WO2023120536A1

WO2023120536A1 - 単一のａａｖベクターによるゲノム編集を用いた遺伝子治療

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Publication number: WO2023120536A1
Application number: PCT/JP2022/046944
Authority: WO
Inventors: 康二西口; 幸輔藤田
Original assignee: 国立大学法人東海国立大学機構
Priority date: 2021-12-21
Filing date: 2022-12-20
Publication date: 2023-06-29
Also published as: WO2023120536A9

Abstract

種々の遺伝子疾患の治療又は多くの変異矯正に広く応用することができるベクターおよび方法を提供すること。細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する方法であって、前記所望の核酸を含むベクターを前記細胞に導入する工程であって、前記ベクターは、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含む、工程と、前記細胞を、前記切断が生じるような条件に配置する工程とを含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、方法。

Description

単一のＡＡＶベクターによるゲノム編集を用いた遺伝子治療

　本開示は、細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、核酸の導入方法、該所望の核酸を含む細胞、及び眼疾患の治療方法に関する。

　アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は従来から遺伝子治療に広く用いられており、近年、遺伝性網膜変性疾患に対して、ＡＡＶを使った遺伝子補充療法の成功例が複数報告されている。治療コンセプトとしては、機能低下又は欠損している病因遺伝子に対して、正常機能を有する遺伝子を、ＡＡＶを使って標的網膜細胞に遺伝子導入することにより病気の根治を目指すという非常にリーズナブルなものである。

　この治療プラットフォームは様々な遺伝子を対象に応用可能ではあるが、網膜変性の頻度の高い病因遺伝子の多くは４０００ｂｐを大きく超える一方で、ＡＡＶのベクターに導入可能な遺伝子のサイズ（約４０００ｂｐ以下)に制約がある。例えば日本人網膜色素変性で圧倒的に頻度の高い病因遺伝子であるＥＹＳ遺伝子は約１００００ｂｐあり、従来のＡＡＶ遺伝子治療の対象にはならない。

　他方、近年開発されたＰＩＴＣｈ(Precise　Integration　into　Target　Chromosome)法では、ゲノム上の正確な位置にＤＮＡ断片を挿入する際に用いるホモロジーアームが従来のものと比べて非常に短く、この方法を採用することによりゲノム編集治療に必要な要素の大幅な小型化が可能になった。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する方法であって、
　前記所望の核酸を含むベクターを前記細胞に導入する工程であって、前記ベクターは、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含む、工程と、
　前記細胞を、前記切断が生じるような条件に配置する工程と
を含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、方法。
（項目１ａ）
　前記ベクターは、少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、上記項目に記載の方法。
（項目２）
　前記標的核酸配列がイントロンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３）
　少なくとも２箇所の標的核酸配列を切断し、前記２箇所の標的核酸配列のうち、少なくとも１箇所がイントロンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８ａ）
　前記ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記細胞に特異的なプロモーターの長さが約７００塩基以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモ
ーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
　インビトロで行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４ａ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４ｂ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４ｃ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４ｄ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１）
　細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
　前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含み、
　前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、ベクター。
（項目Ａ１ａ）
　少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、上記項目に記載のベクター。
（項目Ａ２）
　前記標的核酸配列がイントロンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ３）
　少なくとも２箇所の標的核酸配列を切断し、前記Ａ２箇所の標的核酸配列のうち、少なくとも１箇所がイントロンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ４）
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ５）
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ６）
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ７）
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ８）
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ８ａ）
　Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ９）
　前記細胞に特異的プロモーターの長さが約７００塩基以下である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１０）
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１１）
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１２）
　対象における眼疾患、障害または症状を治療または予防するための、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１４ａ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１４ｂ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１４ｃ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ａ１４ｄ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｂ１）
　細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的イントロン配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する方法であって、
　前記所望の核酸を含むベクターを前記細胞に導入する工程であって、前記ベクターは、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含む、工程と、
　前記細胞を、前記切断が生じるような条件に配置する工程と
を含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、方法。
（項目Ｂ１ａ）
　前記ベクターは、少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ２）
　少なくとも１箇所の標的核酸配列をさらに切断する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ３）
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的イントロン配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ７）
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ８ａ）
　前記ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ８）
　前記細胞に特異的プロモーターの長さが約７００塩基以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ９）
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、上記項目のいずれか一項項に記載の方法。
（項目Ｂ１０）
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１１）
　インビトロで行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１４ａ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１４ｂ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１４ｃ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１４ｄ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｄ１）
　細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的イントロン配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
　前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含み、
　前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、ベクター。
（項目Ｄ１ａ）
　少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、上記項目に記載のベクター。
（項目Ｄ２）
　少なくとも１箇所の標的核酸配列をさらに切断する、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ３）
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ４）
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ５）
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ６）
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ７）
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項記載のベクター。
（項目Ｄ８ａ）
　Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ８）
　前記細胞に特異的プロモーターの長さが約７００塩基以下である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ９）
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ１０）
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ１１）
　対象における眼疾患、障害または症状を治療または予防するための、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ１４ａ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ１４ｂ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ１４ｃ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｄ１４ｄ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｃ１）
　細胞内の核酸における１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する方法であって、
　前記所望の核酸を含むベクターを前記細胞に導入する工程であって、前記ベクターは、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含む、工程と、
　前記細胞を、前記切断が生じるような条件に配置する工程と
を含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、方法。
（項目Ｃ１ａ）
　少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ｃ２）
　前記標的核酸配列がイントロンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ３）
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的イントロン配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ４）
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ５）
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ６）
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ７）
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８ａ）
　前記ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ８）
　前記細胞に特異的プロモーターの長さが約７００塩基以下である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ９）
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１０）
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１１）
　インビトロで行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１４ａ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１４ｂ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１４ｃ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｃ１４ｄ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｅ１）
　細胞内の核酸における１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
　前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含み、
　前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、ベクター。
（項目Ｅ１ａ）
　少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、上記項目に記載のベクター。
（項目Ｅ２）
　前記標的核酸配列がイントロンを含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ３）
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ４）
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ５）
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ６）
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ７）
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ８ａ）
　Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ８）
　前記細胞に特異的プロモーターの長さが約７００塩基以下である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ９）
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ１０）
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ１１）
　対象における眼疾患、障害または症状を治療または予防するための、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ１４ａ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ１４ｂ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ１４ｃ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。
（項目Ｅ１４ｄ）
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、上記項目のいずれか一項に記載のベクター。

　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

　本開示の方法により、細胞内のゲノムにおける標的核酸配列をターゲットとすることで、種々の遺伝子疾患の治療又は多くの変異矯正に広く応用することができる。

図１は、ゲノム編集ベクターの設計を示す模式図である。ａ．ＭＭＥＪシングルカットベクターとドナーテンプレートの拡大図である。総サイズは４，７５０ｂｐ。ｂ．ＨＩＴＩベクターのドナーテンプレートの拡大図である。ｃ．ＳＡＴＩベクターのドナーテンプレートの拡大図である。ｄ．シングルカットＭＭＥＪを用いた変異修復戦略の説明図である。編集部位より下流の変異は、ＭＭＥＪやＨＮＥＪを介し、通常のエキソンカセット挿入により修復されることができる。ＮＨＥＪ修復では、ＧＯＩはドナーテンプレートの隣接するｇＲＮＡ標的部位に対して反対方向に挿入される。そのため、ＮＨＥＪによってＧＯＩが正しい向きでゲノムに挿入されると、これらの部位は破壊されてＳａＣａｓ９による再切断を防ぐことができる。逆に、ＧＯＩが誤った方向でゲノムに挿入された場合、隣接するｇＲＮＡ標的部位はそのまま残り、ＧＯＩが正しい方向に配置されるまで、ＳａＣａｓ９による再切断を受けることになる。ＭＭＥＪ（ｍｉｃｒｏ－ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｉｎｇ）、ＮＨＥＪ（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｅｎｄ　－ｊｏｉｎｎｉｎｇ）、ＨＩＴＩ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）、ＳＡＴＩ（ｓｉｎｇｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍ　ｄｏｎｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｎｔｒｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）ＧＯＩ（ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、ｇＲＮＡ－Ｔ（ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ　ｔａｒｇｅｔ）、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ）ＩＴＲ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔ）、ＭＨＡ（ｍｉｃｒｏ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍ）、ＮＬＳ（ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌ）、ｐＡ（ｐｌｏｙ　Ａ）図２は、ＭＭＥＪシングルカットゲノム編集の塩基配列解析結果を示す模式図である。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＭＥＪとＨＩＴＩを介したＰＣＲアンプリコンの代表的なクロマトグラムを示す。図中、Ｎｏｎ　ｃｏｄｅ　ＲＮＡの配列を配列番号１に、ＭＭＥＪ　５／１３　ｃｌｏｎｅｓの配列を配列番号２に、ＨＩＴＩ　８／１３　ｃｌｏｎｅｓの配列を配列番号３に、それぞれ示した。図３は、シングルカットＭＭＥＪによるゲノム編集のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの結果を示す。ａ．ジェノタイピングＰＣＲのプライマー設計図である。ｂ．シングルカットのＭＭＥＪ、ＨＩＴＩ、ＳＡＴＩのジェノタイピングＰＣＲの結果である。ｃ．ゲルバンド像の測定による編集効率の定量化を示すグラフである。図４は、シングルカットＭＭＥＪによるゲノム編集のｉｎ　ｖｉｖｏでの結果を示す。ａ．Ｂ６マウスにおけるシングルカットＭＭＥＪによるゲノム編集の模式図である。編集部位から下流のマウスＲｈｏエキソンは、ＭＭＥＪ－Ｈを介してヒトエキソンカセット挿入により置換される。ｂ．シングルカットのＭＭＥＪ－ＨのジェノタイピングＰＣＲの結果である。ｃ．無処理およびＭＭＥＪ－ＨでのヒトＲｈｏ　ｇＲＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲの結果である。データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。図５は、ＭＭＥＪ－Ｈを介した網膜色素変性症モデルマウスのｉｎ　ｖｉｖｏゲノム編集の結果を示す。ａ．ヒトＲＨＯとマウスＲｈｏ　ｍＲＮＡの相対的発現量のグラフである。Ｒｈｏ^{ｔｖｒｍ３３４／＋}の眼球におけるマウスＲｈｏの発現は、野生型無処理マウスと比較して減少したが、Ｒｈｏ^{ｔｖｒｍ３３４／＋}の眼球におけるヒトＲｈｏの発現はＭＭＥＪ－Ｈ処理後に増加した。ＭＭＥＪ－ＨはＲＨＯ　ｃＤＮＡ（Ｅｘ２－５）挿入処理した眼球（Ｎ＝２）、Ｍｏｃｋは対照として投与したＧＦＰ　ｃＤＮＡ（Ｎ＝２）を示し、いずれもＡＡＶで投与した。ｂ．Ｆｌａｓｈ　ＶＥＰｓの結果である。処置した目の対側の皮質応答は、光感受性の改善を明らかにした。ＭＭＥＪ－ＨとＭｏｃｋについて、それぞれＮ＝２、および２である。恐怖条件付け光照射前（ベースライン）と照射中（刺激）のフリージング時間の変化は、光感受性の改善を反映した。ＭＭＥＪ－ＨとＭｏｃｋは、それぞれＮ＝２，および３である。ＭＭＥＪ－Ｈ、Ｍｏｃｋ、ＮｏＴｘ（未治療）は、それぞれＮ＝２、３、５である。ｅ．様々な空間解像度の位相反転格子に反応する眼球の対側の視覚野のパターン視覚誘発電位（ｐＶＥＰ）を示す。ＭＭＥＪ－ＨとＭｏｃｋで、それぞれＮ＝２，および２である。ＭＭＥＪ－Ｈを投与したマウスは、より大きな振幅を示した。図６は、設計したゲノム編集ベクターの模式図を示す。ａ．ＲＨＯエキソン１－５挿入用ＭＭＥＪ－Ｈシングルカットベクターの設計とドナーテンプレートの拡大図を示す。ｂ．ＲＨＯエキソン１－５挿入ＨＩＴＩベクターのドナーテンプレートの拡大図を示す。ｃ．ＲＨＯエキソン３－５挿入ＭＭＥＪ－Ｈベクターのドナーテンプレートの拡大図を示す。ｄ．ＲＨＯエキソン４－５挿入ＭＭＥＪ－Ｈベクターのドナーテンプレートの拡大図を示す。MMEJ,　micro-homology-mediated　end-joining;　HITI,　homology-independent　targeted　integration;　gRNA-T,　guide　RNA　target;　PAM,　protospacer　adjacent　motif;　ITR,　inverted　terminal　repeat;　MHA,　micro　homology　arm;　NLS,　nuclear　localizing　signal;　pA,　ploy　A;　PAM,　protospacer　adjacent　motif 図７は、ＡＡＶにおけるゲノムパッケージングの評価結果である。ＡＡＶから抽出したＤＮＡを表すナノポアシーケンスリードのアラインメントである。ａ．対照となるコーディングＭＭＥＪ－Ｈ　ＲＨＯ　Ｅｘ２－５（上）とＭＭＥＪ－Ｈ　ＲＨＯ　Ｅｘ１－５（下）のプラスミド配列を示す。ｂ．ＡＡＶ．ＭＭＥＪ－Ｈ　ＲＨＯ　Ｅｘ２－５（上）とＡＡＶ．ＭＭＥＪ－Ｈ　ＲＨＯ　Ｅｘ１－５（下）のＡＡＶゲノム配列を示す。図８は、神経網膜特異的プロモーターを選択するため、ＧＲＫ１－９３プロモーターを用いたＡＡＶ注入の１週間後に行ったマカカ網膜切片のＥｘ　ｖｉｖｏ　ＥＧＦＰ　レポーター解析結果である。切片はＤＡＰＩのみで染色した。ＯＮＬは視細胞体と一致する。スケールバー：２０μｍ、ＯＮＬ：外顆粒層。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。

　本明細書において、「ゲノム」とは、生物体の遺伝情報を指す。核酸ゲノムは核酸（特にはＤＮＡ又はＲＮＡ）であるゲノムを指し、本明細書では「ゲノム核酸」と互換的に用いられる。

　本明細書において、「改変」とは、細胞内の核酸（例えば、ＤＮＡ）に塩基配列（この文脈では１つの塩基であり得る）を挿入すること、細胞内の核酸（例えば、ＤＮＡ）の塩基配列（この文脈では１つの塩基であり得る）を欠失すること、もしくは細胞内の核酸（例えば、ＤＮＡ）の塩基配列（この文脈では１つの塩基であり得る）を置換すること（別のものにかえること）、またはそれらの組み合わせをいう。

　本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、核酸自体であり得、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」「ＲＮＡ」および「ＤＮＡ」を指すことがあり、時に核酸によってコードされるタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド又はペプチドを指すこともあり、当業者は文脈に応じて適切に理解し得る。こうしたタンパク質をコードする遺伝子は、対象となる生物において内因性であってもよいし、外因性であってもよい。また、公知のこれらの遺伝子を適宜利用できる。遺伝子としては、由来を問わないで利用できる。すなわち、遺伝子は、対象となる生物以外の他の種の生物、他の属の生物に由来するものであってもよいし、動物、植物、真菌（カビ等）、細菌などの生物に由来するものであってもよい。こうした遺伝子に関する情報は、当業者であれば、NCBI（National　Center　for　Biotechnology　Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov）等のＨＰにアクセスすることにより適宜入手できる。これらの遺伝子は、各活性を有する限りにおいて、データベース等において開示される配列情報と一定の関係を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

　本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本開示の実施形態に係る抗体が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がＬ型、またはＤ型であってもよい。それらのような場合でも、本開示の実施形態に係る蛋白質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えば、Ｎ末端修飾（例えば、アセチル化、ミリストイル化等）、Ｃ末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、または側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。アミノ酸は、本開示の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

　本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’－Ｏ－メチル－リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’－Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ－５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ－５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’－Ｏ－プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’－メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６０：　２６０５－２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　８：９１－９８（１９９４））。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。

　本明細書において遺伝子、タンパク質または核酸の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列または核酸配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。このような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本開示の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。

　アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ２．２．２８（２０１３．４．２発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。類似性は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。

　本開示の一実施形態において「９０％以上」は、例えば、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％以上であってもよく、それらいずれか２つの値の範囲内であってもよい。上記「相同性」は、２つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、当該技術分野で公知の方法に従って算定してもよい。割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該技術分野で従来からよく知られている（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＧＥＮＥＴＹＸ等）。本明細書において「相同性」は、特に断りのない限りＮＣＢＩのＢＬＡＳＴによって測定された値で表すことができる。ＢＬＡＳＴでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Ｂｌａｓｔｐをデフォルト設定で使用できる。測定結果はＰｏｓｉｔｉｖｅｓまたはＩｄｅｎｔｉｔｉｅｓとして数値化される。

　本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、「対象遺伝子」またはその抗体の機能的等価物は、対象遺伝子またはその抗体自体ではないが、対象遺伝子またはその抗体の変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、対象遺伝子またはその抗体の持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、対象遺伝子またはその抗体自体またはこの対象遺伝子またはその抗体の変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、対象遺伝子またはその抗体自体または対象遺伝子またはその抗体の変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本開示において、対象遺伝子またはその抗体の機能的等価物は、格別に言及していなくても、対象遺伝子またはその抗体と同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ　＆　Ｌｉｐｍａｎ，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８５：２４４４－２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本開示において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

　本開示の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～９個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～２個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、対象遺伝子のアミノ酸配列において１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。

　本明細書において「ベクター」とは、複製開始点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外のベクターであり得、好ましくはＤＮＡプラスミドである。

　本明細書において「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター」とは、転写調節エレメント、すなわち、一つまたは複数のプロモーターおよび／またはエンハンサーに機能的に連結したタンパク質コード配列、並びにポリアデニル化配列、並びに、所望により、前記タンパク質コード配列のエキソン間に挿入された一つまたは複数のイントロンに隣接しているＡＡＶ５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列およびＡＡＶ３’ＩＴＲを有する、一本鎖または二本鎖の核酸を指す。一本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶウイルス粒子のゲノム内に存在し、本明細書で開示される核酸配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり得る核酸を指す。このような一本鎖核酸のサイズは塩基単位で与えられる。二本鎖ＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクター核酸を発現または遺伝子導入するために使用される、プラスミド（例えば、ｐＵＣ１９）のＤＮＡ内、または二本鎖ウイルス（例えば、バキュロウイルス）のゲノム内に存在する核酸を指す。このような二本鎖核酸のサイズは塩基対（ｂｐ）単位で与えられる。

　本明細書で互換的に使用される「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、「一本鎖ｇＲＮＡ」、および「ｓｇＲＮＡ」は、少なくとも目的の標的核酸配列とハイブリダイズするスペーサー配列と、ＣＲＩＳＰＲリピート配列とを含む、短い合成ＲＮＡを指す。

　本明細書において「ｇＲＮＡ標的配列」とは、ガイドＲＮＡが標的とする配列である。

　本明細書において「標的核酸配列」とは、既知のまたは推定上の遺伝子産物をコードする、あらゆるヌクレオチド配列を指す。標的核酸配列は、遺伝性疾患に関与する変異した遺伝子であり得る。

　本明細書において「所望の核酸」とは、細胞の核酸ゲノム中に挿入する対象となる任意の配列であり、機能的な核酸配列や、その一部を含む。

　本明細書において「細胞に特異的なプロモーター」とは、ある細胞において特異的に機能するプロモーターを指し、例えば網膜で用いられるものとして、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーターなどが挙げられる。

　本明細書において「Ｃａｓ」、「Ｃａｓタンパク質」、または「Ｃａｓヌクレアーゼ」とは、Ｃａｓタンパク質（例えば多様な細菌種からのＣａｓヌクレアーゼ）、そのフラグメント、バリアント（例えば触媒として不活性なＣａｓもしくはＣａｓニッカーゼ）、または融合タンパク質（例えば別のタンパク質ドメインに融合したＣａｓ）を含む、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを指す。例えば「Ｃａｓ９」といった場合、Ｃａｓ９という名称が使用されていなくても、同様の機能を有する場合、本開示の範囲に包含される。ＣａｓとしてはＣａｓ９やＣａｓ１２などを挙げることができる。

　本明細書において、遺伝子または核酸の「導入」とは、外来性もしくは内在性の遺伝子、好ましくは機能遺伝子を適宜の導入技術により、その遺伝子を、例えば染色体ゲノム等に導入することをいう。遺伝子の導入には、ファージ、プラスミドなどのベクターを用いて遺伝子を導入することができ、また、自然形質転換法、接合法、プロトプラスト－ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法なども用いることができる。また、当該分野で公知の標的遺伝子組換え法を利用すれば、内在性の機能遺伝子と置換させることによって外来性の機能遺伝子を導入することもできる。なお、外来性の機能遺伝子は、その生物の染色体ゲノムに元来存在しない遺伝子であり、他の生物種由来の遺伝子やＰＣＲ等で作製した合成遺伝子等でありうる。遺伝子の導入には、既存のゲノムに対してゲノム編集を行うことで所望の遺伝子に変換することも包含される。

　本明細書において「ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター」とは、ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターであれば任意のものを使用することができ、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが含まれる。

　本明細書において「ホモロジーアーム配列」とは、相同的組換えを通じて、ゲノムに対して遺伝子を標的化するのに適するポリヌクレオチドを意味する。一般的に、２つのホモロジーアームがゲノムに組み込まれる遺伝子と隣接し、各ホモロジーアームは、組込みが起きる遺伝子座の上流及び下流に配列を含む。一般的に、第１のホモロジーアームは、長さが約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００個又はそれ以上の塩基対であり、及び第２のホモロジーアームは、長さが少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約１５００、約２０００個のヌクレオチドである。

　本明細書において「イントロン」とは、遺伝子内のＤＮＡ配列とプロセッシングされていないＲＮＡ転写における対応する配列の両方を指す。ＲＮＡプロセッシング経路の部分として、イントロンは、転写直後または転写と同時のいずれかで、ＲＮＡスプライシングにより除去され得る。イントロンは、大部分の生物および多数のウイルスの遺伝子に見いだされる。それらは、タンパク質、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）およびトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を生成するものを含めた、幅広い範囲の遺伝子に位置し得る。本開示の技術の対象としてイントロン部分を標的とすることができる。

　本明細書において「エキソン」とは、イントロンがＲＮＡスプライシングによって除去された後のその遺伝子によって産生された最終の成熟ＲＮＡの部分をコードする遺伝子の任意の部分とすることができる。用語「エキソン」は、遺伝子内のＤＮＡ配列と、ＲＮＡ転写における対応する配列の両方を指す。本開示の技術の対象としてエキソン部分を標的とすることができる。

　本明細書において、ある「配列」が別の「配列」を「認識する」とは、ある配列と別の配列とが、例えば完全に、または部分的に相補的な関係であることにより、完全に、または部分的に結合することを含む。ある「配列」が別の「配列」を「認識する」かどうかは、配列情報を比較すること、あるいは結合（ハイブリダイズ実験）などで確認することができる。

　本明細書において「反対側」とは、配列上における上流または下流の位置関係を指し、例えば、配列Ａの配列Ｂとは反対側に存在する配列Ｃとは、配列Ａが配列Ｂの上流に位置する場合には、配列Ｃは配列Ａの上流に位置し、配列Ａが配列Ｂの下流に位置する場合には、配列Ｃは配列Ａの下流に位置する。

　本明細書において配列に「隣接」とは、配列上における上流または下流の位置関係を指し、例えば、配列Ａに隣接する配列Ｂとは、配列Ａの上流または下流に接して配列Ｂが位置することのほか、本開示の目的が達せられる限り、直接接していなくても一定程度近傍に存在すれば「隣接」の概念に入ると理解される。

　本明細書において「ＰＡＭ配列」または「プロトスペーサー隣接モチーフ」とは、相互に互換的に使用され、Ｃａｓタンパク質によるＤＮＡ切断の際に、Ｃａｓタンパク質に認識される配列を指す。ＰＡＭの配列及び位置は、Ｃａｓタンパク質の種類によって異なる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質の場合、ＰＡＭは標的配列の３'側直後に隣接する必要がある。Ｃａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭの配列は、Ｃａｓ９タンパク質が由来する細菌種によって異なっている。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＧＧ」であり、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＡＧＡＡ」であり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＧＲＲＴ」又は「ＮＮＧＲＲ（Ｎ）」であり、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭは「ＮＮＮＮＧＡＴＴ」であり、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのＣａｓ９タンパク質に対応する「ＮＡＡＡＡＣ」である（「Ｒ」はＡ又はＧ；「Ｎ」は、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣ）。

　本明細書において「Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列」とは、例えば、ＲｈＫプロモーターを挙げることができ、Ｃａｓの発現や、安定性を増強させる任意の配列を含む。転写量を増加させる作用をもつエンハンサー配列（例えばＣＭＶエンハンサーなど）や、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強する目的で、特定のイントロン配列（例えばｇｌｏｂｌｉｎイントロンなど）をプロモーターの後に配置することも含まれる。本開示で使用されるＣａｓとしては、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２などを挙げることができる。

　本明細書において「Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列」とは、例えば、半減期２時間のｄ２タグなどの不安定化タグ配列が含まれる。

　本明細書において「自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット」とは、例えば、同じ治療遺伝子に対する異なる、または同じｇＲＮＡ発現カセット（プロモーター＋ｇＲＮＡ＋ｓｃａｆｆｏｌｄ）や、治療に有用な別の遺伝子に対するｇＲＮＡ発現カセット（プロモーター＋ｇＲＮＡ＋ｓｃａｆｆｏｌｄ）などが含まれる。

　本明細書において「自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列」とは、例えば、Ｃａｓ９配列を標的とするｇＲＮＡなどが含まれる。

　本明細書において「対象」とは、例えば、ヒト；ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの非ヒト哺乳動物；鳥類；ゼブラフィッシュなどの魚類；カエルなどの両生類；爬虫類；ショウジョウバエなどの昆虫類；甲殻類などを含む。

　本明細書において「疾患、障害または症状」とは、例えば、遺伝性網膜変性疾患、緑内障、白内障、ブドウ膜炎、視神経炎、糖尿病網膜症、網膜血管閉塞疾患、加齢黄斑変性、角膜ジストロフィ、水泡性角膜症、角膜混濁などの眼疾患の他、パーキンソン病、ハンチントン病、眼疾患（例えば、黄斑変性症、網膜変性症）、アルツハイマー病、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、脳損傷及び／又は脊髄損傷、再かん流傷害、ＡＬＳ、ダウン症、白内障、統合失調症、てんかん、ヒト白血病及び他の癌、並びに糖尿病からなる群から選択される少なくとも一つが挙げられる。

　本明細書において「眼疾患」とは、眼に関連する疾患をいい、眼に生じる症状の原因となる疾患も含む。本開示では特に、遺伝子操作あるいは編集によって改善が見込まれる種々の疾患が好ましく、そのような例としては、遺伝性網膜疾患（網膜色素変性、レーバー先天盲、杆体錐体ジストロフィ、錐体ジストロフィ、黄斑ジストロフィ、全色盲、網膜ジストロフィなど）、非遺伝性網膜疾患（加齢黄斑班変性、糖尿病網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、近視性網膜症、未熟児網膜症、脈絡膜新生血管、中心性網脈絡膜症など）、視神経疾患（遺伝性視神経萎縮、レーベル視神経症、外傷性視神経症、視神経炎、緑内障など）、ぶどう膜炎（原田病、べーチェット病、サルコイドーシス、汎ぶどう膜炎、後部ぶどう膜炎、中間部ぶどう膜炎、前部ぶどう膜炎、など）、眼感染症（サイトメガロ感染症、ヘルペス感染症、など）、眼腫瘍（悪性リンパ腫など）、角膜疾患（角膜ジストロフィ、ドライアイ、水泡性角膜症、角膜混濁など）、近視、遠視、乱視、弱視などが挙げられる。

　本明細書で使用される「遺伝性疾患」は、ゲノム内の１つ以上の異常によって、部分的にまたは完全に、直接的にまたは間接的に引き起こされる疾患、特に、生まれつき存在する状態を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、限定はされないが、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝性ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性の障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、地中海貧血症、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得る。

　本明細書において「処置」とは、広義には予防的および／または治療的のいずれかで、狭義には病的な状態からの改善（治癒）を目的として、疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和する、弱化させる、または改善すること、追加の症状を予防する、疾患または状態を阻害する、例えば、疾患または状態の発症を抑止する、疾患または状態を軽減する、疾患または状態の後退を引き起こす、疾患または状態により引き起こされる状態を軽減する、または疾患または状態の症状を停止させることを含む。本明細書において「治療」とは、病的な状態からの改善（治癒）を目的として、疾患または状態の少なくとも１つの症状を緩和する、弱化させる、または改善することをいう。

　本明細書において「予防」とは、疾患状態に曝露されるまたはこれに罹患し易い恐れがあるが、疾患状態の症状をまだ経験していないかまたは示していない対象において、疾患状態の臨床的症状を発症させないことを表す。

　本明細書において「ゲノム編集」とは、遺伝子を変化させることを指す。ゲノム編集は、変異遺伝子を修正することまたは修復することを含むことができる。ゲノム編集は、変異遺伝子または正常遺伝子などの遺伝子をノックアウトすることを含むことができる。ゲノム編集は、対象となる遺伝子を変化させることによって、疾患を治療するために使用することができる。

　本明細書において「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ」または「ＣＲＩＳＰＲ系」とは、例えばＷＯ２０１４／０９３６２２（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７）などに記載されているとおり、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性の発現または活性の誘導に関与する転写物及び他の配列要素を総称的に示し、これに含まれるものとして、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ－ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直列反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的な直列反復を含む）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも称する）、または「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓをガイドするＲＮＡ、例えばＣＲＩＳＰＲ　ＲＮＡ及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡまたはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物が挙げられる。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する配列要素（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも称する）を特徴とする。ＣＲＩＳＰＲタンパク質がＣｐｆ１タンパク質である場合、ｔｒａｃｒＲＮＡは、必要ではない。

　本明細書において「ＨＩＴＩ（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」とは、ＮＨＥＪ（非相動性末端接合）を利用して分裂細胞・非分裂細胞の両方で標的部位にＤＮＡ配列をノックインできる技術または手法をいう。

　本明細書において「ＳＡＴＩ（ｓｉｎｇｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍ　ｄｏｎｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｎｔｒｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」とは、ＨＩＴＩの改良版であり、ＮＨＥＪとＨＤＲによるゲノム編集をいう。

　本明細書において「非相同端末結合（ＮＨＥＪ）」または「非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路」とは、相同の鋳型を必要とせずに、切断末端を直接的に連結することによって、ＤＮＡ内の二本鎖切断を修復する経路を指す。ＮＨＥＪによる、鋳型に依存しないＤＮＡ末端の再連結は、ＤＮＡ切断点にランダムな微小挿入および微小欠失（インデル）を導入する、確率的な、誤りがちな修復プロセスである。この方法は、標的とされる遺伝子配列を意図的に破壊する、欠失させる、または読み枠を変更するために使用することができる。ＮＨＥＪは、一般的に、修復を誘導するための、マイクロホモロジーと呼ばれる短い相同のＤＮＡ配列を使用する。これらのマイクロホモロジーは、多くの場合、二本鎖切断の末端の単鎖オーバーハング中に存在する。このオーバーハングが完璧に適合する場合、ＮＨＥＪは通常、切断を正確に修復し、一方で、ヌクレオチドの喪失をもたらす不正確な修復も起こり得るが、これは、オーバーハングが適合しない場合にははるかに一般的である。

　本明細書において「ＤＳＢ」とは、二本鎖切断（double-strand　break）の略称であり、代表的に、ＤＮＡの二本鎖切断を意味する。

　本明細書において「ｉｎｄｅｌ」とは、共存する挿入及び欠失並びにヌクレオチドの増加または減少をもたらす突然変異を指す。

　本明細書において「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」とは、ゲノム編集技術によって誘導されたＤＮＡ二本鎖切断が生じた際、ドナーベクターの相同配列を認識し、ベクターの配列を取り込む形での修復をいう。ドナーベクター内に薬剤耐性遺伝子を挿入しておくと，ＨＤＲが生じた細胞を薬剤選択できる。ドナーＤＮＡを用いた修復機構であり、標的領域に所望の変異を導入することも可能である。

　本明細書において「ＭＭＥＪ（マイクロホモロジー媒介末端結合）」とは、ＤＳＢの切断された末端間の短い相補的配列（約５～約２５塩基対）に依存して修復を行う経路であり、片方の鎖が削り込まれて一本鎖として突出した配列を利用してＤＳＢを修復する手法である。

　本明細書において「ＭＭＥＪ－Ｈ」とは、ＤＳＢの切断された末端間の短い相補的配列（マイクロホモロジー配列。約５～約２５塩基対）を認識してＤＳＢを修復するとともに、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による修復機構を利用してＤＳＢを修復する手法である。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。

　本開示の一局面において、細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する方法であって、前記所望の核酸を含むベクターを前記細胞に導入する工程であって、前記ベクターは、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含む、工程と、前記細胞を、前記切断が生じるような条件に配置する工程とを含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、方法が提供される。

　ＡＡＶを用いたゲノム編集遺伝子治療では、ゲノム編集に必要な例えばＣａｓ９などのＣａｓ遺伝子が大きいため、遺伝子治療のために使用できる領域が限られた単一のＡＡＶベクターで、ゲノム編集により変異配列を正確に正常配列と置換するのが困難である。
　本開示者らは、従来の遺伝子治療が全長遺伝子をベクターに導入して治療するのを前提にしているのに対して、ゲノム編集を使用して遺伝子の異常配列のみ置換する（異常配列を切り出し、正常配列を挿入する）方法を採用することで、サイズが大きな遺伝子の遺伝子治療又は核酸の変異矯正にも有用なＡＡＶベクターを作製できることを見出している（ＷＯ２０２０／０９６０４９）。本開示の一実施形態においては、このようなシングルベクターを利用したゲノム編集の際に、細胞の核酸ゲノム上のイントロンまたはエキソンの少なくとも１箇所を切断して、当該切断部位に正常配列を挿入することで、あらゆるサイズの遺伝子の遺伝子治療を行うことができる。

　したがって、本開示の他の局面において、細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、ベクターが提供される。一実施形態において、このようなベクターを用いることで、細胞の核酸ゲノム上のイントロンまたはエキソンの少なくとも１箇所を切断して、細胞内の核酸ゲノムに所望の核酸を挿入することができる。

　一実施形態において、本開示のベクター及び／または方法を用いてゲノム編集を行う場合には、例えば図１に示すように、ＨＩＴＩやＳＡＴＩなどのゲノム編集技術を利用することができる。

　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を用いてゲノム編集を行う場合、Ｃａｓ９に切断されたｄｓＤＮＡ（ＤＳＢ）に対する非相同端末結合（ＮＨＥＪ）が誘導するｉｎｄｅｌｓを介した遺伝子ノックアウトと、ＤＳＢの修復用ドナー配列を利用するＨＤＲ過程を介した遺伝子ノックインを行うことになる。ＨＩＴＩ（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）では、ＮＨＥＪを介することで、高い効率で遺伝子のノックインを実現することができる。またＳＡＴＩ（ｓｉｎｇｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍ　ｄｏｎｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｎｔｒｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）はＨＩＴＩの改良版であり、ＮＨＥＪとＨＤＲによるゲノム編集である。

　二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）修復の修復過程として、ＮＨＥＪ（非相同末端結合）とテンプレートに依存するＨＤ（相同組換え）に加えて、ＤＳＢの切断された末端間の短い相補的配列（約５～約２５塩基対）に依存するＭＭＥＪ（マイクロホモロジー媒介末端結合）が知られている。一実施形態において、本開示のベクター及び／または方法を用いてゲノム編集を行う場合には、ＭＭＥＪ－Ｈという手法を用いることもできる。この場合、ＤＮＡ切断後の末端部分のマイクロホモロジー配列（約５～約２５塩基対）を認識して修復する機構の他に非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による修復機構を利用することができる。

　ＨＩＴＩによる遺伝子挿入を行う場合、ｇＲＮＡ標的配列由来の余分な配列が付加されるため、１か所切断あるいは２か所切断のいずれの場合も切断箇所はイントロン内に限定される。ＳＡＴＩも同様に挿入配列の片方にｇＲＮＡ標的配列由来の余分な配列が付加されるため、１か所のみ切断する場合は、イントロン内に限定される一方で、２か所切断する場合には、少なくとも１ヶ所がイントロンとする必要がある。ＭＭＥＪ－Ｈによる遺伝子挿入では、１か所切断あるいは２か所切断のいずれの場合も、切断箇所はイントロンおよびエキソンのいずれであってもよく、２ヶ所のイントロンまたはエキソンや、イントロンとエキソンを１か所ずつ切断してもよい。細胞内において二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）の修復機構がどの機構になるかは、細胞やゲノム配列などの種類によっておこりやすさを決めることができ、一実施形態において、ドナーの配列を変えることにより、特定の修復機構がおきたときに挿入されるようにすることができる。また一実施形態において、例えばＨＩＴＩによる修復を生じさせたい場合には、ＭＭＥＪ修復に特異的な阻害剤を投与したり、ＭＭＥＪによる修復を生じさせたい場合には、ＭＭＥＪ修復の促進のためのＮＨＥＪ阻害剤を投与したりすることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の方法を用いて所望の核酸を挿入する細胞が由来する対象としては、ヒト；ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの非ヒト哺乳動物；鳥類；ゼブラフィッシュなどの魚類；カエルなどの両生類；爬虫類；ショウジョウバエなどの昆虫類；甲殻類などが挙げられる。好ましくは、対象はヒト及び非ヒト哺乳動物である。

　一実施形態において、宿主細胞となる細胞は、生体内の細胞であってもよいし、単離された初代細胞又は培養細胞であってもよい。ゲノムはあらゆる細胞に共通する要素であるため、神経系組織の細胞、又は神経系組織以外のあらゆる臓器の細胞を対象に、開発したゲノム編集技術を応用できる。例えば、細胞は、視細胞、網膜色素上皮細胞、網膜双極細胞、網膜神経節細胞、網膜水平細胞、網膜アストロサイト、網膜ミューラー細胞、アマクリン細胞、網膜血管内皮細胞、角膜内皮細胞、角膜上皮細胞、角膜実質細胞、虹彩上皮細胞、毛様体上皮細胞、繊維柱体細胞などであることができるが、これらに限定されない。癌化が起こりにくい点で、細胞は視細胞など網膜細胞であることが好ましい。しかし、同じ中枢神経系である脳や脊髄の細胞（錐体細胞、星状細胞、顆粒細胞、プルキンエ細胞、ミクログリア、オリゴデンドロサイト、アストロサイトなど）も対象になる。

　一実施形態において、細胞は、正常な対象の細胞であることもできるが、疾患を有する対象の細胞であることが好ましく、遺伝性疾患を有する対象の細胞であることがより好ましい。

　一実施形態において、遺伝性疾患とは、遺伝子の変異が一因となって起こる疾患であればよく、例えば、疾患又は遺伝性疾患としては、主に遺伝性網膜変性疾患、緑内障、白内障、ブドウ膜炎、視神経炎、糖尿病網膜症、網膜血管閉塞疾患、加齢黄斑変性、角膜ジストロフィ、水泡性角膜症、角膜混濁などの眼疾患の他、パーキンソン病、ハンチントン病、眼疾患（例えば、黄斑変性症、網膜変性症）、アルツハイマー病、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、ペイロニー病、潰瘍性大腸炎、脳虚血（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）、脳損傷及び／又は脊髄損傷、再かん流傷害、ＡＬＳ、ダウン症、白内障、統合失調症、てんかん、ヒト白血病及び他の癌、並びに糖尿病からなる群から選択される少なくとも一つが挙げられるが、これらに限定されない。

　一実施形態において、本開示の方法によれば、ロドプシン遺伝子異常を治療することができる。本開示の方法によって治療可能な疾患としては、ドナー内に収まるような小さい遺伝子であることが好ましい。たとえばロドプシンは全５エキソンからなり、エキソン２～５までがドナーに収容できるため、エキソン２以降にある変異が治療対象となり得る。また他の実施形態において、全長の長い遺伝子であっても、下流のエキソン内にある変異を治療対象とすることができる。

　他の実施形態において、本開示の方法および／またはベクターによれば、ロドプシン遺伝子の第１～第５のすべてのエキソンを細胞に導入することができる。網膜色素変性（ＲＰ）は、最も一般的な遺伝性網膜変性（ＩＲＤ）であり、３５００人に１人の割合で発症する。ＩＲＤにおける視力低下は、進行性の視細胞機能障害および視細胞死によって引き起こされる。２３遺伝子の変異がａｄＲＰを引き起こすことが報告されており、そのうちロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子は１８０以上の変異があり、ａｄＲＰ症例の２５％以上を占める。またＲＨＯ関連ａｄＲＰのおよそ半分がＰ２３Ｈ変異によって引き起こされる（CRISPR　J.　2018　Feb;1(1):55-64.）。変異型Ｐ２３Ｈロドプシンタンパク質は、ミスフォールドして野生型ロドプシンと共凝集し、桿体視細胞において機能獲得またはドミナントネガティブ効果をもたらすと考えられている。欧米における網膜色素変性の原因としてもっとも多いのがＰ２３Ｈ変異といわれており、Ｐ２３はロドプシン遺伝子の第１エキソンに位置することから、本開示の方法および／またはベクターによってロドプシン遺伝子の第１～第５のすべてのエキソンを細胞に導入することで、網膜色素変性症を治療することができる。また他の実施形態において、本開示の方法および／またはベクターによれば、ロドプシン遺伝子の第２～第５のエキソン、または第３～第５のエキソンを細胞に導入することができる。また他の実施形態において、本開示の方法および／またはベクターによれば、ロドプシン遺伝子の第１～第５のエキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンを細胞に導入することができる。これにより、網膜色素変性を治療することができる。

　一実施形態において、標的核酸配列は、本開示のＡＡＶベクターを用いて置換したい核酸配列であり、イントロンまたはエキソンのいずれをも含むことができる。一実施形態において、標的核酸配列は１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上）の変異型塩基を有することもでき、遺伝子疾患と関連する１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上）の変異型塩基を有することが好ましい。他の実施形態において、１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上）の変異型塩基は、標的核酸配列中ではなく、標的核酸配列の下流の配列中に存在することもできる。この場合、本開示のベクター及び／または方法を使用して、標的核酸配列の下流に存在する配列をゲノム核酸に挿入することで、変異型塩基を置換することができる。

　変異としては置換、欠失、及び／又は付加が挙げられる。１又は複数の塩基の変異が疾患の原因となり得ることは周知であり、細胞内のゲノム核酸における１つ又は複数の変異型塩基を、本開示のベクター及び／または方法を用いて、正常型塩基と置き換えることにより、対象における細胞のＤＮＡの変異を矯正することができ、ひいては疾患の治療に資することができる。他の実施形態において、変異を有さない遺伝子領域やプロモーター領域をゲノム編集の対象とすることもできる。また一実施形態において、本開示のベクター及び／または方法を用いて、正常遺伝子の全長をそのまま核酸ゲノム中に挿入することもできる。

　本開示の一実施形態において、本開示の方法は、少なくとも２箇所の標的核酸配列を切断し、当該２箇所の標的核酸配列のうち、少なくとも１箇所がイントロンを含むことができる。このようにすることで、例えば１箇所のエキソンと１箇所のイントロンを切断して、ある遺伝子の当該切断したエキソンの下流に存在する変異のすべてを正常遺伝子で置換することができる。またイントロンを切断する場合には、厳密な正確性は必要とされない。

　標的核酸配列の長さは特に限定されないが、１～約１５００塩基長とすることができ、好ましくは１～約１２００塩基長、より好ましくは１～約１０００塩基長、より好ましくは１～約９００塩基長、より好ましくは１～約８００塩基長、より好ましくは１～約７００塩基長、より好ましくは１～約６００塩基長、またはより好ましくは１～約５００塩基長とすることができる。

　一実施形態において、標的核酸配列の上流と下流のＰＡＭ配列（第１のＰＡＭ配列及び第２のＰＡＭ配列。同じ配列であってもよい）の５'末端側の約１７～約２４塩基長のヌクレオチドからなる配列を、それぞれ第１のｇＲＮＡ標的配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列とすることができ、第１のｇＲＮＡ標的配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列は同じ配列であってもよく、異なる配列とすることもできる。一実施形態において、本開示のベクターは、第１のｇＲＮＡ標的配列を認識する第１のｇＲＮＡをコードする配列、および第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する第２のｇＲＮＡをコードする配列を有することもできる。この場合、第１のｇＲＮＡをコードする配列と第２のｇＲＮＡをコードする配列とは同じ配列であってもよく、または異なる配列とすることもできる。

　一実施形態において、細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、本開示のベクターにおけるｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置されることができる。

　一実施形態において、本開示のベクターのｇＲＮＡ標的配列は、該ベクターにより発現されるｇＲＮＡにより認識される配列であればいかなる配列であってもよい。また一実施形態において、ｇＲＮＡ標的配列は、反対の向きに配置されていてもよい。好ましくは本開示のベクターの第１のｇＲＮＡ標的配列は細胞内の核酸の第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列である。

　一実施形態において、第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列は隣接することができ、また第２のｇＲＮＡ標的配列及び第２のＰＡＭ配列は隣接することができる。

　ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列は細胞内の核酸が備える当該技術分野で周知の配列である。このため、細胞内の核酸におけるＰＡＭ配列はＣａｓの種類により異なる。例えば、黄色ブドウ球菌由来のｓａＣａｓ９では、ＰＡＭ配列は５'－ＮＮＧＲＲＴ－３'（ＲはＡまたはＧ、Ｎは任意のヌクレオチド）が挙げられ、長さは通常約３～約８塩基長である。ＰＡＭ配列としては、例えばＮＲＧ（ＲはＡ又はＧ）、ＮＧＡ、ＮＮＡＧＡＡＷ（ＷはＡ又はＴ）、ＮＮＮＮＧＭＴＴ（ＭはＡ又はＣ）、ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＡ又はＧ）等が挙げられるがこれらに限定されない。また一実施形態において、本開示のベクターは、標的核酸の両側に、第１のＰＡＭ配列と第２のＰＡＭ配列とを含むことができ、この場合、第１のＰＡＭ配列と第２のＰＡＭ配列とは同じ配列であってもよく、または異なる配列であってもよい。本開示のベクターの第１及び第２のＰＡＭ配列は、細胞内の核酸の第１及び第２のＰＡＭ配列と同じ配列であることが好ましい。

　一実施形態において、第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列は、第１のｇＲＮＡ配列と相補的な約１７～約２４塩基長のヌクレオチドからなる配列とそれに隣接する約３～約８塩基長の第１のＰＡＭ配列とを含むことができる。ベクター内の第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列全体の塩基長は好ましくは約２０～約３２、より好ましくは約２６～約３０とすることができる。

　一実施形態において、本開示のベクターは、少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含むことができ、この配列は、細胞内のゲノム核酸とベクター由来の核酸配列との間でマイクロホモロジー媒介性結合（Microhomology-mediated　end-joining,　MMEJ）を起こさせるためのホモロジーアームとして作用する。

　一実施形態において、ホモロジーアーム配列は、好ましくは約５～約４０塩基長、より好ましくは約１０～約３０塩基長、さらに好ましくは約１２～約２０塩基長のヌクレオチド配列とすることができる。また本開示のベクターは、ホモロジーアームを上記標的核酸配列の両側にそれぞれ１つずつ含むことができ、この場合、それぞれのホモロジーアームは同じ配列であってもよく、または異なる配列であってもよい。

　一実施形態において、本開示のベクターは、第１のホモロジーアームと第２のホモロジーアームとの間に、ベクターの第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列、第２のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列、又はその両方をいずれも有しないように構成することが好ましい。より詳細には、本開示のベクターは、第１のホモロジーアームと第２のホモロジーアームとの間のセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれにも、ベクターの第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列、第２のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列、又はその両方をいずれも有しないことが好ましい。

　一つの実施形態において、第１のホモロジーアーム配列と第２のホモロジーアーム配列との間に、より具体的には第１のホモロジーアーム配列と所望の核酸の間に、第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列が存在する場合、該第１のｇＲＮＡ標的配列を変異させることができる。別の実施形態において、第１のホモロジーアーム配列と第２のホモロジーアーム配列との間に、より具体的には所望の核酸と第２のホモロジーアーム配列との間に、第２のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列が存在する場合、第２のｇＲＮＡ標的配列を変異させることができる。さらに別の実施形態では、第１のホモロジーアーム配列と第２のホモロジーアーム配列との間に、第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列の両方が存在する場合、第１のｇＲＮＡ標的配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列の両方を変異させることができる。このような構成をとることで、第１のホモロジーアーム配列と所望の核酸の間の配列、及び／又は所望の核酸とホモロジーアーム配列の間の配列でＡＡＶベクターの配列がＣａｓヌクレアーゼにより切断されることを回避することができる。

　一つの実施形態において、第１のホモロジーアーム配列と第２のホモロジーアーム配列との間に、より具体的には第１のホモロジーアーム配列と所望の核酸の間に、第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列が存在する場合、第１のｇＲＮＡ標的配列に第２のホモロジーアーム配列に近い側で隣接する第１のＰＡＭ配列を変異させることができる。別の実施形態において、第１のホモロジーアーム配列と第２のホモロジーアーム配列との間に、より具体的には所望の核酸と第２のホモロジーアーム配列との間に、第２のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列が存在する場合、第２のｇＲＮＡ標的配列に第１のホモロジーアーム配列に近い側で隣接する第２のＰＡＭ配列を変異させることができる。さらに別の実施形態では、第１のホモロジーアーム配列と第２のホモロジーアーム配列との間に、第１のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列と同じ配列の両方が存在する場合、第１のｇＲＮＡ標的配列に第２のホモロジーアーム配列に近い側で隣接する第１のＰＡＭ配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列に第１のホモロジーアーム配列に近い側で隣接する第２のＰＡＭ配列の両方を変異させることができる。このような構成をとることで、第１のホモロジーアーム配列と所望の核酸の間の配列、及び／又は所望の核酸と第２のホモロジーアーム配列の間の配列でＡＡＶベクターの配列がＣａｓヌクレアーゼにより切断されることを回避することができる。

　一実施形態において、本開示のベクター中の第１のホモロジーアーム配列、所望の核酸、及び第２のホモロジーアーム配列が、連続する一つの断片としてＣａｓヌクレアーゼによって切断されることを確実するために、言い換えると、第１のホモロジーアーム配列と所望の核酸の間の配列、及び所望の核酸と第２のホモロジーアーム配列の間の配列において、ベクターの配列がＣａｓ９ヌクレアーゼにより切断されることを回避するために、必要に応じて、それらの配列が天然(wildtypeor native)の配列から変異されることが好ましい。

　一実施形態において、本開示のベクターは、一つのベクターでＣａｓヌクレアーゼを発現する機能と、ｇＲＮＡを発現する機能と、細胞内のゲノム核酸における標的核酸配列を含む核酸領域を切断する機能と、ベクター自体から所望の核酸を含む核酸断片を切り出す機能と、細胞内の核酸に該所望の核酸を挿入する機能とを兼ね備えており、所望の核酸を対象に正確かつ簡便に挿入することができる。

　一実施形態において、本開示のベクターは、ＤＮＡ鎖の両端に、ＡＡＶゲノムの効率的な増殖に必要な逆位末端反復(ＩＴＲ)を含むこともできる。

　一実施形態において、本開示のベクターは、ｇＲＮＡをコードする配列の、ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Ｓｃａｆｆｏｌｄ配列を含むことができる。

　本開示の一実施形態において、本開示のベクターは、本明細書に記載されるエレメントを好ましくは５'末端から３'末端の方向に順に有するが、本開示の効果を奏する限り、エレメントの配置の順序は限定されない。

　ベクター中のヌクレオチド配列の変異は本技術分野における周知技術を用いて実施することができる。Ｃａｓヌクレアーゼは、２つのＤＮＡ切断ドメイン（ＨＮＨドメイン及びＲｕｖＣドメイン）を有し、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合体を形成して、核酸の標的部を切断することができる。

　一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは特に限定されず、例えばＣａｓ９やＣａｓ１２などを用いることができる。また一実施形態において、Ｃａｓ９としては、任意の野生型のＣａｓ９ヌクレアーゼ及びヌクレアーゼ活性を有するその変異体が含まれる。このような変異体としては、野生型のＣａｓ９ヌクレアーゼの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、又は５０個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されたヌクレアーゼが挙げられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ由来のＳｐＣａｓ９、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＳｔＣａｓ９、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　由来のＳａＣａｓ９　（Ｎａｔｕｒｅ　５２０：１８６－１９１，　２０１５）などが挙げられる。サイズが小さくＡＡＶベクター内の空き容量を多くできるという点からＳａＣａｓ９が好ましい。

　核酸の標的化は、ｇＲＮＡ（第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ）の５'末端にある少なくとも約１７～約２０ヌクレオチドの配列によって媒介される。かかるヌクレオチドは、核酸のＰＡＭ配列の隣にある核酸配列（第１のｇＲＮＡ標的配列、第２ｇＲＮＡ標的配列）の相補鎖（反対鎖）に相補的であるように設計される。標的化は、該核酸配列（ｇＲＮＡ標的配列、第２ｇＲＮＡ標的配列）の核酸配列の相補鎖（反対鎖）とｇＲＮＡ（第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ）の上記少なくとも約１７～約２０ヌクレオチドとの間の塩基対相補性による相互作用により起こる。このため、Ｃａｓヌクレアーゼにより、細胞内の標的核酸配列を含む核酸とベクターとの両方に対して、特異的な二本鎖切断が行われる。

　二本鎖切断が起こる箇所は、ＰＡＭ配列より３塩基上流（５'末端側）に位置することが多いがｇＲＮＡ標的配列内の異なる部位に位置することもある。ｇＲＮＡは、ＰＡＭの５'側に位置する塩基配列を認識する。このため、Ｃａｓヌクレアーゼは細胞内の核酸の第１のｇＲＮＡ標的配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列に対して特異的な切断を行うと共に、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡ標的配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列に対して特異的な切断を行う。ベクターから生じた核酸断片と細胞内の核酸との連結の際、ＰＡＭとその上流に連続するｇＲＮＡ標的配列の残存核酸配列（多くは３塩基分）を失う。そのため、連結された核酸は細胞内に存在するヌクレアーゼによる再度の切断を受けず、安定的に保持される。

　ベクターの第１のｇＲＮＡがＣａｓヌクレアーゼと複合体を形成して細胞内の核酸の第１のｇＲＮＡ標的配列を認識すると共に、ベクターの第２のｇＲＮＡがＣａｓヌクレアーゼと複合体を形成して細胞内の核酸の第２のｇＲＮＡ標的配列を認識し、二本鎖切断により、細胞内の核酸の第１のｇＲＮＡ標的配列のＣａｓヌクレアーゼによる切断部位よりも下流の配列、第１のＰＡＭ配列、標的核酸配列、及び第２のｇＲＮＡ標的配列におけるＣａｓヌクレアーゼによる切断部位よりも上流の配列からなる領域を含む核酸断片が切り出され、第１のホモロジーアーム配列及び第２のホモロジーアーム配列は、切り出されずに細胞内の核酸として残る。

　ベクターの第１のｇＲＮＡがＣａｓヌクレアーゼと複合体を形成してベクターの第１のｇＲＮＡ標的配列を認識すると共に、ベクターの第２のｇＲＮＡがＣａｓヌクレアーゼと複合体を形成してベクターの第２のｇＲＮＡ標的配列を認識し、二本鎖切断により、ベクターから第１のヌクレオチド配列からなる領域、所望の核酸、及び第２のヌクレオチド配列からなる領域を含む核酸断片が生じる。

　ベクターの上記所望の核酸は、細胞内の核酸の上記標的核酸配列との置換が意図される核酸であり、細胞内の核酸への導入が望まれる任意の核酸であってよい。所望の核酸は、好ましくは、細胞内の核酸の上記標的核酸配列の変異型塩基の位置が正常型塩基となっている以外は、上記標的核酸配列と同一配列を有する核酸である。所望の核酸は、より好ましくは、細胞の遺伝子である標的核酸配列の変異型塩基の位置が正常型塩基となっている以外は上記標的核酸配列と同一配列を有する核酸である。

　所望の核酸の長さは１～約１５００塩基長とすることができ、好ましくは１～約１２００塩基長、より好ましくは１～約１０００塩基長、より好ましくは１～約９００塩基長、より好ましくは１～約８００塩基長、より好ましくは１～約７００塩基長、より好ましくは１～約６００塩基長、またはより好ましくは１～約５００塩基長とすることができる。

　一実施形態において、ベクターに含まれる第１のホモロジーアーム配列と同じ配列（第１の配列）が細胞内の核酸に含まれることが好ましい。また、細ベクターに含まれる第２のホモロジーアーム配列と同じ配列（第２の配列）が細胞内の核酸に含まれることが好ましい。このような配列が細胞の核酸ゲノム中に存在することにより、細胞内の核酸における第１の配列とベクターにおける第１のホモロジーアーム配列がマイクロホモロジー媒介性結合（Microhomology-mediatedend-joining, ＭＭＥＪ）により連結され、細胞内の核酸における第２の配列とベクターにおける第２のヌクレオチド配列がマイクロホモロジー媒介性結合により連結され、それにより所望の核酸が細胞内の核酸における第１の配列と第２の配列の間の位置で該核酸に挿入される。

　このため、本開示のベクターは、細胞内の核酸の標的核酸を、ベクターの所望の核酸に置換するためのベクターと言うこともできる。マイクロホモロジー媒介性結合は、真核生物が有するＤＮＡ修復機構として発見された機構であり、ＤＮＡの二本鎖切断の際に生じた５～２５塩基程度の短い両末端間で相補的な配列同士で結合し、ＤＮＡを修復する機構である（NATUREPROTOCOL, Vol.11, No.1 published on line 17 December 2015,doi:10.1038/nprot.2015.140参照）。

　一実施形態において、細胞特異的プロモーターは、細胞の種類に合わせて当業者に適宜選択することができる。細胞特異的プロモーターは天然のプロモーター又はその一部であることもできるし、合成プロモーターであることもできる。

　そのような細胞特異的プロモーターとしては天然の細胞特異的プロモーター、それらのプロモーターの連続する約５０～約１５０個の塩基配列を有するプロモーター、又はそれらのプロモーターの該連続する約５０～約１５０個の塩基配列に対して約９０％以上の同一の塩基配列からなるプロモーターが挙げられる。

　一実施形態において、天然の細胞特異的プロモーターとしては、網膜で用いられるものとして、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーターなどが挙げられるがそれらに限定されない。また、その他の臓器のものとして、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩプロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。

　一実施形態において、細胞に特異的なプロモーターの長さは特に限定されないが、ベクターの空き領域を増大させる点から短いことが好ましく、好ましくは塩基長で８００塩基以下であり、より好ましくは塩基長で７００塩基以下であり、より好ましくは塩基長で６００塩基以下であり、より好ましくは塩基長で５００塩基以下であり、より好ましくは塩基長で４００塩基以下であり、より好ましくは塩基長で３００塩基以下であり、より好ましくは２００塩基以下であり、より好ましくは１５０塩基以下であり、より好ましくは１２０塩基以下であり、さらに好ましくは１００塩基以下である。塩基長の短い細胞特異的プロモーターを用いることにより、疾患に応じて、ＭＭＥＪを用いた遺伝子のノックインに十分な長さの挿入断片をＡＡＶのシングルベクターに搭載可能することができる。

　天然のプロモーターの配列に基づいてその一部を置換、削除、又は付加して合成プロモーターを作製する場合は、例えば種間の保存性の高い領域を用いることにより、細胞特異的プロモーターの機能を維持しつつ塩基長が短縮された合成プロモーターを当業者は通常の技能により作製することができる。

　ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターはベクターの導入後の哺乳動物細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターである。ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターとしてはＵ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーターなどが上げられ、比較的短い塩基配列を駆動する点で、Ｕ６プロモーターが好ましい。

　一実施形態において、本開示のベクターは、タンパク質の核移行をもたらす核局在配列（ＮＬＳ）を含むことができ、公知の好適なＮＬＳを使用することができる。例えばＮＬＳの多くは、二分塩基性リピートと称される複数の塩基性アミノ酸を有する（Biochim.Biophys.Acta,　1991,　1071:83-101）。二分塩基性リピートを含むＮＬＳは、核酸配列の任意の部分に置くことができ、発現タンパク質の核内局在化をもたらす。

　一実施形態において、本開示のベクターはさらに、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、又は翻訳終結に必要な任意のシグナルを含むことができる。かかる部位は当該技術分野において周知であり、当業者であれば好適な配列を選択することが可能である。

　一実施形態において、本開示のベクターはさらに、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含むことができる。

　Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列としては、例えば、ＲｈＫプロモーターを挙げることができる。また他の実施形態において、転写量を増加させる作用をもつエンハンサー配列（例えばＣＭＶエンハンサーなど）をプロモーターに付加することもできる。さらに他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強する目的で、特定のイントロン配列（例えばｇｌｏｂｌｉｎイントロンなど）をプロモーターの後に配置することもできる。さらに他の実施形態において、プロモーターを直列につなぐことでＣａｓヌクレアーゼの発現を増強することもできる。

　Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列としては、例えば、半減期２時間のｄ２タグなどの不安定化タグ配列を挙げることができる。

　ｇＲＮＡ発現カセットとしては、例えば、同じ治療遺伝子に対する異なる、または同じｇＲＮＡ発現カセット（プロモーター＋ｇＲＮＡ＋ｓｃａｆｆｏｌｄ）や、治療に有用な別の遺伝子に対するｇＲＮＡ発現カセット（プロモーター＋ｇＲＮＡ＋ｓｃａｆｆｏｌｄ）などを挙げることができる。

　自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセットとしては、例えば、Ｃａｓ配列を標的とするｇＲＮＡなどを挙げることができる。また自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列としては、例えば、上記の分解用のｇＲＮＡ標的配列を挙げることができ、ベクター内に追加で配置することができる。他の実施形態において、治療用と同じｇＲＮＡ標的配列をベクター内に配置することで同じ効果を得ることができる。

　一実施形態において、本開示のベクターはさらに、ｇＲＮＡのＵ６プロモーターの改変配列や、複数の所望の核酸を含むこともできる。

　一実施形態において、本開示のベクターが挿入される細胞内の核酸は、５’末端から３’末端の方向に順に、第１のホモロジーアーム配列に対応する配列、標的核酸配列、及び第２のホモロジーアーム配列に対応する配列を含む核酸を含む。

　細胞内の核酸はさらに、第１のホモロジーアーム配列に対応する配列と標的核酸配列との間に、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡにより認識される第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列を有し、標的核酸配列と第２の第１のホモロジーアーム配列に対応する配列との間に、ＡＡＶベクターの第２のｇＲＮＡにより認識される第２のｇＲＮＡ標的配列及び第２のＰＡＭ配列を有することができる。第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列はＡＡＶベクターのセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれにあってもよく、第２のｇＲＮＡ標的配列及び第２のＰＡＭ配列はＡＡＶベクターのセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれにあってもよい。第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡは、細胞内の核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれを標的にしてもよい。

　ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡにより認識される細胞内の核酸の第１のｇＲＮＡ標的配列と、ＡＡＶベクターの第２のｇＲＮＡにより認識される細胞内の核酸の第２のｇＲＮＡ標的配列とは、異なる配列であってもよいし、同じ配列であってもよい。

　一つの実施形態では、細胞内の核酸は、５'末端から３'末端の方向に順に、第１のホモロジーアーム配列に対応する配列と標的核酸配列との間に第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列を有し、かつ標的核酸配列と第２のホモロジーアーム配列に対応する配列との間に第２のｇＲＮＡ標的配列及び第２のＰＡＭ配列を有することができる。第１のｇＲＮＡ標的配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列は、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡによりそれぞれ認識される配列である。この実施形態の場合、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡは細胞内の核酸のセンス鎖をいずれも標的とする。

　別の実施形態では、細胞内の核酸は、５'末端から３'末端の方向に順に、第１のホモロジーアーム配列に対応する配列と標的核酸配列との間に第１のｇＲＮＡ標的配列及び第１のＰＡＭ配列を有し、かつ標的核酸配列と第２のホモロジーアーム配列に対応する配列との間に第２のＰＡＭ配列の相補配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列の相補配列を有することができる。この実施形態の場合、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡは細胞内の核酸のセンス鎖を標的とし、ＡＡＶベクターの第２のｇＲＮＡは細胞内の核酸のアンチセンス鎖を標的とする。

　別の実施形態では、細胞内の核酸は、５'末端から３'末端の方向に順に、第１のホモロジーアーム配列に対応する配列と標的核酸配列との間に第１のＰＡＭ配列の相補配列及び第１のｇＲＮＡ標的配列の相補配列を有し、かつ標的核酸配列と第２のホモロジーアーム配列に対応する配列との間に第２のｇＲＮＡ標的配列及び第２のＰＡＭ配列を有することができる。この実施形態の場合、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡは細胞内の核酸のアンチセンス鎖を標的とし、ＡＡＶベクターの第２のｇＲＮＡは細胞内の核酸のセンス鎖を標的とする。

　別の実施形態では、細胞内の核酸は、５'末端から３'末端の方向に順に、第１のホモロジーアーム配列に対応する配列と標的核酸配列との間に第１のＰＡＭ配列の相補配列及び第１のｇＲＮＡ標的配列の相補配列を有し、かつ標的核酸配列と第２のホモロジーアーム配列に対応する配列との間に第２のＰＡＭ配列の相補配列及び第２のｇＲＮＡ標的配列の相補配列を有することができる。この実施形態の場合、ＡＡＶベクターの第１のｇＲＮＡ及びＡＡＶベクターの第２のｇＲＮＡは細胞内の核酸のアンチセンス鎖をいずれも標的とする。

　本開示のベクターは、網膜視細胞をターゲットとした多くの変異矯正治療にすぐに応用可能ではあるが、他の組織に使用可能な小型プロモーターを用いることにより、眼疾患以外の疾患の治療にも応用可能な、汎用性が高いものである。

　本開示の他の局面によれば、細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのキットであって、上記本開示のベクターを備えたキットが提供される。

　本開示の他の局面によれば、本開示のベクターを、細胞に導入する工程と、該細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する工程とを含む、所望の核酸を含む細胞を製造する方法が提供される。

　所望の核酸を含む細胞は、該所望の核酸の挿入を反映した指標に基づいて細胞を選択することによって取得することができる。例えば、挿入される核酸が特定のレポータータンパク質をコードする遺伝子を含む場合、当該レポータータンパク質の発現を検出し、検出された発現の量を指標として細胞を簡便かつ高感度で選択することができる。

　本開示の他の局面によれば、本開示のベクターを、細胞に導入する工程と、該細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する工程とを含む、疾患の治療方法が提供される。かかる治療方法はヒトにおける治療方法であっても非ヒト動物における治療方法であってもよく、インビボにおける治療方法であってもインビトロにおける治療方法であってもよい。疾患については本明細書の他の箇所に記載したとおりである。

　本開示の他の局面によれば、本開示のベクターを含有する疾患の治療用の治療組成物が提供される。治療される対象としては、ヒト；ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラット、サルなどの非ヒト哺乳動物；鳥類；ゼブラフィッシュなどの魚類；カエルなどの両生類；爬虫類；ショウジョウバエなどの昆虫類；甲殻類などが挙げられる。疾患については本明細書の他の箇所に記載したとおりである。

　本開示の一実施形態において、本開示のベクターや、本開示のベクターや方法によって遺伝子改変した細胞を医薬として用いることもでき、この場合、本開示のベクターや細胞の効果を損なわない限り、任意の成分を含有することができる。

　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

（実施例１：ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでのオンターゲット評価）
動物
　ｉｎ　ｖｉｖｏ解析のために、ＡＡＶベクター（１×１０^１２　ｇｃ　ｍＬ^－１）を５～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｐａｎ　ＳＬＣ　Ｉｎｃ．，　Ｈａｍａｍａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）の腹側網膜下空間に注射した（１回の注射で１．５μＬ）。治療用ゲノム編集のために、ＡＡＶベクター（１×１０^１２　ｇｃ　ｍＬ^－１）をＲｈｏＴｖｒｍ３３４マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＭＥ）の背側および腹側網膜下腔に注射した（１回の注射で１．５μＬ）。ケタミン（３７．５ｍｇ　ｋｇ－１）とメデトミジン（０．６３ｍｇ　ｋｇ－１）の混合物を腹腔内投与した後に外科的処置を行った。メデトミジンは術後にアチパメゾール（１．２５ｍｇ　ｋｇ－１）の腹腔内投与により無効化した。マウスの取り扱いは、ARVO　Statement　On　the　Use　of　Animals　in　phthalmic　and　Vision　Researchおよび東北大学の動物飼育・使用ガイドラインに準拠した。すべての実験手順は、名古屋大学大学院医学系研究科の関連する動物実験委員会の承認を得て実施された。

プラスミドの構築
　シングルカット変異修復ゲノム編集用オールインワンＣＲＩＳＰＲ／ＳａＣａｓ９プラスミドを図１に示すように組み立てた。９３－ｂｐ　ＧＲＫ１　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　（ＧＲＫ１－９３）を用いてＳａＣａｓ９（Ａｃ．Ｎｏ．　ＣＣＫ７４１７３．１；　ｐＸ６０１由来）の発現を駆動させた。ドナーテンプレートは、マイクロホモロジーアーム、ｇＲＮＡターゲットサイト、ドナー配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、ＤＮＡライゲーションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，　ＣＡ）を用いて、ベクターに挿入した。ｇＲＮＡ標的部位は、ＨＩＴＩ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，２０１６）と同様に、ドナー配列がＭＨＥＪ修復によって誤った方向に挿入された場合に再度切断できるように、ゲノム配列と反対方向に配置した。ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの評価のため、ＤＮＡライゲーションキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＧＲＫ１プロモーターをＣＭＶプロモーターに置き換えた。ＨＩＴＩおよびＳＡＴＩプラスミドは、図１に示すように組み立てた。各フラグメントを合成し、上記と同じ手法を用いてベクターに挿入した。各プラスミドベクターをＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ，　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，　ＰＡ）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＡＡＶ２ｒｅｐ／ＡＡＶ８ｃａｐベクター（ｐｄｐ８；　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｆａｃｔｏｒｙ，　Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に導入した。ＡＡＶ粒子をＰＢＳで抽出し、ＡＶＢ　Ｓｅｐａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，　Ｃｈｉｃａｇｏ，　ＩＬ）上のＡＫＴＡ　ｇｏクロマトグラフィーシステム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した（Ｆｕｊｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１５，　２０１７）。

ＲＴ－ＰＣＲ
　ｍｉＲＮｅａｓｙ　ｐｌｕｓ　ｍｉｎｉ　ｋｉｔ　（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてマウス網膜からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを精製し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で逆転写した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、９５℃で２０秒の初期変性ステップと、９５℃で３秒、６０℃で２０秒を４０サイクル行った（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ５　リアルタイムＰＣＲシステム；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｇａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｒｈｏ（Ｍｍ０１１８４４０５；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびＲＨＯ（Ｈｓ００８９２４３１；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＴａｑｍａｎプローブを使用した。各ｍＲＮＡの発現量は、内因性コントロールであるＧａｐｄｈを基準として比較Ｃｔ法（２－ΔΔＣＴ）により測定した。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでのオンターゲット評価
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ）に、ＰＥＩ試薬（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ，　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，　ＰＡ）を用いてゲノム編集プラスミドを導入した。ＨＥＫ２９３Ｔでは導入４８時間後、マウスではＡＡＶ注入の２週間後に、ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動で解析した。オンターゲットサイトのＰＣＲ産物をＴ－ｖｅｃｔｏｒ（ｐＴＡＣ２；　ＢｉｏＤｙｎａｍｉｃｓ，　Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にサブクローニングし、これを用いてＤＨ５ａ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ｃｅｌｌ（Ｔｏｙｏｂｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を形質転換させた。各ＰＣＲ断片は、ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ遺伝子解析装置（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて標準的な手順で塩基配列を決定した。

結果
シングルカット変異修復ゲノム編集の特徴
　ゲノムを１カ所切断し、治療用配列を挿入することで、下流の変異をすべて修復する新しいゲノム編集法を開発することができた（図１）。ＭＭＥＪとＭＨＥＪの両方で編集可能なＲＨＯ遺伝子変異の治療用ベクタープラスミドを構築し、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでオンターゲットサイトのＰＣＲによる塩基配列解析を実施した。成功したクローンの塩基配列解析の結果、ＭＭＥＪで３８％、ＨＩＴＩで６２％であった（図２）。

　続いて、他の競合するゲノム編集との比較を行った。ＨＩＴＩはＮＨＥＪによるゲノム編集であり、ＳＡＴＩ（ｓｉｎｇｌｅ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｒｍ　ｄｏｎｏｒ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｎｔｒｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；　Ｓｕｚｕｋｉ　ｅｔ　ａｌ，　２０１９）はＨＩＴＩの改良版で、ＮＨＥＪとＨＤＲによるゲノム編集である。しかし、ＳＡＴＩは相同性アームが長く、１つのベクターにすることができない。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ解析の結果、シングルカットＭＭＥＪによる変異修復後の成功率は２３．１％であり、ＨＩＴＩやＳＡＴＩの１５．９％、１６．７％より高いことがわかった（図３）。これらの結果は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて、変異修復を伴う本プラットフォームの方がゲノムレベルでの編集効率が高いことを裏付けている。

　同様に、Ｂ６野生型マウスを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ解析でも、マウス網膜のゲノム配列への遺伝子挿入が確認された。さらに、編集産物に由来するｍＲＮＡの発現も確認された。これらの結果から、本ベクターはマウス網膜においても編集され、正確な遺伝子発現が行われたことが示された。

（実施例２：Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療）
　実施例１で作製したベクターを用いて、Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療を行う。このマウスはＲＨＯ遺伝子の第３エキソンにＹ１７８Ｃの点変異を有し、網膜色素変性（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっていることがわかっている。本遺伝子治療ベクターは、２番目以降のエキソンを置換し、正常な状態にすることができる。ゲノム編集の効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーで解析する。治療効果は、組織学、電気生理、行動解析により解析する。

（実施例３：エキソンを１箇所のみ切断する場合の治療例）
　実施例１で作製したベクターを用いて、Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療を行う。このマウスはＲＨＯ遺伝子の第３エキソンにＹ１７８Ｃの点変異を有し、網膜色素変性（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっていることがわかっている。本実施例では、この遺伝子のエキソンを一ヶ所のみ切断し、その下流のすべてのエキソンを置換し、正常な状態にすることができる。ゲノム編集の効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーで解析する。治療効果は、組織学、電気生理、行動解析により解析する。

（実施例４：イントロンを１箇所のみ切断する場合の治療例）
　実施例１で作製したベクターを用いて、Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療を行う。このマウスはＲＨＯ遺伝子の第３エキソンにＹ１７８Ｃの点変異を有し、網膜色素変性（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっていることがわかっている。本実施例では、この遺伝子のイントロンを一ヶ所のみ切断し、その下流のすべてのエキソンを置換し、正常な状態にすることができる。ゲノム編集の効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーで解析する。治療効果は、組織学、電気生理、行動解析により解析する。

（実施例５：エキソンを２箇所切断する場合の治療例）
　実施例１で作製したベクターを用いて、Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療を行う。このマウスはＲＨＯ遺伝子の第３エキソンにＹ１７８Ｃの点変異を有し、網膜色素変性（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっていることがわかっている。本実施例では、この遺伝子のエキソンを二か所切断し、その二か所に挟まれた部分の配列を置換し、正常な状態にすることができる。ゲノム編集の効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーで解析する。治療効果は、組織学、電気生理、行動解析により解析する。

（実施例６：イントロンとエキソンをそれぞれ切断する場合の治療例）
　実施例１で作製したベクターを用いて、Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療を行う。このマウスはＲＨＯ遺伝子の第３エキソンにＹ１７８Ｃの点変異を有し、網膜色素変性（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっていることがわかっている。本実施例では、この遺伝子のイントロンを一ヶ所と、エキソンを一ヶ所切断し、切断したエキソンの下流の配列を置換し、正常な状態にすることができる。ゲノム編集の効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーで解析する。治療効果は、組織学、電気生理、行動解析により解析する。

（実施例７：遺伝子治療効率の改良例）
　実施例１で作製したベクターを用いて、Ｒｈｏ変異マウスに対する遺伝子治療を行う。加えてベクターは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列等の配列を１つまたは、複数以上付加したものを用いる。このマウスはＲＨＯ遺伝子の第３エキソンにＹ１７８Ｃの点変異を有し、網膜色素変性（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっていることがわかっている。本遺伝子治療ベクターは、２番目以降のエキソンを置換し、正常な状態にすることができる。ゲノム編集の効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーで解析する。治療効果は、組織学、電気生理、行動解析により解析する。

（実施例８：Ｒｈｏ変異マウスの遺伝子治療）
動物
　治療用ゲノム編集のため、ＡＡＶベクター（１×１０^１２　ｇｃ　ｍＬ－１）をＲｈｏ^{Ｔｖｒｍ３３４／＋}マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ，　ＭＥ）の網膜下背側および腹側に注入した（１回の注入につき１．５μＬ）。ケタミン（３７．５ｍｇ　ｋｇ－１）とメデトミジン（０．６３ｍｇ　ｋｇ－１）の混合物を腹腔内投与した後に外科的処置を行った。メデトミジンは術後にアチパメゾール（１．２５ｍｇ　ｋｇ－１）の腹腔内投与により無効化した。マウスの取り扱いは、ARVO　Statement　On　the　Use　of　Animals　in　Ophthalmic　and　Vision　Researchおよび東北大学の動物飼育・使用ガイドラインに準拠した。すべての実験手順は、名古屋大学大学院医学系研究科の関連する動物実験委員会の承認を得て実施した。

ＲＴ－ＰＣＲ
　NucleoSpin　TriPrep　(MACHEREY-NAGAL,　Duren,　Germany)を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　III　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて逆転写した。ｑＲＴ－ＰＣＲは９５℃、２０秒の初期変性、９５℃、３秒と６０℃、２０秒の４０サイクルで行った（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ　５；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。Ｇａｐｄｈ（Ｍｍ９９９９９９１５；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ヒトＲＨＯ（Ｈｓ００８９２４３１；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびマウスＲｈｏ（Ｍｍ０１１８４４０５；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＴａｑｍａｎプローブを使用した。ｍＲＮＡ発現量は、Ｇａｐｄｈ（Ａｃ．Ｎｏ．　ＮＭ＿００１２８９７２６）、ヒトＲＨＯ　（Ａｃ．Ｎｏ．　ＮＭ＿０００５３９）およびマウスＲｈｏ（Ａｃ．Ｎｏ．　ＮＭ＿１４５３８３）の各ｃＤＮＡの希釈系列により作成した標準曲線にＣＴ値をプロットして決定した。編集に成功したヒトＲＨＯの発現は、正常なマウスＲｈｏの発現との相対値で計算した。

ドロップレットデジタルＰＣＲ　（ｄｄＰＣＲ）
　ゲノムＤＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＴｒｉＰｒｅｐ　（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＡＬ）またはＱＩＡａｍｐ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，　Ｈｉｌｄｅｎ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ヒトＲＨＯ（Ｃａ．Ｎｏ．１００３１２７６；　Ｂｉｏ－Ｒａｄ，　Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびマウスＲｈｏ（Ｃａ．Ｎｏ．１００３１２７９；　Ｂｉｏ－Ｒａｄ）用のＴａｑｍａｎプローブを使用した。ＰＣＲ反応混合物をＱＸ２００　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｄｉｇｉｔａｌ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に製造者の指示に従いロードした。

ウェスタンブロット
　ＡＡＶ注入から５週間後に眼球を摘出した。網膜をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＴｒｉＰｒｅｐ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＡＬ）を用いて溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ　ＢＣＡ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ，　Ｋｕｓａｔｓｕ，　Ｊａｐａｎ）を用いて総タンパク質濃度を測定した。タンパク質（各１０μｇ）を５～２０％　Ｓｕｐｅｒｓｅｐ　Ａｃｅゲル（日本、大阪、和光）のＳＤＳ－ＰＡＧＥで分子量に基づいて分離し、ＰＶＤＦ膜（マサチューセッツ州、ビレリカ、ミリポア）に移した。メンブレンを５％スキムミルクで１時間ブロックし、マウス抗Ｒｈｏ抗体（ＭＡＢ５３１６，　１／１０００；　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１時間インキュベートし、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウス抗体（＃３１４３０，　１／２０００；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１時間一緒にインキュベートした。免疫原性シグナルはＥＣＬ　ｐｒｉｍｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で検出した。メンブレンを剥がし、抗β－アクチン（Ｆ５３１６，　１／２０００；　Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，　Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，　ＭＯ）とインキュベートし、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（＃３１４３０，　１／２０００；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートし、ＥＣＬプライムで検出した。

免疫組織化学
　眼球は４％パラホルムアルデヒドで固定した。その後、ＯＣＴコンパウンドに包埋し、クリオスタットを用いて切片化し、網膜切片を作成した。レポーターアッセイのために、網膜切片は画像化の前に４５分間ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ，　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　ＣＡ）のみで染色した。ＲＨＯ発現の解析のために、ＴＳＡ　Ｐｌｕｓ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（ＫｉｋｏＴｅｃｈ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、製造業者の説明書に従って免疫組織化学を行った。切片を１％スキムミルクで１時間ブロックし、マウスＲｈｏ抗体（ＭＡＢ５３１６、１／２００；ミリポア）で１時間インキュベートし、ＨＲＰ標識抗マウス抗体（＃３１４３０、１／２０００；サーモフィッシャーサイエンティフィック）で１時間インキュベートし、さらに４５分間ＴＳＡ試薬および／またはＤＡＰＩで染めた。画像は、Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ７８０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，　Ｊｅｎａ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）上で取得した。

電気生理学的評価
　ＥＲＧおよびＶＥＰは、ＰｕＲＥＣ（株式会社メイヨー、日本、稲沢市）獲得システムおよびＬＥＤ刺激装置（ＬＳ－１００；メイヨー）を用いて記録した。マウスは実験前に一晩暗順応させ、トロピカミド０．５％とフェニレフリン０．５％（Ｍｙｄｒｉｎ－Ｐ；　Ｓａｎｔｅｎ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を併用して瞳孔を拡張させた。標準的な単一閃光ＥＲＧでは、－７．０から２．０　ｌｏｇ　ｃｄ　ｓ　ｍ^－２まで、１．０　ｌｏｇ単位で区切った１０段階の閃光強度を使用した。ＶＥＰ電極の外科的移植は注射の５週間後に一次視覚野に行った。その１週間後に記録を行った。ｐＶＥＰの記録には、黒（３　ｃｄ　ｍ^－２）と白（１５９　ｃｄ　ｍ^－２）の等幅の縦縞（平均照度：８１　ｃｄ　ｍ^－２）を、異なる空間分解能（Ｒｈｏ^{ｔｖｒｍ３３４／＋}マウスでは０．２１，　０．１４，　０．０７，　０．０５，　０．０３，　０．０２，　０．０１　ｃｙｃｌｅｓ　ｐｅｒ　ｄｅｇｒｅｅ）で使用した。負の谷（Ｐ１－Ｎ１）と正のピーク（Ｎ１－Ｐ２）に対する振幅を、刺激の対数空間分解能の関数として垂直にプロットした。

行動テスト
　ＡＡＶ注入２週間後に視力を測定した。マウスを囲むモニター（平均輝度：６２ｃｄ　ｍ^－２）上に提示された回転正弦波グレーティングに対するマウスの視運動反応を観察した（Ｏｐｔｏｍｏｔｒｙ、Ｃｅｒｅｂｒａｌ　Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ、Ｌｅｔｈｂｒｉｄｇｅ、Ｃａｎａｄａ）。このテストでは、時間－鼻腔間の運動がトラッキング反応を意味するため、パターンの回転方向に対する感度の不均等性に基づき、右目と左目で独立した視力測定が可能である。視力データは、連続した４日間の４回の試行の平均値である。

　ＡＡＶ注射から３週間後に恐怖条件付け試験を行った。訓練では、減音ボックス内に設置したステンレス製グリッドフロアーのショックチャンバー（幅２１．５ｃｍ×奥行２０．５ｃｍ×高さ３０ｃｍ、小原医科産業、日本、東京都）に各マウスを入れ、刺激コントローラ（ＦＺ－ＬＵ、小原医科産業）でＬＥＤライトキュー（５３５ｎｍ，　０．０１５　ｃｄ　ｍ^－２，　２．０　Ｈｚ，　５．０ｓｅｃ）と０．８ｍＡフットショックを共終端とした（２．０　ｓｅｃ　ｄｕｒａｔｉｏｎ）．これを擬似的にランダムな間隔（７０～１４０秒）で５回繰り返した後、マウスを収容ケージに戻した。トレーニングセッションから２４時間後に行われたテストセッションでは、マウスを白い紙で囲み、バニラエキスで香りをつけた環境改変チャンバーと同じチャンバーに戻した。４分間環境適応させた後、２分間光合図を与えた。凍結時間は、動きのない状態（２００ピクセル未満、１．０秒以上）で定義し、内蔵の赤外線ビデオカメラで記録した。光照射前後２分間の凍結時間は、プリインストールされた画像処理ソフト（小原医科産業）で平均化した。

ナノポアロングリードシーケンスによるＡＡＶのゲノムパッケージングの評価
　ＡＡＶウイルスＤＮＡは、フェノール・クロロホルム抽出とエタノール沈殿により抽出した。分離したＤＮＡは、Ｎａｔｉｖｅ　Ｂａｒｃｏｄｉｎｇ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　１－１２（ＰＣＲ－ｆｒｅｅ）（ＥＸＰ－ＮＢＤ１０３；　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌｔｄ）およびＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＳＱＫ－ＬＳＫ１０８；　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌｔｄ）のコンポーネントを用いて、ゲノムＤＮＡの１Ｄ　Ｎａｔｉｖｅバーコーディング用プロトコルに従ってＯｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌｔｄ，　英国　オックスフォード）用ライブラリ作成に供された。その後、ＯＮＴ　ＭｉｎＩＯＮ装置（Ｆｌｏｗ　Ｃｅｌｌ　Ｒ９．４．１，　ＦＬＯ－ＭＩＮ１０６Ｄ；　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌｔｄ）でライブラリのマルチプレキシングとシーケンシングを実施した。塩基コール、アダプタートリミング、デマルチプレキシングにはＭｉｎＫＮＯＷソフトウェア（ｖ１９．１０．１；　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｎａｎｏｐｏｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｌｔｄ）を使用した。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を用いたオンターゲットおよびオフターゲット評価
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｗａｌｔｈａｍ，　ＭＡ）中、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で培養した。オンターゲット評価のため、ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ，　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，　ＰＡ）を用いて各プラスミドベクターをトランスフェクションした。ゲノムＤＮＡは、Ｍｉｓｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，　ＣＡ）を用いたｄｄＰＣＲおよびＮＧＳシーケンスによって解析した。オフターゲット効果をＧＵＩＤＥ－ｓｅｑで評価した。ＧＵＩＤＥ－ｓｅｑ実験は、Ｔｓａｉ　ｅｔ　ａｌ．、２０１５に記載されたように行った。

患者由来のリンパ芽球系細胞株を用いたゲノム編集評価
　患者由来ＬＣＬを作製するために、リンパ球をＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルスで形質転換した。ＬＳＬは、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；　Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で培養した。各プラスミドベクターは、エレクトロポレーター（ＮＥＰＡ２１－ＮＧＹ；　Ｎｅｐｐａ　Ｇｅｎｅ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、メーカーの説明書に従ってトランスフェクションを行った。ゲノムＤＮＡはｄｄＰＣＲで解析した。

マカクザル生体外培養
　網膜を分離し、３ｍｍの生検パンチを用いて神経網膜全体からパンチを採取した。網膜パンチを、神経培養培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｎ２培地、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン；Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を入れた６ウェル組織培養プレート中の核膜の上に、網膜外側（視細胞側）を下にして、膜を湿らせるために移した。ベクター（２×１０^１２ｇｃ／ｍＬで１０μｌ）をマイクロシリンジ（ＩＴＯ，　Ｆｕｊｉ，　Ｊａｐａｎ）を用いて網膜と核膜の間に注入した。組織は３７℃、５％ＣＯ_２で１時間培養した後、１ウェルあたり２ｍｌの培地を加え、７日または２８日間培養し、培地は３日おきに交換した。組織を回収し、免疫組織化学またはｄｄＰＣＲを用いたオンターゲット評価のいずれかのために処理した。

ヒト化ＲＨＯマウスの遺伝子治療
　ヒト化ＲＨＯマウスを作製するために、ヒトＲＨＯゲノムを内在性マウスＲｈｏプロモーターの下に直接挿入した。得られたヒト化ＲＨＯマウスは、Ｒｈｏ変異マウスと同様に治療効果の評価に使用した。

[結果]
Ｒｈｏ遺伝子欠損マウスに対する遺伝子治療
　ＲｈｏＴｖｒｍ３３４マウスは、ＲＨＯ遺伝子第３エキソンにＹ１７８Ｃ点突然変異を有し、網膜色素変性症（ＲＰ）や先天性定常性夜盲症の原因となっている。ＭＭＥＪ－Ｈを介し正常ヒトＲＨＯ　ｃＤＮＡ（ｅｘ２－５）をイントロン１に挿入できる単一ＡＡＶ　ＭＭＥＪ－Ｈベクターを構築し、９日齢のマウスに網膜下注射を行った。治療効果は、ＲＴ－ＰＣＲ、電気生理、行動解析によって解析した。

　ＲＴ－ＰＣＲにより解析したところ、治療により誘導されたヒトＲｈｏ　ｍＲＮＡの発現量は、野生型マウスの内因性Ｒｈｏ　ｍＲＮＡの６．８％であった（図５ａ）。網膜組織中の杆体視細胞の割合（７０％）から絶対的な編集効率を計算すると、約１０％の復元が可能であることがわかった。次に、視覚機能に対する治療効果を検討した。視覚野の光感受性を、フラッシュ視覚誘発電位（ｆＶＥＰｓ）を用いて評価した。治療眼で誘発された皮質反応は、模擬治療眼では異常波形が見られたものの、治療眼では光感受性が１００倍向上し、正常波形（最初に陰性波、次に陽性波）が見られた（図５ｂ）。また、光による行動（恐怖条件付け、図５ｃ）の変化も、この改善を反映していた。視運動反応（ＯＫＲ）を測定して求めた視覚の空間分解能の閾値（＝視力）は、治療マウスでは対照マウスの１．５倍まで上昇した（図５ｄ）。さらに、様々な空間解像度の位相反転格子に対する皮質反応、すなわちパターンＶＥＰ（ｐＶＥＰ）は、治療により大きな振幅を示した（図５ｅ）。以上のことから、ＭＭＥＪ－ＨによるヒトＲＨＯ　ｃＤＮＡの挿入は、光感受性と視力の大幅な改善を可能にすることがわかる。さらに、ゲノム解析、免疫組織化学、ＥＲＧ検査において、治療効果が見られることがわかる。

ＡＡＶのゲノムパッケージングの評価
　ＡＡＶのゲノムが野生型ゲノム（４．７ｋｂ）を超えると、完全長ゲノムの合成や遺伝子治療の効率が大きく低下することがある（Ｄｕａｎ　ｅｔ　ａｌ．、２００１）。そこで、様々なサイズの治療用ベクターを設計し（図６）、ＡＡＶベクターのパッケージングへの影響を評価した。まず、ＡＡＶゲノムをコードするプラスミドの塩基配列を決定し、サイズと構造に影響がないことを確認した（図７ａ）。完全長ｃＤＮＡ　ＭＭＥＪ－Ｈ　ＡＡＶベクター（５．３　ｋｂ）は、ナノポアシーケンスで評価したｅｘ２－５　ＭＭＥＪ－Ｈ　ＡＡＶベクター（４．７５　ｋｂ）と比較して、完全長ＡＡＶゲノム合成の成功率が４．３％に減少した（図７ｂ）。同様に、ＨＩＴＩベクターは全長ゲノム合成を減少させると予測されるが、ｅｘ３－５挿入ベクターは減少させないことが予測される。全長ゲノム合成能の低下は、治療効果の低下につながる可能性が高い。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株を用いたオンターゲットおよびオフターゲット評価
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたオンターゲット評価でも、同様にＭＭＥＪ－Ｈ法のＨＩＴＩ法に対する優位性が示されることが予想される。また、オフターゲット解析により、ｇＲＮＡの安全性が示されることが期待される。エディティング効果は、ｄｄＰＣＲおよび次世代シーケンサーにより解析する。オフターゲット効果はＧＵＩＤＥ－ｓｅｑで解析する。

患者由来リンパ芽球細胞株を用いたゲノム編集評価
　樹立した患者由来リンパ芽球に治療用ベクターをエレクトロポレーション法により導入し、ｄｄＰＣＲおよびＭｉｓｅｑシークエンスによるゲノム解析を行い、ゲノム編集効率を算出する。高いゲノム編集効率が期待できる。

マカクザルｅｘ　ｖｉｖｏ培養
　ＭＭＥＪ－Ｈベクターの優位性は、霊長類の網膜でも実証されることが期待される。サル網膜ｅｘ　ｖｉｖｏ培養系を用い、桿体視細胞におけるプロモーターの転写誘導効率をＡＡＶレポーターアッセイで解析する。ＧＲＫ１－９３プロモーターは、マカクザル網膜の視細胞で発現を示した（図８）。ＭＭＥＪ－Ｈ　ＡＡＶベクターをサル網膜に移植し、ｄｄＰＣＲやＮＧＳを用いてゲノム編集の効率性を検証する。

ヒト化ＲＨＯマウスへの遺伝子治療
　ヒト化ＲＨＯマウスに遺伝子治療を行い、ゲノム編集効率をゲノム、ｍＲＮＡ、タンパク質レベルで解析し、網膜変性抑制効果を組織学的、電気生理学的、行動学的に検討する。また、正常なＲＨＯ遺伝子への影響も同様に評価する。Ｒｈｏ遺伝子変異マウスと同様の治療効果が期待され、正常ＲＨＯ遺伝子に対する安全性が確認される。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は、日本国特許庁に２０２１年１２月２１日に出願された特願２０２１－２０７５１８に対して優先権主張をするものであり、その内容はその全体があたかも本願の内容を構成するのと同様に参考として援用される。

　本開示によれば、細胞の核酸ゲノム上のイントロンまたはエキソンの少なくとも１箇所を切断して、当該切断部位に正常配列を挿入することで、あらゆるサイズの遺伝子の遺伝子治療を行うことができるため、遺伝子治療の分野において有用である。

配列番号１：図２のＮｏｎ　ｃｏｄｅ　ＲＮＡ配列
配列番号２：図２のＭＭＥＪ　５／１３　ｃｌｏｎｅｓ配列
配列番号３：図２のＨＩＴＩ　８／１３　ｃｌｏｎｅｓ配列

Claims

　細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入する方法であって、
　前記所望の核酸を含むベクターを前記細胞に導入する工程であって、前記ベクターは、前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含む、工程と、
　前記細胞を、前記切断が生じるような条件に配置する工程と
を含み、前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、方法。
　前記ベクターは、少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
　前記標的核酸配列がイントロンを含む、請求項１または２に記載の方法。
　少なくとも２箇所の標的核酸配列を切断し、前記２箇所の標的核酸配列のうち、少なくとも１箇所がイントロンを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、請求項６に記載の方法。
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
　前記ベクターは、Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞に特異的なプロモーターの長さが約７００塩基以下である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
　インビトロで行われる、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列を切断することで、前記細胞内の核酸に所望の核酸を挿入するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
　前記所望の核酸の両側にそれぞれ位置する少なくとも１つのｇＲＮＡ標的配列、前記所望の核酸、前記細胞に特異的なプロモーター、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする配列、前記ベクターの導入後の細胞におけるｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーター、及びｇＲＮＡをコードする配列を含み、
　前記ベクターは、前記Ｃａｓヌクレアーゼにより、前記所望の核酸を含む核酸断片を生じさせるような切断部位を含むように構成される、ベクター。
　少なくとも１つのホモロジーアーム配列をさらに含む、請求項１９に記載のベクター。
　前記標的核酸配列がイントロンを含む、請求項１９または２０に記載のベクター。
　少なくとも２箇所の標的核酸配列を切断し、前記Ａ２箇所の標的核酸配列のうち、少なくとも１箇所がイントロンを含む、請求項１９～２１のいずれか一項に記載のベクター。
　前記細胞内の核酸における少なくとも１箇所の標的核酸配列と、前記ｇＲＮＡをコードする配列とが、逆向きになるように配置される、請求項１９～２２のいずれか一項に記載のベクター。
　前記ベクターが、２つのｇＲＮＡ標的配列と、ｇＲＮＡをコードする２つの配列とを含み、第１のｇＲＮＡをコードする配列が第１のｇＲＮＡ標的配列を認識し、第２のｇＲＮＡをコードする配列が第２のｇＲＮＡ標的配列を認識する、請求項１９～２３のいずれか一項に記載のベクター。
　前記第１のｇＲＮＡをコードする配列と前記第２のｇＲＮＡをコードする配列とが異なる配列である、請求項２４に記載のベクター。
　前記ｇＲＮＡをコードする配列の前記ｇＲＮＡの発現を可能にするプロモーターとは反対側に、Scaffold配列を含む、請求項１９～２５のいずれか一項に記載のベクター。
　前記ｇＲＮＡ標的配列に隣接したＰＡＭ配列をさらに含む、請求項１９～２６のいずれか一項に記載のベクター。
　Ｃａｓヌクレアーゼの発現を増強させる配列、Ｃａｓヌクレアーゼを不安定にさせる配列、ｇＲＮＡ発現カセット、自己分解させるためのｇＲＮＡ発現カセット、及び／または自己分解させるためのｇＲＮＡ標的配列をさらに含む、請求項１９～２７のいずれか一項に記載のベクター。
　前記細胞に特異的プロモーターの長さが約７００塩基以下である、請求項１９～２８のいずれか一項に記載のベクター。
　前記細胞に特異的なプロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、RPE65プロモーター、Best1プロモーター、mGluR6プロモーター、錐体アレスチンプロモーター、CRALBP1プロモーター、Chx10プロモーター、ロドプシンプロモーター、錐体オプシンプロモーター、リカバリンプロモーター、シナプシンＩプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質プロモーター、ニューロン特異的エノラーゼプロモーター、カルシウム／カルモジュリン-依存性蛋白キナーゼＩＩ（ＣＭＫＩＩ）プロモーター、チューブリンαＩプロモーター、血小板由来成長因子β鎖プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、Ｌ７プロモーター、及びグルタミン酸受容体デルタ２プロモーターから選択されるプロモーターであるか、該プロモーターの連続する５０～１５０の塩基配列を有するプロモーターか、又は該５０～１５０の塩基配列に対して９０％以上同一の塩基配列からなるプロモーターである、請求項１９～２９のいずれか一項に記載のベクター。
　前記ベクターにおける前記少なくとも１つのヌクレオチド配列の塩基の長さが約１０～約５００である、請求項１９～３０のいずれか一項に記載のベクター。
　対象における眼疾患、障害または症状を治療または予防するための、請求項１９～３１のいずれか一項に記載のベクター。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのすべてが前記細胞に導入される、請求項１９～３２のいずれか一項に記載のベクター。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第２～第５エキソンが前記細胞に導入される、請求項１９～３２のいずれか一項に記載のベクター。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第３～第５エキソンが前記細胞に導入される、請求項１９～３２のいずれか一項に記載のベクター。
　前記所望の核酸がロドプシン遺伝子を含み、前記ベクターによって、該ロドプシン遺伝子の第１～第５エキソンのうち、少なくともいずれか１つのエキソンが前記細胞に導入される、請求項１９～３２のいずれか一項に記載のベクター。