WO2020071448A1 - 吸入粉末剤、その評価方法及びその用途 - Google Patents

吸入粉末剤、その評価方法及びその用途

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WO2020071448A1
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inhalable powder
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岡本　浩一
知将 奥田
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学校法人名城大学
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Definitions

  • the present specification relates to an inhalation powder, an evaluation method thereof, and use thereof.
  • This application is a related application of Japanese Patent Application No. 2018-187498 filed on October 2, 2018 and claims priority based on this Japanese application. It is incorporated herein by reference.
  • This application is a related application of Japanese Patent Application No. 2017-91941 filed on May 2, 2017, the entire contents of which are incorporated herein by reference.
  • the lungs are attracting attention as a route of administration that can be expected to have systemic effects with low gastrointestinal absorption as well as locally acting drugs.
  • Inhalants that can deliver drugs directly and non-invasively to the lungs can be expected to quickly exert their effects, and have the advantage of reducing systemic side effects because they require smaller doses than oral administration ( Patent Document 1). Therefore, it is expected to be used for diseases such as lung cancer and pulmonary hypertension in the future.
  • Inhalants are classified into three types: inhaled aerosols (Metered-Dose Inhaler; MDI), inhaled liquids (Inhalation Solution), and inhaled powders (Dry Powder Inhaler; DPI). It is important to use it properly in order to achieve an effective therapeutic effect.
  • MDI Metal-Dose Inhaler
  • Inhalation Solution inhalation Solution
  • DPI Dry Powder Inhaler
  • drug powder is generally disintegrated / dispersed in the air by a patient's inhalation effort and delivered to the respiratory treatment area, so that it is easy to synchronize powder spraying with inhalation, no propellant is required, and the inhalation procedure is simple.
  • research and development have been actively conducted because of its relatively small size and excellent portability.
  • DPI requires a certain level of inhalation capability to disperse the fine powder particles, so that there is a problem that there are restrictions on the patients that can be used.
  • a large amount of drug adheres to the oral cavity and pharynx. If the aim is to adapt to diseases such as lung cancer and pulmonary hypertension, it is necessary to design a formulation to improve those problems.
  • This specification provides an inhalation powder preparation excellent in dispersibility, pulmonary delivery property and deposition property, an evaluation method thereof, and use thereof.
  • the present inventors have conducted various formulation studies and evaluations on inhalation powders that achieve dispersibility, pulmonary delivery, and deposition properties, and as a result, have found that an inhalation powder that can satisfy these characteristics can be constructed. In addition, they have found a method for evaluating such formulation characteristics. According to the present specification, the following means is provided based on such knowledge.
  • OE (%) recovered amount (mg) from throat and on / total recovered amount (mg) ⁇ 100 is 80% or more.
  • the mass change rate at 70% RH is 1% or less, and the mass change rate at 95% RH
  • a peak particle size in a geometric particle size distribution of the particles is 1 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less.
  • the inhalable powder according to [12], wherein the anionic component is hyaluronic acid or a salt thereof.
  • the weight-average molecular weight contains hyaluronic acid or a salt thereof having a molecular weight of 30,000 or more and 70,000 or less and phenylalanine, and based on the total mass of these two components,
  • the inhalable powder according to any of [10] to [17] which is used for gene expression in mammals.
  • the inhalable powder according to any of [10] to [17] which is used for gene suppression in mammals.
  • a method for producing an inhalation powder comprising: Spray-freezing a liquid in which the active ingredient and at least one excipient are dissolved so that porous hollow spherical particles that can be dispersed and disintegrated by inhalation and swell when absorbing moisture are obtained. A drying step of drying.
  • the method according to [20] further comprising selecting the excipient to prepare the liquid as described above.
  • a method for evaluating an inhalation powder comprising: A method of obtaining a calculated first median aerodynamic mass diameter and a second median aerodynamic mass diameter smaller than the first median aerodynamic mass diameter in the evaluation of inhalation characteristics by ACI. . [26] The method according to [25], wherein a ratio (mass) of the powder having the second aerodynamic mass median diameter to the total powder is obtained.
  • a method for evaluating an inhalation powder comprising: A method of measuring a mass change rate at least at 70% RH and a mass change rate at 95% RH when changing from 50% RH to 95% RH at 37 ° C. in the dynamic moisture adsorption measurement method.
  • FIG. 3 is a view showing an electron microscope (SEM) observation result of the inhalation powder preparation prepared in Example 1. It is a diagram showing a particle size distribution and D 50 diameter of the suction powders prepared in Example 1.
  • FIG. 2 is a view showing the recovery rate of each of the inhaled powder preparations prepared in Example 1 at each site by the ACI method.
  • FIG. 3 is a view showing an index of inhalation characteristics of the inhalation powder preparation prepared in Example 1.
  • FIG. 2 is a view showing aerodynamic mass median diameter (MMAD), geometric standard deviation (GSD), and decay rate (R) of the inhalation powder preparation prepared in Example 1.
  • MMAD aerodynamic mass median diameter
  • GSD geometric standard deviation
  • R decay rate
  • FIG. 1 It is a figure which shows the measurement result of moisture resistance and hygroscopicity by a dynamic moisture adsorption measuring device. It is a figure which shows the outline
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between storage conditions and efficacy (gene expression upon inhalation administration to mice) of an inhalation powder using only hyaluronic acid / leucine and hyaluronic acid as an excipient.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the molecular weight of hyaluronic acid on gene expression (in vitro) of an inhalation powder using hyaluronic acid / phenylalanine as an excipient. It is a figure which shows the evaluation result of the gene expression (in vitro) of the inhalation powder which used the hyaluronic acid (sodium salt) with a weight average molecular weight of 50,000 and phenylalanine in various ratios as an excipient.
  • the disclosure of the present specification relates to an inhalable powder, a method for evaluating the same, and uses thereof.
  • the inhalation powder formulation disclosed in the present specification by inhalation, it is excellent in dispersibility and lung reach for dispersion and disintegration, and furthermore, it absorbs and swells in a high-humidity environment and exhibits adhesive cohesion in the lungs. Can demonstrate.
  • an inhalation powder having excellent dispersibility, lung accessibility, and adhesion, and to manage its characteristics.
  • a pharmaceutical composition useful for prevention and treatment of diseases and disorders in the lung can be provided by targeting the lung and its surrounding organs.
  • the inhalable powder (hereinafter simply referred to as the present powder) disclosed in the present specification is a porous hollow sphere that can be dispersed / disintegrated by inhalation and swells when absorbing moisture.
  • the active ingredient can be contained in at least a part of the particles.
  • the particle size of the powder can be measured by a dry laser diffraction method. From the cumulative particle size distribution curve, a 50% particle size (D 50 ) can be calculated. For example, it can be measured using a laser micron sizer (LMS-2000e) or its equivalent.
  • LMS-2000e laser micron sizer
  • the 50% particle size of the present powder is not particularly limited, but, for example, from 1 ⁇ m to 100 ⁇ m, for example, from 2 ⁇ m to 50 ⁇ m, and from 5 ⁇ m to 20 ⁇ m in consideration of scattering and dispersibility. Can be.
  • the thickness can be 5 ⁇ m or more and 20 ⁇ m or less, or, for example, 5 ⁇ m or more and 15 ⁇ m or less.
  • the particle shape of the present powder can be observed with a scanning electron microscope. In the observation, for example, after spraying onto a sample table using a powder fine particle addition device used for dispersion addition of the present powder, platinum coating is performed as necessary so as to be suitable for SEM observation, and observation is performed.
  • the powder fine particle adding device and the spraying method for example, those used in Examples described later can be adopted.
  • the particle diameter shape of the present powder agent is not particularly limited, but is preferably spherical in consideration of scattering properties and dispersibility. Further, it is preferably porous in consideration of scattering properties and swelling properties. Further, it preferably has a hollow structure. Typically, the present powder has a large number of pores (hollows) formed by sublimation of water, which are defined by partition walls composed of components such as an active ingredient and an excipient of the present powder. Porous spherical particles having (hollow portions) can be used.
  • the powder is delivered to the respiratory tract by inhalation (gas flow at the time of inhalation from the oral cavity to the bronchus), and evaluated by the Andersen Cascade Impactor (ACI) method, the characteristics (inhalation characteristics), That is, the dispersibility, delivery property and disintegration property of the present powder can be evaluated. Dispersibility, deliverability and disintegration are independent properties but are interrelated.
  • the ACI method refers to the 17th revised Japanese Pharmacopoeia first supplementary general test method 6.15 Aerodynamic particle size measurement method for inhalants 5.2 Measurement described in Andersen Cascade Impactor Method (Apparatus 2) Use the device.
  • a pre-separator can be used as appropriate.
  • the measuring device include a low-volume air sampler, an Andersen type, AN-200, and a device manufactured by Shibata Scientific Co., Ltd.
  • Fig. 1 shows an outline of the measuring device and an example of the measuring method.
  • a measuring apparatus a device serving as an introduction part, a throat, eight stages from stage 0 to stage 7, and a lowermost filter are provided.
  • Each stage has a filter structure and is configured to classify and trap particles having a smaller aerodynamic particle size downward.
  • the particle diameter ( ⁇ m) of the particles classified in each stage for example, the diameter shown in FIG. 1 can be adopted as the cutoff diameter when the suction amount is 28.3 L / min.
  • FIG. 1 also shows respiratory organ sites corresponding to each stage.
  • ⁇ Evaluation of the powder according to the ACI method can be in accordance with the above-mentioned General Test Method 5.2 ⁇ 5.2.2 Measurement Procedure for Inhalation Powder in the Andersen Cascade Impactor Method (Apparatus 2). That is, it can be implemented with a flow rate of 28.3 L per minute and an air volume of 4 L. Note that the suction resistance is appropriately selected depending on the suction device.
  • the measurement measure the mass of the present powder (particle or active ingredient) on the capsule, device, throat, each stage and filter used for introduction.
  • the amount of the present powder can be measured, for example, by giving an appropriate label to particles for evaluation purposes and measuring the label.
  • the quantification of the active ingredient can be carried out as needed by those skilled in the art, and the use and detection of such a label is well known to those skilled in the art.
  • stage 3 and subsequent stages are defined as an in-pulmonary delivery region effective for inhalant application, and the stage 5 and subsequent stages are defined as a deep lung delivery region where a systemic effect can be expected.
  • O OE Output Efficiency:% which is a release rate from the device is calculated by the following equation (1).
  • FPF Stage3 and FPF Stage5 (Fine Particle Fraction:%), which indicate the ratio of the present powder agent released from the device to the stage 3 and the stage 5 or later, can be calculated from the equations (2) and (3), respectively.
  • OE ⁇ FPF Stage5 (%) indicating the ratio of the total recovered amount reaching stage 5 or later can be calculated from equation (4).
  • OE (%) recovered amount T ( ⁇ g) / total recovered amount ( ⁇ g) ⁇ 100 (1) (However, the recovery amount T is the recovery amount after the throat.)
  • FPF Stage3 (%) (FPF3) Amount recovered from stage 3 and onward ( ⁇ g) / Amount recovered T ( ⁇ g) ⁇ 100 (2)
  • FPF Stage5 (%) (FPF5) Recovered amount ( ⁇ g) from stage 5 or later / recovered amount T ( ⁇ g) ⁇ 100 (3)
  • OE is an index of dispersibility
  • FPF3 is an index of pulmonary delivery
  • FPF5 is an index of deep lung delivery.
  • the ratio (recovery rate%) of the recovery amount of the present powder in each site and each stage in the device to the total recovery amount from the measurement device is different from each other. It can be used as an indicator of the rate of delivery to the corresponding respiratory site.
  • the powder can have, for example, an OE of 80% or more in the evaluation of inhalation characteristics by the ACI method. If it is 80% or more, it can be said that the release rate is good.
  • the OE is, for example, 85% or more, for example, 90% or more, and for example, 95% or more.
  • the powder preparation can have, for example, an FPF3 of 20% or more, for example, 30% or more, and for example, 40% or more.
  • the lung delivery rate can be said to be extremely good.
  • it is 50% or more, for example, 60% or more, for example, 70% or more, for example, 80% or more, and for example, 90% or more.
  • FPF3 of 20% or more may be sufficient.
  • FPF5 is, for example, 10% or more, for example, 15% or more, for example, 20% or more, for example, 25% or more, and for example, It can be 30% or more. This is because when it is 30% or more, it can be said that the deep lung delivery rate is extremely good.
  • the FPF 5 is also, for example, 40% or more, for example, 50% or more, for example, 55% or more, for example, 60% or more, and for example, 65% or more.
  • FPF5 of 10% or more may be sufficient.
  • This powder can have a peak recovery rate in any of stages 2 to 4 and the filter in the evaluation of inhalation characteristics by the ACI method. This is because, by having such recovery rate characteristics, the present powder is excellent in crushability or disintegration, excellent in hygroscopic swelling, and excellent in deep lung delivery.
  • stage 3 and the filter can be provided with recovery peaks.
  • the recovery peak in the filter is greater than the other peak, for example, 30% or more, and for example, 40% or more.
  • the disintegration of the present powder can be evaluated by the ACI method.
  • the disintegration of the present powder can be determined from the disintegration rate of the present powder and the median aerodynamic mass.
  • FIG. 8 shows an outline of this inference. As shown in FIG. 8, particles of the initial size are partially disintegrated by the inhalation airflow, and relatively large particles adhere to, for example, the lungs near the bronchi. It will flow deep into the lungs.
  • the particle size distribution of the powder empirically follows a log-normal distribution, and when the integrated value of the recovery rate for each stage is plotted against the logarithmic value of the cutoff diameter, a straight line is obtained.
  • % Particle diameter) / (50% particle diameter) can be defined as a geometric standard deviation (GSD). It can be said that this powder has the property that the lognormal plot is not a straight line but a curve.
  • the powder is large particle size and small powder (mass median aerodynamic diameter MMAD f and geometric standard With a deviation GSD f ) is assumed to exist in the ratio (1-R): R (decay rate), and the collapse rate R and the median aerodynamic diameter MMAD f, c and their geometric standard deviation GSD f, c Ask.
  • A The integrated value (%) of the recovery rate for each stage is NORM.
  • the random variable B converted by the INV function B NORM.
  • Integrated value C NORM.
  • MMAD c and GSD c NORM.
  • Integrated value of the recovery rate of the powder DIST function small particles of a particle size calculated by (MMAD f and GSD f)
  • D B ⁇ ( 1-R) + C ⁇ NORM values of R.
  • the random variable E converted by the INV function the total value of (DA) 2 obtained for each stage
  • the median aerodynamic mass MMAD c (first median aerodynamic mass) and the first median aerodynamic mass calculated under the above conditions were evaluated.
  • the present powder agent is characterized in that the mass of the powder having the second median aerodynamic mass is based on the total mass of the powders (the powders having the first and second median aerodynamic masses).
  • the ratio (%) (decay rate) can be, for example, 40% or more. This is because when it is 40% or more, it can be said that the deep lung delivery rate is high.
  • the decay rate is also, for example, at least 44%, for example, at least 50%, for example, at least 55%, for example, at least 60%.
  • the present powder can also have a mass change rate of, for example, 70% RH of 2% or less when changed from 50% RH to 95% RH at 37 ° C. in the dynamic moisture adsorption measurement method. . If the content is 2% or less, it can be said that sufficient moisture resistance is provided before inhalation. Further, for example, the mass change rate is 1.5% or less, and for example, 1% or less.
  • the mass change rate at 95% RH can be 8% or more.
  • moisture is easily absorbed.
  • Such a mass change rate is, for example, 9% or more, for example, 10% or more, and for example, 11% or more.
  • the dynamic moisture adsorption measurement method is a dynamic moisture adsorption measurement device (DVS: Dynamic Vapor Sorption; DVS advantage, which monitors, on a second scale, a mass change of a sample on a balance due to adsorption and desorption of moisture in a set temperature and humidity environment.
  • DVS Dynamic Vapor Sorption
  • DVS advantage which monitors, on a second scale, a mass change of a sample on a balance due to adsorption and desorption of moisture in a set temperature and humidity environment.
  • Surface Measurement Systems It is possible to evaluate hygroscopicity and hygroscopic growth from inhalation to the airways and deep humid lungs.
  • the environment before inhalation is “temperature 37 ° C., relative humidity (RH) 50% (absolute humidity: 6.903 g / m 3 )”, and the lung environment after inhalation is “temperature 37 ° C., 95% RH (absolute humidity: 41.62 g / m 3 ) ".
  • the moisture absorption / swelling property was evaluated by ACI method under normal conditions (that is, drying conditions, about 40% RH or less), and then the particles on each stage were collected as dry particles, and then humidified air (for example, 90% RH). % RH), and thereafter, the particles on each stage are collected as particles during humidification, and the hygroscopicity and swellability can be evaluated by observing the shape of each of these particles with an SEM or the like.
  • the ACI method is performed under the same conditions except that a box for adjusting the dry and humid conditions is arranged between the device and the throat, and the box is set to the dry and humid conditions.
  • the powder is sprayed on a sample stage of a scanning electron microscope, the powder is exposed to a water bath at 37 ° C. for a short time (for example, within several seconds to several tens of seconds), and SEM observation is performed. From the change in the particle shape before and after the exposure to water vapor, the hygroscopicity and the swelling property can be evaluated.
  • the powder can have advantageous properties in one or more indices of the properties described above.
  • Such a powder is excellent in dispersibility, pulmonary delivery and deposition, and is useful as an inhalation powder.
  • the powder is generally intended for pharmaceutical use and may contain pharmaceutically acceptable excipients.
  • excipients are not particularly limited, but may contain, for example, one or more selected from leucine, mannitol and trehalose.
  • leucine, mannitol and trehalose Preferably, three types are used. Each of these three excipients can contribute to the above-mentioned advantageous properties of the present powder.
  • Leucine, mannitol and trehalose are not particularly limited, but any of natural types, that is, L-leucine, D-(-)-mannitol and D-(+)-trehalose can be used.
  • leucine can contribute to moisture absorption resistance and high dispersibility.
  • the inventors have already reported this (Chem. ⁇ Pharm. ⁇ Bull. 64, 239-245 (2016)).
  • Mannitol can contribute to disintegration.
  • Trehalose can contribute to moisture absorption and swelling.
  • Mannitol and trehalose can contribute to moisture absorption and swelling under high humidity. Therefore, by appropriately combining these three, it is excellent in hygroscopicity during storage, good in dispersibility and disintegration during inhalation, and excellent in hygroscopic swelling under a high humidity environment corresponding to the lung.
  • a formulation can be provided.
  • the content of leucine, mannitol and trehalose in the present powder preparation is not particularly limited, but for example, the mass ratio of mannitol: trehalose: leucine is 0 or more and 10 or less: 0 or more and 5 or less: 85 or more and 100 or less. can do. Preferably, it is more than 0 and 10 or less: more than 0 and 5 or less: 85 or more and 100 or less, and more preferably 5 or more and 10 or less: 1 or more and 5 or less: 85 or more and 94 or less.
  • known excipients can be appropriately used for the present powder.
  • the powder may also have an anionic component which is an anionic polymer or a salt thereof as an excipient.
  • an anionic component which is an anionic polymer or a salt thereof as an excipient.
  • the anionic component is not always clear, it is presumed that the co-existence of the nucleic acid as an active ingredient as a solid substance can enhance the efficiency of introducing the nucleic acid into cells. Further, it is inferred that coexistence when the present powder containing nucleic acid is dried by spray freeze-drying or the like contributes to maintenance of the biological activity of the nucleic acid.
  • Such an anion component and its usefulness are disclosed in JP-A-2018-11588 by the present inventors.
  • anionic polymer examples include, but are not particularly limited to, a negatively charged, naturally occurring or synthetic polymer having a molecular weight of about 5 to 4,000,000 and containing an anionic group in the molecule.
  • the anionic group is not particularly limited, but a polymer having a plurality, preferably five or more in one molecule can be used.
  • Examples of such a functional group include a carboxyl group, a —OSO 3 H group, and a —SO Examples include a 3 H group and a phosphate group.
  • such an anionic polymer includes a zwitterionic polymer.
  • anionic polymer more specifically, a polysaccharide having an anionic group or a derivative thereof; a polypeptide containing an amino acid residue having an anionic group in a side chain; a PEG derivative having a carboxyl side chain; And the like.
  • Glycosaminoglycans are examples of polysaccharides having anionic groups or derivatives thereof.
  • the molecular weight of the glucosaminoglycan is preferably 10 to 4,000,000, more preferably 4000 to 3,000,000.
  • Specific examples of glucosaminoglycans include hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, carboxymethylcellulose, keratan sulfate, heparin, dermatan sulfate, and the like. Above all, hyaluronic acid is presumed to have an excellent contribution to nucleic acid introduction and protection.
  • Derivatives of various glucosaminoglycans such as hyaluronic acid include those obtained by introducing polyethylene glycol, peptides, sugars, proteins, iodic acid, antibodies or a part thereof, and spermine, spermidine. And zwitterionic derivatives having a positively charged portion.
  • hyaluronic acid or a salt thereof hyaluronic acid or a salt thereof having a wide range of molecular weight can be used regardless of its origin.
  • the average molecular weight (typically, weight average molecular weight) of hyaluronic acid is preferably 5,000 or less (less than), the average molecular weight may be 10,000 or more, or 20,000 or more. And may be 30,000 or more. Further, the average molecular weight may be 40,000 or more.
  • the upper limit is not particularly limited, for example, the average molecular weight may be 200,000 or less, or 150,000 or less. Further, for example, even if the average molecular weight is 50,000 or more and 110,000 or less, it can be suitably used.
  • hyaluronic acid or a salt thereof examples include, for example, FCH-SU (molecular weight of 50,000 to 110,000) and micro-hyaluronic acid FCH (molecular weight of 5,000 or less (or less)) (both from Kikkoman Biochemifa) Manufactured) can be used as appropriate.
  • FCH-SU molecular weight of 50,000 to 110,000
  • micro-hyaluronic acid FCH molecular weight of 5,000 or less (or less)
  • Kikkoman Biochemifa Kikkoman Biochemifa
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid is preferably 15,000 or more and 40,000 or less.
  • the weight average molecular weight of hyaluronic acid may be 30,000 or more and 70,000 or less, or 40,000 or more and 60,000 or less.
  • the average molecular weight of hyaluronic acid can be determined, for example, by a method using a combination of size exclusion chromatography and a multi-angle light scattering detector (SEC / MALS, for example, “Report of the National Institute of Health Sciences”, 2003, vol. 121, p. 30-). 33) or a combination of the Morgan-Elson method and the Carbazol sulfuric acid method, etc. (refer to Patent Document ⁇ JP-A-2009-155486]).
  • SEC / MALS is used.
  • polypeptide containing an amino acid residue having an anionic group in the side chain a peptide having a molecular weight of preferably 5 to 1,000,000 can be mentioned.
  • a polypeptide having a molecular weight of preferably 5 to 1,000,000 include polyglutamic acid and polyaspartic acid.
  • the PEG derivative having a carboxyl side chain has a molecular weight of 500 or more, preferably 2,000 or more, more preferably 4,000 to 40,000, having a plurality of, preferably five or more, carboxyl side chains per PEG molecule. PEG derivatives.
  • the synthetic polymer having an anionic group is a polymer or copolymer having a plurality of, preferably 5 or more anionic groups per molecule, and preferably a polymer or copolymer having a molecular weight of 5 to 4,000,000.
  • Specific examples of such a polymer or copolymer include a polymer or copolymer of acrylic acid or methacrylic acid having a molecular weight of 10 to 3,000,000, a sulfate of polyvinyl alcohol, and succinimidylated poly-L-lysine.
  • Examples of the salt of the anionic polymer include salts of alkali metals such as potassium and sodium, salts of alkaline earth metals such as calcium and magnesium, and ammonium salts.
  • the salt is appropriately selected according to the anionic polymer used.
  • anionic components of various aspects can be used alone or in appropriate combination of two or more.
  • the anionic component used in the present powdery agent can improve the stabilization of nucleic acid as a solid substance, the introduction into cells, the expression of functions specific to nucleic acids such as gene expression or suppression in cells, and the like. If so, it can be appropriately commercially obtained, or artificially synthesized as necessary, or used in combination as appropriate.
  • the mixing ratio of the nucleic acid and the anionic component is not particularly limited, and depends on the type of the anionic component and the presence or absence of an excipient that acts as a dispersion aid described below.
  • the amount can be from 5 parts by mass to 100 parts by mass with respect to 1 part by mass of the nucleic acid. More preferably, the content is 5 parts by mass or more and 50 parts by mass or less. Further, for example, it is 25 parts by mass or more and 45 parts by mass or less, for example, 30 parts by mass or more and 43 parts by mass or less, for example, 25 parts by mass or more and 40 parts by mass or less, for example, 30 parts by mass or less Or more and not more than 43 parts by mass.
  • the present powder may further contain one or more hydrophobic amino acids as an excipient. It is considered that when such an amino acid is contained, the dispersibility in supplying the present powder to cells, the inhalation characteristics in inhalation administration, and the like can be improved.
  • hydrophobic amino acids and their usefulness are disclosed in JP-A-2018-11588 by the present inventors.
  • hydrophobic amino acids examples include leucine, isoleucine, valine, glycine, proline, alanine, tryptophan, phenylalanine and methionine. Especially, it is preferable to use leucine and phenylalanine. It is considered that the dispersibility and the like of the active ingredient such as nucleic acid and the anionic ingredient which are present as a solid phase with suitable hydrophobicity can be improved. For example, phenylalanine is considered to contribute to a suitable cell introduction efficiency of an active ingredient such as a nucleic acid. Phenylalanine can be used in place of leucine.
  • the mixing ratio of the hydrophobic amino acid to the active ingredient such as nucleic acid is not particularly limited, but is appropriately set within a range where the dispersibility of the nucleic acid can be improved.
  • the amount can be 5 parts by mass or more and 100 parts by mass or less based on 1 part by mass of the nucleic acid. More preferably, the content is 5 parts by mass or more and 50 parts by mass or less. Further, for example, it is 4 to 24 parts by mass, 6 to 19 parts by mass, for example, 9 to 19 parts by mass, for example, 9 to 24 parts by mass. Not more than parts by mass.
  • hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 30,000 or more and 70,000 or less, preferably 40,000 or more and 60,000 or less, as an excipient that is a component other than the active ingredient, It can contain its salts and hydrophobic amino acids such as phenylalanine.
  • This composition is excellent in compatibility between the biological activity (such as gene expression and gene expression suppression) of the nucleic acid as an active ingredient and the inhalation characteristics of the present powder.
  • the hyaluronic acid or a salt thereof is, for example, 40% by mass or more and 90% by mass or less, for example, 50% by mass or more and 90% by mass or less, and 60% by mass based on the total mass of these two components of the excipient. 90 mass% or less and 60 mass% or more and 85 mass% or less.
  • a hydrophobic amino acid such as phenylalanine can be this residue. With such a ratio, it is possible to easily achieve both the biological activity of the nucleic acid and the inhalation characteristics.
  • a cationic carrier When the present powder contains nucleic acids, it is preferable that the powder does not contain a cationic carrier.
  • a cationic carrier is generally useful for introduction into a cell such as a nucleic acid, even if the cationic carrier is non-viral such as a cationic polymer, the cationic carrier exhibits cytotoxicity and the like. Due to the possibility, it is preferable not to contain a cationic carrier.
  • a cationic carrier is not particularly limited, and examples thereof include a cationic polymer having a cationic group and a cationic lipid. Examples of the cationic polymer include a polysaccharide having a cationic group, a polypeptide having a cationic group in a side chain, an artificial polymer having a cationic group, and a salt thereof.
  • Such cationic carriers include, for example, cationic lipids (including cationic cholesterol derivatives) such as DC-Chol (3 ⁇ - (N- (N ′, N′-dimethylaminoethane) carbamoyl) cholesterol) and DDAB ( N, N-distearyl-N, N-dimethylammonium bromide), DMRI (N- (1,2-dimyristyloxyprop-3-yl) -N, N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide), DODAC (N, N-dioleyl-N, N-dimethylammonium chloride), DOGS (diheptadecylamidoglycylspermidine), DOSPA (N- (1- (2,3-dioleyloxy) propyl) -N- (2 -(Sperminecarboxamido) ethyl) -N, N-dimethylammonium Trifluoroacetate), DOTAP (
  • the present powder preparation can contain an excipient in addition to the active ingredient.
  • an excipient in addition to at least one selected from leucine, trehalose and mannitol, an embodiment containing an anionic component and, if necessary, a hydrophobic amino acid can be adopted.
  • the present powder does not exclude inclusion of additives generally used in a composition containing DNA, RNA, or the like intended for gene expression or suppression thereof.
  • the powder can contain an active ingredient.
  • the content of the active ingredient is not particularly limited, but can be, for example, about 0.2% or more and 15% or less based on the total mass.
  • the active ingredient is not particularly limited, but may be any one that can be used in the spray freeze-drying method described below. Generally, it is an organic compound, for example, a nucleic acid is also included.
  • the nucleic acid includes a natural nucleic acid which is a polymer of naturally occurring deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides and a non-natural nucleic acid which is a polymer containing deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides having at least partly a non-natural structure.
  • Natural deoxyribonucleotides and ribonucleotides have a natural base. Natural bases are bases in natural DNA and RNA and include adenine, thymine, guanine, cytosine and uracil.
  • natural deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides have a diester phosphate bond between the 2-deoxyribose and / or ribose 5-position phosphate and the adjacent deoxyribose and / or ribose 3 ′ hydroxyl group.
  • the natural nucleic acid may be DNA, RNA, or a chimera of deoxyribonucleotide and ribonucleotide (hereinafter, also referred to as DNA / RNA chimera).
  • DNA and RNA may be single-stranded, double-stranded of the same kind, or a hybrid of DNA and RNA hybridized.
  • the DNA / RNA chimera may be DNA, RNA or a hybrid hybridized with the DNA / RNA chimera.
  • the non-natural nucleic acid refers to a nucleic acid having a non-natural structure in at least a part of any of a base and a skeleton (a sugar portion and a phosphate portion).
  • a base and a skeleton a sugar portion and a phosphate portion.
  • various unnatural bases are known.
  • Various skeletons that replace the natural ribose-phosphate skeleton are also provided.
  • glycol nucleic acids and peptide nucleic acids having about 3 carbon atoms in place of the sugar-ribose skeleton may be used.
  • the natural nucleic acid is L-DNA or L-RNA, but a nucleic acid having at least a part of the structure of D-DNA and D-RNA is included in the non-natural nucleic acid.
  • Non-natural nucleic acids also include various aspects such as single-stranded, double-stranded, hybrid and chimeric.
  • non-natural nucleic acid is generally not a protein-encoding or template strand, but, for example, interacts with another function, for example, a certain nucleic acid in a cell, to alter the function of that nucleic acid. Used for etc. Typically, it is used for functional expression such as target protein expression inhibition and function inhibition.
  • a nucleic acid that directly acts on a nucleic acid in a living body without mediating gene expression is mentioned, and specific examples include antisense nucleic acid, sense nucleic acid, shRNA, siRNA, decoy nucleic acid, aptamer, miRNA and the like.
  • Such non-natural nucleic acids are often oligonucleotides in which about ten to several tens of nucleotides are polymerized.
  • the composition is preferably in the form of naked nucleic acid as nucleic acid.
  • a naked nucleic acid is a naked nucleic acid. More specifically, for example, when gene expression is intended, a nucleic acid construct (non-viral vector) using a plasmid can be mentioned. For example, when gene expression is intended to be suppressed, in addition to non-viral vectors such as plasmid DNA, antisense nucleic acids (antisense DNA or antisense RNA), shRNA, siRNA, decoy nucleic acids, aptamers, microRNAs, etc. Is mentioned.
  • the naked nucleic acid may be a nucleic acid mainly composed of a nucleic acid element for therapeutic purposes, or a nucleic acid consisting solely of the nucleic acid and containing no nucleic acid element as a vehicle solely for introducing the nucleic acid into cells.
  • the form of the naked nucleic acid is not particularly limited, and may be linear, circular (closed or open), or supercoiled. A form according to the purpose can be appropriately provided.
  • the naked nucleic acid preferably does not have a viral carrier having a virus-derived element or a cationic non-viral carrier such as a liposome or a cationic polymer. This is because, in addition to the danger of viral carriers, such non-viral carriers are not always sufficient with respect to cell damage, target performance, and expression efficiency.
  • the present powder is a solid phase which itself exhibits the appearance of a powder when dried, and contains a nucleic acid as an active ingredient in a part of the spherical particles constituting the powder.
  • the nucleic acid may be in a crystalline or non-crystalline state and form a solid phase.
  • the present powder preparation can be preferably produced by a freeze-drying method, and more preferably produced by a spray freeze-drying method.
  • the present powder agent which is a hollow porous spherical particle can be easily obtained.
  • the present invention provides a method for producing an inhalation powder containing an active ingredient, wherein one or two or more selected from the group consisting of leucine, mannitol, and trehalose are used as excipients, Drying the liquid containing the active ingredient by a spray freeze-drying method.
  • an anionic component such as hyaluronic acid or a salt thereof and / or a hydrophobic amino acid can be used separately or in combination with the excipient.
  • the characteristics of the spherical particles of the present powder preparation described above that is, a liquid in which the active ingredient and at least one excipient are dissolved, can be dispersed and disintegrated by inhalation, and Alternatively, a drying step of spray-freeze-drying may be carried out so as to obtain porous hollow spherical particles which can swell when absorbing moisture.
  • a drying step of spray-freeze-drying may be carried out so as to obtain porous hollow spherical particles which can swell when absorbing moisture.
  • the inhalation characteristics of the spherical particles were evaluated by the Andersen Cascade Impactor (ACI).
  • OE (%) recovered amount (mg) after throat / total recovered amount (mg) ⁇
  • a step of selecting the excipient so that 100 is 80% or more and preparing the liquid may be provided.
  • the liquid may be prepared by selecting the excipient so that the inhalation characteristics evaluation of the spherical particles by ACI is FPF5 (%) of 30% or more.
  • the excipient is selected to prepare the liquid so that spherical particles having a peak of recovery rate are obtained in any one of the filter and stages 2 to 4. You can also.
  • a method for evaluating an inhalation powder is also provided. That is, in the evaluation method of the present invention, in the evaluation of inhalation characteristics by the ACI method, the first median aerodynamic diameter and the second median diameter smaller than the first median aerodynamic diameter calculated under the conditions described above are used. Of obtaining a median aerodynamic mass diameter of According to this method, it is possible to evaluate the reachability, which is the characteristic of the inhalable powder, and also to evaluate the disintegration property.
  • a method of obtaining a ratio (mass) of the powder having the second median aerodynamic mass diameter to the total powder By obtaining such a ratio (disintegration rate), the reachability and disintegration of the inhalable powder can also be evaluated.
  • the decay rate may be obtained together with the first and second median aerodynamic diameters described above.
  • the mass change rate at least at 70% RH and the mass change rate at 95% RH A method for measuring the rate is also provided. According to the present measurement method, the moisture resistance, moisture absorption and swelling of the inhalable powder can be evaluated.
  • the present powder can be used for introducing the nucleic acid into cells. Furthermore, the present powder is intended for introducing various effects of the nucleic acid by introducing the nucleic acid into cells, for example, gene expression (protein synthesis) and suppression of gene expression.
  • the nucleic acid contained in the present powder can take various forms depending on the purpose of the present powder.
  • the nucleic acid when the nucleic acid includes a coding region encoding a protein or the like, the nucleic acid can simultaneously include an expression control region such as a promoter or a terminator so that the protein can be expressed.
  • such nucleic acids include an expression cassette, or a plasmid vector or artificial chromosome containing the expression cassette.
  • Those skilled in the art can appropriately select and use the control region including the promoter and the terminator and other elements as necessary.
  • the plasmid vector and the artificial chromosome are appropriately selected in consideration of the type of the cell to be introduced, the size of the nucleic acid to be introduced, and the like.
  • examples of the nucleic acid include sense nucleic acids, antisense nucleic acids (such as DNA or RNA), shRNAs, siRNAs, miRNAs, decoy nucleic acids, and aptamers.
  • the nucleic acid may be a DNA that forms such RNA or the like by transcription.
  • Cells to which the present powder is applied are not particularly limited, but are preferably animal cells or microbial cells.
  • Animal cells include mammals, including humans, and various non-mammalian cells.
  • Examples of the microorganism include yeast, bacteria, fungi, and the like, but are not particularly limited.
  • This powder can be suitably used for gene therapy for humans and animals, nucleic acid medicine, immunotherapy, embryo preparation, and various gene-related studies. That is, it can be used for ex vivo gene therapy in addition to so-called in vivo gene therapy. In particular, it is useful as a powder for preventing or treating diseases effective in acting on genes, such as tumors in bronchi and lungs caused by inhalation through the nasal cavity and oral cavity.
  • the present powder can be a composition for supplying cells to cells substantially without using an aqueous medium.
  • substantially no aqueous medium is used means that the present powder is dissolved or dispersed in a medium mainly composed of water such as a buffer solution (hereinafter referred to as an aqueous medium) when applied to cells. Without that.
  • a buffer solution hereinafter referred to as an aqueous medium
  • the dissolution of nucleic acids and the like by the water (water) to which the present powder is applied is not contrary to "substantially no use of an aqueous medium”.
  • the powder containing the nucleic acid as a solid substance is maintained as it is, and the nucleic acid of the solid substance is maintained, and more preferably, the solid phase powder is applied to cells in vivo.
  • the present powder containing a nucleic acid as a solid substance or the solid powder of the present powder to cells, it is considered that an environment favorable for nucleic acid introduction is formed on the cell surface.
  • the present powder agent of such an aspect acts by mediating the water on the cell surface existing as a gas-liquid interface in a living body, and the nucleic acid is taken into the cell.
  • organs that can be non-invasively or approximately non-invasively accessible from outside using a catheter or the like for example, nasal cavity, eyes, oral cavity, respiratory tract, lung, stomach, duodenum, small intestine, large intestine,
  • This powder can be injected into the rectum, bladder, vagina, uterus, heart, blood vessels, and other inner surfaces (mucous membranes) by injection of an appropriate gas to allow nucleic acid as a solid substance to reach the target site. it can.
  • the supply of a powder formulation or the like to the lung mucosa or nasal mucosa is well known as an inhalation method or the like.
  • the present powder preparation may be directly supplied to the inside of an animal, for example, a lesion such as subcutaneous, muscle, abdominal cavity, or tumor by laparotomy or incision.
  • a lesion such as subcutaneous, muscle, abdominal cavity, or tumor by laparotomy or incision.
  • the present powder can be carried on a surface of a gel, a porous body such as a sponge, or a non-woven fabric, and then placed.
  • the powder By supplying the present powder to the target site or the cell in a form containing the nucleic acid as a solid substance, the powder is supplied to the target site at a high concentration without being diluted with an aqueous medium as in the past, It can remain at the site continuously. That is, the present powder can essentially reach a target cell at a high concentration. As a result, it is considered that high incorporation ability and function expression by nucleic acid are possible.
  • This powder exhibits sufficient effects even when dissolved and used at the time of use.
  • it is also possible to prepare and apply a re-dissolved product by suspending or dissolving the present powder in an aqueous medium such as water, physiological saline, a buffer solution, a glucose solution, or a culture medium.
  • an aqueous medium such as water, physiological saline, a buffer solution, a glucose solution, or a culture medium.
  • the powder is suspended or diluted, for example, using a solvent 100 to 10,000 times (by weight) the nucleic acid. Because different volumes and different types of solvents can be used before freeze-drying, relatively high-concentration suspensions and solutions (for example, 1 mg of DNA in 1 ml), which were difficult in the past, can be easily prepared. Can be.
  • the powder may be in a state where nucleic acid is contained as a solid substance in a non-aqueous medium at the time of use.
  • the powder may be suspended in a non-aqueous medium before use.
  • the nucleic acid can be applied based on a non-aqueous medium which has been difficult in the past.
  • the powdered agent dissolved or suspended in an appropriate liquid medium can use any method commonly used for introducing nucleic acids or derivatives thereof into living cells.
  • the amount of the present powder to be applied to cells varies depending on the above-described method of introduction, the type of disease, the purpose, and the like.
  • the amount of nucleic acid varies greatly depending on the administration site, but for local administration to a tumor, for example, 5 to 1000 ⁇ g. ⁇ / cm 3 tumors, can be, for example 0.1ng ⁇ 10mg / Kg ⁇ body weight, for example 0.1 [mu] g ⁇ 100 mg / organs, systemic administration by administration to organs such as the bladder.
  • Powder fine particles were prepared by SFD (spray freeze-drying method).
  • the SFD method includes two steps, a spraying step and a freeze-drying step.
  • the sample solution was sent at 5 mL / min, and spraying was continued for 1.5 min.
  • the resulting ice droplets are placed in a square dry chamber (DRC-1000 Tokyo Rikakikai Co., Ltd.) connected to a freeze dryer (FDU-210 Tokyo Rikakiki Co., Ltd.) and dried under vacuum for 24 hours to obtain the desired preparation. I got
  • hollow porous spherical particles were obtained regardless of the mixing ratio of the excipients. Note that no hollow porous particles could be observed for trehalose alone or fluorescein sodium alone.
  • the prepared powder had a single particle size distribution regardless of the mixing ratio.
  • formulations around 100 to 1000 ⁇ m were observed.
  • similar values of around 50 ⁇ m were calculated for all the formulations for D 50 .
  • the evaluation method was as follows: about 1.0 mg of a sample was filled in a No. 2 HPMC capsule (Qualicaps Co., Ltd.), and the flow rate (PFR) was 28.3 L / P with a Hitachi rotary bebicon (Becicon, 200RC-20C5, Hitachi Industrial Equipment Systems Co., Ltd.). Suction was performed in min. The suction time was 10 seconds.
  • Single, dual, and reverse jet inhalers (Jethaler (registered trademark), Hitachi Automotive Systems Measurement Co., Ltd.) having different inhalation resistances were used as inhalation devices.
  • Example 1 (Calculation of median aerodynamic mass of powder) The powder prepared in Example 1 had a tendency that the lognormal plot tended to be a curve, so that part of the powder collapsed and the powder had a large particle size (MMAD and GSD were referred to as MMAD c and GSD c ). And small powders (MMAD f and GSD f ) were considered to have occurred in the ratio (1-R): R. Then, from the eight measurement points (integrated value of the recovery rate) obtained by the ACI analysis, the following A to D values are obtained for each stage using an Excel function, and R, MMAD c , GSD c , MMAD f , and GSD f were determined by Excel's solver function. These results are shown in FIG. FIG. 6 also shows an example of an analysis result of the powder before and after the particle collapse.
  • A The integrated value (%) of the recovery rate for each stage is NORM.
  • the random variable B converted by the INV function B NORM.
  • Integrated value of the recovery rate of the powder of MMAD c and GSD c calculated by the DIST function C NORM.
  • the integrated value D B ⁇ (1 ⁇ R) + C ⁇ R of the recovery rate of the powder of MMAD f and GSD f calculated by the DIST function is set to NORM.
  • the random variable E converted by the INV function the total value of (DA) 2 obtained for each stage
  • the disintegration rate R analyzed by the solver function was about 45% when the Man content was 0%, and was about 50 to 60% when the Man content was 5 to 10%, and increased with the addition of Man.
  • MMAD c and MMAD f were reduced by the addition of Man (Man 0%: about 4.3 ⁇ m, Man 5 to 10%: 3.5 to 4.0 ⁇ m) (Man 0%: about 0.35 ⁇ m, Man 5 to 10%: 0.2 ⁇ m). From the above, it was found that mannitol greatly contributes to disintegration.
  • the DVS can fill a sample into one side of a balance-type measuring unit, and can monitor a change in mass of the sample due to adsorption and desorption of moisture in a set temperature and humidity environment on a second scale.
  • the measurement conditions for the evaluation are shown in the following table.
  • the condition setting for the evaluation of the hygroscopic growth the environment before inhalation was changed to “temperature 37 ° C., relative humidity (RH) 50% (absolute humidity: 6 .903 g / m 3 ) and the environment in the lungs after inhalation was “temperature 37 ° C., 95% RH (absolute humidity: 41.62 g / m 3 )”.
  • RH relative humidity
  • plasmid DNA encoding firefly luciferase was used as a model drug (for inhalation characteristics, fluorescein sodium (FlNa) which is a fluorescent dye was used), and L-leucine (hereinafter also referred to as Leu) as an excipient. ) And hyaluronic acid (sodium salt, weight average molecular weight: 50,000, hereinafter also referred to as LHA) to prepare a liquid for spray freeze-drying with the following composition and spray freeze-dry.
  • FlNa fluorescein sodium
  • Leu L-leucine
  • hyaluronic acid sodium salt, weight average molecular weight: 50,000, hereinafter also referred to as LHA
  • Sample 1 (FlNa / LHA / Leu) Aqueous solution containing 1 mg of FINa, 12.5 mg of LHA and 36.5 mg of Leu (50 mg in total)
  • Sample 2 (FlNa / LHA), An aqueous solution containing 1 mg of FlNa and 49 mg of LHA (50 mg in total)
  • spray freeze-drying is performed according to Example 1 at a spray air pressure of 150 kPa, a sample solution flow rate of 5 ml / min, a spray nozzle diameter of 0.4 mm, a drying time of 24 hours, a final vacuum degree of 5 Pa or less, and a final shelf temperature of 10 ° C. Was.
  • the obtained powder preparation was stored under three conditions of 5 ° C./dry (silica gel), 25 ° C./dry (silica gel) and 25 ° C./75% RH for up to 12 months, and both SEM, inhalation characteristics and gene expression Was evaluated.
  • Example 4 The inhalation characteristics were evaluated according to Example 4. For evaluation of inhalation characteristics, a powder containing FlNa was used. The results are shown in FIGS. 9A and 9B. As shown in FIG. 9A, sample 1 did not show a significant decrease in inhalation characteristics under dry conditions, but under humidified conditions, FPF3 decreased and MMAD increased after 4 months. This indicates that the initial spherical particles are aggregated due to moisture absorption. Further, as shown in FIG. 9B, in the sample 2, the inhalation characteristics did not change with the storage period under the drying condition, but the FPF3 was low and the MMAD was as large as about 5 to 8 ⁇ m. Further, under humidification conditions, measurement was impossible due to moisture absorption.
  • mice As a pretreatment, anterior teeth of female ICR mice (5 weeks old) were placed on a self-made fixed plate under pentobarbital (50 mg / kg, ip) anesthesia, and the chest was placed vertically. did. Using a light (MegaLight 100 (trademark), Shot Japan Co., Ltd.), the mouse was opened and the tongue was pulled out with tweezers while locally shining light on the chest.
  • a light MegaLight 100 (trademark), Shot Japan Co., Ltd.
  • trachea which appears as a white hole in the mouth, was confirmed, and a cannula for mouse intrapulmonary administration (total length of 4.0 cm of PE) attached to an intubation aid (using the spray tip portion of Liquid MicroSprayer (trade name, PennCentury, Inc.)) -60 polyethylene tubing) was inserted into the 3.0 cm trachea.
  • a cannula for mouse intrapulmonary administration total length of 4.0 cm of PE
  • an intubation aid using the spray tip portion of Liquid MicroSprayer (trade name, PennCentury, Inc.)) -60 polyethylene tubing
  • the tip of the device for intrapulmonary administration was inserted into the cannula, and the tip of the device was adjusted to 0.
  • 0.5 mg (10 ⁇ g as pDNA) of each powder pre-filled in the chip was administered into the lung.
  • Luminescence based on luciferase activity was evaluated by detection and analysis using IVIS (trademark).
  • the luciferin used at the time of measurement was adjusted to 30 mg / mL using PBS and used at -80 ° C.
  • the luminous substrate luciferin (30 mg / mL, 0.05 mL / mouse; 300 mg / kg) was intranasally administered 6, 12, 24, and 48 hours after intrapulmonary administration in mice. was administered.
  • a region of interest (ROI; length 1 cm, width 3 cm) corresponding to the lung was prepared, and the luminescence intensity (Total Flux (photon / sec)) was determined as the gene expression level, and the gene expression level-time pattern was analyzed. From the obtained gene expression-time pattern, the area under the gene expression-time curve (AUC) and the maximum gene expression (Luc (max)) were determined. The results are shown in FIG.
  • Sample 1 and Sample 2 generally maintained the initial gene expression after 12 months under dry conditions, but significantly decreased after 4 months under humidified conditions.
  • the expression level of Sample 2 was higher than that of Sample 1.
  • Example 1 Molecular weight and gene expression of hyaluronic acid
  • Example 1 the effect of powders using various molecular weights of hyaluronic acid (sodium salt) on gene expression was examined.
  • hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 2,000, 5,000, 50,000, 80000 and 350,000 (each referred to as HA2, etc.), 1 mg (2% by mass) of pDNA (plasmid DNA encoding firefly luciferase) and 12.5 mg of each hyaluronic acid (25% by mass) and 36.5 mg (73% by mass) of phenylalanine to prepare a spray freeze-drying liquid containing a total of 50 mg.
  • a solution adjusted to pH 7.0 ⁇ 0.5 with NaOH was used. This solution was spray-freeze-dried in the same manner as in Example 6 to produce a powder.
  • A549 cells which are human-derived alveolar carcinoma cells, at a cell seeding number of 2 ⁇ 10 2 cells / well (Transwell (registered trademark), a gas-liquid interface culture system) for each of the produced powders for 4 to 9 days
  • Transwell registered trademark
  • a gas-liquid interface culture system a constant amount was added from a powder addition device filled with 0.4-0.6 mg.
  • the cells in the wells were freeze-thawed and destroyed, and then pickagene was added, and the fluorescence was measured with a luminometer.
  • FIG. 11 HA50 having a weight average molecular weight of 50,000 showed the highest gene expression.
  • HA50 is preferable from the viewpoint of gene expression, and that it is useful to use phenylalanine in combination.
  • HA50 preferably contains 50% by mass or more, for example, 50% by mass or more, for example, 60% by mass or more, or for example, 70% by mass or more in all excipients.
  • HA50 and an excipient such as phenylalanine are, for example, 10 parts by mass or more, for example, 15 parts by mass, or, for example, a lower limit of 20 parts by mass or more, for example, 40 parts by mass, based on 100 parts by mass of HA50.
  • a lower limit of 20 parts by mass or more for example, 40 parts by mass, based on 100 parts by mass of HA50.
  • an upper limit of 35 parts by mass or less for example, 30 parts by mass or less, it was found to be useful in the range defined by the lower limit and the upper limit selected respectively.
  • Sample 1 5 ml of a solution containing 2% by weight of FlNa, 98% by weight of HA50 and 0% by weight of Phe (50 mg in total).
  • Sample 2 5 ml of a solution containing 2% by mass of FlNa, 73% by mass of HA50, and 25% by mass of Phe (50 mg in total)
  • Sample 3 5 ml of a solution containing 2% by weight of FlNa, 49% by weight of HA50 and 49% by weight of Phe (50 mg in total).
  • Sample 4 5 ml of a solution containing 2% by weight of FlNa, 25% by weight of HA50 and 73% by weight of Phe (50 mg in total)
  • FIG. 13 shows the results. As shown in FIG. 13, the lower the mass% of HA50 and the higher the mass% of Phe, the higher the lung reach. All the preparations also showed good MMAD, but the MMAD became smaller as the weight% of HA50 was lower and the weight% of Phe was higher.
  • FIG. 14 shows the effectiveness of the inhalation powder containing HA50 and phenylalanine as excipients, which can be estimated from the in vitro gene expression effect shown in FIG. 12 and the results of the inhalation characteristics shown in FIG.
  • HA50 and phenylalanine are such that HA50 is 40% by mass or more and 90% by mass or less, and for example, 50% by mass or more and 90% by mass or less, 60% by mass or more based on the total mass of these two components. It has been found that by setting the content to 90% by mass or less, 60% by mass or more and 85% by mass or less, and 60% by mass or more and 80% by mass or less, high effectiveness as an inhalable powder is expected.

Abstract

分散性、肺送達性及び沈着性に優れる吸入粉末剤として、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子の少なくとも一部に有効成分を含有する吸入粉末剤を提供する。

Description

吸入粉末剤、その評価方法及びその用途
　本明細書は、吸入粉末剤、その評価方法及びその用途に関する。
（関連出願の相互参照）
　本出願は、２０１８年１０月２日に出願された日本国特許出願である特願２０１８－１８７４９８の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この全内容が、引用により本明細書に組み込まれるものとする。また、本出願は、２０１７年５月２日に出願された日本国特許出願である特願２０１７－９１９４１の関連出願であり、この全内容は、引用により本明細書に組み込まれるものとする。
　肺は、局所作用薬のみならず消化管吸収性の低い全身作用が期待できる投与経路として注目されている。肺に直接かつ非侵襲的に薬物送達可能な吸入剤は、速やかな作用発現が期待でき、経口投与に比べて投与量も少ないため、全身性の副作用を軽減できるなどの長所を持っている（特許文献１）。そのため、今後は肺癌、肺高血圧症などの疾患への使用も期待されている。
　吸入剤は吸入エアゾール剤（Metered-Dose Inhaler；MDI）、吸入液剤（Inhalation Solution）、吸入粉末剤（Dry Powder Inhaler；DPI）の３種に分類され、それぞれの吸入器により吸入方法は異なり、良好な治療効果を達成するためには適正に使用することが重要である。ＤＰＩでは一般に薬物粉末が患者の吸入努力により気中に崩壊・分散され、呼吸器系治療域へ送達されるため、粉末噴霧と吸入との同調が容易かつ噴射剤が不要で吸入手技が簡便である点及び吸入器が比較的小さく携帯性に優れる点から、近年研究開発が盛んに行われている。
特表２００７－５２２２４６号公報
　ＤＰＩでは、粉末微粒子の分散に一定以上の吸入能力が必要となるため、使用可能な患者に制約があることが問題となる。また、強く吸引することが推奨されるために、結果として、口腔・咽頭などへの薬剤の付着が多い。肺癌、肺高血圧症などの疾患への適応を目指すならば、それらの問題を改善するための製剤設計が必要となる。
　しかしながら、高い分散性、肺送達性及び沈着性を実現する吸入粉末剤が提供されていないのが現状である。
　本明細書は、分散性、肺送達性及び沈着性に優れる吸入粉末剤、その評価方法並びにその用途を提供する。
　本発明者らは、分散性、肺送達性及び沈着性を実現する吸入粉末剤につき、種々の製剤検討及び評価を行った結果、こうした特性を充足できる吸入粉末剤を構成できることを見出した。また、こうした、製剤特性を評価する方法を見出した。本明細書によれば、こうした知見に基づき以下の手段が提供される。
［１］吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子の少なくとも一部に有効成分を含有する、吸入粉末剤。
［２］アンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）による吸入特性評価において、ＯＥ（％）＝スロート以降からの回収量（ｍｇ）／全回収量（ｍｇ）×１００が、８０％以上である、［１］に記載の吸入粉末剤。
［３］ＡＣＩによる吸入特性評価において、ＦＰＦ５（％）が３０％以上である、［１］又は［２］に記載の吸入粉末剤。
［４］ＡＣＩによる吸入特性評価において、フィルター及びステージ２～４のいずれか１つにおいて回収率のピークを有する、［１］～［３］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［５］ＡＣＩによる吸入特性評価において算出される第１の空気力学的質量中位径及び前記第１の空気力学的質量中位径よりも小さい第２の空気力学的質量中位径を有する、［１］～［４］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［６］前記第２の空気力学的質量中位径を有する粉体の全粉体に対する比率（質量）が、４０％以上である、［５］に記載の吸入粉末剤。
［７］動的水分吸着測定法において、３７℃で５０％ＲＨ～９５％ＲＨまで変化させたとき、７０％ＲＨでの質量変化率が１％以下であり、９５％ＲＨでの質量変化率５％以上である、［１］～［６］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［８］前記球状粒子は、賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースを含有する、［１］～［７］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［９］前記前記粒子の幾何学的粒子径分布のピーク粒子径は、１μｍ以上１００μｍ以下である、［１］～［８］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［１０］有効成分として核酸を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［１１］前記核酸は、ネイキッド核酸である、［１０］に記載の吸入粉末剤。
［１２］さらに、賦形剤としてアニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分、を含有する［１０］又は［１１］に記載の吸入粉末剤。
［１３］前記アニオン性成分は、ヒアルロン酸又はその塩である、［１２］に記載の吸入粉末剤。
［１４］前記ヒアルロン酸又はその塩の重量平均分子量は、３０，０００以上７０，０００以下である、［１３］に記載の粉末吸入剤、
［１５］さらに、賦形剤として、１又は２以上の疎水性アミノ酸を含有する、［１０］～［１４］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［１６］前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される１種又は２種以上である、［１５］に記載の吸入粉末剤。
［１７］前記有効成分以外の成分である賦形剤として、重量平均分子量が３０，０００以上７０，０００以下のヒアルロン酸又はその塩とフェニルアラニンを含有し、これら２成分の総質量に対して、前記ヒアルロン酸又はその塩を、４０質量％以上８５質量％以下含有する、［１０］又は［１１］に記載の吸入粉末剤。
［１８］哺乳類に対する遺伝子発現用である、［１０］～［１７］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［１９］哺乳類における遺伝子抑制用である、［１０］～［１７］のいずれかに記載の吸入粉末剤。
［２０］吸入粉末剤の製造方法であって、
　有効成分と少なくとも一種の賦形剤とを溶解した液体を、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子が得られるように噴霧凍結乾燥する乾燥工程、を備える方法。
［２１］前記球状粒子のアンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）による吸入特性評価が、ＯＥ（％）＝スロート以降からの回収量（ｍｇ）／全回収量（ｍｇ）×１００が、８０％以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する工程をさらに備える、［２０］に記載の方法。
［２２］前記球状粒子のＡＣＩによる吸入特性評価が、ＦＰＦ５（％）が３０％以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する、［２１］に記載の方法。
［２３］前記球状粒子のＡＣＩによる吸入特性評価において、フィルター及びステージ２～４のいずれか１つにおいて回収率のピークを有する球状粒子が得られるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する、［２０］～［２２］のいずれかに記載の方法。
［２４］前記乾燥工程は、前記前記賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースを用い、有効成分を含有する液体を噴霧凍結乾燥法にて乾燥する工程である、［２０］～［２３］のいずれかに記載の方法。
［２５］吸入粉末剤の評価方法であって、
　ＡＣＩによる吸入特性評価において、算出される第１の空気力学的質量中位径及び前記第１の空気力学的質量中位径よりも小さい第２の空気力学的質量中位径を取得する、方法。
［２６］前記第２の空気力学的質量中位径を有する粉体の全粉体に対する比率（質量）を取得する、［２５］に記載の方法。
［２７］吸入粉末剤の評価方法であって、
　動的水分吸着測定法において、３７℃で５０％ＲＨ～９５％ＲＨまで変化させたとき、少なくとも７０％ＲＨでの質量変化率及び９５％ＲＨでの質量変化率を測定する方法。
アンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）による吸入特性評価の概要を示す図である。 実施例１で調製した吸入粉末剤の電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察結果を示す図である。 実施例１で調製した吸入粉末剤の粒度分布とＤ５０径を示す図である。 実施例１で調製した吸入粉末剤のＡＣＩ法による各部位での回収率を示す図である。 実施例１で調製した吸入粉末剤の吸入特性の指標を示す図である。 実施例１で調製した吸入粉末剤の空気力学的質量中位径（ＭＭＡＤ）、幾何標準偏差（ＧＳＤ）、崩壊率（Ｒ）を示す図である。 動的水分吸着測定装置による耐湿性及び吸湿性の測定結果を示す図である。 吸入粉末剤の作用態様の概要を示す図である。 賦形剤としてヒアルロン酸／ロイシンを用いた吸入粉末剤の保存条件と吸入特性評価との関係を示す図である。 賦形剤としてヒアルロン酸のみを用いた吸入粉末剤の保存条件と吸入特性評価との関係を示す図である。 賦形剤としてヒアルロン酸／ロイシン及びヒアルロン酸のみを用いた吸入粉末剤の保存条件と有効性（マウスに吸引投与時の遺伝子発現）との関係を示す図である。 賦形剤としてヒアルロン酸／フェニルアラニンを用いた吸入粉末剤の遺伝子発現（インビトロ）に及ぼすヒアルロン酸の分子量の影響を示す図である。 賦形剤として重量平均分子量５００００のヒアルロン酸（ナトリウム塩）とフェニルアラニンとを各種の比率で用いた吸入粉末剤の遺伝子発現（インビトロ）の評価結果を示す図である。 賦形剤として重量平均分子量５００００のヒアルロン酸（ナトリウム塩）とフェニルアラニンを用いたときの沈着率、吸引特性及びＭＭＡＤの評価結果を示す図である。 賦形剤として重量平均分子量５００００のヒアルロン酸（ナトリウム塩）とフェニルアラニンを用いたときの有効性を推測する図である。
　本明細書の開示は、吸入粉末剤、その評価方法及びその用途に関する。本明細書に開示される吸入粉末剤によれば、吸気によって、分散し解砕するため分散性及び肺到達性に優れ、しかも、高湿度環境下で吸湿膨潤して、肺において付着凝集性を発揮できる。
　また、本明細書に開示される吸入粉末剤の評価方法によれば、分散性、肺到達性及び付着性に優れる吸入粉末剤を評価し、その特性を管理することができる。
　また、本明細書に開示される吸入粉末剤によれば、肺及びその周辺器官を標的として、肺における疾患、障害の予防及び治療に有用な医薬組成物を提供できる。
　以下、本開示の代表的かつ非限定的な具体例について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本開示の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「吸入粉末剤及びその評価方法」等を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
　また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
　本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
（吸入粉末剤）
　本明細書に開示される吸入粉末剤（以下、単に、本粉末剤ともいう。）は、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子の少なくとも一部に有効成分を含有することができる。以下、こうした本粉末剤の、各種特性及びその評価方法について説明し、次いで、本粉末剤の製造方法について説明する。
（本粉末剤の粒子径）
　本粉末剤の粒子径は、乾式レーザー回折法にて測定することができる。累積粒度分布曲線から、５０％粒子径（Ｄ50）を算出することができる。例えば、レーザーマイクロンサイザー（ＬＭＳ－２０００ｅ）又はその同等装置を用いて測定することができる。本粉末剤の５０％粒子径は、特に限定するものではないが、飛散性や分散性を考慮すると、例えば、１μｍ以上１００μｍ以下、また例えば、２μｍ以上５０μｍ以下、５μｍ以上２０μｍ以下などとすることができる。また例えば、５μｍ以上２０μｍ以下、また例えば、５μｍ以上１５μｍ以下などとすることができる。
（本粉末剤の粒子形状）
　本粉末剤の粒子形状は、走査型電子顕微鏡で観察することができる。観察にあたっては、例えば、本粉末剤の分散添加に用いられる粉末微粒子添加デバイスを用いて試料台上に噴霧後、ＳＥＭ観察に適するように、プラチナコーティングを必要に応じて行い、観察する。粉末微粒子添加デバイス及び噴霧方法としては、例えば、後述する実施例において用いるものを採用することができる。
　本粉末剤の粒子径形状は、特に限定するものではないが、飛散性や分散性等を考慮すると、球状であることが好ましい。また、飛散性や膨潤性等を考慮すると多孔質であることが好ましい。さらに、中空構造を有していることが好ましい。典型的には、本粉末剤は、本粉末剤の有効成分や賦形剤などの構成成分からなる隔壁によって水の昇華によって生じる多数の孔部（中空部）が区画される、多数の孔部（中空部）を有する多孔質球状粒子などとすることができる。
（吸入特性）
　本粉末剤は、吸気（口腔から気管支への吸引時のガス流）によって呼吸器に送達されるが、アンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）法により評価することで、その場合の特性（吸入特性）、すなわち、本粉末剤の分散性、送達性や崩壊性を評価できる。分散性、送達性及び崩壊性はそれぞれ独立の特性であるが相互に関連している。
（アンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）法による評価方法）
　本明細書において、ＡＣＩ法とは、第１７改正日本薬局方第一追補一般試験法６．１５吸入剤の空気力学的粒度測定法 ５．２ アンダーセンカスケードインパクター法（装置２）に記載の測定装置を用いる。プレセパレーターを適宜用いることができる。測定装置としては、例えば、ローボリウム・エアーサンプラー、アンダーセンタイプ、ＡＮ－２００型、柴田科学株式会社製の装置が挙げられる。
　測定装置の概要及び測定方法の一例を図１に示す。図１に示すように、測定装置、導入部分であるデバイス、スロート、ステージ０からステージ７の８段階のステージと最下段のフィルターを備えている。各ステージは、フィルター構造を有し、下方に向かってより小さい空気力学的粒子径の粒子を分級し捕捉できるように構成されている。各ステージで分級される粒子の粒子径（μｍ）は、吸引量が２８．３Ｌ／ｍｉｎのときのカットオフ径として、例えば、図１に示す径を採用することができる。図１には、各ステージに対応する呼吸器官部位も併せて記載する。
　ＡＣＩ法による本粉末剤の評価は、上記一般試験法５．２ アンダーセンカスケードインパクター法（装置２）の５．２．２吸入粉末剤の測定手順に準ずることができる。すなわち、毎分２８．３Ｌの流量で、空気量４Ｌ、として実施することができる。なお、吸入デバイスにより、吸入抵抗も適宜選択される。
　測定後に、導入に用いたカプセル、デバイス、スロート、各ステージ及びフィルター上の本粉末剤（粒子又は有効成分）の質量を測定する。本粉末剤量の測定は、有効成分を定量的に検出するほか、例えば、評価目的のために粒子に適当な標識を付与してその標識を測定することによっても実施できる。有効成分の定量は当業者であれば必要に応じて実施できるし、こうした標識の利用及び検出についても当業者において周知である。
（分散性及び送達特性）
　本粉末剤の分散性及び送達性について、以下の式を用いて得られる数値等を指標として評価することができる。なお、本明細書においては、ステージ３以降を吸入剤応用に有効な肺内送達領域とし、ステージ５以降を全身作用が期待できる肺深部送達領域とする。
　デバイスからの放出率であるＯＥ（Output Efficiency：％）を、以下の式（１）で算出する。
　また、デバイスから放出された本粉末剤のうちステージ３及びステージ５以降に到達した割合を示すＦＰＦStage3及びＦＰＦStage5（Fine Particle Fraction：％）をそれぞれ式（２）、（３）より算出できる。また、全回収量のうちステージ５以降に到達した割合を示すＯＥ×ＦＰＦStage5（％）を式（４）より算出できる。
ＯＥ（％）＝回収量Ｔ（μｇ）／全回収量（μｇ）×１００　　　（１）
（ただし、回収量Ｔは、スロート以降からの回収量である。）
ＦＰＦStage3（％）（ＦＰＦ３）
＝ステージ３以降からの回収量（μｇ）／回収量Ｔ（μｇ）×１００　　　（２）
ＦＰＦStage5（％）（ＦＰＦ５）
＝ステージ５以降からの回収量（μｇ）／回収量Ｔ（μｇ）×１００　　　（３）
ＯＥ×ＦＰＦStage5（％）
＝ステージ５以降からの回収量（μｇ）／全回収量（μｇ）×１００　　　（４）
　ＯＥは分散性の指標となり、ＦＰＦ３は、肺内送達性の指標、ＦＰＦ５は肺深部送達性の指標値となる。
　また、各ステージは、呼吸器部位に対応させることができることから、測定装置からの全回収量に対する装置における各部位や各ステージにおける本粉末剤の回収量の割合（回収率％）は、それぞれに対応する呼吸器の部位への送達率の指標として用いることができる。
　本粉末剤は、ＡＣＩ法による吸入特性評価において、例えば、ＯＥが８０％以上とすることができる。８０％以上であると、放出率が良好であるといえるからである。ＯＥは、また例えば同８５％以上であり、また例えば同９０％以上であり、また例えば同９５％以上である。
　また、本粉末剤は、ＡＣＩ法による吸入特性評価において、例えば、ＦＰＦ３が２０％以上とすることができ、また例えば、同３０％以上、また例えば、同４０％以上とすることができる。例えば、４０％以上であると肺送達率が極めて良好であるといえるからである。また例えば、同５０％以上であり、また例えば、同６０％以上であり、また例えば、同７０％以上であり、また例えば、同８０％以上であり、また例えば、同９０％以上である。なお、吸入粉末剤の有効成分や用途によっては、ＦＰＦ３が２０％以上でも十分である場合もある。
　また、本粉末剤は、ＡＣＩ法における吸入特性評価において、ＦＰＦ５が、例えば、１０％以上、また例えば、同１５％以上、また例えば、２０％以上、また例えば、同２５％以上、また例えば同３０％以上とすることができる。３０％以上であると肺深部送達率が極めて良好であるといえるからである。ＦＰＦ５は、また例えば、４０％以上であり、また例えば、５０％以上であり、また例えば、５５％以上であり、また例えば、６０％以上であり、また例えば、６５％以上である。なお、吸入粉末剤の有効成分や用途によっては、ＦＰＦ５が１０％以上でも十分である場合もある。
　本粉末剤は、ＡＣＩ法による吸入特性評価において、ステージ２～４のいずれかとフィルターとにおいて回収率のピークを備えることができる。かかる回収率特性を有することで、本粉末剤が解砕性ないし崩壊性に優れているほか、吸湿膨潤性に優れており、肺深部送達性に優れているといえるからである。典型的には、ステージ３とフィルターに回収率のピークを備えることができる。また、典型的には、フィルターにおける回収率のピークが他方のピークよりも大きく、例えば、３０％以上大きく、また例えば４０％以上大きい。
（崩壊性）
　本発明者らによれば、ＡＣＩ法によって本粉末剤の崩壊性を評価することができる。本粉末剤の崩壊性は、本粉末剤の崩壊率と空気力学的質量中位径とから求めることができる。
　こうした特性評価が本粉末剤において有用なのは、本粉末剤は、吸引によって、その一部が崩壊し、当初の大きさの粒子の一部が崩壊した粒子が生じ、当初の大きさの粒子と崩壊粒子とが混在することになるからと推論される。この推論の概要を図８に示す。図８に示すように、当初の大きさの粒子が吸入気流によって一部が崩壊し、比較的大きなままの粒子は、例えば、肺の気管支近傍に付着し、崩壊した小さい粒径の粒子はさらに肺の深部にまで流入することとなる。
　粉体の粒度分布は経験的に対数正規分布に従い、ステージごとの回収率の積算値をカットオフ径の対数値に対してプロットすると直線が得られ、５０％粒子径をＭＭＡＤ、（８４．３％粒子径）／（５０％粒子径）を幾何標準偏差（ＧＳＤ）とすることができる。本粉末剤は、対数正規プロットが直線とならず、曲線となるという特性を有しているといえる。
　本明細書においては、粒子径が大きい粉体（空気力学的質量中位径ＭＭＡＤc及びその幾何標準偏差ＧＳＤcを有する。）と小さい粉体（空気力学的質量中位径ＭＭＡＤf及び幾何標準偏差ＧＳＤfを有する。）が比率（１－Ｒ）：Ｒ（崩壊率）で存在すると考え、崩壊率Ｒ及び空気力学的質量中位径ＭＭＡＤf,c及びその幾何標準偏差ＧＳＤf,cを求める。
（崩壊率及び空気力学的質量中位径）
　ＡＣＩ法によって得られた、８つの測定点（ステージ１～フィルター）の回収率（放出量に対する％）の積算値から、各ステージつき、下記Ａ～Ｄの値を求め，Ｅが最小になるような、Ｒ、ＭＭＡＤc、ＧＳＤc、ＭＭＡＤf、ＧＳＤfを求める（表１参照）。なお、Ａ～Ｄ及びＥが最小となるような各数値の算出には、例えば表計算ソフトであるＥｘｃｅｌ（マイクロソフト株式会社）の下記関数及びソルバー機能などを用いることができる。なお、カットオフ値としては、図１に示す数値を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Ａ＝ステージごとの回収率の積算値（％）をＮＯＲＭ．Ｓ．ＩＮＶ関数により変換した確率変数
Ｂ＝ＮＯＲＭ．ＤＩＳＴ関数により算出した粒径の大きい粒子（ＭＭＡＤc及びＧＳＤc）の回収率の積算値
Ｃ＝ＮＯＲＭ．ＤＩＳＴ関数により算出した粒径の小さい粒子（ＭＭＡＤf及びＧＳＤf）の粉体の回収率の積算値
Ｄ＝Ｂ×（１－Ｒ）＋Ｃ×Ｒの値をＮＯＲＭ．Ｓ．ＩＮＶ関数により変換した確率変数
Ｅ＝ステージごとに求めた（Ｄ－Ａ）2の合計値
　以上のことから、本粉末剤は、ＡＣＩ法による吸入特性評価において、上記の条件で算出される空気力学的質量中位径ＭＭＡＤc（第１の空気力学的質量中位径）及び前記第１の空気力学的質量中位径よりも小さい第２の空気力学的質量中位径ＭＭＡＤf（第２の空気力学的質量中位径）を有することができるといえる。
　また、本粉末剤は、第２の空気力学的質量中位径を有する粉体の質量の全粉体（第１及び第２の空気力学的質量中位径を有する粉体）の総質量に対する比率（％）（崩壊率）が、例えば４０％以上とすることができる。４０％以上であると肺深部送達率が高いといえるからである。崩壊率は、また例えば、４４％以上であり、また例えば、５０％以上であり、また例えば、５５％以上であり、また例えば、６０％以上である。
（吸湿性・膨潤性）
　本粉末剤は、また、動的水分吸着測定法において、３７℃で５０％ＲＨ～９５％ＲＨまで変化させたとき、例えば、７０％ＲＨでの質量変化率が２％以下とすることができる。２％以下であると、吸入前において十分な耐湿性を備えるといえるからである。また例えば、質量変化率は１．５％以下であり、また例えば、同１％以下である。
　また例えば、９５％ＲＨでの質量変化率が８％以上とすることができる。８％以上であると吸湿しやすいからである。かかる質量変化率は、また例えば、９％以上であり、また例えば、１０％以上であり、また例えば、１１％以上である。
　動的水分吸着測定法とは、設定した温湿度環境における水分の吸脱着に伴う天秤上の試料の質量変化を秒スケールでモニタリングする動的水分吸着測定装置（ＤＶＳ：Dynamic Vapor Sorption；DVS advantage、Surface Measurement Systems）を用いる方法である。吸入から気道内、そして高湿度の肺深部での耐吸湿性及び吸湿成長の評価が可能である。本明細書においては、吸入前の環境を『温度３７℃、相対湿度（ＲＨ）５０％（絶対湿度：６．９０３ｇ／ｍ3）』、吸入後の肺内環境を『温度３７℃、９５％ＲＨ（絶対湿度：４１．６２ｇ／ｍ3）』として、評価することができる。
　なお、吸湿・膨潤性については、通常の条件（すなわち、乾燥条件、４０％ＲＨ以下程度）でＡＣＩ法で評価後、各ステージ上の粒子を乾燥時粒子として採取、その後、加湿空気（例えば９０％ＲＨ以上）を吸引し、その後、各ステージ上の粒子を加湿時粒子として採取、これらの粒子をそれぞれＳＥＭ等で粒子形状を観察することにより、吸湿性及び膨潤性を評価できる。
　あるいは、ＡＣＩ法において、デバイスとスロートとの間に、乾湿条件調節のためのボックスを配置し、かかるボックスを乾燥条件及び加湿条件に設定する以外は、同一条件でＡＣＩ法を実施する。この結果得られる各ステージの回収率を評価することで、粒子の吸湿性及び膨張性を評価できる。
　さらにまた、走査型電子顕微鏡の試料台に本粉末剤を散布後、３７℃の水浴上に短時間（例えば数秒～数十秒以内）曝露し、ＳＥＭ観察する。水蒸気曝露前後の粒子形状の変化から吸湿性及び膨張性を評価できる。
　図８に示すように、適切な吸湿・膨潤性を備えることにより、崩壊性を確保できるとともに、吸入時に崩壊後に、気道等において吸湿・膨潤することで肺深部に沈着することができる。
　本粉末剤は、以上説明した特性の１又は２以上の指標において、有利な特性を備えることができる。こうした本粉末剤は分散性、肺送達性及び沈着性に優れ、吸入粉末剤として有用である。
（本粉末剤の組成及びその製造方法）
　本粉末剤は、概して、医薬用を意図しており、薬学上許容される賦形剤を含有することができる。かかる賦形剤として特に限定するものではないが、例えば、ロイシン、マンニトール及びトレハロースから選択される１種又は２種以上を含有することができる。好ましくは、３種類を用いる。これら３種の賦形剤は、それぞれ、本粉末剤の、上記した有利な特性に貢献することができる。ロイシン、マンニトール及びトレハロースは、特に限定するものではないが、いずれも天然型、すなわち、Ｌ－ロイシン、Ｄ－（－）－マンニトール、Ｄ－（＋）－トレハロースを用いることができる。
　例えば、ロイシンは、耐吸湿性及び高分散性に貢献することができる。これについては、本発明者らは、既に報告している（Chem. Pharm. Bull. 64, 239-245 (2016)）。マンニトールは、崩壊性に貢献することができる。トレハロースは、吸湿・膨潤性に貢献することができる。マンニトールとトレハロースは、高湿度下での吸湿・膨潤性に貢献することができる。したがって、これらの３者を適宜組み合わせることにより、保存時においては耐吸湿性に優れ、吸引時の分散性及び崩壊性が良好で、肺内に相当する高湿度環境下では、吸湿膨潤性に優れる製剤を提供することができる。
　ロイシン、マンニトール及びトレハロースの本粉末剤における含有量は、特に限定するものではないが、例えば、マンニトール：トレハロース：ロイシンの質量比が、０以上１０以下：０以上５以下：８５以上１００以下などとすることができる。好ましくは、０超１０以下：０超５以下：８５以上１００以下であり、また好ましくは、５以上１０以下：１以上５以下：８５以上９４以下などとすることができる。なお、本粉末剤は、上記した賦形剤のほか、公知の賦形剤を適宜用いることができる。
（アニオン性成分）
　本粉末剤は、また、賦形剤として、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分を有していてもよい。ア二オン性成分は、必ずしも明らかではないが、固体物質である有効成分として核酸と併存させることで、核酸の細胞への導入効率を高めることができると推論される。また、核酸を含む本粉末剤を噴霧凍結乾燥などで乾燥するときにおいて併存させることで、核酸の生物活性の維持に寄与することが推論される。こうしたアニオン成分及びその有用性については、本発明者らによる特開２０１８－１１５８８号公報に開示されている。
　アニオン性ポリマーとしては、特に限定するものではないが、分子中にアニオン性基を含む、負に荷電された、分子量が５００～４００万程度の天然由来又は合成ポリマーが挙げられる。アニオン性基は、特に限定しないが、１分子中に複数、好ましくは５個以上有するポリマーを使用することができ、このような官能基としては、例えばカルボキシル基、－ＯＳＯ3Ｈ基、－ＳＯ3Ｈ基、リン酸基が挙げられる。なお、このようなアニオン性ポリマーとしては、両イオン性ポリマーも含まれる。
　アニオン性ポリマーとしては、より具体的には、アニオン性基を有する多糖類又はその誘導体；アニオン性基を側鎖に有するアミノ酸残基を含むポリペプチド；カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体；アニオン性基を有する合成ポリマー等が挙げられる。
　アニオン性基を有する多糖類又はその誘導体としては、グルコサミノグリカンが挙げられる。かかるグルコサミノグリカンの分子量は、好ましくは１０００～４００万、より好ましくは４０００～３００万である。グルコサミノグリカンは、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸、カルボキシメチルセルロース、ケラタン硫酸、ヘパリン、デルマタン硫酸等が挙げられる。なかでも、ヒアルロン酸は、核酸導入や保護に優れた寄与が推測される。ヒアルロン酸を始めとする各種グルコサミノグリカンの誘導体としては、ポリエチレングリコール、ペプチド、糖、蛋白質、ヨウ酸、抗体又はその一部などを導入することによって得られるものが挙げられるほか、スペルミン、スペルミジン等を導入し、プラスに荷電した部分を持つ両イオン性の誘導体等が挙げられる。
　ヒアルロン酸又はその塩は、特にその由来を問わないで、広い範囲の分子量のヒアルロン酸又はその塩を用いることができる。例えば、ヒアルロン酸の平均分子量（典型的には、重量平均分子量）が５，０００以下（未満）であっても好適であり、平均分子量が１０，０００以上であってもよく、２０，０００以上であってもよく、さらには、３０，０００以上であってもよい。また、平均分子量は、４０，０００以上であってもよい。また、上限も特に限定するものではないが、例えば、平均分子量は、２００，０００以下であってもよく、１５０，０００以下であってもよい。また、例えば、平均分子量が５０，０００以上１１０，０００以下であっても好適に用いることができる。こうしたヒアルロン酸又はその塩（例えば、ナトリウム塩）としては、例えば、ＦＣＨ－ＳＵ（分子量５万から１１万）やマイクロヒアルロン酸ＦＣＨ（分子量５０００以下（又は未満））（いずれも、キッコーマンバイオケミファ社製）等を適宜用いることができる。
　ヒアルロン酸の重量平均分子量が、１５，０００以上４０，０００以下であることが好適である。こうしたヒアルロン酸又はその塩を用いることで、ｓｉＲＮＡなどのネイキッド核酸の導入効率を高めることができる場合がある。
　ヒアルロン酸の重量平均分子量は、３０，０００以上７０，０００以下であってもよく、また、４０，０００以上６０，０００以下であってもよい。かかるヒアルロン酸又はその塩を用いることで、有効成分としての核酸の生物活性（例えば、核酸が発現カセットの場合にはその発現量等）を十分に高く発揮できるとともに、適切な吸入特性を発揮することができる。
　ヒアルロン酸の平均分子量は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーと多角度光散乱検出器を組み合わせる方法（ＳＥＣ／ＭＡＬＳ、例えば、「国立医薬品食品衛生研究所報告」，２００３年，１２１巻，ｐ．３０－３３）やＭｏｒｇａｎ－Ｅｌｓｏｎ法とＣａｒｂａｚｏｌ硫酸法の組み合わせ等により求めることができる（特許文献　特開２００９－１５５４８６号公報参照）。好ましくは、ＳＥＣ／ＭＡＬＳを用いる。
　アニオン性基を側鎖に有するアミノ酸残基を含むポリペプチドとしては、好ましくは５００～１００万の分子量を有するペプチドが挙げられる。このようなポリペプチドとしては、具体的にはポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などを例示することができる。
　カルボキシル側鎖を持つＰＥＧ誘導体としては、ＰＥＧ１分子当たりカルボキシル側鎖を複数、好ましくは５個以上有する、５００以上、好ましくは２，０００以上、より好ましくは４，０００～４０，０００の分子量を有するＰＥＧ誘導体が挙げられる。
　アニオン性基を有する合成ポリマーとしては、１分子当たり複数、好ましくは５個以上のアニオン性基を有するポリマー又はコポリマーであって、好ましくは５００～４００万の分子量を有するポリマー又はコポリマーである。このようなポリマー又はコポリマーとしては、具体的には分子量１０００～３００万のアクリル酸又はメタクリル酸のポリマー又はコポリマー、あるいはポリビニルアルコールの硫酸エステル体、サクシニミジル化ポリ－Ｌ－リジン等が挙げられる。
　アニオン性ポリマーの塩としては、例えば、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属の塩のほか、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属の塩、アンモニウム塩等が挙げられる。用いるアニオン性ポリマーに応じて適宜その塩が選択される。
　本粉末剤においては、賦形剤として、各種態様（すなわち、ポリマーの種類、分子量、塩の種類等）のアニオン性成分を１種又は２種以上を適宜組み合わせて使用することができる。本粉末剤に用いるアニオン性成分は、後述するように、固体物質としての核酸の安定化、細胞への導入、細胞における遺伝子発現又は抑制などの核酸固有の機能発現等を向上させることができるものであれば適宜商業的に入手し、あるいは必要に応じて人工的に合成し、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
　本粉末剤における、核酸とアニオン性成分との配合比率は、特に限定するものではなく、アニオン性成分の種類や後述する分散補助剤的に作用する賦形剤の存否等にもよるが、例えば、核酸１質量部に対して、５質量部以上１００質量部以下とすることができる。より好ましくは同５質量部以上５０質量部以下である。また例えば、同２５質量部以上４５質量部以下であり、また例えば、同３０質量部以上４３質量部以下であり、また例えば、２５質量部以上４０質量部以下であり、また例えば、同３０質量部以上４３質量部以下である。
（疎水性アミノ酸）
　本粉末剤は、さらに、賦形剤として、１又は２以上の疎水性アミノ酸を含有していてもよい。かかるアミノ酸を含有していると、本粉末剤を細胞に供給する際の、分散性、吸入投与に際しての吸入特性などを向上させることができると考えられる。かかる疎水性アミノ酸及びその有用性については、本発明者らによる特開２０１８－１１５８８に開示されている。
　疎水性アミノ酸としては、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、アラニン、トリプトファン、フェニルアラニン及びメチオニン等が挙げられる。なかでも、ロイシン及びフェニルアラニンを用いることが好ましい。好適な疎水性で固相として存在する核酸などの有効成分及びアニオン性成分の分散性等を向上させることができると考えられる。例えば、フェニルアラニンは、核酸などの有効成分の好適な細胞導入効率に寄与しているものと考えられる。フェニルアラニンは、ロイシンに替えて用いることもできる。
　疎水性アミノ酸の、核酸などの有効成分に対する配合比率は特に限定するものではないが、核酸の分散性等を向上させることができる範囲で適宜設定される。例えば、核酸１質量部に対して、５質量部以上１００質量部以下とすることができる。より好ましくは同５質量部以上５０質量部以下である。また例えば、同４質量部以上２４質量部以下であり、同６質量部以上１９質量部以下であり、また例えば、同９質量部以上１９質量部以下であり、また例えば、９質量部以上２４質量部以下である。
　本粉末剤の組成の一例として、有効成分以外の成分である賦形剤として、重量平均分子量が３０，０００以上７０，０００以下、好ましくは、同４０，０００以上６０，０００以下のヒアルロン酸又はその塩とフェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸とを含有することができる。この組成であると、有効成分としての核酸の生物活性（遺伝子発現や遺伝子発現抑制など）と本粉末剤の吸入特性の両立性に優れている。さらに、これら２成分の賦形剤の総質量に対して、前記ヒアルロン酸又はその塩を、例えば、４０質量％以上９０質量％以下、また例えば、５０質量％以上９０質量％以下、６０質量％以上９０質量％以下、６０質量％以上８５質量％以下含有することができる。フェニルアラニンなどの疎水性アミノ酸は、この残分とすることができる。こうした比率とすることで、核酸の生物活性と吸入特性との両立を図りやすくすることができる。
（カチオン性キャリア）
　本粉末剤が核酸を含むとき、カチオン性キャリアを含有していないことが好適である。カチオン性キャリアは、一般に、核酸などの細胞への導入に有用であるが、カチオン性キャリアは、カチオン性ポリマーなどの非ウイルス性であっても、カチオン性キャリアは、細胞障害性等を発現する可能性があるため、カチオン性キャリアを含有しないことが好ましい。かかるカチオン性キャリアとしては、特に限定するものではないが、カチオン性基を有するカチオン性ポリマーやカチオン性脂質が挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、カチオン性基を有する多糖類、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチド、カチオン性基を有する人工ポリマー若しくはこれらの塩等が挙げられる。
　こうしたカチオン性キャリアとしては、例えば、カチオン性脂質（カチオン性コレステロール誘導体を含む）としては、ＤＣ－Ｃｈｏｌ（３β－（Ｎ－（Ｎ′，Ｎ′－ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール）、ＤＤＡＢ（Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド）、ＤＭＲＩ（Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド）、ＤＯＤＡＣ（Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド）、ＤＯＧＳ（ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン）、ＤＯＳＰＡ（Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ－（２－（スペルミンカルボキサミド）エチル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムトリフルオロアセタート）、ＤＯＴＡＰ（Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、又はＤＯＴＭＡ（Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
　以上説明したように、本粉末剤は、有効成分の他、賦形剤を含むことができる。賦形剤としては、ロイシン、トレハロース及びマンニトールから選択される少なくとも１種のほか、アニオン性成分、さらには、必要に応じて、疎水性アミノ酸を含む態様を採ることができる。さらに、本粉末剤は、遺伝子発現やその抑制を意図したＤＮＡやＲＮＡ等を含む組成物に一般的に使用される添加剤を含むことを排除するものではない。
　本粉末剤には、有効成分を含有することができる。有効成分の含有量は特に限定するものではないが、例えば、全質量に対して０．２％以上１５％以下程度とすることができる。
　有効成分として、特に限定するものではないが、後述する噴霧凍結乾燥法に用いられうるものであればよい。一般的には、有機化合物であり、例えば、核酸も含まれる。
　核酸は、天然に存在するデオキシリボクレオチド及び／又はリボヌクレオチドの重合体である天然核酸及び少なくとも一部に非天然構造を有するデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを含む重合体である非天然核酸を含むことができる。天然のデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドは天然塩基を備えている。天然塩基は、天然のＤＮＡ及びＲＮＡにおける塩基であって、アデ二ン、チミン、グアニン、シトシン及びウラシルが挙げられる。また、天然のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドは、その２－デオキシリボース及び／又はリボースの５位のリン酸と隣接するデオキシリボース及び／又はリボースの３’の水酸基とがリン酸ジ工ステル結合で連結した骨格を有している。本明細書において、天然核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとのキメラ（以下、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラともいう。）であってもよい。また、ＤＮＡ、ＲＮＡはそれぞれ一本鎖であってもよいし、同種の二本鎖であってもよいし、ＤＮＡとＲＮＡとがハイブリダイズしたハイブリッドであってもよい。さらには、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラが、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡキメラとハイブリダイズしたハイブリッドであってもよい。
　非天然の核酸は、塩基、骨格（糖部分及びリン酸部分）のいずれかにおいて、少なくとも一部に非天然構造を有する核酸をいう。非天然塩基としては、種々の非天然塩基が知られている。また、天然のリボースーリン酸骨格を代替する各種の骨格も提供されている。例えば、糖－リボース骨格に替えて炭素数が３個程度の炭素を有するグリコール核酸、ペプチド核酸等が挙げられる。また、天然の核酸はＬ－ＤＮＡ又はＬ－ＲＮＡであるが、Ｄ－ＤＮＡ及びＤ－ＲＮＡの構造を少なくとも一部に備える核酸は非天然核酸に含まれる。非天然の核酸においても、一本鎖、二本鎖、ハイブリッド及びキメラ等の各種態様が含まれる。
　この種の非天然核酸は、概して、タンパク質をコードするコード鎖や鋳型鎖でなく、例えば、他の機能、例えば、細胞内である種の核酸と相互作用させて、その核酸の機能を変化させるなどに用いられる。典型的には、標的タンパク質の発現阻害や機能阻害という機能発現のために用いられる。例えば、遺伝子発現を介することなく、生体内核酸に直接作用する核酸が挙げられ、具体的には、アンチセンス核酸、センス核酸、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー、ｍｉＲＮＡ等が挙げられる。この種の非天然核酸は、ヌクレオチドが十数個から数十個程度が重合したオリゴヌクレオチドである場合が多い。
　本組成物は、核酸として、ネイキッド核酸の状態であることが好ましい。ネイキッド核酸（naked核酸）とは、すなわち、裸の核酸である。より具体的には、例えば、遺伝子発現を意図する場合には、プラスミドを用いた核酸コンストラクト（非ウイルス性ベクター）が挙げられる。また、例えば、遺伝子発現の抑制を意図する場合には、プラスミドＤＮＡなどの非ウイルス性ベクターほか、アンチセンス核酸（アンチセンスＤＮＡ又はアンチセンスＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー、マイクロＲＮＡ等が挙げられる。ネイキッド核酸としては、治療目的のための核酸要素を主体とし、あるいは当該核酸のみからなり、細胞への核酸の導入のためだけのビヒクルとしての核酸要素を含まない核酸であってもよい。
　ネイキッド核酸の形態は、特に限定するものではなく、リニアであってもよいし、サーキュラー（閉環又は開環）であってもよい、また、スーパーコイル状であってもよい。目的に応じた形態を適宜備えることができる。ネイキッド核酸としては、ウイルス由来の要素を有するウイルス性キャリア、リポソームやカチオン性ポリマーなどのカチオン性の非ウイルス性キャリアを有していないことが好ましい。ウイルス性キャリアの危険性のほか、かかる非ウイルス性キャリアについても細胞障害、標的性能、発現効率に関して必ずしも十分でないからである。
　本粉末剤は、乾燥によりそれ自体粉末の外観を呈した固相であるとともに、粉末を構成する球状粒子の一部に有効成分としての核酸を含有している。本粉末剤において、核酸は、結晶又は非結晶の状態であって固相を形成している状態を有することができる。
　本粉末剤は、好ましくは、凍結乾燥法によって製造することができ、より好ましくは、噴霧凍結乾燥法によって製造することができる。かかる製造法を採用することで、中空多孔質の球状粒子である本粉末剤を容易に取得できる。
　以上のことから、本明細書によれば、有効成分を含む吸入粉末剤の製造方法であって、賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースからなる群から選択される１種又は２種以上と、有効成分を含有する液体を、噴霧凍結乾燥法にて乾燥する工程、を備える、方法が提供される。また、賦形剤としては、上記の賦形剤とは別個に又は上記賦形剤と組み合わせて、ヒアルロン酸又はその塩などのアニオン性成分及び／又は疎水性アミノ酸を用いることができる。
　また、本明細書によれば、上記した本粉末剤の球状粒子の特性、すなわち、有効成分と少なくとも一種の賦形剤とを溶解した液体を、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子が得られるように噴霧凍結乾燥する乾燥工程を実施してもよい。こうした球状粒子が得られる賦形剤その他の条件は本明細書に開示されている。
　また、かかる乾燥工程のために、さらに、前記球状粒子のアンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）による吸入特性評価が、ＯＥ（％）＝スロート以降からの回収量（ｍｇ）／全回収量（ｍｇ）×１００が、８０％以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する工程を備えることもできる。さらにまた、前記球状粒子のＡＣＩによる吸入特性評価が、ＦＰＦ５（％）が３０％以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製するにすることもできる。また、前記球状粒子のＡＣＩによる吸入特性評価において、フィルター及びステージ２～４のいずれか１つにおいて回収率のピークを有する球状粒子が得られるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製することもできる。
（吸入粉末剤の評価方法）
　本明細書によれば、吸入粉末剤の評価方法も提供される。すなわち、本評価方法は、ＡＣＩ法による吸入特性評価において、既に説明した条件で算出される第１の空気力学的質量中位径及び前記第１の空気力学的質量中位径よりも小さい第２の空気力学的質量中位径を取得する、方法が提供される。かかる方法によれば、吸入粉末剤の特性である到達性が評価できるほか、併せて崩壊性も評価することができる。
　また、本明細書によれば、第２の空気力学的質量中位径を有する粉体の全粉体に対する比率（質量）を取得する方法も提供される。かかる比率（崩壊率）を取得することで、吸入粉末剤の到達性及び崩壊性も評価することができる。崩壊率は、上記した第１及び第２の空気力学的質量中位径とともに取得してもよい。
　また、本明細書によれば、動的水分吸着測定法において、３７℃で５０％ＲＨ～９５％ＲＨまで変化させたとき、少なくとも７０％ＲＨでの質量変化率及び９５％ＲＨでの質量変化率を測定する方法も提供される。本測定法によれば、吸入粉末剤の耐湿性並びに吸湿性及び膨潤性を評価することができる。
（本粉末剤の用途）
　本粉末剤は、有効成分が核酸であるとき、核酸の細胞への導入用として用いることができる。さらには、本粉末剤は、核酸を細胞に導入して当該核酸による種々の効果、例えば、遺伝子の発現（タンパク質の合成）や遺伝子の発現の抑制を意図するものである。
　本粉末剤に含まれる核酸は、本粉末剤の目的に応じて種々の態様を採ることができる。例えば、核酸が、タンパク質などをコードするコード領域を含む場合には、核酸には、当該タンパク質を発現可能に、プロモーター、ターミネーター等の発現制御領域を同時に含むことができる。例えば、こうした核酸としては、発現カセット、あるいは発現カセットを含むプラスミドベクターや人工染色体が挙げられる。プロモーターやターミネーターを始めとする制御領域やその他の要素は、当業者であれば適宜必要に応じて選択して用いることができる。また、プラスミドベクターや人工染色体は、導入する細胞の種類や導入しようとする核酸のサイズ等を考慮して適宜選択される。
　また、例えば、遺伝子の発現を抑制する場合には、既述のように、核酸として、センス核酸、アンチセンス核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ等）、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー等の態様が挙げられる。また、核酸は、こうしたＲＮＡ等を転写によって形成するＤＮＡであってもよい。
　本粉末剤を適用する細胞は、特に限定するものではないが、動物細胞や微生物細胞であることが好ましい。動物細胞としては、ヒトを含む哺乳類のほか、各種非哺乳類細胞が挙げられる。微生物としては、酵母、細菌、真菌等が挙げられるが、特に限定するものではない。
　本粉末剤は、ヒトや動物に対する遺伝子治療、核酸医薬、免疫治療、胚作製等及び各種の遺伝子関連研究に好適に用いることができる。すなわち、いわゆるin vivo遺伝子治療のほか、ex vivo遺伝子治療に用いることができる。特に、鼻腔や口腔からの吸入による気管支及び肺における腫瘍など、遺伝子に対する作用が効果的な疾患を予防又は治療するための粉末剤として有用である。
　本粉末剤は、実質的に水系媒体を利用しないで細胞に供給するための組成物とすることができる。「実質的に水系媒体を利用しない」とは、細胞への適用に際して、本粉末剤を緩衝液などの水を主体とする媒体（本明細書において、水系媒体という。）で溶解又は分散等することなく、という意味である。本粉末剤を適用した先の水（水分）によって、核酸等が溶解することは、「実質的に水系媒体を利用しない」に反しない。
　固体物質としての核酸を含む本粉末剤は、そのままの状態で、固体物質の核酸を維持して、より好ましくは固相の粉末剤を、インビボの細胞に適用することが好適である。固体物質としての核酸を含む本粉末剤又は固相の本粉末剤を細胞に適用することにより、細胞表面において、核酸の導入に有利な環境が形成されるものと考えられる。例えば、こうした態様の本粉末剤は、生体内における気液界面として存在する細胞表面の水分を媒介して作用し、核酸が細胞内に取り込まれるものと考えられる。
　また、ヒトを含む動物等において、外部から非侵襲的又はおおよそ非侵襲的にカテーテル等を用いて到達可能な臓器、例えば、鼻腔、眼、口腔、気道、肺、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、膀胱、膣、子宮、心臓、血管等の内表面（粘膜）に対しては、本粉末剤を、適当なガスを介したインジェクションにより、固体物質としての核酸を標的箇所に到達させることができる。例えば、肺粘膜や鼻腔粘膜に対する粉末製剤等の供給は、吸入法等として周知である。また、開腹や切開等によって動物の内部、例えば、皮下、筋肉、腹腔、腫瘍等の病変部に、直接本粉末剤を供給してもよい。なお、本粉末剤の適用にあたっては、標的組織内部、その表面又はその近傍に移殖するなどの手段を採ることもできる。また、ゲル状物、スポンジなどの多孔体、不織布などの表面に本粉末剤を担持させて留置することもできる。
　本粉末剤が、このように固体物質としての核酸を含む形態で標的箇所又は細胞に供給されることにより、従来のように水系媒体で希釈されることもなく高濃度に標的部位に供給され、当該部位に継続して留まることができる。すなわち、本粉末剤は、本質的に、高濃度に標的細胞に到達させることが可能となっている。その結果、高い取り込み能と核酸による機能発現が可能となっていると考えられる。
　本粉末剤は、用時に溶解して用いても十分な効果を発揮する。例えば、用時に、本粉末剤を、水、生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液、培地液などの水系媒体に懸濁又は溶解することにより再溶解物を調製して適用することも可能である。再溶解については、本粉末剤を、例えば、例えば、核酸の１００～１００００倍（重量比）の溶媒を用いて懸濁又は稀釈する。凍結乾燥前と異なる量、異なる種類の溶媒を用いることができるため、従来困難であった比較的高濃度の懸濁液や溶液（たとえば１ｍｌ中にＤＮＡを１ｍｇ含む液）も容易に調製することができる。
　本粉末剤は、用時に非水系媒体に核酸を固体物質として含有させた状態であってもよい。例えば、用時に、本粉末剤を、非水系媒体に懸濁してもよい。例えば、凍結乾燥前と異なる量、異なる種類の溶媒を用いることができるため、従来困難であった非水系媒体をベースとして核酸を適用することができるようになる。
　このように、適当な液性媒体で溶解又は懸濁した本粉末剤は、生体細胞への核酸、又はその誘導体の導入に通常用いられる任意の方法を用いることができる。
　本粉末剤の細胞への適用量は、上述した導入方法、疾患の種類、目的などによって異なるが、例えば核酸の量にして、投与部位によって大きく異なるが、腫瘍への局所投与では例えば５～１０００μｇ／ｃｍ3・腫瘍、膀胱などの臓器への投与では例えば０．１μｇ～１００ｍｇ／臓器、全身投与では例えば０．１ｎｇ～１０ｍｇ／Ｋｇ・体重とすることができる。
　以下、本明細書の開示をより具体的に説明するために具体例としての実施例を記載する。以下の実施例は、本明細書の開示を説明するためのものであって、その範囲を限定するものではない。
（吸入粉末剤の調製）
　本実施例では、モデル薬物として蛍光色素であるフルオレセインナトリウム（ＦｌＮａ）、賦形剤として以下に示すロイシン、マンニトール及びトレハロースを、以下の表に示す組みあわせで用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　粉末微粒子はＳＦＤ（噴霧凍結乾燥法）により調製した。ＳＦＤ法は、噴霧工程と凍結乾燥工程の２工程からなる。まず、噴霧乾燥機（ＳＤ－１０００、東京理化器械株式会社）に付属する２流体噴霧ノズルを用いて、試料溶液をノズル先端から１５ｃｍ下の液体窒素（５００ｍＬ）中に１５０ｋＰａで噴霧することにより急速凍結した。試料溶液は５ｍＬ／ｍｉｎで送液し、１．５ｍｉｎ噴霧を続けた。得られた氷滴を凍結乾燥機（ＦＤＵ－２１０東京理化器械株式会社）を接続した角形ドライチャンバー（ＤＲＣ－１０００東京理化器械株式会社）に入れ、真空条件下で２４ｈｒ乾燥することにより目的の製剤を得た。
　ＳＦＤ法操作条件
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（粉末剤の走査型電子顕微鏡による粒子形状の評価）
調製した粉末微粒子の粒子形状を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ：JSM-IT100LA、日本電子株式会社）で観察した。図２に示す分散添加のための粉末微粒子添加デバイスを用いて、噴霧した。噴霧方法としては、調製した粉末製剤を少量充填した１００μＬチップに三方活性を介して接続した１ｍＬシリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）内で０．２５ｍＬの空気を圧縮し、三方活栓を開放した。黒色両面テープを貼付した試料台上に粉末微粒子を分散添加後、３０ｍＶ、９０ｓｅｃの条件でプラチナコーティング（JFC-1600、日本電子データム株式会社）し、ＳＥＭ観察した。結果を図２に示す。
　図２に示すように、賦形剤の混合比にかかわらず、中空多孔な球状粒子が得られた。なお、トレハロース単体及びフルオレセインナトリウム単体については、中空多孔粒子を観察できなかった。
（粉末剤のレーザー回折・散乱式粒度分布測定装置（ＬＭＳ）ニよる粒度分布評価）
　実施例１で調製した製剤の幾何学的粒子径・粒度分布は、レーザー回折・散乱式粒度分布測定器（ＬＭＳ：LMS-2000e、SEISHIN ENTERPRISE Co.,Ltd.）を使用した。乾式ワンショット測定法で行い、０．４ＭＰａにエアー供給圧を設定して測定を行った。得られた累積粒度分布から５０％粒子径（Ｄ50）を算出し、粒度分布評価を行った。結果を図３に示す。算出したD50を併せて図３に示す。
　図３に示すように、調製した粉末剤は混合比にかかわらず単一な粒度分布が観測された。一部の製剤（Ｍ０Ｔ０、Ｍ５Ｔ０、Ｍ０Ｔ１、Ｍ５Ｔ１、Ｍ１０Ｔ３、Ｍ５Ｔ３、Ｍ０Ｔ５）に関しては、１００～１０００μｍ付近の製剤が観測された。また、Ｄ５０は全ての製剤で１０μｍ前後の類似した値が算出された。
（粉末剤のＡＣＩによる吸入特性の評価）
　吸入特性の詳細なデータを得るため、ＡＣＩ（ローボリウム・エアーサンプラー、アンダーセンタイプ、AN-200型、柴田科学株式会社）を用いて吸入特性評価を行った。
　評価方法は、試料約１．０ｍｇを２号ＨＰＭＣカプセル（クオリカプス株式会社）に充填し、日立ロータリーベビコン（ベビコン、200RC-20C5、日立産機システム株式会社）によって、流量（ＰＦＲ）２８．３Ｌ／ｍｉｎにて吸引を行った。吸引時間は１０ｓｅｃとした。吸入デバイスにはジェットヘラー（Jethaler（登録商標）、日立オートモティブシステムズメジャメント株式会社）の吸入抵抗の異なるシングル、デュアル、リバースを用いた。
（粉末剤の回収率の算出）
　デバイス、カプセル、スロート、フィルター、各ステージに沈着した試料をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）５０ｍｌ又は１０ｍｌに溶解した後、ＦｌＮａの濃度をマルチプレートリーダー（Enspire、株式会社パーキンエルマージャパン）にて定量（励起波長：４９０ｎｍ、蛍光波長：５１５ｎｍ）し、各パーツにおける回収量及び回収率を算出した。必要に応じて希釈定量を行った。各ステージでの回収率を図４に示す。
（粉末剤の各指標の算出）
　本実験結果から、ＯＥ、ＦＰＦStage3、ＦＰＦStage5及びＯＥ×ＦＰＦStage5を既述の式（１）～（４）から算出した。種々の製剤についてのこれらの指標を図５に示す。
（粉末剤の空気力学的質量中位径の算出）
　実施例１で調製した粉末剤は、対数正規プロットが曲線となる傾向があったため、粉体の一部が崩壊し，粒子径が大きい粉体（ＭＭＡＤ及びＧＳＤをＭＭＡＤc及びＧＳＤcとする）と小さい粉体（ＭＭＡＤf及びＧＳＤf）が比率（１－Ｒ）：Ｒで生じたと考えた。そこでＡＣＩ解析で得られた８つの測定点（回収率の積算値）から、Ｅｘｃｅｌの関数を用いて各ステージに下記Ａ～Ｄの値を求め，Ｅが最小になるようなＲ、ＭＭＡＤc、ＧＳＤc、ＭＭＡＤf、ＧＳＤfをＥｘｃｅｌのソルバー機能により求めた。これらの結果を図６に示す。なお、図６には、あわせて、粒子崩壊前後の粉体の解析結果の一例を示す。
Ａ＝ステージごとの回収率の積算値（％）をＮＯＲＭ．Ｓ．ＩＮＶ関数により変換した確率変数
Ｂ＝ＮＯＲＭ．ＤＩＳＴ関数により算出したＭＭＡＤc及びＧＳＤcの粉体の回収率の積算値
Ｃ＝ＮＯＲＭ．ＤＩＳＴ関数により算出したＭＭＡＤf及びＧＳＤfの粉体の回収率の積算値
Ｄ＝Ｂ×（１－Ｒ）＋Ｃ×Ｒの値をＮＯＲＭ．Ｓ．ＩＮＶ関数により変換した確率変数
Ｅ＝ステージごとに求めた（Ｄ－Ａ）2の合計値
　図４及び図５に示すように、フィルターへの製剤沈着が一番多く２０％以上という結果となった。各ステージの回収率で一番高くなったものは、どの製剤でもステージ３であった。また、図５に示すように、特に、マンニトールを含む製剤において、良好な指標（ＯＥ、ＦＰＦ）が得られる傾向があった。
　図６に示すように、ソルバー機能にて解析した崩壊率ＲはＭａｎ含有率０％で４５％程度、５～１０％で約５０～６０％となり、Ｍａｎ添加で増加した。一方、Ｍａｎ添加によりＭＭＡＤcとＭＭＡＤfは小さくなった（Ｍａｎ０％：４．３μｍ程度、Ｍａｎ５～１０％：３．５～４．０μｍ）（Ｍａｎ０％：０．３５μｍ程度、Ｍａｎ５～１０％：０．２μｍ台）。以上のことから、マンニトールが崩壊性に大きく貢献することがわかった。
（粉末剤の耐吸湿性・吸湿性評価）
　実施例１で調製した各ＳＦＤ製剤及び組成の各原末（Ｌｅｕ、Ｍａｎ、Ｔｒｅ、ＦｌＮａ）について、動的水分吸着測定装置（DVS：Dynamic Vapor Sorption；DVS advantage、Surface Measurement Systems）を使用して、吸入から気道内、そして高湿度の肺深部での耐吸湿性及び吸湿成長の評価を行った。
　ＤＶＳは、試料を天秤型の測定部の片側に充填し、設定した温湿度環境における水分の吸着・脱着に伴った試料の質量変化を秒スケールでモニターすることができる。評価の測定条件を以下の表に示す。吸湿成長評価の条件設定に関して、粉末微粒子が肺深部に到達するまでの温湿度環境変化の再現に向けて、吸入前の環境を『温度３７℃、相対湿度（ＲＨ）５０％（絶対湿度：６．９０３ｇ／ｍ3）』とし、吸入後の肺内環境を『温度３７℃、９５％ＲＨ（絶対湿度：４１．６２ｇ／ｍ3）』とした。結果を、図７に示す。
ＤＶＳ測定条件
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　図７に示すように、ＳＦＤ製剤同士を比較するとＭａｎとＴｒｅの割合が多いほど相対湿度が高くなるにつれて吸湿し、質量変化率が高くなる結果となった。また、Ｌｅｕの割合が多いほど高湿度においても耐吸湿性を示した。また、Ｌｅｕ、Ｍａｎ及びＴｒｅ単独の質量変化率は原末（約０．０８、０．２９、２２％）とＳＦＤ製剤（約０．１４、２．４０、４１％）とを比較すると、ＳＦＤ製剤の質量変化率がより高くなる結果となった。
（粉末剤の長期保存試験（耐吸湿性・吸湿性））
　本実施例では、モデル薬物としてホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ（吸入特性については蛍光色素であるフルオレセインナトリウム（ＦｌＮａ）を用いた。）、賦形剤としてＬ－ロイシン（以下、Ｌｅｕとも表記する。）及びヒアルロン酸（ナトリウム塩、重量平均分子量５００００、以下、ＬＨＡとも表記する。）を用いて、以下の組成で、噴霧凍結乾燥用液を調製し、噴霧凍結乾燥した。
［１］試料１（ＦｌＮａ／ＬＨＡ／Ｌｅｕ）
　ＦｌＮａ１ｍｇ、ＬＨＡ１２．５ｍｇ及びＬｅｕ３６．５ｍｇ（合計５０ｍｇ）を含む水溶液
［２］試料２（ＦｌＮａ／ＬＨＡ）、
　ＦｌＮａ１ｍｇ、ＬＨＡ４９ｍｇ（合計５０ｍｇ）を含む水溶液
　なお、噴霧凍結乾燥は、実施例１に準じて、噴霧空気圧１５０ｋＰａ、試料溶液流速５ｍｌ／分、噴霧ノズル径０．４ｍｍ、乾燥時間２４時間、最終真空度５Ｐａ以下、最終棚温度１０℃で行った。得られた粉末製剤を、５℃／乾燥（シリカゲル）、２５℃／乾燥（シリカゲル）及び、２５℃／７５％ＲＨの３条件で１２ヶ月まで保存し、ＳＥＭ、吸入特性と遺伝子発現との双方を評価した。
（ＳＥＭ観察）
　試料１及び試料２のいずれにおいても、乾燥条件下では、１２ヶ月後も中空多孔構造を維持したが、加湿条件（７５％ＲＨ）では、試料１では、保存開始から１ヶ月、試料２では保存直後～１週間で吸湿し、それ以降は中空多孔構造を実質的に構成できなかった。ＳＥＭ観察によれば、耐吸湿性は、試料１が試料２よりも優れていた。
（吸入特性）
　吸入特性については、実施例４に準じて評価した。吸入特性評価にはＦｌＮａを含む粉末剤を用いた。結果を図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａに示すように、試料１は、乾燥条件下では、大きな吸入特性の低下を観察しなかったが、加湿条件では、４ヶ月以降ＦＰＦ３は低下し、ＭＭＡＤは増大した。このことは、吸湿により、初期の球状粒子が凝集していることを示す。また、図９Ｂに示すように、試料２では、乾燥条件では、保存期間による吸入特性の変化はなかったが、ＦＰＦ３も低く、ＭＭＡＤも約５～８μｍと大きかった。また、加湿条件では、吸湿により測定不可能であった。
（遺伝子発現）
　試料１及び２の粉末剤をマウス肺内に投与して、遺伝子発現効果を評価した。マウスへの投与及び評価は以下のようにして行った。
（１）マウス肺内への投与
　前処置としてペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）麻酔下、雌性ＩＣＲマウス（５週齢）の前歯を自作の固定板に設置し、胸部を垂直にした。ライト（MegaLight100（商標）、ショット日本株式会社）を用いて、胸部に局所的に光を当てながら、マウスの口を開放してピンセットで舌を引き出した。口内で白色の穴として見える気管を確認し、挿管補助器具（Liquid MicroSprayer（商品名、PennCentury, Inc））のスプレーチップ部分を使用）に装着したマウス肺内投与用カニューレ（総長４．０ｃｍのＰＥ－６０ポリエチレンチューブ）を３．０ｃｍ気管に挿入した。
　カニューレを気管に残しつつ挿管補助器具だけを引き抜いた後、カニューレから呼気が通ることを確認し、その後、肺内投与用デバイスのチップ先端をカニューレに挿入して、マウスの吸気に合わせて０．２５ｍＬの圧縮空気を開放することで予めチップに充填しておいた各粉末剤０．５ｍｇ（ｐＤＮＡとして１０μｇ）を肺内投与した。
（２）肺内遺伝子発現効果の評価
　ルシフェラーゼ活性に基づく発光をＩＶＩＳ（商標）を用いて検出・解析することにより評価した。測定時に用いたluciferinはＰＢＳを用いて３０ｍｇ／ｍＬに調整し、－８０°Ｃで保存したものを使用した。Isoflurane（イソフル、商標、アボットラボラトリーズ）により麻酔し、マウス肺内投与６、１２、２４、４８時間後に、発光基質であるluciferin（３０ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍＬ／ｍｏｕｓｅ；３００ｍｇ／ｋｇ）を経鼻投与した。luciferin投与１０分後にisoflurane麻酔下、exposure time １分で発光を検出した。肺に相当するregion of interest（ＲＯＩ；縦１ｃｍ、横３ｃｍ）を作成して、その発光強度（Total Flux (photon/sec)）を遺伝子発現量として求め、遺伝子発現量－時間パターンを解析した。得られた遺伝子発現量－時間パターンより、遺伝子発現量－時間曲線下面積（ＡＵＣ）及び最大遺伝子発現量（Ｌｕｃ（ｍａｘ））をそれぞれ求めた。結果を、図１０に示す。
　図１０に示すように、試料１及び試料２は、乾燥条件下では、初期の遺伝子発現を１２ヶ月後も概ね維持したが、加湿条件下では、４ヶ月で顕著に低下した。また、試料２の発現量が試料１に比較して高かった。
　以上のことから、本粉末剤が、乾燥条件下であれば、その吸入特性及び遺伝子発現特性を維持できることがわかった。
（ヒアルロン酸の分子量と遺伝子発現）
　本実施例では、種々の分子量のヒアルロン酸（ナトリウム塩）を用いた粉末剤の遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。
　ヒアルロン酸として、重量平均分子量２０００、５０００、５００００、８００００及び３５００００（それぞれ、ＨＡ２などという。）を用い、ｐＤＮＡ（ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡ）１ｍｇ（２質量％）、各ヒアルロン酸１２．５ｍｇ（２５質量％）、フェニルアラニン３６．５ｍｇ（７３質量％）の合計５０ｍｇを含む噴霧凍結乾燥用液を調製した。ヒアルロン酸は、ＮａＯＨによりｐＨ７．０±０．５に調製した溶液を用いた。この溶液を、実施例６と同様の方法により噴霧凍結乾燥して、粉末剤を製造した。
　製造した各粉末剤につき、ヒト由来肺胞がん細胞であるＡ５４９細胞を、細胞播種数を２×１０2ｃｅｌｌｓ／ウエル（気液界面培養系Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標））として４～９日培養後、これらのウエルに対して、０．４～０．６ｍｇを充填した粉末添加デバイスから一定量を添加した。４８時間経過後、ウエル内の細胞を凍結融解して破壊後、ピッカジーンを添加しルミノメータで蛍光を測定した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、重量平均分子量が５００００のＨＡ５０が最も高い遺伝子発現を示した。
　次いで、重量平均分子量５００００のＨＡ５０につき、ｐＤＮＡ１ｍｇ（２質量％）を固定し、ＨＡ量を１２．５ｍｇ（２５質量％）、２４．５ｍｇ（４９質量％）、３６．５ｍｇ（７３質量％）、４９ｍｇ（９８質量％）とし、フェニルアラニンをそれぞれ３６．５ｍｇ（７３質量％）、２４．５ｍｇ（４９質量％）、１２．５ｍｇ（３５質量％）、０ｍｇ（０質量％）をそれぞれ含んだ各５ｍｌの４種類の噴霧凍結乾燥用液を調製した。この溶液を、実施例６と同様の方法により噴霧凍結乾燥して、粉末剤を製造し、上記と同様に遺伝子発現を評価した。結果を図１２に示す。
　図１２に示すように、ＨＡ５０を７３質量％含み、フェニルアラニンを１２．５質量％含む組成物が、最も高い遺伝子発現効果を示した。以上の結果から、遺伝子発現の観点からは、ＨＡ５０が好適であり、また、フェニルアラニンを併用することが有用であることがわかった。また、遺伝子発現の観点からは、ＨＡ５０は、全賦形剤中、５０質量％以上、また例えば、５０質量％以上、また例えば、６０質量％以上、また例えば、７０質量％以上含むことが好適であり、例えば、９０質量％以下、また例えば、８５質量％以下、また例えば、８０質量％以下含むことが好適であり、これらの下限値及び上限値から選択される組み合わせにより規定される範囲もまた好適である。また、ＨＡ５０とフェニルアラニンなどの賦形剤とは、ＨＡ５０ １００質量部に対して、例えば１０質量部以上、また例えば、１５質量部、また例えば、２０質量部以上の下限値、例えば、４０質量部以下、また例えば、３５質量部以下、また例えば、３０質量部以下の上限値から、それぞれ選択される下限値及び上限値で規定される範囲において有用であることがわかった。
（ヒアルロン酸とフェニルアラニンを含む粉末剤の吸入特性）
　実施例７において良好な遺伝子発現が確認されたヒアルロン酸（重量平均分子量５００００）とフェニルアラニンを含む粉末剤の吸入特性を確認した。本実施例では、蛍光色素であるフルオレセインナトリウム（ＦｌＮａ）を用い、賦形剤としてＬ－フェニルアラニン（以下、Ｐｈｅとも表記する。）及びヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量５００００、以下、ＨＡ５０とも表記する。）を用いて、以下の組成で、噴霧凍結乾燥用液を調製し、噴霧凍結乾燥した。なお、ＨＡ５０は、ＮａＯＨによりｐＨ７に調製した溶液として用いた。
［１］試料１
　ＦｌＮａ２質量％、ＨＡ５０ ９８質量％、及びＰｈｅ０質量％（合計５０ｍｇ）を含む５ｍｌの溶液。
［２］試料２
　ＦｌＮａ２質量％、ＨＡ５０ ７３質量％、及びＰｈｅ２５質量％（合計５０ｍｇ）を含む５ｍｌの溶液
［３］試料３
　ＦｌＮａ２質量％、ＨＡ５０ ４９質量％、及びＰｈｅ４９質量％（合計５０ｍｇ）を含む５ｍｌの溶液。
［４］試料４
　ＦｌＮａ２質量％、ＨＡ５０ ２５質量％、及びＰｈｅ７３質量％（合計５０ｍｇ）を含む５ｍｌの溶液
　なお、噴霧凍結乾燥は、実施例６に準じて行い、粉末剤を得て、実施例４に準じて吸入特性を評価した。結果を図１３に示す。図１３に示すように、ＨＡ５０の質量％が低くＰｈｅの質量％が高いほど、高い肺到達性を示した。また、いずれの製剤も良好なＭＭＡＤも示したが、ＨＡ５０の質量％が低くＰｈｅの質量％が高いほどＭＭＡＤは小さくなった。
　なお、こうした吸入特性評価の結果、いずれの製剤も、肺内到達率である「ＦＰＦ３」や「ＯＥ×ＦＰＦ３」は、２０％以上であることがわかった。また、ＨＡ２５％製剤すなわち、Ｐｈｅ含有量が多い製剤ほど、高い吸入特性が得られることもわかった。また、いずれの製剤も、ＭＭＡＤが１～６μｍであることから、吸入剤に適していることもわかった。このように、本実施例によれば、ＨＡ５０とフェニルアラニンの組み合わせが良好であることがわかった。
　また、図１２に示すインビトロにおける遺伝子発現効果と図１３に示す吸入特性の結果から推定できる、ＨＡ５０とフェニルアラニンとを賦形剤とする吸入粉末剤の有効性を図１４に示す。
　図１４に示すように、ＨＡ５０とフェニルアラニンとは、これら２成分の総質量に対して、ＨＡ５０が４０質量％以上９０質量％以下、また例えば、５０質量％以上９０質量％以下、６０質量％以上９０質量％以下、６０質量％以上８５質量％以下、さらに、６０質量％以上８０質量％以下などとすることで、吸入粉末剤としての高い有効性が見込まれることがわかった。

Claims (27)

  1. 　吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子の少なくとも一部に有効成分を含有する、吸入粉末剤。
  2. 　アンダーセン・カスケード・インパクター（ＡＣＩ）による吸入特性評価において、ＯＥ（％）＝ｔｈｒｏａｔ以降からの回収量（ｍｇ）／全回収量（ｍｇ）×１００が、８０％以上である、請求項１に記載の吸入粉末剤。
  3. 　ＡＣＩによる吸入特性評価において、ＦＰＦ５（％）が３０％以上である、請求項１又は２に記載の吸入粉末剤。
  4. 　ＡＣＩによる吸入特性評価において、ｆｉｌｔｅｒ及びＳｔａｇｅ２～４のいずれか１つにおいて回収率のピークを有する、請求項１～３のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  5. 　ＡＣＩによる吸入特性評価において算出される第１の空気力学的質量中位径及び前記第１の空気力学的質量中位径よりも大きい第２の空気力学的質量中位径を有する、請求項１～４のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  6. 　前記第２の空気力学的質量中位径を有する粉体の前全粉体に対する比率（質量）が、４０％以上である、請求項５に記載の吸入粉末剤。
  7. 　動的水分吸着測定法において、３７℃で５０％ＲＨ～９５％ＲＨまで変化させたとき、７０％ＲＨでの質量変化率が１％以下であり、９５％ＲＨでの質量変化率５％以上である、請求項１～６のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  8. 　前記球状粒子は、賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースを含有する、請求項１～７のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  9. 　前記前記粒子の幾何学的粒子径分布のピーク粒子径は、１μｍ以上１００μｍ以下である、請求項１～８のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  10. 　有効成分として核酸を含む、請求項１～９のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  11. 　前記核酸は、ネイキッド核酸である、請求項１０に記載の吸入粉末剤。
  12. 　さらに、賦形剤としてアニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分、を含有する、請求項１０又は１１に記載の吸入粉末剤。
  13. 　前記アニオン性成分は、ヒアルロン酸又はその塩である、請求項１２に記載の吸入粉末剤。
  14. 　前記ヒアルロン酸の重量平均分子量は、３０，０００以上７０，０００以下である、請求項１３に記載の吸入粉末剤。
  15. 　さらに、賦形剤として、１又は２以上の疎水性アミノ酸を含有する、請求項１０～１４のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  16. 　前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項１５に記載の吸入粉末剤。
  17. 　前記有効成分以外の成分である賦形剤として、重量平均分子量が３０，０００以上７０，０００以下のヒアルロン酸又はその塩とフェニルアラニンを含有し、これら２成分の総質量に対して、前記ヒアルロン酸又はその塩を、４０質量％以上８５質量％以下含有する、請求項１０又は１１に記載の吸入粉末剤。
  18. 　哺乳類に対する遺伝子発現用である、請求項１０～１７のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  19. 　哺乳類における遺伝子抑制用である、請求項１０～１７のいずれかに記載の吸入粉末剤。
  20. 　吸入粉末剤の製造方法であって、
    　有効成分と少なくとも一種の賦形剤とを溶解した液体を、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子が得られるように噴霧凍結乾燥する乾燥工程、を備える方法。
  21. 　前記球状粒子のアンダーセンカスケードインパクター（ＡＣＩ）による吸入特性評価が、ＯＥ（％）＝スロート以降からの回収量（ｍｇ）／全回収量（ｍｇ）×１００が、８０％以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する工程をさらに備える、請求項２０に記載の方法。
  22. 　前記球状粒子のＡＣＩによる吸入特性評価が、ＦＰＦ５（％）が３０％以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する、請求項２１に記載の方法。
  23. 　前記球状粒子のＡＣＩによる吸入特性評価において、フィルター及びステージ２～４のいずれか１つにおいて回収率のピークを有する球状粒子が得られるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する、請求項２０～２２のいずれかに記載の方法。
  24. 　前記乾燥工程は、前記前記賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースを用い、有効成分を含有する液体を噴霧凍結乾燥法にて乾燥する工程である、請求項２０～２３のいずれかに記載の方法。
  25. 　吸入粉末剤の評価方法であって、
    　ＡＣＩによる吸入特性評価において算出される第１の空気力学的質量中位径及び前記第１の空気力学的質量中位径よりも小さい第２の空気力学的質量中位径を取得する、方法。
  26. 　前記第２の空気力学的質量中位径を有する粉体の全粉体に対する比率（質量）が、４０％以上とする、請求項２５に記載の方法。
  27. 　吸入粉末剤の評価方法であって、
    　動的水分吸着測定法において、３７℃で５０％ＲＨ～９５％ＲＨまで変化させたとき、少なくとも７０％ＲＨでの質量変化率及び９５％ＲＨでの質量変化率を測定する方法。
PCT/JP2019/038991 2018-10-02 2019-10-02 吸入粉末剤、その評価方法及びその用途 WO2020071448A1 (ja)

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