ES2647272T3 - Producción de ácido nucleico - Google Patents

Abstract

Una enzima transcriptasa inversa que comprende una secuencia de aminoácidos de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney, en la que dicha enzima tiene una actividad óptima a una temperatura por encima de 42 ºC, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación en la posición L603, en la que la mutación no es L603A y, opcionalmente, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación adicional en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos: D200, L139, T330, E607, T287, Q221, I49, N479, H594, A502, D653, K658, P130, Q237, A307, Y344, Q430, D449, A644, N649, L671, E673, M39, Q91, M66, W388, I179, L333, R390, Q374, y E5, en la que cuando la mutación adicional está en la posición D653, la mutación no es D653N, y en la que cuando la mutación adicional está en la posición H594, la mutación no es H594A.

Description

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DESCRIPCIÓN

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Producción de ácido nucleico

Campo de invención

La presente invención se refiere a enzimas de transcriptasa inversa.

Antecedentes de la invención

El desarrollo de proteínas es una tecnología conocida para la selección y desarrollo dirigido de proteínas obtenidas de bibliotecas grandes. El principio básico de selección es garantizar que exista un enlace entre un fenotipo específico (proteína) y su genotipo codificante. Este enlace entre fenotipo y genotipo puede realizarse de tres maneras diferentes:

•

enlace covalente, tal como presentación en ARNm, y hasta cierto grado, presentación en fagos, presentación en bacterias, presentación en levaduras, etc.

•

enlace no covalente que utiliza interacción por afinidad. Son ejemplos de ello la presentación en ribosomas, la presentación en CIS, presentación en plásmidos etc.,

•

compartimentalización, tal como compartimentalización in vitro (CIV, in vitro compartmentalisation), autorreplicación compartimentalizada (CSR, compartmentalized self-replication), exploración bacteriana simple y exploración a alto rendimiento etc.

Como se indica en el párrafo anterior, un ejemplo de enlace covalente entre fenotipo y genotipo se realiza utilizando presentación en ARNm. Como describen Roberts y Szostak (1997) las fusiones covalentes entre un ARNm y el péptido o la proteína que codifica pueden generarse mediante la traducción in vitro de ARNm sintéticos que contienen puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo en su extremo 3’.

El enlace no covalente entre fenotipo y genotipo puede realizarse con presentación en ribosomas. En la presentación en ribosomas, una matriz de ARN que incluye uno o más que codifican una proteína diana, se somete a un sistema de traducción in vitro para formar un complejo ternario no covalente de ribosoma, ARNm y proteína que se acopla a ARNt. Esta matriz de complejos ternarios debe estabilizarse. Por consiguiente, cada complejo ternario formado durante la traducción in vitro utiliza ARNm que carece de un codón de TERMINACIÓN (STOP) en el extremo. Los complejos ternarios se estabilizan además a baja temperatura (4 ºC) y a alta concentración de magnesio (50 mM). En el complejo estable, el enlace entre fenotipo y genotipo se conserva. La sigue una etapa de selección mediante la cual la proteína diana se selecciona basándose en una propiedad de la proteína mientras que aún permanece unida al complejo ternario. Los complejos ternarios seleccionados pueden después desensamblarse y el ARNm asociado con la proteína diana se amplifica por RT-PCR.

En general, la presentación en ribosomas se aplica satisfactoriamente para la selección de péptidos (Mattheakis et al., 1994; Matsuura y Pluckthun, 2003) y proteínas (Hanes y Pluckthun, 1997; He y Taussig, 1997; Irving et al., 2001) que se unen a dianas diferentes. En algunos casos, es posible utilizar presentación en ribosomas para seleccionar actividades enzimáticas, realizando selección de proteínas por afinidad con un inhibidor suicida (Amstutz et al., 2002) o un ligando de sitio activo (Takahashi et al., 2002).

En la compartimentalización in vitro (IVC), el enlace entre fenotipo y genotipo se realiza por compartimentalización in vitro de genes en una emulsión de agua en aceite. La cantidad de genes que se utiliza para preparar la emulsión se calcula de tal manera que la mayoría de los compartimentos acuosos contienen como máximo un solo gen. Los genes compartimentalizados se transcriben y traducen. Después, se evalúa la actividad de las proteínas sintetizadas. Una selección posterior, basándose en la actividad de la proteína, produce una amplificación de ADN que codifica proteínas activas con propiedades deseadas. Las gotitas de agua utilizadas en la mayoría de las aplicaciones de compartimentalización in vitro, IVC, tienen un tamaño de 2-3 μm, proporcionando un volumen de reacción de ~ 5 femtolitros y ~1010 compartimentos de agua en aceite (fase acuosa 50 µl) por 1 ml de emulsión. El primer ejemplo satisfactorio del sistema de selección IVC se basó en la actividad de metilación de ADN específico diana (Tawfik y Griffiths, 1998). Genes de HaeIII metiltransferasa se compartimentalizaron, se transcribieron y tradujeron. La metiltransferasa sintetizada in vitro en presencia de un cofactor pudo metilar su propio ADN. Basándose en la resistencia del ADN metilado (producto de reacción) a la digestión con endonucleasa de restricción HaeIII, se seleccionaron genes que codificaban la metiltransferasa a partir de un exceso de 107 veces superior a otras moléculas de ADN.

Hasta ahora se han diseñado y realizado muchas más modificaciones de IVC. La forma más fácil de realizar la selección con IVC es utilizar enzimas modificadoras de ADN, en particular ADN-metiltransferasas (Lee et al., 2002; Cohen et al., 2004). Se aplicó una estrategia experimental similar para seleccionar variantes activas de la endonucleasa de restricción FokI (Doi et al., 2004). El ADN compartimentalizado, que codifica endonucleasas de restricción activas, se digirió y seleccionó por incorporación posterior de biotina-dUTP y unión a perlas de estreptavidina.

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Se aplicó una estrategia de selección con IVC diferente para el desarrollo de ADN polimerasas (Ghadessy et al., 2001; Ghadessy et al., 2004; Ong et al., 2006). Este nuevo método de selección se basa en “la autorreplicación compartimentalizada” (CSR) de genes que codifican ADN polimerasa activa. Contraria a la IVC habitual, en la que las proteínas de interés se expresan in situ, la CSR se realiza por compartimentalización de células bacterianas que expresan ADN polimerasa termófila. Las células resuspendidas en tampón de PCR, complementadas con cebadores y con los dNTP se emulsionan dando compartimentos de un tamaño aproximado de 15 μm. Cada gotita de agua actúa como un compartimiento de PCR distinto. Durante la etapa inicial de desnaturalización de la PCR, las células bacterianas se rompen liberando la ADN polimerasa termófila expresada y su gen codificante en la mezcla de reacción, permitiendo que prosiga la autorreplicación mientras que otras proteínas bacterianas se desnaturalizan debido a la alta temperatura.

Una modificación de la IVC es el uso de emulsiones dobles de agua en aceite en agua. Las gotitas de agua rodeadas por una capa de aceite pueden analizarse y clasificarse en un FACS a una velocidad de >104 variantes por segundo (Bernath et al., 2004; Mastrobattista et al., 2005).

La selección para la unión de proteínas también puede realizarse mediante IVC. Una proteína de interés expresada en compartimentos de agua en aceite se acopla de manera covalente (Bertschinger y Neri, 2004) o no covalente (Doi y Yanagawa, 1999; Yonezawa et al., 2003; Sepp y Choo, 2005) con el gen que la codifica.

Se conocen otras aplicaciones de IVC, en las que microperlas atrapadas en compartimentos se utilizan como mediadores para el acoplamiento de la proteína y el gen. Genes sencillos unidos a microperlas se transcriben y traducen en gotitas de agua. La proteína recién sintetizada se captura sobre la misma perla dentro del compartimento de reacción. Después, la emulsión se rompe y las perlas aisladas pueden utilizarse adicionalmente para la selección por afinidad (Sepp et al., 2002). Normalmente, las emulsiones se rompen utilizando disolventes orgánicos (hexano, éter, cloroformo), que también pueden disminuir la actividad de determinadas enzimas presentadas en las perlas, limitando la aplicación de esta tecnología. Para la selección de actividad catalítica las microperlas pueden lavarse fácilmente, resuspenderse en tampón de reacción diferente y compartimentalizarse de nuevo mediante una segunda etapa de emulsificación (Griffiths y Tawfik, 2003). Sin embargo, algunas veces los complejos rígidos enzima-perla-gen (debido al impedimento estérico y a las limitaciones de movilidad de las enzimas) no pueden cumplir con los requisitos de reacción esenciales y la actividad de las enzimas unidas puede ser inferior a la de la enzima libre. Además, dichos métodos son técnicamente complicados dado que tienen que utilizarse muchos componentes adicionales (es decir etiquetas de afinidad, anticuerpos y perlas).

La composición de emulsiones utilizada en la IVC se diseña para garantizar la estabilidad de los compartimentos acuosos y la transcripción eficiente in vitro de ARNm y posterior traducción de proteínas diana. El desarrollo in vitro tiene una amplia serie de dianas a mejorar. Algunas proteínas y enzimas de interés funcionan de un modo intenso y pueden ser lo suficientemente activas en diferentes tampones, en particular en mezclas de reacción utilizadas en la IVC. Sin embargo, hay muchas enzimas complicadas, que pueden funcionar únicamente en condiciones optimizadas

o específicas. Además, la primera ley del desarrollo in vitro dice -“desarrollarás para lo que estás seleccionando”. Esto significa que una enzima desarrollada y optimizada en la mezcla de reacción de transcripción/traducción funcionará bien en esa mezcla en particular y lo más probable es que funcione mucho peor en su propio tampón. En algunos casos, las condiciones de funcionamiento de las enzimas son incompatibles con la mezcla de transcripción y traducción in vitro utilizada para la expresión de proteínas en compartimentos. Una solución parcial es un sistema de suministro de nanogotas (Bernath et al., 2005) que se utiliza para transportar diferentes solutos en compartimentos de emulsión. Incluso manipulaciones más sofisticadas con compartimentos de agua en aceite pueden realizarse empleando dispositivos de microfluido. Emulsiones individuales o dobles muy monodispersas (Thorsen et al., 2001; Okushima et al., 2004) pueden prepararse a una velocidad de hasta 10000 gotitas de agua por segundo. Los compartimentos acuosos generados pueden transportarse en canales microfluidos, fusionarse, subdividirse y clasificarse (Song et al., 2003; Link et al., 2006). No obstante el cambio de tampón completo en los compartimentos sigue siendo un problema.

Las transcriptasas inversas son enzimas comerciales muy importantes utilizadas para sintetizar ADNc a partir de una diana de ARNm. Se han realizado muchas investigaciones para mejorar las propiedades de las transcriptasas inversas. Sin embargo, hasta ahora no se conocía ningún sistema de selección que funcionase correctamente y que fuese adecuado para el desarrollo in vitro de la transcriptasa inversa. Utilizando exploración a alto rendimiento y diseño racional, se realizan casi todas las mejoras y se seleccionan mutantes de transcriptasa inversa.

Para la selección de la transcriptasa inversa totalmente activa no se puede utilizar ni presentación en ribosomas (RD, ribosome display) ni compartimentación in vitro (IVC). Los complejos ternarios utilizados en la presentación en ribosomas no suelen ser estables a temperaturas más altas, necesarias para realizar la selección de la transcriptasa inversa y, como consecuencia, se perderá el enlace entre fenotipo y genotipo. Mientras que los complejos ternarios relativamente estables utilizados en la presentación en ribosomas pueden producirse utilizando extracto sintético de traducción in vitro WakoPURE (Matsuura et al., 2007), la transcriptasa inversa traducida in vitro inmovilizada en ribosoma y ARNm encontrará un impedimento estérico significativo durante la síntesis del ADNc de longitud completa. También existe la posibilidad de que la enzima inmovilizada actúe tanto en trans como en cis, lo que de nuevo es incompatible con la estrategia de desarrollo de las proteínas, porque no se preservará el enlace entre el fenotipo y el genotipo.

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La IVC generalmente emplea ADN como material genético. La transcripción in vitro de ARNm y la traducción de proteínas diana se realiza en compartimentos de agua emulsionados, separados espacialmente, en presencia del

5 ADN. En el caso del desarrollo in vitro de la transcriptasa inversa, la presencia de una secuencia de ADN codificante anula el requisito previo principal de selección para la actividad transcriptasa inversa – el ADNc tiene que sintetizarse de novo. En otras palabras, la selección para obtener mejores variantes de transcriptasa inversa se basa en la capacidad enzimática de sintetizar su propio ADNc codificante a partir de ARNm. El ADNc recién sintetizado tiene que amplificarse por PCR, por lo tanto el ADNc debe ser la única fuente de ADN en la reacción. El ADN utilizado en la selección de IVC se amplificará junto con el ADNc cancelando el esquema de selección básico.

Variantes más sofisticadas de compartimentalización in vitro, tales como el uso de microperlas atrapadas en compartimentos de agua (Sepp et al., 2002; Griffiths y Tawfik, 2003), permiten realizar un cambio completo del tampón de reacción. En esta estrategia, el enlace entre fenotipo y genotipo se realiza a través de microperlas, dando

15 lugar a una unidad de selección rígida ARNm-microperla-proteína, que, en caso de selección de transcriptasa inversa, de nuevo puede causar impedimento estérico y, como resultado, una síntesis ineficaz de ADNc.

La ADN polimerasa de Taq (Thermus aquaticus), capaz de sintetizar ADNc de ~300 nucleótidos de longitud, se seleccionó utilizando modificación de la tecnología de presentación en fagos (Vichier-Guerre et al., 2006). Aunque esta estrategia funciona, tiene algunos inconvenientes: 1) no todas las proteínas pueden presentarse en fagos; 2) requisito absoluto de utilizar nucleótidos marcados con biotina para la selección; 3) la enzima presentada puede funcionar tanto en trans como en cis; 4) debido al impedimento estérico y a las limitaciones de movilidad de la enzima, el complejo fago-enzima-ADN/ARN puede interferir con la síntesis eficaz de ADNc.

25 La posibilidad de selección para la transcriptasa inversa también se menciona en el documento WO0222869, que está relacionada con el método de autorreplicación compartimentalizada (CSR). La tecnología CSR se utiliza para seleccionar ADN polimerasas termófilas, en particular ADN polimerasa de Taq (Ghadessy et al., 2001; Ghadessy et al., 2004; Ong et al., 2006). Células bacterianas, que expresan bibliotecas mutantes de ADN polimerasa termófila se suspenden en la mezcla de PCR y se emulsionan dando lugar a compartimentos de PCR distintos para selección in vitro de polimerasas más activas.

La selección real para la actividad transcriptasa inversa se impedirá por la presencia de RNasas bacterianas, que permanecen activas a temperaturas moderadas y degradarán el ARNm diana. También habrá contaminación de ADN a partir de ADN plasmídico no seleccionado (liberado de las células bacterianas) así como la presencia de

35 todas las enzimas de E. coli, proteínas estructurales, ribosomas, NTP, RNasas, DNasas y moléculas de bajo peso molecular.

El documento WO 2007/022045 A2 desvela transcriptasas inversas mutantes y métodos de uso.

El documento WO 2004/024749 A2 desvela transcriptasas inversas termoestables y usos de las mismas.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una enzima transcriptasa inversa que comprende una secuencia de aminoácidos

45 de la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney, en la que dicha enzima tiene una actividad óptima a una temperatura por encima de 42 ºC, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación en la posición L603, en la que la mutación no es L603A, y opcionalmente, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación adicional en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos:

D200, L139, T330, E607, T287, Q221, I49,

N479, H594, A502, D653, K658, P130, Q237, A307, Y344, Q430, D449, A644, N649, L671, E673, M39, Q91, M66, W388, I179, L333, R390, Q374 y E5,

en la que cuando la mutación adicional está en la posición D653, la mutación no es D653N, y en la que cuando la mutación adicional está en la posición H594 la mutación no es H594A.

La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica la enzima transcriptasa inversa de acuerdo 55 con las reivindicaciones.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para la producción de ácido nucleico que codifica una proteína diana, que comprende:

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(a)

proporcionar una matriz de moléculas de ARN o ADN, incluyendo una o más que codifiquen la proteína diana;

(b)

generar una proteína diana a partir de la matriz para formar complejos de ARN-proteína o de ADN-proteína, en los que la molécula de ARN o de ADN está unida, o no, de manera covalente con el complejo;

(c)

separar los complejos en compartimentos, en los que la mayoría de ellos, o todos los compartimentos, no contengan más de un complejo;

(d)

someter los complejos a condiciones de reacción que permitan expresar la actividad de la proteína diana; y

(e)

seleccionar ácido nucleico que codifique la proteína diana basándose en la actividad asociada a la misma,

en el que cuando el complejo es un complejo de ADN-proteína, en el que el ADN no está unido de manera covalente, la etapa b) se realiza en ausencia de compartimientos separados para cada complejo.

En el presente documento se describe un método que utiliza dos tipos distintos de enlace entre fenotipo y genotipo y consigue un nuevo sistema de selección para su uso en métodos de desarrollo de proteínas en el laboratorio. Las nuevas características del método, descritas más adelante, permiten que se aplique a una amplia serie de proteínas diana en comparación con los métodos de la técnica anterior, con mayor facilidad de uso y flexibilidad. En particular, el método actual proporciona, por primera vez, la posibilidad de desarrollar y mejorar las propiedades de las enzimas transcriptasas inversas -uno de los grupos enzimáticos más importantes como herramienta de trabajo de los biólogos moleculares.

En un aspecto, la descripción proporciona un proceso para la producción de ácido nucleico que codifica una proteína diana, que comprende:

(a)

proporcionar una matriz de moléculas de ARN o ADN, incluyendo una o más que codifiquen la proteína diana;

(b)

generar una proteína diana a partir de la matriz para formar complejos de ARN-proteína o de ADN-proteína;

(c)

separar los complejos en compartimentos, en los que la mayoría de ellos, o todos los compartimentos, no contengan más de un complejo;

(d)

someter los complejos a las condiciones de reacción que permitan expresar la actividad de la proteína diana; y

(e)

seleccionar el ácido nucleico que codifique la proteína diana basándose en la actividad asociada a la misma,

en el que en el complejo de ARN-proteína, el ARN está unido, o no, de manera covalente al mismo, y en el complejo de ADN-proteína, el ADN está unido de manera covalente al mismo.

En un segundo aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para la producción de ácido nucleico que codifica una proteína diana, que comprende:

(a)

proporcionar una matriz de moléculas de ARN o ADN, incluyendo una o más que codifiquen la proteína diana;

(b)

generar la proteína diana a partir de la matriz para formar complejos de ARN-proteína o ADN-proteína, en los que la molécula de ARN o de ADN está unida, o no, de manera covalente al complejo;

(c)

separar los complejos en compartimentos, en los que la mayoría de ellos, o todos los compartimentos, no contengan más de un complejo;

(d)

someter los complejos a condiciones de reacción que permitan expresar la actividad de la proteína diana; y

(e)

seleccionar ácido nucleico que codifique la proteína diana basándose en la actividad asociada a la misma,

en el que la etapa b) se realiza en ausencia de compartimentos separados para cada complejo.

Los enlaces covalentes entre ADN o ARN y la proteína diana pueden generarse mediante cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, presentación de ARNm, presentación en fagos, presentación en bacterias o presentación en levaduras. En particular, un enlace covalente entre ARN-proteína puede generarse utilizando la técnica de presentación en ARNm, mientras que un enlace covalente entre ADN-proteína puede generarse utilizando la técnica de presentación en anticuerpos mediante enlace covalente (CAD, covalent antibody display) (Reiersen et al., 2005), realizando la traducción en compartimentos mediante presentación de ADN por enlace covalente (Bertschinger y Neri, 2004) o utilizando técnicas similares de presentación por enlace covalente, tales como las descritas por Stein et al., (2005).

También pueden generarse enlaces no covalentes entre ADN o ARN y la proteína diana, mediante cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, presentación en ribosomas, presentación en CIS, presentación en plásmidos. En particular, puede generarse un enlace no covalente entre ADN-proteína en ausencia de un compartimiento utilizando presentación en CIS (Odergrip et al., 2004), mientras que puede generarse un enlace no covalente entre ARN-proteína utilizando la técnica de presentación en ribosomas.

Como se indicó anteriormente, cuando el complejo es un complejo de ADN-proteína, en el que el ADN no está unido por enlace covalente, la etapa (b) del procedimiento se realiza en ausencia de compartimentos separados para cada complejo. En otras palabras, la etapa (b) no está compartimentalizada. Específicamente, cuando el complejo generado es un complejo de ADN-proteína, en el que el ADN no está unido por enlace covalente, la etapa de generación se realiza sin separar cada miembro de la matriz entre sí. En particular, la etapa de generación se realiza sin separar cada miembro de la matriz mediante compartimentalización in vitro (IVC). En un ejemplo particularmente preferido, la etapa de generación se realiza sin separar cada miembro de la matriz en una emulsión de agua en aceite.

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La compartimentalización también puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica que permita que los complejos se generen o se separen de tal manera que todos ellos, o sustancialmente todos los compartimentos, no contengan más de un complejo. En particular, se prefiere que al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de los compartimentos no contengan más de un complejo. Por ejemplo, la compartimentalización puede realizarse separando miembros de la matriz o de cada complejo en diferentes pocillos en una placa de microtitulación o nanotitulación, o mediante compartimentalización in vitro (IVC). En particular, la separación mediante IVC puede implicar la separación en gotitas acuosas en una emulsión de agua en aceite o una emulsión de agua en aceite en agua.

El método de la presente descripción combina al menos dos tipos diferentes de enlace genotipo-fenotipo seleccionados de la lista: enlace covalente, enlace no covalente y compartimentalización. En un aspecto preferido, el método no utilizó no más de dos de estas uniones. Por tanto, en un ejemplo particularmente preferido el método utiliza el enlace covalente o no covalente como único enlace entre genotipo-fenotipo en la etapa b). En otras palabras, en este ejemplo no hay compartimentalización en la etapa b).

Los enlaces covalentes/no covalentes entre ADN y ARN y la proteína en ausencia de un compartimento, puede establecerse de muchas maneras diferentes, por ejemplo, mediante presentación en ribosomas, presentación en ARNm (Roberts y Szostak, 1997), presentación en CIS (Odergrip et al., 2004) o presentación de anticuerpos por enlace covalente (CAD, covalent antibody display) (Reiersen et al., 2005). Específicamente, el enlace covalente entre ADN-proteína puede realizarse en ausencia de compartimentos utilizando la técnica CAD, mientras que el enlace covalente entre ARN-proteína y el enlace no covalente entre ARN-proteína, puede establecerse mediante presentación en ARNm y presentación en ribosomas, respectivamente.

El método desvelado en el presente documento puede realizarse a través de una combinación de muchos enlaces diferentes. Por ejemplo, el método puede realizarse a través de una combinación de presentación en ribosomas y compartimentalización in vitro, o a través de una combinación de presentación en ARNm, presentación en CIS o presentación CAD e IVC.

En un aspecto preferido, el procedimiento para la producción de ácido nucleico que codifique una proteína diana, se realiza a través de una combinación de presentación en ribosomas y compartimentalización in vitro. En particular, dicho procedimiento comprende:

(a)

proporcionar una matriz de uno o más ARNm, incluyendo uno o más que codifiquen la proteína diana;

(b)

incubar la matriz de los ARNm en condiciones para que se produzca la traducción en el ribosoma, para generar una matriz de complejos ternarios, comprendiendo cada uno de ellos un ARNm, un ribosoma y una proteína traducida a partir del ARNm;

(c)

incorporar la matriz de complejos ternarios en gotitas en fase acuosa de una emulsión de agua en aceite o de agua en aceite en agua, en el que la mayoría, o todas, las gotitas en fase acuosa, no contengan más de un complejo ternario;

(d)

someter las gotitas en fase acuosa a condiciones de reacción que permitan expresar la actividad de la proteína; y

(e)

seleccionar el ácido nucleico que codifique la proteína diana basándose en la actividad enzimática asociada a la misma.

Dicho procedimiento de acuerdo con la presente descripción, puede denominarse “presentación en ribosomas compartimentalizada” (CRD, compartmentalized ribosome display). La CRD es aplicable a una amplia serie de proteínas diana, incluyendo enzimas. La CRD tiene la ventaja de que el enlace entre la enzima y el ARNm no es covalente. Por tanto, si las condiciones de reacción utilizadas en la etapa (d) implican una temperatura elevada, los complejos ternarios generados en la etapa (b) se desintegrarán y la enzima se liberará. Esto evita los problemas asociados con la movilidad enzimática descritos anteriormente para los métodos de la técnica anterior en los que la enzima está inmovilizada en una perla.

Las gotitas de emulsión con complejos de presentación en ribosomas en el interior pueden clasificarse o seleccionarse en la etapa (e) de muchas maneras. Preferentemente se clasifican mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, fluorescence activated cell sorting) o utilizando técnicas de microfluido. Ambas técnicas aprovechan principalmente la clasificación de gotas basada en fluorescencia. Sin embargo, las gotas también pueden separarse por tamaño, difracción de luz o absorción de luz dependiendo de las condiciones de reacción utilizadas en la etapa (d) y de la actividad proteica que se esté seleccionando.

Los métodos de clasificación basados en fluorescencia se utilizan preferentemente cuando la proteína diana es una enzima. En este ejemplo las condiciones de reacción empleadas en la etapa (d) incluyen un sustrato no fluorescente que puede transformarse en un producto fluorescente. La actividad de la enzima genera el producto fluorescente, lo que permite el uso de FACS para diferenciar entre gotitas fluorescentes que contienen una enzima activa y gotitas no fluorescentes, o menos fluorescentes, que no contienen una enzima activa, o que contiene una enzima menos activa.

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En particular, la CRD es aplicable a enzimas de procesamiento de ácido nucleico, tales como transcriptasas inversas, y permite realizar un desarrollo rápido y eficaz in vitro.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona un proceso para la producción de ácido nucleico que codifica una proteína diana, que comprende:

(a)

proporcionar una matriz de uno o más ARNm, incluyendo uno o más que codifiquen la proteína diana; en la que los ARNm comprendan un sustrato para una enzima que comprenda la proteína diana o una coenzima de la misma;

(b)

incubar la matriz de los ARNm en condiciones para que la traducción del ribosoma genere una matriz de complejos ternarios, comprendiendo cada uno de ellos un ARNm, un ribosoma y una proteína traducida a partir del ARNm;

(c)

incorporar la matriz de complejos ternarios, y opcionalmente la coenzima, en gotitas de fase acuosa de una emulsión de agua en aceite o de agua en aceite en agua, en el que la mayor parte, o todas, las gotitas de fase acuosa no contienen más de un complejo ternario;

(d)

someter las gotitas de fase acuosa a condiciones de reacción que permitan expresar la actividad enzimática; y

(e)

seleccionar ácido nucleico que codifique la proteína diana basándose en la actividad enzimática asociada a la misma.

En un ejemplo de este aspecto, en el que la enzima de procesamiento de ácido nucleico es una ADN polimerasa dependiente de ADN, el ARNm de la etapa (a) puede ligarse a una molécula adaptadora de ADN bicatenario para proporcionar el sustrato.

La diversidad CRD es de ~109-1010 variantes y está limitada por etapa de compartimentalización in vitro, IVC. El nuevo método es mucho más eficiente, consume menos tiempo y es más asequible en comparación con la exploración a alto rendimiento (HTS, high throughput screening), que puede utilizarse para explorar ~105-106 variantes mutantes de transcriptasa inversa. La diversidad CRD es aproximadamente cuatro órdenes de magnitud más alta en comparación con la HTS; por tanto, mediante selección de presentación en ribosomas compartimentalizada, pueden eliminarse fácilmente muchos más mutantes beneficiosos omitidos por HTS.

De acuerdo con la etapa (a), se proporciona una matriz de uno o más ARNm que son ARNm típicamente sintetizados, que incluye uno o más miembros de la matriz que codifica la proteína diana. Cuando la proteína diana es una transcriptasa inversa, los ARNm comprenden un sustrato para una enzima que comprende la proteína diana

o una coenzima de la misma en la etapa de selección posterior (e), el ácido nucleico que codifica la proteína diana se selecciona basándose en la actividad enzimática asociada a la misma. De esta manera, se contemplan dos ejemplos: uno en el que la actividad enzimática se proporciona a través de la proteína diana y otro en el que la actividad enzimática se proporciona a través de una coenzima de la proteína diana en presencia de la proteína diana. En el ejemplo que requiere la coenzima, esta se incorpora en gotitas de fase acuosa de la emulsión de agua en aceite de la etapa (c), como ocurre en la matriz de complejos ternarios. Cuando la enzima comprende la proteína diana, no se requiere incorporar una coenzima adicional en las gotitas de fase acuosa.

En la etapa (b) del procedimiento, la matriz de los ARNm se trata con ribosomas para generar una matriz de complejos ternarios, comprendiendo cada uno de ellos un ARNm, un ribosoma y una proteína traducida a partir del ARNm. Esta etapa puede realizarse en cualquiera de las condiciones adecuadas para la traducción típica in vitro de ARNm, como se utiliza, por ejemplo, en la técnica de presentación en ribosomas. En este punto, los complejos ternarios pueden purificarse, aunque esto no es esencial. Los complejos ternarios pueden complementarse en este punto con cualquier cosustrato necesario para la actividad enzimática posterior en el cual la mezcla de reacción se emulsiona típicamente para dar aproximadamente 1010 compartimentos de agua en aceite, teniendo típicamente cada uno de ellos un diámetro medio de aproximadamente 2 a 3 μm. Incluso un volumen pequeño (25 ml) de reacción de traducción in vitro genera aproximadamente de 1011 a 1012 moléculas de complejos ribosómicos almacenados. Un método de presentación en ribosomas típico utiliza ARNm que carece de codones de TERMINACIÓN, aunque el codón de TERMINACIÓN puede estar presente (Matsuura et al., 2007). Para obtener gotitas de fase acuosa, en las que la mayor parte, o todas, no contengan más de un complejo ternario, la concentración de los complejos ternarios debería reducirse en aproximadamente dos órdenes de magnitud en comparación con la concentración correspondiente utilizada en una técnica de presentación en ribosomas típica. En esta etapa del procedimiento solamente se utiliza una concentración muy pequeña de complejos ternarios.

La enzima puede comprender una enzima procesadora de ácido nucleico, que puede ser una enzima procesadora de ARN. La enzima procesadora de ácido nucleico puede comprender la proteína diana y puede seleccionarse de una polimerasa de ácido nucleico, una ligasa de ácido nucleico y una desoxinucleotidil transferasa terminal. Como se describe con más detalle en el presente documento, la polimerasa de ácido nucleico puede comprender una transcriptasa inversa. En este ejemplo, el ARNm que codifica la transcriptasa inversa es en sí mismo el sustrato para la transcriptasa inversa. La etapa (e) de selección de ácido nucleico que codifica la proteína diana, comprende seleccionar ADNc producido por la acción de la transcriptasa inversa, cuyo ADNc codifica la transcriptasa inversa.

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Cuando la proteína diana es una ligasa de ácido nucleico, se puede realizar la selección para ligasas de ARN (ADN) capaces de ligar ARN con ARN o ADN con ARN. Preferentemente, las condiciones de reacción que permiten expresar la actividad enzimática incluyen un cosustrato que comprende un enlazador o adaptador de ácido nucleico, cuyo cosustrato comprende adicionalmente un ligando de afinidad para la unión con un compañero de unión a ligando o a una etiqueta secuenciadora para la amplificación específica de ARNm procesado en RT-PCR. En el primer caso, el ARNm que codifica la proteína diana se liga al cosustrato en aquellas gotitas de fase acuosa que incorporan ARNm que codifica una ligasa de ácido nucleico. Preferentemente, el ligando de afinidad comprende biotina y el compañero de unión a ligando comprende estreptavidina. La etapa de selección de ácido nucleico que codifica la proteína diana comprende la selección de ARNm que incorpora el cosustrato, uniéndose a una fase sólida que comprende el compañero de unión a ligando. En un proceso típico, una biblioteca de ligasas mutantes se traduce in vitro y los complejos ternarios purificados se diluyen y emulsionan en un tampón de reacción con enlazador y/o adaptador de ADN/ARN marcado con biotina. Después de llevar la emulsión a una temperatura de 37 ºC, los complejos ternarios de ribosoma se desensamblan. La ligasa se liberará y el extremo 3’ del ARNm se volverá accesible para el adaptador marcado con biotina y posterior reacción de ligamiento. El ARNm marcado con biotina que codifica únicamente variantes activas (o más activas) de ligasa, se purificará en perlas de estreptavidina y puede amplificarse mediante RT-PCR.

En el segundo caso, la etapa de selección de ácido nucleico que codifica la proteína diana comprende la selección de ARNm con etiqueta específica de secuencia unida, que puede utilizarse para el sitio de emparejamiento selectivo del cebador para la transcripción inversa y posterior PCR.

En un procedimiento típico, una biblioteca de ligasas mutantes se traduce in vitro y los complejos ternarios purificados se diluyen y emulsionan en un tampón de reacción con un enlazador y/o adaptador de ADN/ARN. Después de llevar la emulsión a una temperatura de 37 ºC los complejos ternarios ribosómicos se disocian. La ligasa se liberará y el extremo 3’ del ARNm se volverá accesible para el adaptador y posterior reacción del ligamiento. El ARN que solo codifica variantes activas (o más activas) de ligasa tendrá una secuencia enlazadora específica necesaria para el emparejamiento específico del cebador utilizado en la transcripción inversa y puede amplificarse de manera eficaz mediante RT-PCR.

También es posible seleccionar la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Esta enzima actúa sobre el ARN e incorpora desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos nucleotídicos y similares. En este ejemplo, las condiciones de reacción que permiten expresar la actividad enzimática incluyen un cosustrato comprende dNTP que adicionalmente comprende un ligando de afinidad para la unión con un compañero de unión a ligando. Al igual que con la ligasa de ácido nucleico, el ligando de afinidad puede ser biotina y el compañero de unión a ligando estreptavidina. La selección del ácido nucleico que codifica la proteína diana puede comprender la selección de ARNm que se incorpora al cosustrato por unión a una fase sólida que comprende el compañero de unión a ligando. Una biblioteca de TdT mutantes puede traducirse in vitro y los complejos ternarios ribosómicos purificados pueden tener que diluirse y emulsionarse en un tampón de reacción con nucleótidos marcados con biotina, tales como biotina-dUTP. La temperatura de funcionamiento óptima para la enzima de tipo silvestre es de 37 ºC. A esta temperatura los complejos ternarios ribosómicos se disociarán y el extremo 3’ del ARNm se volverá accesible para la reacción de polimerización independiente de molde. El ARNm que codifica la TdT que incorpora nucleótidos marcados con biotina se selecciona en las perlas de estreptavidina y posteriormente puede retrotranscribirse y amplificarse mediante RT-PCR.

En un ejemplo adicional, la proteína diana comprende una enzima transcriptasa inversa auxiliar, tal como una helicasa, pirofosfatasa, factor de procesividad, proteína de unión a ARN u otra proteína capaz de mejorar una reacción de transcripción inversa en presencia de transcriptasa inversa. En este ejemplo, la enzima de procesamiento de ácido nucleico comprende una transcriptasa inversa, que es la coenzima incorporada en las gotitas de fase acuosa de la emulsión de agua en aceite. En la etapa (e) de selección de un ácido nucleico que codifique una proteína diana, se selecciona ADNc, cuyo ADNc se produce por la acción de la transcriptasa inversa y que codifica la enzima transcriptasa inversa auxiliar. La presencia de la enzima transcriptasa inversa auxiliar en la fase acuosa facilita la transcripción inversa del ARNm que codifica la enzima auxiliar. Por lo tanto, el ARNm que se retrotranscribe forma ADNc que codifica la enzima auxiliar y esto puede amplificarse por PCR.

En un ejemplo adicional, la proteína diana comprende un inhibidor de RNasa (Ribonucleasa). En este ejemplo, la enzima de procesamiento de ácido nucleico comprende una RNasa. La etapa (e) de selección de un ácido nucleico que codifique la proteína diana comprende la selección de ARNm no degradado por RNasa. En este ejemplo, la RNasa se incorpora como coenzima en las gotitas de fase acuosa de la emulsión de agua en aceite. Una vez que las condiciones de reacción permiten expresar la actividad enzimática, cualquier gotita que no contenga inhibidor de RNasa efectivo exhibiría actividad de RNasa, por lo que se ARNm se degradaría. Por tanto, el ARNm que codifica el inhibidor de RNasa efectivo en las condiciones de reacción utilizadas sobreviviría. Típicamente, una biblioteca de inhibidores de RNasa mutante se traduce in vitro y los complejos ternarios ribosómicos purificados se diluyen y emulsionan en un tampón de reacción con RNasa apropiada. En una modalidad alternativa la RNasa puede suministrarse después mediante microgotitas de emulsión. El ARNm que solo codifica un inhibidor de RNasa activo (o más estable) se purificará y amplificará por RT-PCR.

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La presentación compartimentalizada en ribosomas también puede utilizarse para el intercambio del tampón de reacción en la compartimentalización in vitro, donde el tampón de selección es incompatible con la mezcla de traducción in vitro y la conversión del sustrato en producto debe realizarse en condiciones de reacción estrictamente controladas.

El ácido nucleico que codifica la proteína diana que se ha seleccionado basándose en la actividad enzimática asociada con la misma, puede ser ADN o ARN, como se indica en el presente documento. La matriz puede transformarse o amplificarse para formar ADN o ARN. En una modalidad preferida, la matriz se transforma o se amplifica para formar la matriz de los ARNm de la etapa (a) del proceso y se somete a uno o más ciclos adicionales de etapas (b) a (e) para enriquecer adicionalmente la matriz con cantidades crecientes de ARNm que codifican la proteína diana.

La etapa (d) de someter las gotitas de fase acuosa a condiciones de reacción que permitan expresar la actividad enzimática, proporciona la base de la etapa de selección (e) en la que se seleccionan los ácidos nucleicos que codifican la proteína diana. En la etapa (d) puede utilizarse amplia serie de condiciones de reacción para proporcionar una presión selectiva. En un ejemplo, las condiciones de reacción incluyen una temperatura por encima de la temperatura óptima para una enzima de tipo silvestre. Estas condiciones de reacción pueden utilizarse para seleccionar una enzima mutante que sea más termoestable que la enzima de tipo silvestre o que tenga una mayor velocidad de reacción a esa temperatura o un perfil de actividad alterado por la temperatura. Las enzimas mutantes pueden tener que funcionar a mayores sensibilidades que las enzimas de tipo silvestre porque las concentraciones de ARNm en las gotitas de fase acuosa son de aproximadamente 400 pM. Las enzimas mutantes también pueden tener que funcionar con mayor precisión. Todas estas presiones de selección son particularmente importantes en relación con las transcriptasas inversas. Además de las condiciones físicas, las condiciones de reacción pueden incluir alteraciones en el tampón, concentraciones de otros factores, tales como iones metálicos y pH.

En la selección CRD pueden aplicarse muchas más presiones de selección diferentes para obtener mejores transcriptasas inversas: 1) selección de más enzimas solubles que son menos propensas a la agregación – los complejos ternarios (antes de la emulsificación) tienen que preincubarse con material hidrófobo para eliminar proteínas con restos hidrofóbicos expuestos en la superficie; 2) selección de enzimas muy rápidas – los tiempos de reacción de transcripción inversa tienen que reducirse gradualmente durante los ciclos de selección; 3) selección de enzimas que sintetizan ADNc largo -prolongación gradual de bibliotecas de ARNm utilizadas en CRD y como consecuencia síntesis de ADNc más largo; 4) selección de enzimas capaces de transcribirse a través de estructuras secundarias – han de introducirse secuencias formadoras de estructuras secundarias en la biblioteca de ARNm utilizada en CRD; 5) selección de enzimas que funcionan en tampones que son diferentes del tampón RT (por ejemplo en la PCR, un tampón RT-PCR de una etapa o con agentes desnaturalizantes) – la selección CRD tiene que realizarse en un tampón de nuestra elección; 6) selección de enzimas capaces de incorporar análogos nucleotídicos -la selección debe realizarse en tampón RT con análogos nucleotídicos marcados con biotina con purificación de ADNc posterior en perlas de estreptavidina.

La presentación compartimentalizada en ribosomas (CRD) es también adecuada para muchas aplicaciones de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La proteína de interés tiene que presentarse en un formato de presentación en ribosomas. El complejo ternario opcionalmente purificado (o solo diluido muchas veces) que comprende ARNm-ribosoma-proteína (ARNt) mezclado con sustrato (S) no fluorescente en tampón de reacción debe emulsionarse produciendo emulsiones dobles de agua en aceite en agua (Bernath et al., 2004; Mastrobattista et al., 2005). Las variantes activas de enzimas compartimentalizadas transformarán el sustrato (S) en un producto

(P) fluorescente que permita la FACS para diferenciar entre gotitas fluorescentes (con la enzima activa en su interior) y “oscuras” (con la enzima inactiva en su interior). Contrario a los ejemplos anteriormente publicados, en los que la reacción enzimática debe realizarse en una mezcla de transcripción/traducción, la CRD permite realizar el intercambio completo de tampón y la selección de enzimas activas en condiciones (requeridas) más naturales (FIG. 10).

También es posible (FIG. 11) realizar la selección y el desarrollo de ADN polimerasas termoestables utilizando CRD. La polimerasa de interés tiene que presentarse en un formato de presentación en ribosomas. El complejo ternario opcionalmente purificado (o solo diluido muchas veces) que comprende ARNm-ribosoma-polimerasa, puede utilizarse para preparar la mezcla de reacción con transcriptasa inversa (enzima auxiliar), los dNTP y un conjunto de cebadores en el tampón de la PCR. La solución de reacción debe emulsionarse produciendo una emulsión de agua en aceite. En la primera etapa RT, la transcriptasa inversa debe sintetizar ADNc, que posteriormente servirá como una diana para la segunda etapa de PCR -amplificación de ADNc por ADN polimerasa presentada en ribosoma. Uno de los cebadores utilizados en la PCR puede tener biotina para su purificación posterior adicional con perlas de estreptavidina y un extremo 5’ no complementario. Después de la RT-PCR, las emulsiones deben degradarse, el fragmento de ADN recién sintetizado puede purificarse mediante biotina y reamplificarse utilizando un nuevo conjunto de cebadores, que contendrá un cebador con una secuencia no complementaria al ADNc, pero idéntica a la parte 5’ del cebador utilizado en la primera reacción de amplificación (amplificación selectiva de ADN sobre fondo de ADNc). Variantes más activas de ADN polimerasa se enriquecerán sobre variantes menos activas y pueden utilizarse para análisis posteriores o para la próxima ronda de selección (FIG. 11).

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A continuación se indican las características relevantes de la tecnología de presentación en ribosomas compartimentalizada:

1) el genotipo se mantiene mediante una biblioteca de ARNm, lo cual es especialmente útil en la selección de enzimas procesadoras de ARN; 2) la unidad de selección es un complejo ternario de ARNm-ribosoma-proteína (ARNt) y este puede purificarse fácilmente por ultracentrifugación, filtración en gel, purificación con etiqueta de afinidad y otros medios sencillos; 3) el tampón de reacción puede cambiarse permitiendo de este modo que la unidad de selección se transfiera (con o sin purificación) a una nueva mezcla de reacción y al mismo tiempo que se diluya por un factor de 100 a 200 (para ajustar el número de complejos ribosómicos después de la emulsificación a menos de una molécula por compartimento de reacción); 4) la diversidad de la biblioteca de ARNm de CRD está limitada únicamente por la diversidad de la compartimentalización in vitro y es menor de 1010 variantes diferentes; 5) una vez emulsionada, la reacción de selección puede realizarse a un amplio intervalo de temperaturas de 4 ºC a 94 ºC porque las emulsiones son estables por encima de estas temperaturas; 6) si las selecciones se realizan a elevadas temperaturas (30 ºC y mayor), los complejos ternarios se disociarán pero continuarán compartimentalizados de manera que no pierdan el enlace entre genotipo-fenotipo, liberando ARNm y la proteína traducida in vitro.

Se ha descubierto que el procedimiento de presentación compartimentalizada en ribosomas descrito en el presente documento, funciona particularmente bien promoviendo el desarrollo de nuevas enzimas transcriptasas inversas. Como ejemplo, la transcriptasa inversa M-MuLV (Gerard et al., 1986, pRT601) puede utilizarse para la selección (incluyendo la enzima una etiqueta de histidina N terminal para la purificación). Esta transcriptasa inversa tiene una temperatura de actividad óptima de 42 ºC y es activa a temperaturas de hasta 50 ºC. Una matriz de ARNm que codifican la transcriptasa inversa M-MuLV puede someterse en la etapa (d) del procedimiento a condiciones de reacción que incluyen un cebador y dNTP necesarios para la síntesis de ADNc a una temperatura de incubación en el intervalo de 50 ºC a 60 ºC. A estas temperaturas elevadas los complejos ribosómicos almacenados, estables a 4 ºC, se disocian rápidamente liberando en solución un sustrato de transcriptasa inversa (ARNm) y la enzima.

En un ejemplo, la transcriptasa inversa M-MuLV traducida in vitro, liberada del complejo ribosómico, tiene una fusión C terminal con la proteína D en la superficie externa del fago lambda, utilizada en la construcción de presentación en ribosomas como un espaciador que permanece en el túnel ribosómico (Matsuura y Pluckthun, 2003) y está unido por enlace covalente al ARNt, porque la traducción no finalizó adecuadamente. La proteína D es una proteína, que se expresa muy bien, es soluble y estable con una temperatura de transición en desarrollo de ~57 ºC (Forrer y Jaussi, 1998) y por lo tanto es un buen compañero de fusión para la selección de transcriptasas inversas termoestables.

En el método de selección de presentación compartimentalizada en ribosomas tan solo variantes completamente activas de transcriptasa inversa, pueden realizar la síntesis de ADNc, que codifica la misma enzima activa. Al cabo de 1 hora, después de finalizar la reacción de transcripción inversa, la emulsión se degrada, el ADNc se purifica y se amplifica mediante PCR anidada. Debido a la naturaleza de la selección de la CRD solo el ADNc, que codifica variantes activas de transcriptasa inversa, capaz de realizar la síntesis de ADNc de longitud completa, se amplificará y, si fuera necesario, se transferirá a la siguiente ronda de selección. Con el fin de eliminar mutaciones indeseables en la región promotora de la polimerasa T7, el sitio de unión al ribosoma (RBS, ribosome binding site) y la secuencia de proteína la D, el ADN amplificado que codifica únicamente la secuencia M-MuLV, puede ligarse a fragmentos 5’ y 3’ terminales nativos de tal manera que la construcción original de presentación en ribosomas se reestablezca y pueda realizarse la siguiente ronda de selección.

En cinco rondas de selección se han identificado variantes enzimáticas con actividades específicas a 50 ºC, que son 2-4 veces mejores en comparación con la actividad de la enzima primaria utilizada para la preparación de la biblioteca. Algunas de las proteínas son más rápidas, otras más termoestables. Muchas variantes de M-MuLV seleccionadas tienen mutaciones D524G o D583N, que desactivan la actividad RNasa H de la transcriptasa inversa y mejoran la síntesis de ADNc así como la termoestabilidad (Gerard et al., 2002). Muchas más variantes de transcriptasas inversas M-MuLV seleccionadas tienen otras mutaciones beneficiosas diferentes (H204R; H638R; T197A; M289V; E302K; T306A; N454K; Y64C; E69G; Q190R; V223M; F309S; L435P; E562K) mencionadas y descritas anteriormente (US7056716; US20060094050A1; US7078208; US20050232934A1; WO07022045A2). Además de eso se han encontrado muchos puntos calientes nuevos en la secuencia de aminoácidos de la transcriptasa inversa. Algunas mutaciones se repiten con mucha frecuencia y tienen mucha importancia, lo que se demostró analizando mutantes purificados (Ejemplo 2). Por tanto se puede afirmar que nuestra tecnología de CRD es un método de selección muy rápido y contundente, cuya eficacia ha sido confirmada por el desarrollo directo y la mejora de la transcriptasa inversa M-MuLV. Como prueba de principio se seleccionaron variantes de la transcriptasa inversa M-MuLV que funcionaban mejor a temperaturas más altas.

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La presente descripción también se refiere a una enzima transcriptasa inversa que puede obtenerse mediante el procedimiento tal como se describe en el presente documento.

La presente invención proporciona la enzima transcriptasa inversa de las reivindicaciones. En particular, la enzima

5 tiene una actividad óptima a una temperatura por encima de 42 ºC, preferentemente una temperatura de al menos 50 ºC y más preferentemente en el intervalo de 50 ºC a 60 ºC. Las enzimas transcriptasas inversas pueden seleccionarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento aplicando condiciones de reacción que tienen una temperatura elevada, preferentemente de al menos 50 ºC. Puede seleccionarse una enzima transcriptasa inversa que tenga un perfil de actividad en función de la temperatura que se desplace en comparación

10 con la enzima de tipo silvestre para aumentar la temperatura a la que se observa la actividad óptima.

La descripción también proporciona una enzima transcriptasa inversa que comprende una secuencia de aminoácidos de la transcriptasa inversa MMLV con una mutación en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos:

15 D200, D653, L603, T330, L139, Q221 T287, I49, N479, H594, F625, H126 A502, E607, K658, P130, Q237, N249 A307, Y344, Q430, D449, A644, N649, L671, E673, M39, Q91, M66, W388, I179, E302, L333, R390, Q374 y E5

Cuando la mutación está en D653 se prefiere que la mutación no sea D653N. Cuando la mutación está en L603 se prefiere que la mutación no sea L603A. Además, cuando la mutación está en H594 se prefiere que la mutación no sea H594A.

20 Se prefiere que las mutaciones en las posiciones anteriores sean mutaciones puntuales.

Preferentemente, la transcriptasa inversa tiene una o más de las siguientes mutaciones:

D200N,A o, G, D653N,G,A,H o, V, L603W o M, T330P, L139P, Q221R, T287A, I49V o T, N479D, H594R o Q, F625S o L, H126S o R, A502V, E607K, G o A, K658R o Q P130S, Q237R, N249D, A307V, Y344H, Q430R, D449G o A, A644V o T, N649S, L671P, E673G o K, M39V o L, Q91R o L, M66L, W388R, I179T o V E302K L333Q R390W Q374R y E5K.

25 Cada una de estas mutaciones se encuentra, por ejemplo, en enzimas mutantes que tienen una actividad superior a 50 ºC en comparación con la enzima de tipo silvestre correspondiente. En los ejemplos específicos se describen detalles adicionales de estas mutaciones.

30 En el aspecto particularmente preferido, la enzima mutante tiene al menos dos mutaciones. En un ejemplo las dos mutaciones están en D200 y en L603. Por ejemplo, las mutaciones son D200N y L603W. En un ejemplo alternativo, las mutaciones están en N479 y H594. Por ejemplo las mutaciones son N479D y H594R.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona una enzima transcriptasa inversa que tiene una actividad óptima

35 a una temperatura por encima de 37 ºC, en la que la actividad a 50 ºC es al menos el 120 % de la actividad a 37 ºC. Preferentemente, la actividad a 50 ºC es al menos el 130 %, más preferentemente al menos el 160 % de la actividad a 37 ºC.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una enzima transcriptasa inversa mutante que tiene 40 una actividad a 50 ºC que es al menos el doble que la de la enzima de tipo silvestre correspondiente.

En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una enzima transcriptasa inversa mutante que tiene una actividad específica a 37 ºC que es al menos el 130 % de la de la enzima de tipo silvestre correspondiente. Preferentemente, la actividad específica de la enzima transcriptasa inversa mutante es al menos el 140 %, más

45 preferentemente al menos el 150 % y, en particular, preferentemente al menos el 160 % de la de la actividad específica de la enzima de tipo silvestre correspondiente. Se ha descubierto, como se describe en el presente documento, que la actividad específica de la enzima de tipo silvestre parcialmente purificada a 37 ºC es de aproximadamente 200.000 U/mg. Las enzimas transcriptasas inversas mutantes específicas que pueden obtenerse se analizan con más detalle en los ejemplos específicos.

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En un aspecto adicional, la presente descripción proporciona una enzima transcriptasa inversa mutante que tiene una termoestabilidad de al menos 1,5 veces la de la enzima de tipo silvestre correspondiente. En la presente solicitud, la termoestabilidad se mide como actividad residual a 37 ºC después de tratamiento a 50 ºC durante 5 minutos. Preferentemente, la termoestabilidad de la enzima transcriptasa inversa mutante es al menos 1,5 veces, más preferentemente al menos 2 veces, aún más preferentemente al menos 2,5 veces la de la enzima de tipo silvestre correspondiente. Típicamente, la actividad residual a 37 ºC de la enzima transcriptasa inversa de tipo silvestre es aproximadamente 11 % en comparación con una enzima no tratada.

Se prefiere que la enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la descripción, comprenda una transcriptasa inversa MMLV.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un polinucleótido, tal como un ARNm o ADN, que codifica una enzima transcriptasa inversa como se describe en las reivindicaciones.

Las transcriptasas inversas de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse en una variedad de técnicas de biología molecular tales como RT-PCR (qRT-PCR, etc.). Puede proporcionarse un kit para la RT-PCR en el que la transcriptasa inversa del kit sea una transcriptasa inversa de acuerdo con la presente descripción.

Descripción detallada de la invención

La invención se describirá ahora con mayor detalle, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos y anexos acompañantes:

Figura 1. Esquema experimental del Ejemplo 1. Para sintetizar fragmentos de PCR, se utilzaron dos plásmidos pET_his_MLV_pD (que codifica la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-M) fusionada a la proteína D espaciadora) y pET_his_del_pD (que codifica la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-M) inactivada (deleción de 57 aminoácidos en dominio pol). Los fragmentos de PCR se utilizaron adicionalmente en la reacción de transcripción y síntesis de ARNm que carece del codón de TERMINACIÓN en el extremo 3’. El ARNm purificado se mezcló a una proporción de 1:50 = VLM (RT activa): del (RT inactiva) y se utilizó para la reacción de traducción in vitro. Durante la reacción de traducción el complejo ribosómico sintetiza la proteína y se detiene en el extremo del ARNm que carece del codón de TERMINACIÓN. La mezcla de complejos ternarios (CT) se purificó por ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa. Los complejos ternarios purificados (<3*109 moléculas tomadas) que ya contienen ARNm ligado a la transcriptasa inversa MLV traducida in vitro, se utilizaron para preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa complementada con un conjunto de dNTP externo y cebador para la reacción RT. La mezcla de reacción RT enfriada en hielo se emulsionó dando ~1*1010 compartimentos de agua en aceite de un tamaño de ~2 μm. La mezcla de reacción RT emulsionada (menos de un CT (ARNm + MVL + RT) por compartimento se incubó durante 1 hora a 42 ºC para realizar la reacción RT. Después de elevar la temperatura de la mezcla de reacción RT compartimentalizada, la mayoría de los CT se disociaron liberando ARNm y transcriptasa inversa. La reacción RT satisfactoria se realizó únicamente en compartimentos que contenían transcriptasa inversa de MLV activa (MLV_pD) y en compartimentos con transcriptasa inversa inactiva (del_pD) no se sintetizó ADNc. La PCR posterior amplifica el ADNc y se observa un enriquecimiento de genes de transcriptasa inversa activa (MLV_pD) sobre los de transcriptasa inversa inactiva (del_pD).

Figura 2. Esquema estructural del plásmido pET_his_MLV_pD.

Figura 3. Ejemplo 1 -electroforesis en gel de agarosa de la primera PCR realizada en ADNc sintetizado durante la selección CRD. Cebadores utilizados: RD_Nde (SEQ ID NO: 9) y pD_55 (SEQ ID NO: 10). La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 2185 pb para MLV_pD y de 2014 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla de PCR por pocillo.

Figura 4. Ejemplo 1 -electroforesis en gel de agarosa de PCR anidada para amplificación génica parcial realizada en el primer producto de PCR. Cebadores utilizados: M_F (SEQ ID NO: 11) y M_2R (SEQ ID NO: 12). La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 907 pb para MLV_pDa y de 736 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla de PCR por pocillo.

Figura 5. Ejemplo 1 -electroforesis en gel de agarosa de PCR anidada para amplificación génica completa realizada en el primer producto de PCR. Cebadores utilizados: M_Esp (SEQ ID NO: 13) y M_Eri (SEQ ID NO: 14). La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 2077 pb para MLV_pDa y de 1906 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla de PCR por pocillo.

Figura 6. Esquema experimental de selección CRD en el Ejemplo 2. Los fragmentos de la PCR que codifican la biblioteca de la transcriptasa inversa (en fusión con la proteína D) MLV_pD mutante, se utilizaron para sintetizar ARNm. El ARNm purificado se utilizó para la reacción de traducción in vitro. Los complejos ternarios (CT) de ARNm-ribosoma-MLV_pD (ARNt) se formaron en la mezcla de traducción y se estabilizaron a baja temperatura y a alta concentración de iones Mg2+. La mezcla de CT se purificó por ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa. El TC precipitado se disolvió en tampón enfriado con hielo (Mg2+ 50 mM) y se utilizó para preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa complementada con un conjunto de dNTP externo y cebador para reacción RT. La mezcla de reacción RT enfriada con hielo se emulsionó dando ~1*1010 compartimentos de agua en aceite de un tamaño de ~2 μm. La temperatura de reacción óptima de la RT MLV es de ~42 ºC. Para seleccionar variantes de transcriptasa inversa, que funcionan mejor a temperaturas más altas, la mezcla de reacción RT emulsionada (menos de un CT (ARNm + RT MLV) por compartimento) se incubó durante 1 hora a 50 ºC. A esta temperatura la síntesis satisfactoria del ADNc de longitud completa se realizó mejor en compartimentos que contenían variantes de transcriptasa inversa MLV más activas o termoestables. Se utilizó PCR posterior para amplificar el ADNc de longitud completa y se realizó el enriquecimiento de genes de transcriptasa inversa más activos y termoestables. Los genes amplificados por PCR se llevaron de nuevo a un formato CRD restaurando secuencias 5’ (secuencias codificantes de fragmento de INICIO -promotor de polimerasa T7, SD y etiqueta de histidina) y 3’ (fragmento de INICIO -enlazador gs, proteína D y segundo enlazador gs) intactas por PCR de ligamiento El fragmento de PCR reconstruido, que contenía una biblioteca enriquecida con genes de transcriptasa inversa, se utilizó para la transcripción de ARNm posterior y en la siguiente ronda de selección CRD. Cada ronda de selección se realizó a temperaturas de reacción RT cada vez más altas: 50 ºC (1ª ronda); 52,5 ºC (2ª ronda); 55 ºC (3ª ronda); 57,5 ºC (4ª ronda) y 60 ºC (5ª ronda).

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Figura 7. Esquema de reconstrucción de fragmentos de PCR antes de una nueva ronda de selección CRD. La biblioteca de RT MLV mutada se digirió con Esp31 (extremo compatible con NcoI) y EcoRI y se ligó con los fragmentos de INICIO (244 pb) y END (398 pb) para obtener fragmentos de PCR adecuados para la selección CRD. El fragmento de INICIO (que contenía secuencias codificantes del promotor de la polimerasa T7, SD y etiqueta de histidina) se construyó por amplificación por PCR del fragmento de INICIO 983 pb (diana -plásmido pET_his_del_pD (SEQ ID NO: 2), cebadores -pro-pIVEX (SEQ ID NO: 3) y M_1R (SEQ ID NO: 15)) y posterior digestión con NcoI (secuencia de reconocimiento C ↓ CATGG) dando un fragmento de ADN de 244 pb. El fragmento de FIN (que contenía las secuencias del enlazador gs, proteína D y del segundo enlazador gs) se construyó por amplificación por PCR del fragmento de FIN inicial de 1039 pb (diana -plásmido pET_his_del_pD (SEQ ID No: 2), cebadores -M_3F (SEQ ID No: 16) y pD-ter (SEQ ID No: 4)) y posterior digestión con EcoRI (secuencia de reconocimiento G ↓ AATTC) dando un fragmento de ADN de 398 pb.

Figura 8. Actividades transcriptasa inversa de variantes RT mutantes medidas a 37 ºC, 50 ºC y actividad residual a 37 ºC después de 5 minutos de incubación a 50 ºC. La actividad transcriptasa inversa a 37 ºC se normalizó siempre al 100 % y se omitió. Por tanto solo se muestran dos tipos de columnas (porcentajes de actividad RT a 50 ºC y actividad RT residual a 37 ºC después de 5 minutos de incubación a 50 ºC). Como control se da la transcriptasa inversa M-MuLV ts (de tipo silvestre) utilizada para la construcción de la biblioteca de mutantes. Esta enzima primaria se expresa en el mismo vector y se purifica de la misma manera que las variantes de RT mutantes. Un valor promedio de actividad RT mutante a 50 ºC para todos los mutantes ensayados es de aproximadamente ~ 92 % y es más de 2 veces mayor en comparación con la enzima ts (45 %). Una actividad residual promedio de variantes RT mutantes a 37 ºC después de 5 minutos de preincubación a 50 ºC es del 12 % (enzima ts -11 %).

Figura 9. Actividad específica (u/mg de proteína) de variantes RT mutantes y ts, parcialmente purificadas, medida durante 10 minutos a 37 ºC.

Figura 10. Esquema experimental propuesto de selección CRD utilizando FACS. La proteína de interés se presenta en un formato de presentación en ribosomas. El complejo ternario purificado (o solo diluido muchas veces) que comprende ARNm-ribosoma-proteína (ARNt) se mezcló con un sustrato (S) no fluorescente en tampón de reacción y posteriormente se emulsionó produciendo emulsiones dobles de agua en aceite en agua. Variantes activas de enzimas compartimentalizadas transformarán el sustrato (S) en un producto (P) fluorescente permitiendo diferenciar con FACS entre gotitas fluorescentes (enzima activa en su interior) y “oscuras” (enzima inactiva en su interior).

Figura 11. Esquema experimental propuesto para la selección y desarrollo de ADN polimerasas termoestables utilizando CRD. La polimerasa de interés debe presentarse en un formato de presentación en ribosomas. El complejo ternario opcionalmente purificado (o solo diluido muchas veces) que comprende ARNm-ribosomapolimerasa puede utilizarse para preparar una mezcla de reacción con transcriptasa inversa (enzima auxiliar), los dNTP y un conjunto de cebadores en tampón PCR. La solución de reacción debe emulsionarse produciendo una emulsión de aceite en agua. En la primera etapa RT -la transcriptasa inversa debe sintetizar ADNc, que posteriormente servirá como una diana para la segunda etapa de PCR -amplificación de ADNc por ADN polimerasa presentada en ribosoma. Uno de los cebadores utilizados en la PCR puede tener biotina para una purificación posterior opcional con perlas de estreptavidina y un extremo 5’ no complementario. Después de la RT-PCR las emulsiones deben descomponerse, el fragmento de ADN recién sintetizado puede purificarse mediante biotina y reamplificarse utilizando un nuevo conjunto de cebadores, que contendrá un cebador con una secuencia no complementaria al ADNc, pero idéntica a la parte 5’ del cebador utilizado en la primera reacción de amplificación (amplificación selectiva de ADN sobre fondo de ADNc). Las variantes más activas de ADN polimerasa se enriquecerán sobre las variantes menos activas y pueden utilizarse para análisis posterior o para la siguiente ronda de selección.

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Figura 12. Esquema experimental del Ejemplo 4. En esta configuración experimental la transcriptasa inversa M-MuLV se utiliza como ADN polimerasa dependiente de ADN. Se utilizaron dos plásmidos pET_his_MLV_D583N_pD (que codifica la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (M-MLV) sin RNasa fusionada a la proteína espaciadora D) y pET_his_del_pD (que codifica la transcriptasa inversa inactivada fusionada a la proteína espaciadora D -deleción de 57 aminoácidos en dominio pol y mutación puntual D583N en el dominio RNasa H) para sintetizar fragmentos de PCR. Adicionalmente, los fragmentos de PCR se utilizaron en la reacción de transcripción. El ARNm purificado se mezcló a una proporción de 1:20 = MLV_D583N_pD (RT activa): del_pD (RT inactiva) y se utilizó para preparar el complejo ARNm/ADNbc por ligamiento de ADNbc con la mezcla de ARNm utilizando ADN ligasa de T4. El complejo ARNm/ADNbc se utilizó para la reacción de traducción in vitro. Durante la reacción de traducción el complejo ribosómico sintetiza proteína y se detiene al final del ARNm (al inicio del híbrido ARNm/ADN). La mezcla de complejos ternarios (CT) se purificó por ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa. Los complejos ternarios purificados (<3*109 moléculas tomadas) que ya contenían ARNm/ADNbc ligados a la polimerasa traducida in vitro (transcriptasa inversa M-MuLV) se utilizaron para preparar una mezcla de reacción de elongación complementada con biotinadUTP externa. La mezcla de reacción enfriada con hielo se emulsionó dando ~1*1010 compartimentos de agua en aceite de un tamaño de ~2 μm. La mezcla de reacción de elongación emulsionada (menos de un CT (ARNm/ADNbc + polimerasa) por compartimento se incubó durante 30 minutos a 37 ºC para incorporar el nucleótido marcado con biotina. Después de que la temperatura de la mezcla de reacción compartimentalizada se elevase, la mayor parte del CT se disoció liberando el complejo ARNm/ADNbc y la polimerasa. La reacción de incorporación satisfactoria en el sustrato de ADNbc se realizó únicamente en compartimentos que contenían polimerasa activa (transcriptasa inversa -MLV_D583N_pD) y no se sintetizó ADNc en compartimentos con polimerasa inactiva (del_pD). Tras degradarse las emulsiones, el exceso de biotina-DUTP se retiró utilizando una minicolumna de filtración en gel. El complejo ARNm/ADNbc marcado con biotina se purificó en perlas de estreptavidina y se utilizó para sintetizar ADNc. La PCR posterior amplifica el ADNc y se observa un enriquecimiento de genes de polimerasa activa (transcriptasa inversa -MLV_D583N_pD) sobre los de polimerasa inactiva (del_pD).

Figura 13. Determinación de las eficiencias de incorporación de biotina-dUTP en el complejo ARNm/ADNbc y en el ARNm autocebado. Representación de la RT-PCR realizada en muestras de ARNm/ADNbc (MLV_D583N_pD) y ARNm (del_pD) después de la incorporación de dTTP o biotina-dUTP. El tamaño previsto de los amplicones es de 907 pb para el ADNc de MLV_D583N_pD y de 736 pb para el de del_pD. Los productos de la PCR se analizaron en gel de agarosa al 1 % cargando 10 µl de mezcla PCR por pocillo.

Figura 14. Control generado de la existencia del complejo ARNm/ADNbc por incorporación de dTTP (biotinadUTP) y [α-P33] dATP. El dATP radiactivo debe introducirse en el sustrato ADNbc posteriormente después de la incorporación de dTTP o biotina-dUTP inicial. A – gel de agarosa visualizado con bromuro de etidio (bandas de ARNm o ARNm/ADNbc de ~2,5 kb). B -el mismo gel que en A secado en papel de filtro y visualizado utilizando el generador de imágenes Cyclone Phosphor (Perkin-Elmer, Wellesley, MA). Se observaron bandas del complejo ARNm/ADNbc marcado y/o solo de ADNbc. C -estructura y secuencia del homólogo de ADNbc en el complejo ARNm/ADNbc.

Figura 15. Análisis de los fragmentos resultantes finales de la RT-PCR del Ejemplo 4. El tamaño previsto de los amplicones es de 907 pb para el ADNc de MLV_D583N_pD y de 736 pb para el de del_pD. Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa al 1% cargando 10 μl de mezcla PCR por pocillo. Las muestras de RT-PCR antes de purificar en perlas de estreptavidina corresponden a la proporción 1:20 de genes de polimerasa activos e inactivos (apenas solo es visible el fragmento del_pD de ~736 pb). Las muestras de RT-PCR después de purificar en perlas de estreptavidina, corresponden a la proporción -1:1 de genes de polimerasa activos e inactivos después de una sola ronda de selección. En esta selección se observó un factor de enriquecimiento de ~20.

Figura 16. Algunos ejemplos de geles de agarosa alcalina utilizados para determinar la temperatura más alta de la síntesis de reacción de ADNc de 1 kb y de 4,5 kb. Termociclador -Gradiente Mastercycle Eppendor. A-D síntesis de ADNc de 1 kb (M-MuLV (ts), D200N, L603W y Q221R); gradiente de temperatura 41,9 ºC, 43,6 ºC, 45,5 ºC, 47,8 ºC, 50,4 ºC, 53,1 ºC, 55,8 ºC, 58,1 ºC, 60,1 ºC, 62,1 ºC; tamaño estándar -ADN Fast Ruler de medio alcance (Fermentas). E-G -síntesis de ADNc de 4,5 kb (M2, M3 y M4); gradiente de temperatura 49,8 ºC, 51,5 ºC, 53,4 ºC, 55,7 ºC, 58,3 ºC, 61,0 ºC, 63,7 ºC, 66,1 ºC, 68,0 ºC, 70,0 ºC; tamaño estándar – escalera (ladder) de ADN Zip Ruler Express 2 (Fermentas).

Anexo 1. Esquema general de mutaciones encontradas en la biblioteca de RT MLV inicial (secuencia entre sitios de restricción NcoI y EcoRI -SEQ ID NO: 24). Se encontraron 23 mutaciones nucleotídicas entre 10 genes secuenciados (1 transversión, 20 transiciones -las posiciones mutadas se indican subrayadas, las mutaciones se indican sobre la secuencia, 2 deleciones -subrayadas e indicadas como una línea discontinua sobre la secuencia), dando 15 cambios de aminoácidos, 6 mutaciones silenciosas, 1 codón de terminación y 2 desplazamientos de fase de la fase codificante -como promedio 1-2 sustituciones de aminoácidos por gen.

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Anexo 2. Alineamiento CLUSTALW de las 104 secuencias de proteína sin etiqueta de His en el extremo N terminal para tener la misma numeración de aminoácidos que la normalmente utilizada en la bibliografía. La secuencia de tipo silvestre, indicada como MLV (SEQ ID NO: 25), se da siempre como primera secuencia (las secuencias mutadas representan las SEQ ID Nos: 26 a 128 basándose en el orden en el que se muestran). Las mutaciones se marcan utilizando fuente de color blanco con fondo en negro. Las posiciones de aminoácidos, cuyas mutaciones mejoran algo las propiedades de la transcriptasa inversa M-MuLV y que se describen en diferentes solicitudes de patente, se marcan en el alineamiento como columnas de aminoácidos (fuente de color blanco) resaltadas en gris. Las mutaciones originadas en nuestra selección y ubicadas en columnas grises, indican que nuestro procedimiento de selección se dirigió exactamente a las mutaciones de aminoácidos de punto caliente o incluso exactas, beneficiosas, descritas en cualquier parte. Las secuencias de las proteínas analizadas, cuya actividad a 50 ºC es sustancialmente mejor en comparación con la de M-MuLV ts primaria (70 % y más en comparación con el 45 % de la actividad del tipo silvestre, ts) se resaltan en gris.

Anexo 3. Listado de mutaciones encontradas en todas las variantes RT seleccionadas. Las proteínas se clasifican por número decreciente de mutaciones.

Anexo 4. Frecuencia de mutaciones (en orden decreciente) de variantes RT seleccionadas. Los nombres de las proteínas analizadas, cuya actividad a 50 ºC fue sustancialmente mejor en comparación con la de M-MuLV ts primaria (70 % y mayor en comparación con el 45 % de la actividad de ts) se resaltan en gris.

Anexo 5. Tabla resumen de datos sobre mutantes sencillos y de transcriptasa inversa (ts) M-MuLV, que contiene: nombre de la proteína; frecuencia de selección (número de mutantes secuenciados, que tienen una mutación exacta y el número entre paréntesis indica el número total de mutaciones de aminoácidos particulares encontradas en la selección); concentración de proteína (mg/ml); actividad específica de transcriptasa inversa a 37 ºC (u/mg); actividad relativa a 50 ºC (%); actividad residual relativa a 37 ºC después de 5 minutos de incubación enzimática a 50 ºC (%); actividad RNasa H específica de proteína (u/mol); actividad RNasa H relativa (%) y temperatura más alta de reacción de síntesis de ADNc de 1 kb.

Anexo 6. Tabla resumen de datos sobre mutantes sencillos y de transcriptasa inversa (ts) M-MuLV, que contiene: nombre de la proteína; concentración de proteína (mg/ml); actividad específica de transcriptasa inversa a 37 ºC (u/mg); actividad relativa a 50 ºC (%) y temperatura más alta de reacción de síntesis de ADNc de 1 kb y 4,5 kb.

Anexo 7. Secuencia e información relativa a las SEQ ID Nos: 1 a 23.

Ejemplo 1 -CRD -prueba de concepto

Para proporcionar una prueba de concepto para el sistema de selección de presentación compartimentalizada en ribosomas se realizó una selección de ensayo. El experimento de prueba de concepto típico debe dar una señal positiva para la enzima activa (en nuestro caso el fragmento RT-PCR para la transcriptasa inversa MLV original) y ninguna señal para la enzima inactiva (sin fragmento RT-PCR para la transcriptasa inversa MLV inactivada). El experimento más sofisticado es utilizar una mezcla de genes con relación definida que codifica enzimas activas e inactivas. Como resultado del éxito del experimento los genes que codifican la enzima activa deben enriquecerse sobre los genes que codifican la enzima inactiva.

En la FIG. 1 se muestra el esquema general del experimento. Para sintetizar fragmentos de PCR, se utilzaron dos plásmidos pET_his_MLV_pD (que codifica la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-M) fusionada a la proteína D espaciadora) y pET_his_del_pD (que codifica la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney (VLM-M) inactivada (deleción de 57 aminoácidos en dominio pol) fusionada a la proteína D espaciadora). Adicionalmente los fragmentos de PCR se utilizaron en la reacción de transcripción para la síntesis de ARNm, que carece de codón de TERMINACIÓN en el extremo 3’. Los ARNm purificados resultantes de los dos fragmentos de PCR anteriormente mencionados, se mezclaron con una proporción de 1:50 = MLV (RT activa): del (RT inactiva) y se utilizaron para la reacción de la traducción in vitro. Durante la reacción de la traducción, el complejo ribosómico sintetiza la proteína y se detiene en el extremo del ARNm que carece del codón de TERMINACIÓN. La reacción de la traducción se detuvo por dilución con tampón enfriado con hielo que contenía Mg2+ 50 mM. Una baja temperatura, alta concentración de iones Mg2+ y ausencia del codón de TERMINACIÓN en el extremo del ARNm estabiliza los complejos ternarios (CT) de ARNm-ribosoma-proteína (ARNt). La mezcla de complejos ternarios (CT) se purificó por ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa. La ultracentrifugación se optimizó de tal manera que los CT (~3,5 MDa) se precipitaron en la parte inferior del tubo de ultracentrifugación, mientras que moléculas de pequeño peso molecular, proteínas y la mayor parte del ARNm libre (~0,9 MDa) permanecieron en el sobrenadante. Los CT precipitados se disolvieron en el tampón enfriado con hielo (Mg2+ 50 mM). Los complejos ternarios purificados (<3*109 moléculas tomadas) que ya contenían ARNm ligado a la transcriptasa inversa MLV traducida in vitro se utilizaron para preparar la mezcla de reacción de transcripción inversa complementada con un conjunto de dNTP externos y cebadores para la reacción RT. La mezcla de reacción RT enfriada con hielo se emulsionó dando ~1*1010 compartimentos de agua en aceite de un tamaño de ~2 μm. La mezcla de reacción RT emulsionada (menos que un CT (ARNm + MLV RT) por compartimento se incubó durante 1 hora a 42 ºC para realizar la reacción RT. Después de elevar la temperatura de la mezcla de reacción RT compartimentalizada, la mayor parte de los CT se disocian liberando ARNm y transcriptasa inversa. La reacción RT satisfactoria se realizó solo en compartimentos que contenían transcriptasa inversa MLV activa (MLV_pD) y en compartimentos con transcriptasa inversa inactiva (del_pD) no se sintetizó ADNc. La PCR posterior garantiza la amplificación de ADNc sintetizado y se observó un enriquecimiento de genes de transcriptasa inversa activa (MLV_pD) sobre los de transcriptasa inversa inactiva (del_pD).

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Métodos y materiales

El plásmido inicial pET_his_MLV_pD (SEQ ID NO: 1 y FIG 2) se construyó por modificación del plásmido de tipo pET en la región de las secuencias del promotor de la polimerasa T7 y de Shine-Dalgarno e inserción de la secuencia que codifica la transcriptasa inversa MLV H+ (306-2363 en SEQ ID NO: 1) con etiqueta de Histidina en el extremo N terminal (258-305 en SEQ ID NO: 1) y fusión C terminal con un enlazador de glicina-serina (gs) (2364-2393 en SEQ ID NO: 1), parte de proteína D (pD) del fago lambda (2394-2669 en SEQ ID NO: 1) y segundo enlazador de glicinaserina (gs) (2670-2759 en SEQ ID NO: 1). La etiqueta de Histidina N terminal se utilizó para la purificación de la proteína expresada. La fusión C terminal debe permanecer en el túnel ribosómico durante la traducción in vitro de la proteína y formación del complejo ternario ARNm-ribosoma-MLV (ARNt).

La transcriptasa inversa M-MuLV tiene dos actividades enzimáticas principales: ADN polimerasa dependiente de ARN y RNasa H. La actividad RNasa H de la transcriptasa inversa se inactivó introduciendo la mutación puntual D583N (cambiando un solo nucleótido G por A en la posición 2055 en el plásmido pET_his_MLV_pD, SEQ ID NO: 1). El aspartato 583 que se localiza en el sitio activo de la RNasa H, está implicado en la unión de iones Mg y es crucial para la actividad RNasa H. Un nuevo plásmido se identificó como pET_his_MLV_D583N_pD y se utilizó para la construcción posterior del siguiente plásmido pET_his_del_pD (SEQ ID NO: 2), que codifica la transcriptasa inversa inactivada. El plásmido pET_his_MLV_D583N_pD se digirió con la endonucleasa de restricción XmaJI (secuencia de reconocimiento C↓CTAGG -posiciones 1047 y 1218 en SEQ ID NO: 1). El fragmento génico de 171 pb de longitud se retiró y el plásmido digerido se autoligó, dando el plásmido pET_his_del_pD (SEQ ID NO: 2), que codifica el gen de la transcriptasa inversa acortado en 171 nucleótidos o 57 aminoácidos, sin desplazamiento en fase de traducción de proteína.

Fue importante tener el mismo gen de la transcriptasa inversa: 1) más corto en cuanto a longitud (para facilitar la detección por PCR); 2) inactivo (se confirmó experimentalmente que la deleción de 57 aminoácidos en el dominio polimerasa, inactivaba completamente la actividad polimerasa y la mutación D583N inactivó la actividad RNasa H); y 3) sin desplazamiento de fase (cualquier desplazamiento de fase dará como resultado la aparición de codones de TERMINACIÓN, que no son compatibles con el formato de presentación en ribosomas)

Preparación de fragmentos PCR para LA transcripción in vitro. Se preparó una mezcla de PCR en hielo: tampón Taq 20 μl -10X con KCl (Fermentas); 20 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 12 μl -25 mM (Fermentas); DMSO 16 μl (D8418 -Sigma); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 4 μl -1 u/μl (Fermentas); cebador pro-pIVEX 1 μl -100 μM (SEQ ID NO: 3); cebador pD-ter 1 μl -100 μM (SEQ ID NO: 4); agua 122 μl -mezcla dividida en dos tubos 2x 98 μl. A 2x 98 μl de mezcla maestra de PCR se añadieron bien 2 μl de pET_his_MLV_pD (diluido a ~1 ng/μl) o 2 μl de pET_his_del_pD (diluido a ~1 ng/μl). El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial a 94 ºC, 30 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 53 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final de 5 minutos a 72 ºC. La amplificación fue de ~7000 veces a partir de 2 ng de plásmido (7873 pb) dirigido a ~5 μg (50 ng/μl) de producto amplificado (fragmento PCR de 2702 pb para pET_his_MLV_pD; fragmento PCR de 2531 pb para pET_his_del_pD).

Se preparó la mezcla de transcripción: tampón de transcripción T7 40 μl – 5x (HEPES-KOH 1 M, pH 7,6; Mg acetato 150 mM; espermidina 10 mM; DTT 0,2 M); 56 μl – 25 mM de cada NTP (Fermentas); 8 μl – 20 u/μl de ARN polimerasa de T7 (Fermentas); 4 μl – 40 u/μl de inhibidor de RNasa RiboLock (Fermentas); agua sin nucleasa 52 μl mezcla dividida en dos tubos 2x 80 μl y añadidos 20 μl – 50 ng/μl de MLV_pD (pro-pIVEX//pD-ter) o 20 μl -50 ng/μl de del_pD (pro-pIVEX//pD-ter) de mezcla PCR. La transcripción se realizó durante 3 horas a 37 ºC.

Ambas mezclas de transcripción se diluyeron a 200 μl con agua sin nucleasa enfriada con hielo y se añadieron 200 μl de solución LiCl 6 M. Las mezclas se incubaron durante 30 min a +4 ºC y se centrifugaron durante 30 min a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima (25.000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento de ARN se lavó con 500 μl de etanol al 75 % enfriado con hielo. De nuevo los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a + 4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima y el sobrenadante se desechó. El sedimento de ARN se secó durante 12 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendió en 200 μl de agua sin nucleasa enfriada con hielo, agitando durante 15 minutos a +4 ºC y a 1400 rpm. De nuevo los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima para separar el ARN no disuelto. Aproximadamente 180 μl de sobrenadante se transfirieron a un tubo nuevo con 20 μl de tampón DNasa I 10 x (Mg2+) (Fermentas); DNasa l 1 μl -1 u/μl de (sin RNasa) (Fermentas) y se incubó durante 20 minutos a + 37 ºC para degradar el ADN. A cada tubo se añadieron 20 μl de solución de acetato de sodio 3 M, pH 5,0 y 500 μl de etanol al 96 % enfriado con hielo. Finalmente, el ARN se precipitó por incubación durante 30 minutos a -20 ºC y centrifugación durante 30 minutos a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima (25.000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento de ARN se lavó con 500 μl de etanol al 75 % enfriado con hielo. De nuevo los tubos se centrifugaron durante 5 minutos a +4ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima y el sobrenadante se desechó. El sedimento de ARN se secó durante 12 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendió en 43 μl de agua sin nucleasa enfriada con hielo, agitando durante 15 minutos a +4 ºC y a 1400 rpm. La solución de ARN se dividió en alícuotas de 4x10 μl y se congeló con nitrógeno líquido. La concentración de ARNm se midió espectrofotométricamente y se verificó dos veces en gel de agarosa utilizando escalera de ARN RiboRuler™ de medio alcance (Fermentas) -mRNA de MLV_pD ~1,2 μg/μl; ARNm de del_pD ~1,2 μg/μl.

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El ARNm purificado se mezcló a una proporción de 1:50 = MLV (RT activa): del (RT inactiva). El ARNm de MLV_pD se diluyó 25 veces a ~48 ng/μl y 1 μl (~48 ng) se mezcló con 2 μl ~1,2 μg/μl de ARNm del_pD (2,4 μg) dando una mezcla de ARNm de ~0,8 μg/μl a una proporción 1:50. La traducción in vitro se realizó utilizando dos sistemas de traducción Kit RTS 100 de E. coli HY (03 186 148 001 -Roche) y WakoPURE sintético (295-59503 -Wako). Las secuencias de la traducción de proteínas se dan en la SEQ ID NO: 6 para MLV_pD y en la SEQ ID NO: 7 para del_pD.

Mezcla de traducción para el sistema RTS HY (25 μl): 6 μl -lisado de E. coli (Roche); 5 μl -Mezcla de Reacción (Roche); 6 μl -aminoácidos (Roche); Met 0,5 μl -100 mM (Roche); inhibidor de RNasa RiboLock 0,5 μl -40 u/μl (Fermentas); oligonucleótido assrA 0,4 μl -200 μM (SEQ ID NO: 5); DTT 0,25 μl -1 M; tampón de reconstitución 2,5 μl (Roche); nucleasa sin agua 2,5 μl y mezcla de ARNm 1,5 μl -0,8 μg/μl a 1:50 = MLV_pD: del_pD (~1200 ng). La traducción in vitro se realizó durante 20 min a 30 ºC.

Mezcla de traducción para el sistema WakoPURE (25 μl): solución A 12,5 μl (Wako); solución B 5 μl (Wako); inhibidor de RNasa RiboLock 0,5 μl -40 u/μl (Fermentas); oligonucleótido αssrA 0,4 μl -200 μM (SEQ ID NO: 6); DTT 0,25 μl -1 M; agua sin nucleasa 5 μl y mezcla de ARNm 1,5 μl -0,8 μg/μl a 1:50 = MLV_pD: del_pD (~1200 ng). La traducción in vitro se realizó durante 30 min a 37 ºC.

Ambas traducciones (~25 μl) se detuvieron por adición de 155 μl de tampón de detención enfriado con hielo WBK500+DTT+tritón (tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC, NaCl 50 mM; Mg acetato 50 mM; KCl 500 mM, DTT 10 mM, tritón x-100 al 0,1 % (v/v) (T8787 -Sigma)) y se centrifugó durante 5 minutos a +4 ºC y a 25000 g. Muy cuidadosamente, 160 μl de mezcla de traducción centrifugada se transfirieron con una pipeta a la parte superior de una solución de sacarosa al 35 % (p/v) de 840 μl en WBK500+DTT+tritón (tris-acetato 50 mM, pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; tritón x-100 al 0,1 % (v/v) (T8787-Sigma); sacarosa 35 % (p/v) (84097-Fluka)). Para purificar los complejos ternarios (CT) de ARNm-ribosoma-proteína (ARNt), se realizó ultracentrifugación con una ultracentrífuga Beckman TL-100. Rotor del ángulo fijo TLA100.2 (Beckman); tubos de ultracentrifugación transparentes de 1 ml (343778-Beckman) durante 9 min a +4 ºC y a 100.000 rpm. Para mantener el pequeño sedimento transparente de CT en la parte inferior del tubo de ultracentrifugación, los tubos intactos se manipularon con cuidado. Inicialmente se retiraron 750 μl de solución de la parte más superior del tubo de centrifugación. Después (muy cuidadosamente) las paredes del tubo se lavaron con 750 μl de WBK500 (tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg-acetato 50 mM; KCl 500 mM). Finalmente, toda la solución se retiró comenzando desde la parte más superior del tubo de centrifugación y el sedimento se disolvió en 30 μl de tampón de detención enfriado con hielo WBK500+DTT+tritón (tris-acetato 50 mM, pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg-acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; 0,1 % (v/v) -tritón x-100 (T8787-Sigma).

Como se determinó utilizando ARNm marcado con radioactividad después de ultracentrifugación, el 5 % -30 % de ARNm entrante se localizó en el sedimento del complejo ternario. Por lo tanto, se esperaba que tuviese menos de 360 ng (30 % de 1200 ng de ARNm utilizado en la reacción de traducción) de ARNm en 30 μl de tampón (~12 ng/μl

o 9*109 moléculas/μl de complejo ternario).

La mezcla de reacción de transcripción inversa para la selección se preparó en hielo: tampón de reacción 60 μl -5X para la transcriptasa inversa (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 7,5 μl -40 u/µl (Fermentas); oligonucleótido pD_42 15 μl -20 μM (SEQ ID NO: 8); agua sin nucleasa 188 μl -mezcla dividida en dos tubos 2x 135 μl y 0,9 μl de CT purificado (<8*109 moléculas) (traducción en kit Roche -RTS HY) o 0,9 μl de CT purificado (<8*109 moléculas) (traducción en Wako-WakoPURE). Cada mezcla de reacción (~135 μl) se dividió de nuevo en dos tubos 45 μl y 90 μl. A la primera parte -45 μl de mezcla RT se añadieron 5 μl de agua sin nucleasa. Esta muestra se consideró que era el control de selección negativa (sin dNTP) y debe demostrarse que no hay contaminación de ADN en la mezcla de reacción y que la síntesis de ADNc está estrictamente relacionada con la actividad funcional de la transcriptasa inversa que proviene de la RT MLV en el complejo ternario. A la segunda parte de 90 μl de mezcla RT se añadieron 10 μl -10 mM cada Mezcla de dNTP (Fermentas) y la mezcla de reacción de nuevo se dividió en dos tubos -50 μl para el control de selección y 50 μl complementado con 1 μl -200 u/μl de transcriptasa inversa M-MuLV RevertAid H (Fermentas) para control de selección positiva. De acuerdo con el protocolo, cada mezcla de reacción de transcripción inversa contiene <2,7*109 moléculas de complejo ternario en un volumen de 50 μl.

Se preparó una mezcla de aceite-tensioactivo para la emulsificación, mezclando ABIL EM 90 (Goldschmidt) en aceite mineral (M5904-Sigma) a una concentración final de 4 % (v/v) (Ghadessy y Holliger, 2004; US2005064460). Las emulsiones se prepararon a +4 ºC en viales criogénicos de 5 ml (430492 -Corning) mezclando 950 μl de mezcla de aceite-tensioactivo con 50 μl de mezcla RT. La mezcla se realizó utilizando un agitador magnético MS-3000 con velocidad controlada (Biosan) a ~2100 rpm; barras magnéticas Rotilabo®-(3x8 mm) con anillo central (1489.2 -Roth); la fase acuosa se añadió mediante alícuotas de 10 μl cada 30 segundos, continuando la mezcla durante 2 minutos más (tiempo de mezcla total -4 min). Según datos de microscopía óptica, el tamaño de los compartimentos en nuestra emulsión variaba de 0,5 μm a 10 μm con un diámetro promedio de ~2 μm. Por lo tanto se esperaba tener ~1*1010 compartimentos de agua en aceite después de la emulsificación de la mezcla de reacción de transcripción inversa 50 μl, que contenía menos de 2,7*109 moléculas de complejo ternario (aproximadamente 1 molécula de ARNm y transcriptasa inversa por 3-4 compartimentos).

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Las seis emulsiones que representaban reacciones RT con CT, traducción en el kit Roche -RTS HY (control de selección negativa, control de selección y control de selección positiva) y con CT, traducción en Wako -WakoPURE (control de selección negativa, control de selección y control de selección positiva) se incubaron durante 1 hora a +42 ºC.

Para recuperar las mezclas de reacción, las emulsiones se transfirieron a un tubo de 1,5 ml, se centrifugó durante 1 minuto a temperatura ambiente y a 25.000 g. La fase oleaginosa se retiró dejando una emulsión concentrada (aunque aún intacta) en la parte inferior del tubo y se añadieron 250 μl de tampón PB (kit de purificación PCR Qiagen). Finalmente las emulsiones se degradaron por extracción con éter saturado con agua 0,9 ml; etil acetato saturado con agua 0,9 ml (para retirar el detergente ABIL EM 90) y de nuevo éter saturado con agua 0,9 ml. La fase acuosa se secó durante 5 min al vacío a temperatura ambiente. El ADNc sintetizado se purificó con el kit de purificación PCR Qiagen y se eluyó en 30 μl de tampón EB (kit de purificación PCR Qiagen).

La amplificación de ADNc se realizó mediante PCR anidada. Se preparó una mezcla de PCR inicial en hielo: tampón Taq 16 ml -10X con KCl (Fermentas); 16 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 9,6 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 3,2 μl-1 u/μl (Fermentas); cebador RD_Nde 0,8 μl -100 μM (SEQ ID NO: 9); cebador pD_55 0,8 μl -100 μM (SEQ ID NO: 10); agua 74 μl, la mezcla se dividió en 6 muestras x 15 μl (6x15 μl) y 30 μl. A 6x 15 μl de mezcla maestra PCR se añadieron 5 μl de ADNc (1-6 muestras RT); a 30 μl de mezcla maestra PCR se añadieron 9 μl de agua y de nuevo la mezcla se dividió en dos tubos 2x 19,5 μl para un control de PCR negativo (más agua 0,5 μl) y un control PCR positivo (más 0,5 μl -1:1 mezcla (~1 ng) de plásmidos pET_his_MLV_pD y pET_his_del_pD). El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 min a 94 ºC, 25 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 58 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final 5 minutos a 72 ºC. La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 2185 pb para MLV_pD y de 2014 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla de PCR por pocillo (FIG 3).

La PCR anidada se realizó utilizando dos conjuntos de cebadores diferentes, dando bien una amplificación génica parcial (para una mejor resolución de la proporción de ADNc MLV:del en muestras TR) o una amplificación génica completa (para demostrar la posibilidad de una recuperación génica completa).

La mezcla de la PCR anidada para la amplificación génica parcial se preparó en hielo: tampón Taq 28 μl -10X con KCl (Fermentas); 28 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 16,8 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 5,6 μl -1 u/μl (Fermentas); cebador M_F 1,4 μl -100 μM (SEQ ID NO: 11); cebador M_2R 1,4 μl -100 μM (SEQ ID NO: 12); agua 185 μl, la mezcla se dividió 2x 19 μl y 6x 38 μl. A 2x 19 μl de mezcla maestra PCR se añadió 1 μl de controles positivos y negativos de la primera PCR (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55) 30 ciclos de amplificación PCR; a 6x 38 μl de mezcla maestra PCR se añadieron 2 μl de primera PCR (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55) (1-6 muestras) – de nuevo, cada muestra se dividió en 2x 20 μl para 23 o 30 ciclos de amplificación PCR. El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 min a 94 ºC, 23 o 30 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 57 ºC y 1 minuto a 72 ºC) y elongación final 5 min a 72 ºC. La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 907 pb para MLV_pD y de 736 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla PCR por pocillo (FIG 4).

La mezcla de PCR anidada para la amplificación génica completa se preparó en hielo: tampón Taq 28 μl -10X con KCl (Fermentas); 28 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 16,8 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 5,6 μl -1 u/μl (Fermentas); cebador M_Esp 1,4 μl -100 μM (SEQ ID NO: 13); cebador M_Eri 1,4 μl -100 μM (SEQ ID NO: 14); agua 185 μl – la mezcla se dividió 2x 19 μl y 6x 38 μl. A 2x 19 μl de mezcla maestra PCR se añadió 1 μl de controles positivo o negativo de la primera PCR (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55) -30 ciclos de amplificación PCR; a 6x 38 μl de mezcla maestra PCR se añadieron 2 μl de primera PCR (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55) (1-6 muestras) – de nuevo, cada muestra se dividió en 2x 20 μl para 23 o 30 ciclos de amplificación PCR. El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 min a 94 ºC, 23

o 30 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final 5 min a 72 ºC. La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 2077 pb para MLV_pD y de 1906 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla PCR por pocillo (FIG 5).

Resultados

Para proporcionar una prueba de concepto para el método de presentación compartimentalizada en ribosomas (CRD) se realizó una selección utilizando una mezcla de partida 1:50 = MLV:del de dos ARNm que codifican las transcriptasas inversas activa (MLV) e inactiva (del) fusionadas a la proteína D espaciadora (FIG 1). La traducción in vitro se realizó utilizando dos sistemas de traducción diferentes, Roche -RTS 100 E. coli HY o Wako -WakoPURE para saber qué sistema de traducción era mejor en nuestra configuración experimental. Cada sistema de traducción de reacciones RT tricompartimentalizado se realizó: un control de selección negativa sin dNTP que tenía que demostrar que no había contaminación de ADN en la mezcla de reacción; un control de selección, que tenía que demostrar el enriquecimiento de genes que codifican la transcriptasa inversa (MLV) activa sobre los genes que codifican la enzima inactivada (del), porque solamente la enzima activa puede sintetizar ADNc; y un control de selección positiva complementado con transcriptasa inversa comercial externa RevertAid H, que debe servir como control RT positivo que sintetiza ADNc de ARNm tanto de MLV_pD como de del_pD en todos los compartimentos, mostrando una proporción real de genes en la mezcla de reacción sin aplicar presión de selección.

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El ADNc sintetizado se amplificó por PCR anidada. La representación de la electroforesis en gel de agarosa de la PCR inicial (25 ciclos) (FIG 3) muestra bandas débiles de fragmentos de PCR solo en caso de controles de selección ambos positivos (sistemas de traducción -Roche y Wako). Esto es normal, porque estas muestras contienen enzima RT externa que sintetiza el ADNc de manera mucho más eficaz en comparación con las reacciones solo contienen una molécula de transcriptasa inversa sintetizada in vitro por compartimento.

La representación de la electroforesis en gel de agarosa de la PCR anidada (amplificación génica parcial) se muestra en la FIG 4. Los resultados de la amplificación después de 23 y 30 ciclos de PCR son coherentes:

1) no hay amplificación (no hay contaminación de ADN) en los controles de selección negativa (sin dNTP); 2) se observó una amplificación muy eficaz del ADNc de del_pD (fragmento de ADN de 736 pb) en los controles de selección positiva (enzima RT externa) y no era visible amplificación de ADNc de MLV_pD, porque la proporción inicial de ARNm de MLV_pD con respecto a del_pD ARNm era de 1:50; 3) se observó amplificación de ADNc tanto de MLV_pD (fragmento de ADN de 907 pb) como de del_pD (fragmento de ADN de 736 pb) en caso de controles de selección; 4) se observó una proporción de MLV_pD:del_pD de ~1:1 en caso de transcriptasa inversa sintetizada por el sistema de traducción in vitro de Roche, lo que significa un enriquecimiento de genes MLV_pD de ~50 veces sobre genes del_pD comenzando desde una proporción inicial de 1:50; 5) se observa una proporción de MLV_pD:del_pD de ~1:3 en caso de transcriptasa inversa sintetizada por el sistema de traducción in vitro de Wako, lo que significa un enriquecimiento de genes MLV_pD de ~16 veces sobre genes del_pD comenzando desde una proporción inicial de 1:50.

La representación de la electroforesis en gel de agarosa de la PCR anidada (amplificación génica completa) se muestra en la FIG 5. Los resultados de la amplificación después de 23 y 30 ciclos PCR son coherentes entre sí y comparan los resultados de la PCR anidada utilizando amplificación génica parcial (FIG 5):

1) no hay amplificación (no hay contaminación de ADN) en los controles de selección negativa (sin dNTP); 2) se observó una amplificación muy eficaz del ADNc de del_pD (fragmento de ADN de 1906 pb) en los controles de selección positiva (enzima RT externa) y no se observó amplificación de ADNc de MLV_pD, porque la proporción inicial del ARNm de MLV_pD con respecto a del_pD es de 1:50; 3) se observó amplificación tanto de ADNc de MLV_pD (fragmento de ADN de 2077 pb) como de del_PD (fragmento de ADN de 1906 pb) en caso de controles de selección; 4) es difícil determinar la proporción de MLV_pD:del_pD en caso de amplificación génica completa, porque la diferencia relativa entre los fragmentos de ADN de 2077 pb (MLV_pD) y de 1906 pb (del_pD) no es lo suficientemente grande, pero en general las proporciones son similares a los resultados de la PCR anidada utilizados para la amplificación génica parcial.

Como resultado de este ejemplo, se puede llegar a la conclusión de que durante la reacción de transcripción inversa realizada en un formato CRD, tenemos genes enriquecidos que codifican transcriptasa inversa MLV activa sobre los genes que codifican la enzima inactiva por un factor de 50 en caso del sistema de traducción de Roche o por un factor de 16 en caso del sistema de traducción de Wako utilizado para sintetizar enzimas in vitro.

Ejemplo 2 -selección CRD -para transcriptasa inversa, que muestra un rendimiento mejorado a temperaturas más altas

Para saber cuán eficientemente funciona la selección de Presentación Compartimentalizada en Ribosomas (CRD), se realizó un experimento de desarrollo de la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (RT M-MuLV). El esquema general de los experimentos se muestra en la FIG 6. Se construyó una biblioteca inicial de mutantes de transcriptasa inversa mediante PCR propensa a error, utilizando los análogos nucleotídicos dPTP y 8-oxo-dGTP. Se realizó mutagénesis de todo el gen (~2 kb) introduciendo 2-3 nucleótidos o 1-2 mutaciones de aminoácidos por gen. El fragmento PCR que codifica la biblioteca de mutantes de transcriptasa inversa MLV_pD (en fusión con la proteína D), se utilizó para sintetizar ARNm. El ARNm purificado se utilizó para la reacción de traducción in vitro. Los complejos ternarios (CT) de ARNm-ribosoma-MLV_pD (ARNt) se formaron en la mezcla de traducción y se estabilizaron con baja temperatura y alta concentración de iones Mg2+. La mezcla de CT se purificó por ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa. El CT precipitado se disolvió en tampón enfriado con hielo (Mg2+ 50 mM) y se utilizó para preparar una mezcla de reacción de transcripción inversa complementada con un conjunto de dNTP externos y un cebador para la reacción RT. La mezcla de reacción RT enfriada con hielo se emulsificó dando ~1*1010 compartimentos de agua en aceite de un tamaño de ~2 μm. La temperatura de reacción óptima de la RT MLV es de ~42 ºC. Para seleccionar variantes de transcriptasa inversa, que funcionan mejor a temperaturas más altas, la mezcla de reacción RT emulsionada (menos de un CT (ARNm + RT MLV) por compartimento) se incubó durante 1 hora a 50 ºC. A esta temperatura, la síntesis satisfactoria del ADNc de longitud completa se realizó mejor en compartimentos que contenían variantes de transcriptasa inversa MLV más activas o termoestables. La PCR posterior se utilizó para amplificar el ADNc de longitud completa y se realizó enriquecimiento para genes de transcriptasa inversa más activos y termoestables. Los genes amplificados por PCR, se llevaron de nuevo al formato CRD reestableciendo secuencias 5’ (secuencias que codifican el fragmento de INICIO – el promotor de polimerasa T7, SD y etiqueta de his) y 3’ (fragmento de FIN -enlazador gs, proteína D y segundo enlazador gs) intactas, mediante ligamiento por PCR.

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El fragmento de PCR reconstruido, que contenía la biblioteca enriquecida de genes de transcriptasa inversa, se utilizó para la traducción de ARNm posterior y en la siguiente ronda de selección CRD. Cada ronda de selección se realizó a temperaturas de reacción RT cada vez más altas: 50 ºC (1ª ronda); 52,5 ºC (2ª ronda); 55 ºC (3ª ronda); 57,5 ºC (4ª ronda) y 60 ºC (5ª ronda).

La biblioteca de genes de transcriptasa inversa amplificados (sin enlazador pD C terminal) después de la 5ª ronda de selección, se clonó en un vector plasmídico. Los clones individuales se secuenciaron y analizaron. Un grupo de proteínas desarrolladas, así como de mutantes individuales, se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando etiqueta de histidina. Se determinaron las actividades específicas de la transcriptasa inversa MLV a 37 ºC y a 50 ºC y la actividad residual a 37 ºC después de 5 minutos de incubación enzimática a 50 ºC.

Métodos y materiales

El plásmido inicial pET_his_MLV_pD (SEQ ID NO: 1 y FIG 2) se utilizó como material de partida para la PCR propensa a error. Se introdujeron mutaciones utilizando los análogos nucleotídicos dPTP y 8-oxo-dGTP. La mezcla de PCR para la PCR propensa a error se preparó en hielo: tampón Taq 10X 10 μl -con KCl (Fermentas); 10 μl 2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 6 μl -25 mM (Fermentas); ADN Taq polimerasa LC (recombinante) 2 μl 1 u/μl (Fermentas); cebador M_Esp 0,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 13); cebador M_Eri 0,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 14); dPTP 1 μl -10 μM (TriLink BioTechnolgies); 8-oxo-dGTP 5 μl -100 μM (TriLink BioTechnolgies); 3,75 μl 40 ng/μl (en total 150 ng) de plásmido pET_his_MLV_pD; 61,25 μl de agua. El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial, 3 min a 94 ºC, 30 ciclos (30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 55 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final 5 min a 72 ºC. La amplificación fue 150-300 veces de 150 ng de plásmido (7873 pb) dirigido a ~612 μg de producto amplificado (fragmento PCR de 2077 pb para pET_his_MLV_pD). El fragmento de PCR se purificó utilizando el kit de purificación de PCR Qiagen, se digirió con Esp31 (secuencia de reconocimiento CGTCTC (1/5)) y EcoRI (secuencia de reconocimiento G↓AATTC) y finalmente se purificó del gel de agarosa utilizando el kit de extracción en Gel Qiagen dando una concentración de ADN de ~50 ng/μl.

La eficiencia de la mutagénesis y la calidad de la biblioteca se verificaron secuenciando clones individuales subclonados de nuevo en el plásmido original pET_his_MLV_pD digerido con NcoI y EcoRI. Como se esperaba, las mutaciones se distribuyeron al azar en toda la secuencia amplificada del gen de RT MLV (Anexo 1). Entre los 10 genes secuenciados, se encontraron 23 mutaciones nucleotídicas (1 transversión, 20 transiciones, 2 deleciones marcadas en rojo en el Anexo 1) dando 15 cambios de aminoácidos, 6 mutaciones silenciosas, 1 codón de terminación y 2 desplazamientos de fase de la fase codificante -en promedio 1-2 sustituciones de aminoácidos por gen.

La biblioteca mutada se ligó con los fragmentos de INICIO (244 pb) y de FIN (END) (398 pb) para obtener un fragmento de PCR adecuado para selección CRD (FIG 7). El fragmento de INICIO (que contenía el promotor de polimerasa T7, las secuencias codificantes SD y etiqueta de histidina) se construyó por amplificación PCR del fragmento de INICIO de 983 pb (diana -plásmido pET_his_del_pD (SEQ ID NO: 2), cebadores -pro-pIVEX (SEQ ID NO: 3) y M_1R (SEQ ID NO: 15)) y posterior digestión con NcoI (secuencia de reconocimiento C↓CATGG) dando un fragmento de ADN de 244 pb. El fragmento de FIN (que contenía las secuencias del enlazador gs, de la proteína D y del segundo enlazador gs) se construyó por amplificación PCR del fragmento de FIN inicial de 1039 pb (diana plásmido pET_his_del_pD (SEQ ID NO: 2), cebadores -M_3F (SEQ ID NO: 16) y pD-ter (SEQ ID NO: 4)) y posterior digestión con EcoRI (secuencia de reconocimiento G↓AATTC) dando un fragmento de ADN de 398 pb.

La reacción de ligamiento (150 μl) se preparó a temperatura ambiente: tampón de ligamiento 15 μl -10X para ADN ligasa de T4 (Fermentas); ADN ligasa de T4 15 μl -1 u/μl (Fermentas); biblioteca RT MLV mutada 26 μl -50 ng/μl digerida con Esp31 (extremo compatible con NcoI) y EcoRI (~1300 ng o ~ 5,9*1011 moléculas); fragmento de INICIO 9,4 μl -35 ng/μl digerido con NcoI (~329 ng o ~1,2*1012 moléculas); fragmento de FIN 15,7 μl -35 ng/μl digerido con EcoRI (~548 ng o ~1,2*1012 moléculas); agua 68,9 μl. El ligamiento se realizó durante una noche a +4 ºC. La mezcla de reacción se trató una vez con fenol y dos veces con cloroformo, se precipitó y disolvió en 53 μl de agua. Se determinó el rendimiento aproximado del ligamiento ~20 % comparando la eficiencia de amplificación de la mezcla de ligamiento y la cantidad conocida de plásmido pET_his_MLV_pD. Teniendo en cuenta el rendimiento de ligamiento del 20 % de la biblioteca de mutantes, la diversidad RT MLV se definió como ~1,2*1011 moléculas (50 μl).

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La biblioteca RT MLV ligada se amplificó por PCR (1 ml -preparada en hielo): Tampón Taq 100 μl -10X con KCl (Fermentas); 100 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); mgCl2 60 μl – 25 mM (Fermentas); DMSO 80 μl (D8418-Sigma); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 20 μl -1 u/μl (Fermentas); cebador pro-pIVEX 5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 3); cebador pD-ter 5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 17); biblioteca RT MLV ligada 20 μl (~5*1010 moléculas); agua 610 μl. El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 15 ciclos (30 segundos a 94 ºC, 30 segundos a 53 ºC y 3 minutos a 72 ºC) y elongación final 5 minutos a 72 ºC. La amplificación fue de ~200 veces de ~5*1010 moléculas (correspondiente a ~150 ng) de fragmento de ligamiento final de 2702 pb de tamaño frente a ~30 μg (30 ng/ml) de producto amplificado (fragmento PCR de 2702 pb).

1ª ronda de selección

Se preparó una mezcla de transcripción (100 μl): tampón de transcripción T7 20 μl -5x (HEPES-KOH 1 M pH 7,6; Mg acetato 150 mM; espermidina 10 mM; DTT 0,2 M); 28 μl -25 mM de cada NTP (Fermentas); ARN polimerasa de T7 4 μl -20 u/μl (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 2 μl -40 u/μl (Fermentas); 30 μl -30 ng/μl de biblioteca de mutantes (pro-pIVEX//pD-ter-) mezcla PCR (~900 ng o ~3*1011 moléculas); agua sin nucleasa 16 μl. La transcripción se realizó durante 3 h a 37 ºC (diversidad de biblioteca ~5*1010 moléculas).

La mezcla de transcripción se diluyó a 200 μl con agua sin nucleasa enfriada con hielo y se añadieron 200 μl de solución LiCl 6 M. La mezcla se incubó durante 30 min a +4 ºC y se centrifugó durante 30 min a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima (25.000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento de ARN se lavó con 500 μl de etanol al 75 % enfriado con hielo. De nuevo, el tubo se centrifugó durante 5 min a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima y el sobrenadante se desechó. El sedimento de ARN se secó durante 12 min a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendió en 200 μl de agua sin nucleasa enfriada con hielo agitando durante 15 min a +4 ºC y a 1400 rpm. De nuevo, el tubo se centrifugó durante 5 min a +4ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima para separar el ARN no disuelto. Aproximadamente 180 μl de sobrenadante se transfirieron a un tubo nuevo con 20 μl de tampón de DNasa I 10x (Mg2+) (Fermentas); DNasa I 1 μl -1 u/μl (sin RNasa) (Fermentas) y se incubó durante 30 min a +37 ºC para degradar el ADN. A la mezcla de reacción se añadieron 20 μl de solución de acetato de sodio 3 M pH 5,0 y 500 μl de etanol al 96 % enfriado con hielo. Finalmente, el ARN se precipitó por incubación durante 30 min a -20 ºC y centrifugación durante 30 min a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima (25.000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento de ARN se lavó con 500 μl de etanol al 75 % enfriado con hielo. De nuevo, el tubo se centrifugó durante 5 min a +4 ºC en una centrífuga de enfriado a velocidad máxima y el sobrenadante se desechó. El sedimento de ARN se secó durante 12 min a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendió en 33 μl de agua sin nucleasa enfriada con hielo agitando durante 10 min a +4 ºC y a 1400 rpm. La solución de ARN se dividió en alícuotas 3x 10 μl y se congeló con nitrógeno líquido. La concentración de ARNm se midió espectrofotométricamente y se verificó dos veces en gel de agarosa utilizando la escalera de ARN RiboRuler™ de amplio alcance (Fermentas) -ARNm de biblioteca RT MLV ~2,1 μg/μl.

La traducción in vitro se realizó utilizando el sistema de traducción de E. coli HY RTS 100 (03 186 148 001 -Roche) (25 μl): lisado de E. coli 6 μl (Roche); Mezcla de Reacción 5 μl (Roche); aminoácidos 6 μl (Roche); Met 0,5 μl 100 mM (Roche); inhibidor de RNasa RiboLock 0,5 μl -40 u/μl (Fermentas); oligonucleótido assrA 0,4 μl -200 nM (SEQ ID NO: 5); DTT 0,25 μl -1 M; tampón de reconstitución 3 μl (Roche); agua sin nucleasa 2,5 μl y ARNm 0,6 μl 2,1 μg/μl (~1200 ng). La mezcla de reacción se incubó durante 20 min a 30 ºC. La traducción se detuvo añadiendo 155 μl de tampón de detención enfriado con hielo WBK500+DTT+tritón (tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; tritón x-100 al 0,1 % (v/v) (T8787 -Sigma)) y se centrifugó durante 5 min a +4 ºC y a 25.000 g. Muy cuidadosamente, 160 μl de mezcla de traducción centrifugada se transfirieron con una pipeta a la parte superior de 840 μl de una solución de sacarosa al 35 % (p/v) en WBK500+DTT+tritón (tris-acetato 50 mM, pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg-acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; tritón x-100 al 0,1 % (v/v) (T8787 -Sigma); sacarosa al 35 % (p/v) (84097 -Fluka)). Para purificar los complejos ternarios (CT) de ARNm-ribosoma-MLV (ARNt) se realizó ultracentrifugación utilizando la ultracentrífuga Beckman TL-100; un rotor de ángulo fijo de TLA100.2 (Beckman); tubos de ultracentrifugación transparentes de 1 ml (343778 -Beckman), durante 9 min a +4 ºC y a 100.000 rpm. Para mantener un pequeño sedimento transparente de CT en la parte inferior del tubo de ultracentrifugación, los tubos intactos se manipularon con cuidado. Inicialmente se retiraron 750 μl de solución de la parte más superior del tubo de centrifugación. Después (muy cuidadosamente) las paredes de los tubos se lavaron con 750 μl de WBK500 (tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM, Mg acetato 50 mM, KCl 500 mM). Finalmente, toda la solución se retiró comenzando desde la parte más superior del tubo de centrifugación y el sedimento se disolvió en 30 μl de tampón de detención WBK500+DTT+tritón (tris-acetato 50 mM, pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; tritón x-100 al 0,1 % (v/v) (T8787-Sigma)) enfriado con hielo.

Como se determinó experimentalmente, utilizando ARNm marcado radiactivamente, la ultracentrifugación produjo 5 % -30 % de ARNm entrante en el sedimento del complejo ternario. Por lo tanto, se esperaba tener menos de 360 ng (30 % de 1200 ng de ARNm utilizado en la reacción de traducción) de ARNm en 30 μl de tampón (~12 ng/ml o 9x109 moléculas/μl de complejo ternario).

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La mezcla de reacción de transcripción inversa para la selección se preparó en hielo: tampón de reacción 60 μl -5X para transcriptasa inversa (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 7,5 μl -40 u/ml de (Fermentas); oligonucleótido pD_42 15 μl -20 μM de (SEQ ID NO: 8); agua sin nucleasa 186 μl y 1,8 μl de CT (<1,8*1010 moléculas) purificado (traducción en el kit Roche -RTS HY). La mezcla de reacción se dividió en dos tubos de 45 μl y 225 μl. A la primera parte, a los 45 μl de mezcla RT, se añadieron 5 μl de agua sin nucleasa. Se consideró que esta muestra era el control de selección negativa (sin dNTP) y tenía que probar que no había contaminación de ADN en la mezcla de reacción y que la síntesis de ADNc estaba estrictamente relacionada con la actividad funcional de la transcriptasa inversa comenzando desde RT MLV en el complejo ternario. A la segunda parte, a los 225 μl de mezcla RT, se añadieron 25 μl -10 mM de mezcla de cada dNTP (Fermentas) y de nuevo la mezcla de reacción se dividió en dos tubos -200 μl (4x 50 μl) para el control de selección (<1,2*1010 moléculas de CT en su totalidad) y 50 μl complementado con 1 μl -200 u/μl de Transcriptasa Inversa M-MuLV RevertAid H (Fermentas) para el control de selección positiva. De acuerdo con el protocolo, cada mezcla de reacción de transcripción inversa contenía <3*109 moléculas de complejo ternario en un volumen de 50 μl.

Para la emulsificación, la mezcla de aceite-tensioactivo se preparó mezclando ABIL EM 90 (Goldschmidt) en aceite mineral (M5904-Sigma) a una concentración final de 4 % (v/v) (Ghadessy y Holliger, 2004; US2005064460). Las emulsiones se prepararon a +4 ºC en viales criogénicos de 5 ml (430492 -Corning) mezclando 950 μl de mezcla de aceite-tensioactivo con 50 μl de mezcla RT. La mezcla se realizó utilizando un agitador magnético MS-3000 con velocidad controlada (Biosan) a ~2100 rpm; barras magnéticas Rotilabo® (3x8 mm) con anillo central (1489.2 -Roth); la fase acuosa se añadió en partes alícuotas de 10 μl cada 30 segundos, continuando la mezcla durante 2 minutos más (tiempo total de mezclado, 4 min). De acuerdo con los datos de microscopía óptica, el tamaño de los compartimentos en nuestras emulsiones variaban de 0,5 μm a 10 μm con un diámetro promedio de ~2 μm. Por lo tanto, se esperaba tener ~1*1010 compartimentos de agua en aceite después de la emulsificación de la mezcla de reacción de transcripción inversa de 50 μl, que contenía menos de 3*109 moléculas de complejo ternario (aproximadamente 1 ARNm y moléculas de transcriptasa inversa por 3-4 compartimentos).

Todas las emulsiones se incubaron durante 1 h a +50 ºC para seleccionar variantes de transcriptasa inversa, que funcionan mejor a temperaturas más elevadas. Para recuperar las mezclas de reacción, las emulsiones se transfirieron a tubos de 1,5 ml, se centrifugó durante 10 min a temperatura ambiente y a 25.000 g. La fase oleaginosa se retiró dejando la emulsión concentrada (aunque aún intacta) en la parte inferior del tubo. Las emulsiones se degradaron por extracción con éter saturado con agua 0,9 ml; etil acetato saturado con agua 0,9 ml (para retirar el detergente ABIL EM 90) y de nuevo éter saturado en agua 0,9 ml. La fase acuosa se secó durante 5 min al vacío a temperatura ambiente y se añadieron 250 μl de tampón PB (kit de purificación de PCR Qiagen). Se combinaron cuatro muestras de selección en dos tubos. El ADNc sintetizado se purificó después con el kit de purificación de PCR Qiagen y se eluyó en 30 μl de tampón EB (kit de purificación de PCR Qiagen) en caso de controles de selección negativa y positivas y 2x30 μl en caso de control de selección.

La amplificación de ADNc se realizó mediante PCR anidada. En primer lugar, la pequeña amplificación por PCR se realizó para verificar los controles de selección negativa y positiva y para determinar un número mínimo de ciclos de PCR necesario para una amplificación eficiente de ADNc en las muestras de selección. Se preparó una mezcla de PCR (200 μl) en hielo: tampón Taq 20 μl -10X con KCl (Fermentas); 20 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 12 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 2,5 μl -1 u/μl (Fermentas); ADN polimerasa de Pfu 1 μl -2,5 u/μl (Fermentas); cebador RD_Nde 1 μl -100 μM (SEQ ID NO: 9); cebador pD_55 1 μl -100 μM (SEQ ID NO: 10); ADNc purificado -50 μl -de controles de selección; agua 92 μl. El protocolo de ciclado para el fragmento de PCR de 2185 pb fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 25 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 58 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 5 minutos a 72 ºC.

Para la amplificación de todo el gen, se preparó en hielo una mezcla de PCR anidada (500 μl): Tampón Taq 50 μl 10X con KCl (Fermentas); 50 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 30 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 6,25 μl -1 u/μl (Fermentas); ADN polimerasa de Pfu 2,5 μl -2,5 u/μl (Fermentas); cebador M_Esp 2,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 13); cebador M_Eri 2,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 14); 50 μl de PCR primaria (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55); agua 306 μl. El protocolo de ciclado para el fragmento de PCR de 2077 pb fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 22 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 5 minutos a 72 ºC.

El fragmento de PCR final de la muestra de selección se purificó en gel de agarosa utilizando el kit de extracción en gel Qiagen (elución en 60 μl ~50 ng/μl). El fragmento de PCR purificado se digirió con EcoRI y Esp3I durante 1 h a 37 ºC y de nuevo se purificó en gel de agarosa (elución en 30 μl ~ 50 ng/μl).

La biblioteca de transcriptasa inversa MLV recuperada después de la 1ª ronda de selección se ligó con los fragmentos de INICIO y de FIN (construcción descrita anteriormente en este ejemplo) para obtener un fragmento de PCR (FIG 7) adecuado para la 2ª ronda de selección CRD (FIG 6). La reacción de ligamiento (40 μl) se preparó a temperatura ambiente: tampón de ligamiento 4 μl -10X para la ADN ligasa de T4 (Fermentas); ADN ligasa de T4 2 μl -1 u/μl (Fermentas); biblioteca seleccionada 4 μl -50 ng/μl digerida con Esp3I y EcoRI (~200 ng o ~0,9*1011 moléculas); fragmento de INICIO 1,1 μl -35 ng/μl digerido con NcoI (~35 ng o ~1,5*1011 moléculas); fragmento de FIN 1,76 μl -35 ng/μl digerido con EcoRI (~61 ng o ~1,5,5*1011 moléculas); agua 27,2 μl. El ligamiento se realizó durante 1 h a temperatura ambiente.

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La biblioteca de RT MLV ligada se amplificó por PCR (300 μl -preparado en hielo): Tampón Taq 30 μl -10X con KCl (Fermentas); 30 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 18 μl -25 mM (Fermentas); DMSO 24 μl (D8418-Sigma); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 3,7 μl -1 u/μl (Fermentas); ADN polimerasa de Pfu 1,5 μl 2,5 u/μl (Fermentas); cebador pro-pIVEX 1,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 3); cebador pD-ter 1,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 17); biblioteca de RT MLV ligada 25,5 μl (<0,6*1010 moléculas); agua 164,3 μl. El protocolo de ciclado para el fragmento de PCR de 2702 pb fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 15 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 53 ºC y 3 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 5 minutos a 72 ºC. El fragmento de la PCR se purificó en gel de agarosa utilizando el kit de extracción en gel Qiagen (elución en 30 μl ~100 ng/μl).

2ª ronda de selección

La segunda ronda de selección se realizó siguiendo la configuración general de la 1ª ronda de selección del esquema experimental con pequeñas modificaciones en los ciclos de la PCR, en la temperatura de reacción RT emulsificada y algunos detalles más.

A continuación se ofrecen todas las modificaciones:

•

transcripción – se tomaron 10 μl -100 ng/μl (~1000 ng) de fragmento de PCR purificado en gel de agarosa; la concentración final de ARNm que se utilizó en la 2ª ronda de selección fue de 1,5 μg/μl;

•

traducción – se tomaron 0,8 μl -1,5 μg/ml (~1,2 μg) de ARNm;

•

la reacción RT emulsificada se realizó durante 1 h a 52,5 ºC;

•

se realizó la 1ª PCR (RD_Nde//pD_55) -24 ciclos;

•

se realizó la 2ª PCR (anidada) (M_Esp//M_Eri) -23 ciclos;

•

concentración final del fragmento de PCR digerido: 80 ng/μl;

•

ligamiento – se tomaron 200 ng (~0,9*1011 moléculas) de la biblioteca de RT MLV;

•

PCR (en la mezcla de ligamiento) – se tomaron <0,6*1010 moléculas de la biblioteca seleccionada y se realizaron 15 ciclos de PCR; la concentración final del fragmento de PCR purificado en gel de agarosa fue de 200 ng/μl.

3ª ronda de selección

La tercera ronda de selección se realizó siguiendo la configuración general de la 1ª ronda de selección del esquema experimental con pequeñas modificaciones en los ciclos de la PCR, en la temperatura de reacción RT emulsificada y algunos detalles más.

A continuación se ofrecen todas las modificaciones:

•

transcripción -se tomaron 5 μl -200 ng/μl (~1000 ng) de fragmento de PCR purificado en gel de agarosa; la concentración final de ARNm que se utilizó en la 3ª ronda de selección fue de 1,5 μg/μl;

•

traducción -se tomaron 0,8 μl -1,5 μg/ml (~1,2 μg) de ARNm

•

la reacción RT emulsificada se realizó durante 1 h a 55 ºC;

•

se realizó la 1ª PCR (RD_Nde//pD_55) -25 ciclos;

•

se realizó la 2ª PCR (anidada) (M_Esp//M_Eri) -22 ciclos;

•

concentración final del fragmento de PCR digerido -70 ng/μl;

•

ligamiento – se tomaron 200 ng (~0,9*1011 moléculas) de la biblioteca de RT MLV;

•

PCR (en la mezcla de ligamiento) – se tomaron <0,6*1010 moléculas de la biblioteca seleccionada y se realizaron 15 ciclos de PCR; la concentración final del fragmento de PCR purificado en gel de agarosa fue 100 ng/μl.

4ª ronda de selección

La cuarta ronda de selección se realizó siguiendo la configuración general de la 1ª ronda de selección del esquema experimental con pequeñas modificaciones en los ciclos de la PCR, en la temperatura de reacción RT emulsificada y algunos detalles más.

A continuación se ofrecen todas las modificaciones:

•

transcripción -se tomaron 10 μl -100 ng/μl (~1000 ng) de fragmento de PCR purificado en gel de agarosa; la concentración final de ARNm utilizado en la 4ª ronda de selección fue de 1,8 μg/μl;

•

traducción -se tomaron 0,67 μl -1,8 μg/ml (~1,2 μg) de ARNm;

•

la reacción RT emulsificada se realizó durante 1 hora a 57,5 ºC;

•

se realizó la 1ª PCR (RD_Nde//pD_55) -25 ciclos;

•

se realizó la 2ª PCR (anidada) (M_Esp//M_Eri) -24 ciclos;

•

concentración final del fragmento de PCR digerido -50 ng/μl;

•

ligamiento -se tomaron 200 ng (~0,9*1011 moléculas) de la biblioteca de RT MLV;

•

PCR (en mezcla de ligamiento) -se tomaron <0,6*1010 moléculas de la biblioteca seleccionada y se realizaron 15

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ciclos de PCR; la concentración final de fragmento de PCR purificado en gel de agarosa fue de 100 ng/μl.

5ª ronda de selección

La quinta ronda de selección se realizó siguiendo la configuración general de la 1ª ronda de selección del esquema experimental con algunas modificaciones en los ciclos de la PCR, en la temperatura de reacción RT emulsificada y en la fase de análisis final.

A continuación se ofrecen todas las modificaciones:

•

transcripción -se tomaron 10 μl -100 ng/μl (~1000 ng) de fragmento de PCR purificado en gel de agarosa; la concentración final de ARNm utilizado en la 5ª ronda de selección fue de 1,1 μg/μl;

•

traducción -se tomaron 1,1 μl -1,11 μg/ml (~1,2 μg) de ARNm;

•

la reacción RT emulsificada se realizó durante 1 hora a 60 ºC;

•

se realizó la 1ª PCR (RD_Nde//pD_55) -25 ciclos;

•

se realizó la 2ª PCR (anidada) (M_Esp//M_Eri) -33 ciclos;

La mezcla de PCR anidada (500 μl) para la amplificación de todo el gen se preparó en hielo: tampón Taq 50 μl -10X con KCl (Fermentas); 50 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 30 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 6,25 μl -1 u/μl (Fermentas); ADN polimerasa de Pfu 2,5 μl -2,5 u/μl (Fermentas); cebador M_Esp 2,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 13); cebador M_Hind3+ 2,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 18); 50 μl de primera PCR (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55); agua 306 μl. El protocolo de ciclado para el fragmento de PCR de 2077 pb fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 22 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 55 ºC y 3 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 5 minutos a 72 ºC.

El fragmento de PCR final de la muestra de selección se purificó en gel de agarosa utilizando el kit de extracción en gel de Qiagen (elución en 60 μl ~60 ng/μl). El fragmento de PCR purificado se digirió con HindIII y Esp3I durante 1 hora a 37 ºC y de nuevo se purificó en gel de agarosa (elución en 40 μl ~50 ng/μl).

La biblioteca de transcriptasa inversa MLV recuperada después de la 5ª ronda de selección se ligó en el vector plasmídico preparado a partir de pET_his_MLV_pD (SEQ ID NO: 1 y FIG 2) digerido con NcoI y HindIII, dando un nuevo plásmido de 7474 pb pET_his_MLV (SEQ ID NO: 19) que codificaba la RT MLV con etiqueta de his N terminal y sin fusión pD en el extremo C para la purificación rápida de la proteína utilizando cromatografía de afinidad.

La biblioteca de RT MLV ligada después de la 5ª ronda de selección se sometió a electroporación en la cepa de expresión de T7, ER2566. Los clones individuales se secuenciaron y analizaron. El grupo de proteínas desarrolladas, así como los mutantes individuales y la transcriptasa inversa M-MuLV de tipo silvestre primaria en la misma construcción, se desarrollaron en 200 ml de LB a una A590 de ~0,7 y se purificó con etiqueta de his por cromatografía de afinidad utilizando 2 ml de Resina Superflow Ni-NTA de Qiagen (todas las purificaciones se realizaron en condiciones naturales de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes). La elución se realizó en 1 ml de EB (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0, β-mercaptoetanol 10 mM y tritón X-1000 al 1 %). Todas las proteínas se dializaron frente a un exceso de 50 veces de tampón de conservación (Tris-HCl 50 mM (pH 8,3 a 25 ºC), NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM, DTT 5 mM, Tritón X-100 al 0,1% (v/v) y glicerol al 50% (v/v)). La pureza de la proteína se verificó en SDS-PAGE (normalmente ~40-80 % de proteína diana). La concentración de proteína se determinó utilizando el método de Bredford basado en el ensayo de proteínas de Bio-Rad (500-0006).

Las actividades específicas de la transcriptasa inversa MLV se midieron a 37 ºC, a 50 ºC (enzima diluida en tampón de dilución especial: Tris-HCl 30 mM, pH 8,3 a 25 ºC, DTT 10 mM, BSA 0,5 mg/ml) y el resto de actividad a 37 ºC después de una incubación enzimática durante 5 min a 50 ºC (enzima diluida y su estabilidad medida en tampón de reacción RT 1x: Tris-HCl 50 mM pH 8,3 a 25 ºC, MgCl2 4 mM, DTT 10 mM, KCl 50 mM). La actividad enzimática en todos los casos se sometió a ensayo en la siguiente mezcla final: Tris-HCl 50 mM (pH 8,3 a 25 ºC), MgCl2 6 mM, DTT 10 mM, KCl 40 mM, dTTP 0,5 mM, [3H] -dTTP 0,4 MBq/ml, poliA•oligo (dT)12-18 0,4 mM. Las unidades de actividad se determinaron midiendo la incorporación de dTMP en una fracción polinucleotídica (adsorbida en DE-81) en 10 min a una temperatura de reacción particular y comparando con cantidades conocidas de la enzima comercial.

Resultados

Durante los análisis de los datos de selección, habíamos acumulado 104 secuencias que expresaban la transcriptasa inversa M-MuLV de longitud completa. El alineamiento CLUSTALW total de todas las proteínas (Anexo 2) se recopiló sin etiqueta de His N terminal para tener la misma numeración de aminoácidos que la normalmente utilizada en la biblioteca. La secuencia de tipo silvestre indicada como MLV siempre se daba como la primera secuencia. Las mutaciones se marcaron utilizando un color de fuente blanca en fondo negro (Anexo 2). Las posiciones de aminoácidos, cuyas mutaciones mejoran algo las propiedades de la transcriptasa inversa M-MuLV y que se describen en diferentes solicitudes de patente, se marcan en el alineamiento como columnas de aminoácidos (fuente blanca) resaltadas en gris. Las mutaciones que se originan de nuestra selección y que se localizan en las columnas resaltadas en gris, sirven como una prueba de que nuestro procedimiento de selección se dirige exactamente al punto caliente beneficioso o incluso a mutaciones exactas de aminoácidos descritas en cualquier parte. De los 104 clones secuenciados, se descubrieron 98 secuencias únicas y 1 secuencia de tipo silvestre (L5_87). Cinco secuencias se repitieron dos veces (L5_21 y L(5_111; L5_43 y L5_112; L5_49 y L5_63; L5_64 y L5_93; L5_85 y L5_96). En total se expresaron al azar 55 proteínas. De las 55 proteínas expresadas, 40 variantes mutantes enzimáticamente activas (incluyendo el ts de control) de la transcriptasa inversa M-MuLV se purificaron con éxito a una homogeneidad de 40-80 % según SDS-PAGE. La concentración de proteína total en las muestras de RT purificada, estaba en el intervalo de 0,6-5,5 mg/ml. Se ensayaron variantes de RT mutantes para determinar la actividad transcriptasa inversa a 37 ºC, a 50 ºC y la actividad residual a 37 ºC después de 5 min de incubación a 50 ºC (FIG 8). La actividad transcriptasa inversa a 37 ºC se normalizó que era de 100 % y se omite en la FIG 8. Por tanto, solamente se muestran dos tipos de columnas (porcentajes de actividad RT a 50 ºC y actividad RT residual a 37 ºC después de 5 min de incubación a 50 ºC). Como control, se presenta la transcriptasa inversa M-MuLV ts utilizada para la construcción de la biblioteca de mutantes. Esta enzima primaria se expresó en el mismo vector y se purificó de la misma manera que las variantes mutantes de RT. Un valor promedio de actividad RT de la enzima ts a 50 ºC es de aproximadamente 45 % en comparación con la actividad a 37 ºC. Casi todas las proteínas ensayadas, con algunas excepciones, tenían una actividad mayor de 45 % a 50 ºC. Un valor promedio de actividad RT a 50 ºC para todos los mutantes ensayados es de aproximadamente ~92 % y es más de 2 veces mayor en comparación con la enzima de tipo silvestre (45 %). Algunos mutantes eran 100 % activos, o incluso más, a 50 ºC de lo que lo eran a 37 ºC: 20, 23, L5_16, L5_24, L5_30, L5_35, L5_37, L5_43, L5_46, L5_47, L5_49, L5_52, L5_55, L5_64, L5_65, L5_68, L5_72. Los mejores mutantes encontrados tenían una actividad RT a 50 ºC de aproximadamente 140 % y más (3 veces mayor que 45 % de ts): 20 (165 %), L5_37 (162 %), L5_43 (156 %), L5_46 (135 %), L5_47 (179 %), L5_52 (137 %), L5_64 (142 %) y L5_68 (153 %).

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Aunque la mayoría de los mutantes tienen actividades RT muy altas a 50 ºC, no eran tan termoestables. La actividad RT residual a 37 ºC después de 5 minutos de incubación a 50 ºC de control ts es de ~11 %. La misma actividad residual promedio de las enzimas ensayadas es también similar ~12 %. No obstante, algunas variantes de RT ensayadas eran sustancialmente más termoestables y tenían una actividad residual 2-3 veces mayor que la de la enzima de tipo silvestre, ts, (11 %): L5_8 (25 %), L5_43 (32 %), L5_46 (27 %), L5_64 (28 %), L5_65 (25 %), L5_68 (31 %).

La actividad específica (u/mg de proteína) para la enzima ts parcialmente purificada es de ~200.000 u/mg (FIG 9). Las variantes RT seleccionadas se expresaron y purificaron de diversas maneras y con una actividad específica promedio (~155.000 u/mg) que es ligeramente inferior a la del control ts (FIG 9). En algunos casos, la actividad específica disminuyó, en algunos, aumentó (20 -~ 274.000 u/mg; L5_11 -~ 273.000 u/mg; L5_28 -~230.000 u/mg; L5_30 -~224.000 u/mg; L5_35 -~ 316.000 u/mg; L5_43 -~ 328.000 u/mg; L5_46 -~ 304.000 u/mg; L5_52 -~

310.000 u/mg; L5_64 -~ 256.000 u/mg; L5_65 -~ 247.000 u/mg).

Es obvio que nuestro sistema de selección funciona bien. Utilizando una temperatura de reacción RT aumentada como un factor de presión de selección, habíamos logrado desarrollar transcriptasas inversas más rápidamente (la actividad RT específica a 50 ºC es mayor) y más termoestables (actividad RT residual a 37 ºC después de 5 min de preincubación a 50 ºC).

La fuente de información valiosa es un alineamiento de secuencias de proteínas seleccionadas (Anexo 2). Las secuencias de las proteínas analizadas, cuya actividad a 50 ºC era sustancialmente mejor en comparación con la M-MuLV ts primaria (70 % y más en comparación con 45 % de actividad ts) se resaltan en color gris (Anexo 2). El número de aminoácidos mutagenizados varió en el intervalo de 0 (ts o L5_87) a 12 (L5_9). En el Anexo 3, se proporciona el listado de mutaciones encontradas en todas las variantes RT seleccionadas. Las proteínas se clasificaron por número de mutaciones en disminución. La mayoría de los mutantes (53 de 104) tenían 4-6 mutaciones por secuencia. Es obvio que la secuencia de la transcriptasa inversa tenía algunos puntos calientes, lo cual es muy importante y beneficioso para la reacción RT en general y para la termoestabilidad de la enzima. Estos puntos calientes pueden identificarse fácilmente en un alineamiento de secuencias múltiple (Anexo 2) como una conglomeración de mutaciones en una posición particular. Especialmente importantes son las mutaciones encontradas en variantes de transcriptasa inversa M-MuLV que se comportan mejor (las secuencias se resaltan en gris -Anexo 2). En el Anexo se proporciona la información resumida sobre las mutaciones más frecuentes (en orden decreciente). Al igual que en el anexo anterior, las proteínas mutantes con sustancialmente mayor actividad a 50 ºC, se resaltan en gris. Si la misma mutación se repite durante muchas veces y las transcriptasas inversas ensayadas con esta mutación se comportan mejor a 50 ºC, esto significa que esta mutación es de algún modo beneficiosa para la reacción de la transcripción inversa.

De acuerdo con la frecuencia con la que se encuentran las mutaciones estas pueden dividirse en cinco clases: 21-31 repeticiones; 14-18 repeticiones; 4-7 repeticiones; 2-3 repeticiones y 1 repetición. El primer grupo de las mutaciones más frecuentes comprende cuatro aminoácidos D524 (31 repeticiones); D200 (30 repeticiones); D653 (23 repeticiones) y D583 (21 repeticiones). Se sabe que dos aminoácidos (D524 y D583) forman complejos con iones magnesio en centros activos del dominio H de ribonucleasa. Los mutantes D524G, D583N y E562Q se utilizaron para desactivar la actividad RNasa H de la transcriptasa inversa M-MuLV (Gerard et al., 2002), lo que mejora la síntesis de ADNc. Los resultados de nuestra selección son notablemente similares. La mutación de aspartato 524 se encuentra en 31 secuencias de 98. Además, la sustitución D524N se encuentra una vez, D524A -10 veces y finalmente D524G -20 veces. Por tanto, nuestra selección no solamente se dirige exactamente a aminoácidos importantes, sino que también las mismas sustituciones de aminoácidos, que se sabe que son las mejores. Exactamente la misma situación es con la mutación de aspartato 583, que se repite en 21 proteínas seleccionadas de 104. La sustitución D583E se encuentra una vez, D583A -3 veces, D583G -7 veces y finalmente D583N -10 veces. De nuevo, el mismo aminoácido y la misma sustitución (D583N), que se sabe que es la mejor, se seleccionan más frecuentemente. La enzima comercial SUPERSCRIPT II de Invitrogen tiene tres mutaciones: D524G, D583N y E562Q (documento WO2004024749). Una cosa interesante es que la mutación de la sustitución del tercer aminoácido E562 en nuestra selección se encuentra solo una vez (E562K en L5_71). Este resultado sugiere que más probablemente el glutamato 562 no es tan importante como los aspartatos 524 y 583, o que por algunas razones, el intercambio de este aminoácido puede causar algunos efectos secundarios y que no es beneficioso para las reacciones de RT realizadas a temperaturas más altas (> 50 ºC).

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Un análisis adicional de secuencias de proteínas seleccionadas permitió identificar muchas más posiciones de aminoácidos calientes, cuyas mutaciones se describen en otras solicitudes de patente para la transcriptasa inversa M-MuLV mejorada: H204R -7 repeticiones (US7078208); H638R -4 repeticiones (documento US20050232934A1); T197A -2 repeticiones (documento US7056716); M289V(L), T306A(M) -2 repeticiones (documento US7078208); E302K, N454K -2 repeticiones (documento WO07022045A2); E69G, L435P -1 secuencia (documento WO07022045A2); Y64C, Q190R, V223M, F309S -1 secuencia (US7056716); E562K -1 secuencia (documento US7078208). También hay dos secuencias seleccionadas de transcriptasas inversas que tienen combinación de tres sustituciones de aminoácidos descritas en la bibliografía (30 -D200N, T306M, D524N, D583G; L5_28 -T306A, F309S, D524A, H594R, F625S).

Además de las mutaciones conocidas, hemos identificado muchas más posiciones de aminoácidos que se mutan con bastante frecuencia: D200N (A, G) -30 repeticiones; D653N (G, A, H, V) -23 repeticiones; L603W (M) -18 repeticiones; T330P -15 repeticiones; L139P -14 repeticiones; Q221R -6 repeticiones; T287A -6 repeticiones; I49V

(T) -5 repeticiones; N479D -5 repeticiones; H594R (Q) -5 repeticiones; F625S (L) -5 repeticiones; P65S -4 repeticiones; H126S (R) -4 repeticiones; L333Q (P) -4 repeticiones; A502V -4 repeticiones; E607K (G, A) -4 repeticiones; K658R (Q) -4 repeticiones; H8P (R) -3 repeticiones; P130S -3 repeticiones; E233K -3 repeticiones; Q237R -3 repeticiones; N249D -3 repeticiones; A283D (T) -3 repeticiones; A307V -3 repeticiones; Y344H -3 repeticiones; P407S (L) -3 repeticiones; M428L -3 repeticiones; Q430R -3 repeticiones; D449G (A) -3 repeticiones; A644V (T) -3 repeticiones; N649S -3 repeticiones; L671P -3 repeticiones; E673G (K) -3 repeticiones; N678I -3 repeticiones (Anexo 4).

Las variantes de RT que mejor se comportan, suelen tener mutaciones de aminoácidos, que se modifican con mayor frecuencia:

20 (50 ºC -123 %) -D200N (30 repeticiones), L603W (18 repeticiones) y extremo C ligeramente modificado -N678I, S679P, R680A; L5_35 (50 ºC -125 %) -D200N (30 repeticiones), T330P (15 repeticiones), N479D (5 repeticiones); L5_37 (50 ºC -162 %) -H123S (4 repeticiones), L149F (1 secuencia), D200N (30 repeticiones), N454K (2 repeticiones), D583N (21 repeticiones); L5_43 (50 ºC -160 %) -D200N (30 repeticiones), Q237R (3 repeticiones), T330P (15 repeticiones), D524G (31 repeticiones), F625S (5 repeticiones), D653N (23 repeticiones); L5_46 (50 ºC -135 %) -D200N (30 repeticiones), T330P (15 repeticiones), D583N (21 repeticiones), T644T (3 repeticiones); L5_47 (50 ºC -179 %) -N107S (1 repetición), H126R (4 repeticiones), T128A (1 repetición), I179V (2 repeticiones), D200N (30 repeticiones), H642Y (2 repeticiones), D653N (23 repeticiones); L5_52 (50 ºC -137 %) -D200N (30 repeticiones), T330P (15 repeticiones), Q374R (2 repeticiones), (D583N (21 repeticiones); L5_64 (50 ºC -142 %) -D200N (30 repeticiones), D216G (2 repeticiones), D524G (31 repeticiones), E545G (2 repeticiones); L5_65 (50 ºC -127 %) -D200N (30 repeticiones), Q238H (1 repetición), L570I (1 repetición), L603W (18 repeticiones); L5_68 (50 ºC -153 %) -M39V (2 repeticiones), I49V (2 repeticiones), Q91R (2 repeticiones), H204R (7 repeticiones), T287A (6 repeticiones), N454K (2 repeticiones), F625L (5 repeticiones), D653H (23 repeticiones).

El conjunto de datos combinados de las actividades RT medidas y el análisis de alineamiento de secuencias de las proteínas mutantes nos permitieron determinar muchas mutaciones beneficiosas (y sus combinaciones) en la secuencia de la transcriptasa inversa M-MuLV.

Ejemplo 3 -Análisis de mutantes de transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney

El experimento de desarrollo in vitro descrito en el 2º ejemplo fue muy eficaz. La temperatura gradualmente aumentada de la reacción de transcripción inversa se utilizó como una presión de selección y generó muchas variantes mutantes diferentes de RT MuLV-M. La mayoría de ellas pudieron comportarse mejor a temperaturas elevadas en comparación con la enzima primaria. El análisis de secuencias de las transcriptasas inversas desarrolladas indica puntos calientes y las posiciones de aminoácidos más importantes (reemplazos), responsables de la mejora compleja de las propiedades enzimáticas. Para aclarar el impacto individual de las diferentes mutaciones, se construyeron, se purificaron parcialmente y se analizaron, mutantes sencillas y múltiples de RT M-MuLV. El punto de partida para la construcción de mutantes fue el plásmido pET_his_MLV de 7474 pb (SEQ ID NO: 19) que codifica la RT M-MuLV con etiqueta his N terminal para una rápida purificación de proteínas utilizando cromatografía de afinidad. Se determinó la actividad específica de la transcriptasa inversa M-MuLV a 37 ºC, la actividad relativa a 50 ºC y la actividad residual relativa a 37 ºC después de incubación enzimática durante 5 min a 50 ºC. En algunos casos la actividad de la RNasa H se verificó y se realizó una reacción de síntesis de ADNc a diferentes temperaturas en ARN de 1 kb o 4,5 kb.

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Métodos y materiales

El plásmido inicial pET_his_MLV (SEQ ID NO: 19) se utilizó como material de partida para la PCR mutagénica. Se introdujeron mutaciones utilizando cebadores mutagénicos. Los clones individuales se secuenciaron y analizaron. Los mutantes de RT M-MuLV se expresaron en la cepa de expresión de T7 ER2566. Las proteínas individuales y la transcriptasa inversa M-MuLV primaria en la misma construcción se desarrollaron en 200 ml de LB a una A590 de ~0,7 y se purificó con etiqueta de histidina por cromatografía de afinidad utilizando 2 ml de resina Superflow Ni-NTA de Qiagen (todas las purificaciones se realizaron en condiciones naturales según las recomendaciones de los fabricantes). La elución se realizó en 1 ml de EB (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 8,0, βmercaptoetanol 10 mM y 0,1 % de tritón X-100). Todas las proteínas se dializaron frente a un exceso de 50 veces de tampón de conservación (Tris-HCl 50 mM (pH 8,3 a 25 ºC), NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM, DTT 5 mM, Triton X-100 al 0,1 % (v/v) y glicerol al 50 % (v/v)). La pureza de la proteína se verificó en SDS-PAGE (normalmente ~40-80 % de proteína diana). La concentración de la proteína se determinó utilizando el reactivo de Bradford (Fermentas n.º R1271).

Las actividades de la transcriptasa inversa MLV se midieron a 37 ºC, a 50 ºC (enzima diluida en tampón de dilución especial: Tris-HCl 30 mM pH 8,3 a 25 ºC, DTT 10 mM, BSA 0,5 mg/ml) y el resto de actividad a 37 ºC después de una incubación enzimática durante 5 min a 50 ºC (enzima diluida y su estabilidad medida en un tampón de reacción RT 1x: Tris-HCl 50 mM pH 8,3 a 25 ºC, MgCl2 4 mM, DTT 10 mM, KCl 50 mM). La actividad enzimática en todos los casos se ensayó en la siguiente mezcla final: Tris-HCl 50 mM (pH 8,3 a 25 ºC), MgCl2 6 mM, DTT 10 mM, KCl 40 mM, dTTP 0,5 mM, [3H]-dTTP 0,4 MBq/ml, poliA•oligo (dT)12-18 0,4 mM. Las unidades de actividad se determinaron midiendo la incorporación de dTMP en una fracción polinucleotídica (adsorbida en DE-81) en 10 min a una temperatura de reacción particular y comparando con cantidades conocidas de enzima comercial. La actividad RNasa H de las variantes de transcriptasa inversa M-MuLV se midió de acuerdo con la patente de Estados Unidos US5405776. La actividad RNasa H de las enzimas purificadas se ensayó en mezclas de reacción (50 μl) que contenían Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, MnCl2 2 mM, DTT 1 mM y [3H] (A)n*(dT)n (5 µM [3H](A)n, 35 cpm/pmol; 20 μM (dT)n). Las reacciones se incubaron a 37 ºC durante 10 min y se detuvieron añadiendo 10 μl de ARNt (1 mg/ml) y 20 μl de TCA al 50 % frío. Después de 10 minutos en hielo, la mezcla se centrifugó durante 10 min en una centrífuga Eppendorf (a 25000 g). Se contaron 40 μl de sobrenadante en un cóctel LSC universal (Roth -Rotiszint eco plus). Una unidad de actividad de RNasa H es la cantidad de enzima necesaria para solubilizar un mol de [3H](A)n en [3H] (A)n*(dT)n en 10 minutos a 37 ºC.

Para verificar la capacidad de las transcriptasas inversas purificadas de sintetizar ADNc a diferentes temperaturas se utilizó el “Kit de Síntesis de ADNc de Primera Cadena RevertAid™” (n.º K1622-Fermentas) y su ARN de 1,1 kb control con una cola 3’-poli(A) en combinación con el cebador oligo (dT)18. Como alternativa el ARN de 4,5 kb (sintetizado a partir del plásmido pTZ19R linealizado con Eco31I, que adicionalmente contiene un segmento de ADN del fago lambda de 5505-8469 pb) se utilizó para ensayar la reacción de transcripción inversa. El ADNc se sintetizó durante 1 hora en un volumen de reacción de 20 μl utilizando los componentes del kit, 1 μg de ARN sintético, siguiendo el protocolo proporcionado solamente con algunas modificaciones mínimas (sin preincubación durante 5 min a 37 ºC). Las reacciones de transcriptasa inversa se realizaron en una placa de PCR de 96 pocillos en un termociclador de gradiente Mastercycler Eppendorf aplicando el gradiente de temperatura correspondiente. El ADNc sintetizado se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa alcalino (tiñendo con bromuro de etidio). En la FIG 16 se proporcionan las muestras del análisis de la síntesis de ADNc en geles de agarosa alcalinos.

Resultados

De acuerdo con la frecuencia con la que se encuentran las mutaciones durante el desarrollo de la transcriptasa inversa M-MuLV, estas pueden dividirse en cinco clases: 21-31 repeticiones; 14-18 repeticiones; 4-7 repeticiones; 23 repeticiones y 1 repetición. La construcción de mutantes de transcriptasa inversa individuales en general se realizó de acuerdo con esta información. Primero se ensayaron las mutaciones más frecuentemente encontradas. Se determinó la actividad específica de la transcriptasa inversa a 37 ºC, la actividad relativa a 50 ºC y la actividad residual relativa a 37 ºC después de 5 min de incubación enzimática a 50 ºC. En algunos casos, la actividad RNasa H se verificó y se realizó una reacción de síntesis de ADNc a diferentes temperaturas en ARN de 1 kb o 4,5 kb. En el Anexo 5 se presentan todos los datos experimentales sobre los mutantes individuales. La segunda columna (“Frecuencia de selección”) indica el número de mutantes secuenciados, que tiene la mutación exacta y el número entre paréntesis indica el número total de mutaciones de aminoácidos particulares encontradas en la selección. Por ejemplo, D200N -25 (30) significa, que el reemplazo del aspartato 200 por asparagina se encontró 25 veces de 30 mutaciones D200 totales. La actividad específica de la transcriptasa inversa medida a 37 ºC se da en unidades por mg de proteína. La actividad enzimática relativa a 50 ºC y la actividad RT residual relativa a 37 ºC después de 5 min de incubación a 50 ºC se dan en porcentajes normalizados con la actividad específica (100 %) de la misma enzima medida a 37 ºC. Como control (primera línea) se da la transcriptasa inversa M-MuLV ts utilizada para la construcción de la biblioteca de mutantes. Esta enzima primaria se expresó en el mismo vector y se purificó de la misma manera que las variantes de RT mutantes. La actividad específica de la enzima de tipo silvestre es de aproximadamente

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200.000 u/mg a 37 ºC, la actividad relativa a 50 ºC (comparando con la actividad a 37 ºC) -45-50 % (90.000

100.000 u/mg) y la actividad RT residual relativa a 37 ºC después de 5 min de incubación a 50 ºC (en comparación con la actividad a 37 ºC) es de aproximadamente 11 % (~22.000 u/mg). La enzima de tipo silvestre tenía una actividad RNasa H de aproximadamente 160-200 u/mol y puede sintetizar ADNc de longitud completa de 1 kb a 48 ºC. Se sabe, que la transcriptasa inversa M-MuLV está protegida de la inactivación térmica a través de la unión al sustrato molde-cebador y al contrario, la enzima es menos termoestable en solitario en solución (Gerard et al., 2002). La actividad RT residual relativa a 37 ºC después de 5 min de incubación a 50 ºC indica directamente la termoestabilidad de la enzima en solución sin sustrato. Mientras tanto, la actividad relativa a 50 ºC representa la termoestabilidad enzimática en complejo con sustrato ARN/ADN y la velocidad de síntesis de ADNc. La variante rápida mutante de la transcriptasa inversa dará un mayor número de unidades de polimerasa a 50 ºC, incluso si su termoestabilidad será la misma que la de la enzima silvestre. La temperatura más alta de la síntesis de ADNc (en nuestro caso 1 kb o 4,5 kb) es el parámetro más completo, que representa capacidad general de la enzima para sintetizar ADNc a temperaturas elevadas. Los mutantes de transcriptasa inversa, que han aumentado al menos un 10 %: la actividad específica a 37 º (≥220.000 u/mg, 200.000 u/mg -ts), la actividad relativa a 50 ºC en comparación con la actividad mutante a 37 ºC (≥54 %, 45-50 % -ts) o la actividad residual relativa a 37 ºC después de 5 min de incubación a 50 ºC en comparación con la actividad mutante a 37 ºC (≥13 %, 11 % -ts)-se sombrean en gris y se consideran enzimas significativamente mejoradas. Los mutantes capaces de sintetizar ADNc de 1 kb de longitud completa a temperaturas superiores a 48 ºC también se sombrean en color gris.

Los mutantes de transcriptasa inversa con actividad específica aumentada (≥220.000 u/mg) a 37 ºC son (Anexo 5):

D200 (D200N -254.000 u/mg; D200G -276.000 u/mg; D200H -234.000 u/mg),

T330 (T330N -223.000 u/mg; T330D -240.000 u/mg),

Q221 (Q221R -268.000 u/mg),

H594 (H594K -270.000 u/mg; H594Q -231.000 u/mg),

D449 (D449E -224.000 u/mg; D449N -221.000 u/mg),

M39 (M39N -349.000 u/mg),

M66 (M66L -237.000 u/mg; M66V -227.000 u/mg; M66I -240.000 u/mg),

H126 (H126R -227.000 u/mg),

W388 (W388R -266.000 u/mg),

1179 (I179V -251.000 u/mg).

Los mutantes de transcriptasa inversa con actividad relativa aumentada (≥54 %) a 50 ºC (en comparación con la actividad a 37 ºC) son (Anexo 5):

D200 (D200N -84 %; D200A -87 %; D200Q -103 %; D200E -79 %; D200V -131 %; D200W -103 %; D200G 88 %; D200K -102 %; D200R -68 %; D200H -54 %), L603 (L603W -105 %; L603F -104 %; L603Y -95 %; L603M -77 %), D653 (D653N -93 %; D653K -106 %; D653A -99 %; D653V -98 %; D653Q -93 %; D653L -83 %; D653H 116 %; D653G -90 %; D653W -93 %; D653E -80 %), T330 (T330P -80 %; T330N -69 %; T330D -55 %; T330V -65 %; T330S -67 %), Q221 (Q221R -94 %; Q221K -77 %; Q221E -64 %; Q221M -58 %; Q221Y -77 %), E607 (E607K -84 %; E607A -98 %; E607G -72 %; E607D -69 %), L139 (L139P -59 %), T287 (T287S -68 %), N479 (N479D -81 %), H594 (H594R -69 %; H594K -80 %; H594Q -75 %; H594N -61 %), D449 (D449G -79 %; D449E -77 %; D449N -75 %; D449A -99 %; D449V -83 %), M39 (M39V -54 %; M39N -71 %), M66 (M66L -79%; M66V -73%; M66I -80%), L333 (L333Q -54 %), H126 (H126R -58 %), P130 (P130S -70 %), Q91 (Q91R -56 %), W388 (W388R -72 %), R390 (R390W -64 %), Q374 (Q374R -56 %), E5 (E5K -67 %).

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Los mutantes de transcriptasa inversa con actividad residual relativa aumentada (≥13 %) a 37 ºC después de incubación durante 5 min a 50 ºC (en comparación con la actividad a 37 ºC) son (Anexo 5):

D200 (D200N -15 %; D200A -18 %; D200Q -23 %; D200R -27 %; D200H -27 %), L603 (L603W -23 %; L603Y -13 %; L603P -15 %), D653 (D653N -21 %; D653K -15 %; D653A -18 %; D653V -16 %; D653Q -18 %; D653H -13 %; D653G 13 %; D653W -13 %; D653E -19 %), T330 (T330P -21 %; T330N -13 %; T330D -16 %; T330S -15 %), T287 (T287A -13 %; T287F -13 %), H594 (H594R -14 %; H594Q -13 %), D449 (D449G -13 %), M39 (M39V -13 %), M66 (M66L -13 %), Y344 (Y344H -13 %), Q91 (Q91R -13 %), N649 (N649S -16 %), W388 (W388R -14 %).

Los mutantes capaces de sintetizar ADNc de 1 kb de longitud completa a temperaturas superiores a 48 ºC son (Anexo 5):

D200 (D200N -50,4 ºC; D200H -50,4 ºC), L603 (L603W -53,1 ºC; L603F -50,4 ºC; L603Y -47,8-50,4 ºC), D653 (D653N -50,4-53,1 ºC; D653K -50,4-53,1 ºC; D653A -50,4 ºC; D653V -50,4 ºC; D653Q -50,4 ºC; D653L 50,4 ºC; D653H -50,4-53,1 ºC; D653G -50,4 ºC; D653W -50,4 ºC), Q221 (Q221R -50,4 ºC), E607 (E607K -47,8-50,4 ºC), H594 (H594K-47,8-50,4 ºC; H594Q -47,8-50,4 ºC),

En las FIG 16 A-D se proporcionan las muestras de los análisis de síntesis de ADNc 1 kb en geles de agarosa alcalinos.

De acuerdo con los datos biomédicos recogidos, las posiciones más importantes en la secuencia de la transcriptasa inversa M-MuLV, que pueden influir en la síntesis de ADNc a temperatura elevadas, son: D200, L603, D653, T330, Q221, E607, L139, T287, N479, H594, D449, M39, M66, L333, H126, Y344, P130, Q91, N649, W388, R390, I179, Q374, E5.

En general, las mutaciones de interés pueden combinarse entre ellas y la termoestabilidad de la transcriptasa inversa M-MuLV con y sin sustrato, la velocidad, la procesividad y la capacidad global de sintetizar ADNc a temperaturas más altas pueden mejorarse aún más. En el Anexo 6 se presentan algunos datos que ilustran la mejora enzimática mediante una estrategia combinatoria. Los mutantes sencillos D200N y L603W tienen una actividad relativa a 50 ºC, de 84 % y 105 %. Las temperaturas más altas de síntesis de ADNc de 1 kb son 50,4 ºC y 53,1 ºC. El mutante doble D200N; L603W tiene una actividad relativa de 131 % a 50 ºC y puede sintetizar ADNc de 1 kb a 56 ºC. El mutante triple D200N; L603W; T330P (80 % a 50 ºC, ADNc de 1 kb a 47,8 ºC) es mejorado adicionalmente y tiene una actividad relativa de 175 % a 50 ºC y puede sintetizar ADNc de 1 kb a 56-58 ºC. El mutante cuádruple D200N; L603W; T330P; E607K (84 % a 50 ºC; ADNc de 1 kb a 47,8-50,1 ºC) tiene una actividad relativa de 174 % a 50 ºC y puede sintetizar ADNc de 1 kb a 60-62 ºC. El mutante quíntuple D200N; L603W; T330P; E607K; L139P (59 % a 50 ºC; ADNc de 1 kb a 47,8 ºC) tiene una actividad relativa de 176 % a 50 ºC y puede sintetizar ADNc de 1 kb a 62 ºC y esto es aproximadamente una temperatura 14 ºC más alta en comparación con la transcriptasa inversa M-MuLV de tipo silvestre (ADNc de 1 kb a 47,8 ºC). El carácter aditivo de la termoestabilidad también se observa en el caso de:

mutantes N479D, H594R (D200N; L603W -131 % a 50 ºC, ADNc de 1 kb a 56 ºC frente a D200N; L603W; N479D; H594R -182 % a 50 ºC, ADNc de 1 kb a 56-58 ºC, ADNc 4,5 kb a 56-58 ºC),

mutante T330P (D200N; L603W; D653N; D524G -155 % a 50 ºC, ADNc de 1 kb a 58-60 ºC frente a D200N; L603W; D653N; D524G; T330P -180 % a 50 ºC, ADNc 1 kb a 60-62 ºC).

En la FIG 16 E-G se proporcionan las muestras de los análisis de síntesis de ADNc de 4,5 kb en geles de agarosa alcalinos.

Ejemplo 4 -Modificación de selección con CRD para la actividad de ADN polimerasa dependiente de ADN utilizando biotina-dUTP (prueba de concepto).

Este ejemplo ilustra la estrategia de selección basada en la actividad de la transcriptasa inversa como ADN polimerasa dependiente de ADN, que puede incorporar nucleótidos modificados en el sustrato de ADN-ADN. El esquema de selección de concepto se ilustra esquemáticamente en la FIG 12. En este ejemplo, como material de partida, se fusionaron dos plásmidos, pET_his_MLV_D583N_pD (que codifica la transcriptasa inversa del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (M-MLV) sin RNasa H fusionada a la proteína D espaciadora) y su derivado pET_his_del_pD (que codifica la transcriptasa inversa inactivada; deleción de 57 aminoácidos en el dominio pol y mutación D583N en el dominio RNasa H, Ejemplo 1, SEQ ID NO: 2). Los fragmentos de ADN iniciales que codifican las transcriptasas inversas activa e inactiva se sintetizaron en dos reacciones en cadena de la polimerasa distintas utilizando los plásmidos pET_his_MLV_D583N_pD y pET_his_del_pD como diana. Los fragmentos de PCR sintetizados se utilizaron en la reacción de transcripción para la síntesis de ARNm, que carece del codón de TERMINACIÓN en el extremo 3’. Los ARNm purificados se mezclaron a una proporción de 1:20 = MLV (RT activa):del (RT inactiva). El adaptador de ADN bicatenario (necesario para la selección de la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ADN) se ligó a ARNm 3’ mediante una ADN ligasa de T4. Este complejo de ARNm-ADNbc se utilizó para la reacción de traducción in vitro. El ribosoma que se desplaza a lo largo del ARNm detiene la traducción en el sitio de hibridación del ARN-ADN (Tabuchi et al., 2001). Los complejos de ribosoma-ARNm/ADNbc se estabilizaron (como en la presentación en ribosomas convencional) por dilución de la mezcla de traducción con tampón enfriado en hielo que contenía Mg2+ 50 mM. La mezcla de complejos ternarios (CT) se purificó por ultracentrifugación en almohadillas de sacarosa. Los complejos ternarios purificados (<3*109 moléculas tomadas) que contenían ADNm-ADNbc ligados a transcriptasas inversas M-MuLV (RNasa H-) traducidas in vitro, se utilizaron para preparar una mezcla de reacción adicionalmente complementada con biotina-dUTP y tampón de reacción. La mezcla de reacción enfriada con hielo se emulsionó dando lugar a ~1*1010 compartimentos de agua en aceite de un tamaño de ~2 μM. La mezcla de reacción emulsionada (menos de un CT, ribosoma-ARNm/ADNbc-proteína por compartimento) se incubó durante 30 min a 37 ºC. Después de elevar la temperatura de la mezcla de reacción compartimentalizada, la mayoría de los CT se disocian liberando ARNm/ADNbc y transcriptasa inversa. La reacción de incorporación satisfactoria puede producirse únicamente en compartimentos que contienen transcriptasa inversa M-MuLV (RNasa H-) activa dando como resultado la biotinilación del complejo ARNm/ADNbc. El complejo biotinilado puede inmovilizarse selectivamente en perlas magnéticas revestidas con estreptavidina y amplificarse específicamente por RT-PCR. Como resultado de un experimento satisfactorio, los genes que codifican la enzima activa (en nuestro caso el fragmento de RT-PCR de transcriptasa inversa MLV_D583N_pD) deben enriquecerse sobre los genes que codifican la enzima inactiva (del_pD).

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Métodos y materiales

Producción de complejo ARNm/ADNbc.

(1)

Determinación de la eficiencia de ligamiento. La eficiencia de la reacción de ligamiento se determinó a través del ligamiento de ARNm de MLV_pD (sintetizado a partir del plásmido pET_his_MLV_pD, Ejemplo 1) con cebador Long+Tb (SEQ ID NO: 23) utilizando el cebador ddC-Long2 (SEQ ID NO: 22) como molde. El extremo 5’ de Long+Tb se fosforiló previamente utilizando polinucleótido quinasa de T4 (Fermentas). Se preparó una mezcla de emparejamiento de 36 μl mezclando 8,5 pmol (~10 μg) de ARNm de MLV_pD purificado con un exceso molar de 4 veces Long+Tb (SEQ ID NO: 23) y un exceso molar de 4,2 veces ddC-Long2 (SEQ ID NO: 22) en agua sin nucleasa. La mezcla se incubó a 70 ºC durante 5 min y después se enfrió a temperatura ambiente durante 20 min. Antes de añadir los componentes de la reacción de ligamiento la mezcla se llevó al soporte de enfriamiento durante 2 minutos. A los 36 μl de la mezcla de emparejamiento, se añadieron 4,5 μl de tampón de ligamiento 10x y 4,5 μl de ADN ligasa de T4 (5 v/μl) (Fermentas). La reacción de ligamiento se realizó durante 30 min a 37 ºC y seguido de extracción una vez con el mismo volumen de Fenol/cloroformo Roti® (ROTH) y dos veces con el mismo volumen de cloroformo. Suponiendo que la cantidad de ARNm era casi la cantidad inicial tomada para la reacción de ligamiento ~5 μg de mezcla de productos de ligamiento se diluyeron a 43 μl de agua sin nucleasa. Se dejó una alícuota de 2 μl de mezcla resultante para el análisis en gel de agarosa antes de la inmovilización en perlas de estreptavidina Dynabeads M-280 (kit Dynabeads® kilobase BINDER™ (DYNAL Biotech)). Se transfirieron 10 μl de Dynabeads resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y se lavaron con 50 μl de solución de unión proporcionada en el kit. El tubo se colocó en el imán durante 1-2 minutos hasta que las perlas se sedimentaron en el tubo y se retiró la solución. Las Dynabeads se resuspendieron cuidadosamente transfiriendo con pipeta en 38 μl de Solución de Unión complementada con 2 μl de ARNt acuoso (ARNt de solución de levadura (Roche)) (1 μg/μl) para minimizar la unión de ARNm inespecífica. Se añadieron 40 μl de Dynabeads en solución de unión a una solución (~40 μl) que contenía una mezcla de productos de ligamiento. El tubo se incubó agitando a +22 ºC en la termomezcladora (Eppendorf) durante 60 min. Después de la unión del ARNm/ADNbc, el sobrenadante se retiró y las perlas se lavaron tres veces con 50 μl de Solución de lavado (proporcionada en el kit). Las Dynabeads recogidas con el complejo ARNm/ADNbc ligado inmovilizado se suspendieron en 26 μl de agua sin nucleasa y se realizó después extracción una vez con 40 μl de Fenol/cloroformo Roti® (ROTH) y dos veces con un volumen de 40 μl de cloroformo para liberar el complejo de ARNm/ADNbc de las perlas magnéticas. Se analizaron 1; 2 y 5 μl de mezcla final en gel de agarosa junto con la muestra (2 μl) que quedó antes de la inmovilización y la escalera de ADN Ruler™ de amplio alcance. La cantidad de ARNm en el complejo de ARNm/ADN purificado en perlas de estreptavidina se determinó comparando las cantidades de ARNm antes y después de la inmovilización. El rendimiento de ARNm recuperado fue de ~60 %, lo que significa que al menos el 60 % de ARNm se ligó satisfactoriamente con el ADN bicatenario, dando como resultado el complejo ARNm/ADNbc.

(2)

Determinación de las eficiencias de incorporación de biotina-dUTP en el complejo de ARNm/ADNbc y ARNm autocebado. Como se mostró en el primer experimento de ligamiento de ARNm con ADNbc la eficiencia de la reacción de ligamiento es de ~60 % y mayor. El ARNm libre dejado en la mezcla de ligamiento puede autocebarse y participar en la reacción de extensión utilizando la transcriptasa inversa M-MuLV y biotina-dUTP. Este experimento se realizó para demostrar que el complejo de ARNm/ADNbc (producto de ligamiento) es mejor sustrato que el ARNm sin autocebado.

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El ARNm de MLV_D583N_pD se ligó con el oligonucleótido long+ (SEQ ID NO: 21) de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente (la construcción detallada de los plásmidos iniciales pET_his_MLV_D583N_pD y pET_his_del_pD, se describe en el Ejemplo 1). Aproximadamente 12,5 ng de sustrato (MLV_D583N_pD ARNm/long+) preparado, se combinó con ~12,5 ng de ARNm de del_pD previamente incubado a 70 ºC durante 5 min, después se enfrió a temperatura ambiente durante 20 min en agua sin nucleasa, en un volumen total de 12,5 μl. Se preparó la segunda mezcla para la incorporación de dTTP o biotina-dUTP mediante transcriptasa inversa: 8 μl de tampón de reacción 5x para transcriptasa inversa; inhibidor de RNasa RiboLock™ 1 μl – 40 u/μl (Fermentas); agua sin nucleasa 18,6 μl; Transcriptasa inversa M-MuLV RevertAid™ Minus 0,4 μl – 200 u/μl (Fermentas). La mezcla preparada se dividió en dos tubos 2x 15 μl y 1 μl de dTTP 1 mM (Fermentas) o 1 μl de biotina-dUTP 1 mM (Fermentas). Subsecuencialmente se añadieron 5 μl de sustrato (de la primera mezcla) a las mezclas que contenían dTTP y biotina-dUTP. Las reacciones se realizaron a 37 ºC durante 60 min. Después de esto, se añadió 1 μl de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a ambas muestras y las mezclas de reacción se extrajeron una vez con el mismo volumen de Fenol/cloroformo Roti® (ROTH) y una vez con el mismo volumen de cloroformo seguido de purificación en microcolumnas G-50 (GE Healthcare). Se dejaron 2 μl de los productos de reacción resultantes para la reacción RT directa (sin purificación con perlas de estreptavidina) y la parte restante de las soluciones se utilizaron para la inmovilización del complejo ARNm-ADNbc biotinilado en perlas de estreptavidina Dynabeads M-280 (kit Dynabeads® kilobase BINDER™ (DYNAL Biotech)). Se transfirieron 10 μl de Dynabeads resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se lavó con 25 μl de solución de unión proporcionada. El tubo se colocó en el imán durante 1-2 min hasta que las perlas se sedimentaron en la parte inferior del tubo y la solución se retiró. Para minimizar la unión de ARNm inespecífica, las Dynabeads se resuspendieron cuidadosamente transfiriendo con una pipeta en 90 μl de solución de unión y 2 μl de ARNt acuoso (se añadió ARNt de solución de levadura (Roche)) (1 μg/μl). Se añadieron 40 μl de Dynabeads en solución de unión a una solución (~40 μl) que contenía los fragmentos de ARN-ADN marcados con biotina-dUTP y elongados con dTTP. Los tubos se incubaron a +22 ºC en la termomezcladora (Eppendorf) durante 40 min con agitación (1400 rpm). Después de la etapa de unión, el sobrenadante se retiró y las perlas se lavaron tres veces con 50 μl de solución de lavado (proporcionada en el kit) agitando (1400 rpm) durante 5 min a +22 ºC. Las Dynabeads recogidas que inmovilizan el complejo ARNm-ADNbc elongado se resuspendieron en una mezcla de reacción de transcripción inversa. La mezcla de reacción de transcripción inversa se preparó en hielo: tampón de reacción 20 μl -5X para transcriptasa inversa (Fermentas); dNTP 10 μl -10 mM (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 2,5 μl – 40 u/μl (Fermentas); oligonucleótido pD_42 5 μl -20 μM (SEQ ID NO: 8); Transcriptasa Inversa M-MuLV RevertAid™ Minus 2,5 μl (200 u/ml) (Fermentas); agua sin nucleasa 55 μl. La mezcla preparada se dividió en cinco alícuotas de 19 μl (5x19 μl): dos de ellas se utilizaron para resuspender las Dynabeads con el complejo ARNm/ADNbc elongado inmovilizado o ARNm, las otras dos se transfirieron a tubos con las muestras dejadas sin purificación con perlas de estreptavidina y la alícuotas restante de 19 μl se añadió a 1 μl de agua sin nucleasa -control de reacción negativo para demostrar que la mezcla de reacción no estaba contaminada con ADN. Todas las mezclas de reacción se incubaron con agitación (1000 rpm) a +42 ºC en la termomezcladora (Eppendorf) durante 1 hora hasta que la reacción de síntesis de ADNc finalizó.

La amplificación de ADNc se realizó por PCR anidada. La mezcla de PCR inicial se preparó en hielo: tampón Taq 14 μl -10X con KCl (Fermentas); 14 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 8,4 μl -25 mM (Fermentas); ADN Polimerasa de Taq 2,8 μl-1 u/μl LC (recombinante) (Fermentas); cebador M_F 0,7 μl -100 μM (SEQ ID NO: 11); cebador M_2R 0,7 μl -100 μM (SEQ ID NO: 12); agua 92,4 μl – la mezcla se dividió en 7 muestras de 19 μl (7x19 μl). A 5x 19 μl de mezcla maestra de PCR se añadieron 1 μl de ADNc (muestras RT 1-5); al sexto tubo de mezcla maestra de PCR se le añadió 1 μl de agua -control PCR negativo; al séptimo tubo (control PCR positivo) se añadió 1 μl de plásmido pET_his_MLV_D583N_pD (~1 ng). El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 25 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 57 ºC y 1 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 3 min a 72 ºC.

El tamaño esperado de los amplicones era de 907 pb para el ADNc de MLV_D583N_pD y de 736 pb para el de del_pD. Los productos de la PCR se analizaron en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla de PCR por pocillo (FIG 13).

Como se esperaba, se observó una amplificación de ADNc eficiente solo en la reacción de elongación con biotinadUTP. Pueden detectarse bandas muy tenues de ADNc amplificado en la reacción de elongación con dTTP y pueden explicarse por una débil unión inespecífica del ARNm a las perlas de estreptavidina. Después de la purificación en perlas de estreptavidina el ADN que codifica el gen de MLV_D583N_pD (907 pb) se enriquece sobre el ADN de del_pD (736 pb). Esto significa que la biotina-dUTP elonga el complejo de ARNm/ADNbc de una manera mucho más eficaz que el ARNm de del_pD autocebado.

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(3) Preparación de mezcla de ARNm (MLV_D583N_pD:del_pD = 1: 20) y complejo de ARN/ADNbc.

Preparación de fragmentos PCR para la transcripción in vitro. La mezcla de PCR se preparó en hielo: tampón Taq 20 μl -10X con KCl (Fermentas); 20 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 12 μl -25 mM (Fermentas); DMSO 16 μl (D8418 -Sigma); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 4 μl – 1 u/μl (Fermentas); cebador pro-pIVEX 1 μl -100 μM (SEC ID Nº: 3); cebador pD-ter 1 μl -100 μM (SEQ ID NO: 20); agua 122 μl – la mezcla se dividió en dos tubos 2x 98 μl. A 2x 98 μl de mezcla maestra PCR se añadieron 2 μl de pET_his_MLV_D583N_pD (diluido a ~1 ng/μl) o 2 μl de pET_his_del_pD (diluido a ~1 ng/μl) (la construcción detallada de los plásmidos iniciales pET_his_MLV_D583N_pD y pET_his_del_pD se describe en el Ejemplo 1). El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 30 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 53 ºC y 2 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 5 min a 72 ºC. La eficiencia de la amplificación fue ~7000 veces de 2 ng de plásmido (7873 pb) dirigido a ~5 μg (50 ng/μl) de producto amplificado (fragmento PCR de 2702 pb MLV_D583N_pD de pET_his_MLV_D583N_pD y fragmento PCR del_pD de 2531 pb de pET_his_del_pD).

Se preparó la mezcla de transcripción: tampón de transcripción T7 80 μl -5x (HEPES-KOH 1 M pH 7,6; Mg acetato 150 mM; espermidina 10 mM; DTT 0,2 M); 56 μl -112 mM de cada NTP (Fermentas); ARN polimerasa de T7 16 μl – 20 u/ml (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 8 μl – 40 u/μl (Fermentas); agua sin nucleasa 114 μl – la mezcla se dividió en dos tubos 2x 165 μl y se añadieron 35 μl -20 ng/μl de fragmento PCR de MLV_D583N_pD (mezcla de PCR no purificada) o 35 μl -20 ng/μl de fragmento PCR de del_pD PCR (mezcla de PCR no purificada). La transcripción se realizó durante 2 horas a 37 ºC.

Ambas mezclas de transcripción se diluyeron a 200 μl con agua sin nucleasa enfriada con hielo y se añadieron 200 μl de solución de LiCl 6 M. Las mezclas se incubaron durante 25 minutos a +4 ºC y se centrifugaron durante 25 minutos a +4 ºC en una centrífuga de enfriamiento a velocidad máxima (25.000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento de ARN se lavó con 500 μl de etanol al 75 % enfriado con hielo. Los tubos se centrifugaron de nuevo durante 5 min a +4 ºC a velocidad máxima y el sobrenadante se desechó. El sobrenadante de ARN se secó durante 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendió en 400 μl de agua sin nucleasa enfriada con hielo agitando durante 15 min a +4 ºC y a 1400 rpm. Los tubos se centrifugaron de nuevo durante 5 minutos a +4 ºC a velocidad máxima para separar el ARN no disuelto. Aproximadamente 380 μl de sobrenadante se transfirieron a un tubo nuevo con 42 μl de tampón de DNasa I 10x (Mg2+) (Fermentas); DNasa I 3 μl -1 u/μl (sin RNasa) (Fermentas) y se incubó durante 20 min a +37 ºC para degradar el ADN. Las mezclas de reacción se extrajeron una vez con el mismo volumen de Fenol/cloroformo Roti® (ROTH) y dos veces con el mismo volumen de cloroformo para retirar la DNasa I. A cada tubo se añadieron 43 μl de solución de acetato de sodio 3 M, pH 5,0 y 1075 μl de etanol al 96 % enfriado con hielo. Finalmente, el ARN se precipitó por incubación durante 30 min a -20 ºC y centrifugación durante 25 minutos a +4 ºC a velocidad máxima (25.000 g). El sobrenadante se desechó y el sedimento del ARN se lavó con 500 μl de etanol al 75 % enfriado con hielo. Los tubos se centrifugaron de nuevo durante 4 minutos a +4 ºC a velocidad máxima y el sobrenadante se desechó. El sedimento de ARN se secó durante 5 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se resuspendió en 150 μl de agua sin nucleasa enfriada con hielo con agitación (1400 rpm) durante 15 minutos a +4 ºC. La solución de ARN se dividió en alícuotas de 10 μl y se congeló con nitrógeno líquido. La concentración de ARNm se midió con espectrofotometría y se verificó dos veces en un gel de agarosa junto con la escalera de ARN RiboRuler™ de amplio alcance (Fermentas).

El complejo de ARNm/ADNbc se produjo por ligamiento del oligodesoxinucleótido long+ con ARNm utilizando como molde el oligodesoxinucleótido ddC-Long2. El extremo 5’ de long+ se fosforiló previamente utilizando la polinucleótido quinasa de T4 (Fermentas). El oligodesoxinucleótido ddC-Long2 tenía una modificación en el extremo 3’ (ddC) para impedir la posibilidad de la extensión del extremo 3’ por la transcriptasa inversa en su sustrato de ARN-ADN natural.

Se preparó una mezcla de emparejamiento de 50 μl 17 pmol de mezcla de ARNm purificado a una proporción de

1:20 = MLV_D583N_pD (RT activa): del_pD (RT inactiva) con un exceso molar de 4,3 veces long+ y un exceso molar de 4,1 veces ddC-Long2 en agua sin nucleasa. La mezcla se incubó a 70 ºC durante 5 minutos y después se enfrió a temperatura ambiente durante 20 minutos. Antes de añadir los componentes de la reacción de ligamiento la mezcla se llevó al soporte de enfriamiento durante 2 minutos.

A 40 μl de la mezcla de emparejamiento se añadieron 5 μl de tampón de ligamiento 10x y 5 μl de ADN ligasa de T4 (5 v/μl) (Fermentas). La reacción de ligamiento negativa se realizó utilizando la misma mezcla de emparejamiento en tampón de ligamiento 1x sin ADN ligasa T4. Las mezclas de reacción de ligamiento preparadas se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos. Para detener el ligamiento se añadió 1 μl de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a ambos tubos y las mezclas de reacción se extrajeron una vez con el mismo volumen de Fenol/cloroformo Roti® (ROTH) y dos veces con el mismo volumen de cloroformo seguido de la concentración de los productos de reacción a 30 ºC durante 10 minutos en un concentrado de vacío 5301 (Eppendorf). La desalinización se realizó utilizando microcolumnas illiustra ProbeQuant G-50 (GE Healthcare). Las concentraciones de los productos de ligamiento se determinaron en gel de agarosa junto con la Escalera de ARN RiboRuler™ de amplio alcance (Fermentas) – la mezcla de ARNm (MLV_D583N_pD: del_pD = 1:20) se ligó con los oligodexosinucleótidos long+/ddC-Long2 ~0,24 μg/μl (muestra con ADN ligasa de T4) y la mezcla de ARNm simple con los oligodesoxinucleótidos long+/ddC-Long2 de ~0,06 μg/μl (muestra sin ADN ligasa de T4).

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(4) Control general del complejo ARNm/ADNbc por incorporación de [α-P33]dATP. El complejo de ARNm/ADNbc preparado (sustrato) se ensayó con respecto a dTTP (o biotina-dUTP) e incorporación posterior de [α-P33]dATP mediante transcriptasa inversa. Mezcla de reacción: 16 μl de tampón de reacción 5x para transcriptasa inversa; inhibidor de RNasa RiboLock™ 4 μl -40 u/μl (Fermentas); [α-P33]dATP 2 μl (10 mCi)/ml, SRF -203 (Hartmann Analytic)); agua sin nucleasa 35 μl; transcriptasa inversa M-MuLV RevertAid™ Minus 1 μl200 u/μl (Fermentas). La mezcla preparada se dividió en dos tubos 2x 28 μl y 2 μl de dTTP 1 mM (Fermentas) o se añadieron 2 μl de biotina-dUTP 1 mM (Fermentas). Las mezclas resultantes se dividieron en dos tubos 2x 15 μl. Al primer tubo se añadieron 1,25 μl (~0,3 μg) de productos de ligamiento más 3,75 μl de agua sin nucleasa. Al segundo tubo se añadieron 5 μl (~0,3 μg) de productos de reacción de ligamiento negativo. Las mezclas de reacción se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos. Después de esto, se añadió 1 μl de EDTA 0,5 M (pH 8,0) a todos los tubos y las mezclas de reacción se extrajeron una vez con el mismo volumen de Fenol/cloroformo Roti® (ROTH) y dos veces con el miso volumen de cloroformo seguido de purificación en microcolumnas ProbeQuant G-50 illiustra (GE Healthcare). Los productos de reacción se analizaron en gel de agarosa junto con la escalera (ladder) de ARN RiboRuler™ de amplio alcance (Fermentas) FIG 14A. En todas las muestras (con y sin ligasa) puede observarse una banda moderada (~2500 b) de ARNm de del_pD (una cantidad 20 veces más pequeña de ARNm de MLV_D583N_pD de ~ 2700 b, que estaba presente en la mezcla de ARNm, no pudo diferenciarse). Posteriormente, el gel de agarosa se secó en papel de filtro y el complejo de ARNm/ADNbc radiomarcado (en la misma posición que el ARNm) solo se detectó en el caso de muestras de ligamiento positivo (con ligasa) y no en el caso de muestras de ligamiento negativo (sin ligasa) FIG 14B.

(5) Selección de la actividad de la ADN polimerasa dependiente de ADN utilizando biotina-dUTP.

El complejo de ARNm/ADNbc previamente preparado (mezcla de ARNm MLV_D583N_pD (RT activa):del_pD (RT inactiva) = 1:20) se utilizó para la traducción in vitro empleando el sistema WakoPURE sintético (295-59503 -Wako). La mezcla de traducción del sistema WakoPURE (25 μl): solución A 12,5 μl (Wako); solución B 5 μl (Wako); inhibidor de RNasa RiboLock 0,5 μl – 40 u/μl (Fermentas); DTT 0,25 μl – 1 M; agua sin nucleasa 1,75 μl y sustrato de ARNm/ADNbc 5 μl -0,24 μg/μl (~1200 ng). La traducción in vitro se realizó durante 120 min a 37 ºC. Las traducciones (~25 μl) se detuvieron por adición de 155 μl de tampón de detención enfriado con hielo WBK500+DTT+tritón (Tris-acetato 50 mM, pH 7,5 a 25 ºC, NaCl 50 mM; Mg-acetato 50 mM, KCl 500 mM; DTT 10 mM; Triton X-100 al 0,1 % (v/v) -(T8787 -Sigma)) y se centrifugó durante 5 minutos a +4 ºC y a 25000 g. Muy cuidadosamente, 160 μl de mezcla de traducción centrifugada se transfirieron sobre la parte superior de una solución de sacarosa al 35 % (p/v) de 840 μl en WBK500+DTT+Triton X-100 (Tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM); Mg acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; Triton X-100 al 0,1 % (v/v) (T8787 -Sigma); sacarosa al 35 % (p/v) (84097 -Fluka)) a tubos de ultracentrifugación transparentes de 1 ml (343778 -Beckman). Los complejos ternarios (CT) que consistían en ARNm/ADNbc-ribosoma-proteína (ARNt) se purificaron por ultracentrifugación en una ultracentrífuga Beckman TL-100 en un rotor de ángulo fijo TLA100.2 (Beckman) a 100.000 rpm durante 9 min a +4 ºC. Inicialmente, 750 μl de solución se retiraron de la parte más superior del tubo de centrifugación. Después (muy cuidadosamente para mantener un pequeño sedimento transparente de CT en la parte inferior del tubo de ultracentrifugación intacto) las paredes del tubo se lavaron con 750 μl de WBK500 (tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg-acetato 50 mM; KCl 500 mM). Finalmente, toda la solución se retiró comenzando desde la parte más superior del tubo de centrifugación y el sedimento se disolvió en 30 μl de tampón de detención enfriado con hielo WBK500+DTT+tritón (Tris-acetato 50 mM pH 7,5 a 25 ºC; NaCl 50 mM; Mg-acetato 50 mM; KCl 500 mM; DTT 10 mM; Triton X-100 al 0,1 % (v/v) (T8787-Sigma)).

Como se determinó utilizando ARNm marcado con radioactividad después de ultracentrifugación, el 5 % -30 % del ARNm entrante se localizó en el sedimento del complejo ternario. Por lo tanto se esperaba que hubiese menos de 360 ng (30 % de ARNm 1200 ng utilizado en la reacción de traducción) de ARNm en 30 μl de tampón (~12 ng/μl o 9x109 moléculas/μl de complejo ternario).

Se preparó en hielo una mezcla de reacción de incorporación de nucleótidos modificada mezclando: tampón de reacción 5 μl -5X de para transcriptasa inversa (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 1,25 μl -40 u/μl (Fermentas); biotina-dUTP 2,5 μl -1 mM (Fermentas); agua sin nucleasa 40,95 μl y 0,3 μl de CT purificado (<2,7*109 moléculas). De acuerdo con el protocolo 50 μl de mezcla de reacción de incorporación de nucleótidos contenía <2,7*109 moléculas de complejo ternario.

Se preparó una mezcla de aceite-tensioactivo mezclando ABIL EM 90 (Goldschmidt) en aceite mineral (M5904 -Sigma) a una concentración final de 4 % (v/v) (Ghadessy y Holliger, 2004; documento US2005064460). Las emulsiones se prepararon a +4 ºC en viales criogénicos de 5 ml (430492 -Corning) mezclando 950 μl de mezcla de aceite -tensioactivo con 50 μl de mezcla de RT. La mezcla se realizó utilizando un agitador magnético MS-3000 con control de velocidad (Biosan) a ~ 2100 rpm; una barra magnética Rotilabo® (3x8 mM) con anillo central (1489.2 -Roth); cada 30 segundos se añadía fase acuosa en alícuotas de 10 μl, continuando la mezcla durante 2 minutos más (tiempo de mezcla total -4 min). De acuerdo con los datos de microscopía óptica, el tamaño de los compartimentos en las emulsiones preparadas variaba de 0,5 μM a 10 μM con un diámetro promedio de ~2 μM. Por lo tanto, se esperaba tener ~1*1010 compartimentos de agua en aceite después de la emulsificación de la mezcla de reacción de transcripción inversa 50 μl, que contenía menos de 2,7*109 moléculas de complejo ternario (aproximadamente un complejo de ARNm-ADNbc y moléculas de transcriptasa inversa por 3-4 compartimentos).

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La emulsión preparada se incubó durante 30 minutos a +37 ºC.

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Para recuperar la mezcla de reacción de la emulsión, se añadieron 20 μl de EDTA 0,1 M a la emulsión, se agitó durante 10 segundos, y después se añadieron 50 μl de mezcla de fenol/cloroformo y se agitó durante 10 segundos más. A continuación, la emulsión se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se añadieron 0,5 ml de éter saturado con agua mezclados con agitación vorticial y se centrifugó durante 10 minutos a temperatura ambiente durante 16.000 g. La fase de aceite-éter se retiró dejando una emulsión concentrada (aunque aún intacta) en el fondo del tubo. Finalmente, las emulsiones se degradaron por extracción con éter saturado con agua 0,9 ml; etil acetato saturado con agua 0,9 ml (para retirar el detergente ABIL EM 90) y dos veces con éter saturado con agua 0,9 ml. La fase acuosa se secó durante 12 min al vacío a temperatura ambiente seguido de la retirada de nucleótidos incorporados en microcolumnas illiustra ProbeQuant G-50 (GE Healthcare). Una alícuota de 2 μl de mezcla resultante se dejó para la reacción RT directa (sin purificación con perlas de estreptavidina) y la parte restante de la solución se utilizó para la inmovilización del complejo ARNm/ADNbc marcado con biotina en perlas de estreptavidina Dynabeads M-280 (DYNAL Biotech).

Para el aislamiento del complejo de ARNm-ADNbc marcado con biotina, se utilizó el kit BINDE™ kilobase Dynabeads® (DYNAL Biotech) de acuerdo con la descripción dada del producto. Se transfirieron 5 μl de Dynabeads resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, se lavó con 20 μl de solución de unión proporcionada. El tubo se colocó en el imán durante 1-2 minutos hasta que las perlas se sedimentaron en el tubo y se retiró la solución. Las Dynabeads se resuspendieron cuidadosamente con pipeteo en 50 μl de Solución de Unión y se añadió 1 μl de ARNt acuoso (ARNt de solución de levadura (Roche)) (1 μg/ml) para minimizar la unión de ARNm inespecífica. A la solución (~50 μl) que contenía los fragmentos de ARN-ADN marcados con biotina, se añadieron 50 μl de Dynabeads en solución de unión. El tubo se incubó agitando en la termomezcladora a +22 ºC (Eppendorf) durante 1 hora. Después de la unión del ARNm/ADNbc, el sobrenadante se retiró de las perlas y estas se lavaron dos veces con 50 μl de Solución de Lavado (proporcionada en el kit) agitando (1400 rpm) durante 5 minutos a +22 ºC y una vez con 50 μl de Solución de Lavado agitando (1400 rpm) durante 12 minutos a +22 ºC.

Las Dynabeads recogidas con el complejo de ARNm/ADNbc marcado con biotina inmovilizado, se resuspendieron en una mezcla de reacción de transcripción inversa.

La mezcla de reacción de transcripción inversa para el complejo de ARNm/ADNbc seleccionado se preparó en hielo: tampón de reacción para transcriptasa inversa 12 μl -5X (Fermentas); dNTP 6 μl -10 mM (Fermentas); inhibidor de RNasa RiboLock 1,5 μl -40 u/μl (Fermentas); oligonucleótido pD_42 0,3 μl -20 μM (SEQ ID NO: 8); transcriptasa inversa M-MuLV RevertAid™ Minus 1,5 μl (200 u/μl) (Fermentas); agua sin nucleasa 35,7 μl. La mezcla preparada se dividió en tres alícuotas de 19 μl: una se utilizó para resuspender las Dynabeads con el complejo de ARNm/ADNbc marcado con biotina inmovilizado, la otra alícuota de 19 μl se transfirió al tubo con la muestra del complejo ARNm/ADNbc elongado dejado sin purificación con perlas de estreptavidina y al resto de la alícuota de 19 μl se añadió 1 μl de agua sin nucleasa (control de reacción negativo para demostrar que la mezcla de reacción no estaba contaminada). Todas las mezclas de reacción se incubaron agitando (1000 rpm) en la termomezcladora a +42 ºC (Eppendorf) durante 1 hora.

La amplificación de ADNc se realizó mediante PCR anidada. La mezcla de PCR inicial se preparó en hielo: tampón Taq 10 μl -10X con KCl (Fermentas); 10 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); mgCl2 6 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq LC (recombinante) 2 μl -1 u/μl (Fermentas); ADN polimerasa de Pfu 1 μl -2,5 u/μl (Fermentas); cebador RD_Nde 0,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 9); cebador pD_55 0,5 μl -100 μM (SEQ ID NO: 10); agua 65 μl – la mezcla se dividió en 5 muestras de 19 μl (5x19 μl). A 3x 19 μl de mezcla maestra de PCR se añadió 1 μl de ADNc (1-3 muestras de RT); a un tubo con 19 μl de mezcla maestra de PCR se añadió 1 μl de agua -control de PCR negativo. Para el control de PCR positivo, se añadió 1 μl de plásmido pET_his_MLV_pD (~ 1 ng). El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 30 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 58 ºC y 3 minutos a 72 ºC) y elongación final durante 5 min a 72 ºC.

La mezcla de PCR anidada para la amplificación parcial del gen (para mejor resolución de la proporción de ADNc de MLV_D583N_pD:del_pD en muestras de RT) se preparó en hielo: Tampón Taq 20 μl -10X con KCl (Fermentas); 20 μl -2 mM de cada dNTP (Fermentas); MgCl2 12 μl -25 mM (Fermentas); ADN polimerasa de Taq 0,9μl -5u/μl (Fermentas); cebador M_F 1,0 μl -100 μM (SEQ ID NO: 11); cebador M_2R 1,0 μl -100 μM (SEQ ID NO: 12); agua 135,1 μl -la mezcla se dividió 5x 38 μl. Para preparar la mezcla de PCR anidada, se añadieron 2 μl de producto de primera PCR (conjunto de cebadores RD_Nde//pD_55). La mezcla maestra se mezcló de nuevo y se dividió en dos tubos (2x 20 μl) durante 30 o 35 ciclos de amplificación de PCR. El protocolo de ciclado fue: etapa de desnaturalización inicial 3 minutos a 94 ºC, 30 o 35 ciclos (45 segundos a 94 ºC, 45 segundos a 57 ºC y 1 minuto a 72 ºC) y elongación final durante 3 min a 72 ºC. La longitud esperada de los fragmentos de la PCR fue de 907 pb para MLV_D583N_pD y de 736 pb para del_pD. La amplificación se analizó en gel de agarosa al 1 % cargando 10 μl de mezcla PCR por pocillo (FIG 15).

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Resultados

1.

El adaptador bicatenario (ADNbc) se ligó satisfactoriamente a ARNm utilizando ADN ligasa de T4. La eficiencia del ligamiento es de aproximadamente 60 %, como se determina por ligamiento de adaptador ADNbcbiotina. El complejo de ARNm/ADNbc puede purificarse específicamente en perlas de estreptavidina, proporcionando una oportunidad para diferenciar entre sustratos marcados y no marcados con biotina. El ARNm libre es mucho peor sustrato para la ADN polimerasa dependiente de ADN en comparación con el ARNm/ADNbc. Como consecuencia, el 60 % de la eficiencia de ligamiento del ADNbc al ARNm es suficientemente buena y dicho sustrato puede utilizarse satisfactoriamente en el esquema de desarrollo.

2.

El experimento de selección general se realizó utilizando el complejo de ARNm/ADNbc (mezcla de ARNm MLV_D583N_pD:del_pD = 1:20). La traducción in vitro se realizó utilizando el sistema de traducción de proteínas WakoPURE y la reacción de incorporación de biotina-dUTP compartimentalizada en el ADNbc se realizó para demostrar el enriquecimiento de genes que codifican la transcriptasa inversa activa (MLV_D583N_pD) sobre los genes que codifican la enzima (del_pD) inactivada. De acuerdo con el esquema de selección (FIG 12) la reacción de incorporación de biotina-dUTP solo debe producirse en compartimentos acuosos que contienen transcriptasa inversa activa (MLV_D583N_pD) dando como resultado la biotinilación del complejo de ARNm/ADNbc. La ADN polimerasa dependiente de ADN se selecciona a través de la unión del complejo biotinilado con estreptavidina inmovilizada en perlas magnéticas y después el gen seleccionado se amplifica mediante RT-PCR. Los genes que codifican la enzima activa (en nuestro caso el fragmento de RT-PCR para la transcriptasa inversa MLV_D583N_pD) se enriquecieron sobre los genes que codifican la enzima inactiva (FIG 15). La proporción inicial de genes MLV_D583N_pD:del_pD fue de 1:20 y la proporción final (después del enriquecimiento) fue de ~1:1. Respectivamente un factor de enriquecimiento en este experimento particular fue de ~20 veces. Los factores de enriquecimiento calculados a partir de diferentes experimentos variaron en el intervalo de 5 a 200. Y se confirmó que la ADN polimerasa dependiente de ADN podía seleccionarse para la incorporación de nucleótidos modificados aplicando el método de presentación compartimentalizada en ribosomas (CRD). La selección de ADN polimerasas dependientes de ADN convencionales puede realizarse al instante. La biotina-dUTP puede intercambiarse con diferentes análogos nucleotídicos de interés, incluyendo análogos nucleotídicos que tienen modificaciones en 3’. Después de la incorporación de dichos análogos nucleotídicos en la cadena de ADN, el extremo 3’ se bloquea; no puede extenderse y la reacción de elongación finalizaría. Esta estrategia se utiliza en un esquema de secuenciación mediante síntesis (SBS, sequencing by synthesis) y la ADN polimerasa adecuada para la SBS puede desarrollarse fácilmente utilizando la técnica de presentación compartimentalizada en ribosomas (CRD).

ANEXO 1

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ANEXO 2

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ANEXO 3

L5_9

12 mutaciones,

18

11 mutaciones,

L5_79

10 mutaciones,

imagen112

imagen113

imagen114

L5_82

10 mutaciones,

L5_117

10 mutaciones,

21

9 mutaciones,

L5_3

9 mutaciones,

L5_20

9 mutaciones,

L5_75

9 mutaciones,

L5_76

9 mutaciones,

8

8 mutaciones,

L5_13

8 mutaciones,

L5_41

8 mutaciones,

L5_68

8 mutaciones,

L5_72

8 mutaciones,

L5_114

8 mutaciones,

L5_115

8 mutaciones,

17

7 mutaciones,

L5_15

7 mutaciones,

L5_21, L5_111

7 mutaciones,

L5_40

7 mutaciones,

L5_47

7 mutaciones,

L5_71

7 mutaciones,

L5_78

7 mutaciones,

L5_81

7 mutaciones,

L5_118

7 mutaciones,

13

6 mutaciones,

L5_30

6 mutaciones,

L5_32

6 mutaciones,

L5_43, L5_112

6 mutaciones,

L5_53

6 mutaciones,

L5_56

6 mutaciones,

L5_57

6 mutaciones,

L5_60

6 mutaciones,

L5_62

6 mutaciones,

L5_84

6 mutaciones,

L5_95

6 mutaciones,

L5_107

6 mutaciones,

16

5 mutaciones,

20

5 mutaciones,

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imagen117

23 5 mutaciones, L5_2 5 mutaciones, L5_14 5 mutaciones, L5_18 5 mutaciones, L5_23 5 mutaciones, L5_24 5 mutaciones, L5_28 5 mutaciones, L5_37 5 mutaciones, L5_49, L5_63 5 mutaciones, L5_55 5 mutaciones, L5_69 5 mutaciones, L5_88 5 mutaciones, L5_101 5 mutaciones, L5_104 5 mutaciones, 3 4 mutaciones, 5 4 mutaciones, 7 4 mutaciones, 11 4 mutaciones, 12 4 mutaciones, 30 4 mutaciones, L5_1 4 mutaciones, L5_6 4 mutaciones, L5_8 4 mutaciones, L5_11 4 mutaciones, L5_16 4 mutaciones, L5_29 4 mutaciones, L5_39 4 mutaciones, L5_42 4 mutaciones, L5_44 4 mutaciones, L5_46 4 mutaciones, L5_52 4 mutaciones, L5_61 4 mutaciones, L5_64, L5_93 4 mutaciones, L5_65 4 mutaciones, L5_85, L5_96 4 mutaciones, L5_90 4 mutaciones, L5_103 4 mutaciones, L5_106 4 mutaciones, L5_120 4 mutaciones, 1 3 mutaciones, 28 3 mutaciones, L5_4 3 mutaciones, L5_25 3 mutaciones, L5_35 3 mutaciones, L5_51 3 mutaciones, L5_58 3 mutaciones, L5_66 3 mutaciones, L5_73 3 mutaciones, L5_80 3 mutaciones,

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L5_92 3 mutaciones, L5_94 3 mutaciones, L5_97 3 mutaciones, 10 2 mutaciones, L5_59 2 mutaciones, L5_99 2 mutaciones, L5_116 2 mutaciones, L5_48 1 mutaciones,

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WT_MLV, L5_87 0 mutaciones

ANEXO 4

Posición 524, total mutaciones 31,3 aminoácidos diferentes 5 D→G, 20 secuencias (7, 10, L5_8, L5_13, L5_15, L5_29, L5_41, L5_43, L5_53, L5_82, L5_84, L5 88, L5_94,

L5_99, L5_104, L5_106, L5_112, L5_114, L5_115, L5_117) D→A, 10 secuencias (1, 23, L5_6, L5_28, L5_49, L5_56, L5_62, L5_63, L5_64, L5_93) D→N, 1 secuencia (30)

10 Posición 200, total mutaciones 30, 3 aminoácidos diferentes D→G, 2 secuencias (L5_14, L5_115) D→A, 3 secuencias (L5_13, L5_20, L5_30) D→N, 25 secuencias (17, 18, 20, 30, L5_11, L5_35, L5_37, L5_39, L5_43, L5_46, L5_47, L5_52, L5_55, L5_60, L5_64, L5_65, L5_72, L5_76, L5_85, L5_90, L5_92, L5_93, L5_96, L5_103, L5_112)

15

Posición 653, total mutaciones 23, 5 aminoácidos diferentes D→V, 1 secuencia (L5_58) D→G, 5 secuencias (L5_15, L5_40, L5_78, L5_92, L5 _ 14) D→A, 4 secuencias (11, L5_84, L5_97, L5_115)

20 D→N, 10 secuencias (5, L5_21, L5_43, L5_47, L5_51, L5_60, L5_69, L5_82, L5_111, L5_12) D→H, 3 secuencias (L5_55, L5_68, L5_116)

Posición 583, total mutaciones 21,4 aminoácidos diferentes D→E, 1 secuencia (L5_13)

25 D→G, 7 secuencias (18, 30, L5_16, L5_32, L5_41, L5_80, L5_95) D→A, 3 secuencias (21, L5_85, L5_96) D→N, 10 secuencias (17, L5_30, L5_37, L5_44, L5_46, L5_52, L5_53, L5_76, L5_101, L5_106)

Posición 603, total mutaciones 18, 2 aminoácidos diferentes 30 L→W, 17 secuencias (3, 13, 20, L5_3, L5_14, L5_20, L5_21, L5_24, L5_42, L5_57, L5_65, L5_66, L5_69, L5_82, L5_111, L5_118, L5_120) L→M, 1 secuencia (L5_16)

Posición 330, total mutaciones 15, 1 aminoácido diferente 35 T→P, 15 secuencias (8, 18, L5_13, L5_30, L5_35, L5_40, L5_43, L5_46, L5_52, L5_72, L5_78, L5_85, L5_90, L5_96, L5_112)

Posición 139, total mutaciones 14, 1 aminoácido diferente L→P, 14 secuencias (5, 8, 18, L5_24, L5_32, L5_41, L5_53, L5_72, L5_73, L5_84, L5_88, L5_107, L5_115, 40 L5_117)

Posición 204, total mutaciones 7, 1 aminoácido diferente H→R, 7 secuencias (7, 21, L5_49, L5_62, L5_63, L5_68, L5_101)

45 Posición 221, total mutaciones 6, 1 aminoácido diferente Q→R, 6 secuencias (3, 23, L5_13, L5_20, L5_24, L5_118)

Posición 287, total mutaciones 6, 1 aminoácido diferente T→A, 6 secuencias (8, L5_6, L5_49, L5_63, L5_68, L5_118) 50

Posición 680, total mutaciones 6, 2 aminoácidos diferentes R→P, 1 secuencia (L5_6) R→A, 5 secuencias (18, 20, 21, L5_4, L5_8)

55 Posición 49, total mutaciones 5, 2 aminoácidos diferentes I→T, 1 secuencia (L5_69)

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I→V, 4 secuencias (1, 17, L5_57, L5_68)

Posición 479, total mutaciones 5, 1 aminoácido diferente N→D, 5 secuencias (18, L5_30, L5_35, L5_44, L5_88)

Posición 594, total mutaciones 5, 2 aminoácidos diferentes H→Q, 1 secuencia (L5_72) H→R, 4 secuencias (1, L5_6, L5_28, L5_56)

Posición 625, total mutaciones 5, 2 aminoácidos diferentes F→S, 3 secuencias (L5_28, L5_43, L5_112) F→L, 2 secuencias (L5_68, L5_88)

Posición 679, total mutaciones 5, 2 aminoácidos diferentes S→F, 1 secuencia (L5_32) S→P, 4 secuencias (18, 20, 21, L5_8)

Posición 65, total mutaciones 4, 1 aminoácido diferente P→S, 4 secuencias (17, L5_21, L5_101, L5_111)

Posición 126, total mutaciones 4, 2 aminoácidos diferentes H→S, 2 secuencias (L5_37, L5_92) H→R, 2 secuencias (L5_47, L5_84)

Posición 333, total mutaciones 4, 2 aminoácidos diferentes L→Q, 3 secuencias (L5_75, L5_79, L5_117) L→P, 1 secuencia (L5_42)

Posición 502, total mutaciones 4, 1 aminoácido diferente A→V, 4 secuencias (17, L5_1, L5_29, L5_78)

Posición 607, total mutaciones 4, 3 aminoácidos diferentes E→G, 1 secuencia (L5_103) E→A, 1 secuencia (L5_11) E→K, 2 secuencias (8, L5_94)

Posición 638, total mutaciones 4, 1 aminoácido diferente H→R, 4 secuencias (L5_21, L5_85, L5_96, L5_111)

Posición 658, total mutaciones 4, 2 aminoácidos diferentes K→Q, 1 secuencia (L5_3) K→R, 3 secuencias (L5_24, L5_75, L5_79)

Posición 8, total mutaciones 3, 2 aminoácidos diferentes H→P, 2 secuencias (L5_56, L5_115) H→R, 1 secuencia (28)

Posición 130, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente P→S, 3 secuencias (L5_13, L5_53, L5_82)

Posición 233, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente E→K, 3 secuencias (L5_21, L5_107, L5_111)

Posición 237, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente Q→R, 3 secuencias (12, L5_43, L5_112)

Posición 249, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente N→D, 3 secuencias (L5_1, L5_15, L5_114)

Posición 283, total mutaciones 3, 2 aminoácidos diferentes A→D, 2 secuencias (5, L5_101) A→T, 1 secuencia (L5_118)

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Posición 307, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente A→V, 3 secuencias (L5_15, L5_73, L5_114)

Posición 344, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente Y→H, 3 secuencias (L5_9, L5_15, L5_114)

Posición 407, total mutaciones 3, 2 aminoácidos diferentes P→S, 2 secuencias (L5_21, L5_111) P→L, 1 secuencia (L5_9)

Posición 428, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente M→L, 3 secuencias (3, 13, L5_20)

Posición 430, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente Q→R, 3 secuencias (L5_44, L5_75, L5_79)

Posición 449, total mutaciones 3, 2 aminoácidos diferentes D→G, 2 secuencias (L5_13, L5_30) D→A, 1 secuencia (L5_61)

Posición 644, total mutaciones 3, 2 aminoácidos diferentes A→T, 1 secuencia (L5_46) A→V, 2 secuencias (23, 28)

Posición 649, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente N→S, 3 secuencias (L5_24, L5_75, L5_79)

Posición 671, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente L→P, 3 secuencias (L5_30, L5_55, L5_72)

Posición 673, total mutaciones 3, 2 aminoácidos diferentes E→G, 2 secuencias (L5_75, L5_79) E→K, 1 secuencia (L5_114)

Posición 678, total mutaciones 3, 1 aminoácido diferente N→I, 3 secuencias (18, 20, 21)

Posición 5, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente E→K, 2 secuencias (L5_2, L5_55)

Posición 11, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes H→R, 1 secuencia (L5_78) H→Y, 1 secuencia (L5_75)

Posición 12, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes E→V, 1 secuencia (L5_39) E→A, 1 secuencia (L5_20)

Posición 14, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes S→T, 1 secuencia (L5_69) S→P, 1 secuencia (L5_117)

Posición 17, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente P→S, 2 secuencias (L5_15, L5_114) Posición 39, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

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M→V, 1 secuencia (L5_68)

M→L, 1 secuencia (L5_25)

Posición 50, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente I→V, 2 secuencias (L5_49, L5_63)

Posición 66, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente M→L, 2 secuencias (L5_58, L5_76)

Posición 83, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente D→N, 2 secuencias (18, L5_9)

Posición 91, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

Q→R, 1 secuencia (L5_68)

Q→L, 1 secuencia (L5_16)

Posición 95, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente N→S, 2 secuencias (L5_20, L5_117)

Posición 108, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente D→E, 2 secuencias (L5_15, L5_114)

Posición 135, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente L→P, 2 secuencias (L5_9, L5_32)

Posición 148, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente V→M, 2 secuencias (11, L5_78)

Posición 166, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente P→S, 2 secuencias (L5_9, L5_81)

Posición 179, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

I→T, 1 secuencia (21)

I→V, 1 secuencia (L5_47)

Posición 184, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente T→A, 2 secuencias (L5_2, L5_71)

Posición 194, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente N→S, 2 secuencias (L5_49, L5_63)

Posición 197, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente T→A, 2 secuencias (L5_14, L5_115)

Posición 199, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

F→L, 1 secuencia (L5_81)

F→Y, 1 secuencia (L5_41)

Posición 216, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente D→G, 2 secuencias (L5_64, L5_93)

Posición 289, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

M→V, 1 secuencia (L5_76)

M→L, 1 secuencia (L5_71)

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Posición 302, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente E→K, 2 secuencias (L5_25, L5_57)

Posición 306, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

T→A, 1 secuencia (L5_28)

T→M, 1 secuencia (30)

Posición 325, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente Y→H, 2 secuencias (L5_75, L5_79)

Posición 346, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente E→D, 2 secuencias (L5_41, L5_62)

Posición 358, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

G→W, 1 secuencia (L5_115)

G→V, 1 secuencia (5)

Posición 374, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente Q→R, 2 secuencias (L5_52, L5_90)

Posición 380, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente V→A, 2 secuencias (L5_3, L5_117)

Posición 388, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente W→R, 2 secuencias (L5_23, L5_104)

Posición 390, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente R→W, 2 secuencias (11, L5_23)

Posición 391, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

P→S, 1 secuencia (L5_101)

P→L, 1 secuencia (L5_2)

Posición 409, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente C→R, 2 secuencias (17, L5_1)

Posición 417, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente A→V, 2 secuencias (L5_53, L5_84)

Posición 431, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente P→Q, 2 secuencias (L5_32, L5_51)

Posición 433, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente V→A, 2 secuencias (7, L5_14)

Posición 436, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente A→T, 2 secuencias (L5_9, L5_76)

Posición 450, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente R→H, 2 secuencias (L5_41, L5_59)

Posición 454, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente N→K, 2 secuencias (L5_37, L5_68)

Posición 457, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

M→T, 1 secuencia (L5_18)

M→R, 1 secuencia (L5_66)

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Posición 470, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente V→A, 2 secuencias (17, L5_1)

Posición 478, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente L→P, 2 secuencias (L5_21, L5_111)

Posición 491, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente L→P, 2 secuencias (L5_76, L5_84)

Posición 494, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

N→D, 1 secuencia (L5_94)

N→K, 1 secuencia (L5_95)

Posición 503, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente H→R, 2 secuencias (L5_40, L5_59)

Posición 530, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente Q→H, 2 secuencias (L5_61, L5_81)

Posición 545, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente E→G, 2 secuencias (L5_64, L5_93)

Posición 559, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

Q→P, 1 secuencia (L5_103)

Q→R, 1 secuencia (L5_18)

Posición 572, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

M→L, 1 secuencia (L5_72)

M→I, 1 secuencia (7)

Posición 597, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente I→T, 2 secuencias (L5_75, L5_79)

Posición 616, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente E→K, 2 secuencias (L5_75, L5_79)

Posición 618, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente L→V, 2 secuencias (18, L5_95)

Posición 623, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente A→V, 2 secuencias (12, L5_115)

Posición 635, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

C→S, 1 secuencia (8)

C→R, 1 secuencia (L5_106)

Posición 642, total mutaciones 2, 2 aminoácidos diferentes

H→R, 1 secuencia (L5_107)

H→Y, 1 secuencia (L5_47)

Posición 676, total mutaciones 2, 1 aminoácido diferente S→P, 2 secuencias (L5_80, L5_82)

Posición 15, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente K→T, 1 secuencia (L5_11)

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Posición 23, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→P, 1 secuencia (12)

Posición 24, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_40)

Posición 26, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_82)

Posición 29, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente F→L, 1 secuencia (11)

Posición 30, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→L, 1 secuencia (L5_23)

Posición 36, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→I, 1 secuencia (L5_99)

Posición 37, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→W, 1 secuencia (L5_14)

Posición 41, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→R, 1 secuencia (L5_40)

Posición 43, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→I, 1 secuencia (L5_2)

Posición 51, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→S, 1 secuencia (13)

Posición 60, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→A, 1 secuencia (L5_41)

Posición 64, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Y→C, 1 secuencia (L5_61)

Posición 67, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→P, 1 secuencia (L5_73)

Posición 69, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→G, 1 secuencia (L5_32)

Posición 70, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→V, 1 secuencia (L5_88)

Posición 74, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→T, 1 secuencia (L5_79)

Posición 77, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente H→R, 1 secuencia (L5_48)

Posición 86, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→V, 1 secuencia (L5_39)

Posición 87, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_20)

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Posición 88, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→A, 1 secuencia (12)

Posición 89, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→S, 1 secuencia (8)

Posición 90, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente C→Y, 1 secuencia (L5_58)

Posición 92, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→P, 1 secuencia (L5_44)

Posición 93, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→L, 1 secuencia (L5_66)

Posición 96, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→M, 1 secuencia (L5_103)

Posición 97, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→S, 1 secuencia (L5_71)

Posición 104, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→R, 1 secuencia (L5_79)

Posición 105, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→E, 1 secuencia (L5_76)

Posición 107, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente N→S, 1 secuencia (L5_47)

Posición 110, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→G, 1 secuencia (L5_51)

Posición 112, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→A, 1 secuencia (L5_60)

Posición 118, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→A, 1 secuencia (L5_62)

Posición 124, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente D→G, 1 secuencia (L5_95)

Posición 125, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→V, 1 secuencia (L5_3)

Posición 127, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→S, 1 secuencia (L5_40)

Posición 128, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_47)

Posición 131, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente N→S, 1 secuencia (21)

Posición 132, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→S, 1 secuencia (L5_104)

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Posición 136, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→W, 1 secuencia (13)

Posición 137, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→G, 1 secuencia (L5_82)

Posición 138, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→R, 1 secuencia (L5_3)

Posición 143, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente H→R, 1 secuencia (L5_3)

Posición 149, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→F, 1 secuencia (L5_37)

Posición 151, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→F, 1 secuencia (L5_40)

Posición 159, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→K, 1 secuencia (L5_13)

Posición 164, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→G, 1 secuencia (L5_104)

Posición 168, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente F→5, 1 secuencia (L5_41)

Posición 173, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→K, 1 secuencia (L5_57)

Posición 174, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente D→G, 1 secuencia (L5_29)

Posición 187, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→G, 1 secuencia (L5_95)

Posición 190, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Q→R, 1 secuencia (L5_117)

Posición 192, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente F→L, 1 secuencia (L5_42)

Posición 207, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (13)

Posición 208, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→V, 1 secuencia (L5_4)

Posición 211, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→W, 1 secuencia (L5_56)

Posición 214, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente H→R, 1 secuencia (L5_9)

Posición 222, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Y→C, 1 secuencia (L5_9)

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Posición 223, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→M, 1 secuencia (L5_23)

Posición 225, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente D→G, 1 secuencia (L5_4)

Posición 238, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Q→H, 1 secuencia (L5_65)

Posición 240, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_55)

Posición 241, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→Q, 1 secuencia (16)

Posición 242, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_20)

Posición 250, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_71)

Posición 252, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Y→H, 1 secuencia (L5_120)

Posición 259, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (16)

Posición 263, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Q→R, 1 secuencia (L5_95)

Posición 280, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_60)

Posición 282, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→G, 1 secuencia (L5_62)

Posición 292, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→L, 1 secuencia (L5_56)

Posición 293, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_9)

Posición 295, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente K→E, 1 secuencia (L5_107)

Posición 298, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→G, 1 secuencia (L5_90)

Posición 308, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→S, 1 secuencia (L5_120)

Posición 309, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente F→S, 1 secuencia (L5_28)

Posición 311, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→H, 1 secuencia (16)

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Posición 312, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_29)

Posición 314, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→T, 1 secuencia (L5_76)

Posición 322, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_60)

Posición 323, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→L, 1 secuencia (21)

Posición 326, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→S, 1 secuencia (L5_80)

Posición 331, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→E, 1 secuencia (L5_20)

Posición 332, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→I, 1 secuencia (23)

Posición 339, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente D→G, 1 secuencia (L5_117)

Posición 343, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_82)

Posición 351, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→V, 1 secuencia (L5_61)

Posición 353, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (21)

Posición 356, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→G, 1 secuencia (L5_82)

Posición 369, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente F→I, 1 secuencia (L5_118)

Posición 376, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Y→C, 1 secuencia (L5_118)

Posición 379, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→S, 1 secuencia (L5_60)

Posición 383, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Q→P, 1 secuencia (L5_117)

Posición 392, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→A, 1 secuencia (L5_57)

Posición 393, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_72)

Posición 415, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→V, 1 secuencia (L5_9)

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Posición 434, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→T, 1 secuencia (L5_118)

Posición 435, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_23)

Posición 441, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→G, 1 secuencia (L5_120)

Posición 444, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→A, 1 secuencia (L5_9)

Posición 446, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Q→R, 1 secuencia (L5 _81)

Posición 447, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente P→L, 1 secuencia (L5_9)

Posición 459, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente H→R, 1 secuencia (L5_78)

Posición 462, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_18)

Posición 468, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente D→A, 1 secuencia (L5_81)

Posición 475, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente V→G, 1 secuencia (L5_8)

Posición 481, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (10)

Posición 484, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_97)

Posición 486, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_56)

Posición 497, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente D→G, 1 secuencia (L5_71)

Posición 498, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→V, 1 secuencia (L5_97)

Posición 501, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→K, 1 secuencia (L5_81)

Posición 504, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→R, 1 secuencia (L5_18)

Posición 514, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→F, 1 secuencia (8)

Posición 528, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→I, 1 secuencia (L5_62)

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Posición 532, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→R, 1 secuencia (L5_117)

Posición 533, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente Q→K, 1 secuencia (L5_104)

Posición 538, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_69)

Posición 539, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_82)

Posición 543, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→K, 1 secuencia (L5_2)

Posición 544, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→1, 1 secuencia (16)

Posición 551, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_71)

Posición 552, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→P, 1 secuencia (L5_3)

Posición 556, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_42)

Posición 558, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→V, 1 secuencia (L5_81)

Posición 560, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→W, 1 secuencia (13)

Posición 562, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→K, 1 secuencia (L5_71)

Posición 570, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→I, 1 secuencia (L5_65)

Posición 573, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (L5_76)

Posición 576, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente K→R, 1 secuencia (L5_11)

Posición 577, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente K→Q, 1 secuencia (18)

Posición 600, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente R→K, 1 secuencia (L5_16)

Posición 602, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente G→R, 1 secuencia (3)

Posición 622, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente K→R, 1 secuencia (L5_3)

imagen158

imagen159

imagen160

Posición 628, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente K→E, 1 secuencia (L5_25)

Posición 632, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→T, 1 secuencia (28)

Posición 633, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→T, 1 secuencia (L5_107)

Posición 634, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente H→Y, 1 secuencia (L5_53)

Posición 643, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→G, 1 secuencia (L5_107)

Posición 646, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→V, 1 secuencia (L5_39)

Posición 655, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→V, 1 secuencia (L5_18)

Posición 656, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente A→T, 1 secuencia (16)

Posición 661, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→V, 1 secuencia (23)

Posición 662, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_116)

Posición 663, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente E→D, 1 secuencia (8)

Posición 667, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→A, 1 secuencia (L5_78)

Posición 668, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente S→P, 1 secuencia (L5_3)

Posición 669, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente T→5, 1 secuencia (L5_57)

Posición 670, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente L→F, 1 secuencia (L5_106)

Posición 672, total mutaciones 1, 1 aminoácido diferente I→T, 1 secuencia (L5_72)

ANEXO 5

imagen161

imagen162

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imagen166

imagen167

imagen168

imagen169

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ANEXO 6

imagen171

Conc.,

Actividad específica Temperatura más alta de síntesis de ADNc

mg/ml

37 °C (u/mg) 50 °C 1 kb 4,5 kb

M-MuLV (ts)

3,4 ~ 200 000 45-50 % 47,8 °C

D200N, L603W (20 mut.)

0,46 260 000 131 % 56 °C

D200N, L603W, T330P (M0_1)

4,17 321 194 175 % 56-58 °C 53 °C

D200N, L603W, T330P, E607K(M1)

4,27 311 576 174 % 60-62 °C 56 °C

D200N, L603W, T330P, E607K, L139P(M2)

2,91 348 694 176 % 62 °C 61 °C

D200N, L603W, N479D, H594R (M3)

5,37 371 510 182 % 56-58 °C 56 °C

D200N, L603W, D653N, D524G (M4)

4,84 358 112 155 % 58-60 °C 58 °C

D200N, L603W, D653N, D524G, T330P (M6)

5,23 272 031 180 % 60-62 °C 58 °C

ANEXO 7

SEQ ID No: 1

imagen172

imagen173

LOCUS pET-his-MLV-pD 7873 pb ADN Circular 5-JUN-2007 ORGANISMO DE PROCEDENCIA COMENTARIO Este archivo está creado por Vector NTI http://www.invitrogen.com/ COMENTARIO COMENTARIO COMENTARIO

COMENTARIO

COMENTARIO COMENTARIO COMENTARIO COMENTARIO

COMENTARIO CARACTERÍSTICAS imagen174Localización/modificadores

CDS 3534..4391 /vntifkey=”4” /etiqueta = Ap /nota = “ORF”: Fase n.º 2 Inicio: atg Terminación: taa”

CDS Complement (6586..7674) /vntifkey=”4” /etiqueta = lacI /nota = “ORF”: Fase n.º 3 Inicio: gtg Terminación: tga”

terminador /vntifkey=”43” /etiqueta = T7\terminador

rep_origin 2947..3402 /vntifkey=”33” /etiqueta = f1\origen

rep_origin Complemento (2936..2936) /vntifkey=”33” /etiqueta = ori

promotor 174..190 /vntifkey=”30” /etiqueta = PT7

misc_feature 2394..2669 /vntifkey=”21” /etiqueta = pD

misc_feature 2364..2393 /vntifkey=”21” /etiqueta = gs\enlazador

misc_feature 2670..2759 /vntifkey=”21” /etiqueta = gs\enlazador

misc_feature 306...2363 /vntifkey=”21” /etiqueta = MLV/H+

misc_feature 258..305 /vntifkey=”21” /etiqueta = his

RECUENTO DE 1873 a 2155 c 2084 g 1761 t BASES ORIGEN

imagen175

imagen176

imagen177

imagen178

imagen179

imagen180

imagen181

imagen182

imagen183

imagen184

SEQ ID No: 2

LOCUS pET_his_del_pd 7702 pb ADN circular 5-JUN-2007 ORGANISMO DE PROCEDENCIA COMENTARIO Este archivo está creado por Vector NTI

http://www.invitrogen.com/ imagen185COMENTARIO COMENTARIO COMENTARIO COMENTARIO

COMENTARIO COMENTARIO COMENTARIO

COMENTARIO CARACTERÍSTICAS Localización/modificadores

misc_feature 2499..2588 /vntifkey=”21” /etiqueta = gs\enlazador

misc_feature 2193..2222 /vntifkey=”21” /etiqueta = gs\enlazador

misc_feature 2223..2498 /vntifkey=”21” /etiqueta = pD

promotor 174..190 /vntifkey=”30” /etiqueta = PT7

rep_origin Complemento (2765..2765) /vntifkey=”33” /etiqueta = ori

rep_origin 2776..3231 /vntifkey=”33” /etiqueta = origen

terminador 2693..2739 /vntifkey=”43” /etiqueta = T7\terminador

CDS Complemento (6415..7503) /vntifkey=”4” /etiqueta = lacI /nota: “ORF: Fase n.º 3 Inicio: gtg Terminación: tga”

CDS 3363..4220 /vntifkey=”4” /etiqueta = Ap /nota: “ORF: Fase n.º 2 Inicio: atg Terminación: taa”

misc_feature 258..306 /vntifkey=”21” /etiqueta = his

misc_feature 306...2192

imagen186

imagen187

/vntifkey=”21”

/etiqueta = del

RECUENTO DE BASES

1823 a 2115 c 2033 g 1731 t

ORIGEN

imagen188

imagen189

imagen190

imagen191

imagen192

imagen193

imagen194

SEQ ID No: 3 oligonucleótido (22 b)

imagen195

SEQ ID No: 4

10 oligonucleótido (21 b) pD-ter imagen196

15 SEQ ID No: 5

oligonucleótido (38 b) assrA

imagen197

SEQ ID No: 6 Proteína (833 aa) SEQ ID No: 7

imagen198

imagen199

imagen200

Proteína (766 aa) del_pD

imagen201

SEQ ID No: 8 oligonucleótido (15 b)

imagen202

SEQ ID No: 9

oligonucleótido (28 b) RD_Nde

imagen203

20 SEQ ID No: 10 oligonucleótido (14 b)

imagen204

SEQ ID No: 11

oligonucleótido (23 b) M_F

imagen205

SEQ ID No: 12

oligonucleótido (19 b) 35 M_2R

imagen206

SEQ ID No: 13 oligonucleótido (40 b)

imagen207

SEQ ID No: 14

oligonucleótido (32 b) M_Eri

imagen208

50 SEQ ID No: 15 oligonucleótido (18 b)

imagen209

imagen210

M_1R

imagen211

SEQ ID No: 16

oligonucleótido (17 b) M_3F

imagen212

10 SEQ ID No: 17 oligonucleótido (19 b)

imagen213

SEQ ID No: 18

oligonucleótido (36 b) M_Hind3+

imagen214

SEQ ID No: 19

LOCUS ORGANISMO

pET_his_MLV 7474 pb ADN circular 4-JUN-2007

DE PROCEDENCIA

COMENTARIO

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COMENTARIO

http://www.invitrogen.com/

COMENTARIO

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COMENTARIO

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COMENTARIO

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COMENTARIO

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COMENTARIO

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COMENTARIO

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COMENTARIO

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COMENTARIO

imagen222

CARACTERÍSTICAS CDS

Localización/modificadores 3125..3992

CDS

/vntifkey=”4” /etiqueta = Ap /nota: = ORF: Fase n.º 2 Complemento (6187..7275) Inicio: atg Terminación: taa”

terminador

/vntifkey=”4” /etiqueta = lacI /nota: = ORF: 2465..2511 Fase n.º 3 Inicio: gtg Terminación: tga”

rep_origin

/vntifkey=”43” /etiqueta = T7/\terminador (2548..3003) /vntifkey=”33”

rep_origin promotor CDS

/etiqueta = origen Complemento (2537..2537) /vntifkey=”33” /etiqueta = ori 174..190 /vntifkey=”30” /etiqueta = PT7 306..2360

CDS

/vntifkey=”4” /etiqueta = MLV 258..305

/vntifkey=”4” /etiqueta = his

imagen223

imagen224

RECUENTO DE BASES 1810 a 2046 c 1942 g 1676 t ORIGEN

imagen225

imagen226

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imagen228

imagen229

imagen230

imagen231

SEQ ID No: 20 oligonucleótido (19 b)

imagen232

10 SEQ ID No: 21 Oligonucleótido (35b)

imagen233

SEQ ID No: 22

Oligonucleótido (71 b + modificación 3’ ddC). DdC-Long2

imagen234

imagen235

imagen236

SEQ ID No: 23 Oligonucleótido (35b + 3’ biotina (TEG)

imagen237

Referencias

Mattheakis LC, Bhatt RR, Dower WJ. An in vitro polysome display system for identifying ligands from very large peptide libraries. Proc Natl Acad Sci USA. 13 de septiembre de 1994;91(19):9022-6. Matsuura T, Pluckthun A. Selection based on the folding properties of proteins with ribosome display. FEBS Lett. 27 de marzo de 2003, 539(1-3):24-8. Hanes J, Pluckthun A. In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. Proc Natl Acad Sci USA. 13 de mayo de 1997; 94(10):4937-42. He M, Taussig MJ. Antibody-ribosome-mRNA (ARM) complexes as efficient selection particles for in vitro display and evolution of antibody combining sites. Nucleic Acids Res. 15 de diciembre de 1997; 25(24):5132-4. Irving RA, Coia G, Roberts A, Nuttall SD, Hudson PJ. Ribosome display and affinity maturation: from antibodies to single V-domains and steps towards cancer therapeutics. J Immunol Methods. 1 de febrero de 2001; 248(1-2):31

45. Review. Amstutz P, Pelletier JN, Guggisberg A, Jermutus L, Cesaro-Tadic S, Zahnd C, Pluckthun A. In vitro selection for catalytic activity with ribosome display. J Am Chem Soc. 15 de agosto de 2002; 124(32):9396-403. Takahashi F, Ebihara T, Mie M, Yanagida Y, Endo Y, Kobatake E, Aizawa M. Ribosome display for selection of active dihydrofolate reductase mutants using immobilized methotrexate on agarose beads. FEBS Lett. 6 de marzo de 2002; 514(1):106-10. Tawfik DS, Griffiths AD. Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat Biotechnol. Julio de 1998; 16(7):652-6. Lee YF, Tawfik DS, Griffiths AD. Investigating the target recognition of DNA cytosine-5 methyltransferase HhaI by library selection using in vitro compartmentalisation. Nucleic Acids Res. 15 de noviembre de 2002; 30(22):4937

44. Cohen HM, Tawfik DS, Griffiths AD. Altering the sequence specificity of HaeIII methyltransferase by directed evolution using in vitro compartmentalization. Protein Eng Des Sel. Enero de 2004; 17(1):3-11. Ghadessy FJ, Ong JL, Holliger P. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized selfreplication. Proc Natl Acad Sci USA. 10 de abril de 2001; 98(8):4552-7. Epub 27 de marzo de 2001. Ghadessy FJ, Ramsay N, Boudsocq F, Loakes D, Brown A, Iwai S, Vaisman A, Woodgate R, Holliger P. Generic expansion of the substrate spectrum of a DNA polymerase by directed evolution. Nat Biotechnol. Junio de 2004; 22(6):755-9. Epub 23 de mayo de 2004. Ong JL, Loakes D, Jaroslawski S, Too K, Holliger P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 18 de agosto de 2006; 361(3):537-50. Epub 5 de julio de 2006. Bernath K, Hai M, Mastrobattista E, Griffiths AD, Magdassi S, Tawfik DS. In vitro compartmentalization by double emulsions: sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 1 de febrero de 2004; 325(1):151-7. Mastrobattista E, Taly V, Chanudet E, Treacy P, Kelly BT, Griffiths AD. High-throughput screening of enzyme libraries: in vitro evolution of a beta-galactosidase by fluorescence-activated sorting of double emulsions. Chem Biol. Diciembre de 2005; 12(12):1291-300. Bertschinger J, Neri D. Covalent DNA display as a novel tool for directed evolution of proteins in vitro. Protein Eng Des Sel. Septiembre de 2004; 17(9):699-707. Epub 2 de noviembre de 2004. Doi N, Yanagawa H. STABLE: protein-DNA fusion system for screening of combinatorial protein libraries in vitro. FEBS Lett. 27 de agosto de 1999; 457(2):227-30. Yonezawa M, Doi N, Kawahashi Y, Higashinakagawa T, Yanagawa H. DNA display for in vitro selection of diverse peptide libraries. Nucleic Acids Res. 1 de octubre de 2003; 31(19):e118. Sepp A, Choo Y. Cell-free selection of zinc finger DNA-binding proteins using in vitro compartmentalization. J Mol Biol. 25 de noviembre de 2005; 354(2):212-9. Epub 3 de octubre de 2005. Sepp A, Tawfik DS, Griffiths AD. Microbead display by in vitro compartmentalisation: selection for binding using flow cytometry. FEBS Lett. 18 de diciembre de 2002; 532(3):455-8. Griffiths AD, Tawfik DS. Directed evolution of an extremely fast phosphotriesterase by in vitro compartmentalization. EMBO J. 2 de enero de 2003; 22(1):24-35. Bernath K, Magdassi S, Tawfik DS. Directed evolution of protein inhibitors of DNA-nucleases by in vitro compartmentalization (IVC) and nano-droplet delivery. J Mol Biol. 4 de febrero de 2005; 345(5):1015-26. Epub 7 de diciembre de 2004. Thorsen T, Roberts RW, Arnold FH, Quake SR. Dynamic pattern formation in a vesiclegenerating microfluidic device. Phys Rev Lett. 30 de abril de 2001; 86(18):4163-6. Okushima S, Nisisako T, Torii T, Higuchi T. Controlled production of monodisperse double emulsions by two-step droplet breakup in microfluidic devices. Langmuir. 9 de noviembre de 2004; 20(23):9905-8. Song H, Tice JD, Ismagilov RF. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew Chem Int Ed Engl. 17 de febrero de 2003;42(7):768-72.

Claims (11)

1. imagen1

   imagen2

   REIVINDICACIONES

   1. Una enzima transcriptasa inversa que comprende una secuencia de aminoácidos de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney, en la que dicha enzima tiene una actividad óptima a una temperatura por

   5 encima de 42 ºC, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación en la posición L603, en la que la mutación no es L603A y, opcionalmente, en la que la secuencia de aminoácidos comprende una mutación adicional en una o más de las siguientes posiciones de aminoácidos:

   D200, L139, T330, E607, T287, Q221, I49, N479, H594, A502, D653, K658, P130, Q237, A307, Y344, Q430, D449, A644, N649, L671, E673, M39, Q91, M66, W388, I179, L333, R390, Q374, y E5,

   10 en la que cuando la mutación adicional está en la posición D653, la mutación no es D653N, y en la que cuando la mutación adicional está en la posición H594, la mutación no es H594A.
2. 2. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una actividad óptima a una

   temperatura de al menos 50 ºC. 15
3. 3. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que tiene mayor actividad a 50 ºC que la de la enzima de tipo silvestre correspondiente.
4. 4. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que tiene una actividad 20 específica a 37 ºC que es al menos el 125 % de la de la enzima de tipo silvestre correspondiente.
5. 5. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que tiene una termoestabilidad, medida como actividad residual a 37 ºC después de tratamiento a 50 ºC durante 5 minutos, de al menos 1,5 veces la de la enzima de tipo silvestre correspondiente.

   25
6. 6. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que tiene la mutación L603W o M y, opcionalmente, tiene una o más de las siguientes mutaciones adicionales:

   D200N, A o, G, L139P, T330P, E607K, G o A, T287A,

   30 Q221R, I49V o T, N479D, H594R o Q, A502V, D653G, A, H o V, K658R o Q, P130S, Q237R, A307V, Y344H, Q430R, D449G o A, A644V o T, N649S, L671P, E673G o K, M39V o L, Q91R o L, M66L, W388R, I179T o V, L333Q, R390W, Q374R y E5K.

   35
7. 7. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende al menos dos mutaciones.
8. 8. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 7, en la que las al menos dos mutaciones están 40 en D200 y en L603.
9. 9. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 8, en la que las al menos dos mutaciones son D200N y L603W.

   45 10. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 7, en la que las al menos dos mutaciones están en L603, N479 y H594.
10. 11. Una enzima transcriptasa inversa de acuerdo con la reivindicación 10, en la que las al menos dos mutaciones

    son L603W, N479D y H594K. 50
11. 12. Un polinucleótido que codifica la enzima transcriptasa inversa de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

    410