JP7090941B2 - 吸入粉末剤、その評価方法及びその用途 - Google Patents
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Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、2018年10月2日に出願された日本国特許出願である特願2018-187498の関連出願であり、この日本出願に基づく優先権を主張するものであり、この全内容が、引用により本明細書に組み込まれるものとする。また、本出願は、2017年5月2日に出願された日本国特許出願である特願2017-91941の関連出願であり、この全内容は、引用により本明細書に組み込まれるものとする。
[2]アンダーセンカスケードインパクター(ACI)による吸入特性評価において、OE(%)=スロート以降からの回収量(mg)/全回収量(mg)×100が、80%以上である、[1]に記載の吸入粉末剤。
[3]ACIによる吸入特性評価において、FPF5(%)が30%以上である、[1]又は[2]に記載の吸入粉末剤。
[4]ACIによる吸入特性評価において、フィルター及びステージ2~4のいずれか1つにおいて回収率のピークを有する、[1]~[3]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[5]ACIによる吸入特性評価において算出される第1の空気力学的質量中位径及び前記第1の空気力学的質量中位径よりも小さい第2の空気力学的質量中位径を有する、[1]~[4]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[6]前記第2の空気力学的質量中位径を有する粉体の全粉体に対する比率(質量)が、40%以上である、[5]に記載の吸入粉末剤。
[7]動的水分吸着測定法において、37℃で50%RH~95%RHまで変化させたとき、70%RHでの質量変化率が1%以下であり、95%RHでの質量変化率5%以上である、[1]~[6]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[8]前記球状粒子は、賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースを含有する、[1]~[7]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[9]前記前記粒子の幾何学的粒子径分布のピーク粒子径は、1μm以上100μm以下である、[1]~[8]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[10]有効成分として核酸を含む、[1]~[9]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[11]前記核酸は、ネイキッド核酸である、[10]に記載の吸入粉末剤。
[12]さらに、賦形剤としてアニオン性ポリマー又はそれらの塩であるアニオン性成分、を含有する[10]又は[11]に記載の吸入粉末剤。
[13]前記アニオン性成分は、ヒアルロン酸又はその塩である、[12]に記載の吸入粉末剤。
[14]前記ヒアルロン酸又はその塩の重量平均分子量は、30,000以上70,000以下である、[13]に記載の粉末吸入剤、
[15]さらに、賦形剤として、1又は2以上の疎水性アミノ酸を含有する、[10]~[14]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[16]前記疎水性アミノ酸は、ロイシン、フェニルアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される1種又は2種以上である、[15]に記載の吸入粉末剤。
[17]前記有効成分以外の成分である賦形剤として、重量平均分子量が30,000以上70,000以下のヒアルロン酸又はその塩とフェニルアラニンを含有し、これら2成分の総質量に対して、前記ヒアルロン酸又はその塩を、40質量%以上85質量%以下含有する、[10]又は[11]に記載の吸入粉末剤。
[18]哺乳類に対する遺伝子発現用である、[10]~[17]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[19]哺乳類における遺伝子抑制用である、[10]~[17]のいずれかに記載の吸入粉末剤。
[20]吸入粉末剤の製造方法であって、
有効成分と少なくとも一種の賦形剤とを溶解した液体を、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子が得られるように噴霧凍結乾燥する乾燥工程、を備える方法。
[21]前記球状粒子のアンダーセンカスケードインパクター(ACI)による吸入特性評価が、OE(%)=スロート以降からの回収量(mg)/全回収量(mg)×100が、80%以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する工程をさらに備える、[20]に記載の方法。
[22]前記球状粒子のACIによる吸入特性評価が、FPF5(%)が30%以上となるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する、[21]に記載の方法。
[23]前記球状粒子のACIによる吸入特性評価において、フィルター及びステージ2~4のいずれか1つにおいて回収率のピークを有する球状粒子が得られるように前記賦形剤を選択して前記液体を調製する、[20]~[22]のいずれかに記載の方法。
[24]前記乾燥工程は、前記前記賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースを用い、有効成分を含有する液体を噴霧凍結乾燥法にて乾燥する工程である、[20]~[23]のいずれかに記載の方法。
[25]吸入粉末剤の評価方法であって、
ACIによる吸入特性評価において、算出される第1の空気力学的質量中位径及び前記第1の空気力学的質量中位径よりも小さい第2の空気力学的質量中位径を取得する、方法。
[26]前記第2の空気力学的質量中位径を有する粉体の全粉体に対する比率(質量)を取得する、[25]に記載の方法。
[27]吸入粉末剤の評価方法であって、
動的水分吸着測定法において、37℃で50%RH~95%RHまで変化させたとき、少なくとも70%RHでの質量変化率及び95%RHでの質量変化率を測定する方法。
本明細書に開示される吸入粉末剤(以下、単に、本粉末剤ともいう。)は、吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、多孔質中空状の球状粒子の少なくとも一部に有効成分を含有することができる。以下、こうした本粉末剤の、各種特性及びその評価方法について説明し、次いで、本粉末剤の製造方法について説明する。
本粉末剤の粒子径は、乾式レーザー回折法にて測定することができる。累積粒度分布曲線から、50%粒子径(D50)を算出することができる。例えば、レーザーマイクロンサイザー(LMS-2000e)又はその同等装置を用いて測定することができる。本粉末剤の50%粒子径は、特に限定するものではないが、飛散性や分散性を考慮すると、例えば、1μm以上100μm以下、また例えば、2μm以上50μm以下、5μm以上20μm以下などとすることができる。また例えば、5μm以上20μm以下、また例えば、5μm以上15μm以下などとすることができる。
本粉末剤の粒子形状は、走査型電子顕微鏡で観察することができる。観察にあたっては、例えば、本粉末剤の分散添加に用いられる粉末微粒子添加デバイスを用いて試料台上に噴霧後、SEM観察に適するように、プラチナコーティングを必要に応じて行い、観察する。粉末微粒子添加デバイス及び噴霧方法としては、例えば、後述する実施例において用いるものを採用することができる。
本粉末剤は、吸気(口腔から気管支への吸引時のガス流)によって呼吸器に送達されるが、アンダーセンカスケードインパクター(ACI)法により評価することで、その場合の特性(吸入特性)、すなわち、本粉末剤の分散性、送達性や崩壊性を評価できる。分散性、送達性及び崩壊性はそれぞれ独立の特性であるが相互に関連している。
本明細書において、ACI法とは、第17改正日本薬局方第一追補一般試験法6.15吸入剤の空気力学的粒度測定法 5.2 アンダーセンカスケードインパクター法(装置2)に記載の測定装置を用いる。プレセパレーターを適宜用いることができる。測定装置としては、例えば、ローボリウム・エアーサンプラー、アンダーセンタイプ、AN-200型、柴田科学株式会社製の装置が挙げられる。
本粉末剤の分散性及び送達性について、以下の式を用いて得られる数値等を指標として評価することができる。なお、本明細書においては、ステージ3以降を吸入剤応用に有効な肺内送達領域とし、ステージ5以降を全身作用が期待できる肺深部送達領域とする。
(ただし、回収量Tは、スロート以降からの回収量である。)
=ステージ3以降からの回収量(μg)/回収量T(μg)×100 (2)
=ステージ5以降からの回収量(μg)/回収量T(μg)×100 (3)
=ステージ5以降からの回収量(μg)/全回収量(μg)×100 (4)
本発明者らによれば、ACI法によって本粉末剤の崩壊性を評価することができる。本粉末剤の崩壊性は、本粉末剤の崩壊率と空気力学的質量中位径とから求めることができる。
ACI法によって得られた、8つの測定点(ステージ1~フィルター)の回収率(放出量に対する%)の積算値から、各ステージつき、下記A~Dの値を求め,Eが最小になるような、R、MMADc、GSDc、MMADf、GSDfを求める(表1参照)。なお、A~D及びEが最小となるような各数値の算出には、例えば表計算ソフトであるExcel(マイクロソフト株式会社)の下記関数及びソルバー機能などを用いることができる。なお、カットオフ値としては、図1に示す数値を用いた。
B=NORM.DIST関数により算出した粒径の大きい粒子(MMADc及びGSDc)の回収率の積算値
C=NORM.DIST関数により算出した粒径の小さい粒子(MMADf及びGSDf)の粉体の回収率の積算値
D=B×(1-R)+C×Rの値をNORM.S.INV関数により変換した確率変数
E=ステージごとに求めた(D-A)2の合計値
本粉末剤は、また、動的水分吸着測定法において、37℃で50%RH~95%RHまで変化させたとき、例えば、70%RHでの質量変化率が2%以下とすることができる。2%以下であると、吸入前において十分な耐湿性を備えるといえるからである。また例えば、質量変化率は1.5%以下であり、また例えば、同1%以下である。
本粉末剤は、概して、医薬用を意図しており、薬学上許容される賦形剤を含有することができる。かかる賦形剤として特に限定するものではないが、例えば、ロイシン、マンニトール及びトレハロースから選択される1種又は2種以上を含有することができる。好ましくは、3種類を用いる。これら3種の賦形剤は、それぞれ、本粉末剤の、上記した有利な特性に貢献することができる。ロイシン、マンニトール及びトレハロースは、特に限定するものではないが、いずれも天然型、すなわち、L-ロイシン、D-(-)-マンニトール、D-(+)-トレハロースを用いることができる。
本粉末剤は、また、賦形剤として、アニオン性ポリマー又はその塩であるアニオン性成分を有していてもよい。ア二オン性成分は、必ずしも明らかではないが、固体物質である有効成分として核酸と併存させることで、核酸の細胞への導入効率を高めることができると推論される。また、核酸を含む本粉末剤を噴霧凍結乾燥などで乾燥するときにおいて併存させることで、核酸の生物活性の維持に寄与することが推論される。こうしたアニオン成分及びその有用性については、本発明者らによる特開2018-11588号公報に開示されている。
本粉末剤は、さらに、賦形剤として、1又は2以上の疎水性アミノ酸を含有していてもよい。かかるアミノ酸を含有していると、本粉末剤を細胞に供給する際の、分散性、吸入投与に際しての吸入特性などを向上させることができると考えられる。かかる疎水性アミノ酸及びその有用性については、本発明者らによる特開2018-11588に開示されている。
本粉末剤が核酸を含むとき、カチオン性キャリアを含有していないことが好適である。カチオン性キャリアは、一般に、核酸などの細胞への導入に有用であるが、カチオン性キャリアは、カチオン性ポリマーなどの非ウイルス性であっても、カチオン性キャリアは、細胞障害性等を発現する可能性があるため、カチオン性キャリアを含有しないことが好ましい。かかるカチオン性キャリアとしては、特に限定するものではないが、カチオン性基を有するカチオン性ポリマーやカチオン性脂質が挙げられる。カチオン性ポリマーとしては、カチオン性基を有する多糖類、カチオン性基を側鎖に有するポリペプチド、カチオン性基を有する人工ポリマー若しくはこれらの塩等が挙げられる。
本明細書によれば、吸入粉末剤の評価方法も提供される。すなわち、本評価方法は、ACI法による吸入特性評価において、既に説明した条件で算出される第1の空気力学的質量中位径及び前記第1の空気力学的質量中位径よりも小さい第2の空気力学的質量中位径を取得する、方法が提供される。かかる方法によれば、吸入粉末剤の特性である到達性が評価できるほか、併せて崩壊性も評価することができる。
本粉末剤は、有効成分が核酸であるとき、核酸の細胞への導入用として用いることができる。さらには、本粉末剤は、核酸を細胞に導入して当該核酸による種々の効果、例えば、遺伝子の発現(タンパク質の合成)や遺伝子の発現の抑制を意図するものである。
本実施例では、モデル薬物として蛍光色素であるフルオレセインナトリウム(FlNa)、賦形剤として以下に示すロイシン、マンニトール及びトレハロースを、以下の表に示す組みあわせで用いた。
調製した粉末微粒子の粒子形状を走査型電子顕微鏡(SEM:JSM-IT100LA、日本電子株式会社)で観察した。図2に示す分散添加のための粉末微粒子添加デバイスを用いて、噴霧した。噴霧方法としては、調製した粉末製剤を少量充填した100μLチップに三方活性を介して接続した1mLシリンジ(TERUMO)内で0.25mLの空気を圧縮し、三方活栓を開放した。黒色両面テープを貼付した試料台上に粉末微粒子を分散添加後、30mV、90secの条件でプラチナコーティング(JFC-1600、日本電子データム株式会社)し、SEM観察した。結果を図2に示す。
実施例1で調製した製剤の幾何学的粒子径・粒度分布は、レーザー回折・散乱式粒度分布測定器(LMS:LMS-2000e、SEISHIN ENTERPRISE Co.,Ltd.)を使用した。乾式ワンショット測定法で行い、0.4MPaにエアー供給圧を設定して測定を行った。得られた累積粒度分布から50%粒子径(D50)を算出し、粒度分布評価を行った。結果を図3に示す。算出したD50を併せて図3に示す。
吸入特性の詳細なデータを得るため、ACI(ローボリウム・エアーサンプラー、アンダーセンタイプ、AN-200型、柴田科学株式会社)を用いて吸入特性評価を行った。
デバイス、カプセル、スロート、フィルター、各ステージに沈着した試料をリン酸緩衝液(PBS)50ml又は10mlに溶解した後、FlNaの濃度をマルチプレートリーダー(Enspire、株式会社パーキンエルマージャパン)にて定量(励起波長:490nm、蛍光波長:515nm)し、各パーツにおける回収量及び回収率を算出した。必要に応じて希釈定量を行った。各ステージでの回収率を図4に示す。
本実験結果から、OE、FPFStage3、FPFStage5及びOE×FPFStage5を既述の式(1)~(4)から算出した。種々の製剤についてのこれらの指標を図5に示す。
実施例1で調製した粉末剤は、対数正規プロットが曲線となる傾向があったため、粉体の一部が崩壊し,粒子径が大きい粉体(MMAD及びGSDをMMADc及びGSDcとする)と小さい粉体(MMADf及びGSDf)が比率(1-R):Rで生じたと考えた。そこでACI解析で得られた8つの測定点(回収率の積算値)から、Excelの関数を用いて各ステージに下記A~Dの値を求め,Eが最小になるようなR、MMADc、GSDc、MMADf、GSDfをExcelのソルバー機能により求めた。これらの結果を図6に示す。なお、図6には、あわせて、粒子崩壊前後の粉体の解析結果の一例を示す。
B=NORM.DIST関数により算出したMMADc及びGSDcの粉体の回収率の積算値
C=NORM.DIST関数により算出したMMADf及びGSDfの粉体の回収率の積算値
D=B×(1-R)+C×Rの値をNORM.S.INV関数により変換した確率変数
E=ステージごとに求めた(D-A)2の合計値
実施例1で調製した各SFD製剤及び組成の各原末(Leu、Man、Tre、FlNa)について、動的水分吸着測定装置(DVS:Dynamic Vapor Sorption;DVS advantage、Surface Measurement Systems)を使用して、吸入から気道内、そして高湿度の肺深部での耐吸湿性及び吸湿成長の評価を行った。
本実施例では、モデル薬物としてホタルルシフェラーゼをコードするプラスミドDNA(吸入特性については蛍光色素であるフルオレセインナトリウム(FlNa)を用いた。)、賦形剤としてL-ロイシン(以下、Leuとも表記する。)及びヒアルロン酸(ナトリウム塩、重量平均分子量50000、以下、LHAとも表記する。)を用いて、以下の組成で、噴霧凍結乾燥用液を調製し、噴霧凍結乾燥した。
FlNa1mg、LHA12.5mg及びLeu36.5mg(合計50mg)を含む水溶液
[2]試料2(FlNa/LHA)、
FlNa1mg、LHA49mg(合計50mg)を含む水溶液
試料1及び試料2のいずれにおいても、乾燥条件下では、12ヶ月後も中空多孔構造を維持したが、加湿条件(75%RH)では、試料1では、保存開始から1ヶ月、試料2では保存直後~1週間で吸湿し、それ以降は中空多孔構造を実質的に構成できなかった。SEM観察によれば、耐吸湿性は、試料1が試料2よりも優れていた。
吸入特性については、実施例4に準じて評価した。吸入特性評価にはFlNaを含む粉末剤を用いた。結果を図9A及び図9Bに示す。図9Aに示すように、試料1は、乾燥条件下では、大きな吸入特性の低下を観察しなかったが、加湿条件では、4ヶ月以降FPF3は低下し、MMADは増大した。このことは、吸湿により、初期の球状粒子が凝集していることを示す。また、図9Bに示すように、試料2では、乾燥条件では、保存期間による吸入特性の変化はなかったが、FPF3も低く、MMADも約5~8μmと大きかった。また、加湿条件では、吸湿により測定不可能であった。
試料1及び2の粉末剤をマウス肺内に投与して、遺伝子発現効果を評価した。マウスへの投与及び評価は以下のようにして行った。
前処置としてペントバルビタール(50mg/kg、i.p.)麻酔下、雌性ICRマウス(5週齢)の前歯を自作の固定板に設置し、胸部を垂直にした。ライト(MegaLight100(商標)、ショット日本株式会社)を用いて、胸部に局所的に光を当てながら、マウスの口を開放してピンセットで舌を引き出した。口内で白色の穴として見える気管を確認し、挿管補助器具(Liquid MicroSprayer(商品名、PennCentury, Inc))のスプレーチップ部分を使用)に装着したマウス肺内投与用カニューレ(総長4.0cmのPE-60ポリエチレンチューブ)を3.0cm気管に挿入した。
ルシフェラーゼ活性に基づく発光をIVIS(商標)を用いて検出・解析することにより評価した。測定時に用いたluciferinはPBSを用いて30mg/mLに調整し、-80°Cで保存したものを使用した。Isoflurane(イソフル、商標、アボットラボラトリーズ)により麻酔し、マウス肺内投与6、12、24、48時間後に、発光基質であるluciferin(30mg/mL、0.05mL/mouse;300mg/kg)を経鼻投与した。luciferin投与10分後にisoflurane麻酔下、exposure time 1分で発光を検出した。肺に相当するregion of interest(ROI;縦1cm、横3cm)を作成して、その発光強度(Total Flux (photon/sec))を遺伝子発現量として求め、遺伝子発現量-時間パターンを解析した。得られた遺伝子発現量-時間パターンより、遺伝子発現量-時間曲線下面積(AUC)及び最大遺伝子発現量(Luc(max))をそれぞれ求めた。結果を、図10に示す。
本実施例では、種々の分子量のヒアルロン酸(ナトリウム塩)を用いた粉末剤の遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。
実施例7において良好な遺伝子発現が確認されたヒアルロン酸(重量平均分子量50000)とフェニルアラニンを含む粉末剤の吸入特性を確認した。本実施例では、蛍光色素であるフルオレセインナトリウム(FlNa)を用い、賦形剤としてL-フェニルアラニン(以下、Pheとも表記する。)及びヒアルロン酸ナトリウム(重量平均分子量50000、以下、HA50とも表記する。)を用いて、以下の組成で、噴霧凍結乾燥用液を調製し、噴霧凍結乾燥した。なお、HA50は、NaOHによりpH7に調製した溶液として用いた。
FlNa2質量%、HA50 98質量%、及びPhe0質量%(合計50mg)を含む5mlの溶液。
[2]試料2
FlNa2質量%、HA50 73質量%、及びPhe25質量%(合計50mg)を含む5mlの溶液
[3]試料3
FlNa2質量%、HA50 49質量%、及びPhe49質量%(合計50mg)を含む5mlの溶液。
[4]試料4
FlNa2質量%、HA50 25質量%、及びPhe73質量%(合計50mg)を含む5mlの溶液
Claims (15)
- 多孔質中空状の粒子の少なくとも一部に有効成分を含有し、
前記粒子は、賦形剤としてロイシン、マンニトール及びトレハロースから選ばれる2つ以上を含有し、
マンニトール:トレハロース:ロイシンの質量比が、5以上10以下:1以上5以下:85以上94以下である、吸入粉末剤。 - 吸気によって分散・解砕可能であって、かつ、吸湿時に膨潤可能である、請求項1に記載の吸入粉末剤。
- アンダーセン・カスケード・インパクター(ACI)による吸入特性評価において、OE(%)=throat以降からの回収量(mg)/全回収量(mg)×100が、80%以上である、請求項1又は2に記載の吸入粉末剤。
- アンダーセン・カスケード・インパクター(ACI)による吸入特性評価において、FPF5(%)が30%以上である、請求項1~3のいずれかに記載の吸入粉末剤。
- アンダーセン・カスケード・インパクター(ACI)による吸入特性評価において、フィルターに回収率のピークを有する、請求項1~4のいずれかに記載の吸入粉末剤。
- 前記粒子のアンダーセン・カスケード・インパクター(ACI)による吸入特性評価において、前記フィルターのピークが他のピークより高い、請求項5に記載の吸入粉末剤。
- アンダーセン・カスケード・インパクター(ACI)による吸入特性評価において算出される第1の空気力学的質量中位径及び前記第1の空気力学的質量中位径よりも小さい第2の空気力学的質量中位径を有する、請求項1~6のいずれかに記載の吸入粉末剤。
- 前記第2の空気力学的質量中位径を有する粉体の前全粉体に対する比率(質量)が、40%以上である、請求項7に記載の吸入粉末剤。
- 動的水分吸着測定法において、37℃で50%RH~95%RHまで変化させたとき、70%RHでの質量変化率が1%以下であり、95%RHでの質量変化率が5%以上である、請求項1~8のいずれかに記載の吸入粉末剤。
- 前記粒子の幾何学的粒子径分布のピーク粒子径は、1μm以上100μm以下である、請求項1~9のいずれかに記載の吸入粉末剤。
- 有効成分として核酸を含む、請求項1~10のいずれかに記載の吸入粉末剤。
- 前記核酸は、ネイキッド核酸である、請求項11に記載の吸入粉末剤。
- 哺乳類に対する遺伝子発現用である、請求項11又は12に記載の吸入粉末剤。
- 哺乳類における遺伝子抑制用で、請求項11又は12に記載の吸入粉末剤。
- 噴霧凍結乾燥による、吸入粉末剤の製造方法であって、
有効成分と、少なくともロイシン、マンニトール及びトレハロースから選ばれる2つ以上を賦形剤として含有する液体を液体窒素中に噴霧して凍結させる噴霧凍結工程と、
前記噴霧凍結工程で得られた氷滴を凍結乾燥する凍結乾燥工程と、を備え、
マンニトール:トレハロース:ロイシンの質量比が、5以上10以下:1以上5以下:85以上94以下である、方法。
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