CN112843019A - 一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用。本发明提供的核酸脂质纳米粒组合物，包括载药脂质纳米粒和辅料，载药脂质纳米粒与辅料的质量比为(0.1～10):(90～99.9)，载药脂质纳米粒包括核酸类药物和脂质类载体，核酸类药物与脂质类载体的质量比为1:(2～30)，组合物稳定性好，不会因为温度过高而使核酸类药物降解，可常温保存、运输，且可经过多种途径给药，起效快，生物利用率高；可大规模生产，收率高，重现性好。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用。
背景技术
脂质纳米粒(Lipid nanoparticles，LNP)的研究起始于20世纪90年代，是指粒径在50～1000nm、以固态天然或合成的脂质或类脂(如卵磷脂、三酰甘油等)为基质、将药物包裹或夹嵌于脂质或类脂核中所制成的固体胶粒给药系统。
近年来在LNP制备工艺、制备材料及表面修饰等方面取得了较大的进展，在抗癌、克服生物屏障、装载生物药及疫苗制备等领域的应用有巨大的潜力。相比于传统的脂质体，LNP具有如下优点：(1)物理稳定性大大提高，解决了脂质体在体内外不稳定、油相对药物溶解度不高以及制备过程存在潜在的毒性物质等问题；(2)采用生理相容耐受性好的脂质或类脂材料为载体，不会发生化学降解；(3)可通过高压乳匀法、微流控法或机械搅拌法进行工业化生产；(4)具有增加药物溶解度、延长药物在体内滞留时间增强药物靶向性及降低毒性，抗肿瘤多药耐药等特点。
核酸类药物的发展为多种疾病(包括传染病、肿瘤、糖尿病、心血管疾病、单基因遗传病等)的防治提供了有效的手段，但由于核酸类药物在常温下不稳定性以及给药途径单一等因素限制了大规模临床应用。
有鉴于此，开发出一种包载核酸类药物的脂质纳米粒新型给药系统将具有重要的意义。
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术存在技术问题，本发明提供一种核酸脂质纳米粒组合物，在常温下稳定性好，并可通过多种途径给药。
本发明还提供包含上述核酸脂质纳米粒组合物的药物制剂。
本发明还提供上述药物制剂的制备方法，可大规模生产，收率高，重现性好。
本发明还提供上述核酸脂质纳米粒组合物，或者包含上述核酸脂质纳米粒的药物制剂，或者根据上述制备方法制备的药物制剂在制备核酸药物中的应用。
用于解决问题的方案
本发明提供一种核酸脂质纳米粒组合物，包括载药脂质纳米粒和辅料，所述载药脂质纳米粒与所述辅料的质量比为(0.1～10):(90～99.9)；
其中，所述载药脂质纳米粒包括核酸类药物和脂质类载体，所述核酸类药物与所述脂质类载体的质量比为1:(2～30)；
优选地，所述核酸类药物选自DNA、siRNA、miRNA和mRNA中的至少一种；
优选地，所述脂质类载体选自阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质、胆固醇和两亲性脂质中的至少一种。
优选地，根据本发明所述的核酸脂质纳米粒组合物，所述阳离子脂质选自DLin-MC3-DMA、DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、DC-Chol和DOTMA中的至少一种；
优选地，所述中性脂质选自DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE、SOPE、反式DOPE和POPG中的至少一种或其经阴离子修饰基团修饰的脂质；更优选地，所述阴离子修饰基团为磷酸基团；
优选地，所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的至少一种；
优选地，所述两亲性脂质选自PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种；
优选地，所述辅料选自甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、明胶、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、大豆卵磷脂、聚维酮K25、尼泊金丙酯、糖精、硫酸氢钠、氧化锌、赖氨酸、亮氨酸、左旋薄荷脑、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、乙酰半胱氨酸、依地酸钠、甘氨酸、甘油、盐酸、硝酸、乙醇、吐温80、吐温20、碳酸钙、氯化钙、羟丙基纤维素和淀粉中的至少一种。
本发明还提供一种药物制剂，其包括本发明所述的核酸脂质纳米粒组合物；
优选地，所述药物制剂为干粉或注射剂；
优选地，所述吸入剂为干粉；
优选地，所述干粉的流体力学直径为0.5～15μm；
优选地，在所述干粉中，所述载药脂质纳米粒的流体力学直径为30～800nm。
本发明还提供一种根据本发明所述的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
将所述核酸类药物与所述脂质类载体混合制备载药脂质纳米粒，然后加入所述辅料，形成药物制剂。
优选地，根据本发明所述的制备方法，包括以下步骤：
将所述核酸类药物与所述脂质类载体混合制备载药脂质纳米粒溶液，然后加入所述辅料的水溶液，经喷雾干燥形成干粉。
优选地，根据本发明所述的制备方法，在将所述核酸药物与所述脂质类载体混合时，混合方法选自微流控法、机械搅拌法、高压乳匀法、乳化沉淀法、薄膜水化法、溶剂注入法、挤出法和喷雾法中的一种。
优选地，根据本发明所述的制备方法，在所述辅料的水溶液中，所述辅料与所述水的质量比为(0.1～10):(90～99.9)。
优选地，根据本发明所述的制备方法，喷雾干燥选自常温喷雾干燥或冷冻喷雾干燥；
进一步优选地，常温喷雾干燥的进风温度为30～120℃，液体速度0.1～20L/h，压缩空气压力0.01～4MPa；
进一步优选地，冷冻喷雾干燥的温度为-15℃～-90℃，液体速度0.2～40L/h，压缩空气压力0.01～4MPa。
优选地，根据本发明所述的制备方法，喷雾干燥的装置选自单流体雾化装置、二流体雾化装置、三流体雾化装置、超声雾化装置和超临界流体雾化装置中的一种。
本发明还提供根据本发明所述的核酸脂质纳米粒组合物，或者根据本发明所述的药物制剂，或者由根据本发明所述的制备方法制备的药物制剂在制备核酸药物中的应用；
优选地，所述核酸药物通过吸入和/或注射的方式施用于对其有需要的个体。
发明的效果
本发明提供的核酸脂质纳米粒组合物，稳定性好，不会因为温度过高而使核酸药物降解，可常温保存、运输，且可经过多种途径给药，起效快，生物利用率高。
本发明提供的药物制剂，可为吸入剂(优选干粉)或注射剂，其中，干粉复溶后粒径变化不大，能够很好地还原了核酸脂质纳米粒结构，基本无核酸药物的泄露；而且，可经肺部入血，起效快，生物利用率高。
本发明提供的药物制剂的制备方法，可大规模生产，收率高，重现性好，且不会因为温度过高而使核酸药物降解。
附图说明
图1为实施例13中核酸脂质纳米粒干粉复溶后的TEM图；
图2为实施例14中核酸脂质纳米粒干粉复溶前后的TEM图，其中(A)为复溶前的TEM图，(B)为复溶后的TEM图；
图3为实施例15中复溶后的核酸脂质纳米粒经肺部进入小鼠体内成像图；
图4为实施例15中复溶后的核酸脂质纳米粒经肌肉注射进入小鼠体内成像图。
具体实施方式
以下将详细说明本发明的各种示例性实施例、特征和方面。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
如无特殊声明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。
本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。
本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
<第一方面>
本发明提供一种核酸脂质纳米粒组合物，包括载药脂质纳米粒和辅料，载药脂质纳米粒与辅料的质量比为(0.1～10):(90～99.9)，具体可以为0.1:99.9、1:99、2:98、5:95、10:90等。
其中，载药脂质纳米粒包括核酸类药物和脂质类载体，核酸类药物与脂质类载体的质量比为1:(2～30)，优选1:(10～20)，具体可以为1:2、1:：10、1:15、1:20、1:25、1:30等。
在上述质量比范围内，核酸脂质纳米粒组合物稳定性好，可实现常温保存、运输；而且，在通过多种途径给药时，起效快，生物利用率高。
在本发明中，核酸类药物又称核苷酸类药物，是从某些动物、微生物的细胞内提取出的核酸(包括核苷酸和脱氧核苷酸)，或者通过人工合成法制备的具有核酸结构(包括核苷酸和脱氧核苷酸结构)同时又具有一定药理作用的物质；广义的核酸药物可包括核苷酸药物、核酸药物及含有不同碱基化合物的药物。核酸类药物的药理作用按其作用特点可分为：(1)抗病毒剂，代表药物有三氮唑核苷、无环鸟苷和阿糖腺苷等，临床上用于抗肝炎病毒、疤疹病毒及其他病毒；(2)抗肿瘤剂，代表药物有用于治疗消化道癌的氟尿喃等；(3)干扰素诱导剂，代表药物为聚肌胞，临床上用于抗肝炎病毒、疤疹病毒等；(4)免疫增强剂，主要用于抗病毒及抗肿瘤的辅助治疗；(5)功能剂，用于肝炎、心脏病等多种疾病的辅助治疗。
在本发明一些具体的实施方案中，核酸类药物选自DNA、siRNA、miRNA和mRNA中的至少一种。
在本发明中，脂质类载体材料为天然或合成的脂质类分子，能够提高核酸类药物的稳定性。
在本发明一些具体的实施方案中，脂质类载体选自阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质、胆固醇和两亲性脂质中的至少一种。
在本发明一些具体的实施方案中，阳离子脂质选自DLin-MC3-DMA(CAS号：1224606-06-7)、DLinDMA(CAS号：871258-12-7)、DODMA(CAS号：104162-47-2)、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA(CAS号：1190197-97-7)、DOTAP(CAS号：132172-61-3)、DC-Chol(CAS号：166023-21-8)和DOTMA(CAS号：104872-42-6)中的至少一种。
在本发明一些具体的实施方案中，中性脂质选自DOPE(CAS号：4004-05-1)、DSPC(CAS号：816-94-4)、DPPC(CAS号：2797-68-4)、DOPC(CAS号：4235-95-4)、DPPG(CAS号：200880-41-7)、POPC(CAS号：26853-31-6)、POPE(CAS号：10015-88-0)、DPPE(CAS号：923-61-5)、DMPE(CAS号：998-07-2)、DSPE(CAS号：1069-79-0)、SOPE(1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺)、反式DOPE(1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)和POPG(CAS号：81490-05-3)中的至少一种。
在本发明一些具体的实施方案中，中性脂质还可以为上述中性脂质经阴离子修饰基团修饰得到的脂质，阴离子修饰基团不做限定，优选地，阴离子修饰基团为磷酸基团。
在本发明一些具体的实施方案中，磷酸基团不作限定，即含有磷酸基团的即可。上述中性脂质经阴离子修饰基团修饰后再加入部分阳离子基团修饰即可保持中性。
在本发明一些具体的实施方案中，阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸(PS)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)、DOPG(CAS号：62700-69-0)和二豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)中的至少一种。
在本发明一些具体的实施方案中，两亲性脂质选自PEG-DMG(聚乙二醇-二肉豆蔻酰甘油)、PEG-c-DMG、PEG-c-DMA(CAS号：25852-47-5)、PEG-DSPE(聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺)、PEG-PE(PEG修饰的磷脂酰乙醇胺)、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG-DPG(聚乙二醇二棕榈酰甘油)、PEG-s-DMG(PEG修饰的二烷基甘油(甲氧基聚乙二醇)-二肉豆蔻酰甘油)、DAA(PEG-二烷氧基丙基)、PEG-c-DOMG(R-3-[(ω-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1,2-二肉豆蔻基氧丙基-3-胺)和GalNAc-PEG-DSG(N-乙酰半乳糖胺-((R)-2,3-双(十八烷氧基)丙基-l-(甲氧基-聚(乙二醇)2000)丙基氨基甲酸酯)))中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方式中，辅料选自甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、明胶、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、大豆卵磷脂、聚维酮K25、尼泊金丙酯、糖精、硫酸氢钠、氧化锌、赖氨酸、亮氨酸、左旋薄荷脑、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、乙酰半胱氨酸、依地酸钠、甘氨酸、甘油、盐酸、硝酸、乙醇、吐温80、吐温20、碳酸钙、氯化钙、羟丙基纤维素和淀粉中的至少一种。优选地，在本发明的一些具体实施方式中，辅料选自甘露醇、蔗糖、乳糖和海藻糖中的至少一种。
<第二方面>
本发明提供一种药物制剂，其包括第一方面中描述的核酸脂质纳米粒组合物。
在本发明的一些具体实施方案中，药物制剂可以为片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、丸剂、凝胶剂、散剂、口服溶液、吸入剂(例如干粉)、混悬剂或干悬剂中的任一种；优选地，本发明的药物制剂为吸入剂(更优选为干粉)和注射剂。
本发明提供的核酸脂质纳米粒组合物可以直接作为干粉，预装至特殊的供肺吸入使用的雾化器中，通过吸入的方式将核酸脂质纳米粒递送至肺组织。
本发明提供的核酸脂质纳米粒干粉经复溶还可以作为注射剂，即将核酸脂质纳米粒干粉复溶于生理盐水中，通过肌肉注射、静脉注射或局部注射的方式将核酸脂质纳米粒递送至体内。
本发明的核酸脂质纳米粒干粉，以脂质类载体装载核酸类药物形成载药脂质纳米粒，提高了核酸类药物的稳定性，不会因为温度过高而使核酸类药物降解，可在常温下保存、运输。
本发明的载药脂质纳米粒和辅料形成干粉，经复溶后可形成注射剂，其核酸脂质纳米粒粒径变化不大，能够很好地还原了核酸脂质纳米粒结构，基本无核酸类药物的泄露。
本发明的药物制剂为给药途径提供了多种选择，可经肺部入血，起效快，生物利用率高。
在本发明一些具体的实施方案中，核酸脂质体纳米粒干粉的流体力学直径为0.5～15μm，如0.5μm、5μm、10μm、15μm等，该范围的粒径可被更多地吸入至深肺。本发明中，采用新帕泰克干法激光粒度仪对核酸脂质体纳米粒干粉的流体力学直径进行测定。
在本发明一些具体的实施方案中，在干粉中，载药脂质纳米粒的流体力学直径为30～800nm。本发明中，采用动态光散射法对载药脂质纳米粒的流体力学直径进行测定。
在本发明一些具体的实施方案中，干粉或注射剂还可以通过核酸脂质纳米粒组合物与额外的辅料或赋形剂制备而成，其中，额外的辅料或赋形剂选自甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、明胶、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、大豆卵磷脂、聚维酮K25、尼泊金丙酯、糖精、硫酸氢钠、氧化锌、赖氨酸、亮氨酸、左旋薄荷脑、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、乙酰半胱氨酸、依地酸钠、甘氨酸、甘油、盐酸、硝酸、乙醇、吐温80、吐温20、碳酸钙、氯化钙、羟丙基纤维素和淀粉中的至少一种。
<第三方面>
本发明还提供一种第二方面中描述的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：
将核酸类药物与脂质类载体混合制备载药脂质纳米粒，然后加入辅料，形成药物制剂。
在本发明一些具体的实施方案中，对于干粉的制备，本发明提供以下步骤：
将核酸类药物与脂质类载体混合制备载药脂质纳米粒溶液，然后加入辅料的水溶液，经喷雾干燥形成核酸脂质纳米粒干粉。
在本发明一些具体的实施方案中，在将核酸药物与脂质类载体混合时，混合的方法选自微流控法、机械搅拌法、高压乳匀法、乳化沉淀法、薄膜水化法、溶剂注入法、挤出法和喷雾法中的一种。
在本发明一些具体的实施方案中，在辅料的水溶液中，辅料与水的质量比为(0.1～10):(90～99.9)，具体可为0.1:99.9、2:98、5:95、10:90等。
在本发明一些具体的实施方案中，喷雾干燥选自常温喷雾干燥或冷冻喷雾干燥。
在本发明一些具体的实施方案中，常温喷雾干燥的进风温度为30～120℃，优选45～80℃；液体速度0.1～20L/h，优选0.1～0.5L/h；压缩空气压力0.01～4MPa，优选0.05～1MPa。
在本发明一些具体的实施方案中，冷冻喷雾干燥的温度为-15℃～-90℃，优选-20～-80℃；液体速度0.2～40L/h，优选2～20L/h；压缩空气压力0.01～4MPa，优选0.05～1MPa。
在本发明一些具体的实施方案中，喷雾干燥的装置选自单流体雾化装置、二流体雾化装置、三流体雾化装置、超声雾化装置和超临界流体雾化装置中的一种。
<第四方面>
本发明还提供第一方面中描述的核酸脂质纳米粒组合物，或者第二方面中描述的药物制剂，或者由第三方面中描述的制备方法制备的药物制剂在制备核酸药物中的应用。
在本发明一些具体的实施方案中，核酸药物通过吸入和/或注射的方式施用于对其有需要的个体。
实施例1
将总质量24.4mg的DOTAP、DSPC、胆固醇和PEG-DMG按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控技术快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将1g甘露醇溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经常温喷雾干燥塔喷出，使用二流体雾化装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度45℃、液体流速0.3L/h、压缩空气压力0.2Mpa。该组干粉粒径的D50为5μm。
实施例2
将总质量24.4mg的DOTAP、DSPC、胆固醇和PEG-DMG按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控技术快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将1g甘露醇及1g卵磷脂溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经冷冻喷雾塔喷出，使用二流体雾化装置，冻干，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，塔内温度-40℃、液体流速1L/h、压缩空气压力1Mpa。
实施例3
将总质量24.4mg的DLin-MC3-DMA、DOPE、胆固醇和PEG-c-DMA按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过机械搅拌快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将0.7g海藻糖、0.3g吐温80及1g明胶溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经常温喷雾干燥塔喷出，使用超声雾化喷雾装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度80℃、液体流速0.3L/h、压缩空气压力0.5Mpa。该组干粉粒径的D50为6μm。
实施例4
将总质量24.4mg的DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DSPE按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过薄膜水化法制备得到包载mRNA的LNP溶液。将0.5g乳糖、0.5g糖精及0.3g氯化钙溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经常温喷雾干燥塔喷出，使用单流体雾化喷雾装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度60℃、液体流速0.5L/h、压缩空气压力1.0Mpa。该组干粉粒径的D50为3μm。
实施例5
将总质量24.4mg的DOTMA、DOPS、DOPE、胆固醇和PEG-DMG按摩尔比40:10:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的DNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过挤出法得到包载mRNA的LNP溶液。将0.3g羟丙基纤维素及0.1g碳酸钙溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经常温喷雾干燥塔喷出，使用三流体喷雾装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度50℃、液体流速0.5L/h、压缩空气压力0.2Mpa。
实施例6
将总质量24.4mg的DC-Chol、DSPC、胆固醇和PEG-DMG按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的siRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控技术快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将0.5g赖氨酸及0.5g甘氨酸溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经冷冻喷雾塔喷出，使用二流体喷雾装置，冻干，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，塔内温度-85℃、液体流速3L/h、压缩空气压力0.8Mpa。
实施例7
将总质量24.4mg的DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DMG按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将1g甘露醇溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经低温喷雾干燥塔喷出，使用二流体喷雾装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度45℃、液体流速0.3L/h、压缩空气压力0.2Mpa。该组干粉粒径的D50为5μm。
实施例8
将总质量24.4mg的DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-c-DMA按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的miRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控技术快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将0.5g乳糖及0.5g甘露醇溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经冷冻喷雾塔喷出，使用二流体喷雾装置，冻干，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，塔内温度-85℃、液体流速10L/h、压缩空气压力0.8Mpa。该组干粉粒径的D50为15μm。
实施例9
将总质量24.4mg的DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和PEG-DSPE按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控技术快速混合，然后切向流除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将0.5g柠檬酸、0.1g氧化锌及4.4g甘露醇溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经冷冻喷雾塔喷出，使用三流体喷雾装置，冻干，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，塔内温度-60℃、液体流速5L/h、压缩空气压力0.3Mpa。该组干粉粒径的D50为5μm。
实施例10
将总质量100mg的DOTAP、DSPC、胆固醇和PEG-DMG按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过微流控技术快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将1g甘露醇及0.1g吐温-80溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经冷冻喷雾塔喷出，使用超临界流体喷雾装置，冻干，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，塔内温度-60℃、液体流速5L/h、压缩空气压力0.3Mpa。
实施例11
将总质量24.4mg的DLin-MC2-KPZ、DPPC、胆固醇和PEG-c-DMG按摩尔比52:38:8:2溶于1mL乙醇中；将1mg的mRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过机械搅拌快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将1g甘露醇溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经常温喷雾干燥塔喷出，使用二流体雾化喷雾装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度45℃、液体流速0.3L/h、压缩空气压力0.2Mpa。
实施例12
将总质量24.4mg的DLin-KC2-DMA、DPPC、胆固醇和PEG-C14按摩尔比50:38.5:10:1.5溶于1mL乙醇中；将1mg的siRNA溶于3mL的柠檬酸盐缓冲液(50mM，pH＝4.0)中，与上述乙醇溶液通过机械搅拌快速混合，然后透析除去乙醇，得到包载mRNA的LNP溶液。将1g甘露醇及1g乳糖溶于46mL水中，得到辅料的水溶液，与LNP溶液充分溶解后经常温喷雾干燥塔喷出，使用二流体雾化喷雾装置，形成核酸脂质纳米粒干粉。其中，进风温度45℃、液体流速0.4L/h、压缩空气压力0.2Mpa。
实施例13
将实施例1中的核酸脂质纳米粒干粉复溶于水中，并拍摄TEM图，通过激光粒度仪测试两者粒径。
图1为实施例1的核酸脂质纳米粒干粉复溶后TEM图，其结果显示，经复溶后的核酸脂质纳米粒依然可以保持球形。
实施例14
将实施例7中的核酸脂质纳米粒干粉复溶于水中，并与LNP溶液一起拍摄TEM图，通过激光粒度仪测试两者粒径。
图2为核酸脂质纳米粒干粉复溶前后的TEM图，其中(A)为核酸脂质纳米粒干粉复溶前的TEM图，(B)为核酸脂质纳米粒干粉复溶后TEM图，通过二者对比可见，经复溶后的核酸脂质纳米粒依然可以保持球形，且粒径变化不大。
实施例15
将实施例7中的核酸脂质纳米粒干粉复溶于水中，通过肺部吸入和肌肉注射两种方式将其注入小鼠体内(10μg荧光素酶mRNA/只)，通过检测荧光判定mRNA表达情况，在6小时成像观察其表达情况。
图3为复溶后的核酸脂质纳米粒经肺部进入小鼠体内成像图，图4为复溶后的核酸脂质纳米粒经肌肉注射进入小鼠体内成像图，可见，小鼠体内可表达相应荧光，说明脂质纳米粒干粉的可行性。
实施例16
将实施例1-12中的核酸脂质纳米粒组合物取100mg与额外的100mg乳糖共混，得到核酸脂质纳米粒干粉。将核酸脂质纳米粒干粉预装至特殊的供肺吸入使用的雾化器中，通过吸入的方式核酸脂质纳米粒递送至肺组织。
实施例17
将实施例1-12中的核酸脂质纳米粒组合物取100mg复溶于10mL生理盐水中，通过肌肉注射、静脉注射或局部注射的方式将核酸脂质纳米粒递送到体内。
需要说明的是，尽管以具体实例介绍了本发明的技术方案，但本领域技术人员能够理解，本发明应不限于此。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择，旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术改进，或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。
Claims (10)
1.一种核酸脂质纳米粒组合物，其特征在于，包括载药脂质纳米粒和辅料，所述载药脂质纳米粒与所述辅料的质量比为(0.1～10):(90～99.9)；
其中，所述载药脂质纳米粒包括核酸类药物和脂质类载体，所述核酸类药物与所述脂质类载体的质量比为1:(2～30)；
优选地，所述核酸类药物选自DNA、siRNA、miRNA和mRNA中的至少一种；
优选地，所述脂质类载体选自阳离子脂质、中性脂质、阴离子脂质、胆固醇、两亲性脂质中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的核酸脂质纳米粒组合物，其特征在于，所述阳离子脂质选自DLin-MC3-DMA、DLinDMA、DODMA、DLin-MC2-MPZ、DLin-KC2-DMA、DOTAP、DC-Chol和DOTMA中的至少一种；
优选地，所述中性脂质选自DOPE、DSPC、DPPC、DOPC、DPPG、POPC、POPE、DPPE、DMPE、DSPE、SOPE、反式DOPE和POPG中的至少一种或其经阴离子修饰基团修饰的脂质；更优选地，所述阴离子修饰基团为磷酸基团；
优选地，所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、二油酰基磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的至少一种；
优选地，所述两亲性脂质选自PEG-DMG、PEG-c-DMG、PEG-c-DMA、PEG-DSPE、PEG-PE、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG-DPG、PEG-s-DMG、DAA、PEG-c-DOMG和GalNAc-PEG-DSG中的至少一种；
优选地，所述辅料选自甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、明胶、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、卵磷脂、大豆卵磷脂、聚维酮K25、尼泊金丙酯、糖精、硫酸氢钠、氧化锌、赖氨酸、亮氨酸、左旋薄荷脑、硬脂酸镁、对羟基苯甲酸甲酯、乙酰半胱氨酸、依地酸钠、甘氨酸、甘油、盐酸、硝酸、乙醇、吐温80、吐温20、碳酸钙、氯化钙、羟丙基纤维素和淀粉中的至少一种。
3.一种药物制剂，其包括根据权利要求1或2所述的核酸脂质纳米粒组合物；
优选地，所述药物制剂为吸入剂或注射剂；
优选地，所述吸入剂为干粉；
优选地，所述干粉的流体力学直径为0.5～15μm；
优选地，在所述干粉中，所述载药脂质纳米粒的流体力学直径为30～800nm。
4.一种根据权利要求3所述的药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述核酸类药物与所述脂质类载体混合制备载药脂质纳米粒，然后加入所述辅料，形成药物制剂。
5.根据权利要求4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将所述核酸类药物与所述脂质类载体混合制备载药脂质纳米粒溶液，然后加入所述辅料的水溶液，经喷雾干燥形成干粉。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在将所述核酸药物与所述脂质类载体混合时，混合方法选自微流控法、机械搅拌法、高压乳匀法、乳化沉淀法、薄膜水化法、溶剂注入法、挤出法和喷雾法中的一种。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，在所述辅料的水溶液中，所述辅料与所述水的质量比为(0.1～10):(90～99.9)。
8.根据权利要求5或6的制备方法，其特征在于，喷雾干燥选自常温喷雾干燥或冷冻喷雾干燥；
优选地，常温喷雾干燥的进风温度为30～120℃，液体速度0.1～20L/h，压缩空气压力0.01～4MPa；
优选地，冷冻喷雾干燥的温度为-15℃～-90℃，液体速度0.2～40L/h，压缩空气压力0.01～4MPa。
9.根据权利要求5或6的制备方法，其特征在于，喷雾干燥的装置选自单流体雾化装置、二流体雾化装置、三流体雾化装置、超声雾化装置和超临界流体雾化装置中的一种。
10.根据权利要求1或2任一项所述的核酸脂质纳米粒组合物，或者根据权利要求3所述的药物制剂，或者由根据权利要求4-9中任一项所述的制备方法制备的药物制剂在制备核酸药物中的应用；
优选地，所述核酸药物通过吸入和/或注射的方式施用于对其有需要的个体。
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