体及脂质核酸纳米载体200μl，继续培养24h，向96孔板加入20μL的CCK8试剂，避光孵育3h，放入酶标仪，进行检测。细胞存活率百分比是以测试样品的吸光度相比正常细胞的吸光度值表示。由图8可以看出，空载脂质核酸纳米载体的细胞存活率在60％左右，而多肽/脂质核酸纳米载体的细胞存活率在80％左右，说明多肽的加入能够降低细胞毒性。
性能测试6：空载脂质纳米颗粒悬浮液的粒径检测：
采用欧美克NS-90Z纳米粒度及电位分析仪分别测定实施例6-10中空载脂质纳米颗粒和多肽/脂质核酸纳米载体的平均粒径：设定温度25℃，折射介质为水，折射率为1.33，粘度为0.8872cP，测定3次。从表1可以看出，通过控制微流控混合速率的大小，能够得到不同粒径分布的空载脂质纳米颗粒，从而满足不同粒径分布的多肽/脂质核酸纳米载体需求，且随着微流控混合速率的减小，空载脂质纳米颗粒和多肽/脂质核酸纳米载体的平均粒径呈现出逐渐增大趋势；另外，通过实施例6和对比例6的对比可以看出，先制备空载脂质纳米颗粒悬浮液粒径较小，常规方法制备出的样品粒径偏大。
表1样品的平均粒径
综上所述，本发明用有穿透细胞膜功能的短杆菌肽和可电离脂质包裹核酸递送核酸药物。同时利用可电离脂质和短杆菌肽穿过细胞膜与内涵体膜从而进入细胞浆中。多肽脂质核酸纳米载体的优势是利用人体安全性更好的生物材料来构建多肽核酸递送单元，再利用少量脂质体包裹递送，提高了单脂质体递送系统的递送效果，同时减少脂质的用量，从而降低递送系统整体毒性。该载体的具体构建方法：首先制备目标粒径的空载脂质体，超滤除醇后待用。将多肽与核酸共混室温孵育，再加入空载脂质体进行自组装，利用可电离脂质的阳离子吸附核酸阴离子，在室温下空载脂质体通过不断地吸附、融合以包裹在核酸多肽复合物的外层，从而组装成可以在体内长效循环，并通过多肽穿膜能力以及脂质体融膜作用顺利突破细胞膜与内涵体膜进入细胞，在酸性细胞环境下释放核酸，同时自身被及时代谢。由于脂质体是已经被大规模成熟应用的药用载体，而所用的多肽是人体可接受的药用材料，所以该载体具有药用的潜质。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.空载脂质纳米颗粒的制备：将各种脂质体分别溶解于醇溶液中，混合均匀得到有机相溶液，再与不含核酸的水相缓冲溶液通过微流控混合，得到混合溶液，然后采用中空纤维切向流过滤或离心机对混合溶液进行超滤除醇，再经过0.22μm滤膜过滤，得到空载脂质纳米颗粒；
S2.纳米核酸载体的制备：将多肽与核酸静置复合不少于10min，得到多肽与核酸的复合物，然后将此复合物与空载脂质纳米颗粒混合均匀，复合不少于10min，利用静电作用使多肽/脂质/核酸组装成均匀稳定的纳米颗粒，即得到纳米核酸载体。
2.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中脂质体包括可电离脂质、辅助脂质、胆固醇和PEG-脂质，其中辅助脂质为二硬脂酰基磷脂酰胆碱或DOPE中的任意一种或两种，可电离脂质为(4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、PEG-脂质为2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-二十四烷基乙酰胺或PEG2000-DMG中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中醇溶液为甲醇或乙醇中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中水相缓冲溶液为浓度10-100mM的柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液中的任意一种，所述缓冲溶液的pH值为4.0-6.5。
5.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中微流控混合速率为3-200mL/min，水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比为(3～15):1，混合溶液中的总脂质浓度为0.9375～20mg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中多肽为细胞穿膜肽、抗菌肽、靶向肽、内涵体逃逸肽或天然环肽中的任意一种或多种。
7.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中核酸是指mRNA、DNA、siRNA、shRNA或microRNA中的任意一种。
8.根据权利要求1所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中核酸与多肽的质量比为1:(0.0625～2)，脂质与核酸的N/P比为(2～6)：1。
9.根据权利要求2所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述脂质体中的可电离脂质：辅助脂质：胆固醇：PEG-脂质的摩尔比率范围为40-85：5-20：30-55：0.5-3。
10.根据权利要求5所述的一种核酸与多肽的制剂的制备方法，其特征在于：所述水相缓冲溶液/有机相溶液的体积比为(3～15):1或微流控混合速率为3-200mL/min时，核酸与多肽的制剂的粒径可达到50～250nm，粒径分散度小于0.2。
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