JP6140792B2 - 核酸の生成 - Google Patents

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Description

本発明は、標的タンパク質をコードする核酸を生成するためのプロセスと、該プロセスにより得られる標的タンパク質、例えば核酸プロセシング酵素などの酵素、特に逆転写酵素に関する。
タンパク質進化は、巨大なライブラリからタンパク質を選択し定向進化させるための既知の技術である。選択の基本原理は、特定の表現型（タンパク質）とそれをコードする遺伝子型との間に連結が存在するのを保証することである。この表現型−遺伝子型の連結は、３つの異なる方法で実現することができる。
・ｍＲＮＡディスプレイなどの共有結合を介する方法。最良ではないがファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイなども用いられる。
・親和性相互作用を用いる非共有結合を介する方法。例は、リボソームディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、プラスミドディスプレイである。
・インビトロ区画化（ＩＶＣ）、区画化自己複製（ＣＳＲ）、単純細菌スクリーニング、高処理スクリーニングなどの区画化。
上の段落に示したように、共有結合を介する表現型−遺伝子型関連付けの１例は、ｍＲＮＡディスプレイを用いて達成される。非特許文献１に記載されている通り、ｍＲＮＡと該ｍＲＮＡがコードするペプチド又はタンパク質との間の共有結合を介する融合は、３’末端にピューロマイシン、ペプチジル受容体抗生物質、を有する合成ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により生じさせることができる。
表現型と遺伝子型との間の非共有性結合を介する関連付けは、リボソームディスプレイにより達成することができる。リボソームディスプレイでは、リボソーム、ｍＲＮＡ、及びｔＲＮＡに結合しているタンパク質の非共有結合性三元複合体を形成するために標的タンパク質をコードする１以上のＲＮＡを含むＲＮＡのアレイをインビトロ翻訳系に供する。この三元複合体のアレイは安定化されていなければならない。したがってインビトロ翻訳中に形成される各三元複合体は、末端の終止コドンを欠くｍＲＮＡを用いる。三元複合体は、低温（４℃）及び高濃度のマグネシウム（５０ｍＭ）で更に安定化される。安定な三元複合体では、表現型と遺伝子型との間の関連付けが保存されている。次いで選択工程を行い、タンパク質の性質に基づいて標的タンパク質を選択するが、タンパク質は依然として三元複合体に結合している。次いで選択された三元複合体は分解されてもよく、標的タンパク質に会合しているｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲにより増幅される。
一般にリボソームディスプレイは、異なる標的に結合するペプチド（非特許文献２及び３）及びタンパク質（非特許文献４〜６）の選択に成功裏に適用される。場合によっては、リボソームディスプレイを用いて酵素活性について選択を行うことも可能であり、この場合自殺阻害剤（非特許文献７）又は活性部位リガンド（非特許文献８）を用いてタンパク質の親和性選択を実施する。
インビトロ区画化（ＩＶＣ）では、表現型と遺伝子型との関連付けは、油中水型エマルション内に遺伝子をインビトロ区画化することにより実現される。エマルションを調製するために用いられる遺伝子の数は、水区画の大部分が１以下の遺伝子を含むよう算出される。区画化された遺伝子は、転写され翻訳される。次いで合成されたタンパク質の活性が評価される。タンパク質の活性に基づいてその後の選択を行うことにより、所望の性質を有する活性タンパク質をコードするＤＮＡの増幅産物が得られる。大部分のＩＶＣ用途で用いられる水滴の大きさは２μｍ〜３μｍであり、〜５フェムトリットルの反応体積、及びエマルション１ｍＬ当たり〜１０１０個の油中水型区画（水相５０μＬ）が得られる。ＩＶＣ選択系の最初の成功例は、標的特異的ＤＮＡメチル化活性に基づくものであった（非特許文献９）。ＨａｅＩＩＩメチルトランスフェラーゼの遺伝子が区画化され、転写され、翻訳された。共因子の存在下においてインビトロで合成されたメチルトランスフェラーゼは、自身のＤＮＡをメチル化することができた。ＨａｅＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによる切断に対するメチル化ＤＮＡ（反応産物）の耐性に基づいて、他のＤＮＡ分子よりも耐性が１０７倍高い分子からメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が選択された。
今日までＩＶＣの多くの改良法が設計され実現されている。ＩＶＣ選択を実施する最も容易な方法は、ＤＮＡ修飾酵素、特にＤＮＡメチルトランスフェラーゼを用いる方法である（非特許文献１０及び１１）。ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの活性変異体を選択するために類似の実験ストラテジが適用された（非特許文献１２）。活性制限エンドヌクレアーゼをコードする区画化ＤＮＡは切断され、その後ビオチン−ｄＵＴＰの取り込み、及びストレプトアビジンビーズへの結合により選択された。
ＤＮＡポリメラーゼの進化には異なるＩＶＣ選択ストラテジが適用された（非特許文献１３〜１５）。この新規選択方法は、活性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の「区画化自己複製」（ＣＳＲ）に基づいている。対象タンパク質がインサイチュで発現する通常のＩＶＣとは対照的に、ＣＳＲは好熱性ＤＮＡポリメラーゼを発現する細菌細胞の区画化により実施される。ＰＣＲバッファに再懸濁されプライマー及びｄＮＴＰを添加された細胞は、乳化され、〜１５μｍの大きさの区画が得られる。各水滴は、個別のＰＣＲ区画として機能する。細菌細胞は、初期ＰＣＲ変性工程中破壊され、発現している好熱性ＤＮＡポリメラーゼ及びそれをコードする遺伝子を反応混合物中に放出し自己複製を進行させるが、他の細菌タンパク質は高温により変性される。
ＩＶＣの改良法は、二重水中油中水型エマルションを使用する方法である。１秒当たり１０４変異体超の速度で、油層に取り囲まれている水滴を分析しＦＡＣＳにより選別することができる（非特許文献１６及び１７）。
また結合についてのタンパク質の選択は、ＩＶＣにより実施することもできる。油中水型区画内で発現する対象タンパク質は、共有結合を介して（非特許文献１８）又は非共有結合を介して（非特許文献１９〜２１）該タンパク質をコードする遺伝子に結合する。
区画に封入されたマイクロビーズがタンパク質と遺伝子との結合の中間体として用いられるＩＶＣの他の用途が知られている。マイクロビーズに結合している単一遺伝子が、水滴中で転写され翻訳される。新たに合成されたタンパク質は、反応区画内の同一ビーズ上に捕捉される。エマルションが破壊された後、単離されたビーズを親和性選択に更に用いることができる（非特許文献２２）。通常エマルションは、有機溶媒（ヘキサン、エーテル、クロロホルム）を用いて破壊されるが、該有機溶媒はビーズ上に提示されている特定の酵素の活性を低下させる恐れもあるため、この技術の用途は限定される。触媒活性の選択の場合、マイクロビーズは容易に洗浄され、様々な反応バッファに再懸濁され、第２の乳化工程により再び区画化され得る（非特許文献２３）。しかし強固な酵素−ビーズ−遺伝子複合体は、（立体障害及び酵素の可動性の制限により）必須反応要件を満たすことができない場合があり、結合している酵素の活性が遊離酵素の活性より低い場合がある。更にかかる方法は、多くの追加要素（即ち親和性タグ、抗体、及びビーズ）を用いなくてはならないため技術的に複雑である。
ＩＶＣで用いられるエマルションの組成は、水区画の安定性と、ｍＲＮＡのインビトロ転写及びその後の標的タンパク質の翻訳の効率とを保証するよう設計される。インビトロ進化は、改善されるべき広範な標的を有する。対象タンパク質及び対象酵素の一部は、頑強なハードワーカーであり、様々なバッファ中、特にＩＶＣで用いられる反応混合物中において十分な活性を有することができる。しかし最適条件又は特定条件下でしか機能することができない複雑な酵素も数多く存在する。これに加えてインビトロ進化の第１法則は、「選択する性質を進化させられる（ｙｏｕ ｗｉｌｌ ｅｖｏｌｖｅ ｗｈａｔ ｙｏｕ ａｒｅ ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ｆｏｒ）」ということである。これは、転写／翻訳反応混合物中で進化し、最適化された酵素は、該特定の混合物中で有効に機能するが、自然界で該酵素が存在するバッファ中における性能はそれよりも遥かに劣る場合が多いことを意味する。酵素の機能する条件は、区画内におけるタンパク質発現に用いられるインビトロ転写及び翻訳混合物に適合しない場合もある。部分的な解決法は、ナノ滴送達系を用いてエマルション区画に異なる溶質を輸送することである（非特許文献２４）。油中水型エマルションを用いる更により洗練された操作法は、マイクロ流体装置を使用して行うことができる。高単分散性一重エマルション又は二重エマルション（非特許文献２５及び２６）は、１秒当たり最高１０，０００水滴の速度で調製することができる。生成された水区画は、マイクロ流体チャネルに輸送され、融合し、更に分割され、選別され得る（非特許文献２７及び２８）。それにもかかわらず区画内のバッファを完全に交換することは依然として困難である。
逆転写酵素は、ｍＲＮＡ標的からｃＤＮＡを合成するために用いられる非常に重要な商用酵素である。逆転写酵素の性質を改善するために多くの研究が行われている。しかし逆転写酵素のインビトロ進化に適した適切に機能する選択系は今日まで知られていない。ほぼ全ての改良が行われており、高処理スクリーニング及び合理的設計を用いて逆転写酵素の突然変異体が選択される。
リボソームディスプレイ（ＲＤ）もインビトロ区画化（ＩＶＣ）も、十分な活性を有する逆転写酵素の選択には用いることができない。通常リボソームディスプレイで用いられる三元複合体は、逆転写酵素の選択を実施するために必要な高温において安定ではなく、結果として表現型と遺伝子型との間の関連付けが失われる。リボソームディスプレイで用いられる比較的安定な三元複合体は、合成インビトロ翻訳抽出キットＷａｋｏＰＵＲＥを用いて生成することができるが（非特許文献２９）、リボソーム及びｍＲＮＡに固定されているインビトロで翻訳された逆転写酵素は、完全長ｃＤＮＡの合成中大きな立体障害を受ける。固定されている酵素は、トランス型及びシス型で作用する可能性もあるが、表現型−遺伝子型の関連付けが保存されないため、これもタンパク質進化ストラテジには不適合である。
一般にＩＶＣは、遺伝物質としてＤＮＡを使用する。ｍＲＮＡのインビトロ転写及び標的タンパク質の翻訳は、空間的に分離された乳化水区画内で、ＤＮＡの存在下において実施される。逆転写酵素のインビトロ進化の場合、コーディングＤＮＡ配列が存在すると逆転写酵素活性の選択の主な要件が満たされないため、ｃＤＮＡをデノボ合成しなければならない。換言すれば、優れた逆転写酵素変異体の選択は、ｍＲＮＡから自身のコーディングＤＮＡを合成する酵素の能力に基づいている。新規に合成されたｃＤＮＡはＰＣＲにより増幅しなければならないため、ｃＤＮＡは反応における唯一のＤＮＡ源であるべきである。ＩＶＣ選択で用いられるＤＮＡは、ｃＤＮＡと共に増幅し基本的な選択スキームを無効にする。
水区画内に封入されているマイクロビーズの使用（非特許文献２２及び２３）などのインビトロ区画化のより洗練された変法により、反応バッファを全て交換することが可能になる。このアプローチでは、強固な選択ユニットであるｍＲＮＡ−マイクロビーズ−タンパク質が得られるマイクロビーズを介した表現型−遺伝子型の関連付けが実現するが、逆転写酵素の場合、この方法でも立体障害が生じ、結果としてｃＤＮＡ合成の効率が低下する場合がある。
〜３００ヌクレオチド長のｃＤＮＡを合成することができるＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、ファージディスプレイ技術を変更した方法を用いて選択された（非特許文献３０）。このアプローチは機能するが、幾つか問題点がある：１）全てのタンパク質をファージ上に提示することはできない、２）選択にビオチン標識ヌクレオチドを使用することが絶対条件である、３）提示された酵素はトランス型及びシス型で機能することができる、４）立体障害及び酵素の可動性の制限により、ファージ−酵素−ＤＮＡ／ＲＮＡ複合体がｃＤＮＡの効率的合成に干渉する場合がある。
逆転写酵素の選択の可能性については特許文献１にも記載されており、これは区画化自己複製（ＣＳＲ）法に関する。ＣＳＲ技術を用いて、好熱性ＤＮＡポリメラーゼ、特にＴａｑＤＮＡポリメラーゼが選択される（非特許文献１３〜１５）。好熱性ＤＮＡポリメラーゼの突然変異体ライブラリを発現する細菌細胞をＰＣＲ混合物に懸濁させ、乳化させて、より活性の高いポリメラーゼをインビトロで選択するための個別のＰＣＲ区画を得る。
細菌ＲＮａｓｅは中程度の温度で活性を保ち標的ｍＲＮＡを分解するため、逆転写酵素活性の選択は、現実には細菌ＲＮａｓｅの存在により阻止される。また選択されなかったプラスミドＤＮＡ（細菌細胞から放出された）、並びに大腸菌酵素、構造タンパク質、リボソーム、ＮＴＰ、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、及び低分子量分子全ての存在に由来するＤＮＡが夾雑する。
国際公開第０２２２８６９号パンフレット
Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７） Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４ Ｍａｔｓｕｕｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００３ Ｈａｎｅｓ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９７ Ｈｅ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｇ，１９９７ Ｉｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ａｍｓｔｕｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｔａｗｆｉｋ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，１９９８ Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｇｈａｄｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｇｈａｄｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｂｅｒｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｎｅｒｉ，２００４ Ｄｏｉ ａｎｄ Ｙａｎａｇａｗａ，１９９９ Ｙｏｎｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｓｅｐｐ ａｎｄ Ｃｈｏｏ，２００５ Ｓｅｐｐ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｔａｗｆｉｋ，２００３ Ｂｅｒｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｔｈｏｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｏｋｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，２００４ Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７ Ｖｉｃｈｉｅｒ−Ｇｕｅｒｒｅ ｅｔ．ａｌ，２００６
本発明の目的は、先行技術の方法の問題点を克服したタンパク質進化の改良方法を提供することにある。
したがって第１の態様では、本発明は、標的タンパク質をコードする核酸を生成するプロセスであって、
（ａ）該標的タンパク質をコードする１以上のＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子のアレイを提供する工程と、
（ｂ）該アレイから標的タンパク質を生成して、該ＲＮＡ分子又は該ＤＮＡ分子が非共有結合又は共有結合で結合されているＲＮＡ−タンパク質複合体又はＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する工程と、
（ｃ）区画の大部分又は全てが１以下の該複合体を含むように該複合体を区画内に分離する工程と、
（ｄ）タンパク質を活性化させる反応条件に該複合体を供する工程と、
（ｅ）関連する活性に基づいて該標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程と、
を含み、
該複合体が、該ＤＮＡが非共有結合で結合されているＤＮＡ−タンパク質複合体であるとき、工程ｂ）は、各複合体に対する個別の区画の非存在下で実施されるプロセスを提供する。
本発明は、２種の異なる種類の表現型−遺伝子型関連付けを利用する方法を考案し、研究室内でタンパク質を進化させる方法で用いるための新規選択系を得た。以下に更に記載する本方法の新規特徴により、先行技術の方法と比べてより広範な標的タンパク質に本方法を適用することが可能になり、また本方法は先行技術よりも使用が容易であり適応性が高い。具体的には本発明は、分子生物学者の使用するツールの中でも最も重要な酵素群の１つである逆転写酵素の性質を進化させ改善できる可能性を初めて提供する。
この態様の１つの実施形態では、本発明は、標的タンパク質をコードする核酸を生成するプロセスであって、
（ａ）該標的タンパク質をコードする１以上のＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子のアレイを提供する工程と、
（ｂ）該アレイから標的タンパク質を生成して、ＲＮＡ−タンパク質複合体又はＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する工程と、
（ｃ）区画の大部分又は全てが１以下の該複合体を含むように該複合体を区画内に分離する工程と、
（ｄ）タンパク質を活性化させる反応条件に該複合体を供する工程と、
（ｅ）関連する活性に基づいて該標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程と、
を含み、
該ＲＮＡ−タンパク質複合体において該ＲＮＡが非共有結合又は共有結合で結合されており、該ＤＮＡ−タンパク質複合体において該ＤＮＡが共有結合で結合されているプロセスを提供する。
この態様の第２の実施形態では、本発明は、標的タンパク質をコードする核酸を生成するプロセスであって、
（ａ）該標的タンパク質をコードする１以上のＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子を含むＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子のアレイを提供する工程と、
（ｂ）該アレイから標的タンパク質を生成して、該ＲＮＡ分子又は該ＤＮＡ分子が非共有結合又は共有結合で結合されているＲＮＡ−タンパク質複合体又はＤＮＡ−タンパク質複合体を形成する工程と、
（ｃ）区画の大部分又は全てが１以下の該複合体を含むように該複合体を該区画内に分離する工程と、
（ｄ）タンパク質を活性化させる反応条件に該複合体を供する工程と、
（ｅ）関連する活性に基づいて該標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程と、
を含み、
工程ｂ）は、各複合体に対する個別の区画の非存在下で実施されるプロセスを提供する。
次に１例として添付図面を参照して本発明を更に詳細に説明する。
図１は、実施例１の実験スキームである。２つのプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ（プロテインＤのスペーサに融合しているモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする）及びｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（プロテインＤのスペーサに融合している不活化（ｐｏｌドメインの５７個のアミノ酸が欠失）モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする）を用いてＰＣＲ断片を合成した。この先該ＰＣＲ断片は、３’末端の終止コドンを欠くｍＲＮＡの転写反応及び合成で用いられる。精製ｍＲＮＡを１：５０＝ＭＬＶ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ（不活性ＲＴ）の比で混合し、インビトロ翻訳反応に用いる。翻訳反応中リボソーム複合体はタンパク質を合成し、終止コドンを欠くｍＲＮＡの末端で停止する。三元複合体（ＴＣ）の混合物をショ糖クッション溶液上で超遠心により精製する。インビトロ翻訳ＭＬＶ逆転写酵素に連結しているｍＲＮＡを既に含有している精製三元複合体（３×１０９個未満の分子が回収された）を用いて、ＲＴ反応用外因性ｄＮＴＰセット及びプライマーを添加した逆転写反応混合物を調製する。氷冷ＲＴ反応混合物を乳化させ、〜２μｍの大きさの〜１×１０１０個の油中水型区画を得る。ＲＴ反応を実施するために、乳化されたＲＴ反応混合物（１区画当たりＴＣ（ｍＲＮＡ＋ＭＬＶ ＲＴ）１個未満）を４２℃で１時間インキュベートする。区画化ＲＴ反応混合物の温度を上昇させると、大部分のＴＣは解離し、ｍＲＮＡ及び逆転写酵素を放出する。活性ＭＬＶ逆転写酵素（ＭＬＶ＿ｐＤ）を含む区画においてのみＲＴ反応が成功し、不活性逆転写酵素（ｄｅｌ＿ｐＤ）を含む区画ではｃＤＮＡは合成されない。その後ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅させると、不活性逆転写酵素（ｄｅｌ＿ｐＤ）に比べて活性逆転写酵素（ＭＬＶ＿ｐＤ）遺伝子が富化されていることが観察される。 図２は、ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤプラスミドの構造スキームである。 図３は、実施例１の結果を示す。ＣＲＤ選択中に合成されたｃＤＮＡに対して実施された第１のＰＣＲのアガロースゲル電気泳動結果である。用いたプライマーは、ＲＤ＿Ｎｄｅ（配列番号９）及びｐＤ＿５５（配列番号１０）である。ＰＣＲ断片の予想された長さは、ＭＬＶ＿ｐＤが２，１８５ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤが２，０１４ｂｐであった。増幅結果は、１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上で解析した。 図４は、実施例１の結果を示す。第１のＰＣＲ産物に対して実施された遺伝子の一部を増幅させるネステッドＰＣＲのアガロースゲル電気泳動結果である。用いたプライマーは、Ｍ＿Ｆ（配列番号１１）及びＭ＿２Ｒ（配列番号１２）である。ＰＣＲ断片の予想された長さは、ＭＬＶ＿ｐＤａが９０７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤが７３６ｂｐであった。増幅結果は、１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上で解析した。 図５は、実施例１の結果を示す。第１のＰＣＲ産物に対して実施された遺伝子全体を増幅させるネステッドＰＣＲのアガロースゲル電気泳動結果である。用いたプライマーは、Ｍ＿Ｅｓｐ（配列番号１３）及びＭ＿Ｅｒｉ（配列番号１４）である。ＰＣＲ断片の予想された長さは、ＭＬＶ＿ｐＤａが２，０７７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤが１，９０６ｂｐであった。増幅結果は、１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上で解析した。 図６は、実施例２におけるＣＲＤ選択の実験スキームである。逆転写酵素（プロテインＤと融合している）の突然変異体ライブラリをコードするＰＣＲ断片であるＭＬＶ＿ｐＤを用いてｍＲＮＡを合成した。精製ｍＲＮＡをインビトロ翻訳反応に用いた。ｍＲＮＡ−リボソーム−ＭＬＶ＿ｐＤ（ｔＲＮＡ）の三元複合体（ＴＣ）が翻訳混合物中で形成され、低温及び高濃度Ｍｇ２＋イオンにより安定化された。ショ糖クッション溶液上で超遠心することによりＴＣの混合物を精製した。沈殿したＴＣを氷冷バッファ（５０ｍＭ Ｍｇ２＋）に溶解させ、ＲＴ反応用外因性ｄＮＴＰセット及びプライマーを添加した逆転写反応混合物を調製するために用いた。氷冷ＲＴ反応混合物を乳化させ、〜２μｍの大きさの〜１×１０１０個の油中水型区画を得た。ＭＬＶ ＲＴの最適反応温度は〜４２℃である。高温でより良好に機能する逆転写酵素変異体を選択するために、乳化されたＲＴ反応混合物（１区画当たりＴＣ（ｍＲＮＡ＋ＭＬＶ ＲＴ）１個未満）を５０℃で１時間インキュベートする。この温度において、より活性の高い又はより熱安定性の高いＭＬＶ逆転写酵素変異体を含有している区画において、完全長ｃＤＮＡの合成が成功裏に実施された。その後ＰＣＲを用いて完全長ｃＤＮＡを増幅させ、より活性が高く且つより熱安定性の高い逆転写酵素遺伝子を富化させた。ライゲーションＰＣＲによりインタクトな５’配列（ＳＴＡＲＴ断片−Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＤ、及びｈｉｓタグコーディング配列）及び３’配列（ＥＮＤ断片−ｇｓリンカー、プロテインＤ、及び第２のｇｓリンカー）を修復して、ＰＣＲにより増幅された遺伝子をＣＲＤフォーマットに戻した。逆転写酵素遺伝子の富化ライブラリを含有している再構築ＰＣＲ断片を、後のｍＲＮＡ転写及び次のＣＲＤ選択ラウンドで用いた。ＲＴ反応温度を徐々に上げて５０℃（第１ラウンド）、５２．５℃（第２ラウンド）、５５℃（第３ラウンド）、５７．５℃（第４ラウンド）、及び６０℃（第５ラウンド）で各選択ラウンドを実施した。 図７は、ＣＲＤ選択の新ラウンド前に行われるＰＣＲ断片再構築のスキームである。ＣＲＤ選択に好適なＰＣＲ断片を得るために、突然変異ＭＬＶ ＲＴライブラリをＥｓｐ３Ｉ（ＮｃｏＩ適合末端）及びＥｃｏＲＩで切断し、ＳＴＡＲＴ断片（２４４ｂｐ）及びＥＮＤ断片（３９８ｂｐ）とライゲーションさせた。初期９８３ｂｐ ＳＴＡＲＴ断片をＰＣＲで増幅させ（標的−プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（配列番号２）、プライマー−ｐｒｏ−ｐＩＶＥＸ（配列番号３）及びＭ＿１Ｒ（配列番号１５））、次いでＮｃｏＩ（認識配列Ｃ↓ＣＡＴＧＧ）で切断して２４４ｂｐのＤＮＡ断片を得ることにより、ＳＴＡＲＴ断片（Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＤ、及びｈｉｓタグコード配列を含む）を構築した。初期１，０３９ｂｐ ＥＮＤ断片をＰＣＲで増幅させ（標的−プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（配列番号２）、プライマー−Ｍ＿３Ｆ（配列番号１６）及びｐＤ−ｔｅｒ（配列番号４））、次いでＥｃｏＲＩ（認識配列Ｇ↓ＡＡＴＴＣ）で切断し、３９８ｂｐのＤＮＡ断片を得ることにより、ＥＮＤ断片（ｇｓリンカー、プロテインＤ、及び第２のｇｓリンカー配列を含む）を構築した。 図８は、３７℃、５０℃で測定したＲＴ突然変異体の逆転写酵素活性、及び５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における残存活性を示す。３７℃における逆転写酵素活性は常に１００％に正規化され、省略される。従って２種の列（５０℃におけるＲＴ活性の割合、及び５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における残存ＲＴ活性の割合）のみを示す。対照として、突然変異体ライブラリの構築に用いた野生型Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を示す。この一次酵素は、ＲＴの突然変異体と同種のベクター内で発現し、同様の方法で精製される。試験した突然変異体全てについて５０℃における突然変異体のＲＴ活性の平均値は、約〜９２％であり、これは野生型酵素のＲＴ活性（４５％）に比べて２倍超高い。５０℃で５分間プレインキュベートした後の３７℃におけるＲＴ突然変異体の平均残存活性は１２％である（野生型酵素は１１％）。 図９は、３７℃で１０分間測定したときの、部分的に精製された野生型ＲＴ及びＲＴ突然変異体の比活性（ｕ／ｍｇタンパク質）を示す。 図１０は、ＦＡＣＳを用いたＣＲＤ選択の提案実験スキームを示す。対象タンパク質は、リボソームディスプレイフォーマットで提示される。ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質（ｔＲＮＡ）を含む精製された（又は単に多数回希釈された）三元複合体を反応バッファ中で非蛍光基質（Ｓ）と混合し、次いで乳化させて二重水中油中水型エマルションを生成する。区画化酵素の活性変異体は、基質（Ｓ）を蛍光生成物（Ｐ）に変換し、ＦＡＣＳにより蛍光（活性酵素内部）滴と「暗」（不活性酵素内部）滴とを区別することを可能にする。 図１１は、ＣＲＤを用いた熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの選択及び進化の提案実験スキームである。対象ポリメラーゼは、リボソームディスプレイフォーマットで提示されなければならない。ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリメラーゼを含む任意的に精製された（又は単に多数回希釈された）三元複合体を用いて、ＰＣＲバッファ中に逆転写酵素（ヘルパー酵素）、ｄＮＴＰ、及びプライマーセットを含む反応混合物を調製することができる。反応溶液は、乳化され油中水型エマルションを生成するはずである。第１のＲＴ工程では、逆転写酵素はｃＤＮＡを合成しなければならないが、その理由は該ｃＤＮＡが第２のＰＣＲ工程（リボソームディスプレイされたＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ増幅工程である）の標的として後に機能するためである。ＰＣＲで用いられるプライマーの１つは、ストレプトアビジンビーズ及び非相補的５’末端と共に任意的なその後の精製に用いるためのビオチンを有していてもよい。ＲＴ−ＰＣＲ後エマルションは破壊されるべきであり、新規に合成されたＤＮＡ断片をビオチンを介して精製し、新規プライマーセットであって一方のプライマーがｃＤＮＡに非相補的である配列を有するが、第１の増幅反応（ｃＤＮＡバックグラウンドに対して行われるＤＮＡの選択的増幅）で用いられたプライマーの５’部分と同一であるプライマーセットを用いて再増幅させてもよい。ＤＮＡポリメラーゼの高活性変異体が低活性変異体よりも富化され、更なる分析又は次の選択ラウンドで用いることができる。 図１２は、実施例４の実験スキームを示す。この実験構成では、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして用いる。２つのプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（プロテインＤスペーサに融合しているＲＮａｓｅＨマイナスモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする）及びｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（プロテインＤのスペーサに融合している不活化逆転写酵素（ｐｏｌドメインの５７個のアミノ酸が欠失、且つＲＮａｓｅＨドメインに点変異Ｄ５８３Ｎ）をコードする）を用いてＰＣＲ断片を合成した。この先該ＰＣＲ断片は転写反応で用いられる。精製ｍＲＮＡを１：２０＝ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ＿ｐＤ（不活性ＲＴ）の比で混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｍＲＮＡ混合物にｄｓＤＮＡをライゲーションすることにより、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体を調製するために用いる。ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体をインビトロ翻訳反応で用いた。翻訳反応中リボソーム複合体は、タンパク質を合成し、ｍＲＮＡの末端（ｍＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドの始まり）で停止する。三元複合体（ＴＣ）の混合物は、ショ糖クッション溶液上で超遠心することにより精製される。インビトロ翻訳ポリメラーゼ（Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素）に連結しているｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡを既に含有している精製三元複合体（３×１０９個未満の分子が回収された）を用いて、外因性ビオチン−ｄＵＴＰを添加した伸長反応混合物を調製する。氷冷反応混合物を乳化させ、〜２μｍの大きさの〜１×１０１０個の油中水型区画を得る。ビオチン化ヌクレオチドを取り込むために、乳化された伸長反応混合物（１区画当たりＴＣ（ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ＋ポリメラーゼ）１個未満）を３７℃で３０分間インキュベートする。区画化反応混合物の温度を上昇させると、大部分のＴＣは解離し、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体及びポリメラーゼを放出する。活性ポリメラーゼ（逆転写酵素−ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ）を含む区画においてのみｄｓＤＮＡ基質に対する取り込み反応が成功し、不活性ポリメラーゼ（ｄｅｌ＿ｐＤ）を含む区画ではｃＤＮＡが合成されない。エマルションが破壊された後、ゲル濾過ミニカラムを用いて過剰のビオチン−ｄＵＴＰが除去される。ビオチン化ｍＲＮＡ／ｄｓＲＮＡ複合体は、ストレプトアビジンビーズ上で精製され、ｃＤＮＡを合成するために用いられる。その後ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅させると、不活性ポリメラーゼ（ｄｅｌ＿ｐＤ）遺伝子に比べて活性ポリメラーゼ（逆転写酵素−ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ）遺伝子が富化されていることが観察される。 図１３は、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体及び自己プライマー化（ｓｅｌｆ ｐｒｉｍｅｄ）ｍＲＮＡへのビオチン−ｄＵＴＰの取り込み効率の測定結果を示す。ｄＴＴＰ、又はビオチン−ｄＵＴＰの取り込み後、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ）及びｍＲＮＡ（ｄｅｌ＿ｐＤ）のサンプルに対して実施されたＲＴ−ＰＣＲの写真である。予測されるアンプリコンの大きさは、ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤが９０７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤ ｃＤＮＡが７３６ｂｐである。１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を解析した。 図１４は、ｄＴＴＰ（ビオチン−ｄＵＴＰ）及び［α−Ｐ３３］ｄＡＴＰの取り込みによるｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体の存在の一般的制御を示す。ｄＴＴＰ、又はビオチン−ｄＵＴＰの最初の取り込み後、連続して放射性ｄＡＴＰがｄｓＤＮＡ基質に取り込まれるはずである。図１４Ａは、エチジウムブロマイドで可視化したアガロースゲル（ｍＲＮＡ、又はｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡのバンド 〜２．５ｋｂ）を示す。図１４Ｂは、濾紙上で乾燥させ、Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて可視化したＡと同一ゲルを示す。標識ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体及び／又はｄｓＤＮＡのみのバンドが見られる。図１４Ｃは、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体中のｄｓＤＮＡ相当部の構造及び配列を示す。 図１５は、実施例４の最後のＲＴ−ＰＣＲ断片解析の結果を示す。予測されるアンプリコンの大きさは、ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤで９０７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤ ｃＤＮＡで７３６ｂｐである。１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上でＰＣＲ産物を解析した。ストレプトアビジンビーズ前では、ＲＴ−ＰＣＲサンプルの活性ポリメラーゼ遺伝子対不活性ポリメラーゼ遺伝子の比は１：２０に相当する（殆どｄｅｌ＿ｐＤ断片〜７３６ｂｐのみ視認可能）。ストレプトアビジンビーズ上で精製した後のＲＴ−ＰＣＲサンプルでは、１回選択ラウンドを行った後の活性ポリメラーゼ遺伝子対不活性ポリメラーゼ遺伝子の比は１：１に相当する。この選択における濃縮係数は〜２０である。 図１６は、１ｋｂ及び４．５ｋｂのｃＤＮＡ合成反応の最高温度を決定するために用いられるアルカリアガロースゲル解析の幾つかの例を示す。ＰＣＲ機器は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔを用いた。図１６Ａ〜図１６Ｄ−１ｋｂ ｃＤＮＡ合成（Ｍ−ＭｕＬＶ（野生型）、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、及びＱ２２１Ｒ）；温度勾配４１．９℃、４３．６℃、４５．５℃、４７．８℃、５０．４℃、５３．１℃、５５．８℃、５８．１℃、６０．１℃、６２．１℃；サイズ標準−ＤＮＡ Ｆａｓｔ Ｒｕｌｅｒ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒａｎｇｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。図１６Ｅ〜図１６Ｇ−４．５ｋｂのｃＤＮＡ合成（Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４）；温度勾配４９．８℃、５１．５℃、５３．４℃、５５．７℃、５８．３℃、６１．０℃、６３．７℃、６６．１℃、６８．０℃、７０．０℃；サイズ標準−Ｚｉｐ Ｒｕｌｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
表１は、初期ＭＬＶ ＲＴライブラリで見られる突然変異の一般的スキーム（ＮｃｏＩ制限酵素部位とＥｃｏＲＩ制限酵素部位と間の配列（配列番号２４））を示す。１０の配列決定された遺伝子中で２３ヌクレオチドの突然変異が見られ（１箇所の塩基転換、２０箇所の変化（突然変異位置に下線を引き、配列の上方に突然変異を示す）、２箇所の欠失（下線を引き、配列の上方に点線で示す））、アミノ酸置換が１５箇所、サイレント突然変異が６箇所、終止コドンが１箇所、及びコードフレームのフレームシフトが２箇所生じている。これは１遺伝子当たり平均して１〜２個のアミノ酸置換にあたる。
表２Ａ〜表２Ｎは、文献で通常用いられているのと同様のアミノ酸の数表現（ｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）を用いるために、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含まない全１０４タンパク質の配列のＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメントを示す。ＭＬＶと表記される野生型配列（配列番号２５）を常に最初の配列（突然変異配列は、示される順序に基づいて配列番号２６〜配列番号１２８を表す）として用いる。突然変異は、黒色背景中に白色フォントを用いて示す。その突然変異がＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の性質をいくらか改善するアミノ酸位置及び異なる特許出願に記載されているアミノ酸位置を、灰色で強調されたアミノ酸（白色フォント）の列としてアラインメント中に示す。本発明の選択から得られた突然変異であって、灰色の列に位置する突然変異は、本発明の選択手順が有益なホットスポットを正確に標的としていること、又は他の文献に記載されている正確なアミノ酸突然変異さえも標的としていることを示す。５０℃における活性が一次野生型Ｍ−ＭｕＬＶの活性と比べて実質的に優れている被分析タンパク質の配列（野生型活性４５％に比べて７０％超）を灰色で強調する。
表３Ａ〜表３Ｄは、選択された全ＲＴ変異体で見出された突然変異の一覧を示す。タンパク質は突然変異の数で降順に並び替えた。
表４Ａ〜表４Ｎは、選択されたＲＴ変異体の突然変異頻度を示す（降順）。５０℃における活性が一次野生型Ｍ−ＭｕＬＶの活性と比べて実質的に優れている（野生型活性４５％に比べて７０％以上）被分析タンパク質の名称を灰色で強調する。
表５Ａ〜表５Ｃは、Ｍ−ＭｕＬＶ（野生型）逆転写酵素及び単一突然変異体に関するデータを要約した表である。タンパク質の名称；選択頻度（正確な突然変異数を有する配列決定された突然変異の数、括弧内の数字は選択で見出された特定のアミノ酸突然変異の合計数を示す）；タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）；３７℃における逆転写酵素の比活性（ｕ／ｍｇ）；５０℃における相対活性；タンパク質のＲＮａｓｅＨ比活性（ｕ／ｍｏｌ）；５０℃における相対活性（％）；５０℃で５分間酵素をインキュベートした後の３７℃における相対残存活性（％）；タンパク質のＲＮａｓｅＨ比活性（ｕ／ｍｏｌ）；相対ＲＮａｓｅＨ活性（％）及び１ｋｂのｃＤＮＡを合成可能な最高温度を含む。
表６は、Ｍ−ＭｕＬＶ（野生型）逆転写酵素及び単一突然変異に関するデータを要約した表である。タンパク質の名称；タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）；３７℃における逆転写酵素の比活性（ｕ／ｍｇ）；５０℃における相対活性（％）；並びに１ｋｂ及び４．５ｋｂのｃＤＮＡを合成可能な最高温度を含む。
表７Ａ〜表７Ｍは、配列番号１〜配列番号２３に関する配列及び情報を示す。
ＤＮＡ又はＲＮＡと標的タンパク質との間の共有結合を介する関連付けは、例えばｍＲＮＡディスプレイ、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、又は酵母ディスプレイなどの当該技術分野において既知である技術のいずれによっても行うことができる。具体的には共有結合を介するＲＮＡ−タンパク質関連付けは、ｍＲＮＡディスプレイの技術を用いて行うことができ、一方共有結合を介するＤＮＡ−タンパク質連結は、共有結合抗体ディスプレイ（ＣＡＤ）の技術を用いて（Ｒｅｉｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）、共有結合ＤＮＡディスプレイにより区画内で翻訳を実施することにより（Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｎｅｒｉ，２００４）、又はＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００５）に記載されている技術などの類似の共有結合ディスプレイ技術を用いて行うことができる。
またＤＮＡ又はＲＮＡと標的タンパク質との間の非共有結合を介する関連付けは、例えばリボソームディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、又はプラスミドディスプレイなどの当該技術分野において既知である技術のいずれによっても行うことができる。具体的には非共有結合を介するＤＮＡ−タンパク質の関連付けは、ＣＩＳディスプレイを用いて区画の非存在下で行うことができ（Ｏｄｅｒｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，２００４）、一方非共有結合を介するＲＮＡ−タンパク質の関連付けは、リボソームディスプレイの技術を用いて行うことができる。
上記の通り、複合体が、該ＤＮＡが非共有結合で結合されているＤＮＡ−タンパク質複合体であるとき、本発明のプロセスの工程（ｂ）は各複合体に対する個別の区画の非存在下で実施される。換言すれば工程（ｂ）は、区画化されていない状態で行われる。具体的には複合体が、該ＤＮＡが非共有結合で結合されているＤＮＡ−タンパク質複合体であるとき、生成工程はアレイの各構成要素が互いに分離されることなしに実施される。具体的には生成工程は、インビトロ区画化（ＩＶＣ）によりアレイの各構成要素が分離されることなしに実施される。特に好ましい実施形態では、生成工程は、油中水型エマルション内にアレイの各構成要素を分離することなしに実施される。
また区画化は、区画の全て又は実質的に全てが１以下の複合体を含むように複合体を生成又は分離することができる当該技術分野において既知である方法のいずれを用いて実施することもできる。具体的には該区画の少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％が１以下の複合体を含むことが好ましい。例えば区画化は、マイクロタイタープレート若しくはナノタイタープレート上の異なるウェルにアレイの構成要素若しくは各複合体を分離することにより、又はインビトロ区画化（ＩＶＣ）により実施することができる。具体的にはＩＶＣによる分離は、油中水型エマルション又は水中油中水型エマルション中の水滴に分離することを含んでいてもよい。
本発明の方法は、共有結合を介する関連付け、非共有結合を介する関連付け、及び区画化から選択される表現型−遺伝子型関連付けのうちの少なくとも２種の異なる種類を組み合わせる。本発明の好ましい態様では、該方法は、これら関連付けのうちの２以下を利用する。したがって特に好ましい実施形態では、該方法は、工程ｂ）における唯一の遺伝子型−表現型関連付けとして共有結合を介する関連付け又は非共有結合を介する関連付けを利用する。換言すればこの実施形態では、工程ｂ）において区画化は行われない。
区画の非存在下におけるＤＮＡ又はＲＮＡとタンパク質との間の共有結合／非共有結合を介する関連付けは、多くの異なる方法、例えばリボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９７）、ＣＩＳディスプレイ（Ｏｄｅｒｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，２００４）、又は共有結合抗体ディスプレイ（ＣＡＤ）（Ｒｅｉｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００５）により確立することができる。具体的には共有結合を介するＤＮＡ−タンパク質関連付けは、ＣＡＤ技術を用いることにより区画の非存在下で実現することができ、一方共有結合を介するＲＮＡ−タンパク質関連付け及び非共有結合を介するＲＮＡ−タンパク質関連付けは、それぞれｍＲＮＡディスプレイ及びリボソームディスプレイにより確立することができる。
本発明は、多くの異なる関連付けの組み合わせを介して実現することができる。例えば本発明は、リボソームディスプレイとインビトロ区画化との組み合わせ、又はｍＲＮＡディスプレイ、ＣＩＳディスプレイ、若しくはＣＡＤディスプレイとＩＶＣとの組み合わせを介して実現することができる。
好ましい態様では、標的タンパク質をコードする核酸を生成するプロセスは、リボソームディスプレイとインビトロ区画化との組み合わせを介して実現される。具体的にはかかるプロセスは、
（ａ）標的タンパク質をコードする１以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡのアレイを提供する工程と、
（ｂ）リボソーム翻訳のための条件下で該ｍＲＮＡのアレイをインキュベートして、ｍＲＮＡ、リボソーム、及び該ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質を含む三元複合体のアレイを作製する工程と、
（ｃ）水相滴の大部分又は全てが１以下の該三元複合体を含むように油中水型エマルション又は水中油中水型エマルションの水相滴に該三元複合体のアレイを取り込む工程と、
（ｄ）タンパク質を活性化させる反応条件に該水相滴を供する工程と、
（ｅ）関連する酵素活性に基づいて該標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程と、
を含む。
本発明に係るプロセスは、「区画化リボソームディスプレイ」（ＣＲＤ）と呼ばれることもある。ＣＲＤは、酵素を含む広範な標的タンパク質に適用可能である。ＣＲＤは、酵素とｍＲＮＡとの間の関連付けが非共有結合であるという利点を有する。したがって工程（ｄ）で用いられる反応条件が高温を含む場合、工程（ｂ）で生成される該三元複合体は崩壊し、酵素が放出される。これにより酵素がビーズに固定されている先行技術の方法における酵素の可動性に関連する上記問題を避けられる。
リボソームディスプレイ複合体内部のエマルション滴は、多くの方法で工程（ｅ）において選別又は選択することができる。該エマルション滴は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、又はマイクロ流体技術を用いて選別されることが好ましい。両方の技術は、主に蛍光に基づく該エマルション滴選別を利用する。しかし該エマルション滴は、工程（ｄ）で用いられる反応条件、及び選択されるタンパク質の活性に依って、大きさ、光拡散又は光吸収により分離することもできる。
蛍光に基づく選別方法は、標的タンパク質が酵素であるときに用いられることが好ましい。この実施形態では、工程（ｄ）で使用される反応条件は、蛍光生成物に変換され得る非蛍光基質を含む。酵素活性により蛍光生成物が生じるため、ＦＡＣＳを用いて活性酵素を含む蛍光滴と、不活性酵素を含む非蛍光滴又は低活性酵素を含む低蛍光滴とを区別することが可能になる。
具体的にはＣＲＤは、逆転写酵素などの核酸プロセシング酵素に適用することができ、迅速且つ効率的なインビトロ進化を可能にする。
更なる態様では、本発明は、標的タンパク質をコードする核酸を生成するプロセスであって、
（ａ）該標的タンパク質をコードする１以上のｍＲＮＡを含み、該ｍＲＮＡが該標的タンパク質を含む酵素又はその補酵素の基質を含むｍＲＮＡのアレイを提供する工程と、
（ｂ）リボソーム翻訳のための条件下で該ｍＲＮＡのアレイをインキュベートして、ｍＲＮＡ、リボソーム、及び該ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質を含む三元複合体のアレイを作製する工程と、
（ｃ）水相滴の大部分又は全てが１以下の該三元複合体を含むように油中水型エマルション又は水中油中水型エマルションの水相滴に該三元複合体及び任意的に補酵素のアレイを取り込む工程と、
（ｄ）タンパク質を活性化させる反応条件に該水相滴を供する工程と、
（ｅ）関連する酵素活性に基づいて該標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程と、
を含むプロセスを提供する。
本発明のこの態様の１つの実施形態では、核酸プロセシング酵素がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである場合、工程（ａ）のｍＲＮＡは二本鎖ＤＮＡアダプタ分子にライゲーションされ、基質を提供することができる。
ＣＲＤの分子多様性は約１０９変異体〜１０１０変異体であり、ＩＶＣ工程により限定される。新規方法は、逆転写酵素の約１０５突然変異体〜１０６突然変異体のスクリーニングに用いることができる高処理スクリーニング（ＨＴＳ）に比べて遥かに効率的であり、必要とする時間が短く、コストが低い。ＣＲＤの多様性は、ＨＴＳと比べて約４桁高いため、ＨＴＳによるスクリーニングで漏れた多くの有益な突然変異体を区画化リボソームディスプレイ選択により容易に探し出すことができる。
工程（ａ）に従って、典型的には合成ｍＲＮＡであるｍＲＮＡのアレイが提供され、該アレイは標的タンパク質をコードする１以上のアレイ構成要素を含む。標的タンパク質が逆転写酵素である場合、ｍＲＮＡは、標的タンパク質を含む酵素又はその補酵素の基質を含む。後の選択工程（ｅ）では、該標的タンパク質をコードする核酸は、関連する酵素活性に基づいて選択される。この方法では、本発明の２つの実施形態が考えられる。１つは、該酵素活性が該標的タンパク質によりもたらされる場合であり、もう１つは、該酵素活性が該標的タンパク質の存在下で該標的タンパク質の補酵素によりもたらされる場合である。補酵素を必要とする実施形態では、補酵素は、三元複合体のアレイと同様に工程（ｃ）の油中水型エマルションの水相滴に取り込まれる。酵素が標的タンパク質を含む場合、更なる補酵素を水相滴に取り込む必要はない。
プロセスの工程（ｂ）では、ｍＲＮＡのアレイをリボソームで処理して、ｍＲＮＡ、リボソーム、及び該ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質を含む三元複合体のアレイを作製する。この工程は、例えばリボソームディスプレイの技術で用いられるような、典型的なｍＲＮＡのインビトロ翻訳に好適な任意の条件下で実施することができる。この時点で三元複合体を精製してもよいが、必須ではない。三元複合体は、この時点で後の酵素活性に必要な任意の補酵素と共に添加されてもよく、典型的には反応混合物は添加直後に乳化されて、それぞれ典型的に約２μｍ〜３μｍの平均直径を有する約１０１０個の油中水型区画が得られる。更に小さい体積（２５μＬ）のインビトロ翻訳反応では、約１０１１分子〜１０１２分子の取り込まれたリボソーム複合体が得られる。典型的なリボソームディスプレイ法は、終止コドンを欠くｍＲＮＡを用いるが、終止コドンが存在していてもよい（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。大部分又は全ての水相滴が１以下の三元複合体を含むようにするために、該三元複合体の濃度は、典型的なリボソームディスプレイ技術で用いられている対応する濃度に比べて約２桁低くなければならない。該プロセスのこの工程では、非常に低濃度の三元複合体が用いられる。
酵素は、核酸プロセシング酵素を含んでもよく、該核酸プロセシング酵素はＲＮＡプロセシング酵素であってもよい。核酸プロセシング酵素は、標的タンパク質を含んでもよく、核酸ポリメラーゼ、核酸リガーゼ、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼから選択してもよい。本明細書に更に詳細に記載する通り、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素を含んでもよい。この実施形態では、逆転写酵素をコードするｍＲＮＡは、それ自体逆転写酵素の基質である。標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程（ｅ）は、逆転写酵素の作用により生成されるｃＤＮＡであって、逆転写酵素をコードしているｃＤＮＡを選択することを含む。
標的タンパク質が核酸リガーゼである場合、ＲＮＡとＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡとをライゲーションさせることができるＲＮＡ（ＤＮＡ）リガーゼの選択を実施することができる。酵素を活性化させる反応条件は、核酸リンカー又はアダプタを含む補助基質を含むことが好ましく、該補助基質は、プロセシングされたｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで特異的に増幅させるためにリガンド結合パートナー又は配列タグに結合する親和性リガンドを更に含む。第１の場合では、標的タンパク質をコードするｍＲＮＡは、核酸リガーゼをコードするｍＲＮＡが取り込まれた水相滴中の補助基質にライゲーションする。親和性リガンドがビオチンを含み、リガンド結合パートナーがストレプトアビジンを含むことが好ましい。標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程は、リガンド結合パートナーを含む固相に対する結合により補助基質が取り込まれたｍＲＮＡを選択することを含む。典型的なプロセスでは、リガーゼの突然変異体ライブラリをインビトロで翻訳させ、精製した三元複合体を希釈し、ビオチン標識ＤＮＡ／ＲＮＡリンカー及び／又はアダプタと共に反応バッファ中で乳化させる。エマルションの温度を３７℃にすると、リボソーム三元複合体は分解される。リガーゼが放出され、ｍＲＮＡの３’末端がビオチン標識アダプタに接近することが可能になり、続いてライゲーション反応が起こる。リガーゼの活性（又は高活性）変異体をコードするビオチン標識ｍＲＮＡのみがストレプトアビジンビーズで精製され、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅され得る。
第２の場合では、標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程は、配列特異的タグが結合しているｍＲＮＡを選択することを含み、該配列特異的タグは、逆転写及びその後のＰＣＲでプライマーの選択的アニーリング部位として用いられ得る。
典型的なプロセスでは、リガーゼの突然変異体ライブラリをインビトロで翻訳させ、精製した三元複合体を希釈し、ＤＮＡ／ＲＮＡリンカー及び／又はアダプタと共に反応バッファ中で乳化させる。エマルションの温度を３７℃にすると、リボソーム三元複合体は分解される。リガーゼが放出され、ｍＲＮＡの３’末端がアダプタに接近することが可能になり、続いてライゲーション反応が起こる。リガーゼの活性（又は高活性）変異体をコードするＲＮＡのみが、逆転写で用いられるプライマーの特異的アニーリングに必要な特異的リンカー配列を有し、ＲＴ−ＰＣＲにより効率的に増幅され得る。
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を選択することも可能である。この酵素はＲＮＡに対して作用し、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体などを取り込む。この実施形態では、酵素を活性化させる反応条件は、ｄＮＴＰを含む補助基質であって、リガンド結合パートナーに結合する親和性リガンドを更に含む補助基質を含む。核酸リガーゼと同様に、親和性リガンドはビオチンであってもよく、リガンド結合パートナーはストレプトアビジンであってもよい。標的タンパク質をコードする核酸の選択は、リガンド結合パートナーを含む固相への結合により補助基質が取り込まれたｍＲＮＡを選択することを含む。ＴｄＴの突然変異体ライブラリはインビトロで翻訳させてもよく、精製した三元複合体を希釈し、ビオチン−ｄＵＴＰなどのビオチン標識ヌクレオチドと共に反応バッファ中で乳化させなければならないこともある。野生型酵素の最適機能温度は３７℃である。この温度でリボソーム三元複合体は分解され、テンプレート非依存性重合反応にｍＲＮＡの３’末端を利用することができるようになる。ビオチン標識ヌクレオチドを取り込むＴｄＴをコードするｍＲＮＡは、ストレプトアビジンビーズで選択され、その後逆転写され、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅され得る。
更なる実施形態では、標的タンパク質は、逆転写酵素の存在下における逆転写反応を改善することができるヘリカーゼ、ピロホスファターゼ、処理能力向上因子（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）、ＲＮＡ結合タンパク質、又は他のタンパク質などの逆転写酵素ヘルパー酵素を含む。この実施形態では、核酸プロセシング酵素は、油中水型エマルションの水相滴に取り込まれた補酵素である逆転写酵素を含む。標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程（ｅ）では、逆転写酵素の作用により生成され、逆転写酵素ヘルパー酵素をコードするｃＤＮＡが選択される。水相中に逆転写酵素ヘルパー酵素が存在すると、ヘルパー酵素をコードするｍＲＮＡの逆転写が促進される。したがって逆転写されたｍＲＮＡは、ヘルパー酵素をコードするｃＤＮＡを形成し、これをＰＣＲで増殖させることができる。
更なる実施形態では、標的タンパク質は、ＲＮａｓｅ阻害剤を含む。この実施形態では、核酸プロセシング酵素は、ＲＮａｓｅを含む。標的タンパク質をコードする核酸を選択する工程（ｅ）は、ＲＮａｓｅにより分解されていないｍＲＮＡを選択することを含む。この実施形態ではＲＮａｓｅは、油中水型エマルションの水相滴に補酵素として取り込まれる。一旦反応条件が酵素を活性化させると、有効なＲＮａｓｅ阻害剤を含有していない水相滴はいずれもＲＮａｓｅ活性を示し、ｍＲＮＡが分解される。したがって用いられる反応条件で有効なＲＮａｓｅ阻害剤をコードするｍＲＮＡは、残存する。典型的にはＲＮａｓｅ阻害剤の突然変異体ライブラリをインビトロで翻訳させ、精製したリボソーム三元複合体を希釈し、適切なＲＮａｓｅと共に反応バッファ中で乳化させる。他の方法では、エマルション微小滴により、後でＲＮａｓｅを送達してもよい。活性（又はより安定な）ＲＮａｓｅ阻害剤をコードするｍＲＮＡのみを精製し、ＲＴ−ＰＣＲにより増幅する。
また区画化リボソームディスプレイは、選択バッファがインビトロ翻訳混合物と不適合であり、且つ厳しく制御されている反応条件下で基質を生成物へ変換させなければならない場合、インビトロ区画化において反応バッファを交換するために用いることもできる。
関連する酵素活性に基づいて選択された標的タンパク質をコードする核酸は、本明細書で論じる通りＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。アレイを変換又は増幅させてＤＮＡ又はＲＮＡを形成することができる。好ましい方法では、アレイを変換又は増幅させてプロセスの工程（ａ）のｍＲＮＡのアレイを形成し、該アレイにおける標的タンパク質をコードするｍＲＮＡの量を更に増加させるために該アレイを工程（ｂ）〜工程（ｅ）のサイクルの１以上に更に供する。
酵素を活性化させる反応条件に水相滴を供する工程（ｄ）は、標的タンパク質をコードする核酸が選択される選択工程（ｅ）の基礎を提供する。工程（ｄ）で広範な反応条件を用い、選択圧をかけることができる。１例では反応条件としては、野生型酵素の最適温度を上回る温度が挙げられる。これら反応条件を用いて、野生型酵素よりも熱安定性が高い、ある温度における反応速度が速い、又は温度−活性プロファイルの変化した突然変異体酵素を選択することができる。水相滴中のｍＲＮＡ濃度は約４００ｐＭであるため、突然変異体酵素は、野生型酵素よりも高感受性で作用しなければならない可能性がある。また突然変異体酵素は、より正確に機能しなければならない可能性がある。これら選択圧は全て、逆転写酵素に関して特に重要である。物理的条件に加えて、反応条件は、バッファの変更、金属イオンなどの他の因子の濃度、及びｐＨを含んでもよい。
より優れた逆転写酵素を選択するＣＲＤでは多くのより多様な選択圧を適用してもよい。例えば、１）凝集する傾向の低い高可溶性酵素の選択−表面に露出している疎水性残基を有するタンパク質を排除するために、三元複合体を（乳化前に）疎水性物質と共にプレインキュベートしなければならない、２）非常に反応速度の速い酵素の選択−選択サイクル中逆転写酵素の反応時間を徐々に短縮しなければならない、３）長いｃＤＮＡを合成する酵素の選択−ＣＲＤで用いられるｍＲＮＡライブラリを徐々に長くし、結果としてより長いｃＤＮＡを合成させる、４）二次構造を通して翻訳することができる酵素の選択−配列を形成する二次構造をＣＲＤで用いられるｍＲＮＡライブラリに導入しなければならない、５）ＲＴバッファ（例えばＰＣＲでは、１段階ＲＴ−ＰＣＲバッファ、又は変性剤を含むバッファ）とは異なるバッファ中で作用する酵素の選択−ＣＲＤ選択を本発明で選択されたバッファ中で実施しなければならない、６）ヌクレオチド類似体を取り込むことができる酵素の選択−ビオチン標識ヌクレオチド類似体を含むＲＴバッファ中で選択を実施し、次いでストレプトアビジンビーズでｃＤＮＡを精製しなければならない、などである。
また区画化リボソームディスプレイ（ＣＲＤ）は、多くの蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）用途に好適である。対象タンパク質は、リボソームディスプレイフォーマットで提示されなければならない。反応バッファ中で非蛍光基質（Ｓ）と混合されたｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質（ｔＲＮＡ）を含む任意的に精製された（又は単に多数回希釈された）三元複合体は、乳化され二重水中油中水型エマルションを生成するはずである（Ｂｅｒｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２００４；Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．，２００５）。区画化酵素の活性変異体は、基質（Ｓ）を蛍光生成物（Ｐ）に変換するため、ＦＡＣＳにより蛍光（活性酵素内部）滴と「暗」（不活性酵素内部）滴とを区別することが可能になる。既に公開されている例とは対照的に、酵素反応を転写／翻訳混合物中で実施しなければならない場合、ＣＲＤによりバッファを完全に交換し、より自然界に近い（必要な）条件下で活性酵素を選択することが可能になる（図１０）。
ＣＲＤを用いる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの選択及び進化も可能である（図１１）。対象ポリメラーゼは、リボソームディスプレイフォーマットで提示されなければならない。ｍＲＮＡ−リボソーム−ポリメラーゼを含む任意的に精製された（又は単に多数回希釈された）三元複合体を用いて、ＰＣＲバッファ中に逆転写酵素（ヘルパー酵素）、ｄＮＴＰ、及びプライマーセットを含む反応混合物を調製することができる。反応溶液は、乳化され油中水型エマルションを生成するはずである。第１のＲＴ工程では、逆転写酵素はｃＤＮＡを合成しなければならないが、その理由は該ｃＤＮＡが第２のＰＣＲ工程（リボソームディスプレイされたＤＮＡポリメラーゼによるｃＤＮＡ増幅工程である）の標的として後に機能するためである。ＰＣＲで用いられるプライマーの１つは、ストレプトアビジンビーズ及び非相補的５’末端と共に任意的なその後の精製に用いるためのビオチンを有していてもよい。ＲＴ−ＰＣＲ後エマルションは破壊されるべきであり、新規に合成されたＤＮＡ断片をビオチンを介して精製し、新規プライマーセットであって一方のプライマーがｃＤＮＡに非相補的である配列を有するが、第１の増幅反応（ｃＤＮＡバックグラウンドに対して行われるＤＮＡの選択的増幅）で用いられたプライマーの５’部分と同一であるプライマーセットを用いて再増幅させてもよい。ＤＮＡポリメラーゼの高活性変異体が、低活性変異体よりも富化され、更なる分析又は次の選択ラウンドで用いることができる（図１１）。
区画化リボソームディスプレイ技術の重要な特徴は、以下の通りである：
１）ｍＲＮＡライブラリにより遺伝子型が維持されており、これはＲＮＡプロセシング酵素の選択で特に有用である；
２）選択ユニットが、ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質（ｔＲＮＡ）の三元複合体であり、これは超遠心、ゲル濾過、親和性タグ精製、及び他の簡単な手段により容易に精製することができる；
３）反応バッファを交換することができるため、新規反応混合物に選択ユニットを移動させる（精製して又は精製せずに）ことが可能であり、同時に１００倍〜２００倍希釈することができる（乳化後のリボソーム複合体の数を１反応区画当たり１分子未満に調整するため）、
４）ＣＲＤのｍＲＮＡライブラリの多様性は、インビトロ区画化の多様性によってのみ限定され、該多様性は１０１０未満の異なる変異体である、
５）一旦乳化されると、エマルションは４℃〜９４℃の広範な温度で安定であるため、該温度で選択反応を実施することができる、
６）高温（３０℃以上）で選択が実施される場合、三元複合体は解離するが、遺伝子型−表現型関連付けが失われないよう依然として区画化されており、ｍＲＮＡ及びインビトロで翻訳されたタンパク質を放出する。
本発明の区画化リボソームディスプレイプロセスは、新規逆転写酵素の進化促進において特に有効に機能することが見出されている。例として、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ｐＲＴ６０１）を選択に用いることができる（精製のためにＮ末端にＨｉｓタグを含む酵素）。この逆転写酵素の活性に最適な温度は４２℃であり、最高５０℃の温度で活性を有する。本発明のプロセスの工程（ｄ）において、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素をコードするｍＲＮＡのアレイを、５０℃〜６０℃の範囲のインキュベート温度にてｃＤＮＡ合成に必要なプライマー及びｄＮＴＰを含む反応条件に供してもよい。これら高温では、４℃で安定である取り込まれたリボソーム複合体は速やかに解離し、逆転写酵素の基質（ｍＲＮＡ）及び酵素を溶液中に放出する。
１つの実施形態では、リボソーム複合体から放出されるインビトロ翻訳逆転写酵素Ｍ−ＭｕＬＶは、翻訳が適切に終結しないため、リボソームトンネル内に留まるためのスペーサとしてリボソームディスプレイコンストラクトで用いられるファージラムダ細胞表面プロテインＤとＣ末端で融合し（Ｍａｔｓｕｕｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，２００３）、共有結合しているｔＲＮＡを有している。プロテインＤは、非常に多量に発現し、可溶性であり、且つ〜５７℃のアンフォールディング転移温度を有する安定なタンパク質であるため（Ｆｏｒｒｅｒ ａｎｄ Ｊａｕｓｓｉ，１９９８）、熱安定性逆転写酵素の選択において優れた融合パートナーである。
区画化リボソームディスプレイ選択法では、逆転写酵素の十分に活性の高い変異体のみが、同活性酵素をコードするｃＤＮＡを合成することができる。逆転写反応の完了後１時間の間に、エマルションは破壊され、ｃＤＮＡが精製され、ネステッドＰＣＲにより増幅される。ＣＲＤ選択の性質により、逆転写酵素の活性変異体をコードするｃＤＮＡのみが完全長ｃＤＮＡを合成することができ、増幅し、必要に応じて次の選択ラウンドに移される。Ｔ７ポリメラーゼプロモータ領域、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及びプロテインＤ配列における不所望の突然変異を排除するために、オリジナルのリボソームディスプレイコンストラクトが修復され、次の選択ラウンドを実施することができるような方法で、Ｍ−ＭｕＬＶ配列をコードする増幅されたＤＮＡのみが、ナイーブな５’末端及び３’末端断片にライゲーションすることができる。
５回の選択ラウンドで、５０℃にて特定の活性を有する酵素変異体であって、ライブラリの調製に用いられる一次酵素の活性と比べて２倍〜４倍優れている酵素変異体が同定される。タンパク質の一部は反応速度がより早く、一部は熱安定性がより高い。多くの選択されたＭ−ＭｕＬＶ変異体は、Ｄ５２４Ｇ又はＤ５８３Ｎの突然変異を有しているが、これは逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性を失わせ、ｃＤＮＡ合成及び熱安定性を高める変異である（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）。選択されたＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の更なる変異体の多くは、既に言及及び記載されている他の様々な有益な突然変異を有する（Ｈ２０４Ｒ；Ｈ６３８Ｒ；Ｔ１９７Ａ；Ｍ２８９Ｖ；Ｅ３０２Ｋ；Ｔ３０６Ａ；Ｎ４５４Ｋ；Ｙ６４Ｃ；Ｅ６９Ｇ；Ｑ１９０Ｒ；Ｖ２２３Ｍ；Ｆ３０９Ｓ；Ｌ４３５Ｐ；Ｅ５６２Ｋ）（米国特許第７０５６７１６号明細書；米国特許出願公開第２００６００９４０５０Ａ１号明細書；米国特許第７０７８２０８号明細書；米国特許出願公開第２００５０２３２９３４Ａ１号明細書；国際公開第０７０２２０４５Ａ２号パンフレット）。これらに加えて本発明者らは、逆転写酵素アミノ酸配列において多くの新規ホットスポットを見出した。幾つかの突然変異は非常に頻繁に出現し、非常に重要度の高い突然変異であり、このことは精製した突然変異体の分析で示された（実施例２）。したがって、本発明のＣＲＤ技術は非常に迅速且つロバストな選択法であり、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の定向進化及び改善によりその有効性が確認されたと言うことができる。本発明では原理の証明として、高温でより良好に機能するＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の変異体を選択した。
更なる態様では本発明は、本明細書に記載されるプロセスにより得ることができる逆転写酵素を提供する。
更なる態様では本発明は、４２℃超の温度で、好ましくは少なくとも５０℃の温度で、より好ましくは５０℃〜６０℃の温度範囲で最適な活性を有する逆転写酵素を提供する。好ましくは少なくとも５０℃の高温である反応条件を適用することにより、本明細書に記載されるプロセスに従って逆転写酵素を選択することができる。本発明のこの態様では、最適な活性がみられる温度が野生型酵素に比べて上昇する方向に活性−温度プロファイルがシフトしている逆転写酵素を選択することができる。
更なる態様では本発明は、以下のアミノ酸位置のうちの１以上に突然変異を有するＭＭＬＶ逆転写酵素のアミノ酸配列を含む逆転写酵素を提供する：
Ｄ２００、Ｄ６５３、Ｌ６０３、Ｔ３３０、Ｌ１３９、Ｑ２２１、Ｔ２８７、Ｉ４９、Ｎ４７９、Ｈ５９４、Ｆ６２５、Ｈ１２６、Ａ５０２、Ｅ６０７、Ｋ６５８、Ｐ１３０、Ｑ２３７、Ｎ２４９、Ａ３０７、Ｙ３４４、Ｑ４３０、Ｄ４４９、Ａ６４４、Ｎ６４９、Ｌ６７１、Ｅ６７３、Ｍ３９、Ｑ９１、Ｍ６６、Ｗ３８８、Ｉ１７９、Ｅ３０２、Ｌ３３３、Ｒ３９０、Ｑ３７４、及びＥ５。
突然変異がＤ６５３に存在する場合、突然変異はＤ６５３Ｎではないことが好ましい。突然変異がＬ６０３に存在する場合、突然変異はＬ６０３Ａではないことが好ましい。更に突然変異がＨ５９４に存在する場合、突然変異はＨ５９４Ａではないことが好ましい。
上記位置における突然変異は点変異であることが好ましい。
逆転写酵素は、以下の突然変異のうちの１以上を有することが好ましい：
Ｄ２００Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｄ２００Ｇ、Ｄ６５３Ｎ、Ｄ６５３Ｇ、Ｄ６５３Ａ、Ｄ６５３Ｈ、Ｄ６５３Ｖ、Ｌ６０３Ｗ、Ｌ６０３Ｍ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ１３９Ｐ、Ｑ２２１Ｒ、Ｔ２８７Ａ、Ｉ４９Ｖ、Ｉ４９Ｔ、Ｎ４７９Ｄ、Ｈ５９４Ｒ、Ｈ５９４Ｑ、Ｆ６２５Ｓ、Ｆ６２５Ｌ、Ｈ１２６Ｓ、Ｈ１２６Ｒ、Ａ５０２Ｖ、Ｅ６０７Ｋ、Ｅ６０７Ｇ、Ｅ６０７Ａ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｑ、Ｐ１３０Ｓ、Ｑ２３７Ｒ、Ｎ２４９Ｄ、Ａ３０７Ｖ、Ｙ３４４Ｈ、Ｑ４３０Ｒ、Ｄ４４９Ｇ、Ｄ４４９Ａ、Ａ６４４Ｖ、Ａ６４４Ｔ、Ｎ６４９Ｓ、Ｌ６７１Ｐ、Ｅ６７３Ｇ、Ｅ６７３Ｋ、Ｍ３９Ｖ、Ｍ３９Ｌ、Ｑ９１Ｒ、Ｑ９１Ｌ、Ｍ６６Ｌ、Ｗ３８８Ｒ、Ｉ１７９Ｔ、Ｉ１７９Ｖ、Ｅ３０２Ｋ、Ｌ３３３Ｑ、Ｒ３９０Ｗ、Ｑ３７４Ｒ、及びＥ５Ｋ。
これら突然変異はそれぞれ、例えば対応する野生型酵素と比べて５０℃で高い活性を有する突然変異体酵素において見られる。これら突然変異体の更なる詳細は、特定の実施例に記載される。
本発明の特に好ましい態様では、突然変異体酵素は、少なくとも２つの突然変異を有する。１つの実施形態では、２つの突然変異は、Ｄ２００及びＬ６０３に存在する。例えば該突然変異は、Ｄ２００Ｎ及びＬ６０３Ｗである。他の実施形態では、突然変異は、Ｎ４７９及びＨ５９４に存在する。例えば該突然変異は、Ｎ４７９Ｄ及びＨ５９４Ｒである。
更なる態様では、本発明は、３７℃超の温度で最適活性を有する逆転写酵素であって、５０℃における活性が３７℃における活性の少なくとも１２０％である逆転写酵素を提供する。５０℃における活性は３７℃における活性の少なくとも１３０％が好ましく、少なくとも１６０％がより好ましい。
更なる態様では、本発明は、５０℃における活性が、対応する野生型酵素の５０℃における活性の少なくとも２倍である突然変異体逆転写酵素を提供する。
更なる態様では、本発明は、３７℃における比活性が対応する野生型酵素の３７℃における比活性の少なくとも１３０％である突然変異体逆転写酵素を提供する。該突然変異体逆転写酵素の比活性は、対応する野生型酵素の比活性の少なくとも１４０％が好ましく、少なくとも１５０％がより好ましく、少なくとも１６０％が特に好ましい。本明細書に記載されている通り、部分的に精製された野生型酵素の３７℃における比活性は、約２００，０００Ｕ／ｍｇであることが見出されている。本発明に従って得ることができる特定の突然変異体逆転写酵素については、特定の実施例で更に詳細に論じる。
更なる態様では、本発明は、対応する野生型酵素の少なくとも１．５倍の熱安定性を有する突然変異体逆転写酵素を提供する。本願では熱安定性は、５０℃で５分間で処理した後の３７℃における残存活性として測定される。突然変異体逆転写酵素の熱安定性は、対応する野生型酵素の熱安定性の少なくとも１．５倍が好ましく、少なくとも２倍がより好ましく、少なくとも２．５倍が更により好ましい。典型的には野生型逆転写酵素の３７℃における残存活性は、未処理酵素の活性の約１１％である。
本発明に係る逆転写酵素は、ＭＭＬＶ逆転写酵素を含むことが好ましい。
更なる態様では本発明は、本明細書に記載される逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡ又はＤＮＡなどを提供する。
本発明に係る逆転写酵素は、ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲなど）などの各種分子生物学的技術で用いることができる。キットの逆転写酵素が本発明に係る逆転写酵素であるＲＴ−ＰＣＲ用キットを提供することができる。
実施例１−ＣＲＤ−原理の証明
区画化リボソームディスプレイ選択系の原理を証明するために、試験選択を実施した。典型的な原理の証明実験では、活性酵素（本発明の場合オリジナルＭＬＶ逆転写酵素のＲＴ−ＰＣＲ断片）で陽性シグナルが得られ、不活性酵素（不活化ＭＬＶ逆転写酵素のＲＴ−ＰＣＲ断片は存在しない）ではシグナルが生じないはずである。より洗練された実験は、活性酵素をコードする遺伝子と不活性酵素をコードする遺伝子を定義された比で混合した混合物を使用することである。実験成功の結果として、活性酵素をコードする遺伝子が不活性酵素をコードする遺伝子に対して富化されるはずである。
実験の一般的スキームを図１に示す。２つのプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ（プロテインＤのスペーサに融合しているモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする）及びｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（プロテインＤのスペーサに融合している不活化（ｐｏｌドメインの５７個のアミノ酸が欠失）モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする）を用いてＰＣＲ断片を合成した。更に３’末端の終止コドンを欠くｍＲＮＡを合成するための転写反応で該ＰＣＲ断片を用いた。上記２つのＰＣＲ断片から得られる精製ｍＲＮＡを１：５０＝ＭＬＶ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ（不活性ＲＴ）の比で混合し、インビトロ翻訳反応に用いた。翻訳反応中リボソーム複合体はタンパク質を合成し、終止コドンを欠くｍＲＮＡの末端で停止する。５０ｍＭのＭｇ２＋を含有している氷冷バッファで希釈することにより翻訳反応を停止させた。低温、高濃度Ｍｇ２＋イオン、及びｍＲＮＡの末端に終止コドンが存在しないことにより、ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質（ｔＲＮＡ）の三元複合体（ＴＣ）が安定化される。三元複合体（ＴＣ）の混合物をショ糖クッション溶液上で超遠心することにより精製した。ＴＣ（〜３．５ＭＤａ）が超遠心管の底部に沈殿し、一方低分子量分子、タンパク質、及び大部分の遊離ｍＲＮＡ（〜０．９ＭＤａ）は上清中に残るように超遠心を最適化させた。沈殿したＴＣを氷冷バッファ（５０ｍＭ Ｍｇ２＋）に溶解させた。インビトロ翻訳ＭＬＶ逆転写酵素に連結しているｍＲＮＡを既に含有している精製三元複合体（３×１０９個未満の分子が回収された）を用いて、ＲＴ反応用外因性ｄＮＴＰセット及びプライマーを添加した逆転写反応混合物を調製した。氷冷ＲＴ反応混合物を乳化させ、〜２μｍの大きさの〜１×１０１０個の油中水型区画を得た。ＲＴ反応を実施するために、乳化されたＲＴ反応混合物（１区画当たりＴＣ（ｍＲＮＡ＋ＭＬＶ ＲＴ）１個未満）を４２℃で１時間インキュベートした。区画化ＲＴ反応混合物の温度を上昇させると、大部分のＴＣは解離し、ｍＲＮＡ及び逆転写酵素を放出する。活性ＭＬＶ逆転写酵素（ＭＬＶ＿ｐＤ）を含有している区画においてのみＲＴ反応が成功し、不活性逆転写酵素（ｄｅｌ＿ｐＤ）を含む区画ではｃＤＮＡは合成されない。次いでＰＣＲにより合成されたｃＤＮＡを確実に増幅させると、不活性逆転写酵素（ｄｅｌ＿ｐＤ）遺伝子に比べて活性逆転写酵素（ＭＬＶ＿ｐＤ）遺伝子が富化されていることが観察される。
方法及び材料
Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、及びＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列領域においてｐＥＴ型プラスミドを改変し、Ｎ末端にＨｉｓタグ（配列番号１の２５８〜３０５）を有し、Ｃ末端がグリシン−セリン（ｇｓ）リンカー（配列番号１の２，３６４〜２，３９３）と、ファージラムダ由来のプロテインＤ（ｐＤ）の一部（配列番号１の２，３９４〜２，６６９）と、第２のグリシン−セリン（ｇｓ）リンカー（配列番号１の２，６７０〜２，７５９）と融合しているＭＬＶ Ｈ＋逆転写酵素コード配列（配列番号１の３０６〜２，３６３）を挿入することにより、初期プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ（配列番号１及び図２）を構築した。Ｎ末端のＨｉｓタグは、タンパク質発現精製に用いられる。Ｃ末端の融合は、タンパク質のインビトロ翻訳中及びｍＲＮＡ−リボソーム−ＭＬＶ（ｔＲＮＡ）三元複合体の形成中、リボソームトンネル内に留まらなければならない。
Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性及びＲＮａｓｅＨ活性という２つの主な酵素活性を有する。逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、点変異Ｄ５８３Ｎ（プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ、配列番号１の２，０５５の位置で１つのヌクレオチドＧがＡに置換）を導入することにより失われる。アスパラギン酸５８３は、ＲＮａｓｅＨ活性部位に位置し、Ｍｇイオン結合に関与し、ＲＮａｓｅＨ活性にとって極めて重要である。新規プラスミドは、ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤと識別され、不活化逆転写酵素をコードする次のプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（配列番号２）の構築に更に用いられた。プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤは、制限エンドヌクレアーゼＸｍａＪＩ（認識配列Ｃ↓ＣＴＡＧＧ（配列番号１の位置１，０４７〜１，２１８））で切断された。１７１ｂｐの長さの遺伝子断片が除去され、切断されたプラスミドはセルフライゲーションし、タンパク質翻訳フレームがシフトすることなしに１７１ヌクレオチド即ち５７アミノ酸短い逆転写酵素遺伝子をコードするプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（配列番号２）が得られた。
該逆転写酵素遺伝子は、以下の性質を有することが重要であった：１）長さが短い（ＰＣＲ検出が容易）；２）不活性である（ポリメラーゼドメインにおける５７アミノ酸の欠失によりポリメラーゼ活性が完全に不活化され、突然変異Ｄ５８３ＮによりＲＮａｓｅＨ活性が不活化されることが実験的に確認された）；及び３）フレームシフトがない（如何なるフレームシフトでも終止コドンが出現するため、リボソームディスプレイフォーマットには不適合である）。
インビトロ翻訳用ＰＣＲ断片の調製。以下のＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１２μＬ）；ＤＭＳＯ（Ｄ８４１８−Ｓｉｇｍａ）（１６μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４μＬ）；１００μＭのｐｒｏ−ｐＩＶＥＸプライマー（配列番号３）（１μＬ）；１００μＭのｐＤ−ｔｅｒプライマー（配列番号４）（１μＬ）；水（１２２μＬ）。２本の試験管に２×９８μＬずつ混合物を分注した。２μＬのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ（〜１ｎｇ／μＬに希釈）又は２μＬのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（〜１ｎｇ／μＬに希釈）を９８μＬのＰＣＲマスター混合物２つに添加した。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、３０サイクル（９４℃で４５秒間、５３℃で４５秒間、及び７２℃で２分間）、及び最後の伸長工程７２℃で５分間。２ｎｇのプラスミド（７，８７３ｂｐ）標的が〜５μｇ（５０ｎｇ／μＬ）の増幅産物に、〜７，０００倍に増幅された（ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ のＰＣＲ断片は２，７０２ｂｐ；ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ ＿ｐＤのＰＣＲ断片は２，５３１ｂｐ）。
以下の転写混合物を調製した：５×Ｔ７転写バッファ（１ＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）（４０μＬ）；１５０ｍＭの酢酸マグネシウム；１０ｍＭのスペルミジン；０．２ＭのＤＴＴ）；２５ｍＭの各ＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５６μＬ）；２０ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（８μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（５２μＬ）。２本の試験管に２×８０μＬずつ混合物を分注し、５０ｎｇ／μＬのＭＬＶ＿ｐＤ（ｐｒｏ−ｐＩＶＥＸ／／ｐＤ−ｔｅｒ）ＰＣＲ混合物（２０μＬ）又は５０ｎｇ／μＬのｄｅｌ＿ｐＤ（ｐｒｏ−ｐＩＶＥＸ／／ｐＤ−ｔｅｒ）ＰＣＲ混合物（２０μＬ）を添加した。３７℃で３時間転写を実施した。
両方の転写混合物を、２００μＬの氷冷ヌクレアーゼ不含水で希釈し、２００μＬの６Ｍ ＬｉＣｌ溶液を添加した。＋４℃で３０分間混合物をインキュベートし、最高速度（２５，０００ｇ）で冷却遠心機を用いて＋４℃にて３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、５００μＬの氷冷７５％エタノールでＲＮＡペレットを洗浄した。最高速度で冷却遠心機を用いて＋４℃にて５分間再度遠心管を遠心分離に供し、上清を廃棄した。室温で１２分間ＲＮＡペレットを乾燥させ、次いで１，４００ｒｐｍで＋４℃にて１５分間振盪することにより、２００μＬのヌクレアーゼ不含氷冷水に再懸濁させた。溶解していないＲＮＡを分離するために、最高速度で冷却遠心機を用いて＋４℃にて５分間遠心管を再度遠心分離に供した。１０×ＤＮａｓｅＩバッファ（Ｍｇ２＋）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）及び１ｕ／μＬのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ不含）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）を含む新たな試験管に約１８０μＬの上清を移し、ＤＮＡを分解するために＋３７℃で２０分間インキュベートした。２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）及び５００μＬの氷冷９６％エタノールを試験管に添加した。最後に、−２０℃で３０分間インキュベートし、最高速度（２５，０００ｇ）で冷却遠心機を用いて＋４℃にて３０分間遠心分離することによりＲＮＡを沈殿させた。上清を廃棄し、５００μＬの氷冷７５％エタノールでＲＮＡペレットを洗浄した。最高速度で冷却遠心機を用いて＋４℃にて５分間遠心管を再度遠心分離に供し、上清を廃棄した。室温で１２分間ＲＮＡペレットを乾燥させ、次いで４℃及び１，４００ｒｐｍで１５分間振盪することにより、４３μＬのヌクレアーゼ不含氷冷水に再懸濁させた。４×１０μＬにＲＮＡ溶液を分注し、液体窒素で凍結させた。ｍＲＮＡの濃度を分光光度計で測定し、ＲｉｂｏＲｕｌｅｒＴＭＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ，Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いてアガロースゲルでダブルチェックした。ＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡは〜１．２μｇ／μＬ、ｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡは〜１．２μｇ／μＬであった。
精製されたｍＲＮＡを、１：５０＝ＭＬＶ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ（不活化ＲＴ）の比で混合する。ＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡを〜４８ｎｇ／μＬに２５倍希釈し、１μＬ（〜４８ｎｇ）を〜１．２μｇ／μＬのｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡ２μＬ（２．４μｇ）と混合し、混合比１：５０のｍＲＮＡ混合物〜０．８μｇ／μＬを得た。２種の翻訳系ＲＴＳ １００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ Ｋｉｔ（０３ １８６ １４８ ００１−Ｒｏｃｈｅ）及び合成ＷａｋｏＰＵＲＥ（２９５−５９５０３−Ｗａｋｏ）を用いてインビトロ翻訳を実施した。ＭＬＶ＿ｐＤのタンパク質翻訳配列を配列番号６に、ｄｅｌ＿ｐＤのタンパク質配列を配列番号７に示す。
ＲＴＳ ＨＹ系の翻訳混合物（２５μＬ）は以下の通りである：Ｅ．ｃｏｌｉ溶菌液（Ｒｏｃｈｅ）（６μＬ）；反応混合物（Ｒｏｃｈｅ）（５μＬ）；アミノ酸（Ｒｏｃｈｅ）（６μＬ）；１００ｍＭのＭｅｔ（Ｒｏｃｈｅ）（０．５μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（０．５μＬ）；２００μＭのａｓｓｒＡオリゴヌクレオチド（配列番号５）（０．４μＬ）；１ＭのＤＴＴ（０．２５μＬ）；再構築バッファ（Ｒｏｃｈｅ）（２．５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（２．５μＬ）、及び０．８μｇ／μＬのｍＲＮＡ混合物（１：５０＝ＭＬＶ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤ）（〜１，２００ｎｇ）（１．５μＬ）。３０℃で２０分間インビトロ翻訳を実施した。
ＷａｋｏＰＵＲＥ系の翻訳混合物（２５μＬ）は以下の通りである：Ａ溶液（Ｗａｋｏ）（１２．５μＬ）；Ｂ溶液（Ｗａｋｏ）（５μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（０．５μＬ）；２００μＭのαｓｓｒＡオリゴヌクレオチド（配列番号６）（０．４μＬ）；１ＭのＤＴＴ（０．２５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（５μＬ）、及び０．８μｇ／μＬのｍＲＮＡ混合物（１：５０＝ＭＬＶ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤ）（〜１，２００ｎｇ）（１．５μＬ）。３７℃で３０分間インビトロ翻訳を実施した。
１５５μＬの氷冷停止バッファＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ））を添加することにより、両方の翻訳（〜２５μＬ）を停止させ、４℃、２５，０００ｇで５分間遠心分離した。８４０μＬの３５％（ｗ／ｖ）ショ糖−ＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ）；３５％（ｗ／ｖ）−ショ糖（８４０９７−Ｆｌｕｋａ））溶液上に非常に慎重に遠心分離した翻訳混合物１６０μＬをピペットで入れた。ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質（ｔＲＮＡ）の三元複合体（ＴＣ）を精製するために、ＴＬ−１００ Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心機；ＴＬＡ１００．２固定角ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ）；透明な１ｍＬ超遠心管（３４３７７８−Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて＋４℃、１００，０００ｒｐｍで９分間超遠心した。超遠心管の底部に存在するＴＣの小さく透明なペレットを保持するために、管全体を注意深く取り扱った。最初に７５０μＬの溶液を遠心管の最上部から除去した。次いで７５０μＬのＷＢＫ５００（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ）で（非常に慎重に）管壁を洗浄した。最後に、遠心管の最上部から始めて全ての溶液を除去し、３０μＬの氷冷停止バッファＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ））にペレットを溶解させた。
放射活性標識ｍＲＮＡを用いて決定されたように、超遠心後インプットｍＲＮＡの５％〜３０％は、三元複合体ペレット中に存在する。したがって、３０μＬのバッファ（〜１２ｎｇ／μＬ又は９×１０９分子／μＬの三元複合体）中に３６０ｎｇ（翻訳反応で用いられた１，２００ｎｇのｍＲＮＡの３０％）未満のｍＲＮＡが存在すると予想された。
以下の選択用逆転写反応混合物を氷上で調製した：５×逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）反応バッファ（６０μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（７．５μＬ）；２０μＭのｐＤ＿４２オリゴヌクレオチド（配列番号８）（１５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（１８８μＬ）。混合物を２本の試験管に２×１３５μＬずつ分注し、０．９μＬの精製（８×１０９分子未満）ＴＣ（Ｒｏｃｈｅ−ＲＴＳ ＨＹキットで翻訳）又は０．９μＬの精製（８×１０９分子未満）ＴＣ（Ｗａｋｏ−ＷａｋｏＰＵＲＥで翻訳）を添加した。各反応混合物（〜１３５μＬ）を２本の試験管に４５μＬと９０μＬに再度分注した。第１部（４５μＬのＲＴ混合物）に５μＬのヌクレアーゼ不含水を添加した。このサンプルは、陰性選択対照（ｄＮＴＰ無）であるとみなされ、反応混合物中にＤＮＡが夾雑しておらず、ｃＤＮＡ合成が三元複合体におけるＭＬＶ ＲＴから生じる逆転写酵素の機能活性と密接に関連していることを証明しなければならない。第２部（９０μＬのＲＴ混合物）に１０ｍＭの各ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１０μＬを添加し、反応混合物を２本の試験管に再度分注した。１本は選択対照用の５０μＬであり、もう１本は２００ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ−Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１μＬを添加した陽性選択対照用の５０μＬであった。プロトコルによれば、各逆転写反応混合物は、５０μＬの体積中に２．７×１０９分子未満の三元複合体を含有する。
最終濃度が４％（ｖ／ｖ）になるようにＡＢＩＬ ＥＭ９０（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ）を鉱物油に（Ｍ５９０４−Ｓｉｇｍａ）混合することにより、乳化のための油−界面活性剤混合物を調製した（Ｇｈａｄｅｓｓｙ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，２００４；米国特許出願公開第２００５０６４４６０号明細書）。９５０μＬの油−界面活性剤混合物を５０μＬのＲＴ混合物と混合することにより、５ｍＬの低温貯蔵バイアル（４３０４９２−Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で＋４℃にてエマルションを調製した。ＭＳ−３０００調速磁気攪拌機（Ｂｉｏｓａｎ）及びＲｏｔｉｌａｂｏ（登録商標）（３×８ｍｍ）中央リング付磁気撹拌子（１４８９．２−Ｒｏｔｈ）を用いて〜２，１００ｒｐｍで混合を行い、３０秒間に１回１０μＬのアリコートを水相に添加し、更に２分間混合を続けた（合計混合時間４分間）。光学顕微鏡データによれば、本発明のエマルション中の区画の大きさは０．５μｍ〜１０μｍであり、平均直径は〜２μｍである。したがって、２．７×１０９分子未満の三元複合体を含有する逆転写反応混合物５０μＬの乳化後、〜１×１０１０個の油中水型区画が存在すると予測された（３〜４区画当たりｍＲＮＡ及び逆転写酵素が約１分子）。
Ｒｏｃｈｅ−ＲＴＳ ＨＹ ｋｉｔで翻訳されたＴＣ（陰性選択対照、選択対照、及び陽性選択対照）、及びＷａｋｏ−ＷａｋｏＰＵＲＥで翻訳されたＴＣ（陰性選択対照、選択対照、及び陽性選択対照）のＲＴ反応を表す６種のエマルション全てを＋４２℃で１時間インキュベートした。
反応混合物を回収するために、エマルションを１．５ｍＬの試験管に移し、室温、２５，０００ｇで１分間再び遠心分離した。油相を除去して、試験管の底部に濃縮（しかし依然としてインタクトである）エマルションを残し、２５０μＬのＰＢバッファ（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を添加した。最後に、０．９ｍＬの水−飽和エーテル、０．９ｍＬの水−飽和酢酸エチル（ＡＢＩＬ ＥＭ９０洗剤を除去するため）、及び再度０．９ｍＬの水−飽和エーテルで抽出することにより、エマルションを破壊した。真空下において室温で５分間水相を乾燥させた。合成されたｃＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで精製し、３０μＬのＥＢバッファ（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）で溶出した。
ネステッドＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を実施した。以下の初期ＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１６μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１６μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（９．６μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３．２μＬ）；１００μＭのＲＤ＿Ｎｄｅプライマー（配列番号９）（０．８μＬ）；１００μＭのｐＤ＿５５プライマー（配列番号１０）（０．８μＬ）；７４μＬの水。混合物を６サンプル×１５μＬ（６×１５μＬ）と３０μＬに分注した。１５μＬのＰＣＲマスター混合物６つに５μＬのｃＤＮＡ（１〜６のＲＴサンプル）を添加した。３０μＬのＰＣＲマスター混合物に９μＬの水を添加し、混合物を２本の試験管に２×１９．５μＬずつ再度分注した。１本はＰＣＲ陰性対照用（０．５μＬの水を添加）であり、もう１本はＰＣＲ陽性対照用（ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤプラスミドとｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤプラスミドとの１：１混合物（〜１ｎｇ）（０．５μＬ）を添加）である。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２５サイクル（９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、及び７２℃で２分間）、及び最後の伸長工程７２℃で５分間。ＰＣＲ断片の予想される長さは、ＭＬＶ＿ｐＤが２，１８５ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤが２，０１４ｂｐであった。１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲルで増幅を解析した（図３）。
２種の異なるプライマーセットを用いてネステッドＰＣＲを実施した。一方のプライマーセットからは遺伝子の一部が増幅され（ＲＴサンプル中のＭＬＶ：ｄｅｌ ｃＤＮＡ比の解像度を上げるため）、もう一方からは遺伝子全体が増幅される（遺伝子全体を回収できることを証明するため）。
遺伝子の一部を増幅させるためのネステッドＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２８μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２８μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１６．８μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５．６μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｆプライマー（配列番号１１）（１．４μＬ）；１００μＭのＭ＿２Ｒプライマー（配列番号１２）（１．４μＬ）；水（１８５μＬ）。混合物を２×１９μＬ及び６×３８μＬに分注した。１９μＬのＰＣＲマスター混合物２つに、第１のＰＣＲ（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）−３０ＰＣＲサイクル増幅の陽性対照又は陰性対照を１μＬずつ添加した。３８μＬのＰＣＲマスター混合物６つに、第１のＰＣＲ（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）（１〜６のサンプル）を２μＬずつ添加し、各サンプルを２３ＰＣＲサイクル増幅又は３０ＰＣＲサイクル増幅用に２×２０μＬずつ２つに再度分注した。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２３サイクル又は３０サイクル（９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、及び７２℃で１分間）、及び最後の伸長工程７２℃で５分間。ＰＣＲ断片の予想される長さは、ＭＬＶ＿ｐＤが９０７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤが７３６ｂｐであった。１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲルで増幅を解析した（図４）。
遺伝子全体を増幅させるためのネステッドＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２８μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２８μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１６．８μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５．６μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｅｓｐプライマー（配列番号１３）（１．４μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｅｒｉプライマー（配列番号１４）（１．４μＬ）；水（１８５μＬ）。混合物を２×１９μＬ及び６×３８μＬに分注した。１９μＬのＰＣＲマスター混合物２つに第１のＰＣＲ（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）−３０ＰＣＲサイクル増幅の陽性対照又は陰性対照を１μＬずつ添加した。３８μＬのＰＣＲマスター混合物６つに第１のＰＣＲ（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）（１〜６のサンプル）を２μＬずつ添加し、各サンプルを２３ＰＣＲサイクル増幅用又は３０ＰＣＲサイクル増幅用に２×２０μＬずつ２つに再度分注した。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２３サイクル又は３０サイクル（９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、及び７２℃で２分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。ＰＣＲ断片の予想される長さは、ＭＬＶ＿ｐＤが２，０７７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤが１，９０６ｂｐであった。１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上で増幅を解析した（図５）。
結果
区画化リボソームディスプレイ（ＣＲＤ）法の原理の証明を行うために、プロテインＤのスペーサに融合している活性（ＭＬＶ）逆転写酵素及び不活性（ｄｅｌ）逆転写酵素をコードする２種のｍＲＮＡの１：５０＝ＭＬＶ：ｄｅｌ混合物から始めて選択を実施した（図１）。どちらの翻訳系が本発明の実験構成に適しているかを調べるために、２種の異なる翻訳系Ｒｏｃｈｅ−ＲＴＳ １００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ又はＷａｋｏ−ＷａｋｏＰＵＲＥを用いてインビトロ翻訳を実施した。各翻訳系につき、３つの区画化ＲＴ反応を実施した。１つ目はｄＮＴＰを含まない陰性選択対照であり、これは反応混合物中にＤＮＡが夾雑していないことを証明しなければならない。２つ目は選択対照であり、これはｃＤＮＡを合成できるのが活性酵素のみであるため、不活化酵素（ｄｅｌ）をコードする遺伝子よりも活性（ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする遺伝子が富化されることを示さなければならない。３つ目は外因性ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ（市販の逆転写酵素）を添加した陽性選択対照であり、これは全ての区画でＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡ及びｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡの両方からｃＤＮＡを合成する陽性ＲＴ対照として機能しなければならず、選択圧をかけない場合の反応混合物中における遺伝子の実際の比を示す。
合成されたｃＤＮＡをネステッドＰＣＲにより増幅させた。初期ＰＣＲ（２５サイクル）のアガロースゲル電気泳動写真（図３）は、両方の陽性選択対照（翻訳系−Ｒｏｃｈｅ及びＷａｋｏ）においてのみＰＣＲ断片の弱いバンドを示す。これらサンプルは、インビトロで合成された逆転写酵素分子を１区画当たり１分子しか含まない反応と比べて遥かに効率よくｃＤＮＡを合成する外因性ＲＴ酵素を含むため、これは正常な結果である。
ネステッドＰＣＲ（遺伝子の一部を増幅）のアガロースゲル電気泳動写真を図４に示す。２３ＰＣＲサイクル後の増幅結果と３０ＰＣＲサイクル後の増幅結果は一貫している：
１）陰性選択対照（ｄＮＴＰ無）では増幅が起こらない（ＤＮＡの夾雑無）；
２）陽性選択対照（外因性ＲＴ酵素）ではｄｅｌ＿ｐＤ ｃＤＮＡ（７３６ｂｐのＤＮＡ断片）が非常に効率的に増幅され、ＭＬＶ＿ｐＤ ｃＤＮＡの増幅は視認できない、これはＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡとｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡとの初期比が１：５０であったためである；
３）選択対照では、ｃＤＮＡ ＭＬＶ＿ｐＤ（９０７ｂｐのＤＮＡ断片）及びｄｅｌ＿ｐＤ（７３６ｂｐのＤＮＡ断片）の両方が増幅される；
４）Ｒｏｃｈｅのインビトロ翻訳系により合成された逆転写酵素の場合ＭＬＶ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤの比は〜１：１であり、これは１：５０の初期比から始めてｄｅｌ＿ｐＤ遺伝子に対してＭＬＶ＿ｐＤ遺伝子が〜５０倍富化されたことを意味する；
５）Ｗａｋｏのインビトロ翻訳系により合成された逆転写酵素の場合ＭＬＶ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤの比は〜１：３であり、これは１：５０の初期比から始めてｄｅｌ＿ｐＤ遺伝子に対してＭＬＶ＿ｐＤ遺伝子が〜１６倍富化されたことを意味する。
ネステッドＰＣＲ（遺伝子全体を増幅）のアガロースゲル電気泳動写真を図５に示す。２３ＰＣＲサイクル後の増幅結果と３０ＰＣＲサイクル後の増幅結果は一貫しており、遺伝子の一部を増幅するために用いたネステッドＰＣＲの結果と比較しても一貫している（図５）：
１）陰性選択対照（ｄＮＴＰ無）では増幅が起こらない（ＤＮＡの夾雑無）；
２）陽性選択対照（外因性ＲＴ酵素）ではｄｅｌ＿ｐＤ ｃＤＮＡ（１，９０６ｂｐのＤＮＡ断片）が非常に効率的に増幅され、ＭＬＶ＿ｐＤ ｃＤＮＡの増幅は視認できない、これはＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡとｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡとの初期比が１：５０であったためである；
３）選択対照では、ｃＤＮＡ ＭＬＶ＿ｐＤ（２，０７７ｂｐのＤＮＡ断片）及びｄｅｌ＿ｐＤ（１，９０６ｂｐのＤＮＡ断片）の両方が増幅される；
４）遺伝子全体を増幅させた場合ＭＬＶ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤの比を決定することは困難である、これは２，０７７ｂｐ（ＭＬＶ＿ｐＤ）ＤＮＡ断片と１，９０６ｂｐ（ｄｅｌ＿ｐＤ）ＤＮＡ断片との相対的な長さの差がそれ程大きくないためであるが、一般的に比は遺伝子の一部を増幅するために用いたネステッドＰＣＲの結果と類似している。
この実施例の結果として、ＣＲＤフォーマットで実施した逆転写反応中、活性ＭＬＶ逆転写酵素をコードする遺伝子が、インビトロで酵素を合成するためにＲｏｃｈｅの翻訳系を用いた場合は５０倍、Ｗａｋｏの翻訳系を用いた場合は１６倍、不活性酵素をコードする遺伝子に対して富化されたと結論付けることができる。
実施例２−高温において高い性能を示す逆転写酵素のＣＲＤ選択
区画化リボソームディスプレイ（ＣＲＤ）選択がどの程度有効に機能するかを調べるために、モロニーマウス白血病ウイルスの逆転写酵素（Ｍ−ＭｕＬＶＲＴ）の進化実験を実施した。実験の一般的スキームを図６に示す。ヌクレオチド類似体ｄＰＴＰ及び８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰを用いたエラープローンＰＣＲにより逆転写酵素の初期突然変異体ライブラリを構築した。遺伝子全体（〜２ｋｂ）に対して突然変異を誘発し、１遺伝子当たり２ヌクレオチド〜３ヌクレオチド、即ち１アミノ酸〜２アミノ酸に突然変異を導入した。逆転写酵素（プロテインＤと融合している）ＭＬＶ＿ｐＤの突然変異体ライブラリをコードするＰＣＲ断片を用いてｍＲＮＡを合成した。インビトロ翻訳反応には精製ｍＲＮＡを用いた。翻訳混合物中でｍＲＮＡ−リボソーム−ＭＬＶ＿ｐＤ（ｔＲＮＡ）の三元複合体（ＴＣ）が形成され、低温及び高濃度Ｍｇ２＋イオンにより安定化された。ショ糖クッション溶液上で超遠心することによりＴＣの混合物を精製した。沈殿したＴＣを氷冷バッファ（５０ｍＭ Ｍｇ２＋）に溶解させ、ＲＴ反応用外因性ｄＮＴＰセット及びプライマーを添加した逆転写反応混合物を調製するために用いた。氷冷ＲＴ反応混合物を乳化させ、〜２μｍの大きさの〜１×１０１０個の油中水型区画を得た。ＭＬＶ ＲＴの最適反応温度は〜４２℃である。高温でより良好に機能する逆転写酵素変異体を選択するために、乳化したＲＴ反応混合物（１区画当たりＴＣ（ｍＲＮＡ＋ＭＬＶ ＲＴ）１個未満）を５０℃で１時間インキュベートした。この温度において、より活性の高い又はより熱安定性の高いＭＬＶ逆転写酵素変異体を含む区画では完全長ｃＤＮＡの合成が成功裏に実施された。次いでＰＣＲを用いて完全長ｃＤＮＡを増幅させ、より活性が高く且つより熱安定性の高い逆転写酵素遺伝子を富化させた。ライゲーションＰＣＲによりインタクトな５’配列（ＳＴＡＲＴ断片−Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＤ、及びｈｉｓタグコーディング配列）及び３’配列（ＥＮＤ断片−ｇｓリンカー、プロテインＤ、及び第２のｇｓリンカー）を修復して、ＰＣＲにより増幅された遺伝子をＣＲＤフォーマットに戻した。
逆転写酵素遺伝子の富化ライブラリを含有している再構築ＰＣＲ断片を、後のｍＲＮＡ転写及び次のＣＲＤ選択ラウンドで用いた。漸増ＲＴ反応温度下：５０℃（第１ラウンド）、５２．５℃（第２ラウンド）、５５℃（第３ラウンド）、５７．５℃（第４ラウンド）、及び６０℃（第５ラウンド）で各選択ラウンドを実施した。
第５選択ラウンド後の逆転写酵素遺伝子（Ｃ末端にｐＤリンカーを有しない）の増幅ライブラリをプラスミドベクターにクローニングした。個々のクローンの配列を決定し分析した。親和性クロマトグラフィーを用いｈｉｓタグを介して進化したタンパク質及び個々の突然変異体のプールを精製した。３７℃、５０℃におけるＭＬＶ逆転写酵素の比活性、及び５０℃で５分間酵素をインキュベートした後の３７℃における残存活性を測定した。
方法及び材料
初期プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ（配列番号１及び図２）をエラープローンＰＣＲの出発物質として用いた。ヌクレオチド類似体ｄＰＴＰ及び８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰを用いて突然変異を導入した。エラープローンＰＣＲ用ＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｅｓｐプライマー（配列番号１３）（０．５μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｅｒｉプライマー（配列番号１４）（０．５μＬ）；１０μＭのｄＰＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ）（１μＬ）；１００μＭの８−ｏｘｏ−ｄＧＴＰ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｇｉｅｓ）（５μＬ）；４０ｎｇ／μＬ（全体で１５０ｎｇ）のｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤプラスミド（３．７５μＬ）；水（６１．２５μＬ）。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、３０サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で２分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。１５０ｎｇのプラスミド（７，８７３ｂｐ）標的から約６〜１２μｇの増幅産物（ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤでは２，０７７ｂｐのＰＣＲ断片）に１５０〜３００倍に増幅された。ＰＣＲ断片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを用いて精製し、Ｅｓｐ３Ｉ（認識配列ＣＧＴＣＴＣ（１／５））及びＥｃｏＲＩ（認識配列Ｇ↓ＡＡＴＴＣ）で切断し、最後にＱｉａｇｅｎ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてアガロースゲルから精製し、〜５０ｎｇ／μＬのＤＮＡ濃度を得た。
サブクローニングしてＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断されたオリジナルのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤプラスミドに戻した個々のクローンの配列を決定することにより突然変異誘発の効率及びライブラリの品質を調べた。予想通り突然変異はＭＬＶ ＲＴ遺伝子の増幅された配列全体に亘ってランダムに分布していた（表１）。１０個の配列決定された遺伝子中で２３箇所のヌクレオチド突然変異（１箇所の塩基転換、２０箇所の変化、２箇所の欠失−表１では赤で標識されている）が見られ、これによりアミノ酸置換が１５箇所、サイレント突然変異が６箇所、終止コドンが１箇所、及びコードフレームのフレームシフトが２箇所生じた。これは１遺伝子当たり平均して１〜２個のアミノ酸置換にあたる。
ＣＲＤ選択に好適なＰＣＲ断片を得るために、突然変異体ライブラリをＳＴＡＲＴ断片（２４４ｂｐ）及びＥＮＤ断片（３９８ｂｐ）とライゲーションさせた（図７）。最初に９８３ｂｐのＳＴＡＲＴ断片をＰＣＲで増幅させ（標的−プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（配列番号２）、プライマー−ｐｒｏ−ｐＩＶＥＸ（配列番号３）及びＭ＿１Ｒ（配列番号１５））、次いでＮｃｏＩ（認識配列Ｃ↓ＣＡＴＧＧ）で切断して２４４ｂｐのＤＮＡ断片を得ることにより、ＳＴＡＲＴ断片（Ｔ７ポリメラーゼプロモータ、ＳＤ、及びｈｉｓタグコード配列を含む）を構築した。最初に１，０３９ｂｐのＥＮＤ断片をＰＣＲで増幅させ（標的−プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（配列番号２）、プライマー−Ｍ＿３Ｆ（配列番号１６）及びｐＤ−ｔｅｒ（配列番号４））、次いでＥｃｏＲＩ（認識配列Ｇ↓ＡＡＴＴＣ）で切断し、３９８ｂｐのＤＮＡ断片を得ることにより、ＥＮＤ断片（ｇｓリンカー、プロテインＤ、及び第２のｇｓリンカー配列を含む）を構築した。
ライゲーション反応物（１５０μＬ）を室温で調製した：Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ用１０×ライゲーションバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１５μＬ）；１ｕ／μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１５μＬ）；Ｅｓｐ３Ｉ（ＮｃｏＩ適合末端）及びＥｃｏＲＩ（〜１，３００ｎｇ又は〜５．９×１０１１分子）で切断された突然変異ＭＬＶ ＲＴライブラリ５０ｎｇ／μＬ（２６μＬ）；ＮｃｏＩ（〜３２９ｎｇ又は〜１．２×１０１２分子）で切断された開始断片３５ｎｇ／μＬ（９．４μＬ）；ＥｃｏＲＩ（〜５４８ｎｇ又は〜１．２×１０１２分子）で切断されたＥＮＤ断片３５ｎｇ／μＬ（１５．７μＬ）；水（６８．９μＬ）。＋４℃で一晩ライゲーションを実施した。反応混合物をフェノールで１回、クロロホルムで２回処理し、沈殿させ、５３μＬの水に溶解させた。ライゲーション混合物と既知の量のプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤの増幅効率を比較することにより、ライゲーション効率は〜２０％であると決定された。ライゲーション効率が２０％であることを鑑みて、ＭＬＶ突然変異体ライブラリの多様性は〜１．２×１０１１分子（５０μＬ）であると定義された。
ライゲーションされたＭＬＶ ＲＴライブラリをＰＣＲにより増幅させた（１ｍＬ−氷上で調製）：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１００μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１００μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６０μＬ）；ＤＭＳＯ（Ｄ８４１８−Ｓｉｇｍａ）（８０μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；１００μＭのｐｒｏ−ｐＩＶＥＸプライマー（配列番号３）（５μＬ）；１００μＭのｐＤ−ｔｅｒ−プライマー（配列番号１７）（５μＬ）；ライゲーションされたＭＬＶ ＲＴライブラリ（〜５×１０１０分子）（２０μＬ）；水（６１０μＬ）。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、１５サイクル（９４℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、及び７２℃で３分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。長さ２，７０２ｂｐの最終ライゲーション断片である標的〜５×１０１０分子（〜１５０ｎｇに相当）から増幅産物（２，７０２ｂｐＰＣＲ断片）〜３０μｇ（３０ｎｇ／μＬ）に〜２００倍に増幅された。
第１選択ラウンド
転写混合物（１００μＬ）を調製した：５×Ｔ７転写バッファ（１ＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）（２０μＬ）；１５０ｍＭの酢酸マグネシウム；１０ｍＭのスペルミジン；０．２ＭのＤＴＴ）；２５ｍＭの各ＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２８μＬ）；２０ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２μＬ）；３０ｎｇ／μＬの突然変異体ライブラリ（ｐｒｏ−ｐＩＶＥＸ／／ｐＤ−ｔｅｒ−）ＰＣＲ混合物（〜９００ｎｇ又は〜３×１０１１分子）（３０μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（１６μＬ）。３７℃で３時間転写を実施した（ライブラリの多様性〜５×１０１０分子）。
転写混合物を、２００μＬの氷冷ヌクレアーゼ不含水で希釈し、２００μＬの６Ｍ ＬｉＣｌ溶液を添加した。＋４℃で３０分間混合物をインキュベートし、最高速度（２５，０００ｇ）で冷却遠心機を用いて＋４℃にて３０分間遠心分離した。上清を廃棄し、５００μＬの氷冷７５％エタノールでＲＮＡペレットを洗浄した。最高速度で冷却遠心機を用いて＋４℃にて５分間再度遠心管を遠心分離に供し、上清を廃棄した。ＲＮＡペレットを室温で１２分間乾燥させ、次いで１，４００ｒｐｍで＋４℃にて１５分間振盪することにより、２００μＬのヌクレアーゼ不含氷冷水に再懸濁させた。溶解していないＲＮＡを分離するために、最高速度で冷却遠心機を用いて＋４℃にて５分間遠心管を再び遠心分離に供した。１０×ＤＮａｓｅＩバッファ（Ｍｇ２＋）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；１ｕ／μＬのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ不含）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）を含む新たな試験管に約１８０μＬの上清を移し、ＤＮＡを分解するために＋３７℃で３０分間インキュベートした。２０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）及び５００μＬの氷冷９６％エタノールを反応混合物に添加した。最後に、−２０℃で３０分間インキュベートし、最高速度（２５，０００ｇ）の冷却遠心機を用いて＋４℃で３０分間遠心分離することによりＲＮＡを沈殿させた。上清を廃棄し、５００μＬの氷冷７５％エタノールでＲＮＡペレットを洗浄した。最高速度で冷却遠心機を用いて＋４℃にて５分間遠心管を再度遠心分離に供し、上清を廃棄した。室温で１２分間ＲＮＡペレットを乾燥させ、次いで＋４℃、１，４００ｒｐｍで１０分間振盪することにより、３３μＬのヌクレアーゼ不含氷冷水に再懸濁させた。ＲＮＡ溶液を３×１０μＬに分注し、液体窒素で凍結させた。ｍＲＮＡの濃度を分光光度計で測定し、ＲｉｂｏＲｕｌｅｒＴＭＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ，Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いてアガロースゲルでダブルチェックした。ＭＬＶ ＲＴライブラリのｍＲＮＡは〜２．１μｇ／μＬであった。
ＲＴＳ１００ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＹ（０３ １８６ １４８ ００１−Ｒｏｃｈｅ）翻訳系（２５μＬ）を用いてインビトロ翻訳を実施した：Ｅ．ｃｏｌｉ溶菌液（Ｒｏｃｈｅ）（６μＬ）；反応混合物（Ｒｏｃｈｅ）（５μＬ）；アミノ酸（Ｒｏｃｈｅ）（６μＬ）；１００ｍＭ Ｍｅｔ（Ｒｏｃｈｅ）（０．５μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（０．５μＬ）；２００μＭのａｓｓｒＡオリゴヌクレオチド（配列番号５）（０．４μＬ）；１ＭのＤＴＴ；再構築バッファ（Ｒｏｃｈｅ）（０．２５μＬ）（３μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（２．５μＬ）、及び２．１μｇ／μＬのｍＲＮＡ（〜１，２００ｎｇ）（０．６μＬ）。３０℃で２０分間反応混合物をインキュベートした。１５５μＬの氷冷停止バッファＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ））を添加することにより翻訳を停止させ、＋４℃、２５，０００ｇで５分間遠心分離した。８４０μＬの３５％（ｗ／ｖ）ショ糖−ＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ）；３５％（ｗ／ｖ）−ショ糖（８４０９７−Ｆｌｕｋａ））溶液上に１６０μＬの遠心分離した翻訳混合物を非常に慎重にピペットで入れた。ｍＲＮＡ−リボソーム−ＭＬＶ（ｔＲＮＡ）の三元複合体（ＴＣ）を精製するために、ＴＬ−１００ Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心機；ＴＬＡ１００．２固定角ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ）；透明な１ｍＬ超遠心管（３４３７７８−Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて＋４℃、１００，０００ｒｐｍで９分間超遠心した。超遠心管の底部に存在するＴＣの小さく透明なペレットを保持するために、管全体を注意深く取り扱った。最初に７５０μＬの溶液を遠心管の最上部から除去した。次いで（非常に慎重に）管壁を７５０μＬのＷＢＫ５００（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ）で洗浄した。最後に、遠心管の最上部から始めて全ての溶液を除去し、ペレットを３０μＬの氷冷停止バッファＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ））に溶解させた。
放射活性標識ｍＲＮＡを用いて実験的に決定されたように、超遠心後インプットｍＲＮＡの５％〜３０％は、三元複合体ペレット中に存在する。したがって、３０μＬのバッファ（〜１２ｎｇ／μＬ又は９×１０９分子／μＬの三元複合体）中に３６０ｎｇ（翻訳反応で用いられた１，２００ｎｇのｍＲＮＡの３０％）未満のｍＲＮＡが存在すると予想された。
選択用逆転写反応混合物を氷上で調製した：逆転写酵素用５×反応バッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６０μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（７．５μＬ）；２０μＭのｐＤ＿４２オリゴヌクレオチド（配列番号８）（１５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（１８６μＬ）、及び精製（１．８×１０１０分子未満）ＴＣ（Ｒｏｃｈｅ−ＲＴＳ ＨＹ ｋｉｔで翻訳）（１．８μＬ）。反応混合物を２本の試験管に４５μＬと２２５μＬに再度分注した。第１部（４５μＬのＲＴ混合物）に５μＬのヌクレアーゼ不含水を添加した。このサンプルは、陰性選択対照（ｄＮＴＰ無）であるとみなされ、反応混合物中にＤＮＡが夾雑しておらず、ｃＤＮＡ合成が三元複合体におけるＭＬＶ ＲＴから生じる逆転写酵素の機能活性と密接に関連していることを証明しなければならない。第２部（２２５μＬのＲＴ混合物）に１０ｍＭの各ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）２５μＬを添加し、２本の試験管に反応混合物を再度分注した。１本は選択対照用の２００μＬ（４×５０μＬ）（全体で１．２×１０１０分子未満のＴＣ）であり、もう１本は２００ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｈ−Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）１μＬを添加した陽性選択対照用の５０μＬであった。プロトコルによれば、各逆転写反応混合物は、５０μＬの体積中に３×１０９分子未満の三元複合体を含有する。
最終濃度が４％（ｖ／ｖ）になるようにＡＢＩＬ ＥＭ９０（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ）を鉱物油（Ｍ５９０４−Ｓｉｇｍａ）に混合することにより乳化のための油−界面活性剤混合物を調製した（Ｇｈａｄｅｓｓｙ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，２００４；米国特許出願公開第２００５０６４４６０号明細書）。９５０μＬの油−界面活性剤混合物を５０μＬのＲＴ混合物と混合することにより、５ｍＬの低温貯蔵バイアル（４３０４９２−Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で＋４℃にてエマルションを調製した。〜２，１００ｒｐｍのＭＳ−３０００調速磁気攪拌機（Ｂｉｏｓａｎ）及びＲｏｔｉｌａｂｏ（登録商標）（３×８ｍｍ）中央リング付磁気撹拌子（１４８９．２−Ｒｏｔｈ）を用いて混合を行い、３０秒間に１回１０μＬのアリコートを水相に添加し、更に２分間混合を続けた（合計混合時間４分間）。光学顕微鏡データによれば、本発明のエマルション中の区画の大きさは０．５μｍ〜１０μｍであり、平均直径は〜２μｍである。したがって、３×１０９分子未満の三元複合体を含有する逆転写反応混合物５０μＬの乳化後、〜１×１０１０個の油中水型区画が存在すると予測された（ｍＲＮＡ及び逆転写酵素は３〜４区画当たり約１分子）。
高温で良好に機能する逆転写酵素の変異体を選択するために、エマルション全てを＋５０℃で１時間インキュベートした。反応混合物を回収するために、エマルションを１．５ｍＬの試験管に移し、室温、２５，０００ｇで１０分間再び遠心分離した。油相を除去して、試験管の底部に濃縮（しかし依然としてインタクトである）エマルションを残した。０．９ｍＬの水−飽和エーテル、０．９ｍＬの水−飽和酢酸エチル（ＡＢＩＬ ＥＭ９０洗剤を除去するため）、及び再度０．９ｍＬの水−飽和エーテルで抽出することにより、エマルションを破壊した。真空下において室温で５分間水相を乾燥させ。２５０μＬのＰＢバッファ（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を添加した。４つの選択サンプルを２本の試験管にまとめた。合成されたｃＤＮＡをＱｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔで更に精製し、陰性選択対照及び陽性選択対照の場合３０μＬ、選択対照の場合２×３０μＬのＥＢバッファ（Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ）で溶出した。
ネステッドＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を実施した。最初に、陰性選択対照及び陽性選択対照を確認し、選択サンプル中のｃＤＮＡの効率的増幅に必要なＰＣＲサイクルの最小数を決定するために小規模ＰＣＲ増幅を実施した。ＰＣＲ混合物（２００μＬ）を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１２μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．５μＬ）；２．５ｕ／μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）；１００μＭのＲＤ＿Ｎｄｅプライマー（配列番号９）（１μＬ）；１００μＭのｐＤ＿５５プライマー（配列番号１０）（１μＬ）；選択対照の精製ｃＤＮＡ（５０μＬ）；水（９２μＬ）。２，１８５ｂｐのＰＣＲ断片のためのサイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２５サイクル（９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、及び７２℃で２分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。
遺伝子全体を増幅させるためのネステッドＰＣＲ混合物（５００μＬ）を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３０μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６．２５μＬ）；２．５ｕ／μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．５μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｅｓｐプライマー（配列番号１３）（２．５μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｅｒｉプライマー（配列番号１４）（２．５μＬ）；５０μＬの第１ＰＣＲ産物（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）；水（３０６μＬ）。２，０７７ｂｐのＰＣＲ断片のためのサイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２２サイクル（９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間，及び７２℃で２分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。
選択サンプルの最後のＰＣＲ断片をＱｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてアガロースゲル精製した（６０μＬで溶出（〜５０ｎｇ／μＬ））。３７℃で１時間ＥｃｏＲＩ及びＥｓｐ３Ｉで精製ＰＣＲ断片を切断し、再度アガロースゲル精製した（３０μＬで溶出（〜５０ｎｇ／μＬ））。
ＣＲＤ選択（図６）の第２ラウンドに好適なＰＣＲ断片（図７）を得るために、第１選択ラウンド後に回収されたＭＬＶ逆転写酵素ライブラリをＳＴＡＲＴ断片及びＥＮＤ断片とライゲーションさせた（この実施例で既に記載されているコンストラクション）。ライゲーション反応物（４０μＬ）を室温で調製した：Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ用１０×ライゲーションバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４μＬ）；１ｕ／μＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２μＬ）；Ｅｓｐ３Ｉ及びＥｃｏＲＩで切断された選択ライブラリ（〜２００ｎｇ又は〜０．９×１０１１分子）５０ｎｇ／μＬ（４μＬ）；ＮｃｏＩで切断されたＳＴＡＲＴ断片（〜３５ｎｇ又は〜１．５×１０１１分子）３５ｎｇ／μＬ（１．１μＬ）；ＥｃｏＲＩで切断されたＥＮＤ断片（〜６１ｎｇ又は〜１．５×１０１１分子）３５ｎｇ／μＬ（１．７６μＬ）；水（２７．２μＬ）。室温で１時間ライゲーションを実施した。
ライゲーションさせたＭＬＶ ＲＴライブラリをＰＣＲにより増幅させた（３００μＬ−氷上で調製）：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１８μＬ）；ＤＭＳＯ（Ｄ８４１８−Ｓｉｇｍａ）（２４μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３．７μＬ）；２．５ｕ／μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１．５μＬ）；１００μＭのｐｒｏ−ｐＩＶＥＸプライマー（配列番号３）（１．５μＬ）；１００μＭのｐＤ−ｔｅｒ−プライマー（配列番号１７）（１．５μＬ）；ライゲーションしたＭＬＶ ＲＴライブラリ（０．６×１０１０分子未満）（２５．５μＬ）；水（１６４．３μＬ）。２，７０２ｂｐのＰＣＲ断片のためのサイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、１５サイクル（９４℃で４５秒間、５３℃で４５秒間，及び７２℃で３分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。ＰＣＲ断片をＱｉａｇｅｎ ｇｅｌ ｅｘｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔを用いてアガロースゲル精製した（３０μＬで溶出（〜１００ｎｇ／μＬ））。
第２選択ラウンド
ＰＣＲサイクル、乳化ＲＴ反応温度、及び更に幾つかの詳細について軽微な変更を行ったことを除いて、第１選択ラウンドの実験スキームの一般的な設定に従って第２選択ラウンドを実施した。
全ての変更点を以下に記載する：
・転写 １００ｎｇ／μＬ（〜１，０００ｎｇ）のアガロースゲル精製ＰＣＲ断片（１０μＬ）を用いた；第２選択ラウンドで用いられたｍＲＮＡの最終濃度は、１．５μｇ／μＬであった；
・翻訳 １．５μｇ／μＬ（〜１．２μｇ）のｍＲＮＡ（０．８μＬ）を用いた；
・乳化ＲＴ反応 ５２．５℃で１時間行った；
・第１ＰＣＲ（ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５） ２４サイクル実施した；
・第２（ネステッド）ＰＣＲ（Ｍ＿Ｅｓｐ／／Ｍ＿Ｅｒｉ） ２３サイクル実施した；
・切断されたＰＣＲ断片の最終濃度 ８０ｎｇ／μＬ；
・ライゲーション ２００ｎｇ（〜０．９×１０１１分子）のＭＬＶ ＲＴライブラリを用いた；
・ＰＣＲ（ライゲーション混合物に対する） ０．６×１０１０分子未満の選択されたライブラリを用い、ＰＣＲを１５サイクル実施した；アガロースゲル精製ＰＣＲ断片の最終濃度は、２００ｎｇ／μＬであった。
第３選択ラウンド
ＰＣＲサイクル、乳化ＲＴ反応温度、及び更に幾つかの詳細について軽微な変更を行ったことを除いて、第１選択ラウンドの実験スキームの一般的な設定に従って、第３選択ラウンドを実施した。
全ての変更点を以下に記載する：
・転写 ２００ｎｇ／μＬ（〜１，０００ｎｇ）のアガロースゲル精製ＰＣＲ断片（５μＬ）を用いた；第３選択ラウンドで用いられたｍＲＮＡの最終濃度は、１．５μｇ／μＬであった；
・翻訳 １．５μｇ／μＬ（〜１．２μｇ）のｍＲＮＡ（０．８μＬ）を用いた；
・乳化ＲＴ反応 ５５℃で１時間行った；
・第１ＰＣＲ（ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５） ２５サイクル実施した；
・第２（ネステッド）ＰＣＲ（Ｍ＿Ｅｓｐ／／Ｍ＿Ｅｒｉ） ２２サイクル実施した；
・切断されたＰＣＲ断片の最終濃度 ７０ｎｇ／μＬ；
・ライゲーション ２００ｎｇ（〜０．９×１０１１分子）のＭＬＶ ＲＴライブラリを用いた；
・ＰＣＲ（ライゲーション混合物に対する） ０．６×１０１０分子未満の選択されたライブラリを用い、ＰＣＲを１５サイクル実施した；アガロースゲル精製ＰＣＲ断片の最終濃度は、１００ｎｇ／μＬであった。
第４選択ラウンド
ＰＣＲサイクル、乳化ＲＴ反応温度、及び更に幾つかの詳細について軽微な変更を行ったことを除いて、第１選択ラウンドの実験スキームの一般的な設定に従って、第４選択ラウンドを実施した。
全ての変更点を以下に記載する：
・転写 １００ｎｇ／μＬ（〜１，０００ｎｇ）のアガロースゲル精製ＰＣＲ断片（１０μＬ）を用いた；第４選択ラウンドで用いられたｍＲＮＡの最終濃度は、１．８μｇ／μＬであった；
・翻訳 １．８μｇ／μＬ（〜１．２μｇ）のｍＲＮＡ（０．６７μＬ）を用いた；
・乳化ＲＴ反応 ５７．５℃で１時間行った；
・第１ＰＣＲ（ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５） ２５サイクル実施した；
・第２（ネステッド）ＰＣＲ（Ｍ＿Ｅｓｐ／／Ｍ＿Ｅｒｉ） ２４サイクル実施した；
・切断されたＰＣＲ断片の最終濃度 ５０ｎｇ／μＬ；
・ライゲーション ２００ｎｇ（〜０．９×１０１１分子）のＭＬＶ ＲＴライブラリを用いた；
・ＰＣＲ（ライゲーション混合物に対する） ０．６×１０１０分子未満の選択されたライブラリを用い、ＰＣＲを１５サイクル実施した；アガロースゲル精製ＰＣＲ断片の最終濃度は、１００ｎｇ／μＬであった。
第５選択ラウンド
ＰＣＲサイクル、乳化ＲＴ反応温度、及び更に幾つかの詳細について軽微な変更を行ったことを除いて、第１選択ラウンドの実験スキームの一般的な設定に従って、第５選択ラウンドを実施した。
全ての変更点を以下に記載する：
・転写 １００ｎｇ／μＬ（〜１，０００ｎｇ）のアガロースゲル精製ＰＣＲ断片（１０μＬ）を用いた；第５選択ラウンドで用いられたｍＲＮＡの最終濃度は、１．１μｇ／μＬであった；
・翻訳 １．１μｇ／μＬ（〜１．２μｇ）のｍＲＮＡ（１．１μＬ）を用いた；
・乳化ＲＴ反応 ６０℃で１時間行った；
・第１ＰＣＲ（ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５） ２５サイクル実施した；
・第２（ネステッド）ＰＣＲ（Ｍ＿Ｅｓｐ／／Ｍ＿Ｅｒｉ） ３３サイクル実施した；
遺伝子全体を増幅するためのネステッドＰＣＲ混合物（５００μＬ）を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３０μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６．２５μＬ）；２．５ｕ／μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．５μＬ）；１００μＭ Ｍ＿Ｅｓｐプライマー（配列番号１３）（２．５μＬ）；１００μＭ Ｍ＿Ｈｉｎｄ３＋プライマー（配列番号１８）（２．５μＬ）；第１ＰＣＲ産物（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）（５０μＬ）；水（３０６μＬ）。２，０７７ｂｐのサイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２２サイクル（９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、及び７２℃で３分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。
Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キット（６０μＬで溶出（〜６０ｎｇ／μＬ））を用いて選択サンプルの最終的なＰＣＲ断片をアガロースゲル精製した。精製ＰＣＲ断片を３７℃で１時間ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｓｐ３Ｉで切断し、再度アガロースゲル精製した（４０μＬで溶出（〜５０ｎｇ／μＬ））。
第５選択ラウンド後に回収したＭＬＶ逆転写酵素ライブラリを、ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断したｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ（配列番号１及び図２）から調製したプラスミドベクターにライゲーションし、親和性クロマトグラフィーを用いて迅速にタンパク質を精製するためにＮ末端にｈｉｓタグを備え、Ｃ末端でｐＤに融合していない、ＭＬＶ ＲＴをコードする新規７，４７４ｂｐ プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ（配列番号１９）を得た。
第５選択ラウンド後にライゲーションしたＭＬＶ ＲＴライブラリをＴ７発現株ＥＲ２５６６に電気穿孔した。個々のクローンの配列を決定し分析した。進化したタンパク質、同コンストラクション中の個々の突然変異体及び一次野生型Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素のプールを、２００ｍＬのＬＢ中でＡ５９０が〜０．７になるまで増殖させ、２ｍＬのＱｉａｇｅｎ−Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂を用いてｈｉｓタグを介して親和性クロマトグラフィーにより精製した（全ての精製は供給業者の推奨に従って自然条件下で実施された）。溶出は、１ｍＬのＥＢ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び０．１％のｔｒｉｔｏｎＸ−１００）中で実施された。全てのタンパク質を５０倍過剰の保存バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．３）、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）で透析した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（通常標的タンパク質は〜４０〜８０％）。Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ（５００−０００６）に基づくＢｒｅｄｆｏｒｄ法を用いてタンパク質濃度を測定した。
ＭＬＶ逆転写酵素の比活性を３７℃、５０℃で測定し（酵素は特別な希釈バッファ：３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで希釈した）、５０℃で５分間酵素をインキュベートした後３７℃にて残存活性を測定した（酵素を希釈し、１×ＲＴ反応バッファ：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＫＣｌ中で該酵素の安定性を測定した）。全ての場合の酵素活性を、以下の最終混合物中でアッセイした：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、０．４ＭＢｑ／ｍＬの［３Ｈ］−ｄＴＴＰ、０．４ｍＭのｐｏｌｙＡ・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８特定の反応温度において１０分間でポリヌクレオチド画分（ＤＥ−８１に吸着）に取り込まれるｄＴＭＰを測定し、既知の量の市販酵素と比較して活性単位を決定した。
結果
選択データの分析中、完全長Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を発現する１０４個の配列を収集した。文献中で通常用いられているのと同じアミノ酸の数表現を用いるために、全てのタンパク質の全体ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント（表２Ａ〜表２Ｎ）は、Ｎ末端のＨｉｓタグを含まないよう編集する。ＭＬＶと表記される野生型配列は、常に最初の配列として示される。突然変異体を黒色背景中に白色フォントで示す（表２Ａ〜表２Ｎ）。その突然変異がＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の性質をいくらか改善するアミノ酸位置及び異なる特許出願に記載されているアミノ酸位置を、灰色で強調されたアミノ酸（白色フォント）の列としてアラインメント中に示す。本発明の選択から得られた突然変異であって、灰色の列に位置する突然変異は、本発明の選択手順が有益なホットスポットを正確に標的としていること、又は他の文献に記載されている正確なアミノ酸突然変異さえも標的としていることを示す証拠として機能する。１０４個の配列決定されたクローンのうち、９８個が独自の配列を有し、１個が野生型（Ｌ５＿８７）配列であることが見出された。５個の配列は２回出現している（Ｌ５＿２１及びＬ５＿１１１；Ｌ５＿４３及びＬ５＿１１２；Ｌ５＿４９及びＬ５＿６３；Ｌ５＿６４及びＬ５＿９３；Ｌ５＿８５及びＬ５＿９６）。合計でランダムに発現する５５個のタンパク質が得られた。５５個の発現タンパク質のうち、４０個の酵素活性を有する突然変異体Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（対照野生型を含む）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより４０％〜８０％の純度まで精製することに成功した。精製ＲＴサンプル中の総タンパク質濃度は、０．６ｍｇ／ｍＬ〜５．５ｍｇ／ｍＬであった。突然変異体ＲＴを、逆転写酵素の３７℃における活性、５０℃における活性、及び５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における残存活性について試験した（図８）。３７℃における逆転写酵素活性を１００％に正規化し、図８では省略した。従って２種の列（５０℃におけるＲＴ活性の割合、及び５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における残存活性の割合）のみを示す。突然変異体ライブラリの構築に用いた野生型Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を対照として示す。この一次酵素は、ＲＴの突然変異体と同種のベクター内で発現し、同様の方法で精製された。５０℃における野生型酵素のＲＴ活性の平均値は、３７℃における活性と比べて約４５％である。稀に例外はあるが試験したタンパク質のほぼ全ては、５０℃において４５％より高い活性を有する。全ての試験した突然変異体の５０℃におけるＲＴ活性の平均値は約〜９２％であり、野生型酵素（４５％）に比べて２倍以上高い。幾つかの突然変異体は、５０℃においても３７℃における活性の１００％又は更に高い活性を有する：２０、２３、Ｌ５＿１６、Ｌ５＿２４、Ｌ５＿３０、Ｌ５＿３５、Ｌ５＿３７、Ｌ５＿４３、Ｌ５＿４６、Ｌ５＿４７、Ｌ５＿４９、Ｌ５＿５２、Ｌ５＿５５、Ｌ５＿６４、Ｌ５＿６５、Ｌ５＿６８、Ｌ５＿７２。５０℃において最も高いＲＴ活性を有する突然変異体は約１４０％以上（野生型の４５％よりも３倍高い）の活性を有することが見出された：２０（１６５％）、Ｌ５＿３７（１６２％）、Ｌ５＿４３（１５６％）、Ｌ５＿４６（１３５％）、Ｌ５＿４７（１７９％）、Ｌ５＿５２（１３７％）、Ｌ５＿６４（１４２％）、及びＬ５＿６８（１５３％）。
殆どの突然変異体は５０℃において非常に高いＲＴ活性を有するにもかかわらず、熱安定性は高くない。野生型対照を５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における残存ＲＴ活性は〜１１％である。選択された酵素の同条件下における平均残存活性も〜１２％である。しかし幾つかの試験されたＲＴ変異体は実質的に熱安定性が高く、野生型酵素（１１％）よりも２倍〜３倍高い残存活性を有する：Ｌ５＿８（２５％）、Ｌ５＿４３（３２％）、Ｌ５＿４６（２７％）、Ｌ５＿６４（２８％）、Ｌ５＿６５（２５％）、Ｌ５＿６８（３１％）。
部分的に精製された野生型酵素の比活性（ｕ／ｍｇタンパク質）は、２００，０００ｕ／ｍｇである（図９）。選択されたＲＴ変異体を発現させ、非常に多様な方法で精製したところ、平均比活性（〜１５５，０００ｕ／ｍｇ）は野生型対照より僅かに低い（図９）。比活性が低下する場合もあり、増加する場合もある（２０−〜２７４，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿１１−〜２７３，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿２８−〜２３０，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿３０−〜２２４，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿３５−〜３１６，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿４３−〜３２８，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿４６−〜３０４，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿５２−〜３１０，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿６４−〜２５６，０００ｕ／ｍｇ；Ｌ５＿６５−〜２４７，０００ｕ／ｍｇ）。
本発明の選択系が有効に機能していることは明らかである。選択圧因子としてＲＴ反応の温度を上昇させることにより、より反応が早く（５０℃におけるＲＴ比活性が高い）、より熱安定性である（５０℃において５分間プレインキュベートした後の３７℃におけるＲＴの残存活性）逆転写酵素の進化がなし遂げられた。
有益な情報源は、選択されたタンパク質配列のアラインメントである（表２Ａ〜表２Ｎ）。５０℃における活性が一次野生型Ｍ−ＭｕＬＶに比べて実質的に優れている（野生型の酵素活性４５％に対して７０％以上）分析されたタンパク質の配列を灰色で強調する（表２Ａ〜表２Ｎ）。突然変異アミノ酸数は０（野生型又はＬ５＿８７）〜１２（Ｌ５＿９）の範囲で変動する。全ての選択されたＲＴ変異体で見出された突然変異体の一覧を表３Ａ〜表３Ｄに示す。タンパク質は突然変異体の数で降順に並び替えられている。殆どの突然変異体（１０４個のうち５３個）は、１配列当たり４個〜６個の突然変異を有していた。逆転写酵素配列が幾つかのホットスポットを有し、該ホットスポットが全体的にＲＴ反応にとって、及び酵素の熱安定性にとって非常に重要且つ有益であることは明らかである。これらホットスポットは、特定の位置における突然変異の集合として複数の配列アラインメント（表２Ａ〜表２Ｎ）において容易に同定することができる。優れた性質を有するＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の変異体に見られる突然変異が特に重要である（灰色で強調された配列−表２Ａ〜表２Ｎ）。最も頻繁に出現する突然変異についての情報を要約したもの（降順）を表４Ａ〜表４Ｎに示す。これまでの図のように、５０℃において実質的に高い活性を有する突然変異タンパク質を灰色で強調する。同一箇所における突然変異が多数回出現しており、且つこの突然変異を有する逆転写酵素を試験したところ５０℃においてより優れた性質を有している場合、この突然変異は逆転写反応にとっていくらか有益であることを意味する。
突然変異が見られる頻度によって、突然変異を５つのクラスに分類することができる：２１回〜３１回出現；１４回〜１８回出現；４回〜７回出現；２回〜３回出現、及び１回出現。最も頻繁に突然変異が起こる最初の群は、アミノ酸Ｄ５２４（３１回出現）；Ｄ２００（３０回出現）；Ｄ６５３（２３回出現）及びＤ５８３（２１回出現）を含む。２つのアミノ酸（Ｄ５２４及びＤ５８３）は、リボヌクレアーゼＨドメインの活性中心においてマグネシウムイオンと錯体化することが知られている。突然変異Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ及びＥ５６２Ｑは、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素のＲＮａｓｅＨ活性を失わせるために用いられ（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）、これによりｃＤＮＡの合成が改善される。本発明の選択の結果は著しく類似している。アスパラギン酸５２４の突然変異は、９８個中３１個の配列で見られる。更にＤ５２４Ｎ置換が１回見られ、Ｄ５２４Ａは１０回、最後にＤ５２４Ｇは２０回見られる。したがって本発明の選択は、重要なアミノ酸を正確に標的とするだけではなく、最良であることが知られているアミノ酸置換と同じアミノ酸置換も正確に標的とする。正確に同じ状況は、１０４個のうち２１個の選択されたタンパク質で出現するアスパラギン酸５８３の突然変異でも見られる。置換Ｄ５８３Ｅは１回、Ｄ５８３Ａは３回、Ｄ５８３Ｇは７回、最後にＤ５８３Ｎは１０回見られる。この場合も、最良であることが知られているのと同じアミノ酸且つ同じ置換（Ｄ５８３Ｎ）が最も頻繁に選択されている。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製市販酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩは、３つの突然変異Ｄ５２４Ｇ、Ｄ５８３Ｎ及びＥ５６２Ｑを有する（国際公開第２００４０２４７４９号パンフレット）。本発明の選択において３番目のアミノ酸置換Ｅ５６２の突然変異が１回しか見られない（Ｌ５＿７１におけるＥ５６２Ｋ）ことは興味深い。この結果は、殆どのグルタミン酸５６２がアスパラギン酸５２４及び５８３ほど重要ではない、又は何らかの理由で個のアミノ酸の交換により幾つかの副作用が引き起こされる恐れがあるため、高温（５０℃超）で実施されるＲＴ反応にとって有益ではないことを示唆する。
選択されたタンパク質配列を更に解析することにより、多くのより突然変異を起こしやすいアミノ酸位置を同定することができ、この突然変異はＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を改善するための他の特許出願に記載されている：Ｈ２０４Ｒ−７回出現（米国特許第７０７８２０８号明細書）；Ｈ６３８Ｒ−４回出現（米国特許出願公開第２００５０２３２９３４Ａ１号明細書）；Ｔ１９７Ａ−２回出現（米国特許第７０５６７１６号明細書）；Ｍ２８９Ｖ（Ｌ）、Ｔ３０６Ａ（Ｍ）−２回出現（米国特許第７０７８２０８号明細書）；Ｅ３０２Ｋ、Ｎ４５４Ｋ−２回出現（国際公開第０７０２２０４５Ａ２号パンフレット）；Ｅ６９Ｇ、Ｌ４３５Ｐ−１回出現（国際公開第０７０２２０４５Ａ２号パンフレット）；Ｙ６４Ｃ、Ｑ１９０Ｒ、Ｖ２２３Ｍ、Ｆ３０９Ｓ−１回出現（米国特許第７０５６７１６号明細書）；Ｅ５６２Ｋ−１回出現（米国特許第７０７８２０８号明細書）。文献に記載されている３つのアミノ酸置換の組み合わせを有する逆転写酵素の２つの配列も選択された（３０−Ｄ２００Ｎ、Ｔ３０６Ｍ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ５８３Ｇ；Ｌ５＿２８−Ｔ３０６Ａ、Ｆ３０９Ｓ、Ｄ５２４Ａ、Ｈ５９４Ｒ、Ｆ６２５Ｓ）。
既知の突然変異に加えて、本発明では頻繁に突然変異が起きている多くのアミノ酸位置を同定した：Ｄ２００Ｎ（Ａ、Ｇ）−３０回出現；Ｄ６５３Ｎ（Ｇ、Ａ、Ｈ、Ｖ）−２３回出現；Ｌ６０３Ｗ（Ｍ）−１８回出現；Ｔ３３０Ｐ−１５回出現；Ｌ１３９Ｐ−１４回出現；Ｑ２２１Ｒ−６回出現；Ｔ２８７Ａ−６回出現；Ｉ４９Ｖ（Ｔ）−５回出現；Ｎ４７９Ｄ−５回出現；Ｈ５９４Ｒ（Ｑ）−５回出現；Ｆ６２５Ｓ（Ｌ）−５回出現；Ｐ６５Ｓ−４回出現；Ｈ１２６Ｓ（Ｒ）−４回出現；Ｌ３３３Ｑ（Ｐ）−４回出現；Ａ５０２Ｖ−４回出現；Ｅ６０７Ｋ（Ｇ、Ａ）−４回出現；Ｋ６５８Ｒ（Ｑ）−４回出現；Ｈ８Ｐ（Ｒ）−３回出現；Ｐ１３０Ｓ−３回出現；Ｅ２３３Ｋ−３回出現；Ｑ２３７Ｒ−３回出現；Ｎ２４９Ｄ−３回出現；Ａ２８３Ｄ（Ｔ）−３回出現；Ａ３０７Ｖ−３回出現；Ｙ３４４Ｈ−３回出現；Ｐ４０７Ｓ（Ｌ）−３回出現；Ｍ４２８Ｌ−３回出現；Ｑ４３０Ｒ−３回出現；Ｄ４４９Ｇ（Ａ）−３回出現；Ａ６４４Ｖ（Ｔ）−３回出現；Ｎ６４９Ｓ−３回出現；Ｌ６７１Ｐ−３回出現；Ｅ６７３Ｇ（Ｋ）−３回出現；Ｎ６７８Ｉ−３回出現（表４Ａ〜表４Ｎ）。
通常最も優れた性質を有するＲＴの変異体は、最も頻繁に改変されるアミノ酸の突然変異を有する：２０（５０℃−１２３％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｌ６０３Ｗ（１８回出現）及びＣ末端が僅かに改変されている−Ｎ６７８Ｉ、Ｓ６７９Ｐ、Ｒ６８０Ａ；
Ｌ５＿３５（５０℃−１２５％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｔ３３０Ｐ（１５回出現）、Ｎ４７９Ｄ（５回出現）；
Ｌ５＿３７（５０℃−１６２％）−Ｈ１２３Ｓ（４回出現）、Ｌ１４９Ｆ（１回出現）、Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｎ４５４Ｋ（２回出現）、Ｄ５８３Ｎ（２１回出現）；
Ｌ５＿４３（５０℃−１６０％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｑ２３７Ｒ（３回出現）、Ｔ３３０Ｐ（１５回出現）、Ｄ５２４Ｇ（３１回出現）、Ｆ６２５Ｓ（５回出現）、Ｄ６５３Ｎ（２３回出現）；
Ｌ５＿４６（５０℃−１３５％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｔ３３０Ｐ（１５回出現）、Ｄ５８３Ｎ（２１回出現）、Ｔ６４４Ｔ（３回出現）；
Ｌ５＿４７（５０℃−１７９％）−Ｎ１０７Ｓ（１回出現）、Ｈ１２６Ｒ（４回出現）、Ｔ１２８Ａ（１回出現）、Ｉ１７９Ｖ（２回出現）、Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｈ６４２Ｙ（２回出現）、Ｄ６５３Ｎ（２３回出現）；
Ｌ５＿５２（５０℃−１３７％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｔ３３０Ｐ（１５回出現）、Ｑ３７４Ｒ（２回出現）、（Ｄ５８３Ｎ（２１回出現）；
Ｌ５＿６４（５０℃−１４２％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｄ２１６Ｇ（２回出現）、Ｄ５２４Ｇ（３１回出現）、Ｅ５４５Ｇ（２回出現）；
Ｌ５＿６５（５０℃−１２７％）−Ｄ２００Ｎ（３０回出現）、Ｑ２３８Ｈ（１回出現）、Ｌ５７０Ｉ（１回出現）、Ｌ６０３Ｗ（１８回出現）；
Ｌ５＿６８（５０℃−１５３％）−Ｍ３９Ｖ（２回出現）、Ｉ４９Ｖ（２回出現）、Ｑ９１Ｒ（２回出現）、Ｈ２０４Ｒ（７回出現）、Ｔ２８７Ａ（６回出現）、Ｎ４５４Ｋ（２回出現）、Ｆ６２５Ｌ（５回出現）、Ｄ６５３Ｈ（２３回出現）。
測定したＲＴ活性と突然変異タンパク質の配列アラインメント解析とを組み合わせたデータセットにより、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素配列中の多くの有益な突然変異（及びその組み合わせ）を決定することができた。
実施例３−モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素突然変異体の解析
実施例２に記載されたインビトロ進化実験は、非常に効率的であった。漸増温度における逆転写反応を選択圧として用い、Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴの多くの様々な突然変異体を生成した。その殆どは、一次酵素に比べて高温でより良好に機能することができた。進化した逆転写酵素の配列解析は、酵素の性質の複雑な改善に関与しているホットスポット及び最も重要なアミノ酸位置（置換）を示す。異なる突然変異の個別の効果を解明するために、Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴの単一箇所突然変異体及び複数箇所突然変異体を構築し、部分的に精製し、解析した。突然変異体構築の出発点は、Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴをコードする７，４７４ｂｐのプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ（配列番号１９）であって、親和性クロマトグラフィーを用いて迅速にタンパク質を精製するためにＮ末端にｈｉｓタグを備えるプラスミドであった。３７℃におけるＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の比活性、５０℃における相対活性、及び５０℃で５分間酵素をインキュベートした後の３７℃における相対残存活性を測定した。場合によってはＲＮａｓｅＨ活性を確認し、１ｋｂ又は４．５ｋｂのＲＮＡに対して異なる温度でｃＤＮＡ合成反応を実施した。
方法及び材料
初期プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ（配列番号１９）を突然変異誘発ＰＣＲの出発物質として用いた。突然変異誘発プライマーを用いて突然変異を導入した。個々のクローンの配列を決定し解析した。Ｍ−ＭｕＬＶ ＲＴ突然変異体を、Ｔ７発現株ＥＲ２５６６で発現させた。同コンストラクト中の個々のタンパク質及び一次野生型Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を、２００ｍＬのＬＢ中でＡ５９０が〜０．７になるまで増殖させ、２ｍＬのＱｉａｇｅｎ−Ｎｉ−ＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂を用いてｈｉｓタグを介して親和性クロマトグラフィーにより精製した（全ての精製は供給業者の推奨に従って自然条件下で実施された）。溶出は、１ｍＬのＥＢ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール（ｐＨ８．０〜、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、及び０．１％のｔｒｉｔｏｎＸ−１００）中で実施された。５０倍過剰の保存バッファ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ８．３）、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）で全てのタンパク質を透析した。タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（通常標的タンパク質は〜４０〜８０％）。Ｂｒｅｄｆｏｒｄ試薬（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ ＃Ｒ１２７１）を用いてタンパク質濃度を測定した。
ＭＬＶ逆転写酵素の活性を３７℃、５０℃で測定し（酵素は特別な希釈バッファ：３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、１０ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡで希釈した）、５０℃で５分間酵素をインキュベートした後３７℃にて残存活性を測定した（酵素を希釈し、１×ＲＴ反応バッファ：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、５０ｍＭのＫＣｌ中で該酵素の安定性を測定した）。以下の最終混合物中で全ての場合の酵素活性をアッセイした：５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、６ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、０．４ＭＢｑ／ｍＬの［３Ｈ］−ｄＴＴＰ、０．４ｍＭのｐｏｌｙＡ・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８特定の反応温度において１０分間でポリヌクレオチド画分（ＤＥ−８１に吸着）に取り込まれるｄＴＭＰを測定し、既知の量の市販酵素と比較して活性単位を決定した。
Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素変異体のＲＮａｓｅＨ活性を、米国特許第５４０５７７６号明細書に従って測定した。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２ｍＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、及び［３Ｈ］（Ａ）ｎ×（ｄＴ）ｎ（５μＭの［３Ｈ］（Ａ）ｎ、３５ｃｐｍ／ｐｍｏｌ；２０μＭ（ｄＴ）ｎ）を含有する反応混合物（５０μＬ）中で精製酵素のＲＮａｓｅＨ活性をアッセイした。反応物を３７℃で１０分間インキュベートし、１０μＬのｔＲＮＡ（１ｍｇ／ｍＬ）及び２０μＬの冷５０％ＴＣＡを添加することにより停止させた。氷上で１０分間放置した後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心機（２５，０００ｇ）で１０分間遠心分離した。４０μＬの上清をＬＳＣユニバーサルカクテル（Ｒｏｔｈ−Ｒｏｔｉｓｚｉｎｔ ｅｃｏ ｐｌｕｓ）中で計測した。１単位のＲＮａｓｅＨ活性は、３７℃で１０分間に１モルの［３Ｈ］（Ａ）ｎを［３Ｈ］（Ａ）ｎ×（ｄＴ）ｎに可溶化するのに必要な酵素の量である。
「ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ」（＃Ｋ１６２２−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、及びその対照である、オリゴ（ｄＴ）１８プライマーと組み合わせられた３’−ポリ（Ａ）テールを備える１．１ｋｂのＲＮＡを用いて、異なる温度でｃＤＮＡを合成する精製逆転写酵素の能力について調べた。或いは４．５ｋｂのＲＮＡ（Ｅｃｏ３１Ｉで線状化されたｐＴＺ１９Ｒプラスミドから合成、ファージラムダＤＮＡの５，５０５ｂｐ〜８，４６９ｂｐの部分を更に含む）を用いて逆転写反応について試験した。提供されたプロトコルに軽微な変更を幾つか加えた（３７℃で５分間プレインキュベートしない）プロトコルに従って、キットの構成要素である１μｇの合成ＲＮＡを用いて２０μＬの反応体積中でｃＤＮＡを１時間合成した。対応する温度勾配を適用するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ勾配ＰＣＲ機を用いて９６ウェルＰＣＲプレートにおいて逆転写反応を実施した。アルカリアガロースゲル電気泳動（エチジウムブロマイドで染色）により合成したｃＤＮＡを分析した。アルカリアガロースゲル上でｃＤＮＡ合成を分析したサンプルを図１６に示す。
結果
Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の進化中にどの突然変異が見られたかという頻度によって、突然変異を５つのクラスに分類することができる：２１回〜３１回出現；１４回〜１８回出現；４回〜７回出現；２回〜３回出現、及び１回出現。一般的に個々の逆転写酵素突然変異体の構築は、この情報に従って実施された。先ず最も頻繁に見られる突然変異体を試験した。３７℃における逆転写酵素の比活性、５０℃における相対活性、及び５０℃で５分間酵素をインキュベートした後の３７℃における相対残存活性を測定した。場合によってはＲＮａｓｅＨ活性を調べ、１ｋｂ又は４．５ｋｂのＲＮＡに対して異なる温度でｃＤＮＡ合成反応を実施した。個々の突然変異体についての全ての実験データを表５Ａ〜表５Ｃに示す。２番目の列（「選択頻度」）は、正確な突然変異を有する配列決定された突然変異体の数を示し、括弧内の数字は選択で見出された特定のアミノ酸突然変異の総数を示す。例えばＤ２００Ｎ−２５（３０）は、アスパラギン酸２００のアスパラギンへの置換が合計３０個のＤ２００突然変異体のうちの２５個で見られたことを意味する。３７℃で測定された逆転写酵素の比活性は、タンパク質１ｍｇ当たりのユニットで表される。５０℃における相対酵素活性及び５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における相対残存ＲＴ活性は、３７℃で測定された同酵素の比活性（１００％）に対して正規化された百分率で表される。対照（１行目）として突然変異体ライブラリ構築に用いられた野生型Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素を示す。この一次酵素はＲＴの突然変異体と同種のベクター内で発現し、同様の方法で精製された。野生型酵素の比活性は、３７℃で２００，０００ｕ／ｍｇであり、５０℃における相対活性は（３７℃における活性と比べて）４５％〜５０％（９０，０００ｕ／ｍｇ〜１００，０００ｕ／ｍｇ）であり、５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における相対残存ＲＴ活性は（３７℃における活性と比べて）約１１％（〜２２，０００ｕ／ｍｇ）である。野生型酵素は、約１６０ｕ／ｍｏｌ〜２００ｕ／ｍｏｌのＲＮａｓｅＨ活性を有し、４８℃で完全長１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる。Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素は、テンプレート−プライマー基質に結合することにより熱失活から保護されており、対照的に酵素は、溶液のみの中では熱安定性が低いことが知られている（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００２）。５０℃で５分間インキュベートした後３７℃における相対残存ＲＴ活性は、基質を含まない溶液中における酵素の熱安定性を直接示す。一方５０℃における相対活性は、ＲＮＡ／ＤＮＡ基質との複合体の状態での酵素の熱安定性及びｃＤＮＡ合成速度を示す。逆転写酵素の反応速度の速い突然変異体は、熱安定性が野生型酵素と同じである場合でさえも５０℃におけるポリメラーゼユニットの数が増加する。ｃＤＮＡ合成（本発明では１ｋｂ又は４．５ｋｂ）の最高温度は、最も包括的なパラメータであり、これは一般的に高温でｃＤＮＡを合成する酵素の能力を表す。３７℃における比活性（野生型２００，０００ｕ／ｍｇに対して２２０，０００ｕ／ｍｇ以上）、３７℃における突然変異体の活性と比較した５０℃における相対活性（野生型４５％〜５０％に対して５４％以上）、又は３７℃における突然変異体の活性と比較した５０℃で５分間インキュベートした後の３７℃における相対残存活性（野生型１１％に対して１３％以上）が少なくとも１０％増加した逆転写酵素の突然変異体を灰色の陰付きで示し、著しく改善された酵素と見なす。４８℃超の温度で完全長１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる突然変異体も灰色の陰付きで示す。
３７℃において高い比活性（２２０，０００ｕ／ｍｇ以上）を有する逆転写酵素を以下に示す（表５Ａ〜表５Ｃ）：
Ｄ２００（Ｄ２００Ｎ−２５４，０００ｕ／ｍｇ；Ｄ２００Ｇ−２７６，０００ｕ／ｍｇ；Ｄ２００Ｈ−２３４，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｔ３３０（Ｔ３３０Ｎ−２２３，０００ｕ／ｍｇ；Ｔ３３０Ｄ−２４０，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｑ２２１（Ｑ２２１Ｒ−２６８，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｈ５９４（Ｈ５９４Ｋ−２７０，０００ｕ／ｍｇ；Ｈ５９４Ｑ−２３１，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｄ４４９（Ｄ４４９Ｅ−２２４，０００ｕ／ｍｇ；Ｄ４４９Ｎ−２２１，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｍ３９（Ｍ３９Ｎ−３４９，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｍ６６（Ｍ６６Ｌ−２３７，０００ｕ／ｍｇ；Ｍ６６Ｖ−２２７，０００ｕ／ｍｇ；Ｍ６６Ｉ−２４０，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｈ１２６（Ｈ１２６Ｒ−２２７，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｗ３８８（Ｗ３８８Ｒ−２６６，０００ｕ／ｍｇ）、
Ｉ１７９（Ｉ１７９Ｖ−２５１，０００ｕ／ｍｇ）。
３７℃における活性と比較して５０℃において高い相対活性（５４％以上）を有する逆転写酵素を以下に示す（表５Ａ〜表５Ｃ）：
Ｄ２００（Ｄ２００Ｎ−８４％；Ｄ２００Ａ−８７％；Ｄ２００Ｑ−１０３％；Ｄ２００Ｅ−７９％；Ｄ２００Ｖ−１３１％；Ｄ２００Ｗ−１０３％；Ｄ２００Ｇ−８８％；Ｄ２００Ｋ−１０２％；Ｄ２００Ｒ−６８％；Ｄ２００Ｈ−５４％）、
Ｌ６０３（Ｌ６０３Ｗ−１０５％；Ｌ６０３Ｆ−１０４％；Ｌ６０３Ｙ−９５％；Ｌ６０３Ｍ−７７％）、
Ｄ６５３（Ｄ６５３Ｎ−９３％；Ｄ６５３Ｋ−１０６％；Ｄ６５３Ａ−９９％；Ｄ６５３Ｖ−９８％；Ｄ６５３Ｑ−９３％；Ｄ６５３Ｌ−８３％；Ｄ６５３Ｈ−１１６％；Ｄ６５３Ｇ−９０％；Ｄ６５３Ｗ−９３％；Ｄ６５３Ｅ−８０％）、
Ｔ３３０（Ｔ３３０Ｐ−８０％；Ｔ３３０Ｎ−６９％；Ｔ３３０Ｄ−５５％；Ｔ３３０Ｖ−６５％；Ｔ３３０Ｓ−６７％）、
Ｑ２２１（Ｑ２２１Ｒ−９４％；Ｑ２２１Ｋ−７７％；Ｑ２２１Ｅ−６４％；Ｑ２２１Ｍ−５８％；Ｑ２２１Ｙ−７７％）、
Ｅ６０７（Ｅ６０７Ｋ−８４％；Ｅ６０７Ａ−９８％；Ｅ６０７Ｇ−７２％；Ｅ６０７Ｄ−６９％）、
Ｌ１３９（Ｌ１３９Ｐ−５９％）、
Ｔ２８７（Ｔ２８７Ｓ−６８％）、
Ｎ４７９（Ｎ４７９Ｄ−８１％）、
Ｈ５９４（Ｈ５９４Ｒ−６９％；Ｈ５９４Ｋ−８０％；Ｈ５９４Ｑ−７５％；Ｈ５９４Ｎ−６１％）、
Ｄ４４９（Ｄ４４９Ｇ−７９％；Ｄ４４９Ｅ−７７％；Ｄ４４９Ｎ−７５％；Ｄ４４９Ａ−９９％；Ｄ４４９Ｖ−８３％）、
Ｍ３９（Ｍ３９Ｖ−５４％；Ｍ３９Ｎ−７１％）、
Ｍ６６（Ｍ６６Ｌ−７９％；Ｍ６６Ｖ−７３％；Ｍ６６Ｉ−８０％）、
Ｌ３３３（Ｌ３３３Ｑ−５４％）、
Ｈ１２６（Ｈ１２６Ｒ−５８％）、
Ｐ１３０（Ｐ１３０Ｓ−７０％）、
Ｑ９１（Ｑ９１Ｒ−５６％）、
Ｗ３８８（Ｗ３８８Ｒ−７２％）、
Ｒ３９０（Ｒ３９０Ｗ−６４％）、
Ｑ３７４（Ｑ３７４Ｒ−５６％）、
Ｅ５（Ｅ５Ｋ−６７％）。
３７℃における活性と比較して５０℃で５分間インキュベートした後３７℃において高い相対残存活性（１３％以上）を有する逆転写酵素を以下に示す（表５Ａ〜表５Ｃ）：
Ｄ２００（Ｄ２００Ｎ−１５％；Ｄ２００Ａ−１８％；Ｄ２００Ｑ−２３％；Ｄ２００Ｒ−２７％；Ｄ２００Ｈ−２７％）、
Ｌ６０３（Ｌ６０３Ｗ−２３％；Ｌ６０３Ｙ−１３％；Ｌ６０３Ｐ−１５％）、
Ｄ６５３（Ｄ６５３Ｎ−２１％；Ｄ６５３Ｋ−１５％；Ｄ６５３Ａ−１８％；Ｄ６５３Ｖ−１６％；Ｄ６５３Ｑ−１８％；Ｄ６５３Ｈ−１３％；Ｄ６５３Ｇ−１３％；Ｄ６５３Ｗ−１３％；Ｄ６５３Ｅ−１９％）、
Ｔ３３０（Ｔ３３０Ｐ−２１％；Ｔ３３０Ｎ−１３％；Ｔ３３０Ｄ−１６％；Ｔ３３０Ｓ−１５％）、
Ｔ２８７（Ｔ２８７Ａ−１３％；Ｔ２８７Ｆ−１３％）、
Ｈ５９４（Ｈ５９４Ｒ−１４％；Ｈ５９４Ｑ−１３％）、
Ｄ４４９（Ｄ４４９Ｇ−１３％）、
Ｍ３９（Ｍ３９Ｖ−１３％）、
Ｍ６６（Ｍ６６Ｌ−１３％）、
Ｙ３４４（Ｙ３４４Ｈ−１３％）、
Ｑ９１（Ｑ９１Ｒ−１３％）、
Ｎ６４９（Ｎ６４９Ｓ−１６％）、
Ｗ３８８（Ｗ３８８Ｒ−１４％）。
４８℃超の温度で完全長１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる突然変異体を以下に示す（表５Ａ〜表５Ｃ）：
Ｄ２００（Ｄ２００Ｎ−５０．４℃；Ｄ２００Ｈ−５０．４℃）、
Ｌ６０３（Ｌ６０３Ｗ−５３．１℃；Ｌ６０３Ｆ−５０．４℃；Ｌ６０３Ｙ−４７．８℃〜５０．４℃）、
Ｄ６５３（Ｄ６５３Ｎ−５０．４℃〜５３．１℃；Ｄ６５３Ｋ−５０．４℃〜５３．１℃；Ｄ６５３Ａ−５０．４℃；Ｄ６５３Ｖ−５０．４℃；Ｄ６５３Ｑ−５０．４℃；Ｄ６５３Ｌ−５０．４℃；Ｄ６５３Ｈ−５０．４℃〜５３．１℃；Ｄ６５３Ｇ−５０．４℃；Ｄ６５３Ｗ−５０．４℃）、
Ｑ２２１（Ｑ２２１Ｒ−５０．４℃）、
Ｅ６０７（Ｅ６０７Ｋ−４７．８℃〜５０．４℃）、
Ｈ５９４（Ｈ５９４Ｋ−４７．８℃〜５０．４℃；Ｈ５９４Ｑ−４７．８℃〜５０．４℃）。
アルカリアガロースゲル上で１ｋｂのｃＤＮＡ合成を分析したサンプルを図１６Ａ〜図１６Ｄに示す。
収集した生化学的データによれば、高温でｃＤＮＡ合成に影響を及ぼすことができるＭ−ＭｕＬＶ逆転写酵素配列中の最も重要な位置は、Ｄ２００、Ｌ６０３、Ｄ６５３、Ｔ３３０、Ｑ２２１、Ｅ６０７、Ｌ１３９、Ｔ２８７、Ｎ４７９、Ｈ５９４、Ｄ４４９、Ｍ３９、Ｍ６６、Ｌ３３３、Ｈ１２６、Ｙ３４４、Ｐ１３０、Ｑ９１、Ｎ６４９、Ｗ３８８、Ｒ３９０、Ｉ１７９、Ｑ３７４、Ｅ５である。
一般に対象突然変異体を組み合わせて、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素の基質の存在下及び非存在下における熱安定性、速度、処理能力、及び高温でｃＤＮＡを合成するための全体的な能力を更に改善することができる。組み合わせアプローチによる酵素の改善を示す幾つかのデータを表６に示す。単一突然変異Ｄ２００Ｎ 及びＬ６０３Ｗは、５０℃でそれぞれ８４％及び１０５％の相対活性を有する。１ｋｂのｃＤＮＡ合成の最高温度はそれぞれ５０．４℃及び５３．１℃である。二重突然変異体Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗは、５０℃で１３１％の相対活性を有し、５６℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる。三重突然変異体Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ；Ｔ３３０Ｐ（５０℃で８０％の相対活性、４７．８℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成）は更に改善されており、５０℃で１７５％の相対活性を有し、５６℃〜５８℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる。四重突然変異体Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ；Ｔ３３０Ｐ；Ｅ６０７Ｋ（５０℃で８４％の相対活性、４７．８℃〜５０．１℃で１ｋｂのｃＤＮＡ）は、５０℃で１７４％の相対活性を有し、６０℃〜６２℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができる。五重突然変異体Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ；Ｔ３３０Ｐ；Ｅ６０７Ｋ；Ｌ１３９Ｐ（５０℃で５９％の相対活性、４７．８℃で１ｋｂのｃＤＮＡ）は、５０℃で１７６％の相対活性を有し、６２℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成することができ、これは野生型Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（４７．８℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成）に比べて約１４℃高い温度である。また熱安定性の更なる特徴が以下の場合に見られる：
Ｎ４７９Ｄ、Ｈ５９４Ｒ突然変異体（Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ−５０℃で１３１％の相対活性、５６℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成対Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ；Ｎ４７９Ｄ；Ｈ５９４Ｒ−５０℃で１８２％の相対活性、５６℃〜５８℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成、５６℃〜５８℃で４．５ｋｂのｃＤＮＡを合成）、
Ｔ３３０Ｐ突然変異体（Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ；Ｄ６５３Ｎ；Ｄ５２４Ｇ−５０℃で１５５％の相対活性、５８℃〜６０℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成対Ｄ２００Ｎ；Ｌ６０３Ｗ；Ｄ６５３Ｎ；Ｄ５２４Ｇ；Ｔ３３０Ｐ−５０℃で１８０％の相対活性、６０℃〜６２℃で１ｋｂのｃＤＮＡを合成）。
アルカリアガロースゲル上で４．５ｋｂのｃＤＮＡ合成について分析したサンプルを図１６Ｅ〜図１６Ｇに示す。
実施例４：ＣＲＤの変更 ビオチン−ｄＵＴＰを用いるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの選択（原理の証明）
この実施例は、修飾ヌクレオチドをＤＮＡ−ＤＮＡ基質に取り込むことができるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとしての逆転写酵素の活性に基づく選択ストラテジを示す。選択の基本スキームを図１２に概略的に示す。２つのプラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（プロテインＤのスペーサに融合しているＲＮａｓｅＨマイナスモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素をコードする）及びその誘導体ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（不活化逆転写酵素をコードする、ｐｏｌドメインの５７アミノ酸が欠失、ＲＮａｓｅＨドメインにＤ５８３Ｎ突然変異、実施例１、配列番号２）をこの実施例の出発物質として用いた。プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ及びｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤを標的として用いて２つの個別のポリメラーゼ連鎖反応により活性逆転写酵素及び不活性逆転写酵素をコードする初期ＤＮＡ断片を合成した。３’末端の終止コドンを欠失くｍＲＮＡを合成するための転写反応において該合成ＰＣＲ断片を用いた。精製ｍＲＮＡを１：２０＝ＭＬＶ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ（不活性ＲＴ）の比で混合した。二本鎖ＤＮＡアダプタ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の選択に必要）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって３’ｍＲＮＡにライゲーションした。このｍＲＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体をインビトロ翻訳反応に用いた。ｍＲＮＡに沿って移動するリボソームは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション部位で翻訳を停止する（Ｔａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，２００１）。５０ｍＭのＭｇ２＋を含有する氷冷バッファで翻訳混合物を希釈することにより、リボソーム−ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ−タンパク質複合体を安定化させた（従来のリボソームディスプレイと同様に）。三元複合体（ＴＣ）の混合物をショ糖クッション溶液上で超遠心することにより精製した。インビトロで翻訳されたＭ−ＭｕＬＶ（ＲＮａｓｅＨ−）に連結しているｍＲＮＡ−ｄｓＤＮＡを含有する精製三元複合体（３×１０９個未満の分子が回収された）を用いて、ビオチン−ｄＵＴＰ及び反応バッファを追加的に添加した反応混合物を調製した。氷冷反応混合物を乳化させて、大きさ〜２μｍの油中水型区画を〜１×１０１０個得た。乳化されたＲＴ反応混合物（１区画当たりＴＣ（リボソーム−ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ−タンパク質）１個未満）を３７℃で３０分間インキュベートした。区画化反応混合物の温度を上昇させた後、大部分のＴＣは解離し、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ及び逆転写酵素を放出する。活性Ｍ−ＭｕＬＶ（ＲＮａｓｅＨ−）逆転写酵素を含む区画においてのみ取り込み反応が成功し、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体がビオチン化される。ビオチン化複合体は、ストレプトアビジンコーティングを施されている磁気ビーズ上に選択的に固定化され、ＲＴ−ＰＣＲにより特異的に増幅され得る。実験が成功した結果として、活性酵素をコードする遺伝子（本発明の場合ではＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ逆転写酵素のＲＴ−ＰＣＲ断片）が、不活性酵素（ｄｅｌ＿ｐＤ）をコードする遺伝子よりも富化されるはずである。
材料及び方法
ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体の生成
（１）ライゲーション効率の測定
スプリントとしてｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２プライマー（配列番号２２）を用いてＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡ（ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤプラスミドから合成、実施例１）とプライマーＬｏｎｇ＋Ｔｂ（配列番号２３）とをライゲーションさせることによりライゲーション反応の効率を測定した。Ｌｏｎｇ＋Ｔｂの５’末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて既にリン酸化されていた。
８．５ｐｍｏｌ（〜１０μｇ）の精製ＭＬＶ＿ｐＤ ｍＲＮＡと４倍モル過剰のＬｏｎｇ＋Ｔｂ（配列番号２３）及び４．２倍モル過剰のｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２（配列番号２２）のヌクレアーゼ不含水溶液とを混合することにより、３６μＬのアニーリング混合物を調製した。混合物を７０℃で５分間インキュベートし、次いで２０分間室温まで冷却した。混合物を２分間冷却スタンドに移動させた後、ライゲーション反応成分混合物を添加した。
４．５μＬの１０×ライゲーションバッファ及び４．５μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５ｖ／μＬ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を３６μＬのアニーリング混合物に添加した。３７℃で３０分間ライゲーション反応を実施し、続いて等体積のＲｏｔｉ（登録商標）フェノール／クロロホルム（ＲＯＴＨ）で１回、等体積のクロロホルムで２回抽出した。ｍＲＮＡ量はライゲーション反応のために回収された初期量とほぼ同じであると仮定して、〜５μｇのライゲーション産物混合物をヌクレアーゼ不含水により４３μＬに希釈した。反応混合物の２μＬのアリコートをアガロースゲルで分析するために残し、次いでＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｋｉｌｏｂａｓｅ ＢＩＮＤＥＲＴＭ Ｋｉｔ（ＤＹＮＡＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ））上に固定した。
１０μＬの再懸濁させたＤｙｎａｂｅａｄｓを１．５ｍＬの微量遠心管に移し、キットに含まれている結合溶液５０μＬで洗浄した。該微量遠心管にビーズが定着するまで該微量遠心管を１分間〜２分間磁石上に定置し、溶液を除去した。２μＬの水性ｔＲＮＡ（酵母のｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ））溶液（１μｇ／μＬ）を添加した３８μＬの結合溶液をピペッティングすることによりＤｙｎａｂｅａｄｓを穏やかに再懸濁させ、非特異的なｍＲＮＡの結合を最低限に抑えた。結合溶液中のＤｙｎａｂｅａｄｓ４０μＬを、ライゲーション産物混合物を含有する溶液（〜４０μＬ）に添加した。サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で＋２２℃にて６０分間振盪しながら該管をインキュベートした。ライゲーションされたｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡの結合後、上清を除去し、５０μＬの洗浄溶液（キットに含まれている）で３回ビーズを洗浄した。ライゲーションされたｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体が固定化されている回収されたＤｙｎａｂｅａｄｓを２６μＬのヌクレアーゼ不含水に再懸濁させ、次いで４０μＬのＲｏｔｉ（登録商標）フェノール／クロロホルム（ＲＯＴＨ）で１回、４０μＬのクロロホルムで２回抽出し、磁気ビーズからｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体を放出させた。１μＬ、２μＬ、及び５μＬの最終混合物を、固定化前に残しておいたサンプル（２μＬ）及びＭａｓｓ ＲｕｌｅｒＴＭ Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒと共にアガロースゲル上で分析した。固定化前及び固定化後のｍＲＮＡ量と比較してストレプトアビジンビーズで精製されたｍＲＮＡ／ＤＮＡ複合体中のｍＲＮＡの量を決定した。回収されたｍＲＮＡの収率は〜６０％であり、これは少なくとも６０％のｍＲＮＡがＤＮＡ二本鎖と成功裏にライゲーションされ、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体が生じたことを意味する。
（２）ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体及び自己プライマー化（ｓｅｌｆ ｐｒｉｍｅｄ）ｍＲＮＡへのビオチン−ｄＵＴＰの取り込み効率の測定
先のＲＮＡのｄｓＤＮＡへのライゲーション実験で示されたように、ライゲーション反応効率は〜６０％以上である。ライゲーション混合物中に残った遊離ｍＲＮＡは自己をプライマー化し、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素及びビオチン−ｄＵＴＰを用いた伸長反応中に沈殿することがある。ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体（ライゲーション産物）が遊離自己プライマー化ｍＲＮＡよりも優れた基質であることを示すためにこの実験を実施した。
上記手順に従ってＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ ｍＲＮＡをｌｏｎｇ＋オリゴヌクレオチド（配列番号２１）とライゲーションさせた（初期プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ及びｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤの構築の詳細は実施例１に記載されている）。調製した（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ ｍＲＮＡ／ｌｏｎｇ＋）基質〜１２．５ｎｇを、７０℃で５分間既にインキュベートされているｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡ〜１２．５ｎｇと組み合わせ、次いでヌクレアーゼ不含水中で２０分間室温まで冷却した。合計体積は１２．５μＬであった。逆転写酵素によりｄＴＴＰ又はビオチン−ｄＵＴＰを取り込むための第２の混合物を調製した：８μＬの５×逆転写酵素用反応バッファ；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋＴＭ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（１８．６μＬ）；２００ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（０．４μＬ）。調製した混合物を２本の試験管に２×１５μＬずつ分注し、１ｍＭのｄＴＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）又は１ｍＭのビオチン−ｄＵＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）を添加した。次いで５μＬの基質（第１の混合物から）をｄＴＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰを含有する混合物に添加した。３７℃で６０分間反応を実行した。その後０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（１μＬ）を両方のサンプルに添加し、等体積のＲｏｔｉ（登録商標）フェノール／クロロホルム（ＲＯＴＨ）で１回、等体積のクロロホルムで１回反応混合物を抽出し、次いで反応混合物をＧ−５０ ＭｉｃｒｏＣｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。得られた反応生成物２μＬを（ストレプトアビジンビーズ精製せずに）直接ＲＴ反応するために残し、ビオチン化ｍＲＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｋｉｌｏｂａｓｅ ＢＩＮＤＥＲＴＭ Ｋｉｔ（ＤＹＮＡＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ））上に固定化するために溶液の残りの部分を用いた。１０μＬの再懸濁させたＤｙｎａｂｅａｄｓを１．５ｍＬの微量遠心管に移し、キットに含まれている結合溶液２５μＬで洗浄した。該微量遠心管の底部にビーズが定着するまで該微量遠心管を１分間〜２分間磁石上に定置し、溶液を除去した。９０μＬの結合溶液をピペッティングすることによりＤｙｎａｂｅａｄｓを穏やかに再懸濁させ、２μＬの水性ｔＲＮＡ（酵母のｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ））溶液（１μｇ／μＬ）を添加して非特異的なｍＲＮＡの結合を最低限に抑えた。結合溶液中のＤｙｎａｂｅａｄｓ４０μＬを、ｄＴＴＰ及びビオチン−ｄＵＴＰにより伸長されたＲＮＡ−ＤＮＡ断片を含有する溶液（〜４０μＬ）に添加した。サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で＋２２℃にて４０分間振盪させながら（１，４００ｒｐｍ）該管をインキュベートした。結合工程後、上清を除去し、＋２２℃で５分間振盪させながら（１，４００ｒｐｍ）５０μＬの洗浄溶液（キットに含まれている）で３回ビーズを洗浄した。伸長されたｍＲＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体が固定化されている回収されたＤｙｎａｂｅａｄｓを逆転写反応混合物に再懸濁させた。逆転写反応混合物を氷上で調製した：５×逆転写酵素用反応バッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１０μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．５μＬ）；２０μＭのｐＤ＿４２オリゴヌクレオチド（配列番号８）（５μＬ）；ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（２００ｕ／μＬ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（５５μＬ）。調製した混合物を１９μＬずつ５つのアリコートに分注した（５×１９μＬ）：伸長されたｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体又はｍＲＮＡが固定化されているＤｙｎａｂｅａｄｓを再懸濁させるために２つを用い、ストレプトアビジンビーズ精製せずに残したサンプルを含む試験管に残りのうち２つを移し、残り１つの１９μＬのアリコートに１μＬのヌクレアーゼ不含水を添加した。これは反応混合物にＤＮＡが夾雑していないことを証明するための陰性反応対照である。全ての反応混合物を、ｃＤＮＡ合成反応が終了するまで１時間、＋４２℃でサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内にて振盪させながら（１，０００ｒｐｍ）インキュベートした。
ネステッドＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を実施した。初期ＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１４μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１４μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（８．４μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．８μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｆプライマー（配列番号１１）（０．７μＬ）；１００μＭのＭ＿２Ｒプライマー（配列番号１２）（０．７μＬ）；水（９２．４μＬ）。混合物を１９μＬずつ７つのサンプルに分注した（７×１９μＬ）。１９μＬのＰＣＲマスター混合物５つに、１μＬのｃＤＮＡ（１〜５のＲＴサンプル）を添加し；ＰＣＲマスター混合物の６番目の試験管に１μＬの水を添加し（陰性ＰＣＲ対照）；７番目の試験管（陽性ＰＣＲ対照）に１μＬのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤプラスミド（〜１ｎｇ）を添加した。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、２５サイクル（９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、及び７２℃で１分間）及び最後の伸長工程７２℃で３分間。
予想されるアンプリコンの長さは、ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤが９０７ｂｐ、ｄｅｌ＿ｐＤ ｃＤＮＡが７３６ｂｐであった。ＰＣＲ産物を１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲルで解析した（図１３）。
予想通り、ビオチン−ｄＵＴＰを用いる伸長反応においてのみ有効なｃＤＮＡ増幅が見られた。ｄＴＴＰを用いた伸長反応では増幅されたｃＤＮＡの非常に弱いバンドを検出することができ、これはｍＲＮＡのストレプトアビジンビーズへの弱い非特異的結合によって説明することができる。ストレプトアビジンビーズで精製した後、ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ遺伝子（９０７ｂｐ）をコードするＤＮＡはｄｅｌ＿ｐＤのＤＮＡ（７３６ｂｐ）よりも富化される。これはｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体が、自己プライマー化ｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡよりも遥かに効率よくビオチン−ｄＵＴＰにより伸長されることを意味する。
（３）ｍＲＮＡ混合物（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤ＝１：２０）及びＲＮＡ／ｄｓＤＮＡの調製
インビトロ翻訳のためのＰＣＲ断片の調製。ＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１２μＬ）；ＤＭＳＯ（Ｄ８４１８−Ｓｉｇｍａ）（１６μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４μＬ）；１００μＭのｐｒｏ−ｐＩＶＥＸプライマー（配列番号３）（１μＬ）；１００μＭのｐＤ−ｔｅｒ−プライマー（配列番号２０）（１μＬ）；水（１２２μＬ）。混合物を２本の試験管に２×９８μＬずつ分注した。９８μＬのＰＣＲマスター混合物２つに、２μＬのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（〜１ｎｇ／μＬに希釈）又は２μＬのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤ（〜１ｎｇ／μＬに希釈）のいずれかを添加した（初期プラスミドｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ及びｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤの構築の詳細は実施例１に記載されている）。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、３０サイクル（９４℃で４５秒間、５３℃で４５秒間、及び７２℃で２分間）、及び最後の伸長工程７２℃で５分間。増幅効率は〜７，０００倍であり、２ｎｇのプラスミド（７，８７３ｂｐ）標的が〜５μｇ（５０ｎｇ／μＬ）の増幅産物（ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤからは２，７０２ｂｐのＰＣＲ断片ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ；ｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ｄｅｌ＿ｐＤからは２，５３１ｂｐのＰＣＲ断片ｄｅｌ＿ｐＤ）に増幅された。
転写混合物を調製した：５×Ｔ７転写バッファ（１ＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）（８０μＬ）；１５０ｍＭの酢酸マグネシウム；１０ｍＭのスペルミジン；０．２ＭのＤＴＴ）；１１２ｍＭの各ＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５６μＬ）；２０ｕ／μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１６μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（８μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（１１４μＬ）。混合物を２本の試験管に２×１６５μＬずつ分注し、２０ｎｇ／μＬのＰＣＲ断片ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（非精製ＰＣＲ混合物）（３５μＬ）又は２０ｎｇ／μＬのＰＣＲ断片ｄｅｌ＿ｐＤ ＰＣＲ（非精製ＰＣＲ混合物）（３５μＬ）を添加した。３７℃で２時間転写を行った。
両方の転写混合物を氷冷ヌクレアーゼ不含水で２００μＬに希釈し、６ＭのＬｉＣｌ溶液（２００μＬ）を添加した。混合物を＋４℃で２５分間インキュベートし、最高速度（２５，０００ｇ）で冷却遠心機を用いて＋４℃にて２５分間遠心分離した。上清を廃棄し、ＲＮＡペレットを５００μＬの氷冷７５％エタノールで洗浄した。最高速度で４℃にて５分間再度遠心管を遠心分離に供し、上清を廃棄した。ＲＮＡペレットを室温で５分間乾燥させ、次いで１，４００ｒｐｍで＋４℃にて１５分間振盪することにより、４００μＬのヌクレアーゼ不含氷冷水に再懸濁させた。溶解していないＲＮＡを分離するために、最高速度で＋４℃にて５分間再度遠心管を遠心分離に供した。約３８０μＬの上清を、１０×ＤＮａｓｅＩバッファ（Ｍｇ２＋）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４２μＬ）；１ｕ／μＬのＤＮａｓｅＩ（ＲＮａｓｅ不含）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（３μＬ）を含む新たな試験管に移し、＋３７℃で２０分間インキュベートしてＤＮＡを分解した。反応混合物を等体積のＲｏｔｉ（登録商標）フェノール／クロロホルム（ＲＯＴＨ）で１回、等体積のクロロホルムで２回抽出し、ＤＮａｓｅＩを除去した。４３μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）及び１，０７５μＬの氷冷９６％エタノールを各試験管に添加した。最後に、−２０℃で３０分間インキュベートし、最高速度（２５，０００ｇ）、＋４℃で２５分間遠心分離することによりＲＮＡを沈殿させた。上清を廃棄し、ＲＮＡペレットを５００μＬの氷冷７５％エタノールで洗浄した。最高速度、＋４℃で４分間再度遠心管を遠心分離に供し、上清を廃棄した。ＲＮＡペレットを室温で５分間乾燥させ、次いで４℃で１５分間振盪させる（１，４００ｒｐｍ）ことにより、１５０μＬのヌクレアーゼ不含氷冷水に再懸濁させた。ＲＮＡ溶液を１０μＬずつ分注し、液体窒素で凍結させた。ｍＲＮＡの濃度を分光光度計で測定し、ＲｉｂｏＲｕｌｅｒＴＭ ＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）と共にアガロースゲル上でダブルチェックした。
スプリントとしてｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２オリゴデオキシヌクレオチドを用いてｌｏｎｇ＋オリゴデオキシヌクレオチドとｍＲＮＡとをライゲーションさせることによりｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体を生成した。Ｌｏｎｇ＋の５’末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて既にリン酸化されていた。天然に存在するＲＮＡ−ＤＮＡ基質に対して逆転写酵素が３’末端を伸長させる可能性を防ぐために、オリゴデオキシヌクレオチドｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２は３’末端修飾（ｄｄＣ）を有する。１：２０＝ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ＿ｐＤ（不活性ＲＴ）の比で混合された１７ｐｍｏｌの精製ｍＲＮＡ混合物と、４．３倍モル過剰のＬｏｎｇ＋及び４．１倍モル過剰のｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２とをヌクレアーゼ不含水に混合することにより、５０μＬのアニーリング混合物を調製した。混合物を７０℃で５分間インキュベートし、次いで２０分間室温まで冷却した。混合物を２分間冷却スタンドに移動させた後、ライゲーション反応成分を添加した。
５μＬの１０×ライゲーションバッファ及び５μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ（５ｖ／μＬ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を４０μＬのアニーリング混合物に添加した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含まない１×ライゲーションバッファ中で同アニーリング混合物を用いて陰性ライゲーション反応を実施した。調製したライゲーション反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ライゲーションを停止させるために、１μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を両方の試験管に添加し、反応混合物を等体積のＲｏｔｉ（登録商標）フェノール／クロロホルム（ＲＯＴＨ）で１回、等体積のクロロホルムで２回抽出し、次いで真空濃縮機５３０１（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で１０分間３０℃にて反応生成物を濃縮した。ｉｌｌｉｕｓｔｒａ ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ−５０ ＭｉｃｒｏＣｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて脱塩を実施した。ＲｉｂｏＲｕｌｅｒＴＭ ＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）と共にアガロースゲル上でライゲーション産物の濃度を測定した。ｌｏｎｇ＋／ｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２ オリゴデオキシヌクレオチド〜０．２４μｇ／μＬにライゲーションしているｍＲＮＡ混合物（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤ＝１：２０）（Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含むサンプル）及びｌｏｎｇ＋／ｄｄＣ−Ｌｏｎｇ２オリゴデオキシヌクレオチド〜０．０６μｇ／μＬとｍＲＮＡとの単なる混合物（Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含まないサンプル）。
（４）［α−Ｐ３３］ｄＡＴＰの取り込みによるｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体の全般的制御
逆転写酵素によるｄＴＴＰ（又はビオチン−ｄＵＴＰ）の取り込み、及びその後の［α−Ｐ３３］ｄＡＴＰの取り込みについて調製したｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体（基質）を試験した。反応混合物：逆転写酵素用５×反応バッファ（１６μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＴＭ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（４μＬ）；［α−Ｐ３３］ｄＡＴＰ（１０ｍＣｉ）／ｍｌ、ＳＲＦ−２０３（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ａｎａｌｙｔｉｃ））（２μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（３５μＬ）；２００ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）。調製した混合物を２本の試験管に２×２８μＬずつ分注し、１ｍＭのｄＴＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２μＬ）又は１ｍＭのビオチン−ｄＵＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２μＬ）を添加した。得られた混合物を２本の試験管に１５μＬずつ分注した。第１の試験管に１．２５μＬ（〜０．３μｇ）のライゲーション産物＋３．７５μＬのヌクレアーゼ不含水を添加した。第２の試験管には５μＬ（〜０．３μｇ）の陰性ライゲーション反応産物を添加した。反応混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで０．５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）（１μＬ）を全ての試験管に添加し、等体積のＲｏｔｉ（登録商標）フェノール／クロロホルム（ＲＯＴＨ）で１回、等体積のクロロホルムで２回反応混合物を抽出し、次いでｉｌｌｉｕｓｔｒａ ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ−５０ ＭｉｃｒｏＣｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＲｉｂｏＲｕｌｅｒＴＭ ＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ、Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）と共にアガロースゲル上で反応生成物を分析した（図１４Ａ）。全てのサンプルにおいて（リガーゼ有及び無）、ｄｅｌ＿ｐＤ ｍＲＮＡの目立たないバンド（〜２，５００ｂ）が見られた（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ ｍＲＮＡ 〜２，７００ｂの２０倍少ない量、ｍＲＮＡ混合物中における存在は識別できなかった）。次いでアガロースゲルを濾紙上で乾燥させたところ、放射標識ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体（ｍＲＮＡと同位置）は、陽性ライゲーションサンプル（リガーゼ有）でのみ検出され、陰性ライゲーションサンプル（リガーゼ無）では検出されなかった（図１４Ｂ）。
（５）ビオチン−ｄＵＴＰを用いたＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの選択
合成ＷａｋｏＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ（２９５−５９５０３−Ｗａｋｏ）を用いるインビトロ翻訳に、既に調製されているｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体（ｍＲＮＡ混合物ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ（活性ＲＴ）：ｄｅｌ＿ｐＤ（不活性ＲＴ）＝１：２０）を用いた。ＷａｋｏＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍ（２５μＬ）用転写混合物：Ａ溶液（Ｗａｋｏ）（１２．５μＬ）；Ｂ溶液（Ｗａｋｏ）（５μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（０．５μＬ）；１ＭのＤＴＴ（０．２５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（１．７５μＬ）、及び０．２４μｇ／μＬのｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ基質（〜１，２００ｎｇ）（５μＬ）。３７℃で１２０分間インビトロ翻訳を行った。
１５５μＬの氷冷停止バッファＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ））を添加することにより翻訳（〜２５μＬ）を停止させ、＋４℃、２５，０００ｇで５分間遠心分離した。透明な１ｍＬの超遠心管（３４３７７８−Ｂｅｃｋｍａｎ）中の８４０μＬの３５％（ｗ／ｖ）ショ糖−ＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋Ｔｒｉｔｏｎ ｘ−１００（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ）；３５％（ｗ／ｖ）−ショ糖（８４０９７−Ｆｌｕｋａ））溶液上に１６０μＬの遠心分離した翻訳混合物を非常に慎重に移した。ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ−リボソーム−タンパク質（ｔＲＮＡ）からなる三元複合体（ＴＣ）を、ＴＬ−１００ Ｂｅｃｋｍａｎ超遠心機；ＴＬＡ１００．２固定角ロータ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて＋４℃、１００，０００ｒｐｍで９分間超遠心することにより精製した。最初に７５０μＬの溶液を遠心管の最上部から除去した。次いで（超遠心管の底部に存在するＴＣの小さく透明なペレットをインタクトなまま保持するために非常に慎重に）管壁を７５０μＬのＷＢＫ５００（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ）で洗浄した。最後に、遠心管の最上部から始めて全ての溶液を除去し、ペレットを３０μＬの氷冷停止バッファＷＢＫ５００＋ＤＴＴ＋ｔｒｉｔｏｎ（５０ｍＭのトリス酢酸（２５℃でｐＨ７．５）；５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭの酢酸マグネシウム；５００ｍＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＤＴＴ；０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｔ８７８７−Ｓｉｇｍａ）に溶解させた。
放射活性標識ｍＲＮＡを用いて決定されたように、超遠心後５％〜３０％のインプットｍＲＮＡは、三元複合体ペレット中に存在する。したがって、３０μＬのバッファ（〜１２ｎｇ／μＬ又は９×１０９分子／μＬの三元複合体）中に３６０ｎｇ（翻訳反応で用いられた１，２００ｎｇのｍＲＮＡの３０％）未満が存在すると予想された。
５×反応逆転写酵素用バッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（５μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１．２５μＬ）；１ｍＭのビオチン−ｄＵＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２．５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（４０．９５μＬ）、及び精製（２．７×１０９分子未満）ＴＣ（０．３μＬ）を混合することにより、修飾ヌクレオチド取り込み反応混合物を氷上で調製した。プロトコルによれば、５０μＬのヌクレオチド取り込み反応混合物は、２．７×１０９分子未満の三元複合体を含有する。
最終濃度が４％（ｖ／ｖ）になるようにＡＢＩＬ ＥＭ９０（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ）を鉱物油（Ｍ５９０４−Ｓｉｇｍａ）に混合することにより油−界面活性剤混合物を調製した（Ｇｈａｄｅｓｓｙ ａｎｄ Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，２００４；米国特許出願公開第２００５０６４４６０号明細書）。９５０μＬの油−界面活性剤混合物を５０μＬのＲＴ混合物と混合することにより、５ｍＬの低温貯蔵バイアル（４３０４９２−Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で＋４℃にてエマルションを調製した。ＭＳ−３０００調速磁気攪拌機（Ｂｉｏｓａｎ）及びＲｏｔｉｌａｂｏ（登録商標）（３×８ｍｍ）中央リング付磁気撹拌子（１４８９．２−Ｒｏｔｈ）を用いて〜２，１００ｒｐｍで混合を行い、３０秒間に１回１０μＬのアリコートを水相に添加し、更に２分間混合を続けた（合計混合時間４分間）。光学顕微鏡データによれば、本発明のエマルション中の区画の大きさは０．５μｍ〜１０μｍであり、平均直径は〜２μｍである。したがって、２．７×１０９分子未満の三元複合体を含有する逆転写反応混合物５０μＬの乳化後、〜１×１０１０個の油中水型区画が存在すると予測された（３〜４区画当たりｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体及び逆転写酵素が約１分子）。
調製されたエマルションを＋３７℃で３０分間インキュベートした。
エマルションから反応混合物を回収するために、０．１ＭのＥＤＴＡ（２０μＬ）をエマルションに添加し、１０秒間撹拌し、次いで５０μＬのフェノール／クロロホルム混合物を添加し、更に１０秒間撹拌した。次いでエマルションを１．５ｍＬの微量遠心管に移し、０．５ｍＬの水−飽和エーテルを添加し、ボルテックスにより混合し、１６，０００ｇ、室温にて１０分間遠心分離した。油相を除去してたところ、試験管の底部に濃縮（しかし依然としてインタクトである）エマルションが残っていた。最後に、０．９ｍＬの水−飽和エーテルで１回、０．９ｍＬの水−飽和酢酸エチルで１回（ＡＢＩＬ ＥＭ９０洗剤を除去するため）、及び０．９ｍＬの水−飽和エーテルで２回抽出することにより、エマルションを破壊した。真空下室温で１２分間水相を乾燥させ、次いでｉｌｌｉｕｓｔｒａ ＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ Ｇ−５０ ＭｉｃｒｏＣｏｌｕｍｎｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて取り込まれたヌクレオチドを除去した。得られた混合物の２μＬのアリコートを（ストレプトアビジンビーズ精製せずに）直接ＲＴ反応させるために残し、ビオチン化ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体をＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ストレプトアビジンビーズ（ＤＹＮＡＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上に固定化するために溶液の残りの部分を用いた。
添付の製品説明書に従ってビオチン化ｍＲＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体を単離するためにＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｋｉｌｏｂａｓｅ ＢＩＮＤＥＲＴＭ Ｋｉｔ（ＤＹＮＡＬ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた。５μＬの再懸濁させたＤｙｎａｂｅａｄｓを１．５ｍＬの微量遠心管に移し、キットに含まれている結合溶液２０μＬで洗浄した。該微量遠心管にビーズが定着するまで該微量遠心管を１分間〜２分間磁石上に定置し、溶液を除去した。５０μＬの結合溶液をピペッティングすることによりＤｙｎａｂｅａｄｓを穏やかに再懸濁させ、１μＬの水性ｔＲＮＡ（酵母のｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ））溶液（１μｇ／μＬ）を添加して非特異的なｍＲＮＡの結合を最低限に抑えた。結合溶液中のＤｙｎａｂｅａｄｓ５０μＬを、ビオチン化ＲＮＡ−ＤＮＡ断片を含有する溶液（〜５０μＬ）に添加した。サーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内で＋２２℃にて１時間振盪させながら（１，４００ｒｐｍ）該管をインキュベートした。ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ結合後、上清をビーズから除去し、＋２２℃で５分間振盪させながら（１，４００ｒｐｍ）５０μＬの洗浄溶液（キットに含まれている）で２回、＋２２℃で１２分間振盪させながら（１，４００ｒｐｍ）５０μＬの洗浄溶液で１回ビーズを洗浄した。ビオチン化ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体が固定化されている回収されたＤｙｎａｂｅａｄｓを逆転写反応混合物に再懸濁させた。
選択されたｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体用の逆転写反応混合物を氷上で調製した：５×逆転写酵素用反応バッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１２μＬ）；１０ｍＭのｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６μＬ）；４０ｕ／μＬのＲｉｂｏＬｏｃｋ ＲＮａｓｅ阻害剤（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１．５μＬ）；２０μＭのｐＤ＿４２オリゴヌクレオチド（配列番号８）（０．３μＬ）；ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＴＭ Ｍｉｎｕｓ Ｍ−ＭｕＬＶ 逆転写酵素（２００ｕ／μＬ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１．５μＬ）；ヌクレアーゼ不含水（３５．７μＬ）。調製された混合物を１９μＬずつ３つのアリコートに分注した：１つはビオチン化ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡの固定化されているＤｙｎａｂｅａｄｓを再懸濁させるために用い、残りのアリコートのうち１つはストレプトアビジンビーズ精製せずに残しておいた伸長したｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体のサンプル含む試験管に移し、残り１つのアリコートには１μＬのヌクレアーゼ不含水を添加した（反応混合物にＤＮＡが夾雑していないことを証明するための陰性反応対照）。全ての反応混合物を、１時間、＋４２℃でサーモミキサー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）内にて振盪させながら（１，０００ｒｐｍ）インキュベートした。
ネステッドＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行った。初期ＰＣＲ混合物を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（６μＬ）；１ｕ／μＬのＬＣ（組み換え）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２μＬ）；２．５ｕ／μＬのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１μＬ）；１００μＭのＲＤ＿Ｎｄｅプライマー（配列番号９）（０．５μＬ）；１００μＭのｐＤ＿５５プライマー（配列番号１０）（０．５μＬ）；水（６５μＬ）。混合物を１９μＬずつ５サンプル（５×１９μＬ）に分注した。１９μＬのＰＣＲマスター混合物３本に、１μＬのｃＤＮＡ（１〜３のＲＴサンプル）を添加し；１９μＬのＰＣＲマスター混合物を含む試験管１本に、１μＬの水を添加した（陰性ＰＣＲ対照）。陽性ＰＣＲ対照として、残りの１本に１μＬのｐＥＴ＿ｈｉｓ＿ＭＬＶ＿ｐＤ プラスミド（〜１ｎｇ）を添加した。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、３０サイクル（９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、及び７２℃で３分間）及び最後の伸長工程７２℃で５分間。
遺伝子の一部を増幅するためのネステッドＰＣＲ混合物（ＲＴサンプル中のＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤ ｃＤＮＡ比の解像度を上げるため）を氷上で調製した：ＫＣｌを含む１０×Ｔａｑバッファ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（２０μＬ）；２５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（１２μＬ）；５ｕ／μＬのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（０．９μＬ）；１００μＭのＭ＿Ｆプライマー（配列番号１１）（１．０μＬ）；１００μＭのＭ＿２Ｒプライマー（配列番号１２）（１．０μＬ）；水（１３５．１μＬ）。混合物を５×３８μＬに分注した。２μＬの第１のＰＣＲ（プライマーセット ＲＤ＿Ｎｄｅ／／ｐＤ＿５５）産物を添加して、ネステッドＰＣＲ混合物を調製した。マスター混合物を再度混合し、３０ＰＣＲサイクル増幅用又は３５ＰＣＲサイクル増幅用に２本の試験管に分注した（２×２０μＬ）。サイクルプロトコルは以下の通りである：最初の変性工程９４℃で３分間、３０サイクル又は３５サイクル（９４℃で４５秒間、５７℃で４５秒間、及び７２℃で１分間）及び最後の伸長工程７２℃で３分間。ＰＣＲ断片の予想される長さは、ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤが９０７ｂｐ及びｄｅｌ＿ｐＤが７３６ｂｐであった。１ウェル当たり１０μＬのＰＣＲ混合物をロードした１％アガロースゲル上で増幅を解析した（図１５）。
結果
１．二本鎖（ｄｓＤＮＡ）アダプタは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてｍＲＮＡに成功裏にライゲーションされた。ｄｓＤＮＡ−ビオチンアダプタのライゲーションにより決定されたように、ライゲーション効率は約６０％である。ビオチン標識基質と非標識基質とを識別できる限り、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体はストレプトアビジンビーズで特異的に精製され得る。遊離ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡと比べてＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの基質としては遥かに劣る。結果として、６０％というｄｓＤＮＡとｍＲＮＡとのライゲーション効率は十分優れており、かかる基質を進化スキームにおいて成功裏に用いることができる。
２．ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体（ｍＲＮＡ混合物 ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤ＝１：２０）を用いる一般的な選択実験を実施した。ＷａｋｏＰＵＲＥタンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳を実施し、ｄｓＤＮＡへの区画化ビオチン−ｄＵＴＰ取り込み反応を実施して、活性（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ）逆転写酵素をコードする遺伝子が不活化酵素（ｄｅｌ＿ｐＤ）をコードする遺伝子よりが富化されることを示した。選択スキーム（図１２）によれば、ビオチン−ｄＵＴＰの取り込み反応は、活性（ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ）逆転写酵素を含む水性区画においてのみ行われ、ｍＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ複合体のビオチン化が生じるはずである。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、磁気ビーズ上に固定化されているストレプトアビジンに対するビオチン化複合体の結合により選択され、次いで選択された遺伝子はＲＴ−ＰＣＲにより増幅される。活性酵素（本発明ではＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ逆転写酵素のＲＴ−ＰＣＲ断片）をコードする遺伝子は、不活性酵素をコードする遺伝子よりが富化された（図１５）。遺伝子ＭＬＶ＿Ｄ５８３Ｎ＿ｐＤ：ｄｅｌ＿ｐＤの初期比は１：２０であり、最終比（富化後）は〜１：１であった。この特定の実験における富化係数は〜２０倍であった。異なる実験から算出された富化係数は、５〜２００で変動した。またＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、修飾ヌクレオチド取り込みを適用する区画化リボソームディスプレイ（ＣＲＤ）法で選択できることが確認された。従来のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの選択は、直ちに実施することができる。ビオチン−ｄＵＴＰを、３’修飾を有するヌクレオチド類似体を含む異なる対象ヌクレオチド類似体に交換してもよい。かかるヌクレオチド類似体がＤＮＡ鎖に取り込まれた後３’末端がブロックされ、伸長することができず、伸長反応は終結する。このアプローチは合成による配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（ＳＢＳ）スキームで用いられ、ＳＢＳに好適なＤＮＡポリメラーゼは区画化リボソームディスプレイ（ＣＲＤ）技術を用いて容易に進化させることができる。
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Ｃｏｈｅｎ ＨＭ，Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ．Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＨａｅＩＩＩ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ｊａｎ；１７（１）：３−１１．
Ｇｈａｄｅｓｓｙ ＦＪ，Ｏｎｇ ＪＬ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００１ Ａｐｒ１０；９８（８）：４５５２−７．Ｅｐｕｂ ２００１ Ｍａｒ２７．
Ｇｈａｄｅｓｓｙ ＦＪ，Ｒａｍｓａｙ Ｎ，Ｂｏｕｄｓｏｃｑ Ｆ，Ｌｏａｋｅｓ Ｄ，Ｂｒｏｗｎ Ａ，Ｉｗａｉ Ｓ，Ｖａｉｓｍａｎ Ａ，Ｗｏｏｄｇａｔｅ Ｒ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．Ｇｅｎｅｒｉｃ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ａ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；２２（６）：７５５−９．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｍａｙ２３．
Ｏｎｇ ＪＬ，Ｌｏａｋｅｓ Ｄ，Ｊａｒｏｓｌａｗｓｋｉ Ｓ，Ｔｏｏ Ｋ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００６ Ａｕｇ１８；３６１（３）：５３７−５０．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｊｕｌ５．
Ｂｅｒｎａｔｈ Ｋ，Ｈａｉ Ｍ，Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ Ｅ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，Ｍａｇｄａｓｓｉ Ｓ，Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ： ｓｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００４ Ｆｅｂ１；３２５（１）：１５１−７．
Ｍａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａ Ｅ，Ｔａｌｙ Ｖ，Ｃｈａｎｕｄｅｔ Ｅ，Ｔｒｅａｃｙ Ｐ，Ｋｅｌｌｙ ＢＴ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ．Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｏｒｔｉｎｇ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｄｅｃ；１２（１２）：１２９１−３００．
Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ Ｊ，Ｎｅｒｉ Ｄ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ ＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ｓｅｐ；１７（９）：６９９−７０７．Ｅｐｕｂ ２００４Ｎｏｖ２．
Ｄｏｉ Ｎ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．ＳＴＡＢＬＥ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９９ Ａｕｇ ２７；４５７（２）：２２７−３０．
Ｙｏｎｅｚａｗａ Ｍ，Ｄｏｉ Ｎ，Ｋａｗａｈａｓｈｉ Ｙ，Ｈｉｇａｓｈｉｎａｋａｇａｗａ Ｔ，Ｙａｎａｇａｗａ Ｈ．ＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｖｅｒｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｏｃｔ１；３１（１９）：ｅ１１８．
Ｓｅｐｐ Ａ，Ｃｈｏｏ Ｙ．Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｎｏｖ２５；３５４（２）：２１２−９．Ｅｐｕｂ ２００５ Ｏｃｔ３．
Ｓｅｐｐ Ａ，Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ．Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ ｄｉｓｐｌａｙ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｓａｔｉｏｎ：ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００２ Ｄｅｃ１８；５３２（３）：４５５−８．
Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ，Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｆａｓｔ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓｔｅｒａｓｅ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．ＥＭＢＯ Ｊ．２００３ Ｊａｎ２；２２（１）：２４−３５．
Ｂｅｒｎａｔｈ Ｋ，Ｍａｇｄａｓｓｉ Ｓ，Ｔａｗｆｉｋ ＤＳ．Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＤＮＡ−ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｂｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ （ＩＶＣ） ａｎｄ ｎａｎｏ−ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５ Ｆｅｂ４；３４５（５）：１０１５−２６．Ｅｐｕｂ ２００４Ｄｅｃ７．
Ｔｈｏｒｓｅｎ Ｔ，Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＷ，Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ，Ｑｕａｋｅ ＳＲ．Ｄｙｎａｍｉｃ ｐａｔｔｅｒｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｖｅｓｉｃｌｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅ．Ｐｈｙｓ Ｒｅｖ Ｌｅｔｔ．２００１ Ａｐｒ３０；８６（１８）：４１６３−６．
Ｏｋｕｓｈｉｍａ Ｓ，Ｎｉｓｉｓａｋｏ Ｔ，Ｔｏｒｉｉ Ｔ，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｔ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅ ｄｏｕｂｌｅ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ｂｙ ｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｄｒｏｐｌｅｔ ｂｒｅａｋｕｐ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ．２００４ Ｎｏｖ９；２０（２３）：９９０５−８．
Ｓｏｎｇ Ｈ，Ｔｉｃｅ ＪＤ，Ｉｓｍａｇｉｌｏｖ ＲＦ．Ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋｓ ｉｎ ｔｉｍｅ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００３ Ｆｅｂ１７；４２（７）：７６８−７２．
Ｌｉｎｋ ＤＲ，Ｇｒａｓｌａｎｄ−Ｍｏｎｇｒａｉｎ Ｅ，Ｄｕｒｉ Ａ，Ｓａｒｒａｚｉｎ Ｆ，Ｃｈｅｎｇ Ｚ，Ｃｒｉｓｔｏｂａｌ Ｇ，Ｍａｒｑｕｅｚ Ｍ，Ｗｅｉｔｚ ＤＡ．Ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｒｏｐｌｅｔｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００６ Ａｐｒ１０；４５（１６）：２５５６−６０．
Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｔ，Ｙａｎａｇｉｄａ Ｈ，Ｕｓｈｉｏｄａ Ｊ，Ｕｒａｂｅ Ｉ，Ｙｏｍｏ Ｔ．Ｎａｓｃｅｎｔ ｃｈａｉｎ，ｍＲＮＡ，ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａ ｐｕｒｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００７ Ｊａｎ１２；３５２（２）：３７２−７．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｎｏｖ１７．
Ｇｅｒａｒｄ ＧＦ，Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ ＪＭ，Ｋｏｔｅｗｉｃｚ ＭＬ，Ｎｏｏｎ ＭＣ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ．ＤＮＡ．１９８６ Ａｕｇ；５（４）：２７１−９．
Ｆｏｒｒｅｒ Ｐ，Ｊａｕｓｓｉ Ｒ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ ｈｅａｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ．Ｇｅｎｅ．１９９８ Ｄｅｃ１１；２２４（１−２）：４５−５２．
Ｇｅｒａｒｄ ＧＦ，Ｐｏｔｔｅｒ ＲＪ，Ｓｍｉｔｈ ＭＤ，Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ Ｋ，Ｄｈａｒｉｗａｌ Ｇ，Ｌｅｅ Ｊ，Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ＤＫ．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｐｒｉｍｅｒ ｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅｒｍａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ１５；３０（１４）：３１１８−２９．
Ｖｉｃｈｉｅｒ−Ｇｕｅｒｒｅ Ｓ，Ｆｅｒｒｉｓ Ｓ，Ａｕｂｅｒｇｅｒ Ｎ，Ｍａｈｉｄｄｉｎｅ Ｋ，Ｊｅｓｔｉｎ ＪＬ．Ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅｓ ｅｖｏｌｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｉ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００６ Ｓｅｐ１８；４５（３７）：６１３３−７．
Ｇｈａｄｅｓｓｙ ＦＪ，Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ．Ａ ｎｏｖｅｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ｍａｒ；１７（３）：２０１−４．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｆｅｂ２７．
Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＷ，Ｓｚｏｓｔａｋ ＪＷ．ＲＮＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｕｓｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９７ Ｎｏｖ１１；９４（２３）：１２２９７−３０２．
Ｏｄｅｇｒｉｐ Ｒ，Ｃｏｏｍｂｅｒ Ｄ，Ｅｌｄｒｉｄｇｅ Ｂ，Ｈｅｄｅｒｅｒ Ｒ，Ｋｕｈｌｍａｎ ＰＡ，Ｕｌｌｍａｎ Ｃ，ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ Ｋ，ＭｃＧｒｅｇｏｒ Ｄ．ＣＩＳ ｄｉｓｐｌａｙ：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４ Ｍａｒ２；１０１（９）：２８０６−１０．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｆｅｂ２３．
Ｒｅｉｅｒｓｅｎ Ｈ，Ｌｏｂｅｒｓｌｉ Ｉ，Ｌｏｓｅｔ ＧＡ，Ｈｖａｔｔｕｍ Ｅ，Ｓｉｍｏｎｓｅｎ Ｂ，Ｓｔａｃｙ ＪＥ，ＭｃＧｒｅｇｏｒ Ｄ，Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｋ，Ｗｅｌｓｃｈｏｆ Ｍ，Ｂｒｅｋｋｅ ＯＨ，Ｍａｒｖｉｋ ＯＪ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｓｐｌａｙ−−ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００５ Ｊａｎ１４；３３（１）：ｅ１０．
Ｂｅｒｔｓｃｈｉｎｇｅｒ Ｊ，Ｎｅｒｉ Ｄ．Ｃｏｖａｌｅｎｔ ＤＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２００４ Ｓｅｐ；１７（９）：６９９−７０７．Ｅｐｕｂ ２００４ Ｎｏｖ２．
Ｓｔｅｉｎ Ｖ，Ｓｉｅｌａｆｆ Ｉ，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ Ｋ，Ｈｏｌｌｆｅｌｄｅｒ Ｆ．Ａ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００７ Ｄｅｃ１７；８（１８）：２１９１−４．
Ｔａｂｕｃｈｉ Ｉ，Ｓｏｒａｍｏｔｏ Ｓ，Ｎｅｍｏｔｏ Ｎ，Ｈｕｓｉｍｉ Ｙ．Ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００１ Ｎｏｖ２３；５０８（３）：３０９−１２．

Claims (18)

  1. 配列番号：２５で表されるアミノ酸配列において、Ｌ１３９の突然変異を有するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素を含む逆転写酵素であって、
    ４２℃以上の温度で最適活性を有し、
    任意に、前記アミノ酸配列は、更に、以下のアミノ酸位置のうちの１以上に突然変異を含むことを特徴とする逆転写酵素：
    Ｌ６０３、Ｄ２００、Ｔ３３０、Ｅ６０７、Ｔ２８７、Ｑ２２１、Ｉ４９、Ｎ４７９、Ｈ５９４、Ａ５０２、Ｄ６５３、Ｋ６５８、Ｐ１３０、Ｑ２３７、Ｈ６３４、Ｄ５２４、Ａ３０７、Ｙ３４４、Ｑ４３０、Ｄ４４９、Ａ６４４、Ｎ６４９、Ｌ６７１、Ｅ６７３、Ｍ３９、Ｑ９１、Ｍ６６、Ｗ３８８、Ｉ１７９、Ｌ３３３、Ｒ３９０、Ｑ３７４、及びＥ５。
  2. 少なくとも５０℃における活性が対応する野生型酵素の少なくとも５０℃における活性よりも高い請求項１に記載の逆転写酵素。
  3. ５０℃における活性が対応する野生型酵素の５０℃における活性よりも高い請求項１から２のいずれかに記載の逆転写酵素。
  4. ５０℃における比活性が対応する野生型酵素の５０℃における比活性の少なくとも１１０％である請求項１から３のいずれかに記載の逆転写酵素。
  5. ４７．８℃において、ｃＤＮＡを合成する能力を有する請求項１から４のいずれかに記載の逆転写酵素。
  6. Ｌ１３９Ｐの突然変異と、任意に、以下の突然変異のうちの１以上を有する請求項１から５のいずれかに記載の逆転写酵素：
    Ｌ６０３Ｗ、Ｌ６０３Ｍ、Ｄ２００Ｎ、Ｄ２００Ａ、Ｄ２００Ｇ、Ｔ３３０Ｐ、Ｅ６０７Ｋ、Ｅ６０７Ｇ、Ｅ６０７Ａ、Ｔ２８７Ａ、Ｑ２２１Ｒ、Ｉ４９Ｖ、Ｉ４９Ｔ、Ｎ４７９Ｄ、Ｈ５９４Ｋ、Ｈ５９４Ｒ、Ｈ５９４Ｑ、Ｈ６３４Ｙ、Ｄ５２４Ａ、Ｄ５２４Ｎ、Ｄ５２４Ｇ、Ａ５０２Ｖ、Ｄ６５３Ｇ、Ｄ６５３Ａ、Ｄ６５３Ｈ、Ｄ６５３Ｖ、Ｋ６５８Ｒ、Ｋ６５８Ｑ、Ｐ１３０Ｓ、Ｑ２３７Ｒ、Ａ３０７Ｖ、Ｙ３４４Ｈ、Ｑ４３０Ｒ、Ｄ４４９Ｇ、Ｄ４４９Ａ、Ａ６４４Ｖ、Ａ６４４Ｔ、Ｎ６４９Ｓ、Ｌ６７１Ｐ、Ｅ６７３Ｇ、Ｅ６７３Ｋ、Ｍ３９Ｖ、Ｍ３９Ｌ、Ｑ９１Ｒ、Ｑ９１Ｌ、Ｍ６６Ｌ、Ｗ３８８Ｒ、Ｉ１７９Ｔ、Ｉ１７９Ｖ、Ｌ３３３Ｑ、Ｒ３９０Ｗ、Ｑ３７４Ｒ、及びＥ５Ｋ。
  7. 少なくとも２つの突然変異を有する請求項１から６のいずれかに記載の逆転写酵素。
  8. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９及びＤ２００に存在する請求項７に記載の逆転写酵素。
  9. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９Ｐ及びＤ２００Ｎである請求項８に記載の逆転写酵素。
  10. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９及びＴ３３０に存在する請求項７に記載の逆転写酵素。
  11. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９Ｐ及びＴ３３０Ｐである請求項１０に記載の逆転写酵素。
  12. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９及びＮ４７９に存在する請求項７に記載の逆転写酵素。
  13. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９Ｐ及びＮ４７９Ｄである請求項１２に記載の逆転写酵素。
  14. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９及びＬ６０３に存在する請求項７に記載の逆転写酵素。
  15. 少なくとも２つの突然変異が、Ｌ１３９Ｐ及びＬ６０３Ｗである請求項１４に記載の逆転写酵素。
  16. アミノ酸位置Ｄ６５３の突然変異は、Ｄ６５３Ｎではない請求項１に記載の逆転写酵素。
  17. アミノ酸位置Ｈ５９４の突然変異は、Ｈ５９４Ａではない請求項１に記載の逆転写酵素。
  18. 請求項１から１７のいずれかに記載の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド。
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