CN113842960B - 一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，通过特殊设计的SNALP微流控芯片管路，能够实现三相溶液稳定、可控的混合，实现了SNALP制备过程的自动化，进一步控制各相流速比后，所得产品与传统手动乙醇注入法制备出的SNALP相比，在粒径与PDI上均表现出显著的优势，该方法可提升稳定核酸脂质纳米粒制备的可重复性，改善操作精确性，有利于制备尺寸可控、粒径分布更均一的纳米粒；本申请采用了精确的数字化泵注入技术，能够准确控制试剂的加入量，减少不必要的试剂消耗。

Description

一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域中的基因纳米递送领域，具体涉及一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法。
背景技术
基因药物纳米递送系统是将核酸类药物包裹在纳米载体中制备而成，其进入体内后被导入特定组织或细胞，在基因水平上通过诱导(如质粒DNA)或抑制(如siRNA、shRNA等)相关功能蛋白的表达从而达到治疗疾病的目的。基因药物纳米递送系统的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。相比于病毒载体，非病毒载体因具有低毒、低免疫原性、靶向性和易组装等优点而备受关注，如阳离子脂质体等。
近年来，研究者们开发了很多新型脂质类载体，如稳定核酸脂质纳米粒(SNALP)。SNALP由可离子化阳离子脂质DLinDMA、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(cholesterol)和PEG-DMA包裹基因药物而形成。目前常用过膜挤压法、乙醇注射技术等方法制备SNALP。常见的是由自主搭建的T型制备装置实现该物质的制备过程，具体是用两个T形三孔接头连接三个注射器和一个SNALP接收器构成制备装置。制备过程中，质粒的水相溶液、脂类的油相溶液和稀释相以一定配比体积同时挤出，水相中的质粒和油相溶液中的各种脂质分子即可在静电吸引力与亲疏水作用力下包裹质粒形成SNALP。但由于流速不可控，混合过程的可调控性差，制备出的SNALP粒径大小分布不均一，且很难在不改变脂质处方的前提下改变粒径。该人工制备方法存在实验重复性差、批间质量差异大、操作复杂等缺点，因此急需一种稳定、可控、简易的操作方法来提高制备过程的可重复性和实现对粒径的可靠调控。
微流控是指在纳米或微米级别的通道中操控微量流体的技术。流体在微小尺寸的流道内呈层流状态，且流体运动行为高度可控。与传统纳米粒制备方法相比，微流控技术实现了脂质体制备过程的自动化，可以通过改变芯片形状、流体流速、流量、混合顺序等因素精密控制层流液体混合效应，是一种有效的合成粒径均一、批次质量可控的纳米粒的工程学工具。
微流控现已在常规脂质体制备过程中得到较为广泛地应用，利用微流控装置制备常规脂质体纳米粒也有诸多优点，如中国专利CN101018816A公开的生产具有选定尺寸、形状、形态和组成的聚合物颗粒的方法，该方法以受控流量将包含可聚合组分的第一流体注入微流体通道并以受控流量将包含可聚合组分的第二流体注入微流体通道，在微流体通道中，第二流体与第一流体不混溶，以使第一流体在微流体通道内形成微滴，微流体通道具有预选尺寸，以使微滴具有预选尺寸、形态和形状，该方案使得聚合物颗粒的制备过程更加精准可控，自动化程度高。
但值得注意的是，稳定核酸脂质纳米粒(SNALP)的制备过程与常规脂质体制备过程有较大不同，主要是由于SNALP配方中可离子化阳离子脂质(例如4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂(DLin-MC3-DMA))的加入和核酸类药物的加入，以及制备过程需要第三相缓冲溶液，且三相液体的流速控制会直接影响产物的均一性和稳定性，导致目前制备脂质体囊泡的微流控装置未能在SNALP的制备上达到良好应用和预期效果。现实验室中SNALP的制备过程仍然主要依靠人工操作，且至今鲜有报道关于稳定核酸纳米粒的微流控制备方案。因此，开发出能够制备大量、性质稳定、粒径均一的稳定核酸纳米粒的装置和方法是发展核酸药物需要解决的一大问题。
发明内容
本发明的目的在于克服目前已有稳定核酸脂质纳米粒(SNALP)制备技术方面的不足，提供一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，针对SNALP制备过程与一般脂质体制备过程的差异，在装置上加入了缓冲相通道，通过管径及流速的设计优化可提高有机相和水相溶液混合效率、提升SNALP制备过程的可重复性并改善操作精确性，制备出粒径较小、分布均匀、稳定性高的SNALP，全面提升制备过程的自动化，为未来不同性质SNALP的制备提供技术支撑。
本发明公开的技术方案如下：一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，微流控装置由SNALP微流控芯片、微型注射泵系统和硅胶管路组成；
SNALP微流控芯片上设有水相注入口、油相注入口、稀释相注入口和出口；
注入口和出口分别通过硅胶管路与微型注射泵系统和产物收集装置连接，
微型注射泵系统包括单通道智能注射泵、智能注射泵控制器和注射器，注射器通过硅胶管路与相应的注入口相连，注射器的另一端连接注射泵，注射泵通过智能注射泵系统控制泵速；
具体制备步骤如下：
1)将DLin-MC3-DMA、PEG-DMG、DSPC和Cholesterol溶解于乙醇中配制成油相溶液，将siRNA溶解于pH＝5的柠檬酸缓冲液中配制成水相溶液，pH＝6的柠檬酸缓冲液作为稀释相溶液；
2)用注射器吸取各溶液后置于相应位置处，连接相应的注入口，并组装好微型注射泵系统；
3)设定水相流速为0.7-0.8mL/min、油相流速为0.7-0.8mL/min、稀释相流速为1.4-1.6mL/min，开启微型注射泵系统进行产物制备；
4)用超滤离心管收集最终的液体，离心，洗脱，收集终产物。
进一步地，步骤1)中，DLin-MC3-DMA:PEG-DMG:DSPC:Cholesterol的比例为40:5:10:45，DLin-MC3-DMA与siRNA的摩尔比为7.6:1，DLin-MC3-DMA的乙醇溶液的浓度不高于5mg/mL，柠檬酸缓冲液的浓度不高于50mM，siRNA的浓度不高于1OD/mL。
进一步地，步骤2)中，用不同注射器吸取的油相、水相和稀释相的体积比为1:1:2。
进一步地，步骤4)中，离心转速为4000r/min，离心时间为20min，洗脱过程采用PBS缓冲液洗脱。
进一步地，水相注入口和油相注入口首先在芯片中通过S型结构通道并联后再与稀释相注入口通过S型结构通道并联混合。
进一步地，S型结构通道的横截面形状为半圆形、方形、梯形、椭圆形、无规则形中的任意一种。
进一步地，硅胶管路为内径小于0.2mm的管路。
相比于现有技术，本发明具有如下优点：
1.本申请首次创新性地采用微流控技术制备稳定核酸脂质纳米粒(SNALP)，通过特殊设计的三相微流控芯片管路，能够实现原料间稳定、可控的混合，实现SNALP制备过程的自动化，进一步控制各相流速比后，所得产品与传统手动乙醇注入法制备出的产品相比，在粒径与PDI上均表现出显著的优势，有利于制备尺寸可控、粒径分布更均一的纳米粒；
2.本申请采用了精确的数字化泵注入技术，能够准确控制试剂的加入量，减少不必要的试剂消耗，尤其是能更好地控制siRNA的消耗，提高试剂的利用率，由于siRNA本身的价格昂贵，利用此方法可大大减少siRNA的浪费，具有较好的经济效益；
3.本发明制备的稳定核酸脂质纳米粒粒度在100nm左右，外观类球形、粒径均一，可实现核酸的稳定包裹，对siRNA种类没有特殊要求，普适性较强，且工艺稳定，产品可控性和重现性好，成品的时间稳定性高，易于工业化生产；
4.本申请设计的SNALP微流控芯片，水相与油相优先混合制备SNALP，再经过稀释相稀释，可降低稀释相被包载进入SNALP的几率，提高siRNA载药量。
附图说明
图1为利用微流控技术制备稳定核酸脂质纳米粒的原理图；
其中，a-微型注射泵系统，b-水相注入口，c-油相注入口，d-稀释相注入口，e-三相芯片，f-出口，g-产物收集装置；
图2为制备稳定核酸脂质纳米粒的系统实物图；
图3为实施例1-4所制备的SNALP的粒径大小统计图；
图4为实施例1-4所制备的SNALP的多分散系数(PDI)的结果图；
图5为实施例1-4所制备的SNALP的透射电镜(TEM)图；
图6为对比例1中，利用微流控法和乙醇注入法制备的SNALP的粒径测定结果对比图；
图7为对比例1中，利用微流控法和乙醇注入法制备的SNALP的粒径对比柱形图；
图8为对比例1中，利用微流控法和乙醇注入法制备的SNALP的PDI对比柱形图；
图9为测试例1中，在最佳流速下包载不同siRNA的SNALP粒径对比图；
图10为测试例2中，在最佳流速下重复三次制备SNALP的粒径对比图；
图11为测试例3测试的SNALP放置一周后的的粒径对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
本实施方式中各实施例所用的新型微型流控装置主要由SNALP微流控芯片、微型注射泵系统和硅胶管路组成；
在SNALP微流控芯片上设有三个注入口和一个出口，三个注入口分别为水相注入口、油相注入口和稀释相注入口，水相注入口和油相注入口首先在芯片中通过S型结构通道并联连接后再与稀释相注入口通过S型结构通道并联混合；
S型结构通道的横截面形状为半圆形、方形、梯形、椭圆形、无规则形中的任意一种。
注入口和出口分别通过硅胶管路与微型注射泵系统和产物收集装置连接，硅胶管路为内径＜0.2mm的管路。
微型注射泵系统有三组，每组包括XMSP-1B单通道智能注射泵、智能注射泵控制器和注射器，三个注射器的注射口通过硅胶管路分别与微流控芯片上的三个注入口相连，注射器的另一端连接注射泵，注射泵通过智能注射泵系统控制泵速。
所用SNALP微流控芯片为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材质，使用光蚀刻法制作，水相油相混合通道不短于3cm，缓冲液混合通道不短于5cm。
传统的手动乙醇注入法制备法，同时注入水相、油相以及稀释相，可能导致稀释相被包载到SNALP中，降低siRNA的载药量。本实施方式中设计的SNALP微流控芯片，水相与油相优先混合制备SNALP，再经过稀释相稀释，可降低稀释相被包载进入SNALP的几率，提高siRNA载药量。
装置搭建完成后，需进行硅胶管路密闭性测试，方法为向注入口注入水，从出口处接收，若无渗漏，则确定硅胶管路密闭性完好。
实施例1
本实施例提供了一种基于新型微型流控装置的稳定核酸脂质纳米粒的可控制备方法，制备的纳米脂质体为载siRNA稳定核酸脂质纳米粒(siRNA@SNALP)，后简称SNALP，制备SNALP所需的各成分及重量比例是DLin-MC3-DMA:PEG-DMG(二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇):DSPC:Cholesterol＝40:5:10:45。DLin-MC3-DMA与siRNA的摩尔比为7.6：1。
具体步骤如下：
1.将各脂质成分溶解于乙醇中配制成油相溶液，将siRNA溶解于pH＝5的柠檬酸缓冲液(无核酶)中配制成水相溶液，pH＝6的柠檬酸缓冲液(无核酶)作为稀释相溶液。
2.用一次性注射器吸取各溶液，油相、水相和稀释相的体积比为1:1:2，安装在微流控装置上的相应位置，连接不同的注入口，并组装好微型注射泵系统；
3.流速设定为水相0.5mL/min、油相0.5mL/min、稀释相1.0mL/min，开启微型注射泵系统开始纳米粒的制备；
4.用超滤离心管(Mw＝10KDa)收集最终的液体，以4000r/min的转速离心20min，加入PBS磷酸缓冲液洗脱并收集终产物，产物即为稳定核酸脂质纳米粒。
实施例2
本实施例与实施例1的实验步骤的区别仅在于步骤3中各组分流速不同，水相0.6mL/min、油相0.6mL/min、缓冲液1.2mL/min，用超滤离心管(Mw＝10KDa)收集最终的液体，以4000r/min的转速离心20min，加入PBS洗脱并收集终产物，其余步骤均相同。
实施例3
本实施例与实施例1的实验步骤的区别仅在于步骤3中各组分流速不同，具体分别为水相0.7mL/min、油相0.7mL/min、缓冲液1.4mL/min；弃掉初始10％产物，用超滤离心管(Mw＝10KDa)收集最终的液体，以4000r/min的转速离心20min，加入PBS洗脱并收集终产物。
实施例4
本实施例与实施例1的实验步骤的区别仅在于步骤3中各组分流速不同，分别为水相0.8mL/min、油相0.8mL/min、缓冲液1.6mL/min。弃掉初始10％产物，用超滤离心管(Mw＝10KDa)收集最终的液体，以4000r/min的转速离心20min，加入PBS洗脱并收集终产物。
实验测试分析：将实施例1-4中制备的样品，每组取1mL于测试皿中，使用Zetasizer Nano ZS(Malvern，UK)仪器测定不同流速下制备出的SNALP的粒径、多分散指数(PDI)，结果如图2-3所示：
实施例一中制备的SNALP平均粒径为213nm，PDI为0.126；
实施例二中制备的SNALP平均粒径为186nm，PDI为0.111；
实施例三中制备的SNALP平均粒径为122nm，PDI为0.097；
实施例四中制备的SNALP平均粒径为106nm，PDI为0.099。
SNALP包载的药物为核酸，可在基因层面上对生命活动进行调控，属于纳米药物的一种。纳米药物与常规药物相比，具有以下优点：
1.纳米药物载体可经过血液循环进入毛细血管，还可透过内皮细胞间隙，进入病灶，被细胞以胞饮的方式吸收，实现靶向用药，提高了药物的生物利用率；
2.纳米载体粒径较小，拥有较高的比表面，可以包埋疏水性药物，提高其溶解性，减少常规用药中助溶剂的副作用；
3.纳米药物载体经靶向基团修饰后可实现靶向药物给药，可减少用药剂量，降低其副作用，如叶酸修饰载药纳米粒、磁性载药纳米粒等；
4.纳米载体可延长药物的消除半衰期(t1/2β)，提高有效血药浓度时间，提高药效，降低用药频率，减少其毒副作用；
5.纳米载体可透过机体屏障对药物作用的限制，如血脑屏障、血眼屏障及细胞生物膜屏障等，使药物到达病灶，提高药效；
上述优点均需要纳米药物的粒径达到一定要求，粒径越小，纳米药物均一性越好，可更好的发挥纳米药物的优势。一般对于满足静脉注射要求的SNALP的PDI要求小于0.2；因此，后续实施例选择粒径最小，且PDI小于0.2的实施例4的流速进行实验。
对比例1：利用乙醇注入法制备SNALP
利用乙醇注入法制备SNALP所需的各成分及比例同上述实施例。
具体是将各脂质成分溶解于90％的乙醇中配制成油相溶液，将siRNA溶解于pH＝5的柠檬酸缓冲液(无核酶)中配制成水相溶液，pH＝6的柠檬酸缓冲液(无核酶)作为稀释相。各溶液放置于40℃下20分钟。用一次性注射器吸取各溶液，油相、水相和稀释相的体积比为1:1:2，安装在T型管的三边，同时推挤注射器，用超滤离心管(Mw＝10KDa)收集最终的液体，以4000r/min的转速离心20min，加入PBS洗脱并收集终产物。
实验测试分析：结果如图7-8所示，使用乙醇注入法制备出的SNALP平均粒径为154nm，PDI为0.27；与实施例四中制备出的SNALP在形貌上有显著性差异。
测试例1
本测试例是对使用微流控法制备的包载不同siRNA的SNALP粒径进行比较，制备SNALP所需的各成分及比例以及相应步骤均同实施例4。使用的siRNA序列如下
实验测试分析：结果见图9，结果显示包载siRNA1的SNALP平均粒径为116nm，PDI为0.103；包载siRNA2的SNALP平均粒径为100.9nm，PDI为0.098；包载siRNA3的SNALP平均粒径为126nm，PDI为0.101，结果证明该方法制备的SNALP对包载的siRNA种类没有特殊要求，制备方案具有较好的普适性。
测试例2
本实施例在制备SNALP时是在实施例4探索出的最佳流速下进行的，重复三次后对制备出的SNALP的粒径进行对比，制备SNALP所需的各成分及比例同上述实施例，包载的siRNA为siRNA1。具体步骤如下：
实验测试分析：结果见图10，结果显示三次制备出的SNALP平均粒径均在100nm左右，PDI为0.106左右，该方法的可重复性强。
测试例3
本测试例是将实施例4制备出的SNALP放置一周后测试其粒径，并与刚制备出的SNALP的粒径进行对比；实验测试结果显示SNALP在室温下放置7天的粒径和PDI基本无变化，结果见图11，所得产品具有稳定性良好的特性。
综上所述，本实施方式在微流控技术背景下实现了稳定核酸脂质纳米粒的可控制备，通过特殊设计的三相微流控芯片管路，以及对流速比的调节，实现对SNALP尺寸大小以及尺寸均匀性的控制，对包载siRNA的种类无特定要求，也可应用于其他种类的核酸药物SNALP的制备，制备过程简单、迅速，试剂消耗少，并且设备简单，成本低，有利于大规模工厂化制备。上述实施例的测试分析结果表明，通过流速调控，制备出的纳米粒的尺寸均一性显著高于传统手动乙醇注入法得到的产品，避免了人工操作对SNALP制备过程的影响，为稳定核酸脂质纳米粒的制备提供了一种高效可控的新方法。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (5)

1.一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，微流控装置由SNALP微流控芯片、微型注射泵系统和硅胶管路组成；
其特征在于，
SNALP微流控芯片上设有水相注入口、油相注入口、稀释相注入口和出口；
注入口和出口分别通过内径小于0.2 mm的硅胶管路与微型注射泵系统和产物收集装置连接，
微型注射泵系统包括单通道智能注射泵、智能注射泵控制器和注射器，注射器通过硅胶管路与相应的注入口相连，注射器的另一端连接注射泵，注射泵通过智能注射泵系统控制泵速；
具体制备步骤如下：
1）将DLin-MC3-DMA、PEG-DMG、DSPC和Cholesterol溶解于乙醇中配制成油相溶液，将siRNA溶解于pH=5的柠檬酸缓冲液中配制成水相溶液，pH=6的柠檬酸缓冲液作为稀释相溶液；
2）用注射器吸取各溶液后置于相应位置处，连接相应的注入口，并组装好微型注射泵系统；
3）设定水相流速为0.7-0.8 mL/min、油相流速为0.7-0.8 mL/min、稀释相流速为1.4-1.6 mL/min，开启微型注射泵系统进行产物制备；
4）用超滤离心管收集最终的液体，离心，洗脱，收集终产物；
步骤2）中，用不同注射器吸取的油相、水相和稀释液的体积比为1:1:2。
2.如权利要求1所述的一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，其特征在于，步骤1）中，DLin-MC3-DMA:PEG-DMG:DSPC:Cholesterol的比例为40:5:10:45，DLin-MC3-DMA与siRNA的摩尔比为7.6:1，DLin-MC3-DMA的乙醇溶液的浓度不高于5mg/mL，柠檬酸缓冲液的浓度不高于50 mM，siRNA的浓度不高于1 OD/mL。
3.如权利要求1所述的一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，其特征在于，步骤4）中，离心转速为4000 r/min，离心时间为20 min，洗脱过程采用PBS缓冲液洗脱。
4.如权利要求1所述的一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，其特征在于，水相注入口和油相注入口首先在芯片中通过S型结构通道并联后再与稀释相注入口通过S型结构通道并联混合。
5.如权利要求4所述的一种利用新型微流控装置制备核酸脂质纳米粒的方法，其特征在于，S型结构通道的横截面形状为半圆形、方形、梯形、椭圆形、无规则形中的任意一种。
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