CN105683375B - 用于插入核酸的载体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：一种载体，其用于在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、规定部位和由第2核苷酸序列构成的区的核酸的上述规定部位插入所期望的核酸，该载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区；包含该载体的试剂盒；核酸的插入方法，该方法包括向细胞中导入该载体的步骤；通过该方法获得的细胞；以及包含该细胞的生物。

Description

用于插入核酸的载体
技术领域
本发明涉及用于在细胞内的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法、以及用于该目的的载体、试剂盒、和通过该方法获得的细胞。而且，本发明还涉及含有包含所期望的核酸的细胞的生物、及其制备方法。
背景技术
作为包含多个由DNA结合结构域和DNA剪切结构域构成的核酸酶亚基(亚单位)的多肽，已知有TALEN(TALE核酸酶(TALE Nuclease))或ZFN(锌指核酸酶(Zinc FingerNuclease))等(专利文献1～4、非专利文献1)。这些人工核酸酶在DNA结合结构域的结合部位因多个DNA剪切结构域接近形成多聚体而引起DNA的双链剪切。DNA结合结构域重复包含多个DNA结合模块，各DNA结合模块识别DNA链中的特定碱基对。因此，通过适当设计DNA结合模块，可以在特定的核苷酸序列中进行特异性剪切。作为在特定的核苷酸序列中进行特异性剪切的其他核酸酶，已知有CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶(非专利文献2)、或使CRISPR/Cas系统与FokI核酸酶融合得到的RNA诱导型FokI核酸酶(FokI-dCas9)(非专利文献3)。通过利用在修复由这些核酸酶进行的剪切时产生的错误或重组，进行基因组DNA上的基因的缺失、插入和突变导入等各种基因修饰(参照专利文献5～6、非专利文献4)。
作为利用人工核酸酶在细胞中插入所期望的核酸的方法，已知有非专利文献5～8中记载的方法。非专利文献5中记载着：利用TALEN通过同源重组插入外来DNA的方法。另外，非专利文献6中记载着：利用ZFN通过同源重组插入外来DNA的方法。但是，利用同源重组的载体无法简便地制作成长链。另外，根据细胞或生物种，有时同源重组效率低，因此这些方法只能用于有限的细胞和生物种。为了获得稳定具有插入了所期望的核酸的细胞的改良生物，向动物胚胎中导入目标核酸后使胚胎分化而获得成体是有效的，但在动物胚胎中同源重组效率低，这些方法没有效率。作为向动物胚胎中导入外来性DNA的技术，已知有ssODN介导的基因修饰，但在该技术中只能导入约数10bp左右的短DNA。
非专利文献7和8中记载的方法是不利用同源重组、而利用人工核酸酶向细胞中插入核酸的方法。非专利文献7公开了下述方法：利用ZFN和TALEN剪切细胞内的核酸和应该插入的外来DNA，利用非同源末端结合(NHEJ)的作用连接两者的剪切部位，从而插入外来DNA。但是，在非专利文献7所记载的方法中，无法控制所插入的核酸的方向，所插入的核酸的连接点也不正确。非专利文献8所记载的方法是使通过核酸酶的剪切由细胞内的核酸产生的单链末端和由外来性DNA产生的单链末端相互退火后再进行连接，以能够控制方向和进行正确的连接。但是，非专利文献8所记载的方法中，为了防止对插入后的DNA再次进行剪切，必须使用异源二聚体型的ZFN和TALEN，而无法使用活性高的同源二聚体型人工核酸酶。另外，非专利文献8所记载的方法不用于向动物胚胎中插入所期望的核酸。而且，非专利文献8所记载的方法中，使单链末端在错误位点退火的发生频率高，而获得接受了正确插入的细胞的频率不高。需要说明的是，非专利文献5～8中没有记载使用CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶或FokI-dCas9等的RNA诱导型FokI核酸酶的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2011/072246号；
专利文献2：国际公开第2011/154393号；
专利文献3：国际公开第2011/159369号；
专利文献4：国际公开第2012/093833号；
专利文献5：日本特表2013-513389号公报；
专利文献6：日本特表2013-529083号公报；
非专利文献
非专利文献1：Nat Rev Genet. 2010 Sep; 11(9): 636-46；
非专利文献2：Nat Protoc. 2013 Nov; 8(11): 2281-308；
非专利文献3：Nat Biotechnol. 2014 Jun; 32(6): 569-76；
非专利文献4：Cell. 2011 Jul 22; 146(2): 318-31.；
非专利文献5：Nat Biotechnol. 2011 Jul 7; 29(8): 731-4；
非专利文献6：Nat Biotechnol. 2009 Sep; 27(9): 851-7；
非专利文献7：Biotechnol Bioeng. 2013 Mar; 110(3): 871-80；
非专利文献8：Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-46。
发明内容
发明所要解决的课题
因此，本发明的目的在于获得一种不需要制作长链载体等的繁杂步骤、且可以在各种生物种细胞内的核酸的规定部位正确且简便地插入所期望的核酸的方法，该方法还可以插入达到较长链的核酸，可以与同源二聚体型的包含DNA剪切结构域的核酸酶、RNA诱导型核酸酶、或RNA诱导型FokI核酸酶组合使用。
用于解决课题的手段
本发明人着眼于夹有以插入核酸为目的的规定部位的由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区，设计了对由细胞内的核酸所含的这些区构成的部分进行特异性剪切的核酸酶。另外，本发明人设计了在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、以插入为目的的所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的载体。然后，本发明人将所设计的载体导入细胞中，使上述核酸酶与细胞发生作用，使在细胞内的核酸中的上述规定部位发生剪切。另外，还使核酸酶与载体发生作用，生成在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段。如此操作，在细胞内，上述细胞内的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来连接，而上述细胞内的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过MMEJ来连接。由此，所期望的核酸被正确插入到细胞的核酸的规定部位。对达到数kb以上的较长链的核酸可以进行插入。虽然所使用的核酸酶对插入前的包含细胞内的核酸所含的由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，但连接后的核酸因插入上述所期望的核酸而失去该部分中的一部分。因此，不会受到细胞内存在的核酸酶的再次剪切，可稳定地保持，可高频率地插入所期望的核酸。
由于该方法是通过在多种细胞中起作用的微同源介导的末端结合进行连接，因此对于即使同源重组效率低的发生阶段的细胞等也可以正确且高频率地插入所期望的核酸，可适用的生物和细胞的种类范围广。另外，该方法可同时对用于导入核酸酶的载体和用于插入核酸的载体的细胞进行插入，操作简便。而且，该方法通过由微同源介导的末端结合引起的细胞内的核酸部分的变化，可防止对插入后的核酸进行再次剪切，因此还可以使用活性高的同源二聚体型结构域作为核酸酶中所含的DNA剪切结构域，实验材料的选择范围广。
即，在第1方案中，本发明提供一种载体，所述载体用于通过核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸，
这里，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，
上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核苷酸序列构成的区和上述由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，
上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区。
即，在第2方案中，本发明提供一种载体，所述载体用于通过包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸，
这里，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，
在上述细胞所含的核酸中，由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，
这里，上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区，
在上述载体中，由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，
上述载体通过上述核酸酶生成在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段。
另外，在第3方案中，本发明提供第1或第2方案所述的载体，其中，上述细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来连接，而上述细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过MMEJ来连接，由此插入上述所期望的核酸。
另外，在第4方案中，本发明提供第2方案所述的载体，其中，上述核酸酶为同源二聚体型核酸酶，上述载体为环状载体。
另外，在第5方案中，本发明提供第1方案所述的载体，其中，核酸酶为Cas9核酸酶。
另外，在第6方案中，本发明提供第2方案所述的载体，其中，核酸酶为TALEN。
另外，在第7方案中，本发明提供试剂盒，其用于在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸，该试剂盒包含第1方案～第6方案中任一项所述的载体和用于表达核酸酶的载体。
另外，在第8方案中，本发明提供在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法，该方法包括如下步骤：向细胞中导入第1方案～第6方案中任一项所述的载体和用于表达核酸酶的载体。
另外，在第9方案中，本发明提供通过第8方案所述的方法获得的细胞。
另外，在第10方案中，本发明提供包含第9方案所述的细胞的生物。
另外，在第11方案中，本发明提供包含所期望的核酸的生物的制备方法，该方法包括如下步骤：使通过第8方案所述的方法获得的细胞分化。
另外，在第12方案中，本发明提供通过第11方案所述的方法制备的生物。
发明效果
使用本发明的载体时，不需要制作长链载体等的繁杂步骤，不依赖于细胞或生物种中的同源重组效率，可以在广泛的各种生物种的细胞内的核酸的规定部位正确且简便地插入所期望的核酸而不会引起移码，还可以插入达到数kb以上的较长链的核酸。另外，使用本发明载体的核酸的插入方法可以与具有高核酸酶活性的同源二聚体型的包含DNA剪切结构域的核酸酶组合使用。或者，使用本发明的载体的核酸的插入方法还可以与CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶组合使用。而且，使用本发明的载体时，可以正确地设计连接点，可以在框内敲入功能结构域，因此在使用包含作为标记的基因的核酸时，通过检测该基因的表达，可以简易地鉴定发生了目标插入的生物，可以简便且高频率地获得插入有所期望的核酸的生物。另外，使用本发明载体的核酸的插入方法可用于同源重组效率低的动物胚胎等的未分化细胞，因此通过使用本发明的载体在未分化细胞中插入所期望的核酸，使所得的未分化细胞分化，可以简便地获得稳定保持所期望的核酸的成体生物。
附图说明
图1显示利用TALEN插入包含所期望的核酸的载体整体时tyr基因座中的靶向整合的概略图。
图2显示利用TALEN插入包含所期望的核酸的载体的一部分时的概略图。
图3显示使用了CRISPR/Cas系统的本发明的载体设计的概略图。
图4a显示利用CRISPR/Cas系统插入包含所期望的核酸的载体整体时的概略图。
图4b显示利用CRISPR/Cas系统插入包含所期望的核酸的载体整体时的概略图。
图5显示利用FokI-dCas9插入包含所期望的核酸的载体整体时的概略图。
图6显示微量显微注入了TALEN和靶向整合用载体(TAL-PITCh载体)的胚胎的表型。图6显示TALEN R+载体注入胚(阴性对照组；A)和TALEN mix+载体注入胚(实验组；B)的亮视野图像(上段)和GFP荧光图像(下段)。
图7显示阴性对照组和实验组中的表型的比例。除异常产生胚(灰色、Abnormal)以外，将表型分为4类(Full、Half、Mosaic、Non)。个体数见各图的上部。
图8显示向靶基因座中导入供体载体(TAL-PITCh载体)的检测。下图是使用了tyrTALEN的靶序列上游和下游、载体侧的引物组的PCR产物的电泳照片。上图显示引物的位置。在下图中，箭头显示表明载体已被整合的谱带。数字对应于图6的个体编号。
图9中的图9A和图9B显示插入部位和供体载体(TAL-PITCh载体)的连接点的序列分析。显示来自No.3和No.4(图6)的PCR产物(图8；5’侧和3’侧)的测序结果。MMEJ依赖性地导入时所期待的序列见上段。TALEN靶序列带有下划线。中央附近的框(盒)分别显示通过5’侧、3’侧的MMEJ而变短的间隔区周边序列。缺失用虚线(-)显示，插入用斜体文字显示。
图10是利用CRISPR/Cas系统将HEK293T细胞靶向整合到FBL基因座中的概略图。
图11A和图11B显示供体载体(CRIS-PITCh载体)的全长序列。mNeonGreen的编码序列用绿色显示，2A肽的编码序列用紫色显示，嘌呤霉素耐性基因的编码序列用蓝色显示。下划线显示5’侧和3’侧的gRNA靶序列。图11B是图11A的续图。
图12是显示同时导入了表达3种gRNA和Cas9的载体和供体载体(CRIS-PITCh载体)的HEK293T细胞的表型的mNeonGreen荧光图像。
图13显示插入部位和供体载体(CRIS-PITCh载体)的连接点的序列分析。MMEJ依赖性地导入时所期待的序列见上段。缺失用虚线(-)表示，插入用双下划线表示，取代用下划线表示。
具体实施方式
通过第1方案的本发明提供的载体是用于在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的载体。作为细胞所含的核酸，例如可以列举细胞的基因组DNA。作为细胞的来源，可以列举：人；牛、小种猪、猪、绵羊、山羊、兔、狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、大鼠、猴等非人哺乳动物；鸟类；斑马鱼等鱼类；青蛙等两栖类；爬行类；果蝇等昆虫类；甲壳类等。另外，作为细胞的来源，可以列举拟南芥等植物等。细胞可以是培养细胞。
插入第1方案的本发明载体的细胞包含核酸，所述核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、以插入核酸为目的的规定部位和由第2核苷酸序列构成的区。第1核苷酸序列和第2核苷酸序列是用于显示与插入的载体所含的序列的关系的方便性的表述。第1核苷酸序列和第2核苷酸序列可以与上述规定部位直接相邻，也可以经由由特定的核苷酸序列构成的区相邻。经由由特定的核苷酸序列构成的区相邻时，该特定的核苷酸序列优选1个核苷酸长度～7个核苷酸长度，更优选为1个核苷酸长度～3个核苷酸长度。第1核苷酸序列优选3个核苷酸长度～10个核苷酸长度、更优选4个核苷酸长度～8个核苷酸长度、进一步优选为5个核苷酸长度～7个核苷酸长度。另外，第2核苷酸序列优选3个核苷酸长度～10个核苷酸长度、更优选4个核苷酸长度～8个核苷酸长度、进一步优选为5个核苷酸长度～7个核苷酸长度。
通过第1方案的本发明提供的载体是用于通过核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的载体。在第1方案的本发明中，上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核苷酸序列构成的区和上述由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切。作为这样的核酸酶，可以列举包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶，关于该核酸酶，在本说明书中，在说明根据第2方案的本发明提供的载体的部分进行说明。作为如上所述的进行特异性剪切的其他核酸酶，可以列举CRISPR/Cas系统的核酸酶等RNA诱导型核酸酶。在CRISPR/Cas系统中，被称作PAM的部分在Cas9核酸酶所进行的双链剪切中是必须的。Cas9核酸酶例如可以列举来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9、来自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的StCas9。SpCas9的PAM是“ 5’-NGG-3’ ”序列(N为任意的核苷酸)，发生双链剪切的位置较PAM更位于3个核苷酸上游(5’末端侧)。CRISPR/Cas系统中的指导RNA(gRNA)识别位于发生双链剪切的位置的5’侧的核苷酸序列。而且，CRISPR/Cas系统中的发生双链剪切的位置在细胞所含的核酸中与以插入所期望的核酸为目的的上述规定部位对应。在该规定部位的两端存在由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区。因此，使用识别较细胞中的核酸所含的PAM更位于5’末端侧的核苷酸序列的gRNA的CRISPR/Cas系统可以对包含由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切。
通过第1方案的本发明提供的载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、以插入细胞中为目的的所期望的核酸、和由第2核苷酸序列构成的区。载体中所含的由第1核苷酸序列构成的区和上述的细胞所含的核酸中的由第1核苷酸序列构成的区相同。另外，载体中所含的由第2核苷酸序列构成的区和上述的细胞所含的核酸中的由第2核苷酸序列构成的区相同。以图1为例说明载体中所含的第1核苷酸序列和第2核苷酸序列与细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和第2核苷酸序列的关系。图1的TALEN位点所含的AAcatgag是第1核苷酸序列。第1核苷酸序列中的AA是由第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列与第1核苷酸序列的重复部分。图1的TALEN位点所含的attcagaA是第2核苷酸序列。第2核苷酸序列的大写字母A是指第2核苷酸序列与由第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列的重复部分。另一方面，图1的供体载体中所含的Attcagaa是第2核苷酸序列。第2核苷酸序列中所含的大写字母A是指通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列与第1核苷酸序列的重复部分。图1的供体载体中所含的aacatgag是第1核苷酸序列。图1的供体载体中所含的编码CMV和EGFP的序列是指以插入细胞中为目的的所期望的核酸。如图1的供体载体的示意图所示，以由第1核苷酸序列(aacatgag)构成的区为起点依次进行说明时，图1的供体载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含：由第1核苷酸序列构成的区、以插入细胞中为目的的所期望的核酸、和由第2核苷酸序列构成的区。通过图1的供体载体与图1的TALEN位点的对比进行说明时，在TALEN位点第1核苷酸序列的3’末端与第2核苷酸序列的5’末端相邻或接触，相对于此，在供体载体中第2核苷酸序列的3’末端与第1核苷酸序列的5’末端相邻或接触。关于这一点，在图1的一个例子中，细胞内的核酸中的第1核苷酸序列和第2核苷酸序列的位置关系与载体中的它们的位置关系相比是反过来的。这样的关系起因于图1的供体载体是环状载体、以及核酸酶对载体中的包含由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分进行剪切。如上所述，第1方案的本发明的载体优选为环状载体。另外，在第1方案的本发明的载体为环状载体的情况下，第1方案的本发明的载体中所含的第2核苷酸序列的3’末端与第1核苷酸序列的5’末端优选相邻或直接连接。当第1方案的本发明的载体为环状载体、且第2核苷酸序列与第1核苷酸序列相邻时，第2核苷酸序列的3’末端与第1核苷酸序列的5’末端通过由优选1～7个核苷酸长度、更优选1～5个核苷酸长度、进一步优选1～3个核苷酸长度的核苷酸序列构成的区隔开。
根据第2方案的本发明提供的载体是用于通过包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶插入所期望的核酸的载体。
作为DNA结合结构域的来源，可以列举植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)的TALE(类转录激活因子效应物(Transcription Activator-Like Effector))、锌指(Zincfinger)等。DNA结合结构域优选从N末端侧起连续包含特异性地识别碱基对的1个或多个DNA结合模块。1个DNA结合模块特异性地识别1个碱基对。因此，第1 DNA结合结构域和第2DNA结合结构域分别识别由特定的核苷酸序列构成的区。第1 DNA结合结构域所识别的核苷酸序列和第2 DNA结合结构域所识别的核苷酸序列可以相同也可以不同。从兼具DNA剪切结构域的核酸酶活性高和DNA序列识别特异性高的角度考虑，DNA结合结构域中所含的DNA结合模块数优选8～40、更优选12～25、更进一步优选为15～20。作为DNA结合模块，例如可以列举TAL效应子重复(effector repeat)等。作为1个DNA结合模块的长度，例如可以列举20～45、30～38、32～36、或34等。DNA结合结构域中所含的DNA结合模块的长度优选对于所有的DNA结合模块均相同。第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域优选来源、特性等相同。
当使用RNA诱导型FokI核酸酶(FokI-dCas9)时，与gRNA形成了复合体的FokI-dCas9相当于上述第2方案中的包含DNA结合结构域的核酸酶。dCas9是催化活性被灭活了的Cas9，其被导入到识别位于发生双链剪切的位置近旁的核苷酸序列的gRNA中，与核酸结合。即，与gRNA形成了复合体的dCas9相当于上述第2方案中的DNA结合结构域。
包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶优选包含：含有第1 DNA结合结构域和第1 DNA剪切结构域的第1核酸酶亚基、以及含有第2 DNA结合结构域和第2DNA剪切结构域的第2核酸酶亚基。
第1 DNA剪切结构域和第2 DNA剪切结构域优选在第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域分别与DNA结合后相互接近以形成多聚体，获得有所提高的核酸酶活性。作为这样的DNA剪切结构域，可以列举来自限制酶FokI的DNA剪切结构域等。DNA剪切结构域可以是异源二聚体型的DNA剪切结构域，也可以是同源二聚体型的DNA剪切结构域。在若第1 DNA剪切结构域和第2 DNA剪切结构域接近则形成多聚体并获得已提高了的核酸酶活性、但即使第1 DNA剪切结构域与第1 DNA剪切结构域接近也不会形成多聚体且无法获得已提高了的核酸酶活性、而且即使第2 DNA剪切结构域与第2 DNA剪切结构域接近也不会形成多聚体且无法获得已提高了的核酸酶活性的情况下，该第1 DNA剪切结构域和该第2 DNA剪切结构域是异源二聚体型的DNA剪切结构域。另外，在若第1 DNA剪切结构域和第1 DNA剪切结构域接近则形成多聚体、且核酸酶活性有所提高的情况下，该第1 DNA剪切结构域是同源二聚体型的DNA剪切结构域。当使用同源二聚体型的DNA剪切结构域时，通常可获得高的核酸酶活性。第1 DNA剪切结构域和第2 DNA剪切结构域优选来源、特性等相同。
当使用TALEN时，在第1核酸酶亚基中，第1 DNA结合结构域和第1 DNA剪切结构域通过由20～70个、25～65个、或30～60个、优选35～55个、更优选40～50个、进一步优选45～49个、最优选47个氨基酸构成的多肽进行连接。当使用ZFN时，在第1核酸酶亚基中，第1 DNA结合结构域和第1 DNA剪切结构域通过由0～20个、或2～10个、优选3～9个、更优选4～8个、进一步优选5～7个氨基酸构成的多肽进行连接。当使用FokI-dCas9时，在第1核酸酶亚基中，dCas9和FokI通过由1～20个、1～15个、或1～10个、优选2～8个、更优选3～7个、进一步优选4～6个、最优选5个氨基酸构成的多肽进行连接。关于第2核酸酶亚基也相同。通过这种长度的多肽连接的第1核酸酶亚基对包含由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分的长度的特异性高，对特定长度的间隔区进行特异性剪切，因此通过非特异性剪切在目标外的部位插入核酸的频率低，另外，对后述的通过微同源介导的末端结合进行连接后的核酸进行再次剪切的发生频率低，故优选。
在以利用通过第2方案的本发明提供的载体进行的插入为目的的细胞所含的核酸中，由第1核苷酸序列构成的区位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间。另外，由第2核苷酸序列构成的区位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间。另外，上述规定部位位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间。在该核酸中，通过包围由第1核苷酸序列构成的区的DNA结合结构域识别的两个核苷酸序列的组合可以与通过包围由第2核苷酸序列构成的区的DNA结合结构域识别两个核苷酸序列的组合不同。这种情况下，用于剪切由第1核苷酸序列构成的区的周边的核酸酶和用于剪切由第2核苷酸序列构成的区的周边的核酸酶使用不同的核酸酶。在上述细胞所含的核酸中，由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区通过由优选5～40个核苷酸长度的、更优选10～30个核苷酸长度的、进一步优选12～20个核苷酸长度的核苷酸序列构成的区隔开。隔开两者的区的核苷酸长度可以与第1核苷酸序列的核苷酸长度和第2核苷酸序列的核苷酸长度的总计的核苷酸长度相同，但也可以不同。例如，在上述细胞所含的核酸中，当满足第1核苷酸序列的3’末端与第2核苷酸序列的5’末端直接接触、通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列和第1核苷酸序列之间不重复、以及第2核苷酸序列和通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列之间不重复的条件时，上述的隔开两者的区的核苷酸长度与第1核苷酸序列的核苷酸长度和第2核苷酸序列的核苷酸长度的总计的核苷酸长度相同。但是，当不满足选自上述条件的一个或多个条件时，上述的隔开两者的区的核苷酸长度与第1核苷酸序列的核苷酸长度和第2核苷酸序列的核苷酸长度的总计的核苷酸长度不同。在细胞所含的核酸中，由第1核苷酸序列构成的区可以和由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区有一部分重复。另外，在细胞所含的核酸中，由第2核苷酸序列构成的区可以和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区有一部分重复。当存在一部分重复时，重复部分由优选1～6个核苷酸长度、更优选1～5个核苷酸长度、进一步优选2～4个核苷酸长度的核苷酸序列构成。当存在一部分重复时，因后述的利用微同源介导的末端结合进行的连接，隔开通过DNA结合结构域识别的两个区、且包含由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分的长度进一步大幅减少，因此更不易遭受连接后的再次剪切，可更稳定地保持所插入的核酸，故优选。
在通过第2方案的本发明提供的载体中，由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间。在该载体中，通过包围由第1核苷酸序列构成的区的DNA结合结构域识别的两个核苷酸序列的组合可以和通过包围由第2核苷酸序列构成的区的DNA结合结构域识别的两个核苷酸序列的组合不同。这种情况下，用于剪切由第1核苷酸序列构成的区的周边的核酸酶和用于剪切由第2核苷酸序列构成的区的周边的核酸酶使用不同的核酸酶。在载体中，与由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区相比，由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区可以存在于5’末端侧也可以存在于3’末端侧。但是，在载体中，优选位于第1核酸酶序列的3’末端侧、且通过第1 DNA结合结构域或第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列和位于细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列的3’末端侧、且通过第1 DNA结合结构域或第2 DNA结合结构域识别的序列不同。另外，在载体中，优选位于第2核酸酶序列的5’末端侧、且通过第1 DNA结合结构域或第2DNA结合结构域识别的核苷酸序列和位于细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列的5’末端侧、且通过第1 DNA结合结构域或第2 DNA结合结构域识别的序列不同。上述情况下，通过组合使用异源二聚体型的包含DNA剪切结构域的核酸酶，可以进一步降低在插入所期望的核酸后发生的再次剪切的频率。另外，载体可以是通过包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的一种或多种核酸酶产生1个剪切部位的载体，也可以是产生两个以上的剪切部位的载体。作为产生两个剪切部位的载体，例如可以列举：在从5’末端到3’末端的方向依次包含由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区、由第1核苷酸序列构成的区、由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区、以插入细胞中为目的的所期望的核酸、由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区、由第2核苷酸序列构成的区、以及由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区的载体。当使用产生两个剪切部位的载体时，可以通过核酸酶的剪切除去载体中所含的不需要的核酸，因此可以更安全地获得不含不需要的核酸的所期望的细胞。
在通过第2方案的本发明提供的载体中，隔开由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区、且包含由第1核苷酸序列构成的区或由第2核苷酸序列构成的区的区域由优选5～40个核苷酸长度、更优选10～30个核苷酸长度、进一步优选12～20个核苷酸长度的核苷酸序列构成。当隔开由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区的区域包含第1核苷酸序列和第2核苷酸序列两者时，上述的隔开区域的核苷酸长度与第1核苷酸序列的核苷酸长度和第2核苷酸序列的核苷酸长度的总计相同、或大致相同。如上所述，第1核苷酸序列优选3个核苷酸长度～10个核苷酸长度、更优选4个核苷酸长度～8个核苷酸长度、进一步优选为5个核苷酸长度～7个核苷酸长度。另外，如上所述，第2核苷酸序列优选3个核苷酸长度～10个核苷酸长度、更优选4个核苷酸长度～8个核苷酸长度、进一步优选为5个核苷酸长度～7个核苷酸长度。当由第1核苷酸序列或第2核苷酸序列构成的区和由通过DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区中存在重复时、由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区中存在重复时、或由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区不直接相连时，上述隔开区域的核苷酸长度与第1核苷酸序列的核苷酸长度和第2核苷酸序列的核苷酸长度的总计的核苷酸长度不同，仅限于大致相同。
在通过第1或第2方案的本发明提供的载体中，例如，上述细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来连接，而上述细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过MMEJ来连接，由此上述所期望的核酸被插入到上述细胞所含的核酸中的规定部位。
在通过第2方案的本发明提供的载体中，例如，上述核酸酶为同源二聚体型核酸酶，上述载体为环状载体。
在通过第1方案的本发明提供的载体中，例如，上述核酸酶为CRISPR/Cas系统的核酸酶等的RNA诱导型核酸酶。优选上述核酸酶为Cas9核酸酶。
在通过第2方案的本发明提供的载体中，上述核酸酶优选为ZFN、TALEN或FokI-dCas9，更优选为TALEN。ZFN、TALEN或FokI-dCas9可以是同源二聚体型，也可以是异源二聚体型。上述核酸酶优选为同源二聚体型的ZFN、TALEN或FokI-dCas9，更优选为同源二聚体型TALEN。
上述的核酸酶还包含它们的突变体。这样的突变体只要显示出上述核酸酶的活性即可，可以是任何的突变体。这样的突变体例如可以列举：包含在上述核酸酶的氨基酸序列中有多个、例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸被取代、缺失和/或添加而获得的氨基酸序列的核酸酶。
通过本发明提供的载体中所含的所期望的核酸例如可以是由10～10000个核苷酸长度构成的核酸，也可以是由数千个核苷酸长度构成的核酸。所期望的核酸可以包含编码基因的核酸。所编码的基因可以是任意的基因，例如可以列举编码碱性磷酸酶、过氧化物酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶等转换化学发光底物的酶的基因。所期望的核酸可以包含编码可根据光信号来检测表达的基因的核酸。这种情况下，通过检测在导入载体后的细胞中是否存在光信号，可以简便地确认插入的成败，插入有所期望的核酸的细胞的获取效率和频率有所提高。作为可根据光信号来检测表达的基因，可以列举：编码绿色荧光蛋白(GFP)、人源化海肾绿色荧光蛋白(hrGFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、黄绿色荧光蛋白(mNeonGreen)、增强型蓝色荧光蛋白(eBFP)、增强型蓝绿色荧光蛋白(eCFP)、增强型黄色荧光蛋白(eYFP)、红色荧光蛋白(RFP或DsRed)等荧光蛋白的基因；编码萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶等生物发光蛋白的基因。
在通过本发明提供的载体中，由第1核苷酸序列构成的区和上述所期望的核酸优选直接相邻。另外，上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区优选直接相邻。另外，当上述所期望的核酸包含基因等功能性因子时，该载体中所含的第1核苷酸序列和第2核苷酸序列可以是编码一部分该功能性因子的核苷酸序列。
通过本发明提供的载体可以是环状载体，也可以是直链状的载体。优选通过本发明提供的载体为环状载体。作为本发明的载体，可以列举质粒载体、粘粒载体、病毒载体、人工染色体载体等。作为人工染色体载体，可以列举酵母人工染色体载体(YAC)、细菌人工染色体载体(BAC)、P1人工染色体载体(PAC)、小鼠人工染色体载体(MAC)、人人工染色体载体(HAC)。另外，作为载体的成分，可以列举：DNA、RNA等核酸；GNA、LNA、BNA、PNA、TNA等核酸类似物等。载体可以用糖类等核酸以外的成分修饰。
在第7方案中，本发明提供试剂盒，所述试剂盒用于在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸。第7方案的本发明的试剂盒包含第1方案～第6方案中任一方案的本发明的载体。另外，第7方案的本发明的试剂盒包含用于表达核酸酶的载体。作为用于表达核酸酶的载体，例如可以列举用于表达包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶的载体。在上述用于表达核酸酶的载体中，作为载体，可以列举质粒载体、粘粒载体、病毒载体、人工染色体载体等。作为上述用于表达核酸酶的载体，例如可以列举由第1载体以及第2载体构成的载体组，所述第1载体包含编码含有第1 DNA结合结构域和第1 DNA剪切结构域的第1核酸酶亚基的基因，所述第2载体包含编码含有第2 DNA结合结构域和第2 DNA剪切结构域的第2核酸酶亚基的基因。或者，可以列举包含上述编码第1核酸酶亚基的基因和上述编码第2核酸酶亚基的基因这两者的载体。上述第1载体和上述第2载体可以存在于不同的核酸片段中，也可以存在于同一核酸片段中。当用于剪切由第1核苷酸序列构成的区的周边的核酸酶和用于剪切由第2核苷酸序列构成的区的周边的核酸酶使用不同的核酸酶时，第7方案的本发明的试剂盒包含多个上述的由第1载体和第2载体构成的载体组。当使用CRISPR/Cas系统的核酸酶作为核酸酶时，第7方案的本发明的试剂盒可以包含：用于表达剪切第1方案的本发明载体中的由第1核苷酸序列构成的区的近旁的gRNA和核酸酶的载体、用于表达剪切第1方案的本发明载体中的由第2核苷酸序列构成的区的近旁的gRNA和核酸酶的载体、以及用于表达用于剪切细胞所含的核酸中的规定部位的gRNA和核酸酶的载体。用于表达CRISPR/Cas系统的核酸酶的载体在每一个剪切处可以包含用于表达gRNA的载体和用于表达Cas9的载体。上述的用于表达gRNA和Cas9的载体可以是包含编码gRNA的基因和编码Cas9的基因这两者的载体。或者，可以是由包含编码gRNA的基因的载体和包含编码Cas9的基因的载体构成的载体组。具有不同功能的多个载体可以存在于同一核酸片段上，也可以存在于不同的核酸片段上。
在第8方案中，本发明提供在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法。第8方案的本发明的方法包括如下步骤：向细胞中导入第1方案～第6方案的任一方案的本发明的载体、以及用于表达核酸酶的载体。作为用于表达核酸酶的载体，例如可以列举：如上所述的用于表达包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶的载体。或者，可以列举由第1载体以及第2载体构成的载体组，所述第1载体包含编码含有第1 DNA结合结构域和第1 DNA剪切结构域的第1核酸酶亚基的基因，所述第2载体包含编码含有第2DNA结合结构域和第2 DNA剪切结构域的第2核酸酶亚基的基因。向细胞中的导入可以通过使这些载体与在生物体外培养的细胞接触来进行，也可以通过对生物体给予这些载体以使其与生物体内存在的细胞间接接触来进行。这些载体可以同时、或者分别导入到细胞中。将这些载体分别导入细胞中时，例如，可以预先向细胞中导入用于表达核酸酶的载体，制作该核酸酶的稳定表达株或诱导型表达株，然后，向所制作的稳定表达株或诱导型表达株中导入第1方案～第6方案的任一方案的本发明的载体。进行上述的向细胞中导入载体的步骤时，在细胞内，上述的包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶等核酸酶起作用，由上述载体生成在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、以插入为目的的所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段。另外，通过上述步骤，在细胞内的核酸中的规定部位发生剪切。之后，在细胞内，上述细胞内的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合(MMEJ)来连接，而上述细胞内的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过MMEJ来连接。由此，所期望的核酸被正确地插入到细胞的核酸的规定部位。当使用第1方案的本发明的载体时，虽然组合使用的核酸酶对包含插入前的细胞内的核酸所含的由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，但连接后的核酸因插入所期望的核酸而不包含该部分。例如，当使用CRISPR/Cas系统的核酸酶时，在连接后，所有的gRNA靶序列均会失去PAM序列和与其相邻的3个核苷酸部分的序列。由此，不会受到细胞内存在的核酸酶的再次剪切而稳定地保持，高频率地发生所期望的核酸的插入。需要说明的是，像连接后的核酸失去PAM序列或与其相邻的核苷酸这样的第1方案的本发明载体和CRISPR/Cas系统的组合可以参照两者所含的第1核苷酸序列、第2核苷酸序列、以及与这些核苷酸序列相邻的序列来适当设计。在图3中以概略图的形式显示了设计的一个例子。当使用第2方案的本发明的载体时，由于隔开两个DNA结合结构域的间隔区与连接前相比变短，因此连接后的核酸不会受到细胞内存在的核酸酶的再次剪切而稳定地保持，高频率地发生所期望的核酸的插入。需要说明的是，包含多个DNA结合结构域的核酸酶的剪切活性取决于通过DNA结合结构域识别的区所夹持的间隔区的长度，该核酸酶对具有特定长度的间隔区进行特异性剪切。在连接后的核酸中，隔开两个DNA结合结构域的间隔区由优选1～20个核苷酸长度、更优选2～15个核苷酸长度、进一步优选3～10个核苷酸长度的核苷酸序列构成。
在本发明中，用于在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的载体和用于表达核酸酶的载体可以是相同的载体，也可以是不同的载体。当使用CRISPR/Cas系统的核酸酶时，用于在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的载体、用于表达核酸酶的载体、和用于表达gRNA的载体可以是相同的载体，也可以是不同的载体。
当利用本发明的载体来插入所期望的核酸时，包含所期望的核酸的载体的一部分可被插入到细胞内的核酸中的规定部位。或者，包含所期望的核酸的载体整体可被插入到细胞内的核酸中的规定部位。图1表示通过TALEN插入包含所期望的核酸的载体整体时的概略图。图2表示通过TALEN插入包含所期望的核酸的载体的一部分时的概略图。图3表示通过CRISPR/Cas系统将包含所期望的核酸的载体的一部分插入到细胞内的核酸中的规定部位时的概略图。另外，图4表示通过CRISPR/Cas系统插入包含所期望的核酸的载体整体时的概略图。图5表示通过FokI-dCas9插入包含所期望的核酸的载体整体时的概略图。
在第9方案中，本发明提供通过第8方案的本发明的方法获得的细胞。第9方案的本发明的细胞可以通过在进行第8方案的方法中的导入后选择发生了插入的细胞而获得。关于细胞的选择，例如，当以插入为目的的核酸包含编码特定的报道蛋白的基因时，通过检测该报道蛋白的表达、并以检测到的表达量为指标进行选择，可以简便且高频率地进行细胞的选择。
在第10方案中，本发明提供包含第9方案的本发明的细胞的生物。在第8方案的本发明的方法中，当对生物体给予载体并使其与生物体内存在的细胞进行间接接触时，可获得第10方案的本发明的生物。
在第11方案中，本发明提供包含所期望的核酸的生物的制备方法，该方法包括如下步骤：使通过第8方案的本发明的方法获得的细胞分化。在第8方案的本发明的方法中，使载体与在生物体外培养的细胞接触，获得包含所期望的核酸的细胞，之后使所得细胞分化，从而制备包含所期望的核酸的成体生物。
在第12方案中，本发明提供通过第11方案的本发明的方法制备的生物。该所制备的生物在生物内的细胞所含的核酸的规定部位含有所期望的核酸，根据该所期望的核酸的功能，可将其用于基因、蛋白、脂质、糖类等生物体物质的功能分析等各种用途。
实施例
以下，根据实施例来更具体地说明本发明，但本发明并不限于实施例的范围。
实施例1. 利用了TALEN的靶向整合
在本实施例中，使用TALEN和供体载体(TAL-PITCh载体)向非洲爪蟾(Xenopus laevis)的酪氨酸酶(tyr)基因的外显子1中导入(靶向整合)了荧光蛋白基因的表达盒。
1-1. TALEN的制作：
TALEN质粒如下制作。将以pFUS_B6载体(Addgene)为模板、并通过In-Fusion Cloning(クロンテック)制作的载体和具有单一的DNA结合结构域的质粒混合，通过Golden Gate反应连接4个DNA结合结构域(STEP1质粒)。之后，将以pcDNA-TAL-NC2载体(Addgene)为模板、并通过In-Fusion Cloning(クロンテック)制作的载体和上述的STEP1质粒混合，通过第二阶段的Golden Gate反应得到了TALEN质粒。质粒的全长序列见序列表的SEQ ID NO: 1～2(Left_TALEN)和SEQ ID NO: 3～4(Right_TALEN)。
1-2. 靶向整合用供体载体(TAL-PITCh载体)的制作：
制作了具有更换了tyrTALEN靶序列的间隔区的前半(第1核苷酸序列)和后半(第2核苷酸序列)的改变TALEN序列的质粒(图1)。模板质粒使用在pCS2+的ClaI和XbaI位点插入了EGFP的pCS2/EGFP，使用添加上述序列的引物组(Xltyr-CMVEGFP-F+Xltyr-CMVEGFP-R；序列见后述的表1)进行了反向PCR。接下来，向PCR反应液中加入DpnI(New England Biolabs)，消化了模板质粒。将已纯化的反应液自身连接，进行了亚克隆。由通过序列分析确认到了正确插入的克隆调制质粒，作为供体载体(序列见序列表的SEQ ID NO: 5～6。在SEQ ID NO:5中，第98位～第817位的核苷酸序列显示EGFP的ORF序列。其被插入到pCS2+的ClaI/XbaI位点。在SEQ ID NO: 5中，第1116位～第1167位的核苷酸序列显示改变TALEN的识别序列。)。
1-3. 对非洲爪蟾进行的微量显微注入：
在实验前1天，对非洲爪蟾给予人下垂体性性腺刺激激素(あすか制药)，其中雄性给予150单位、雌性给予600单位。第二天，在采集的卵中加入数滴精子悬浮液，使其人工受精。约20分钟后加入3%的半胱氨酸溶液，将受精卵脱胶，之后用0.1×MMR(两栖类用林格氏液)清洗数次，转移到5%的Ficoll/0.3×MMR中。通过微量显微注入法将上述1-1和1-2中制作的酪氨酸酶TALEN mRNA mix(Left、Right各250pg)和供体载体(100pg)一同导入受精卵中(实验组)。作为阴性对照，将250pg单独的TALEN mRNA Right和100pg供体载体一同导入。在20℃下培养胚胎，在囊胚期转移到0.1×MMR中，促进生长。
1-4. 靶向整合的检测：
在荧光实体显微镜下观察同时导入有TALEN和载体的胚胎(蝌蚪期)，判定了是否存在GFP荧光。从对照组和实验组的胚胎中提取每个个体的基因组DNA，通过PCR判定了靶位点中的供体载体导入。使用设计在TALEN靶序列的上游和下游、载体侧的引物组，通过PCR扩增了基因组和载体的5’侧和3’侧的连接点。5’侧使用引物组tyr-genomic-F和pCS2-R、3’侧使用引物组tyr-genomic-R和pCS2-F(序列见后述的表1)。通过琼脂糖电泳确认后，切取目标大小的谱带，亚克隆到pBluescript SK载体中。通过集落PCR扩增插入序列，通过直接测序进行了分析。测序使用了CEQ-8000(ベックマン・コールター)。
结果：
供体载体导入胚(蝌蚪期)中的实验组(TALEN mix+载体注入胚)和阴性对照组(TALENR+载体注入胚)的表型见图6A和图6B。在实验组中，由于tyr基因被破坏，因此显示出在视网膜色素上皮或黑色素保有细胞中缺少色素(白化现象)的表型，而且在全身观察到多个发强烈GFP荧光的个体(图6B)。在阴性对照组中没有观察到白化现象，在一部分中观察到了发出镶嵌式的GFP荧光的个体(图6A)。将实验组、阴性对照组的表型比例分为以下4类。Full：全身可见GFP荧光的个体、Half：左右任一半带有荧光的个体、Mosaic：带有镶嵌式的荧光的个体、Non：未观察到GFP荧光的个体(图7)。在阴性对照组中完全没有看到Full和Half的个体，相对于此，在实验组中，存活的个体中约20%显示出Full的表型、约50%显示出Half的表型。
接下来，从图6观察到的显示出Full的表型的5个蝌蚪个体和阴性对照组的3个个体中分别提取基因组DNA，进行了基因分型。为了确认基因组上的插入部位和载体的连接点，使用设计在tyrTALEN靶序列的上游和下游、载体侧的引物组，通过PCR扩增了靶部位和供体载体的5’侧和3’侧的连接点(图8)。在将PCR产物进行电泳时，在实验组No.1、3、4(5’侧)、No.2、3、4(3’侧)确认到了所预料的大小的谱带(图8、箭头)。另一方面，在阴性对照组中没有确认到PCR产物。接下来，为了研究连接点的序列，将在NO.3、4中检测到的5’侧和3’侧的PCR产物亚克隆，进行了序列分析。其结果，No.3的5’侧的连接点以100%(5/5克隆)的比例确认到了通过MMEJ连接时所期待的序列，而3’侧的连接点以80%(4/5克隆)的比例确认到了通过MMEJ连接时所期待的序列(图9A)。No.4的5’侧的连接点确认到缺失了10个核苷酸或插入了3个核苷酸的序列，而3’侧的连接点可以以100%(3/3)的比例确认到所期待的序列(图9B)。
上述1-1～1-4中使用的引物序列见以下的表1。
[表1]
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例2. 利用CRISPR/Cas9系统对HEK293T细胞进行靶向整合
在本实施例中，利用CRISPR/Cas9系统向HEK293T细胞的核仁纤维蛋白(FBL)基因的最后的编码外显子中导入(靶向整合)了荧光蛋白基因的表达盒。本实施例的概要见图10。简而言之，向HEK293T细胞中同时导入图10中以橙色、红色和绿色显示的表达3种gRNA和Cas9的载体和供体载体(CRIS-PITCh载体)，利用嘌呤霉素进行筛选后，进行了DNA测序和荧光观察。
2-1. gRNA和Cas9表达载体的制作：
如SCIENTIFIC REPORTS 2014 Jun 23; 4: 5400. doi: 10.1038/srep05400所记载，制作了同时表达3种gRNA和Cas9的载体。简而言之，改变pX330载体(Addgene; Plasmid42230)使通过Golden Gate反应可以连接多个gRNA表达盒，在3种改变型pX330载体中分别插入已退火的合成寡核苷酸。具体而言，使寡核苷酸13和14退火，制作了用于生成基因组剪切用gRNA(图10的橙色)的合成寡核苷酸。另外，使寡核苷酸15和16退火，制作了用于生成供体载体的5’侧剪切用gRNA(图10的红色)的合成寡核苷酸。再使寡核苷酸17和18退火，制作了用于生成供体载体的3’侧剪切用gRNA(图10的绿色)的合成寡核苷酸。向各质粒中插入所制作的各合成寡核苷酸后，通过Golden Gate反应合并载体，得到了同时表达3种gRNA和Cas9的载体。
2-2. 靶向整合用供体载体(CRIS-PITCh载体)的制作：
CRIS-PITCh载体如下制作。在以pCMV(Stratagene)为基质的载体上，一边除去CMV启动子，一边使用In-Fusion Cloning构建了载体，使形成5’侧的gRNA靶序列、mNeonGreen编码序列、2A肽编码序列、嘌呤霉素耐性基因的编码序列、3’侧的gRNA靶序列这样的排列。图11A和图11B中显示所构建的载体的全长序列(SEQ ID NO: 23)。在图11A和图11B中，mNeonGreen的编码序列用绿色(SEQ ID NO: 23的第1566位～第2273位的核苷酸)显示，2A肽的编码序列用紫色(SEQ ID NO: 23的第2274位～第2336位的核苷酸)显示，嘌呤霉素耐性基因的编码序列用蓝色(SEQ ID NO: 23的第2337位～第2936位的核苷酸)显示。下划线显示5’侧和3’侧的gRNA靶序列。
2-3. 对HEK293T细胞进行的导入：
对HEK293T细胞进行的导入如下进行。用含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养了HEK293T细胞。将所培养的细胞在导入质粒的前1天以1×105细胞/孔的细胞密度接种在6孔板中。导入质粒时，使用Lipofectamine LTX(ライフテクノロジーズ)导入了400ng gRNA和Cas9表达载体、200ng CRIS-PITCh载体。在导入质粒后，用无药培养基培养了细胞3天，之后用含有1μg/mL的嘌呤霉素的培养基培养了6天。之后，通过有限稀释在96孔板上进行了单细胞克隆。
2-4. 靶向整合的检测：
使用共聚焦激光显微镜观察同时导入有表达gRNA和Cas9的载体和CRIS-PITCh载体的HEK293T细胞，判定了是否存在荧光。接下来，从嘌呤霉素耐性细胞克隆中提取基因组DNA，确认了靶位点的供体载体导入。使用设计在CRISPR靶序列的上游和下游、载体侧的引物组，通过PCR扩增了基因组和载体的5’侧和3’侧的连接点。5’侧使用了引物19和20的引物组，而3’侧使用了引物21和22的引物组(序列见后述的表2)。在通过琼脂糖电泳进行确认后，切取目标大小的谱带，通过直接测序进行了分析。测序使用了ABI 3130xl Genetic analyzer(ライフテクノロジーズ)。
结果：
在激光共聚焦显微镜下的观察结果见图12。由于FBL是核小体特异性蛋白，所以当成功地向FBL基因中靶向整合了荧光蛋白基因时，荧光蛋白分布在核小体中。如图12所示，得到了与FBL蛋白的局部存在图案(核小体)一致的荧光图像。接下来，研究了基因组和所导入的载体的5’侧和3’侧的连接点的序列。其结果，当5’侧的连接点通过MMEJ连接时，所期待的序列以50%(2/4克隆)的比例存在，剩下的2克隆发生了9个核苷酸的缺失或插入(图13)。3’侧的连接点虽然完全形成如所期待的序列的克隆为0%(0/4克隆)，但有1克隆只确认到1个核苷酸的取代，其他则是每一克隆分别确认到1个核苷酸的缺失、5个核苷酸的缺失、7个核苷酸的缺失(图13)。需要说明的是，同样利用CRISPR/Cas9系统向HCT116细胞的β-肌动蛋白(ACTB)基因座中导入(靶向整合)了荧光蛋白基因的表达盒时，也得到了与上述的HEK293T细胞中的靶向整合相同的结果。
上述2-1～2-4中使用的寡核苷酸的序列见以下的表2。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure IDA0000977284860000011
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Claims (6)

1.载体在生物体外用于通过核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法中的应用，
其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，
上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核苷酸序列构成的区和上述由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，
上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区，
上述载体通过上述核酸酶产生在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段，
上述细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，上述细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，由此插入上述所期望的核酸。
2.载体在生物体外用于通过包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法中的应用，
其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，
在上述细胞所含的核酸中，由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，
其中，上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区，
在上述载体中，由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，
上述载体通过上述核酸酶产生在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段，
上述细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，上述细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，由此插入上述所期望的核酸。
3.权利要求2所述的应用，其中，上述核酸酶为同源二聚体型的核酸酶，上述载体为环状载体。
4.权利要求1所述的应用，其中，核酸酶为Cas9核酸酶。
5.权利要求2所述的应用，其中，核酸酶为TALEN。
6.权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，第1核苷酸序列为3个核苷酸长度～10个核苷酸长度，并且第2核苷酸序列为3个核苷酸长度～10个核苷酸长度。
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