CN111849938B

CN111849938B - 一种突变型逆转录酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111849938B
Application number: CN202010503289.4A
Authority: CN
Inventors: 胡松青; 陈雪梅; 赵劲松; 刘光毅; 侯轶; 苑歆
Original assignee: Guangzhou Yingzan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou yingzan Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2040-06-05
Also published as: CN111849938A

Abstract

本发明公开了一种突变型逆转录酶及其制备方法与应用。本发明公开的突变型逆转录酶是野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶经定点突变改造而成。所述的突变型逆转录酶不但完整保留了野生蛋白结构，具有野生型逆转录酶的聚合酶活性，而且，其RNase H水解活性丧失。所述突变型逆转录酶耐抑制剂、耐热能力强，以RNA为模板逆转录合成cDNA的效率高。所述突变型逆转录酶对应用体系中存在的各类抑制剂均具有很高的耐受性，在基因检测中能有效防止抑制剂干扰cDNA合成而造成假阴性，提高了检测的准确性。所述突变型逆转录酶可用于RNA扩增和检测，普通及长链cDNA的快速合成，以及具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。

Description

一种突变型逆转录酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种突变型逆转录酶及其制备方法与应用。

背景技术

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是现代分子生物学中不可或缺的实验技术。该技术在医学检测、病原微生物检测、法医学鉴定和食品安全检测等诸多领域有广泛应用。PCR技术所使用的模板为单链cDNA或双链DNA，而当检测模板为RNA时，需先将RNA逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。逆转录酶是将单链RNA转化为cDNA的关键酶。逆转录酶一般具有三种酶活性：RNA依赖性DNA聚合酶活性、DNA依赖性DNA聚合酶活性和RNase H活性，其中，RNase H活性能特异性地消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于第二链cDNA的合成，但会妨碍单一链长cDNA的合成，不适用于长cDNA链的克隆。cDNA的合成是继PCR之后的第二大分子生物学技术，逆转录反应广泛应用于cDNA文库的克隆、相对定量RT-PCR、绝对定量qRT-PCR、cDNA微阵列分析、RNA扩增、基因表达分析等应用。

目前，逆转录酶主要有禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(Avian myeloblastosisvirus reverse transcriptase，AMV RT)和莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(Moloneymurine leukaemia virus reverse transcriptase，MMLV RT)，AMV RT热稳定性较好，但cDNA合成长度短，得率低；MMLV RT热稳定性差，但cDNA合成长度长，得率高，两者均具有DNA聚合酶活性和RNase H活性。AMV RT的RNase H活性高，RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链形成RNA-DNA杂合链，RNase H活性会与聚合酶活性竞争此杂合链，并降解杂合链中的RNA链，被RNase H活性所降解的RNA不能再作为合成cDNA的有效底物，因此降低了cDNA合成的产量与长度；从cDNA合成效率而言，MMLV RT性能优于AMV RT。现有的由野生型MMLV RT改造的逆转录酶一般是通过删除RNase H活性结构域去除RNase H活性。这种改造改变了蛋白质的完整结构，降低了DNA聚合酶活性，cDNA合成效率并未有明显提升。因此，找到一种既能降低逆转录酶RNase H活性又不影响DNA聚合酶活性的改造方法一直是逆转录酶的研究热点。

同时，逆转录反应中存在各类抑制剂组分干扰cDNA的合成，在RT-PCR或qRT-PCR检测时，易造成假阴性结果。抑制剂包括样本中的腐殖酸、多糖等，以及RNA提取时使用的化学试剂，如异丙醇和盐类等。此外，实验证明，适当提高逆转录反应的温度有利于打开RNA模板的二级结构，提升引物与模板的亲和结合能力，降低非特异性结合，提高cDNA合成效率和质量，温度升高会降低逆转录活性。现有的逆转录酶耐受抑制剂和耐热能力有限，提升耐抑制剂和耐热能力对逆转录酶的应用也是至关重要的。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种突变型逆转录酶。该逆转录酶具有更高的催化效率和更好的耐抑制剂、耐热的能力。

本发明的另一目的在于提供上述突变型逆转录酶的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述突变型逆转录酶的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种突变型逆转录酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的突变型逆转录酶的氨基酸序列与NCBI编号为NP_955591的野生型MMLV RT相比，具有以下氨基酸突变：8位组氨酸突变成为酪氨酸、51位脯氨酸突变成为异亮氨酸、200位天冬氨酸突变成为谷氨酸、249位天冬酰胺突变成为谷氨酰胺、330位苏氨酸突变成为丝氨酸、524位天冬氨酸突变成为甘氨酸、562位谷氨酸突变成为谷氨酰胺、583位天冬氨酸突变成为天冬酰胺、603位亮氨酸突变成为异亮氨酸、664位苏氨酸突变成为天冬酰胺。

编码上述突变型逆转录酶的DNA分子。

所述的突变型逆转录酶的DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，能显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

一种重组表达载体，是将编码上述突变型逆转录酶的DNA分子克隆入表达载体得到。

所述的表达载体优选为原核表达载体；更优选为pET系列载体；更优选为pET-28a。

一种重组工程细胞株，是将上述重组表达载体转化入工程细胞得到。

所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为BL21(DE3)细胞。该重组工程细胞株可快速、可溶表达上述重组表达载体。

上述突变型逆转录酶可通过化学合成方法得到，或是通过重组工程细胞株诱导表达、纯化制备得到。从成本考虑，优选为通过重组工程细胞株诱导表达、纯化制备得到；具体包括如下步骤：

(1)取上述重组工程细胞株，接种于LB培养基中培养，得到重组工程细胞种子液；

(2)取重组工程细胞种子液接种至LB培养基中，培养至菌液OD₆₀₀达到0.6～0.8；

(3)向菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度为0.08～0.12mmol/L，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀，所得菌体沉淀中包含所述的突变型逆转录酶。

所述的LB培养基均优选为含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基。

步骤(1)中所述的培养的条件优选为振荡培养；更优选为于37℃振荡培养过夜。

步骤(2)中所述的重组工程细胞种子液和LB培养基的配比优选为体积比1:90～110；更优选为体积比1:100。

步骤(2)中所述的培养的条件优选为温度35～38℃、转速150～200r/min；更优选为温度37℃、转速180r/min。

步骤(3)中所述的加入诱导剂IPTG至终浓度为0.08～0.12mmol/L优选为加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1mmol/L。

步骤(3)中所述的诱导的条件优选为于16～20℃诱导16～20h；更优选为于18℃诱导16h。

步骤(3)中所述的离心的条件优选为4℃下5000～10000r/min离心20～30min；更优选为4℃下7000r/min离心15min。

所述的突变型逆转录酶的制备方法还包括如下步骤：

(4)在所得菌体沉淀中加入裂解缓冲液，震荡处理，得到分散均匀的菌体重悬液；

(5)取菌体重悬液超声处理，离心去除沉淀，过滤，得到上清液；

(6)先通过镍离子亲和层析收集含有目的蛋白的样品洗脱液，再经阴离子交换层析，即得到所述的突变型逆转录酶。

步骤(4)中所述的裂解缓冲液的配方优选为：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，5％甘油，pH为8.0。

步骤(4)中所述的菌体沉淀和裂解缓冲液的配比优选为质量体积比1g:5～10mL；更优选为1g:5mL。

步骤(5)中所述的超声处理的条件优选为功率200～300W，超声4～6s，间隔4～5s，持续20～30min；更优选为功率250W，超声5s，间隔5s，持续30min。

步骤(5)中所述的离心的条件优选为4℃下10000～15000r/min离心20～40min；更优选为4℃下12000r/min离心30min。

步骤(5)中所述的过滤优选为使用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤。

步骤(6)中所述的镍离子亲和层析和阴离子交换层析所用的结合缓冲液(BufferA)的配方优选为：50mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，5％甘油，25℃时pH为8.0。

步骤(6)中所述的镍离子亲和层析所用的洗脱缓冲液(Buffer B)的配方优选为：50mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，5％甘油，25℃时pH为8.0。

步骤(6)中所述的阴离子交换层析所用的洗脱缓冲液(Buffer C)的配方优选为：100mmol/L Tris，1mol/L NaCl，10％甘油，25℃时pH为8.0。

一种逆转录反应试剂盒，包含PCR用水、逆转录反应缓冲液、dNTPs和逆转录反应引物中的至少一种，和上述突变型逆转录酶。

所述的逆转录反应缓冲液的配方优选如下：10～50mmol/L Tris-HCl，3～50mmol/L MgCl，50～100mmol/L KCl，10～100mmol/L DTT，pH值为7～9；更优选如下：50mmol/LTris-HCl，3mmol/L MgCl，75mmol/L KCl，10mmol/L DTT，25℃时pH值为8.3。

所述的突变型逆转录酶在体系中的浓度优选为1～100U/μL；更优选为10U/μL。

所述的dNTPs在体系中的浓度优选为100～600μmol/L；更优选为500μmol/L。

所述的逆转录反应引物优选为Oligo(dT)₂₃VN、随机引物和基因特异性反转引物中的至少一种。

所述的Oligo(dT)₂₃VN在体系中的浓度优选为2～3mol/L；更优选为2.5mol/L。

所述的随机引物在体系中的浓度优选为2～3mg/L；更优选为2.5mg/L。

上述逆转录反应试剂盒在逆转录RNA样本中的应用。

所述的应用的具体操作为：采用上述逆转录反应试剂盒和含有所述RNA样本的样品，进行逆转录反应，以便获得经逆转录的cDNA产物。

本发明与现有技术相比具有如下的优点及有益效果：

1、本发明所述突变型逆转录酶具有很强的耐抑制剂能力，在各种抑制剂存在的情况下，本突变型逆转录酶的活性不受影响或影响很小，在20μL逆转录体系中，能够耐受25％(v/v)乙醇、25％(v/v)异丙醇、50μg人类血清免疫球蛋白、100ng腐殖酸、50μg黄芪多糖等，降低了抑制剂组分对cDNA合成的干扰，提高cDNA完整度和得率，使得用所述突变型逆转录酶合成的cDNA产物在进行PCR或qPCR扩增或进一步分析鉴定时，所得结果更加真实可靠。

2、本发明所述的突变型逆转录酶能够耐受75℃高温，在此温度下，所需逆转录的RNA样本的二级结构基本被打开，且提升了引物与样本的亲和结合能力，降低了体系中的非特异性结合，提升了cDNA合成效率以及合成cDNA的质量，使得用所述突变型逆转录酶进行逆转录反应时，能够对复杂结构的RNA模板进行高效的逆转录反应，合成更高质量的cDNA。

3、本发明所述突变型逆转录酶DNA聚合酶活性高、逆转录速度快，在50℃反应条件下，10s内即可合成完整的可用于后续PCR、qPCR扩增或其它进一步实验的cDNA产物，使得用所述突变型逆转录酶进行反应的范围更广，能够用于快速cDNA的合成，加快了以RNA为模板的RT-PCR或RT-qPCR检测速率。

附图说明

图1为亲和层析纯化洗脱液的SDS-PAGE蛋白电泳检测结果图；其中，泳道M为Marker，泳道1～9依次为按时间顺序洗脱出的1～9管的亲和层析蛋白洗脱液。

图2为亲和层析纯化洗脱液的SDS-PAGE蛋白电泳检测结果图；其中，泳道M为Marker，泳道10～18依次为按时间顺序洗脱出的10～18管的亲和层析蛋白洗脱液。

图3为离子交换层析纯化洗脱液的SDS-PAGE蛋白电泳检测结果图；其中，泳道M为Marker，泳道1～9依次为按时间顺序洗脱出的1～9管的离子交换层析蛋白洗脱液。

图4为逆转录酶在添加不同量的乙醇的条件下进行的qRT-PCR检测结果图；其中，(1)为本发明突变型逆转录酶检测结果；(2)为突变型逆转录酶A(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号—R302-01)检测结果；(3)为删除RNase H活性结构域的逆转录酶B(通过删除MMLV RT中520～660位共计141个氨基酸残基所得)检测结果；曲线a、b、c、d、e依次对应5％、10％、15％、20％、25％的乙醇添加量。

图5为逆转录酶在添加不同量的异丙醇的条件下进行的qRT-PCR检测结果图；其中，(1)为本发明突变型逆转录酶检测结果；(2)为突变型逆转录酶A检测结果；(3)为逆转录酶B检测结果；曲线a、b、c、d、e依次对应5％、10％、15％、20％、25％的异丙醇添加量。

图6为逆转录酶在添加不同量的人类血清免疫球蛋白的条件下进行的qRT-PCR检测结果图；其中，(1)为本发明突变型逆转录酶检测结果；(2)为突变型逆转录酶A检测结果；(3)为逆转录酶B检测结果；曲线a、b、c、d、e依次对应10μg、20μg、30μg、40μg、50μg的人类血清免疫球蛋白添加量。

图7为逆转录酶在添加不同量的腐殖酸的条件下进行的qRT-PCR检测结果图；其中，(1)为本发明突变型逆转录酶检测结果；(2)为突变型逆转录酶A检测结果；(3)为逆转录酶B检测结果；曲线a、b、c、d、e依次对应40ng、50ng、60ng、80ng、100ng的腐殖酸添加量。

图8为逆转录酶在添加不同量的黄芪多糖的条件下进行的qRT-PCR检测结果图；其中，(1)为本发明突变型逆转录酶检测结果；(2)为突变型逆转录酶A检测结果；(3)为逆转录酶B检测结果；曲线a、b、c、d、e依次对应10μg、20μg、30μg、40μg、50μg的黄芪多糖添加量。

图9为本发明突变型逆转录酶在不同逆转录时间下的RT-PCR检测结果图；其中，泳道M为Marker，泳道1为不添加逆转录酶的空白对照，泳道2～12依次对应逆转录时间为10s、30s、1min、2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min、30min。

图10为逆转录酶B在不同逆转录时间下的RT-PCR检测结果图；其中，泳道M为Marker，泳道1为不添加逆转录酶的空白对照，泳道2～12均依次对应逆转录时间为10s、30s、1min、2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min、30min。

图11为逆转录酶在不同逆转录温度下的RT-PCR检测结果图；其中，泳道M为Marker，泳道1为不添加逆转录酶的空白对照，泳道2～9为本发明突变型逆转录酶的检测结果，泳道10～17为逆转录酶B的检测结果，且均分别依次对应逆转录温度为42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃。

图12为突变型逆转录酶与其它商品酶的逆转录性能比较结果图；其中，曲线I为本发明所述逆转录酶检测结果；曲线II为逆转录酶A(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号—R302-01)的扩增结果；曲线III为逆转录酶C(Thermo Fisher，货号—18090010)的扩增结果；曲线IV为逆转录酶D(NEB，货号—E6300)的扩增结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明，但引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。

实施例1构建含编码突变型逆转录酶的核苷酸序列的重组载体

(1)根据突变型逆转录酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)，进行大肠杆菌表达系统的密码子优化后，获得能在大肠杆菌中进行高效表达的DNA分子，利用拼接PCR的方法，人工合成编码所述突变型逆转录酶的DNA分子，具体如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.1(方框内为突变氨基酸)：

SEQ ID NO.2：

(2)将编码突变型逆转录酶的DNA分子与表达载体pET-28a进行重组。合成引物序列如下：

FP1：5’-ATCCATGGAGAAATATACAGAA-3’(SEQ ID NO.3)；

RP1：5’-GTACCGAATTCCTTCAAGCC-3’(SEQ ID NO.4)；

FP2：5’-GGCTTGAAGGAATTCGGTAC-3’(SEQ ID NO.5)；

RP2：5’-TTCTGTATATTTCTCCATGGAT-3’(SEQ ID NO.6)。

应用PCR对突变型逆转录酶的DNA分子进行扩增，以人工合成编码所述突变型逆转录酶的DNA分子为模板，加入25μL 2×Pfu Max HiFi PCR Pro Mix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)、各1μL(10μmol)上下游引物FP1和RP1以及适量的灭菌水，进行PCR扩增。扩增条件为：98℃2min；98℃10s、60℃30s、68℃1min30s，共20个循环；68℃5min。琼脂糖凝胶电泳回收全长约2.9kb的目的基因片段，以FP2和RP2为引物线性化载体pET-28a，采用上述方法进行同样的PCR反应，仅更改延伸时长为3min40s，琼脂糖凝胶电泳回收全长约7kb的目的基因片段；用T4 DNA酶进行连接反应，连接产物转化至DH5a感受态细胞中。

(3)挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆送往测序公司测序验证，证实编码突变型逆转录酶的DNA分子的正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码突变型逆转录酶的DNA分子的重组载体。

实施例2表达突变型逆转录酶的转化体的制备

将实施例1获得的重组载体转化到宿主细胞E.coliBL21(DE3)中，挑取单菌落，接种至液体LB培养基(含50μg/mL的卡那霉素)培养至OD₆₀₀为0.8，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，18℃诱导16h，收集菌体超声破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备的转化体能够高效表达突变型逆转录酶。

实施例3突变型逆转录酶在重组大肠杆菌中的表达和鉴定

将实施例2获得的能够表达突变型逆转录酶的阳性转化体菌种，接种至含50μg/mL卡那霉素的60mL LB培养基中，放置于37℃摇床中震荡培养过夜；取过夜培养的种子液，按体积比1:100接种至500mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床中继续震荡培养3h；向每瓶菌液加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，18℃继续震荡诱导16h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重；取诱导前及诱导后菌液各1mL，12000r/min离心1min后取沉淀，加入150μL裂解缓冲液(50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，5％甘油，pH为8.0)，震荡均匀，超声破碎(250W功率，超声0.5s，间隔0.5s，超声时长1min)，离心取上清液，沉淀物加入150μL裂解缓冲液，震荡重悬。取上清及沉淀组分悬液进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达情况。表达结果为上清液在74.7KDa处有明显蛋白条带，而沉淀组分悬浮液在此处没有明显蛋白条带。

实施例4突变型逆转录酶纯化

(1)首先为重组菌体超声破碎，取-20℃冻存的诱导表达菌体，根据实施例3记录的菌体湿重，按每克菌体加入5mL裂解缓冲液重悬菌体，用超声波细胞破碎仪裂解菌体，超声条件为：功率250W，超声5s，间隔5s，持续30min。将裂解后菌体放入高速冷冻离心机，4℃下12000r/min离心30min，取上清液过0.22μm微孔滤膜至250mL灭菌烧瓶中。

(2)其次为镍离子亲和层析，纯化选用的层析柱是HisTrap^T ^M HP 5mL(购自GEHealthcare)，结合缓冲液为缓冲液A：50mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、5％甘油，pH为8.0；洗脱缓冲液为缓冲液B：50mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、500mmol/L咪唑、5％甘油，pH为8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

(3)将HisTrap^T ^M HP 5mL接入快速蛋白质纯化仪柱位阀中，后用超纯水清洗系统和柱子，再用缓冲液A平衡柱子，然后用样品泵将步骤(1)所述上清液进行上样，上样完毕，先用结合缓冲液A清洗柱子，再用洗脱缓冲液B进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。分别对各个洗脱峰取样20μL，用SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图1和图2所示。

(4)最后为强阴离子交换柱层析，所用层析柱为HisTrap^TMCapto^T ^M Q 5mL(购自GEHealthcare)，所用的结合缓冲液仍为缓冲液A；洗脱缓冲液为缓冲液C：100mMTris、1MNaCl、10％甘油，pH为8.0，0.22μm滤膜过滤备用。

(5)将HisTrap^TMCapto^T ^M Q 5mL接入AKTA纯化仪柱位阀中，再用超纯水清洗系统和柱子，用缓冲液A平衡柱子，然后用样品泵将上述含有目的蛋白的亲和层析样品进行上样，上样完毕，先用缓冲液A清洗柱子，再用洗脱缓冲液C进行梯度洗脱，并收集洗脱峰。分别对各个洗脱峰取样20μL，SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如图3所示。

实施例5突变型逆转录酶活性测试

取实施例4制备的突变型逆转录酶，按照以下方法测定酶活。以Poly(rA)·Oligo(dT)_12-18为模板/引物，在37℃、10min内，掺入1nmol的[3H]dTTP所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。结果表明，本发明的突变型逆转录酶的活力单位为800U/μL。

实施例6突变型逆转录酶耐抑制剂能力测试

以1μg人宫颈癌细胞HeLa细胞系(ATCC)Total RNA为模板，采用本发明所述突变型逆转录酶和突变型逆转录酶A(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号—R302-01)以及逆转录酶B(具体制备方法参考实施例1～4，其氨基酸序列为通过删除MMLV RT中520～660位共计141个氨基酸残基所得)，在各自最适RT条件下和同一qPCR检测条件下进行检测，其中在逆转录反应体系中分别添加不同种类和剂量的抑制剂，然后以1μL逆转录反应后原液为模板，进行qPCR检测，qPCR扩增基因为B2M基因，所用引物为：B2M-FP：5’-CTATCCAGCGTACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)和B2M-FP：5’-GAAAGACCAGTCCTTGCTGA-3’(SEQ IDNO.8)，本发明高耐受性逆转录酶和商品酶A、逆转录酶B反应体系均为20μL：4μL5×RTReaction Buffer(广州英赞生物科技有限公司，货号—R410)，50μmol Oligo(d T)₂₃VN，50ng随机引物，40URNA酶抑制剂(广州英赞生物科技有限公司，货号—NL301A)，200U不同逆转录酶，10μmol dNTPs，其中高耐受性逆转录酶和商品酶A反应程序为25℃变性5min、50℃逆转录15min、85℃灭活2min；逆转录酶B反应程序为25℃变性5min、42℃逆转录45min、70℃灭活15min。qPCR所用试剂均为2×Robust SYBR Green qPCRPro Mix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)，反应体系和程序参照说明书；测试结果如图4、图5、图6、图7、图8所示；其中，各图所示的结果中，图(1)为本发明突变型逆转录酶检测结果，(2)为突变型逆转录酶A检测结果，(3)为逆转录酶B检测结果；图4为添加乙醇的检测结果，在20μL体系中，乙醇添加量(v/v)依次为5％、10％、15％、20％、25％，扩增曲线依次为a、b、c、d、e；图5为添加异丙醇的检测结果，在20μL体系中，异丙醇添加量(v/v)依次为5％、10％、15％、20％、25％，扩增曲线依次为a、b、c、d、e；图6为添加人类血清免疫球蛋白的检测结果，在20μL体系中，人类血清免疫球蛋白添加量依次为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，扩增曲线依次为a、b、c、d、e；图7为添加腐殖酸的检测结果，在20μL体系中，腐殖酸添加量依次为40ng、50ng、60ng、80ng、100ng，扩增曲线依次为a、b、c、d、e；图8为添加黄芪多糖的检测结果，在20μL体系中，黄芪多糖添加量依次为10μg、20μg、30μg、40μg、50μg，扩增曲线依次为a、b、c、d、e。

实施例7突变型逆转录酶的逆转录能力测试

以1μg人肾上皮293T细胞系(ATCC)Total RNA为模板，采用本发明所述突变型逆转录酶和逆转录酶B在同一逆转录温度50℃和同一PCR检测条件下，仅改变逆转录时间进行RT-PCR检测，PCR扩增片段长度为1097bp，PCR扩增基因为内参基因GAPDH，所用引物为：GAPDH1-FP：5’-GAAGACCTTGGGCTGGGACT-3’(SEQ ID NO.9)和GAPDH-RP：5’-CAAGAGGACCTCCATAAACCCACT-3’(SEQ ID NO.10)。RT试剂同实施例6；PCR所用试剂为2×PfuMax HiFi PCR Pro Mix(由广州英赞生物科技有限公司生产，EnzyValley，货号P217)，反应体系和程序参照说明书进行配制和进行反应，将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图9、10所示，其中图9为本发明突变型逆转录酶在不同逆转录时间下的RT-PCR检测结果图，图10为逆转录酶B在不同逆转录时间下的RT-PCR检测结果图。两图中泳道M均为Marker，泳道1均为不添加逆转录酶的空白对照，泳道2～12均依次对应逆转录时间为10s、30s、1min、2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min、30min。结果表明，本发明所述突变型逆转录酶具有很强的逆转录能力，能够在10s内完成逆转录，且合成的cDNA的量与逆转录30min时合成cDNA的量相比，无明显差别。

实施例8突变型逆转录酶热稳定性测试

以1μg人肾上皮293T细胞系(ATCC)Total RNA为模板，采用本发明所述突变型逆转录酶和逆转录酶B在同一逆转录时间5min和同一PCR检测条件的情况下，仅改变逆转录温度进行RT-PCR检测，PCR扩增片段长度为1097bp，PCR扩增基因为内参基因GAPDH，所用引物为：GAPDH1-FP：5’-GAAGACCTTGGGCTGGGACT-3’(SEQ ID NO.9)和GAPDH-RP：5’-CAAGAGGACCTCCATAAACCCACT-3’(SEQ ID NO.10)。RT和PCR的反应试剂和程序均同实施例7；将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图11所示，其中泳道M为Marker，泳道1为不添加逆转录酶的空白对照，泳道2～9为本发明突变型逆转录酶的检测结果，泳道10～17为逆转录酶B的检测结果，且均分别依次对应逆转录温度为42℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃。结果表明，本发明所述突变型逆转录酶具有极高的热稳定性，能够在75℃高温下完成逆转录，且合成的cDNA的量与在42～70℃下合成cDNA的量相比，无明显差别。

实施例9突变型逆转录酶与其它同类商品酶逆转录性能的比较

以1μg人类结肠癌细胞HT29细胞系(ATCC)Total RNA为模板，将本发明所述突变型逆转录酶与其它商品酶在同一RT-qPCR反应条件下进行检测，RT和qPCR的反应试剂和程序同实施例6；qPCR扩增基因为内参基因B2M，所用引物为：B2M-FP：5’-CTATCCAGCGTACTCCAAAG-3’(SEQ ID NO.7)和B2M-FP：5’-GAAAGACCAGTCCTTGCTGA-3’(SEQ ID NO.8)扩增结果如图12所示，其中曲线I为本发明所述逆转录酶检测结果；曲线II为逆转录酶A的扩增结果；曲线III为逆转录酶C的扩增结果；曲线IV为逆转录酶D的扩增结果。结果显示，和市售的其它同类商品酶相比，本发明突变型逆转录酶的Ct值最小，平台期荧光值最高，证明本发明所述突变型逆转录酶的逆转录能力更强，逆转录生成cDNA时速度更快且生成的cDNA量更多。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种突变型逆转录酶及其制备方法与应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 671

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变型逆转录酶氨基酸序列

<400> 1

Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu Tyr Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu

1 5 10 15

Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala

20 25 30

Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu

35 40 45

Ile Ile Ile Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr

50 55 60

Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg

65 70 75 80

Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val

100 105 110

Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr

115 120 125

Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln

130 135 140

Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu

145 150 155 160

His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe

180 185 190

Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Glu Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala

195 200 205

Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr

225 230 235 240

Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Gln Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala

245 250 255

Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val

275 280 285

Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu

290 295 300

Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met

305 310 315 320

Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Ser Gly Thr Leu Phe Asn Trp

325 330 335

Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu

340 345 350

Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu

355 360 365

Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys

370 375 380

Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp

385 390 395 400

Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile

405 410 415

Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu

420 425 430

Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro

435 440 445

Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu

450 455 460

Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro

465 470 475 480

Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu

485 490 495

Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln

500 505 510

Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Gly Gly Ser Ser Leu

515 520 525

Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr

530 535 540

Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg

545 550 555 560

Ala Gln Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys

565 570 575

Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asn Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His

580 585 590

Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Ile Leu Thr Ser Glu Gly

595 600 605

Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu

610 615 620

Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys

625 630 635 640

Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala

645 650 655

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Asn Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu

660 665 670

<210> 2

<211> 2013

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 突变型逆转录酶核苷酸序列

<400> 2

accctgaata ttgaagatga gtatcggttg catgaaacta gcaaggaacc cgatgtgtct 60

ctgggcagca cctggctgag cgactttcca caagcgtggg cggagacagg tggtatgggt 120

ttagcagtgc gccaggctcc cctgattatc atcctgaagg caacgagcac ccctgtgagc 180

atcaaacaat atccgatgag ccaggaagct cgtttaggca ttaaaccgca tattcaacgt 240

ttgctggatc agggcattct ggtcccatgc cagagcccat ggaatacccc gttgctgcca 300

gtgaaaaagc caggcacgaa tgactaccgg ccagtgcaag atctgcgtga agtgaataaa 360

cgcgtggaag atatacatcc gaccgtgccg aatccgtata atcttttaag tgggctgcct 420

ccgagccatc agtggtacac tgtgttggac cttaaagacg cattcttttg cttgcggtta 480

catcccacta gccagccgct gtttgcgttt gagtggcgtg atcccgagat gggcatttcc 540

ggtcaactga catggacccg tctgccgcag ggcttcaaaa attccccgac ccttttcgaa 600

gaggccttgc atcgtgattt agcggacttt cgcatacaac acccggacct gattctgtta 660

cagtatgtgg acgatttact gctggcggct acgtctgagc tggattgtca gcaaggtaca 720

cgcgcattat tgcagacgct ggggcagttg ggttaccgtg cgagcgcgaa aaaagcgcag 780

atttgccaaa agcaagtgaa atatctggga tatttgctga aggaagggca gcggtggttg 840

acagaggccc gtaaggagac tgtgatgggg caaccaaccc cgaagacacc tcgccagtta 900

cgtgaattcc tggggactgc gggattttgt cgcctgtgga tccccggctt tgcagagatg 960

gcagctccac tttatccgct tacgaaaagc ggaaccctgt ttaattgggg gccagaccaa 1020

cagaaagcat accaggaaat caagcaagca ttactgactg cgcctgccct gggcctgccg 1080

gacttgacca aaccgttcga gttatttgtg gatgaaaagc aggggtacgc aaaaggcgtt 1140

cttacccaga agctgggccc ctggcgtcgc cccgtcgcgt atctgtccaa aaagttggat 1200

cctgtagcgg caggttggcc gccttgctta cgcatggttg cggccatcgc ggtgttgacg 1260

aaggatgcgg gcaagttaac aatgggccag ccccttgtca ttcttgcgcc tcatgcagtg 1320

gaagcattgg tgaagcagcc cccagatcgt tggcttagca atgcacgcat gacccattat 1380

caggcgctgt tactggatac cgatcgcgtg cagtttggcc cggtggtggc gttgaacccg 1440

gcgacacttt taccattgcc cgaggaagga cttcaacata attgcttgga catcctggcc 1500

gaagcacacg ggacacggcc cgacctgacg gatcaacctc ttcccgacgc agaccacaca 1560

tggtatacag ggggttcgag cctgctgcaa gagggacagc ggaaggcggg agcggcggtg 1620

acaaccgaaa ccgaggtcat atgggcgaaa gccttaccgg ctggaacgtc agcgcaacgc 1680

gctcaactta ttgcgttgac ccaagcgctg aaaatggccg agggcaaaaa actgaatgtt 1740

tacacgaata gccgttatgc attcgcgacc gcgcacatac atggcgaaat ctatcgtcgc 1800

cgtggcatac tgaccagcga aggaaaagag atcaaaaaca aggatgagat attggctctt 1860

ctgaaagctc tgtttcttcc gaagcggtta tccatcatac attgtcctgg tcatcaaaag 1920

ggccatagtg cggaggctcg tggtaatcgt atggcagatc aagctgctcg caaagcggca 1980

attacagaga atcctgatac cagcacgctt ctg 2013

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FP1

<400> 3

atccatggag aaatatacag aa 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FR1

<400> 4

gtaccgaatt ccttcaagcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FP2

<400> 5

ggcttgaagg aattcggtac 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> FR2

<400> 6

ttctgtatat ttctccatgg at 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B2M-FP

<400> 7

ctatccagcg tactccaaag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B2M-RP

<400> 8

gaaagaccag tccttgctga 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH1-FP

<400> 9

gaagaccttg ggctgggact 20

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> GAPDH-RP

<400> 10

caagaggacc tccataaacc cact 24

Claims

1.一种突变型逆转录酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1中所述的突变型逆转录酶的DNA分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于：是将编码权利要求1中所述的突变型逆转录酶的DNA分子克隆入表达载体得到。

4.一种重组工程细胞株，其特征在于：是将权利要求3中所述的重组表达载体转化入工程细胞得到。

5.一种突变型逆转录酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)取权利要求4中所述的重组工程细胞株，接种于LB培养基中，培养，得到重组工程细胞种子液；

6.根据权利要求5中所述的突变型逆转录酶的制备方法，其特征在于：还包括如下步骤：

(5)取菌体重悬液，超声处理，离心去除沉淀，过滤，得到上清液；

7.根据权利要求6中所述的突变型逆转录酶的制备方法，其特征在于：

所述的LB培养基均为含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基；

步骤(1)中所述的培养的条件为于37℃振荡培养过夜；

步骤(2)中所述的重组工程细胞种子液和LB培养基的配比为体积比1:90～110；

步骤(2)中所述的培养的条件为温度35～38℃、转速150～200r/min；

步骤(3)中所述的诱导的条件为于16～20℃诱导16～20h；

步骤(4)中所述的裂解缓冲液的配方为：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，15mmol/L咪唑，5％甘油，pH为8.0；

步骤(4)中所述的菌体沉淀和裂解缓冲液的配比为质量体积比1g:5～10mL；

步骤(5)中所述的超声处理的条件为功率200～300W，超声4～6s，间隔5s，持续30min；

步骤(5)中所述的离心的条件为4℃下10000～15000r/min离心20～40min。

8.一种逆转录反应试剂盒，其特征在于：包含PCR用水、逆转录反应缓冲液、dNTPs和逆转录反应引物中的至少一种，和权利要求1中所述的突变型逆转录酶。

9.根据权利要求8中所述的逆转录反应试剂盒，其特征在于：

所述的逆转录反应缓冲液的配方如下：10～50mmol/L Tris-HCl，3～50mmol/L MgCl，50～100mmol/L KCl，10～100mmol/L DTT，pH值为7～9；

所述的突变型逆转录酶在体系中的浓度为1～100U/μL；

所述的dNTPs在体系中的浓度为100～600μmol/L；

所述的逆转录反应引物为Oligo(dT)₂₃VN、随机引物和基因特异性反转引物中的至少一种；

所述的Oligo(dT)₂₃VN在体系中的浓度为2～3mol/L；

所述的随机引物在体系中的浓度为2～3mg/L。

10.权利要求8或9中所述的逆转录反应试剂盒在逆转录RNA样本中的应用。