CN111285845B

CN111285845B - 末端官能团化的泊洛沙胺衍生物

Info

Publication number: CN111285845B
Application number: CN202010086668.8A
Authority: CN
Inventors: 张龙贵
Original assignee: Shenzhen Houcun Nano Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Shenzhen Houcun Nano Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-02-11
Filing date: 2020-02-11
Publication date: 2021-01-01
Anticipated expiration: 2040-02-11
Also published as: CN111285845A

Abstract

泊洛沙胺衍生物，涉及基因治疗领域，其结构如式(I)所示

其中R为X‑Z或Y‑Z，X的结构式如式(II)所示

Y的结构如式(III)所示

本发明提供了一种复合物纳米粒组合物，所述复合物纳米粒组合物包括至少一种如式(I)所示的末端官能化的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体。

Description

末端官能团化的泊洛沙胺衍生物

技术领域

本发明涉及基因治疗领域，具体涉及一种末端官能团化的泊洛沙胺衍生物，以及包含所述泊洛沙胺衍生物的复合物纳米粒，及其用于体内外细胞基因转染的用途。

背景技术

基因治疗是指将外源治疗性基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。基因递送是将外源治疗性基因通过递送技术将有生物活性的基因递送至病人的受体细胞中，并使外源治疗性基因翻译产生的蛋白多肽能治疗某种疾病。随着mRNA更多应用场景的发现，如蛋白质替代治疗、癌症和传染病的疫苗接种等，人们开始着手克服mRNA的缺点如体内外稳定性、短半衰期和不利的免疫原性，以挖掘其更多的功能。跟DNA疗法相比，IVTmRNA疗法有自己的优势。IVTmRNA不需要进入细胞核就能发挥作用；相比之下，DNA疗法需要进入细胞核转录成RNA。而且与质粒 DNA和病毒载体不同，基于IVTmRNA的疗法不会整合到基因组中，因此不会造成插入诱变的风险。因此，基于mRNA的疗法和药物开发引起了科学家与投资者的广泛兴趣。随着基因的体外合成技术、载体技术和编辑技术等生物技术的成熟，以及近两年基因药物的不断上市，基因治疗时代已经宣告正式来临。

使用IVTmRNA作为药物无非就是将特定的遗传信息转到患者的细胞中以改变某一疾病状态。有两种方法：一种是先将IVTmRNA转移到离体的细胞中，再将这些转染细胞送回患者体内，转染细胞将信息翻译成蛋白质。这种方法一般用于基因组工程、遗传重编程、基于T细胞和树突细胞(DC)的免疫疗法以治疗癌症和感染性疾病，以及一些蛋白质替代方法。另一种方法是利用各种方式直接将IVTmRNA递送到患者体内的细胞中。这种方法主要应用于肿瘤学和传染病、过敏治疗的耐受方案和其他蛋白质替代方法。 IVTmRNA发挥药效学活性的主要位置是细胞质，与在细胞核中产生并通过核输出进入细胞质的天然mRNA相反，IVTmRNA必须从细胞外空间进入细胞质。两个关键因素决定细胞质生物利用度：一种是普遍存在的高活性RNase使其快速降解；另一种是细胞膜，其阻碍带负电的大mRNA分子被动扩散到细胞质中。从IVTmRNA翻译的蛋白质产物经历翻译后修饰。IVTmRNA模板和蛋白质产物的半衰期是药代动力学的关键决定因素。

将外源的治疗性基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法和载体，然而，IVTmRNA的递送是使其产业转化的难点，也是行业领域的痛点。虽然大多数细胞可以自发地摄取mRNA，但是效率很低并且低剂量就饱和了。因此需要合适的制剂来保护 IVTmRNA免受细胞外RNase介导的降解并促进其进入细胞。目前除了各种带正电荷的脂质，其他含有聚合物的转染剂，例如聚乙烯亚胺、阳离子多肽，可以帮助保护mRNA 免受RNase介导的降解。国际上已经开发了几种技术来将mRNA递送到细胞质中用于体外和离体应用。电穿孔(Electroporation)是使用电场增加细胞膜对核酸的渗透性。另一种方法是基因枪(GeneGun)，它将已经表面涂有mRNA的金属(例如金)颗粒射入细胞，由加压载气驱动。微注射(Microinjection)是另一种物理mRNA转染方法，使用微量移液管将核酸直接注射到细胞内空间。在大多数临床试验中，离体递送mRNA。具体地，从患者体内取出血细胞，在细胞培养皿中转染，然后重新输注体内。该方法确保转染足够大量的靶细胞，并且仅转染靶细胞使副作用最小化。但与全身注射相比，离体治疗是昂贵且侵入性的，通常限于靶向白细胞。

在病毒mRNA疫苗和肿瘤mRNA疫苗开发过程中，将特定序列的IVTmRNA递送至树突状细胞使其安全、高效、足量的表达对疫苗产生药效至关重要。目前国际上主流的递送技术是通过制备可降解的纳米粒载体，经过肌内、皮内、结内、皮下、静脉、鞘内、呼吸道及消化道等给药途径，使具有生物活性的基因递送至病人的受体细胞中发挥作用。这种纳米载体是未来基因体内外给药不可替代的传递系统，具有重要的临床实用潜力，它们具有以下特色和优势：1)生产成本低；2)便于靶向修饰，增强靶向特异性，可以实现局部靶向给药；3)能通过生理代谢完全降解；4)化学结构明确方便质量控制，并且可以通过处方优化调节基因的载量，理论上基因的大小不受限制；5)无免疫原性，细胞毒性低且生物相容性好。目前科学家已经开发了多种递送载体，用于保护IVTmRNA 免受细胞外RNase介导的降解并促进其进入细胞，同时改善IVTmRNA的药代动力学性质，但目前大部分递送系统仍然存在严重的不稳定性、半衰期短、转染效率低等问题。

发明内容

本发明目的是提供一种泊洛沙胺衍生物及其用于递送核酸的复合物纳米粒组合物。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案实现：

一方面，本发明提供一种末端官能团化的泊洛沙胺衍生物，其结构如式(I)所示

其代表商品名为

末端官能化衍生物，Tetronic简写为T，如

304简写为T304。其中R为X-Z或Y-Z，X的结构式如式(II)所示

Y的结构如式(III)所示

式(II)和式(III)中x、y代表中括号[]重复单元的个数，x、y取值范围为2至2000，优选2至200，更优选2至20；

当所述R为X-Z时，所述结构式(I)为

304、

701、

704、

707、

803、

901、

904、

908、末端Z官能化的泊洛沙胺衍生物，当所述R为Y-Z时，所述结构式(I)为

90R4或

150R1末端官能化的泊洛沙胺衍生物。所述末端Z官能化的泊洛沙胺衍生物表示为T904-RT、T701-R、T904-RC、T704-RT、T901-C、T304-RC、T803-RT、T304-D、 T304-RT、T904-CR、T304-T、T90R4-RT或T704-M等等。

X-Z或Y-Z中的Z代表X和Y末端官能团化对应的官能团，Z代表一端为羧基，另一端为带有氨基、巯基、1,2-二硫戊环基、酰胺、胍基、仲胺基或叔胺基的取代或未取代羧酸或其衍生物；在一些实施例中，Z具有如下结构式L-(CH₂)n₁-QCOOH(IV)，其中 L为氨基、巯基、1,2-二硫杂环戊烷基、酰胺、马来酰亚胺、胍基、仲胺基或叔胺基等亲水性基团，n₁为大于2的整数，Q为

其中：m或n₂为0、1或2， R₁或R₂各自独立的为氢、烷基或COR₂，R₂为取代烷基；在一些实施例中，m或n₂同时为零。

在一些实施例中，Z为下列化合物与结构式(I)末端羟基发生酯化反应后对应的基团；

在一些实施例中，结构式(I)代表以

304、

701、

704、

707、

803、

901、

904、

908、为基础的末端官能化的泊洛沙胺衍生物；在一些实施例中，结构式(I)代表以

90R4或

150R1为基础的末端官能化的泊洛沙胺衍生物；

在另一个方面，本发明提供了一种复合物纳米粒组合物，所述复合物纳米粒组合物包括至少一种如式(I)所示的末端官能化的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体。

在某些实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物还包括至少一种具有如下结构的脂质，本发明所述脂质是指PC、DMPC、DPPC、DSPC、DMPE、DOTAP、DOPE，其结构式下式所示：

在某些实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物还包括至少一种利于改善纳米粒体内药动学性质或利于稳定纳米粒的PEG化的两亲性高分子化合物，所述PEG化的两亲性高分子化合物为PEG2000-C-DMG、mPEG1000-C-CLS、mPEG2000-C-CLS、 mPEG5000-C-CLS、mPEG10000-C-CLS结构式如下式所示：

在一个实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物包括如式(I)所示的末端官能化的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体的一种或几种；在一些实施例中，所述复合物纳米粒组合物包括T904-RT、T701-R、T904-RC、T704-RT、T901-C、T304-RC、T803-RT、T304-D、T304-RT、T904-CR、T304-T、T90R4-RT或T704-M中的一种或几种；在一个实施例中，所述复合物纳米粒组合物由T904-RT、DSPC、DOTAP或DOPE组成；在一个实施例中，所述复合物纳米粒组合物由T704-RT、T704-RC、DOTAP或DOPE组成；在另外一些实施例中，所述复合物纳米粒组合物由T304-RT、T304-D、DSPC或 PEG2000-C-CLS组成；在另外一些实施例中，所述复合物纳米粒组合物包括T904-CR；在另一个实施方案中，所述复合物纳米粒组合物包括T904-RC；在另一个实施方案中，所述复合物纳米粒组合物包括T90R4-RT；在另一个实施方案中，所述复合物纳米粒组合物包括T704-M；在另一个实施方案中，所述复合物纳米粒组合物包括T901-C。

在一个实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物包括：1.至少一种如式(I)所示末端官能化的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体，2.至少一种本发明所述的脂质；在一个实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物包括：1.至少一种如式(I)所示的末端官能化的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体；2.至少一种本发明所述的脂质；还包括至少一种本发明所述的利于改善纳米粒体内药动学性质或起稳定纳米粒作用的PEG化两亲性高分子化合物。

在一个实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物包括摩尔比约50-100％式(I) 所示的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体:0-45％的脂质。

在一个实施方案中，本发明所述复合物纳米粒组合物包括摩尔比约50-100％式(I) 所示的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体:0-45％的脂质:0-20％PEG化的两亲性高分子化合物。

在一个实施方案中，所述复合物纳米粒组合物具有自组装形成纳米粒的功能和促进纳米粒穿过细胞膜的结构。

在一个实施方案中，所述纳米脂质组合物的中值粒径为50-200nm。

在另外的相关实施方案中，本发明还提供包括本发明所述泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体的复合物纳米粒，该复合物纳米粒还包含治疗剂。在一个实施方案中，所述治疗剂是核酸。在一个实施方案中，所述核酸是质粒、免疫刺激性寡核苷酸、单链寡核苷酸(例如IVTmRNA、反义寡核苷酸、antagomir)、双链寡核苷酸(例如siRNA)、适体或核酶。

在另一个相关的实施方案中，本发明包括含有本发明的复合物纳米粒和药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的药物组合物。

本发明提供了一种适用于一般性治疗用途的可通过系统或局部递送的改良的复合物纳米粒-核酸组合物，以及制备所述复合物纳米粒的方法和使复合物纳米粒将核酸递送至特定细胞(包括用于治疗疾病)的方法。

本发明创造的优点：

本发明提供的复合物纳米粒组合物作为核酸载体比病毒载体成本低，便于质量控制，比一般纳米载体(行业金标准ThermoFischer公司的Lipofactamine2000)转染效率高，毒性小，生物相容性好，体内有效，且制备简单。

本发明所述复合物纳米粒LLLRNA-2000主要用于体内外细胞的基因转染，可以将细胞外的基因递送至特定细胞内，使基因实现表达。本发明所述复合物纳米粒 LLLRNA-2000既可以用于科研，尤其是指用于制备基因转染试剂盒或细胞标记试剂盒，还可以用于人的新药研发，尤其是指用于mRNA肿瘤疫苗和mRNA流感病毒疫苗的开发。

附图说明

图1.不同处方的N/P比与FLuc-mRNA混合后在DC2.4细胞中的转染。

图2.不同浓度T904-CR、T304-T、T90R4-RT、T704-M复合物纳米粒在DC2.4细胞中的转染。

图3.处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7、处方8、处方9、处方10、处方11及处方12含mRNA的复合物纳米粒的动态光散射纳米粒径大小 (Intensity Mean)。

图4.处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7、处方8、处方9、处方10、处方11及处方12含mRNA的复合物纳米粒的表面电位。

图5.处方4含mRNA的复合物纳米粒的动态光散射纳米粒径分布示意图。

图6.不同处方按最佳N/P比与FLuc-mRNA混合后在DC2.4细胞中的转染。

图7.处方3按N/P＝800与FLuc-mRNA混合后在不同细胞中的转染。

图8.处方4按N/P＝400与FLuc-mRNA混合后在不同细胞中的转染。

图9.处方6按N/P＝800与FLuc-mRNA混合后在不同细胞中的转染。

图10.处方7按N/P＝1600与FLuc-mRNA混合后在不同细胞中的转染。

图11.不同处方按最佳N/P比与Luc-pDNA混合后在DC2.4细胞中的转染。

图12.不含基因处方3、处方4、处方6、处方7在DC2.4细胞中培养48h后的细胞活性。

图13.载mRNA处方3、处方4、处方6、处方7在不同细胞中培养48h后的细胞活性。

图14.不同处方按最佳N/P比与4.ug FLuc-mRNA混合后在Balb/c小鼠肌肉中的转染。

图15.处方3、处方4、处方6、处方7对应的LLLRNA-OVA-mRNA疫苗与裸mRNA 和PBS对照组在C57BL/6J小鼠肿瘤模型中的预防肿瘤治疗效果。

术语定义：

本发明使用的术语“烷基”，表示含有1至20个碳原子，饱和的直链或支链一价烃基基团，其中，所述烷基基团可以任选地被一个或多个本发明描述的取代基所取代。除非另外详细说明，烷基基团含有1-20个碳原子。在一实施方案中，烷基基团含有1-12个碳原子；在另一实施方案中，烷基基团含有1-6个碳原子；在又一实施方案中，烷基基团含有1-4个碳原子。

发明公开的化合物、包括它们的盐，也可以以它们的水合物形式或包含其溶剂(例如乙醇、DMSO，等等)的形式得到。本发明公开化合物可以与药学上可接受的溶剂(包括水)固有地或通过设计形成溶剂化物；因此，本发明旨在包括溶剂化的和未溶剂化的形式。

其异构体：术语异构体为“互变异构体”或“互变异构形式”是指具有不同能量的可通过低能垒(low energy barrier)互相转化的结构异构体。若互变异构是可能的(如在溶液中)，则可以达到互变异构体的化学平衡。例如，质子互变异构体(protontautomer)(也称为质子转移互变异构体(prototropic tautomer))包括通过质子迁移来进行的互相转化

依据起始物料和方法的选择，本发明化合物可以以可能的异构体中的一个或它们的混合物，例如外消旋体和非对应异构体混合物(这取决于不对称碳原子的数量)的形式存在。

术语“包含或包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。

除非另有说明或者上下文中有明显的冲突，本文所使用的冠词“一”、“一个(种)”和“所述”旨在包括“至少一个”或“一个或多个”。因此，本文所使用的这些冠词是指一个或多于一个(即至少一个)宾语的冠词。例如，“一组分”指一个或多个组分，即可能有多于一个的组分被考虑在所述实施方案的实施方式中采用或使用。

除非另有说明，贯穿本说明书所述的百分比是摩尔/摩尔(M/M)百分比；

具体实施方式

本发明特别地针对肿瘤等疾病模型进行了大量的mRNA疫苗递送载体研究，以提高复合物纳米粒的耐受性和治疗指数，使有效剂量的核酸进入患者体内且不伴随针对患者的显著毒性和/或风险。本发明提供一种适用于一般性治疗用途的可通过系统或局部递送的改良复合物纳米粒-核酸组合物，以及制备所述组合物的方法和在体内外使组合物将核酸递送至特定细胞(包括用于治疗疾病)的方法。

本文中显示此类组合物在mRNA和DNA水平上是有效的。此外，经显示，此类改良的组合物的活性依赖于某些脂质的存在以及制剂中各组分的摩尔比可影响活性。

如本文中所描述的，本发明的复合物纳米粒特别用于递送核酸(包括，例如IVTmRNA、 siRNA分子和质粒)。因此，本发明的复没合物纳米粒和组合物可用于通过将细胞与核酸 -复合物纳米粒相接触来在体外和体内调节靶基因和蛋白质的表达，所述核酸减少靶基因的表达(例如，siRNA)或可用于增加期望的蛋白质的表达(例如，IVTmRNA及编码所述期望的蛋白质的质粒)。

核酸-复合物纳米粒

在某些实施方案中，将本发明的复合物纳米粒与核酸组合，从而形成核酸-复合物纳米粒。在特定的实施方案中，核酸被完全封装在复合物纳米粒中。如本文中所使用的，术语“核酸”意指包括任意寡核苷酸或多核苷酸。包含达到50个核苷酸的片段通常称为寡核苷酸，更长的片段称为多核苷酸。在特定的实施方案中，本发明的寡核苷酸在长度上为15至50个核苷酸。

在本发明的上下文中，术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指由天然存在或人工合成的碱基、糖和糖间(主链)键组成的核苷酸或核苷单体的聚合物或寡聚体。术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”也包括包含非天然存在的单体的多聚体或寡聚体，或其部分，所述多聚体或寡聚体的功能相似。此类修饰的或取代的寡核苷酸因性质(诸如，例如增强的细胞吸收和在核酸酶存在的情况下增加的稳定性)而通常优于天然形式。

存在于根据本发明的核酸-复合物纳米粒中的核酸包括已知的任意形式的核酸。本文中使用的核酸可以是单链DNA或RNA或双链DNA或RNA或DNA-RNA杂交体。双链DNA的实例包括结构基因、包含控制和终止区域的基因以及自主复制的系统，诸如病毒或质粒DNA。双链RNA的实例包括siRNA和其它RNA干扰试剂。单链核酸包括，例如信使RNA(尤其是指体外转录mRNA或体外合成mRNA，IVTmRNA)、反义寡核苷酸、核酶、微RNA和形成三链的寡核苷酸。存在于本发明的核酸-复合物纳米粒中的核酸可包括下述的一种或多种寡核苷酸修饰。

本发明的核酸可以是不同的长度，通常取决于核酸的具体形式。例如，在特定的实施方案中，质粒或基因在长度上可以是约1,000至100,000个核苷酸残基。在特定的实施方案中，寡核苷酸在长度上可以在约10至100个核苷酸的范围内。在不同的相关实施方案中，单链、双链和三链的寡核苷酸在长度上可在约10至约50个核苷酸，约20 至约50个核苷酸，约15至约30个核苷酸，约20至约30个核苷酸的范围内。

在某些实施方案中，本发明涉及用于产生核酸-复合物纳米粒(其中核酸被封装在复合物纳米粒中)的方法和组合物。使用多个生物物理学参数表征此类包封IVTmRNA 的核酸-复合物纳米粒，所述参数包括：(1)材料的核磁峰位；(2)材料临界胶束浓度；(3) 纳米粒粒径大小和表面电位，通常直径小于200nm；(4)优化的综合N/P比(即纳米材料总的含氮元素的摩尔质量与核酸总的含磷元素的摩尔质量之比，具体算法为：

N/P＝(m_材料1/M_材料1+m_材料2/M_材料2+m_材料3/M_材料3+……)/(m_基因1/M_基因1+m_基因2/M_基因2+……)，

m_材料代表材料的质量，M_材料代表该材料每含有一个氮元素所含有的摩尔质量；m_基因代表基因的质量，M_基因代表该基因每含有一个磷元素所含有的摩尔质量，以此类推)；

(5)IVTmRNA或DNA在体内外转染效率。

药物组合物

本发明所述复合物纳米粒，特别地当与治疗剂缔合时，可配制为药物组合物，例如，其还包含根据施用途径和标准药学实践选择的药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，诸如生理盐水或磷酸盐缓冲液。

在特定的实施方案中，包含本发明的核酸-复合物纳米粒的药物组合物按照标准技术来制备，并且还可以包含药学上可接受的载体。通常，将生理盐水用作药学上可接受的载体。其它适当的载体包括，例如水、缓冲用水、0.9％生理盐水、0.3％甘氨酸等，包括用于增加稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等多肽。在包含盐水或其它含盐载体的组合物中，优选地在复合物纳米粒形成后加入载体。因此，在形成核酸- 复合物纳米粒组合物后，可将组合物稀释至药学上可接受的载体，例如生理盐水中。

可通过常规的公知灭菌技术对所得的药物制剂进行灭菌。然后包装水溶液以待使用或在无菌条件下将其过滤并且冻干，在施用之前将冻干的制剂与无菌水溶液组合。组合物可包含如接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。此外，复合物纳米粒可包含纳米粒保护剂，其保护纳米粒在贮存中免受自由基和超氧化破坏。亲脂性自由基淬灭剂，诸如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂(诸如铁草胺)是适当的。

本发明还以试剂盒形式提供了复合物纳米粒-治疗剂组合物。试剂盒通常由经划分用以容纳试剂盒的不同成分的容器组成。试剂盒将包括优选地以脱水或浓缩的形式装载本发明的颗粒或药物组合物，以及用于其再水化或稀释和施用的说明书。在某些实施方案中，颗粒包含活性剂，然而在其它实施方案中，它们不包含活性剂。

泊洛沙胺：

泊洛沙胺，商品名称Tetronic的四官能形式，分子是以伯羟基封端并由中间二胺连接四官能嵌段共聚物，泊洛沙胺具有以下通式结构：

本发明上下文所述末端官能化的泊洛沙胺衍生物是指末端伯羟基通过酯化反应或其他缩合反应与式(Z)所示化合物连接得到相应衍生物。

本发明所述式(I)所示的末端官能化的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体，其结构式如表1所示：

表1：T为

的缩写，如T701-R表示

701末端与式(R)所示化合物进行酯化反应获得的末端官能团化化合物。

表1中结构式中

表示省略的R基团。

现在详细描述本发明的某些实施方案，其实例由随附的结构式和化学式说明。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。

应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。

除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。

在下文中更详细地描述了本发明的用于递送核酸的泊洛沙胺衍生物的制备方法，及其复合物纳米粒组合物LLLRNA-2000的制备方法，及其复合物纳米粒用于体内外细胞转染的方法，及其递送治疗剂和调节基因及蛋白质表达的用途的不同示例性实施方案。

式(RC)所示化合物采用中国专利申请CN 103497985A方法制备获得；

本发明中式(RT)、式(CR)、式(RC)、式(R)、式(C)、式(T)、式(RT) 式(M)所示化合物均可从商业途径购买得到；

实施例1泊洛沙胺衍生物的制备方法

合成概述：

304、

701、

704、

707、

803、

901、

904、

908、

90R4和

150R1末端羟基与化合物Z末端羧基或活化羧基在碱催化下发生酯化反应，经过常规纯化方法如重结晶、沉淀析出等后处理方法即可获得。现举例如下合成步骤作为表1泊洛沙胺衍生物的合成步骤的代表。具体地也可参CN105308080B公开的方法制备，示例如下：

T304-RT的合成步骤：

称取9.447g(14.55mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取0.594g(0.36mmol)T304于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T304逐滴加入用DCC 活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸 CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物T304-O-Arg(NH₂)-Fmoc析出。称取0.331g(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸(1.60mmol)、0.20mmol T304-O-Arg(NH₂)-Fmoc和 0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸- 醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物 T304-RT充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T304-RT，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.25(m，8H)，1.32(d，36H)，1.51(m，8H)， 1.51(m，8H)，1.55(m，8H)，1.71-1.96(m，8H)，1.88(q，8H)，2.05(t，8H)，2.34(m， 4H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.5(m，4H)，2.49-2.59(m，8H)，3.34(t，8H)， 3.35(m，4H)，3.54(s，48H)，3.35-3.60(m，24H)，3.60(s，12H)，3.63(t，8H)，4.25 (t，8H)，4.51(t，4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)。

T901-C的合成步骤：

称取1.622g N,N'-羰基二咪唑(CDI,10.00mmol)加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，称取4.701g (1.00mmol)T901于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T901逐滴加入用CDI的CH₂Cl₂溶液中，反应 4h。反应完后，加入-20℃乙醚使产物T901-CDI析出，用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化。称取1.282g N,N-二(2-氨乙基)-1,3-丙二胺(8.00mmol)加CH₂Cl₂溶解，在冰浴条件下将0.8mmol T901-CDI的CH₂Cl₂溶液逐滴加入并继续反应6h，加入 -20℃乙醚使产物T901-C析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤3次，用无核酸酶的水透析后冻干得到T901-C，¹HNMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.32(d，204H)， 1.5(s，8H)，1.5(s，8H)，1.60(m，8H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.53(m， 16H)，2.62(m，8H)，2.66(m，16H)，3.28(t，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m，136H)， 3.54(s，32H)，3.60(s，68H)，3.63(t，8H)，4.20(t，8H)，6.76(s，4H)。

T304-T的合成步骤：

称取2.000g(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸(9.69mmol)加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取77.55mmol DCC和9.69mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸的 CH₂Cl₂溶液中反应24h，将其活化。称取1.998g(1.21mmol)T304于圆底烧瓶中，在 80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T304逐滴加入用DCC活化好的(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加入-20℃乙醚使产物T304-T析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6 次并进一步纯化得到T304-T， ¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.25(m，8H)， 1.32(d，36H)，1.51(q，8H)，1.66(m，8H)，1.71-1.96(m，8H)，2.32(t，8H)，2.34(m， 4H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.49-2.59(m，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m， 24H)，3.54(s，48H)，3.60(s，12H)，3.63(t，8H)，4.20(t，8H)。

T803-RT的合成步骤：

称取9.440g(14.55mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取0.199g(0.36mmol)T803于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T803逐滴加入用DCC 活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸 CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物T803-O-Arg(NH₂)-Fmoc析出。称取0.330g(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸(1.60mmol)、0.20mmol T803-O-Arg(NH₂)-Fmoc和 0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸- 醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物 T803-RT充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T803-RT，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.25(m，8H)，1.32(d，168H)，1.51(m，8H)， 1.51(m，8H)，1.55(m，8H)，1.71-1.96(m，8H)，1.88(q，8H)，2.05(t，8H)，2.34(m， 4H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.5(m，4H)，2.49-2.59(m，8H)，3.34(t，8H)， 3.35(m，4H)，3.54(s，160H)，3.35-3.60(m，112H)，3.60(s，56H)，3.63(t，8H)，4.25 (t，8H)，4.51(t，4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)。

T304-D的合成步骤：

称取1.000g 4-(二甲基氨基)丁酸(7.62mmol)加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取60.99mmol DCC和7.62mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入4-(二甲基氨基)丁酸的CH₂Cl₂溶液中反应24h，将其活化。称取1.572g(0.95mmol)T304于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T304逐滴加入用DCC活化好的4-(二甲基氨基)丁酸的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加入-20℃乙醚使产物T304-D析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T304-D，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.32(d，36H)，1.88(m，8H)，2.03(s，24H)， 2.35-2.60(m，8H)，2.46(s，4H)，2.47(s，8H)，3.04(t，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60 (m，24H)，3.54(s，48H)，3.60(s，12H)，3.63(t，8H)，4.20(t，8H)。

T904-RC的合成步骤：

称取9.445g(14.55mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC 和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取2.114g(0.36mmol)T904于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T904逐滴加入用DCC活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物 T904-O-Arg(NH₂)-Fmoc析出。称取0.742g Boc-Cys(Trt)-OH(1.60mmol)、0.20mmol T904-O-Arg(NH₂)-Fmoc和0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸-醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T904-RC充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T904-RC，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.32(d，192H)，1.4(s，4H)，1.51(m，8H)，1.88(q，8H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(s，4H)， 2.5(s，4H)，2.94-3.19(m，8H)，3.34(t，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m，128H)，3.54 (s，224H)，3.60(s，64H)，3.63(t，8H)，3.88(t，4H)，4.25(t，8H)，4.51(t，4H)， 6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)，8.76(s，8H)。

T904-CR的合成步骤：

称取0.742g Boc-Cys(Trt)-OH(1.60mmol)加重蒸过的CH₂Cl₂溶解。取12.8mmolDCC 和1.60mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Boc-Cys(Trt)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，在冰浴下反应24h。称取1.100g(0.20mmol)T904于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T904逐滴加入用 DCC活化好的Boc-Cys(Trt)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入大量氨水搅拌，随后加入-20℃乙醚中使脱去Boc保护的化合物T904-O-Cys(Trt)-NH2析出。称取0.475g(1.00mmol)Boc-Arg(Boc)2-OH、0.10mmol T904-O-Cys(Trt)-NH2和0.25mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.01mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸-醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T904-CR充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T904-CR，¹H NMR(400MHzDMSO)：1.12(d，12H)，1.32(d，192H)， 1.4(s，4H)，1.51(m，8H)，1.77(q，8H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.5(s， 4H)，3.04-3.29(m，8H)，3.21(t，4H)，3.34(t，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m，128H)， 3.54(s，224H)，3.60(s，64H)，3.63(t，8H)，4.25(t，8H)，4.74(t，4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)，8.76(s，8H)。

T90R4-R的简易合成步骤：

称取10.005g(15.41mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH2Cl2溶解，取30.82mmol DCC和1.54mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH2Cl2溶液中将其活化，反应24h。称取6.998g(0.97mmol)T90R4于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH2Cl2加入溶解。将T90R4 逐滴加入用DCC活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH CH2Cl2溶液中，反应48h。反应完后，加 95％的三氟乙酸CH2Cl2溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物 T90R4-O-Arg(NH2)-Fmoc析出。过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环 -NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T90R4-R充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T90R4-R，1H NMR(400MHz DMSO)：1.30 (d，12H)，1.32(d，192H)，1.51(m，8H)，1.88(q，8H)，2.37(s，4H)，2.5 (m，4H)，2.51(m，8H)，3.34(m，8H)，3.35-3.60(m，128H)，3.36(m，4H)， 3.46-3.71(m，8H)，3.51(m，8H)，3.52(m，288H)，3.60(m，64H)，4.97(m， 4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.76(s，8H)。

T304-RC的简易合成步骤：

称取15.729g(24.24mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取取48.48mmol DCC和2.42mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH 的C2Cl2溶液中将其活化，反应24h。称取5.001g(3.03mmol)T304于圆底烧瓶中，在 80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T304逐滴加入用DCC活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物 T304-O-Arg(NH2)-Fmoc析出。称取7.418gBoc-Cys(Trt)-OH(16.00mmol)、2.00mmol Fmoc-Arg(NH2)-O-T904和4.00mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.50mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸-醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T304-RC充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T304-RC，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.32(d， 36H)，1.4(s，4H)，1.51(m，8H)，1.88(q，8H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(s，4H)， 2.5(s，4H)，2.94-3.19(m，8H)，3.34(t，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m，24H)，3.54 (s，48H)，3.60(s，12H)，3.63(t，8H)，3.88(t，4H)，4.25(t，8H)，4.51(t，4H)， 6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)，8.76(s，8H)。

T701-R的简易合成步骤：

称取10.000g(15.41mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取30.82mmolDCC和1.54mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取3.499g(0.97mmol)T701于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T701逐滴加入用DCC活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物 T701-O-Arg(NH2)-Fmoc析出。过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M) 溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T701-R充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T701-R，¹H NMR(400MHzDMSO)：1.12(d，12H)，1.32 (d，156H)，1.51(m，8H)，1.88(q，8H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.5(t， 4H)，3.34(q，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m，104H)，3.36(m，4H)，3.54(s，16H)， 3.60(s，52H)，3.63(t，8H)，4.25(t，8H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.76(s，8H)。

T704-RC的简易合成步骤：

称取9.431g(14.54mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC 和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取2.411g(0.36mmol)T704于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T704逐滴加入用DCC活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物 T704-O-Arg(NH₂)-Fmoc析出。称取0.739g Boc-Cys(Trt)-OH(1.60mmol)、0.20mmol T704-O-Arg(NH₂)-Fmoc和0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸-醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T704-RC充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T704-RC，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.32(d，156H)，1.4(s，4H)，1.51(m，8H)，1.88(q，8H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(s，4H)， 2.5(s，4H)，2.94-3.19(m，8H)，3.34(t，8H)，3.35(m，4H)，3.35-3.60(m，104H)，3.54 (s，192H)，3.60(s，52H)，3.63(t，8H)，3.88(t，4H)，4.25(t，8H)，4.51(t，4H)， 6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)，8.76(s，8H)。

T704-RT的简易合成步骤：

称取9.440g(14.55mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取2.400g(0.36mmol)T704于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T704逐滴加入用DCC 活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸 CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物T704-O-Arg(NH₂)-Fmoc析出。称取0.332g(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸(1.60mmol)、0.20mmol T704-O-Arg(NH₂)-Fmoc和 0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸- 醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物 T704-RT充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T704-RT，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.25(m，8H)，1.32(d，156H)，1.51(m，8H)， 1.51(m，8H)，1.55(m，8H)，1.71-1.96(m，8H)，1.88(q，8H)，2.05(t，8H)，2.34(m， 4H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.5(m，4H)，2.49-2.59(m，8H)，3.34(t，8H)， 3.35(m，4H)，3.54(s，192H)，3.35-3.60(m，104H)，3.60(s，52H)，3.63(t，8H)，4.25 (t，8H)，4.51(t，4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)。

T704-M的简易合成步骤：

称取1.000g 3-马来酰亚胺基丙酸(5.91mmol)加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取47.30mmol DCC和5.91mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入3-马来酰亚胺基丙酸的CH₂Cl₂溶液中反应24h，将其活化。称取4.952g(0.74mmol)T704于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T704逐滴加入用DCC活化好的3-马来酰亚胺基丙酸的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加入-20℃乙醚使产物T704-M析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到。

T90R4-RT的简易合成步骤：

称取9.440g(14.55mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取2.610g(0.36mmol)T90R4于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T90R4逐滴加入用DCC活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物T90R4-O-Arg(NH₂)-Fmoc 析出。称取0.330g(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸(1.60mmol)、0.20mmol T90R4-O-Arg(NH₂)-Fmoc和0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸-醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物T90R4-RT充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T90R4-RT，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.25(m，8H)，1.30(t，12H)，1.32 (t，192H)，1.51(m，8H)，1.51(m，8H)，1.55(m，8H)，1.71-1.96(m，8H)，1.88(q， 8H)，2.05(t，8H)，2.34(s，4H)，2.37(s，4H)，2.49-2.59(m，8H)，2.5(t，4H)，2.51 (q，8H)，3.34(t，8H)，3.35-3.60(m，128H)，3.46-3.71(m，8H)，3.51(t，8H)，3.52(t，288H)，3.60(m，64H)，4.51(t，4H)，4.97(m，4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32 (s，4H)。

T904-RT的简易合成步骤：

称取9.441g(14.55mmol)Fmoc-Arg(Pbf)-OH加重蒸过的CH₂Cl₂溶解，取29.10mmolDCC和1.46mmol DMAP用重蒸过的CH₂Cl₂溶解，加入Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中将其活化，反应24h。称取1.998g(0.36mmol)T904于圆底烧瓶中，在80℃油浴的情况下用油泵抽真空4h，除去其中的水分，将重蒸过的CH₂Cl₂加入溶解。将T904逐滴加入用DCC 活化好的Fmoc-Arg(Pbf)-OH的CH₂Cl₂溶液中，反应48h。反应完后，加95％的三氟乙酸CH₂Cl₂溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使脱去Pbf的化合物T904-O-Arg(NH₂)-Fmoc析出。称取0.330g(±)-1,2-二硫戊环基-3-戊酸(1.60mmol)、0.20mmol T904-O-Arg(NH₂)-Fmoc和 0.40mmol TBTU加入重蒸过的DMSO溶解，再加入0.05mmol DIEA，在氮气的保护下反应3h，通过茚三酮反应进行检测。反应结束后移除溶剂，将体积比为7:1:2的三氟乙酸- 醋酸-CH₂Cl₂溶液搅拌4h，脱去Boc和Trt保护，加入-20℃乙醚使中间产物析出，过滤后加入体积比为30:9:1的浓氨水-二氧六环-NaOH(4M)溶液搅拌4h，加入-20℃乙醚使化合物 T904-RT充分析出。用布氏漏斗过滤，并用乙醚充分洗涤6次并进一步纯化得到T904-RT，¹H NMR(400MHz DMSO)：1.12(d，12H)，1.25(m，8H)，1.32(d，192H)，1.51(m，8H)， 1.51(m，8H)，1.55(m，8H)，1.71-1.96(m，8H)，1.88(q，8H)，2.05(t，8H)，2.34(m， 4H)，2.35-2.60(m，8H)，2.46(m，4H)，2.5(m，4H)，2.49-2.59(m，8H)，3.34(t，8H)， 3.35(m，4H)，3.54(s，224H)，3.35-3.60(m，128H)，3.60(s，64H)，3.63(t，8H)，4.25 (t，8H)，4.51(t，4H)，6.63(s，8H)，7.84(s，4H)，8.32(s，4H)。

本发明实施例制备得到的泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体属于两亲性的表面活性剂，其表面活性源于其分子的两亲结构，亲水基团使分子有进入水中的趋势，而憎水基团则竭力阻止其在水中溶解而从水的内部向外迁移，有逃逸水相的倾向。本发明所述泊洛沙胺衍生物及其相应的盐或其异构体具有相对较低的临界胶束浓度(criticalmicelle concentration CMC)，其测量方法与测量原理如下：

芘是芳环化合物，具有极强的疏水性，对环境的极性敏感，当聚合物浓度低于CMC时，芘微溶于水，当聚合物浓度增大到产生胶束时，芘在胶束的疏水内核富集。从荧光光谱中可以观察到芘荧光强度的变化，激发光谱发生红移，最大激发光波长从334nm偏移到337nm，从而证实其胶束行为。测量方法：

1)材料胶束的配制：精密称取10mg，加DMF溶解，滴入超声中的水中转入3500 透析袋中透析24h。离心，将胶束溶液稀释为0.1mg/ml、0.02mg/ml、0.01mg/ml、0.005mg/ml、0.002mg/ml、0.001mg/ml、0.0002mg/ml、0.0001mg/ml、0.00002mg/ml、0.00001mg/ml 的溶液。

2)精密称取30.42mg溶于丙酮中，完全溶解后，转至50ml容量瓶中定容，取10ml 至50ml容量瓶定容，得浓度为6×10^-4mol/L的芘溶液。取1ml定至10ml，取1ml定至 50ml，得6×10^-7mol/L溶液。分别向10ml容量瓶中加入1ml 1.2×10^-6mol/L芘的丙酮溶液，放入真空干燥箱中抽去丙酮，分别加入上述不同浓度的胶束溶液3ml，使芘的最终浓度为4×10^-7mol/L，振荡数次使溶液混匀，为平衡胶束与芘，混合溶液在65℃的水浴中加热1h，之后在常温下暗处放置24h。

3)用荧光分光光度计测CMC，固定发射波长为390nm，扫激发光谱280nm-360nm，带宽为5nm。I₃₃₈/I₃₃₃对lgC作图，转折点为CMC，具体数值如表2所示。

表2：末端官能团化泊洛沙胺衍生物的临界胶束浓度(critical micelleconcentration CMC)

衍生物

T904-RT

T701-R

T904-RC

T704-RT

T901-C

T304-RC

CMC(mol/L)

5.56×10-3

3.23×10-5

5.87×10-3

3.09×10-3

7.53×10-5

6.78×10-3

衍生物

T904-CR

T304-T

T90R4-RT

T704-M

T803-RT

T304-RT

CMC(mol/L)

5.03×10-3

4.49×10-3

4.51×10-3

3.21×10-3

8.67×10-4

6.69×10-3

实施例2复合物纳米粒组合物(简写为LLLRNA-2000)的制备方法

处方1：T904-RT:DSPC:DOTAP:DOPE摩尔比为32:1:6:2

先将T904-RT从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下称取，加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到储备液A；将DSPC、DOTAP和DOPE从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下按摩尔比1:6:2称取，用氯仿在室温下溶解于圆底烧瓶中。用旋转蒸发仪旋转蒸发除去氯仿，使材料混合组分紧贴于烧瓶内壁，然后将储备液A加入旋干的烧瓶中，持续超声10min；用高速剪切机剪切5min，继续以超声3秒暂停3秒的方式超声，持续超声5min；转入MWCO为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤，得到各组分摩尔比为32:1:6:2的总浓度为100mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方1。将制备好的处方1保存于4℃冰箱中待用。

处方2：T701-R:PC:DOTAP:DOPE摩尔比8:2:2:1

先将T701-R从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下称取，加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到储备液A；将PC、DOTAP和DOPE从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下按2:2:1的摩尔比用氯仿在室温下溶解于圆底烧瓶中。用旋转蒸发仪旋转蒸发除去氯仿，使材料混合组分紧贴于烧瓶内壁，然后将储备液A加入旋干的烧瓶中，以超声3秒暂停3秒的方式超声，持续超声5min；用高速剪切机剪切5min，继续以超声3秒暂停3秒的方式超声，持续超声5min；转入MWCO为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um 水性滤膜过滤，得到各组分摩尔比为8:2:2:1的总浓度为100mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方2。将制备好的处方2保存于4℃冰箱中待用。

处方3：T904-RC:T90R4-R摩尔比1:1

将T904-RC和T90R4-R从-20℃冰箱取出平衡至室温，按1:1的质量比在室温下称取加去核酸酶的超纯水混合溶解，用斡旋仪充分振荡5min，用0.22um水性滤膜过滤，制备总浓度为200mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方3。将制备好的处方3保存于4℃冰箱中待用。

处方4：T704-RT:T704-RC:DOTAP:DOPE摩尔比4:4:1:1

先将T704-RT和T704-RC从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下按质量比1:1称取，加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到储备液A；将DOTAP和 DOPE从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下按质量比1:1称取，用氯仿在室温下溶解于圆底烧瓶中。用旋转蒸发仪旋转蒸发除去氯仿，使材料混合组分紧贴于烧瓶内壁，然后将储备液A加入旋干的烧瓶中，以超声2秒暂停2秒的方式超声，持续超声5min；用高速剪切机剪切5min，继续以超声2秒暂停2秒的方式超声，持续超声5min；转入MWCO 为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤，得到各组分质量比为4:4:1:1的总浓度为150mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方4。将制备好的处方4保存于4℃冰箱中待用。

处方5：T901-C:DOTAP:DOPE:PEG2000-C-DMG质量比为16:6:2:1

先将T901-C从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下称取，加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到储备液A；将DOTAP、DOPE和PEG2000-C-DMG 从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下按质量比6:2:1称取，用乙醇在40℃下溶解，逐滴加入去核酸酶的超纯水中，超声60min，转入MWCO为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤，得到储备液B，将储备液A和储备液B按各组分质量比为16:6:2:1的比例混合，制备总浓度为100mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方5。将制备好的处方5保存于4℃冰箱中待用。

处方6：T304-RC:PC摩尔比为97:1

先将T304-RC从-20℃冰箱取出并平衡至室温，在室温下开封称取并加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到200mg/ml储备液A；将PC从-20℃冰箱取出，平衡至室温开封，用乙醇在40℃下溶解，逐滴加入去核酸酶的超纯水中，超声60min，转入MWCO为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤，得到3mg/ml的储备液B，将储备液A和储备液B按摩尔比为97:1的比例混合，即得到处方6。将制备好的处方6保存于4℃冰箱中待用。

处方7：T803-RT:DOTAP:DOPE:PEG2000-C-CLS摩尔比为18:8:2:5

先将T803-RT从-20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下称取，加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到储备液A；将DOTAP、DOPE和PEG2000-C-CLS从 -20℃冰箱取出平衡至室温，在室温下按摩尔比8:2:5称取，用乙醇在40℃下溶解，逐滴加入去核酸酶的超纯水中，超声60min，转入MWCO为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤，得到储备液B，将储备液A和储备液B按各组分摩尔比为18:8:2:5的比例混合，制备总浓度为200mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方7。将制备好的处方7保存于4℃冰箱中待用。

处方8：T304-RT:T304-D:DSPC:PEG2000-C-CLS摩尔比为60:20:1:19

先将T304-RT和T304-D从-20℃冰箱取出并平衡至室温，在室温下按3:1的摩尔比称取并加去核酸酶的超纯水溶解，用斡旋仪充分振荡5min，得到储备液A；将DSPC和PEG2000-C-CLS从-20℃冰箱取出并平衡至室温，按1:19摩尔比称取并用乙醇在40℃下溶解，逐滴加入去核酸酶的超纯水中，超声60min，转入MWCO为10000的透析袋中，用去核酸酶的超纯水透析24小时，每6小时跟换一次透析液。透析完后用0.22um水性滤膜过滤，得到储备液B。将储备液A与储备液B按 T304-RT:T304-D:DSPC:PEG2000-C-CLS摩尔比为60:20:1:19的比例混合，制备总浓度为 200mg/ml的复合物纳米粒，即得到处方8。将制备好的处方8保存于4℃冰箱中待用。

处方9：T904-CR复合物纳米粒

将T904-CR从-20℃冰箱取出平衡至室温，按10mg/ml到200mg/ml的浓度在室温下称取加去核酸酶的超纯水混合溶解，用斡旋仪充分振荡5min，用0.22um水性滤膜过滤，制备复合物纳米粒，即得到处方9。将制备好的处方9保存于4℃冰箱中待用。

处方10：T304-T复合物纳米粒

将T304-T从-20℃冰箱取出平衡至室温，按10mg/ml到200mg/ml的浓度在室温下称取加去核酸酶的超纯水混合溶解，用斡旋仪充分振荡5min，用0.22um水性滤膜过滤，制备复合物纳米粒，即得到处方10。将制备好的处方10保存于4℃冰箱中待用。

处方11：T90R4-RT复合物纳米粒

将T90R4-RT从-20℃冰箱取出平衡至室温，按10mg/ml到200mg/ml的浓度在室温下称取加去核酸酶的超纯水混合溶解，用斡旋仪充分振荡5min，用0.22um水性滤膜过滤，制备复合物纳米粒，即得到处方11。将制备好的处方11保存于4℃冰箱中待用。

处方12：T704-M复合物纳米粒

将T704-M从-20℃冰箱取出平衡至室温，按10mg/ml到200mg/ml的浓度在室温下称取加去核酸酶的超纯水混合溶解，用斡旋仪充分振荡5min，用0.22um水性滤膜过滤，制备复合物纳米粒，即得到处方12。将制备好的处方12保存于4℃冰箱中待用。

实施例3本发明复合物纳米粒表征方法

本发明涉及纳米粒径与电位是采用用Malvern Zetasizer Nano ZSE测试，在25℃条件下考察了处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7、处方8、处方9、处方10、处方11及处方12含FLuc-mRNA的复合物纳米粒的动态光散射纳米粒子的粒径大小(IntensityMean)、表面电位(Zeta Potential)及多分散性(PDI)，结果如下表 3所示：

表3：

实施例4

使用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒(ThermoFische公司)测定LLLRNA-2000各处方(处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7、处方8、处方9、处方10、处方11及处方12)对FLuc-mRNA的包封率，具体方法参考试剂盒说明书，本发明的简要处理方法为：

使用低温高速离心机将各处方在4℃，16000rpm条件下离心2.5h，收集上清液并用移液器定量其体积，记为V1；用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒测量上清中的 FLuc-mRNA的浓度，记为C1；将离心后的沉淀溶于1ml的DMSO，从中取100ul，加入200ul肝素钠溶液(6.667mg/ml)混匀，室温静置2h后，记录置换的体积V2并用 Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒测定FLuc-mRNA的浓度，记为C2；LLLRNA-2000 各处方的包载率计算公式如下：

包载率＝100％-(V1C1)/(V1C1+V2C2)×100％

本发明所述处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7、处方8、处方9、处方10、处方11及处方12的包载率分别为：86.6％、89.7％、95.0％、92.3％、90.9％、 88.3％、90.5％、88.7％、81.2％、78.4％、82.4％、83.4％。

实施例5将特定基因递送至体外培养的细胞中的方法，具体步骤如下：

1)细胞复苏

从液氮罐中取出冻存细胞，迅速置于37℃恒温水浴中，使其迅速融化后，将冻存管从水浴中取出，用酒精消毒后开启，用吸管将细胞悬液吸入离心管，并加入10倍完全培养基，混合后于1500转/min离心5min，除去上清液，用培养基重悬细胞，并接种于培养皿，放入37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，24h更换一次完全培养基。

2)细胞传代

待培养瓶中的细胞生长至约80％融和时，进行细胞传代。从培养箱中取出培养瓶，吸出完全培养基，加入PBS 10ml，轻轻摇动培养皿，使其流遍细胞表面，然后倒去，再向瓶内加入约1ml消化液(0.25％胰蛋白酶溶液或0.25％胰蛋白酶-0.03％EDTA溶液)，轻轻摇动后，消化30秒，将培养瓶置倒置显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入完全培养基终止消化。用1ml枪头吸取瓶内培养液，反复轻轻吹打皿壁细胞，使之成为单细胞悬液，将得到的细胞悬液分瓶培养。

3)细胞收集

从培养箱中取出细胞，弃去培养液，加入PBS 10ml，轻轻摇动培养瓶，使其流遍细胞表面，弃去PBS，向瓶内加入约2ml消化液(0.25％胰蛋白酶-0.03％EDTA溶液)，轻轻摇动后，消化30秒，将培养瓶置显微镜下观察，发现胞质回缩，细胞间隙增大后，立即加入含血清的培养液终止消化。用1ml枪头吸取皿内培养液，反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之成为单细胞悬液，在计数板上计数后，调节细胞悬液的浓度，待用。

4)FLuc-mRNA在体外细胞中的基因转染

将细胞悬液以4×10⁴个每孔的密度分装至96孔板，放入37℃、5％CO₂培养箱中静置培养。24h后将浓度为1ug/ul的FLuc-mRNA用去核酸酶的超纯水稀释至0.1ug/ul，按不同N/P比以每孔200ng FLuc-mRNA的浓度分别与不同浓度的处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8等体积混合，分别得到88ul含FLuc-mRNA的复合物纳米粒处方混合液，静置30min后，分别加至每孔含180ul Opti-MEM的96孔板中，以Thermofischer公司的Lipofactamine2000及其处方作为阳性对照，以不加处方和 mRNA的孔做阴性对照，每个样品重复4个孔。

给药4h后将含药培养液吸出，置换成新鲜的完全培养基。继续培养18小时后用DPBS配置浓度为25mg/ml的D-Luciferin储存液，混匀后立即使用或分装后-20℃保存。用预热好的完全培养基以1:100的比例稀释D-Luciferin，使其工作浓度为250ug/ml，吸出96孔板中的培养液。在成像前将100ul D-Luciferin工作溶液加入各96孔板，继续在 37℃孵育箱中培养5min，最后用Omega-FLuostar酶标仪成像，测试FLuc-mRNA的荧光表达强度。结果如图1所示

以每孔200ng FLuc-mRNA的浓度分别与处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8蛋白表达最高的N/P比浓度等体积混合，重复在DC2.4细胞中的转染实验。结果如下图6所示：

处方3与FLuc-mRNA按N/P比为800的浓度(每孔200ng FLuc-mRNA)参照前述体外细胞转染方式给药，测试处方3在4T1(小鼠乳腺癌细胞)、HCT116(人结肠癌肿瘤细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、Hep G2(人肝癌细胞)、 NIH/313(小鼠胚胎成纤维细胞)、HL7702(人肝正常细胞)、L929(小鼠成纤维细胞)、C2C12 (小鼠骨骼肌细胞)、RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)和DC2.4(小鼠树突状细胞)细胞中的转染实验。结果如图7所示：

处方4与FLuc-mRNA按N/P比为400的浓度(每孔200ng FLuc-mRNA)参照前述体外细胞转染方式给药，测试处方3在4T1(小鼠乳腺癌细胞)、HCT116(人结肠癌肿瘤细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、Hep G2(人肝癌细胞)、 NIH/313(小鼠胚胎成纤维细胞)、HL7702(人肝正常细胞)、L929(小鼠成纤维细胞)、C2C12 (小鼠骨骼肌细胞)、RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)和DC2.4(小鼠树突状细胞)细胞中的转染实验。结果如图8所示：

处方6与FLuc-mRNA按N/P比为800的浓度(每孔200ng FLuc-mRNA)参照前述体外细胞转染方式给药，测试处方3在4T1(小鼠乳腺癌细胞)、HCT116(人结肠癌肿瘤细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、Hep G2(人肝癌细胞)、 NIH/313(小鼠胚胎成纤维细胞)、HL7702(人肝正常细胞)、L929(小鼠成纤维细胞)、C2C12 (小鼠骨骼肌细胞)、RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)和DC2.4(小鼠树突状细胞)细胞中的转染实验。结果如图9所示：

处方7与FLuc-mRNA按N/P比为1600的浓度(每孔200ng FLuc-mRNA)参照前述体外细胞转染方式给药，测试处方3在4T1(小鼠乳腺癌细胞)、HCT116(人结肠癌肿瘤细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、Hep G2(人肝癌细胞)、 NIH/313(小鼠胚胎成纤维细胞)、HL7702(人肝正常细胞)、L929(小鼠成纤维细胞)、C2C12 (小鼠骨骼肌细胞)、RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)和DC2.4(小鼠树突状细胞)细胞中的转染实验。结果如图10所示：

实施例6Luc-pDNA在DC2.4细胞中的基因转染

将细胞悬液以4×10⁴个每孔的密度分装至96孔板，放入37℃、5％CO2培养箱中静置培养。24h后将浓度为1ug/ul的Luc-pDNA用去核酸酶的超纯水稀释至0.1ug/ul，按不同N/P比以每孔200ng Luc-pDNA的浓度分别与不同浓度的处方1、处方2、处方3、处方4、处方5、处方6、处方7及处方8等体积混合，分别得到88ul含Luc-pDNA的复合物纳米粒处方混合液，静置30min后，分别加至每孔含180ul Opti-MEM的96孔板中，以Thermofischer公司的Lipofactamine2000及其处方作为阳性对照，以不加处方和 Luc-pDNA的孔做阴性对照，每个样品重复4个孔。

给药4h后将含药培养液吸出，置换成新鲜的完全培养基。继续培养24小时后将100ul 工作溶液为250ug/ml的D-Luciferin加入各96孔板，继续在37℃孵育箱中培养5min，最后用Omega-FLuostar酶标仪成像，测试Luc-pDNA的荧光表达强度，每24小时重复测试一次，每次测试完后将含D-Luciferin的培养基吸出，加入新鲜完全培养基继续培养 24小时，重复四天。结果如图11所示：

实施例7材料毒性实验

取对数生长期DC2.4细胞，在计数板上计数后，将细胞悬液加至96孔板，使每孔的细胞浓度为4×10⁴个细胞。在培养箱继续培养24h后，吸出旧的培养基，用PBS润洗三遍，将总浓度为5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml、60mg/ml、80mg/ml、100mg/ml、 200mg/ml的处方3、处方4、处方6及处方7溶液取100μl加入每孔含有100ul完全培养基的96孔板中，以不加材料的细胞孔作阴性对照，不含细胞的CCK-8培养基孔作空白对照。继续培养48h后，吸出供试品溶液，用PBS润洗三遍，向每孔加入90μL不含血清培养基和10μl CCK-8溶液，继续在培养箱内孵育2h。用Omega-FLuostar酶标仪测定在450nm处的吸光度。

细胞活力计算公式：

细胞活力*％＝[A(加药)-A(空白)]/[A(不加药)-A(空白)]×100％

A(加药)：每孔加有DC2.4细胞、处方溶液和CCK-8溶液的吸光度

A(空白)：每孔仅加有CCK-8溶液的吸光度

A(不加药)：每孔加有DC2.4细胞和CCK-8溶液的吸光度

*细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

材料毒性实验结果如图12所示：

实施例8细胞毒性实验

将处方3、处方4、处方6和处方7分别按与FLuc-mRNA按N/P比为800、400、 800、1600浓度与FLuc-mRNA(每孔200ng FLuc-mRNA)参照前述体外细胞转染方式给药，分别测试四个处方在4T1(小鼠乳腺癌细胞)、Hela(人宫颈癌细胞)、HL7702(人肝正常细胞)、L929(小鼠成纤维细胞)、C2C12(小鼠骨骼肌细胞)和DC2.4(小鼠树突状细胞)转染中的细胞毒性。取对数生长期细胞在计数板上计数后，将细胞悬液加至96孔板，使每孔的细胞浓度为4×10⁴个细胞。分别用处方组给药，以不加处方的细胞孔作阴性对照，不含细胞的CCK-8培养基孔作空白对照。继续培养48h后，吸出供试品溶液，用 PBS润洗三遍，向每孔加入90ul不含血清培养基和10ul CCK-8溶液，继续在培养箱内孵育2h。用Omega-FLuostar酶标仪测定在450nm处的吸光度。结果如图13所示：

实施例9本发明涉及将特定基因递送至小鼠肌肉中表达的方法，具体步骤如下：

1)实验前将需要使用到的胰岛素注射器、棉签、脱毛膏、小鼠手术器械、匀胶机、DMEM培养基(不含双抗和血清)、NaCl生理盐水(9％)、超纯水、D-Luciferin(15mg/ml PBS溶液)、细胞裂解液、离心机及标记涂料等放入紫外传递窗，整个灭菌过程需要三十分钟。用脱毛膏将30只Balb/c雄鼠的大腿脱毛处理，分别标记处方一组、处方二组、处方三组、处方四组、处方五组、处方六组、处方七组、处方八组、裸mRNA组及生理盐水组，每组3只，每只两个给药位点。

2)在灭菌三十分钟后，将在安全柜配置好的含mRNA的纳米处方实验组、裸mRNA 组和PBS组递送至动物房。将小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，用胰岛素注射器在小鼠大腿股直肌处注射给药。给药剂量：每个给药位点4.0ug mRNA或含有4.0ug mRNA 的纳米制剂处方，生理盐水组不含mRNA，每个位点给药总体积为100ul，其中含50ul 等渗缓冲液(6ul9％NaCl+44ul DMEM培养基)。

3)给药18小时后，将小鼠用1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，然后用颈椎脱臼法牺牲，分别将小鼠股直肌全部取下放入离心管，做好标记，浸泡于1ml细胞裂解液中，在冰浴下用匀浆机将组织搅碎，放入-80℃冰箱过夜。将离心管取出于14000rpm高速离心，取上清液50ul至96孔板，加30ul D-Luciferin，用Omega-Fluostar酶标仪测定荧光强度。

实验结果如图14所示：

实施例10本发明LLLRNA-OVA-mRNA疫苗对荷瘤小鼠模型的治疗

1)LLLRNA-OVA-mRNA疫苗的制备：将处方3、处方4、处方6、处方7分别与OVA-mRNA(从美国TriLink公司购买获得)简单轻轻混合10分钟后分别得到由处方3、处方4、处方6、处方7制备的四种LLLRNA-OVA-mRNA疫苗；

2)对6周龄的雌性C57BL/6J小鼠用LLLRNA-OVA-mRNA疫苗(每次每只注射含有 5ug治疗剂mRNA-OVA的纳米粒疫苗，注射前用9％生理盐水缓冲液稀释)分别在第0 天、第1天、第4天、第9天通过脚掌注射的方式接种疫苗，同时将接种等体积PBS缓冲溶液和同体积等量的OVA-mRNA溶液的小鼠设定为对照组，平行每组5只小鼠。

3)将鼠源淋巴瘤细胞B16-OVA在体外扩增培养，得到B16-OVA细胞系，用DPBS 稀释备用，每只小鼠打4×10⁵个肿瘤细胞。将小鼠侧腹部脱毛，收集培养的B16-OVA肿瘤细胞，将B16-OVA肿瘤细胞皮下注射到小鼠的侧腹部，建立皮下B16-OVA肿瘤模型。从接种肿瘤后第16开始，每天测量肿瘤垂直直径。按下述公式计算C57BL/6J小鼠的肿瘤体积：V(mm3)＝x×y2/2，单位为mm，其中V代表肿瘤体积，x表示肿瘤长径，y表示肿瘤短径。同时每天用电子天平记录C57BL/6J小鼠体重的变化，并统计存活率。其考察结果如图15所示。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种泊洛沙胺衍生物，其结构如式(I)所示

其中R为X-Z或Y-Z，

X的结构式如式(II)所示

Y的结构如式(III)所示

式(II)和式(III)中x和y代表重复单元的个数，x和y的数值范围为2至20；

所述Z具有如下结构式L-(CH₂)n₁-QCOOH(IV)，其中L为氨基、巯基、1,2-二硫杂环戊烷基、酰胺基、马来酰亚胺基、胍基、仲胺基或叔胺基，n₁为大于2的整数，Q为

或NH(CH₂)_mNH；

所述Q中m或n₂为0、1或2，R₁或R₂各自独立的为氢、1至20个碳原子的烷基。

2.如权利要求1所述泊洛沙胺衍生物，其特征在于，Z为下列化合物与X或Y末端羟基发生酯化反应后对应的基团:

3.如权利要求2所述泊洛沙胺衍生物，其结构式如下所示：

式中：x为4.3、y为3.8，

式中：x为4.3、y为3.8，

式中：x为4.3、y为3.8，

式中：x为4.3、y为3.8，

式中：x为14、y为2.1，

式中：x为18.2、y为2.7，

式中：x为15、y为11，

式中：x为17、y为15，

式中：x为17、y为15，

式中：x为17、y为15，

式中：x为17、y为19，

式中：x为17、y为19，

式中：x为14、y为13，

式中：x为14、y为13，

式中：x为14、y为13，以上结构式中

表示省略的R基团。

4.一种复合物纳米粒组合物，所述复合物纳米粒组合物包括至少一种如权利要求1-3任一项所述泊洛沙胺衍生物及其相应的盐。

5.如权利要求4所述复合物纳米粒组合物，其特征在于还包括至少一种如下脂质PC、DMPC、DPPC、DSPC、DMPE、DOTAP、DOPE，其结构式如下式所示：

6.如权利要求4所述复合物纳米粒组合物，其特征在于所述复合物纳米粒组合物包括权利要求3所述的T904-RT、T701-R、T904-RC、T704-RT、T901-C、T304-D、T304-RC、T803-RT、T304-RT、T904-CR、T304-T、T90R4-RT或T704-M中的一种或几种。

7.如权利要求4所述复合物纳米粒组合物，其特征在于所述复合物纳米粒组合物包括：至少一种如权利要求1-3任一项所述泊洛沙胺衍生物及其相应的盐；至少一种权利要求5所述的脂质；还包括至少一种PEG化两亲性高分子化合物。

8.如权利要求7所述复合物纳米粒组合物，其特征在于所述PEG化的两亲性高分子化合物为PEG2000-C-DMG、mPEG1000-C-CLS、mPEG2000-C-CLS、mPEG5000-C-CLS、mPEG10000-C-CLS。

9.如权利要求5，7，8任一项所述复合物纳米粒组合物，其特征在于所述复合物纳米粒组合物包括摩尔比50-100％如权利要求1-3任一项所述泊洛沙胺衍生物及其相应的盐:0-45％的脂质。

10.如权利要求7，8任一项所述复合物纳米粒组合物，其特征在于所述复合物纳米粒组合物包括摩尔比50-100％如权利要求1-3任一项所述泊洛沙胺衍生物及其相应的盐:0-45％的脂质:0-20％PEG。

11.如权利要求10所述复合物纳米粒组合物，其还包含核酸。

12.如权利要求11所述复合物纳米粒组合物，所述核酸选自siRNA、mRNA、IVTmRNA、反义寡核苷酸、核酶、微RNA和形成三链的寡核苷酸。

13.一种药物组合物，其包括如权利要求12所述复合物纳米粒组合物和药学上稀释剂、赋形剂或载体。