JP2021087454A - Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリング Download PDF

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Abstract

【課題】ＣＲＩＳＰＲにより可能にされる多重ゲノムエンジニアリングの提供。【解決手段】種々のＣＲＩＳＰＲシステムが使用される、（例えば、タンパク質ライブラリーにおける）オープンリーディングフレームまたは細胞もしくは細胞の集団における染色体の任意のセグメント内の染色体の合理的な多重操作のための方法およびベクターが本明細書において記載される。方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９および配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を細胞に導入し、配列指向性２本鎖切断を導入するＣＲＩＳＰＲシステムの能力を使用してかかる切断をもたらすステップを含む。【選択図】なし

Description

関連出願
本出願は、米国特許法§１１９の下、２０１４年２月１１日に出願された米国仮出願第６１／９３８，６０８号の利益を請求し、その全体の教示は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
巨大なＤＮＡ構築物の合理的な操作は、現在の合成生物学にとっての中心的な課題およびゲノムエンジニアリングの取り組みである。近年、様々なテクノロジーが、この課題に取り組むために開発され、変異が生み出され得る特異性およびスピードを増大させる。加えて、適応変異は、進化の中心的な駆動するものであるが、それらの存在量、および細胞の表現型への関連のある寄与は、最も十分に研究された生物においてでさえあまり理解されていない。これは、これらの遺伝子型、および目的の表現型と相関するそれらの存在を観察し、再構築することに関連する技術的課題に大部分起因し得る。例えば、ランダム変異誘発に頼ったゲノム編集の方法は、多くの変異からなる複雑な遺伝子型をもたらし、そのそれぞれの関連のある寄与は、絡まりを解くのが難しい。さらに、対立遺伝子間のエピスタシス相互作用は、個々の変異に関する情報の欠如に起因し、割り当てることが難しい。
クラスター化規則的間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）は、多くの細菌のゲノムに存在し、適応細菌免疫において重要な役割を果たすことが見出された。これらのアレイの転写は、遺伝子抑制またはＤＮＡ切断のため、細胞においてＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ複合体のＤＮＡ標的への配列特異的結合を指向する、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを生じさせる。これらの複合体の特異性は、菌株エンジニアリングの新規ｉｎ ｖｉｖｏ適用を可能にする。
種々のＣＲＩＳＰＲシステムが使用される、オープンリーディングフレーム内（例えば、タンパク質ライブラリーを作製するために）または染色体の任意のセグメントにおける複数の遺伝子内の染色体の合理的な多重操作の方法が、本明細書において記載される。これらの方法は、従前の利用可能なものより効率的なコンビナトリアルゲノムエンジニアリングを提供する。
ＣＲＩＳＰＲの多重化能力を拡大することは、現在の技術的課題を提示し、高処理形式で合理的なライブラリーを作製するためのこれらのシステムの使用を可能にするであろう。かかる進歩は、最適な生成のための複雑な遺伝子ネットワークをリファクタリングしようとする、代謝エンジニアリングおよびタンパク質エンジニアリングの分野に対する広範な意味を有する。
方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９および配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素を細胞に導入し、配列指向性２本鎖切断を導入するＣＲＩＳＰＲシステムの能力を使用してかかる切断をもたらすステップを含む。ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９および配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素は、プラスミドなどの１つまたは複数のベクター上にコードされる細胞に導入され得る。ＤＮＡリコンビニアリングカセットまたは編集オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子座内の所望の変異、およびＣＲＩＳＰＲシステムにより認識され得る標的遺伝子座の外側の共通の位置の変異を含むよう合理的に設計され得る。記載される方法は、目的の経路を変えることを含む多くの適用のために使用され得る。
一実施形態において、方法は、（ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異などの、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、（ｉｉ）プロモーター、ならびに（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）、を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、ベクターを含む細胞を生成するステップ、（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下でベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または細胞のゲノム上にコードされ、ベクターを含みＰＡＭ変異を含まない細胞ならびにベクターおよびＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、（ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、（ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに（ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞のベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップを含む、ゲノムエンジニアリングの方法である。
別の実施形態において、方法は、（ａ）（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異などの、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、をコードするベクターを細胞の第１の集団に導入して、これにより、ベクターを含む細胞の第２の集団を生成するステップ、（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼが発現される条件下で細胞の第２の集団を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ベクター、第２のベクター、または細胞の第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、ＰＡＭ変異を含まない細胞におけるＤＮＡ切断およびかかる細胞の死をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに（ｄ）細胞の第２の集団の少なくとも１つの細胞のベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定することにより、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップを含む、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリングの方法である。
上記実施形態のいずれかは、編集オリゴヌクレオチドの集団を合成するおよび／または得るステップをさらに含み得る。いずれかの実施形態は、編集オリゴヌクレオチドの集団を増幅するステップをさらに含み得る。実施形態のいずれかにおいて、ベクターは、スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位両方をさらに含み得る。一部の実施形態において、編集カセットは、ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内の少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む。
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターも記載される。
さらなる実施形態は、
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む、編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターである。
さらなる実施形態は、
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターである。
ベクターの別の実施形態は、
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターである。
任意の実施形態において、ベクターは、スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位をさらに含み得る。変異が、少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドのものであるベクターにおいて、編集カセット変異は、例えば、ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内にあり得る。
本明細書において記載される方法により生成される細胞の集団を含むライブラリーも記載される。細胞の集団のライブラリーは、本明細書において記載されるベクターのいずれかを有する細胞を含み得る。例えば、細胞の集団は、
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含み得る。
さらなる実施形態において、細胞の集団は、
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含み得る。
さらなる実施形態において、方法は、
（ａ）（ｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する遺伝子（隣接遺伝子）における少なくとも１つのコドンの変異を有する第１の単一のＰＡＭの欠失と結合する、合理的に設計されたオリゴヌクレオチドなどの、１つまたは複数の編集オリゴヌクレオチド、および（ｂ）染色体のオープンリーディングフレームの５’にあるヌクレオチド配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、第１の細胞の集団に導入することにより（例えば、共形質転換により）、プラスミド中に組換え染色体または組換えＤＮＡなどの、組換えＤＮＡを含む、ドナーライブラリーを構築し、これにより、標的コドン変異を有する組換え染色体を含む第１の細胞の集団を含むドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）編集オリゴヌクレオチド由来の合成特性を使用し、遺伝子の３’末端の第２のＰＡＭ欠失（最終ＰＡＭ欠失）を同時に取り込む、組換え染色体の、例えば、ＰＣＲ増幅により、（ａ）において構築されたドナーライブラリーを増幅し、これにより、標的コドン変異を最終ＰＡＭ欠失に直接結合、例えば、共有結合させ、最終ＰＡＭ欠失および標的コドン変異を有する回収されたドナーライブラリーを生成するステップ、ならびに
（ｃ）最終ＰＡＭ欠失および標的コドン変異を有するドナーライブラリー、ならびに最終ｇＲＮＡプラスミドを、典型的には、ナイーブ細胞の集団である、第２の細胞の集団に導入し（例えば、共形質転換し）、これにより、標的コドン変異を含む最終ライブラリーを生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（コンビナトリアルゲノムエンジニアリング）の方法である。
第１の細胞の集団、および第２の細胞の集団（例えば、ナイーブ細胞の集団）は、典型的には、細胞が、全て同一タイプであり、これらに限定されないが、細菌、哺乳動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などの、原核生物または真核生物であり得る集団である。
一部の実施形態において、方法は、タンパク質が生成される条件下で最終ライブラリーを維持するステップをさらに含む。
一部の実施形態において、第１の細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。
一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、第１の細胞に存在する（１つ、１つまたは複数、少なくとも１つの）標的核酸に相補的である。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチド［所望のコドン］の核酸配列は、１つまたは複数の置換、欠失、挿入、または標的核酸に対する置換、欠失、および挿入の任意の組合せを含む。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、合理的に設計され、さらなる実施形態において、それらは、ランダム変異誘発または縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用することにより生成される。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する。
一部の実施形態において、ｇＲＮＡは、プラスミド上にコードされる。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、形質転換、例えば、編集オリゴヌクレオチドおよびガイド（ｇ）ＲＮＡの共形質転換により、第１の細胞に導入される。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、第１の細胞に順次導入される。他の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドおよびｇＲＮＡは、第１の細胞に同時に導入される。
一部の実施形態において、ドナーライブラリーを回収するステップは、（ａ）編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む。一部の実施形態において、ドナーライブラリーを回収するステップは、回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む。
一部の実施形態において、最終細胞／ナイーブ細胞は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドは、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される。
（ａ）（ｉ）編集オリゴヌクレオチドを含む合成ｄｓＤＮＡ編集カセット、および（ｉｉ）目的の遺伝子のすぐ上流のゲノム配列を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターを、第１の細胞の集団に、編集オリゴヌクレオチドのｇＲＮＡによる多重リコンビニアリングおよび選択的濃縮が生じる条件下で導入し（例えば、共形質転換し）、これにより、ドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）目的の遺伝子の３’末端に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（最終ＰＡＭ）を欠失する、オリゴヌクレオチドを有するドナーライブラリーを増幅し、これにより、最終ＰＡＭが欠失された（３’ＰＡＭ欠失を有する）ｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、およびＰ１部位を含む増幅されたドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｃ）増幅されたドナーライブラリーを、制限酵素（例えば、ＢｓａＩ）などの酵素で処理して、Ｐ１部位を取り除くステップ、ならびに
（ｄ）（ｃ）において処理された増幅されたドナーライブラリーおよび最終ｇＲＮＡで、ナイーブ細胞の集団を共形質転換し、これにより、最終ＰＡＭが欠失された（３’ＰＡＭ欠失を有する）ｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、および最終ｇＲＮＡを含む、共形質転換された細胞の集団を生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリングの方法も記載される。
記載される全ての実施形態において、変異は、１つもしくは複数の挿入、欠失、置換、または前述の２つもしくは３つの任意の組合せ（例えば、挿入および欠失；挿入および置換；欠失および置換；置換および挿入；挿入、欠失、および置換）などの任意の所望のタイプのものであり得る。挿入、欠失、および置換は、任意の数のヌクレオチドのものであり得る。それらは、コドン（コード領域）および／または非コード領域にあり得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む、少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、ベクターを含む細胞を生成するステップ、
（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で前記ベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または前記細胞のゲノム上にコードされ、前記ベクターを含み前記ＰＡＭ変異を含まない細胞ならびに前記ベクターおよび前記ＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、
（ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
（ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
を含む、ゲノムエンジニアリングの方法。
（項目２）
（ａ）（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
をコードするベクターを細胞の第１の集団に導入して、これにより、ベクターを含む細胞の第２の集団を生成するステップ、
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼが発現される条件下で細胞の前記第２の集団を維持するステップであって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター、第２のベクター、または細胞の前記第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、前記ＰＡＭ変異を含まない細胞におけるＤＮＡ切断およびかかる細胞の死をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
（ｄ）細胞の前記第２の集団の少なくとも１つの細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定することにより、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
を含む、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリングの方法。
（項目３）
編集オリゴヌクレオチドの集団を合成するおよび／または得るステップをさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
編集オリゴヌクレオチドの前記集団を増幅するステップをさらに含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ベクターが、スペーサーおよび／または少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記編集カセットが、前記ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内の少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
（ａ）（ｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する遺伝子（隣接遺伝子）における少なくとも１つのコドンの変異を有する第１の単一のＰＡＭの欠失と結合する、合理的に設計されたオリゴヌクレオチドなどの、１つまたは複数の編集オリゴヌクレオチド、および（ｂ）染色体のオープンリーディングフレームの５’にあるヌクレオチド配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、第１の細胞の集団に導入すること（それらにより第１の細胞の集団を共形質転換すること）により、プラスミド中に組換え染色体または組換えＤＮＡなどの組換えＤＮＡを含む、ドナーライブラリーを構築し、これにより、標的化されたコドン変異を有する組換え染色体を含む第１の細胞の集団を含むドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）前記編集オリゴ由来の合成特性を使用し、前記遺伝子の３’末端の第２のＰＡＭ欠失（最終ＰＡＭ欠失）を同時に取り込む組換えＤＮＡ（組換え染色体など）の増幅（ＰＣＲ増幅など）により、（ａ）において構築された前記ドナーライブラリーを回収し、これにより、標的化されたコドン変異を前記最終ＰＡＭ欠失に直接共有結合させ、前記最終ＰＡＭ欠失および標的化されたコドン変異を有する回収されたドナーライブラリーを生成するステップ、ならびに
（ｃ）前記最終ＰＡＭ欠失および標的化されたコドン変異を有する前記回収されたドナーライブラリー、ならびに最終ｇＲＮＡプラスミドを、ナイーブ細胞の集団に共形質転換し、これにより、標的化されたコドン変異を含む最終ライブラリーを生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（コンビナトリアルゲノムエンジニアリング）の方法。
（項目８）
タンパク質が生成される条件下で前記最終ライブラリーを維持するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
細胞の前記第１の集団が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目７または項目８に記載の方法。
（項目１０）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞に存在する標的核酸に相補的である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記編集オリゴヌクレオチドの核酸配列が、前記標的核酸に対する１つまたは複数の置換、欠失、挿入を含む、項目７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記編集オリゴヌクレオチドが合理的に設計される、項目７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記編集オリゴヌクレオチドが、縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される、項目７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記編集オリゴヌクレオチドが、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する、項目７に記載の方法。
（項目１７）
前記ｇＲＮＡがプラスミド上にコードされる、項目７に記載の方法。
（項目１８）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、形質転換により前記第１の細胞に導入される、項目７に記載の方法。
（項目１９）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に順次導入される、項目７に記載の方法。
（項目２０）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に同時に導入される、項目７に記載の方法。
（項目２１）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、（ａ）前記編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）前記編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目２２）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、前記回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目２３）
前記最終細胞／ナイーブ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目７に記載の方法。
（項目２４）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）（ｉ）編集オリゴヌクレオチドを含む合成ｄｓＤＮＡ編集カセット、および（ｉｉ）目的の遺伝子のすぐ上流のゲノム配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターを、第１の細胞の集団に、前記編集オリゴヌクレオチドのｇＲＮＡによる多重リコンビニアリングおよび選択的濃縮が生じる条件下で導入し（共形質転換し）、これにより、ドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｂ）目的の前記遺伝子の３’末端に隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（最終ＰＡＭ）を欠失する、オリゴヌクレオチドを有する前記ドナーライブラリーを増幅し、これにより、３’ＰＡＭ欠失を有するｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、およびＰ１部位を含む増幅されたドナーライブラリーを生成するステップ、
（ｃ）前記増幅されたドナーライブラリーを、ＢｓａＩで処理して、前記Ｐ１部位を取り除くステップ、ならびに
（ｄ）（ｃ）において生成された前記増幅されたドナーライブラリーおよび最終ｇＲＮＡで、ナイーブ細胞の集団を共形質転換し、これにより、３’ＰＡＭ欠失を有するｄｓＤＮＡ編集カセット、合理的なコドン変異、および最終ｇＲＮＡを含む、共形質転換された細胞の集団を生成するステップ
を含む、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリングの方法。
（項目２６）
（ｄ）において生成された共形質転換された細胞の前記集団を、タンパク質発現が生じる条件下で維持するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記第１の細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞に存在する標的核酸に相補的である、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記編集オリゴヌクレオチドが、前記第１の細胞における１つより多くの標的部位または遺伝子座を標的にする、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記編集オリゴヌクレオチドの核酸配列が、前記標的核酸に対する１つまたは複数の置換、欠失、挿入を含む、項目２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記編集オリゴヌクレオチドが合理的に設計される、項目２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記編集オリゴヌクレオチドが、縮重プライマーオリゴヌクレオチドを使用して生成される、項目２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記編集オリゴヌクレオチドが、核酸の収集物（ライブラリー）に由来する、項目２５に記載の方法。
（項目３５）
前記ｇＲＮＡがプラスミド上にコードされる、項目２５に記載の方法。
（項目３６）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、形質転換により前記第１の細胞に導入される、項目２５に記載の方法。
（項目３７）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、第１の細胞の前記集団に順次導入される、項目２５に記載の方法。
（項目３８）
前記編集オリゴヌクレオチドおよび前記ｇＲＮＡが、前記第１の細胞に同時に導入される、項目２５に記載の方法。
（項目３９）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、（ａ）前記編集オリゴヌクレオチドの取り込みについて細胞をスクリーニングするステップ、および（ｂ）前記編集オリゴヌクレオチドを取り込んだことが確認された細胞を選択するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目４０）
前記ドナーライブラリーを回収するステップが、前記回収されたドナーライブラリーを処理するステップをさらに含む、項目２５に記載の方法。
（項目４１）
前記最終細胞／ナイーブ細胞が、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有するポリペプチドを発現する、項目２５に記載の方法。
（項目４２）
Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を有する前記ポリペプチドが、誘導可能なプロモーターの制御下で発現される、項目３８に記載の方法。
（項目４３）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同である領域を含み、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む編集カセット、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ベクター。
（項目４４）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同である領域を含み、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む編集カセット、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ベクター。
（項目４５）
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含む、ベクター。
（項目４６）
（ｉ）（ａ）核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む少なくとも１つの編集カセット、
（ｉｉ）少なくとも１つのプロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）および（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ベクター。
（項目４７）
スペーサー、少なくとも２つのプライミング部位、またはスペーサーおよび少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む、項目４３〜４６のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４８）
前記編集カセットが、前記ＰＡＭ変異の１００ヌクレオチド以内に少なくとも１つのコドンの変異を含む標的領域を含む、項目４４、４６、または４７のいずれか一項に記載のベクター。
（項目４９）
項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法により生成される細胞の集団を含む、ライブラリー。
（項目５０）
項目４３〜４８のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞の集団を含む、ライブラリー。
（項目５１）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含む、細胞の集団。
（項目５２）
（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
を含むベクターを含む、細胞の集団。
（項目５３）
（ａ）（ｉ）細胞中の核酸の標的領域に相同であり、前記標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、およびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む編集カセット、
（ｉｉ）プロモーター、ならびに
（ｉｉｉ）（ａ）前記標的領域の部分に相補的な領域（ＲＮＡ）、および
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを動員する領域（ＲＮＡ）
を含む少なくとも１つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
をコードするベクターを細胞に導入して、これにより、前記ベクターを含む細胞を生成するステップ、
（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で前記ベクターを含む細胞を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、前記ベクター上にコードされるか、第２のベクター上にコードされるか、または前記細胞のゲノム上にコードされ、前記ベクターを含み前記ＰＡＭ変異を含まない細胞ならびに前記ベクターおよび前記ＰＡＭ変異を含む細胞の生成をもたらす、ステップ、
（ｃ）（ｂ）の生成物を細胞生存に適した条件下で培養し、これにより、生細胞を生成するステップ、
（ｄ）（ｃ）において生成された生細胞を得るステップ、ならびに
（ｅ）（ｄ）において得られた少なくとも１つの生細胞の前記ベクターの編集オリゴヌクレオチドを配列決定し、少なくとも１つのコドンの前記変異を同定するステップ
を含む、ゲノムエンジニアリングの方法。
図１Ａおよび１Ｂは、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（ＣＡＲＰＥ）の概略を提示する。図１Ａは、ドナーライブラリー構築の概要を示す。合成ｄｓＤＮＡ編集カセットは、目的の遺伝子の上流のゲノム配列を標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を発現するベクターと共形質転換された。共形質転換は、編集オリゴヌクレオチドの多重リコンビニアリングを介して、ドナーライブラリーを作製し、それは、ｇＲＮＡにより選択的に濃縮される。次に、ドナーライブラリーは、遺伝子の３’末端に隣接するＰＡＭ（最終ＰＡＭ）に変異導入される（欠失する）オリゴヌクレオチドを使用して、増幅された。図１Ｂは、最終タンパク質ライブラリー作製の概略を示す。ドナーライブラリーは、ＢｓａＩで処理されて、Ｐ１部位が取り除かれ、３’ＰＡＭ欠失および合理的なコドン変異を有するｄｓＤＮＡカセットのライブラリーは、最終ｇＲＮＡと共形質転換されて、最終タンパク質ライブラリーが作製された。 図２は、高い効率での編集オリゴヌクレオチドのＰ１特性の取り込み、ならびに標的化コドン位置（下線）における変異を確かにする、ｇａｌＫドナーライブラリー構築物からのクローン由来のＤＮＡ配列を提示する。Ｐ１の配列は、配列番号１により提供される。 図３Ａは、プライマー設計を示す。図３Ｂは、プライマーの数に対する予測される密度を示す。 図４Ａは、リンカーおよび構築物結果を提示する。図４Ｂは、エマルジョンＰＣＲベースの追跡に関連する１０個の編集を示す。 図４Ａは、リンカーおよび構築物結果を提示する。図４Ｂは、エマルジョンＰＣＲベースの追跡に関連する１０個の編集を示す。 図５は、代謝エンジニアリングのための合理的なタンパク質編集の概要である。 図６は、ＣＲＩＳＰＲにより濃縮された合理的なタンパク質ライブラリーの作製の概要である。 図７は、ＣＡＲＰＥの設定および実証の概要である。 図８は、反復性ＣＲＩＳＰＲ同時選択のためのストラテジーを示す。 図９は、ＣＡＲＰＥを使用した多重タンパク質エンジニアリングのためのストラテジーを提示する。 図１０は、ＣＡＲＰＥを使用したｇａｌＫドナーライブラリーの構築を示す。 図１１Ａは、ＣＡＲＰＥを使用した多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。図１１Ｂは、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリング（ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ）によるゲノムエンジニアリングを使用した、多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。 図１１Ａは、ＣＡＲＰＥを使用した多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。図１１Ｂは、追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリング（ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ）によるゲノムエンジニアリングを使用した、多重ＣＲＩＳＰＲベースの編集の概要を示す。 図１２は、ｇａｌＫの編集コドン２４のための編集カセット、プロモーター、およびスペーサーを含む、代表的なＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲベクター（構築物）を示す。 図１３は、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲを使用した、ｇａｌＫ編集の結果を示す。上部のパネルは、ｇａｌＫコドン２４編集ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲベクターで形質転換された細胞由来の染色体およびベクター（プラスミド）のＤＮＡ配列決定結果を示し、これは、ベクター上の編集カセット（オリゴヌクレオチド）が、所望のゲノム編集（変異）の高い効率での追跡を可能にする「トランス−バーコード」として配列決定され得ることを示している。下部のパネルは、編集されていない野生型表現型（赤色）を示す、細胞のＤＮＡ配列決定クロマトグラフを示す。方法は、野生型、編集されていない対立遺伝子および編集／変異導入された対立遺伝子の両方を有する、複数の染色体を有する細胞の同定を可能にする。 図１４Ａ〜１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの概要を示す。図１４Ａは、設計構成要素の概略を示す。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、細胞ゲノムにおける特定の部位を標的にし、ｄｓＤＮＡ切断を生じさせるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を含有する。標的領域に相補的な相同性の領域は、ＰＡＭおよび他の近くの所望の部位に変異導入される。組換えを起こす細胞は、高い存在量に選択的に濃縮される。ベクターにおけるＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ編集カセットの配列決定は、ゲノム編集／変異の追跡を可能にする。図１４Ｂは、コドン１４５におけるＥ．ｃｏｌｉ ｇａｌＫ遺伝子のための編集カセット設計の例を示す。ＰＡＭは、最も近くの利用可能なＰＡＭ位置における同義の変化のため作られ得る、最も近くの利用可能なＰＡＭ変異で欠失される。これは、ＰＡＭ欠失部位における１〜２ヌクレオチドの「サイレント痕（ｓｉｌｅｎｔ ｓｃａｒ）」を有する変異誘発を可能にする。図１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットが、アレイベースの合成方法を使用して合成され得ること、これにより、ゲノムワイドスケールの何千もの変異の系統的標的化、および適合の同時評価のため、少なくとも１０４〜１０６カセットの並行合成を可能にすることを示す。 図１４Ａ〜１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの概要を示す。図１４Ａは、設計構成要素の概略を示す。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、細胞ゲノムにおける特定の部位を標的にし、ｄｓＤＮＡ切断を生じさせるためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列を含有する。標的領域に相補的な相同性の領域は、ＰＡＭおよび他の近くの所望の部位に変異導入される。組換えを起こす細胞は、高い存在量に選択的に濃縮される。ベクターにおけるＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ編集カセットの配列決定は、ゲノム編集／変異の追跡を可能にする。図１４Ｂは、コドン１４５におけるＥ．ｃｏｌｉ ｇａｌＫ遺伝子のための編集カセット設計の例を示す。ＰＡＭは、最も近くの利用可能なＰＡＭ位置における同義の変化のため作られ得る、最も近くの利用可能なＰＡＭ変異で欠失される。これは、ＰＡＭ欠失部位における１〜２ヌクレオチドの「サイレント痕（ｓｉｌｅｎｔ ｓｃａｒ）」を有する変異誘発を可能にする。図１４Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットが、アレイベースの合成方法を使用して合成され得ること、これにより、ゲノムワイドスケールの何千もの変異の系統的標的化、および適合の同時評価のため、少なくとも１０４〜１０６カセットの並行合成を可能にすることを示す。 図１５Ａは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲベクターの概略を示す。図１５Ｂは、ＰＡＭ変異および変異導入されるコドンが１７ヌクレオチドだけ離れた、Ｅ．ｃｏｌｉ ｇａｌＫ遺伝子におけるＹ１４５＊変異の作製のための代表的なＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの部分を示す。代表的なＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲの部分の核酸配列は、配列番号２８により提供され、リバース相補体は、配列番号３３により提供される。 図１６Ａ〜１６Ｃは、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ設計のための対照を提示する。図１６Ａは、方法の効率に対する編集カセットのサイズの効果を示す。図１６Ｂは、方法の効率に対するＰＡＭ変異／欠失と所望の変異の間の距離の効果を示す。図１６Ｃは、方法の効率に対するＭｕｔＳシステムの存在または不存在の効果を示す。
詳細な説明
細菌および古細菌ＣＲＩＳＰＲシステムは、正確なゲノム編集のための強力な新規ツールとして現れた。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特に十分に特徴付けられ、単純な設計規則が、その２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）結合活性をリプログラミングするために確立された（Jinekら、Science（２０１２年）、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁）。ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集法の使用は、細菌（Congら、Science（２０１３年）、３３９巻（６１２１号）：８１９〜８２３頁）、Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（DiCarloら、Nucleic Acids Res.（２０１３年
）４１巻：４３３６〜４３４３頁）、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ（Waaijersら、Genetics（２０１３年）、１９５巻：１１８７〜１１９１頁）、および種々の哺乳動物細胞株（Congら、Science（２０１３年）、３３９巻（６１２１号）：８１９
〜８２３頁、Wangら、Cell（２０１３年）、１５３巻：９１０〜９１８頁）を含む、広範な生物における文献において急速に蓄積されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミングヌクレアーゼ、およびＴＡＬＥＮＳのなどの、他のエンドヌクレアーゼベースのゲノム編集技術同様、ＣＲＩＳＰＲシステムの正確なゲノム編集を媒介する能力は、標的認識の高度に特異的な性質から生じる。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓシステム由来のＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と１４〜１５塩基対認識標的の間の完全な相補性を要求し、これは、ＣＲＩＳＰＲシステムの免疫機能が、自然に利用されることを示唆している（Jinekら、Science（２０１２年）、３３７巻（６０９６号）：８１６〜８２１頁、Brounsら、Science（２００８年）、３２１巻：９６０〜９６４頁、Semenovaら、ＰＮＡＳ（２
０１１年）、１０８巻：１００９８〜１０１０３頁）。
ｃａｓ９遺伝子によりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼなどのエンドヌクレアーゼを利用して、定向ゲノム進化を行い／ゲノムＤＮＡなどのＤＮＡにおいて変化（欠失、置換、付加）を生成するゲノム編集の方法が、本明細書において記載される。ｃａｓ９遺伝子は、任意の供給源から、例えば細菌Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓなどの細菌から得られ得る。ｃａｓ９の核酸配列、および／またはＣａｓ９のアミノ酸配列は、天然に存在するｃａｓ９および／またはＣａｓ９の配列に対して、変異導入され得、変異は、例えば、１つもしくは複数の挿入、欠失、置換、または前述の２つもしくは３つの任意の組合せであり得る。かかる実施形態において、得られた変異導入Ｃａｓ９は、天然に存在するＣａｓ９と比較して、増強されたまたは低減したヌクレアーゼ活性を有し得る。
図１Ａ、１Ｂ、および１１Ａは、ＣＲＩＳＰＲに支援される合理的なタンパク質エンジニアリング（ＣＡＲＰＥ）と称される、ＣＲＩＳＰＲにより媒介されるゲノム編集法を提示する。ＣＡＲＰＥは、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）編集カセット由来の指向性変異を直接ゲノムに取り込む、「ドナー」ライブラリーおよび「最終」ライブラリーの作製に依存する２段階の構築プロセスである。ドナー構築の第１の段階（図１Ａ）において、合理的に設計された編集オリゴは、目的のオープンリーディングフレームの５’にある配列または他の配列などの、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズする／標的にするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と共に細胞に共形質転換される。ＣＡＲＰＥの鍵となる技術革新は、隣接遺伝子における１つまたは複数の所望のコドンの変異を有する単一のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の欠失または変異を結合させ、これにより、１回の形質転換において完全なドナーライブラリーの作製を可能にする編集オリゴヌクレオチドの設計にある。次に、ドナーライブラリーは、編集オリゴヌクレオチド由来の合成特性を使用する、組換え染色体の増幅により（例えば、ＰＣＲ反応により）回収され、第２のＰＡＭ欠失または変異が、遺伝子の３’末端において同時に取り込まれる。従って、このアプローチは、コドン標的化変異を直接ＰＡＭ欠失に共有結合させる。ＣＡＲＰＥの第２の段階（図１Ｂ）において、最終ＰＡＭ欠失／変異、および標的化変異（１つまたは複数のコドンにおける１つまたは複数のヌクレオチドなどの、１つまたは複数のヌクレオチドの所望の変異）を有するＰＣＲにより増幅されたドナーライブラリーは、最終ｇＲＮＡベクターでナイーブ細胞に共形質転換されて、合理的に設計されたタンパク質ライブラリーを発現する細胞の集団が生み出される。
ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、ＣＲＩＳＰＲトランス活性化（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびスペーサーＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、標的領域の選択をガイドする。本明細書において使用される場合、標的領域は、少なくとも１つのコドン（１つまたは複数のコドン）における少なくとも１つのヌクレオチドの変異などの、少なくとも１つのヌクレオチドの変異が所望される、細胞または細胞の集団の核酸における任意の遺伝子座を指す。標的領域は、例えば、ゲノム遺伝子座（標的ゲノム配列）または染色体外遺伝子座であり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、単一のガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、またはｇＲＮＡと称される、単一のキメラＲＮＡ分子として表され得る。ｇＲＮＡの核酸配列は、標的領域の領域に相補的である、第１の領域とも称される第１の核酸配列、およびステムループ構造を形成し、Ｃａｓ９を標的領域に動員するよう機能する、第２の領域とも称される第２の核酸配列を含む。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、標的ゲノム配列の上流の領域に相補的である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、標的領域の少なくとも一部に相補的である。ｇＲＮＡの第１の領域は、標的ゲノム配列に完全に相補的（１００％相補的）であり得るか、または１つもしくは複数のミスマッチを含み得、但し、それは、Ｃａｓ９に特異的にハイブリダイズ／ガイドし、動員するのに、標的ゲノム配列に十分に相補的である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｇＲＮＡの第１の領域は、少なくとも２０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、第２の核酸配列により形成されるステムループ構造は、少なくとも５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ステムループ構造は、８０〜９０または８２〜８５ヌクレオチド長であり、さらに特定の実施形態において、ステムループ構造を形成する、ｇＲＮＡの第２の領域は、８３ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、ＣＡＲＰＥ法を使用して、第１の細胞に導入される（ドナーライブラリーの）ｇＲＮＡの配列は、第２の細胞／ナイーブ細胞に導入される（最終ライブラリーの）ｇＲＮＡの配列と同一である。一部の実施形態において、１つより多くのｇＲＮＡは、第１の細胞の集団、および／または第２の細胞の集団に導入される。一部の実施形態において、１つより多くのｇＲＮＡ分子は、１つより多くの標的領域に相補的である、第１の核酸配列を含む。
ＣＡＲＰＥ法において、記載される方法において使用するための、編集オリゴヌクレオチドとも称される、２本鎖ＤＮＡカセットは、多くの供給源から得られるか、またはそれに由来し得る。例えば、一部の実施形態において、ｄｓＤＮＡカセットは、非相同なランダム組換え（ＮＲＲ）により多様化された核酸ライブラリーに由来し、かかるライブラリーは、ＮＲＲライブラリーと称される。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、例えば、アレイベースの合成により合成される。編集オリゴヌクレオチドの長さは、編集オリゴヌクレオチドを得る際に使用される方法に依存し得る。一部の実施形態において、編集オリゴヌクレオチドは、およそ５０〜２００ヌクレオチド、７５〜１５０ヌクレオチド、または８０〜１２０の間のヌクレオチド長である。
編集オリゴヌクレオチドは、（ａ）細胞の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンの変異（所望の変異と称される）を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む。ＰＡＭ変異は、ＣＲＩＳＰＲシステムによりもはや認識されないように、ＰＡＭの配列を変異する、１つまたは複数のヌクレオチドの任意の挿入、欠失、または置換であり得る。かかるＰＡＭ変異を含む細胞は、ＣＲＩＳＰＲにより媒介される殺傷に対する「免疫」であると言われ得る。標的領域の配列に関連する所望の変異は、標的領域の少なくとも１つのコドンにおける１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換であり得る。
ＣＡＲＰＥ法は、説明のみの目的のため、細菌の遺伝子に関連して以下で記載される。方法は、細菌および古細菌を含む任意の原核生物由来の遺伝子、または酵母および哺乳動物（ヒトを含む）を含む任意の真核生物由来の遺伝子を含む、目的の任意の遺伝子に適用され得る。ＣＡＲＰＥ法は、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるｇａｌＫ遺伝子において行われ、これは、部分的には、この遺伝子についての活性アッセイの利用可能性に起因している。方法を、ＢＷ２３１１５親株、およびリコンビニアリングを媒介するｐＳＩＭ５ベクター（Dattaら、Gene（２００８年）、３７９巻：１０９〜１１５頁）を使用して行った。
ｃａｓ９遺伝子は、アラビノースの添加により切断活性の制御を可能にするｐＢＡＤプロモーターの制御下でｐＢＴＢＸ−２骨格にクローニングされた。合成ｄｓＤＮＡカセット（１２７ｂｐ）を選択的に取り込む能力の評価は、縮重プライマーから、および／またはマイクロアレイ技術を介して２７，０００個のメンバーライブラリーの一部として合成された合理的に設計されたオリゴヌクレオチド（オリゴ）から構築された、ＮＮＫライブラリー由来のｄｓＤＮＡカセットを使用して行われた。両方の場合において、オリゴヌクレオチドは、ｇａｌＫ遺伝子産物の活性部位残基に変異導入されるよう設計された。ドナー株ライブラリーの高度に効率的なリカバリーは、ｇａｌＫ遺伝子座において指向されたプライマーで得られる増幅産物サイズの変化に基づき検証された。ＮＲＲライブラリー由来のこれらのコロニーＰＣＲ産物の配列決定は、ｄｓＤＮＡカセット由来の合成プライミング部位（Ｐ１）が、効率約９０〜１００％で取り込まれたことを示した。これは、これらのライブラリーが、他のリコンビニアリングベースの編集アプローチにおいて典型的に使用されているエラープローンｍｕｔＳノックアウト株に依存することなく、高い効率で作製され得ることを示した（Costantinoら、ＰＮＡＳ（２００３年）、１００巻：１５７４８〜１５７５３頁、Wangら、Nature（２００９年）、４６０巻：８９４〜８９８頁）。コドン変異の効率の下降（約２０％）が存在し、それは、対立遺伝子置換中のｍｕｔＳ補正に起因し得る。最終ライブラリーにおけるクローンの予備的評価は、最終コドン編集効率が、構築の両方の相が、ｍｕｔＳ＋バックグラウンドにおいて行われるとき、約１０％であったことを示した。
同時選択可能な編集についての他の最近公開されたプロトコールとの比較は、ＰＡＭおよびコドン変異を共有結合させないが、代わりに複製中に互いに近接することによる、代替のプロトコールを使用して行われた（Wangら、Nat. Methods（２０１２年）、９巻：
５９１〜５９３頁）。これらの非共有結合的実験において、上と同一の編集オリゴが使用され、同一のドナー／最終ＰＡＭ部位を標的にするｓｓＤＮＡオリゴを使用して、それらの挿入について同時選択するための努力がなされた。得られた変異体のコロニースクリーニングは、ＰＡＭ変異体のリカバリーにおける高い効率を明らかにする。しかしながら、これらは、ｄｓＤＮＡ編集カセットの挿入についての強力な同時選択でないように思われる。これは、ＰＡＭ欠失オリゴヌクレオチドの相対的リコンビニアリング効率の大きな差、およびかなり多い染色体欠失を生み出す編集カセットに起因し得る。
ＣＡＲＰＥ法の最終編集効率を改善する能力は、ドナー構築相中に変異の喪失を防ぐ努力において野生型ドナー株に導入される前に、例えば、ｍｕｔＳ欠損株においてドナー構築を行うことにより、評価され得る。加えて、ＣＡＲＰＥ法の一般性は、例えば、ｄｘｓ、ｍｅｔＡ、およびｆｏｌＡを含む、いくつかの必須遺伝子においてＣＡＲＰＥを利用することにより、評価され得る。必須遺伝子は、記載されるｇＲＮＡ設計ストラテジーを使用して、有効に標的化された。結果はまた、ドナーライブラリー作製中に生じる遺伝子破壊にも関わらず、ドナーライブラリーが有効に構築され、リコンビニアリングの１〜３時間後以内に回収され得ることを示す。
追跡可能なＣＲＩＳＰＲ濃縮リコンビニアリングによるゲノムエンジニアリング（ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ）と称されるＣＲＩＳＰＲにより媒介されるシステムを使用した、追跡可能な、正確なゲノム編集のための方法も、本明細書において提供される。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法は、編集カセットおよびｇＲＮＡ両方をコードする単一のベクターを使用して、高い効率の編集／変異導入を達成する。アレイベースのＤＮＡ合成などの、並行ＤＮＡ合成で使用されるとき、ＧＥＮ−ＴｒａＣＥＲは、何千もの正確な編集／変異の単一ステップの作製を提供し、細胞のゲノム（ゲノムＤＮＡ）の配列決定よりむしろ、ベクター上の編集カセットを配列決定することにより、変異をマッピングすることを可能にする。方法は、タンパク質およびゲノムエンジニアリング適用における、ならびに実験室の革新的実験において同定される変異などの、変異の再構築についての広範な有用性を有する。
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法およびベクターは、所望の変異およびＰＡＭ変異を含む編集カセットを、単一のベクター上のｇＲＮＡをコードする遺伝子と組み合わせ、それは、１回の反応において変異のライブラリーの作製を可能にする。図１１Ｂにおいて示される通り、方法は、所望の変異およびＰＡＭ変異を含む編集カセットを含むベクターを、細胞または細胞の集団に導入することを伴う。一部の実施形態において、ベクターが導入される細胞はまた、Ｃａｓ９もコードする。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、細胞または細胞の集団にその後導入される。細胞または細胞集団において、Ｃａｓ９およびｇＲＮＡを含む、ＣＲＩＳＰＲシステムの発現が活性化され、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９を、ｄｓＤＮＡ切断が生じる標的領域に動員する。任意の特定の理論により拘束されることを望まないが、標的領域に相補的な編集カセットの相同な領域は、ＰＡＭおよび標的領域の１つまたは複数のコドンに変異導入される。ＰＡＭ変異が組み込まれていない細胞の集団の細胞は、Ｃａｓ９により媒介されるｄｓＤＮＡ切断に起因する、編集されていない細胞の死を起こす。ＰＡＭ変異が組み込まれている細胞の集団の細胞は、細胞死を起こさず、それらは、生存可能なままであり、高い存在量に選択的に濃縮される。生細胞が得られ、標的変異のライブラリーを提供する。
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲを使用した追跡可能なゲノム編集の方法は、（ａ）少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡをコードするベクターを、細胞または細胞の集団に導入し、これにより、ベクターを含む細胞または細胞の集団（細胞の第２の集団）を生成するステップ、（ｂ）Ｃａｓ９が発現される条件下で、細胞の第２の集団を維持するステップであって、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、ベクター、第２のベクター、または細胞の第２の集団の細胞のゲノム上にコードされ、ＤＮＡ切断、およびＰＡＭ変異を含まない細胞の第２の集団の細胞の死をもたらし、一方、ＰＡＭ変異を含む細胞の第２の集団の細胞は、生存可能である、ステップ、（ｃ）生細胞を得るステップ、ならびに（ｄ）細胞の第２の集団の少なくとも１つの細胞におけるベクターの編集カセットを配列決定して、少なくとも１つのコドンの変異を同定するステップを含む。
一部の実施形態において、ｃａｓ９をコードする別々のベクターはまた、細胞または細胞の集団に導入される。ベクターを細胞または細胞の集団に導入することは、当該技術分野において公知の任意の方法または技術を使用して行われ得る。例えば、ベクターは、化学的形質転換およびエレクトロポレーションを含む形質転換、形質導入、ならびに微粒子銃などの、標準的プロトコールにより導入され得る。
編集カセットは、（ａ）細胞または細胞の集団における核酸の標的領域を認識し（それにハイブリダイズし）、細胞の核酸の標的領域に相同であり、標的領域に対する少なくとも１つのコドンにおける少なくとも１つのヌクレオチドの変異（所望の変異と称される）を含む領域、および（ｂ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）変異を含む。ＰＡＭ変異は、変異導入されたＰＡＭ（ＰＡＭ変異）が、ＣＲＩＳＰＲシステムにより認識されないように、ＰＡＭの配列に変異導入する１つまたは複数のヌクレオチドの任意の挿入、欠失、または置換であり得る。例えば、ＰＡＭ変異を含む細胞は、ＣＲＩＳＰＲにより媒介される殺傷に対する「免疫」であると言われ得る。標的領域の配列に関連する所望の変異は、標的領域の少なくとも１つのコドンにおける１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換であり得る。一部の実施形態において、ＰＡＭ変異と所望の変異の間の距離は、編集カセット上の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＰＡＭ変異は、編集カセットの末端から少なくとも９ヌクレオチドに位置する。一部の実施形態において、所望の変異は、編集カセットの末端から少なくとも９ヌクレオチドに位置する。
一部の実施形態において、標的領域の配列に関連する所望の変異は、核酸配列の挿入である。標的領域に挿入された核酸配列は、任意の長さのものであり得る。一部の実施形態において、挿入された核酸配列は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または少なくとも２０００ヌクレオチド長である。核酸配列が標的領域に挿入される実施形態において、編集カセットは、少なくとも３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または少なくとも６０ヌクレオチド長であり、標的領域に相同である、領域を含む。
用語「ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセット」は、編集カセット、プロモーター、スペーサー配列、およびｇＲＮＡをコードする遺伝子の少なくとも部分を指すために使用され得る。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセット上のｇＲＮＡをコードする遺伝子の部分は、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分をコードする。一部の実施形態において、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または少なくとも３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分は、２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、少なくとも２つのプライミング部位をさらに含む。一部の実施形態において、プライミング部位を使用して、例えば、ＰＣＲにより、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットが増幅され得る。一部の実施形態において、標的領域に相補的であるｇＲＮＡの部分は、プライミング部位として使用される。
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法において、記載される方法における使用のための編集カセットおよびＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、多くの供給源から得られるか、またはこれに由来し得る。例えば、一部の実施形態において、編集カセットは、例えば、アレイベースの合成により合成される。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、例えば、アレイベースの合成により合成される。編集カセットおよび／またはＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットの長さは、編集カセットおよび／またはＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットを得る際に使用される方法に依存し得る。一部の実施形態において、編集カセットは、およそ５０〜３００ヌクレオチド、７５〜２００ヌクレオチド、または８０〜１２０の間のヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、およそ５０〜３００ヌクレオチド、７５〜２００ヌクレオチド、または８０〜１２０の間のヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、方法はまた、例えば、アレイベースの合成により、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットを得ること、およびベクターを構築することも伴う。ベクターを構築する方法は、当業者に公知であり、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットをベクターにライゲーションすることを伴い得る。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットまたはＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットのサブセット（プール）は、ベクターの構築に先立ち、例えば、ＰＣＲにより増幅される。
ベクターを含み、Ｃａｓ９もコードする細胞または細胞の集団は、Ｃａｓ９が発現される条件下で維持されるか、または培養される。Ｃａｓ９発現は制御され得る。本明細書において記載される方法は、Ｃａｓ９発現が活性化され、Ｃａｓ９の生成をもたらす条件下で細胞を維持することを伴う。Ｃａｓ９が発現される具体的な条件は、Ｃａｓ９発現を調節するために使用されるプロモーターの性質などの、要因に依存するであろう。一部の実施形態において、Ｃａｓ９発現は、アラビノースなどの、インデューサー分子の存在下において誘導される。Ｃａｓ９をコードするＤＮＡを含む細胞または細胞の集団が、インデューサー分子の存在下にあるとき、Ｃａｓ９の発現が生じる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９発現は、リプレッサー分子の存在下で抑制される。Ｃａｓ９をコードするＤＮＡを含む細胞または細胞の集団が、Ｃａｓ９の発現を抑制する分子の不存在下にあるとき、Ｃａｓ９の発現が生じる。
生存可能なままの細胞の集団の細胞は、Ｃａｓ９により媒介される殺傷の結果として編集されていない細胞の死を起こす細胞から得られるか、または分離され、これは、例えば、細胞の集団を培養物表面に広げて生細胞の成長を可能にすることにより行われ得、それは、次に、評価のため利用可能である。
ＰＡＭ変異に結合した所望の変異は、集団の生細胞（ＰＡＭ変異が組み込まれている細胞）中のベクター上の編集カセットを配列決定することにより、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法を使用して追跡可能である。これは、細胞のゲノムを配列決定する必要なく、変異の容易な同定を可能にする。方法は、編集カセットを配列決定して、１つより多くのコドンの変異を同定することを伴う。ベクターの成分としての、またはベクターからの分離および任意選択で増幅の後、編集カセットの配列決定が行われ得る。配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ配列決定などの、当該技術分野において公知の任意の配列決定法を使用して、行われ得る。
本明細書において記載される方法は、原核細胞および真核細胞を含む、ＣＲＩＳＰＲシステムが機能し得る（例えば、ＤＮＡを標的化し、切断する）任意のタイプの細胞において行われ得る。一部の実施形態において、細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐｐ．（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）などの、細菌細胞である。他の実施形態において、細胞は、酵母細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの、真菌細胞である。他の実施形態において、細胞は、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞である。
「ベクター」は、所望の配列、または細胞に送達されるべき、もしくは細胞において発現されるべき配列を含む様々な核酸のいずれかである。所望の配列は、例えば、制限およびライゲーションにより、または組換えにより、ベクターにおいて含まれ得る。ＲＮＡベクターも利用可能であるが、ベクターは、典型的にＤＮＡで構成される。ベクターは、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、および人工染色体を含むが、これらに限定されない。
ＧＥＮ−ＴｒａＣＥＲ法において有用なベクターは、本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、およびｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。一部の実施形態において、１つより多くの編集カセット（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超の編集カセット）は、ベクター上に含まれる。一部の実施形態において、１つより多くの編集カセットは、異なる標的領域と相同である（例えば、異なる編集カセットが存在し、それぞれが、異なる標的領域と相同である）。あるいは、または加えて、ベクターは、１つより多くのｇＲＮＡ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超のｇＲＮＡ）をコードする１つより多くの遺伝子を含んでもよい。一部の実施形態において、１つより多くのｇＲＮＡは、異なる標的領域の部分に相補的である領域を含有する（例えば、異なるｇＲＮＡが存在し、それぞれが、異なる標的領域の部分に相補的である）。
一部の実施形態において、少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、およびｇＲＮＡの部分をコードする遺伝子を含む、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットは、ｇＲＮＡの別の部分をコードするベクターにライゲーションされる。ライゲーションの際、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセット由来のｇＲＮＡの部分およびｇＲＮＡの他の部分がライゲーションされて、機能性ｇＲＮＡが形成される。
プロモーターおよびｇＲＮＡをコードする遺伝子は、作動可能に連結される。一部の実施形態において、方法は、Ｃａｓ９をコードする第２のベクターの導入を含む。かかる実施形態において、ベクターは、Ｃａｓ９をコードする遺伝子に作動可能に連結した１つまたは複数のプロモーターをさらに含み得る。本明細書において使用される場合、「作動可能に」連結したは、プロモーターが、ｇＲＮＡをコードする遺伝子、またはＣａｓ９をコードする遺伝子などの、遺伝子をコードするＤＮＡの転写に影響するか、または調節することを意味する。プロモーターは、天然のプロモーター（ベクターが導入される細胞に存在するプロモーター）であり得る。一部の実施形態において、プロモーターは、分子（例えば、インデューサーまたはリプレッサー）の存在または不存在により調節されるプロモーターなどの、誘導可能または抑制可能なプロモーターである（プロモーターは調節されて、ｇＲＮＡをコードする遺伝子、またはＣａｓ９をコードする遺伝子などの、遺伝子の誘導可能または抑制可能な転写を可能にする）。ｇＲＮＡの発現に必要とされるプロモーターの性質は、種または細胞タイプに基づき変動し得、当業者に認識されるであろう。
一部の実施形態において、方法は、本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡを含むベクターの導入前またはそれと同時に、Ｃａｓ９をコードする別個のベクターを、細胞または細胞の集団に導入するステップを含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、細胞または細胞の集団のゲノムに組み込まれる。Ｃａｓ９をコードするＤＮＡは、本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡを含むベクターの導入前、または本明細書において記載される少なくとも１つの編集カセット、プロモーター、および少なくとも１つのｇＲＮＡを含むベクターの導入後に、細胞のゲノムに組み込まれ得る。あるいは、Ｃａｓ９をコードするＤＮＡなどの、核酸分子は、ゲノムに組み込まれたＤＮＡから発現され得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードする遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれる。
本明細書において記載されるＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法において有用なベクターは、スペーサー配列、２つもしくはそれ超のプライミング部位、またはスペーサー配列および２つもしくはそれ超のプライミング部位の両方をさらに含み得る。一部の実施形態において、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットに隣接するプライミング部位の存在は、編集カセット、プロモーター、およびｇＲＮＡ核酸配列の増幅を可能にする。
（実施例１）
ｇａｌＫを編集するためのＣＡＲＰＥ法の使用
ＣＡＲＰＥアプローチを、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるガラクトキナーゼ遺伝子ｇａｌＫ上で行った。遺伝子産物の活性を評価するために多くの利用可能なアッセイが存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＷ２３１１５親株、およびリコンビニアリングを媒介するｐＳＩＭ５ベクター（Dattaら、Gene（２００８年）、３７９巻：１０９〜１１５頁）を使用して、
実験を行った。アラビノースの培養培地への添加による、Ｃａｓ９切断活性の制御を可能にするためのｐＢＡＤプロモーターの制御下で、ｐＢＴＢＸ−２骨格にＣａｓ９をコードする遺伝子をクローニングした。
第一に、合成ｄｓＤＮＡカセット（１２７ｂｐ）を選択的に取り込む能力を試験した。合成ｄｓＤＮＡカセットは、縮重プライマーから、またはマイクロアレイ技術を介して２７，０００個のメンバーのライブラリーの部分として合成した合理的に設計したオリゴから構築したＮＮＲライブラリーに由来した。両方の場合において、ｇａｌＫ遺伝子産物の活性部位残基に変異導入され、ならびに合成プライミング部位、Ｐ１（配列番号１）を含有するよう、オリゴヌクレオチドを設計した。ｇａｌＫ遺伝子座において指向させたプライマーを使用したコロニーＰＣＲにより得た増幅産物サイズの変化に基づき、ドナー株ライブラリーの高度に効率的なリカバリーを検証した。ＮＮＲライブラリー由来のコロニーＰＣＲ産物の配列決定は、ｄｓＤＮＡカセット由来の合成プライミング部位（Ｐ１）を効率約９０〜１００％で取り込むことを示した（図２）。この驚くべき、予測外の結果は、他のリコンビニアリングベースの編集アプローチ（Constantinoら、PNAS（２００３年）
、１００巻：１５７４８〜１５７５３頁、Wangら、Nature（２００９年）、４６０巻：８９４〜８９８頁）において典型的に使用されているエラープローンｍｕｔＳ欠損株に依存することなく、高い効率でライブラリーが作製され得ることを示唆する。しかしながら、コドン変異の効率の下降（約２０％）が存在し、それは、対立遺伝子置換中のＭｕｔＳによる補正に起因し得る。この研究において、構築の両方の相を、ｍｕｔＳ＋バックグラウンドにおいて行うとき、最終コドン編集効率は約１０％であった。
ＣＡＲＰＥ法の最終編集効率および一般性を増強するために、ドナー構築相中の変異の喪失を防ぐ努力において、ｍｕｔＳ＋ドナー株に導入される前に、ｍｕｔＳ欠損株においてドナー構築を行うことができる。
（実施例２）
必須の遺伝子を標的にするためのＣＡＲＰＥ法の使用
ＣＡＲＰＥアプローチの一般性を試験するために、上で記載した通り、ｄｘｓ、ｍｅｔＡ、およびｆｏｌＡを含む、いくつかの必須遺伝子において、方法を使用した。ｇＲＮＡ設計ストラテジーを使用して、必須遺伝子を標的化することができる（図３）。
ｄｘｓ遺伝子を標的化するＣＡＲＰＥ実験由来のデータはまた、ドナーライブラリー作製中に生じる遺伝子破壊にも関わらず、リコンビニアリングの１〜３時間後以内にドナーライブラリーを有効に構築し、回収することが可能であることも示唆する。
（実施例３）
イソペンテノールの生成を調節するためのＣＡＲＰＥ法の使用
細菌生成を介した産業上の製造のための良好なバイオ燃料の捜索は、当該技術分野の水準のゲノム設計、エンジニアリング、および所望の生成物についてのスクリーニングを行う能力を要求する。これまでに、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおける全ての遺伝子の発現レベルを個々に修飾する能力を示した（Warnerら、Nat. Biotechnol（２０１０年）、２８巻：８５６〜８６２頁）。追跡可能な多重リコンビニアリング（ＴＲＭＲ）と呼ばれるこの方法は、約８０００個のゲノム的に修飾した細胞（約４０００個の過剰発現した遺伝子、および約４０００個のノックダウンした遺伝子）のライブラリーを生成した。このライブラリーは、異なる条件下で後にスクリーニングされ、それは、遺伝子産物の活性のより深い理解を可能にし、これらの選択下で良好に遂行する株をもたらした。ＴＲＭＲは、２つのレベル（過剰発現およびノックダウン）のタンパク質発現の修飾を可能にするが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の修飾を可能にしなかった。ここで、本発明者らは、バイオ燃料の最適な生成のための、ＯＲＦ修飾および全代謝経路をエンジニアリングする、巨大なライブラリーを生成することを目的とする。
（ランダム変異誘発と対照的に）合理的に設計されるかかるライブラリーを生成する際の主な困難は、所望の変異の標的細胞への挿入効率である。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるゲノム修飾の基準の方法であるリコンビニアリングは、外来ＤＮＡの宿主ゲノムへの挿入を促進するためにラムダファージ由来の組換え遺伝子を使用する。しかしながら、このプロセスは、低い効率に苦しみ、抗生物質耐性遺伝子の付加に続く選択（ＴＲＭＲにおいてなど）、または組換え事象の再帰的な誘導（すなわち、ＭＡＧＥによる（Wangら、Nature（２００８年）、４６０巻：８９４〜８９８頁）のいずれかにより、克服し得る。本明細書において記載されるＣＡＲＰＥ法は、集団由来の全ての非組換え細胞を取り除くためのＣＲＩＳＰＲシステムの使用に伴ってリコンビニアリング効率を増大する。ＣＲＩＳＰＲは、侵襲性ファージおよびプラスミドに対する、最近発見されたＲＮＡベースの細菌および古細菌の適応性防御機構である（Bhayaら、Ann. Rev. of Genetics（２０１１年）、４５
巻：２７３〜２９７頁）。このシステムは、２つのプラスミド、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼＣａｓ９をコードする１つのプラスミド、およびＣａｓ９をその固有の位置にガイドする配列特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする第２のプラスミドを使用して、配列指向性２本鎖切断を可能にする、広範なエンジニアリングを起こした（Qiら、Cell（２０１３年）、４５巻：２７３〜２９７頁）。ＣＡＲＰＥ法は、配列に依存した態様でＤＮＡ切断およびその結果として細胞死を誘導するＣＲＩＳＰＲシステムの能力を利用する。本発明者らは、ＯＲＦ内の所望の変異に加えて、ＣＲＩＳＰＲ機構により標的にされる遺伝子のオープンリーディングフレームの外側の共通の位置の変異を含む、ＤＮＡリコンビニアリングカセットを生成した。ＰＡＭ変異／欠失に起因する、ＣＲＩＳＰＲにより媒介される死の回避を伴い、所望の変異を連結／結合するこのアプローチは、細胞の総集団内の操作された細胞の劇的な濃縮を可能にする。
方法を、ＤＸＳ経路を使用してさらに示す。ＤＳＸ経路は、テルペンおよびテルペノイドの生合成をもたらす、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生成をもたらす。興味深いことに、ＩＰＰはまた、リコペンまたはイソペンテノールの前駆体でもあり、必要な遺伝子の付加をもたらし得る。リコペンは、細菌のコロニーを赤色にし、故に、容易にスクリーニング可能である一方で、イソペンテノールは、エタノールより高いエネルギー密度および低い水混和性を有する「第２世代」バイオ燃料であると考えられる。３種のタンパク質をエンジニアリングのために選択した：１）経路の第１の酵素および律速酵素、ＤＳＸ、２）ＤＸＳ経路由来の代謝フラックスを転用する、ＩｓｐＢ、ならびに３）Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ両方においてＩＰＰをイソペンテノールに変換することが示された、ＮｕｄＦ（Withersら、App. Environ. Microbiol（２００７年）、７３巻：６２７７〜６２８３頁、Zhengら、Biotechnol. for biofuels（２０１３年）、６巻
：５７頁）。ＤＸＳおよびＩｓｐＢをコードする遺伝子における変異を、コロニー色素定量のために開発された新規画像分析ツールで、リコペン生成の増大についてスクリーニングする。ＮｕｄＦ活性を、ＧＣ／ＭＳによりイソペンテノールレベルを測定することにより直接的に、およびバイオセンサーとして機能するイソペンテノール栄養要求性細胞により間接的にアッセイする。この方法は、高い正確さおよび効率でＥ．ｃｏｌｉゲノムへの巨大変異ライブラリーを合理的に操作する能力、および高収量のイソペンテノールを生成する株をもたらす。
（実施例４）
ｇａｌＫを編集するためのＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法の使用
ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法を使用して、ｇａｌＫ遺伝子を編集し、それは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるリコンビニアリングのためのモデルシステムとして働いた（Yuら、２０００年）。構築した第１のＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲカセットを、ｇａｌＫ＿Ｑ２４と称される、ｇａｌＫのコドン２４におけるインフレームＰＡＭの位置に終結コドンを導入するよう設計した（図１２）。構築物およびベクターを、高処理で必要な変異を生成する、カスタムパイソンスクリプトを使用して、設計した。
対照カセットを、環状ポリメラーゼクローニング（ＣＰＥＣ）法を使用して、Qiら、Cell（２０１３年）により記載されるｇＲＮＡベクターにクローニングした。骨格を、次のプライマー、ＣＣＡＧＡＡＡＴＣＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＡＧＧＡＴ（配列番号２９）、およびＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴ（配列番号３０）で直線化した。
ＧｅｎＴＲＡＣＥＲカセットをｇｂｌｏｃｋｓとして注文し、次のプライマー
ＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＡＧＡＡＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＡＧＣＴＴＴＣＧＣＴＡＡＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＴＧＧ（配列番号３１）、
ＡＣＴＴＴＴＴＣＡＡＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＧＡＣＴＡＧＣＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＴＣＴＡＧＣＴＣＴＡＡＡＡＣ（配列番号３２）
を使用して増幅した。
成分を、ＣＰＥＣを使用して一緒にまとめ（ｓｔｉｔｃｈ）、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換して、ベクターを作製した。この手順は、１０４〜１０５ＣＦＵ／μｇのオーダーのクローニング効率で、プールしたオリゴヌクレオチドライブラリーを使用して、多重で行われるべきである。
ｐＳＩＭ５（ラムダＲＥＤプラスミド）およびＸ２−ｃａｓ９プラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ中３０℃において、中央対数期（０．４〜０．７ＯＤ）まで成長させた。ｐＳＩＭ５ベクターのリコンビニアリング機能を、４２℃において１５分間誘導し、次に、氷上に１０分間置いた。次に、ペレット化して冷却Ｈ２Ｏ １０ｍＬで２回洗浄することにより、細胞をエレクトロコンピテントにした。細胞を、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲプラスミド（カルベニシリン耐性もコードする）１００ｎｇで形質転換し、３７℃にて３時間で回収した。細胞５０〜１００μＬを、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および１００μｇ／ｍｌカルベニシリン（carbenecillin）を含有する適当な培地にプレーテ
ィングして、ＣＲＩＳＰＲにより編集された株について選択的に濃縮した。ｇａｌＫ遺伝子についての編集効率を、ガラクトースを添加したＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上での赤色／白色スクリーニングを使用して、計算した。
ＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上でのスクリーニングに基づき、約１００％の編集効率が、ｇａｌＫ＿Ｑ２４＊設計で観察された。興味深いことに、高い効率を達成するためにミスマッチ修復ノックアウトを必要とする、オリゴにより媒介されるリコンビニアリング方法（Liら、２００３年、Sawitzkeら、２０１１年、Wangら、２０１１年）と異なり、インタクトなミスマッチ修復機構を有するか、または有しない株において、効果は存在しなかった。
次に、染色体およびベクター配列を、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により検証した。
予測した通り、ベクターにおける設計した変異を、染色体上に写し（図１３）、これは、変異が両方の位置に存在したこと、およびプラスミドが、トランス作用性バーコード（トランス−バーコード）またはゲノム編集の記録として働くことを示している。
Ｃａｓ９により媒介される切断に対して細胞を「免疫する」が、撹乱されていない翻訳産物をそのままにする、同義のＰＡＭ変異（図１４Ｂ、ΔＰＡＭ）からなる「サイレント選択可能な痕（ｓｉｌｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｓｃａｒ）」を生み出すことにより、ゲノムスケールでのタンパク質コードフレームの合理的な変異誘発のため、設計を適合させた。本発明者らは、サイレント痕が、コドンにおける近くの編集についての同時選択、または目的の他の特性を高い効率で可能にし得ると判断した。相同性アームの長さの効果、およびｇａｌＫにおけるＰＡＭ変異／欠失と所望の変異の間の距離を評価し、効率を比較した（図１６Ｂ）。相同性アームの長さを、同一のＰＡＭ編集により、８０〜１００ヌクレオチド（それぞれ、約５％および４５％）まで伸長させたとき、ｇａｌＫ位置１４５における変異の効率の有意な増大が観察された。
（実施例５）
変異を再構築するためのＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法の使用
簡単なユーザーインプット定義でゲノム周囲の部位の標的化を可能にする、カスタム自動設計ソフトウエアを使用して、ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲアプローチをゲノムスケールまで拡大させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおける温度適応の最近報告された研究（Tenaillonら、２０
１２年）から、非同義の点変異の全てを再構築することにより、アプローチを試験した。この研究は、独立して増殖させた株由来の１１５種の単離物において生じた変異の完全なセットを特徴付けた。このデータセットは変異の多様な供給源をもたらし、その個々の適合効果がこの複雑な表現型の機構的支持をさらに明らかにする。コドン使用およびΔＰＡＭの２倍の多重度で、これらの変異のそれぞれを再構築し、可能であれば、下流の適合解析におけるＰＡＭおよび標的コドン変異の両方についての統計的補正を可能にした。
（実施例６）
遺伝子相互作用を調節するためのＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法の使用
Ｅ．ｃｏｌｉゲノムにおけるそれぞれの遺伝子の上流の環境要因（酸素レベル、炭素供給源、ストレス）により著しく調節されるプロモーターを組み込むことにより、ライブラリーを作り直すプロモーターを作製する。ＧＥｎ−ＴｒａＣＥＲ法を使用して、例えば、生成のため目的の化学物質に対する耐性について有益であり得る、作り直された遺伝子型を有する株を作製する。

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  1. 本明細書に記載の発明。
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