CN115261352B - 一种耐高温的突变型逆转录酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种耐高温的突变型逆转录酶及其制备方法，涉及基因工程技术领域。根据野生型鼠白血病逆转录酶的蛋白质结构特点，对特定活性位点进行定点突变，得到本申请的突变型逆转录酶。其中，该突变型逆转录酶核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。突变位点包括第66位、第69位、第197位、第288位、第291位、第292位、第302位、第313位、第326位、第334位、和第524位。该突变型逆转录酶具有良好的热稳定性，有助于提升cDNA的合成效率和合成质量，保真性高。此外，该逆转录酶抗干扰性强，具有良好的抑制剂耐受性，且能够应用于一步法RT‑PCR技术中。

Description

一种耐高温的突变型逆转录酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，且特别涉及一种耐高温的突变型逆转录酶及其制备方法。
背景技术
逆转录反应广泛应用于cDNA文库的克隆、相对定量RT-PCR、绝对定量qRT-PCR、基因表达分析等应用领域。逆转录酶(reverse transcriptase， RT，也称为反转录酶)是一种依赖RNA为模板的DNA聚合酶。目前，常用的逆转录酶主要有禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(Avian myeloblastosis virus reverse transcriptase,AMV RT)和莫洛尼鼠白血病毒(Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase,MMLV RT)，二者均具有DNA聚合酶活性和RNase H活性(核糖核酸酶H的活性，其为降解RNA/DNA杂交体的 RNA链的活性)。AMV RT热稳定性较好，但RNase H活性高，cDNA合成长度短，得率低；MMLV RT热稳定性差，但RNase H活性低，cDNA合成长度长，得率高。
在RNA逆转录合成cDNA的过程中，在低温时RNA会形成复杂的二级结构，这种二级结构对逆转录合成cDNA的效率影响较大。一般可以通过提高RNA逆转录反应温度将RNA二级结构的氢键打开，以提高逆转录的反应效率。但是，野生型MMLV RT酶适宜反应温度为37～42℃，过低或过高的反应温度均会使其反应效率显著下降或失去活性。此外，生物学样本中抑制剂，如血液中的血红素、痰液等，也会对逆转录酶的活性造成影响。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种突变型逆转录酶及其制备方法。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明的第一方面提供一种突变型逆转录酶，所述突变型逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二方面提供一种突变型逆转录酶，所述突变型逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第三方面提供一种突变型逆转录酶，包含野生型鼠白血病逆转录酶的氨基酸序列经过如下突变后的氨基酸序列：第66位的甲硫氨酸突变为赖氨酸，第69位的谷氨酸突变为甘氨酸，第197位的苏氨酸突变为缬氨酸，第288位的缬氨酸突变为精氨酸，第291位的谷氨酰胺突变为赖氨酸，第292位的脯氨酸突变为精氨酸，第302位的谷氨酸突变为赖氨酸，第313位的色氨酸突变为苯丙氨酸，第326位的脯氨酸突变为酪氨酸，第 334位的苯丙氨酸突变为丝氨酸，第524位的天冬氨酸突变为缬氨酸。
本发明的第四方面提供一种突变型逆转录酶核酸分子，包含编码如上任意一项所述的突变型逆转录酶的核苷酸序列。
本发明的第五方面提供一种重组表达载体，含有如上所述的突变型逆转录酶核酸分子。
本发明的第六方面提供一种重组宿主细胞，含有如上所述的重组表达载体。
本发明的第七方面提供一种突变型逆转录酶的制备方法，包括：
制备如上所述的重组表达载体；
将所述重组表达载体转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达；
对诱导表达后的所述宿主细胞进行收集、破碎和纯化后，得到所述突变型逆转录酶。
本发明的第八方面提供一种试剂盒，包括如上任意一项所述的突变型逆转录酶。
本发明的第九方面提供一种合成cDNA的方法，包括：获取模板RNA；使用如上任意一项所述的突变型逆转录酶合成与所述模板RNA互补的 cDNA。
在本发明的一个示例性实施例中，所述突变型逆转录酶的逆转录工作温度为60～64℃。
与现有技术相比，本发明的突变型逆转录酶及其制备方法的有益效果是：
本发明所提供的突变型逆转录酶根据野生型鼠白血病逆转录酶的蛋白质结构特点，对多个特定活性位点进行定点突变，得到本申请的突变型逆转录酶。该突变型逆转录酶具有良好的热稳定性，在高温条件下，更有利于打开RNA的二级结构，提升cDNA的合成效率和合成质量，从而进行高效的逆转录反应。在较高的反应温度下，有助于打开RNA二级结构，减少非特异性引物结合，降低错配率，从而有效提高逆转录酶的保真度。
此外，该逆转录酶同时具有良好的抑制剂耐受性，能够有效减少样本成分的干扰。由于该逆转录酶具有高逆转录活性和抑制剂耐受性，能够将其应用于一步法RT-PCR技术中。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明试验例1提供的不同逆转录温度下突变型M-MLV逆转录酶的△CT曲线图；
图2为本发明试验例1提供的不同逆转录温度下野生型M-MLV逆转录酶的△CT曲线图；
图3为本发明试验例4的PCR扩增曲线图；
图4为本发明试验例4的标准曲线图；和
图5为本发明试验例4的熔解曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本公开实施例的突变型逆转录酶及其制备方法进行具体说明。
除非特别定义，本公开所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。以下的文献中本领域中大部分专业名词的一般定义，本专利中所使用的专业名词与上述文献中对该专业名词描述一致。
名词“核苷酸”一般指的是一个核苷通过酯键与一个酸性分子或基团相连而形成的化合物，例如，核苷的磷酸酯，通常有一个、两个或三个磷酸基团共价连接在核苷的糖基团的5号位上。在一些情况下，核苷酸的定义还包括一些典型核苷酸的同系物或类似物。
名词“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使它的分子具有生化活性。如本公开所用“氨基酸”包括下列 20种天然氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、甘氨酸(Gly或G)、异亮氨酸(Ile或I)、天冬酰胺(Asn或N)、精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、半胱氨酸(Cys 或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、谷胺酰胺(Gln或Q)、组氨酸(His或H)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、缬氨酸(Val或V)和酪氨酸(Tyr或Y)。
名词“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，DNA-RNA 杂交体，寡聚核苷酸，适配体(aptamers)，肽核酸(PNAs)，PNA-DNA杂交体，PNA-RNA杂交体等等。包括一切线性形式(单链或双链)或分支状形式的共价相连的核苷酸。一个典型的核酸通常是单链或者双链的，并包含磷酸二脂键。
名词“野生型”指的是从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株(wild typestrain)，简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状(基因型)的菌株,称突变株(mutant，或突变体，突变型)。
名词“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，核酸序列基础扩增(NASBA)等。
名词“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。
名词“转化”指将编码基因导入到宿主细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到宿主细胞中。
本公开的实施例提供一种耐高温的突变型逆转录酶，所述突变型逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本公开的实施例中，提供一种耐高温的突变型逆转录酶，该突变型逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO:1如下：
ACGCTGAATATCGAGGACGAACACCGTCTGCACGAAACCAGCAA GGAGCCGGACGTTAGTCTGGGTAGCACGTGGCTGAGCGATTTTCCAC AAGCGTGGGCGGAAACCGGTGGTATGGGTCTCGCCGTTCGCCAAGCC CCACTCATTATCCCACTGAAAGCCACGAGCACGCCGGTGAGCATCAA GCAGTACCCGAAAAGCCAAGGCGCCCGCCTCGGCATTAAACCGCATA TTCAGCGTCTGCTGGACCAAGGCATTCTGGTGCCGTGCCAGAGTCCG TGGAATACGCCACTGCTCCCGGTTAAGAAGCCGGGCACCAACGATTAT CGCCCGGTTCAAGACCTCCGCGAAGTGAACAAGCGCGTGGAAGATAT CCATCCGACCGTGCCAAATCCGTACAATCTGCTGAGTGGCCTCCCGCC GAGTCATCAATGGTACACCGTGCTGGATCTCAAGGATGCGTTTTTCTG CCTCCGTCTGCATCCAACCAGCCAGCCACTCTTTGCGTTTGAGTGGCG CGACCCAGAAATGGGTATCAGCGGTCAACTGACGTGGACGCGTCTGC CGCAAGGCTTCAAAAACAGCCCGGTGCTGTTCGATGAGGCCCTCCAT CGCGATCTGGCGGATTTCCGTATCCAGCATCCAGATCTGATTCTGCTGC AGTACGTTGACGATCTGCTCCTCGCGGCCACCAGTGAACTGGATTGCC AGCAAGGTACCCGTGCGCTGCTGCAGACGCTGGGCAATCTGGGCTAC CGTGCCAGCGCGAAAAAGGCGCAAATCTGCCAGAAGCAAGTTAAGTA CCTCGGTTATCTGCTGAAAGAGGGTCAACGCTGGCTGACCGAGGCGC GTAAAGAGACCCGTATGGGTAAACGTACGCCAAAGACGCCACGCCA GCTCCGCAAATTTCTGGGTACCGCCGGCTTCTGTCGTCTGTTTATTCCG GGCTTCGCGGAAATGGCGGCGCCACTCTACTATCTGACCAAAACCGGT ACCCTCAGCAATTGGGGCCCAGATCAGCAGAAGGCCTACCAAGAAAT TAAACAAGCGCTGCTCACCGCGCCGGCCCTCGGTCTCCCAGATCTGA CCAAACCGTTTGAGCTGTTCGTGGACGAGAAGCAAGGCTACGCCAAA GGCGTGCTGACCCAGAAACTCGGTCCATGGCGTCGTCCGGTGGCCTA CCTCAGTAAGAAACTGGATCCAGTTGCGGCGGGTTGGCCGCCATGTC TCCGTATGGTGGCGGCGATTGCCGTTCTGACCAAAGACGCCGGCAAA CTCACCATGGGTCAGCCGCTGGTTATTCTCGCCCCACATGCGGTGGAA GCGCTGGTTAAACAACCGCCAGACCGCTGGCTGAGCAATGCCCGCAT GACCCATTATCAAGCGCTGCTGCTGGACACCGACCGCGTTCAGTTCGG TCCGGTGGTTGCGCTGAATCCAGCGACGCTGCTGCCGCTGCCAGAAG AAGGTCTGCAGCACAACTGTCTGGACATTCTGGCCGAGGCCCATGGC ACCCGTCCAGATCTCACCGATCAGCCACTGCCAGACGCCGATCATACG TGGTACACCGTGGGTAGTAGTCTGCTGCAAGAAGGTCAACGTAAAGC GGGTGCCGCGGTGACGACGGAAACCGAGGTGATCTGGGCCAAAGCG CTGCCAGCGGGTACCAGCGCGCAACGTGCGGAACTGATCGCGCTGAC CCAAGCGCTCAAAATGGCCGAGGGCAAGAAACTCAACGTGTACACC GACAGTCGCTACGCGTTTGCGACCGCGCACATCCACGGTGAGATTTAT CGCCGCCGTGGTCTGCTCACGAGCGAAGGTAAGGAGATCAAGAATAA GGACGAGATCCTCGCGCTGCTGAAAGCCCTCTTTCTGCCGAAACGTC TGAGCATCATCCATTGCCCGGGTCACCAGAAGGGCCACAGTGCGGAA GCGCGCGGTAATCGCATGGCCGATCAAGCCGCGCGCAAAGCGGCGATTACGGAAACCCCGGATACGAGCACGCTGCTG
其中，上述SEQ ID NO:1中，下划线所示的位置为突变后的位点。
本公开的实施例中，该突变型逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。
SEQ ID NO：2如下：
TLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQA PLIIPLKATSTPVSIKQYPKSQGARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPL LPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYT VLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSP VLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQ TLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETRMGKRTPKTPRQLRKFLGTAGFCRLFIPGFAEMAAPLYYLTKTGTLSNWGPDQQ KAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRR PVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHA VEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPE EGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTVGSSLLQEGQRKA GAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSR YAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPG HQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLL
可以理解，由于编码同一种氨基酸的密码子有多种，多肽的编码序列具有多态性及变异的特点。因此在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个碱基且能够编码得到具有本公开的突变型逆转录酶活性的衍生的蛋白，得到的蛋白与突变型逆转录酶没有明显的功能差异，或者在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有本公开的突变型逆转录酶活性的蛋白质，也包括在本发明的范围内。
在本公开的实施例中，该耐高温的逆转录酶包含野生型鼠白血病逆转录酶的氨基酸序列经过如下突变后的氨基酸序列：第66位的甲硫氨酸突变为赖氨酸(M66K)，第69位的谷氨酸突变为甘氨酸(E69G)，第197位的苏氨酸突变为缬氨酸(T197V)，第288位的缬氨酸突变为精氨酸(V288R)，第291位的谷氨酰胺突变为赖氨酸(Q291K)，第292位的脯氨酸突变为精氨酸(P292R)，第302位的谷氨酸突变为赖氨酸(E302K)，第313位的色氨酸突变为苯丙氨酸(W313F)，第326位的脯氨酸突变为酪氨酸(P326Y)，第334位的苯丙氨酸突变为丝氨酸(F334S)，第524位的天冬氨酸突变为缬氨酸(D524V)。
在本公开的具体实施方式中，本公开以野生型鼠白血病逆转录酶基因的质粒模板为起始，按照预先设计的点突变引物依次进行M66K、E69G、 T197V、V288R、Q291K、P292R、E302K、W313F、P326Y、F334S和D524V 的PCR突变。
在本公开的其他具体实施方式中，也可以使用常规的方法获得本公开的突变型逆转录酶的基因序列，例如全人工合成或者PCR合成。
本公开的实施例还提供上述耐高温的突变型逆转录酶的制备方法，包括：
S1，对含有野生型M-MLV基因序列的表达载体依次进行M66K、E69G、 T197V、V288R、Q291K、P292R、E302K、W313F、P326Y、F334S、D524V 定点突变，得到所述重组表达载体。
该步骤中，例如可以通过QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(Agilent)方法进行点突变扩增。该方法可以通过市售的定点突变试剂盒实现。
S2，将所述重组表达载体转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达。
宿主细胞例如可以为DH5a、TOP10、JM109、大肠杆菌感受态细胞BL21 等，本公开不进行具体的限定。诱导表达过程例如可以通过加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)等诱导剂诱导蛋白质表达。
S3，对诱导表达后的所述宿主细胞进行收集、破碎和纯化后，得到所述突变型逆转录酶。
具体地，收集诱导表达后的宿主细胞(例如菌液等)进行离心、超声破碎、过滤，然后通过层析法进行纯化，例如使用HisTrap纯化柱或Ni-亲和柱对产物进行纯化，得到所述突变型逆转录酶。
本公开的实施例提供一种试剂盒，包含上述的突变型逆转录酶。
需要说明的是，本公开的实施例中，试剂盒为至少包括一个设备的任何制品，设备例如为包装或容器。在本公开的一个实施例中，该试剂盒可以仅包含上述的突变型逆转录酶。
在本公开的其他实施例中，该试剂盒可用于实现逆转录反应。该试剂盒可以进一步包括：RNA提取试剂、逆转录反应液、dNTPs、水、逆转录引物中的一种或多种。其中，逆转录引物可以根据需要进行设计，例如可以为Oligo dT引物、随机引物或基因特异性引物。
进一步地，在该试剂盒中，该突变型逆转录酶可以以单一组分的形式存在。该突变型逆转录酶也可以是，加入到含有其他组分的反应体系中，以混合组分的形式存在，本公开不进行具体限定。
本公开的实施例提供一种合成cDNA的方法，包括：获取模板RNA；使用如上所述的突变型逆转录酶合成与所述模板RNA互补的cDNA。获得的cDNA可以进一步进行PCR扩增。
以下结合实施例对本公开的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
步骤一、野生型M-MLV的定点突变
基于野生型M-MLV序列进行M66K、E69G、T197V、V288R、Q291K、 P292R、E302K、W313F、P326Y、F334S、D524V定点突变，得到突变型逆转录酶的质粒。
步骤二、突变型逆转录酶的表达；
将突变型逆转录酶的质粒载体转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，取 100μL感受态细胞涂到含有相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，挑取单克隆菌接种于10mL含相应抗生素的LB液体培养液中37℃培养至OD值 0.4～0.8，然后进一步扩大培养至1000mL，当OD600(optical density at 600 nm)值在0.6～0.8之间，加入终浓度为0.8～1mM IPTG诱导蛋白质表达，继续培养4小时。
步骤三、逆转录酶纯化
(1)取培养好的菌液，5000rpm离心10～30min，离心菌体，加入20mL Bindingbuffer(50mM Tris，100～500mM NaCl，0～40mM咪唑，pH8.0)重悬菌体，重复超声4s，停6s，总共30min。
(2)对超声破碎的菌液在5000～11000rpm条件下离心30min，取上清液，进行0.45μm的微孔滤膜过滤。
(3)在AKTA纯化系统上，将过滤完的上清液用1mL或5mL HisTrap 纯化柱纯化，用Elution buffer(50mM Tris，100～500mM NaCl，250～500mM 咪唑)洗脱得到逆转录酶。再将纯化后的逆转录酶进一步用HiLoad 16/60 Superdex 200进行凝胶过滤层析，根据蛋白质大小进一步纯化。
(4)使用离心过滤装置对纯化后的蛋白进行浓缩。
(5)取5μL浓缩后的蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定蛋白质的大小和纯度。
为了明确实施例1获得的逆转录酶的特性，通过下述试验例对该突变型逆转录酶的热稳定性、抗干扰性以及在一步法RT-PCR中的应用进行验证。
试验例1
将本公开实施例1制备的突变型M-MLV逆转录酶与野生型M-MLV逆转录酶在同一实验条件下进行RT-PCR检测，选用新型冠状病毒的开放读码框1ab(open reading frame,ORF1ab)靶序列的RT-PCR反应体系。
其中，RT反应体系如表1所示。
表1
逆转录引物序列：5’-CCACATGGAAATGGCTTGAT-3’(SEQ ID NO： 3)
设置突变型M-MLV逆转录酶组(A组)和野生型M-MLV逆转录酶组 (B组)进行试验，其中A组中加入实施例1制备的突变型逆转录酶1U，B组中加入野生型M-MLV逆转录酶1U；且A组和B组各设置6个变量组 (序号分别为1～6)。
对于A组，按照下表2所示的逆转录反应程序进行逆转录反应。
表2
项目 1 2 3 4 5 6 时间 循环数
逆转录 58℃ 60℃ 62℃ 64℃ 66℃ 68℃ 10min 1
变性 92℃ 92℃ 92℃ 92℃ 92℃ 92℃ 2min 1
对于B组，按照下表3所示的逆转录反应程序进行逆转录反应。
表3
项目 1 2 3 4 5 6 时间 循环数
逆转录 38℃ 40℃ 42℃ 44℃ 46℃ 48℃ 10min 1
变性 92℃ 92℃ 92℃ 92℃ 92℃ 92℃ 2min 1
将表2和表3中各组逆转录后得到的cDNA作为模板用于下表4中的 PCR体系扩增。
表4
上游引物F(SEQ ID NO：4)：5’-TGCTAGTTGGGTGATGCGTA-3’；
下游引物R(SEQ ID NO：5)：5’-CCACATGGAAATGGCTTGAT-3’；
探针P(SEQ ID NO：6)：
FAM-5’-TGATGATGGTGCTAGGAGAGTGTGG-3’-BHQ1。
PCR扩增反应程序：第一阶段：95℃2分钟、1循环；第二阶段：95℃ 10秒、64℃60秒、信号采集、45循环。
当不同逆转录温度下得到的cDNA参与相同PCR体系扩增时，CT值可反应各组逆转录体系的逆转录效率。如下表5所示为不同逆转录反应温度下的突变型M-MLV逆转录酶(A组)的CT值和△CT值。
在荧光定量PCR中，C代表cycle，t代表threshold(荧光域值)，CT 值表示：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。CT 值越小，逆转录效果越好。△CT值表示不同逆转录温度下的CT值与该组中最小的CT之间的差值，例如：A组中，在逆转录温度为62℃时，CT值最小(23.11)，逆转度温度为58℃时的△CT(58℃)＝CT(58℃)-CT(62℃)＝26.78-23.11＝3.67。
表5
序号 1 2 3 4 5 6
逆转录温度 58℃ 60℃ 62℃ 64℃ 66℃ 68℃
CT值 26.78 23.87 23.11 23.21 25.45 26.89
△CT值 3.67 0.76 0 0.1 2.34 3.78
如表5所示，突变型M-MLV逆转录酶在温度62℃时CT值最小，逆转录效果最好。且在60～64℃温度时，△CT值均不超过1，该温度范围最适合进行逆转录反应。当逆转录温度越低或越高时逆转录效率有所下降。
如下表6所示为不同逆转录反应温度下的野生型逆转录酶(B组)的 CT值和△CT值。△CT值的计算方法参照A组的计算方法。
表6
序号 1 2 3 4 5 6
逆转录温度 38℃ 40℃ 42℃ 44℃ 46℃ 48℃
CT值 32.33 29.27 27.89 28.96 30.64 33.13
△CT值 4.44 1.38 0 1.07 2.75 5.24
如表6所示，野生型M-MLV逆转录酶在温度42℃时CT值最小，逆转录效果最好，但是比突变型M-MLV逆转录酶的逆转效率差(相差4.78个 CT值)，且当逆转录温度越低或越高时逆转录效率有所下降。
如图1所示为不同逆转录温度下突变型M-MLV逆转录酶的△CT曲线图，图2所示为不同逆转录温度下野生型M-MLV逆转录酶的△CT曲线图。从表5、表6和图1～2中可以看出，突变型M-MLV逆转录酶在较高的温度下(58～68℃)的CT值，仍然低于野生型M-MLV逆转录酶在较低(38～48℃) 温度下CT值。可见，本实施例1的突变型M-MLV逆转录酶具有更好的耐热性，且在60～64℃条件下具有良好的逆转录活性。
试验例2～3
对实施例1获得突变型M-MLV逆转录酶对抑制剂的耐受性进行验证。采用成分比较复杂、对PCR影响较大的痰液和全血进行验证。
试验例2和3分别设置突变型M-MLV逆转录酶试验组和野生型M-MLV 逆转录酶试验组，且试验过程参照试验例1中的逆转录体系和PCR体系，突变型M-MLV逆转录酶试验组在62℃条件下进行逆转录，野生型M-MLV 逆转录酶试验组在42℃条件下进行逆转录。
试验例2为痰液抑制剂验证，突变型M-MLV逆转录酶试验组和野生型 M-MLV逆转录酶试验组均采用试验例1中的逆转录体系，并在逆转录体系中分别加入体积比为0～15％的痰液，进行逆转录后，对逆转录后的cDNA 采用试验例1中的PCR反应体系进行扩增。验证结果对比如下表7所示。其中，表7中，△CT1～△CT5分别为加了不同体积比痰液的CT值和未加痰液的CT值之差。
表7
试验例3为全血抑制剂验证，突变型M-MLV逆转录酶试验组和野生型 M-MLV逆转录酶试验组均采用试验例1中的逆转录体系，并在逆转录体系中分别加入体积比为0～15％的全血，进行逆转录后，对逆转录后的cDNA 采用试验例1中的PCR反应体系进行扩增。验证结果对比如下表8所示。其中，表8中，△CT1～△CT5分别为加了不同体积比全血的CT值和未加全血的CT值之差。
表8
从表7和表8中可以看出，从痰液和全血抑制剂的验证结果来看，突变型M-MLV逆转录酶组，随着痰液和全血体积比的增大(0％至15％)，对逆转录的影响也有所增大，但是，CT差值能够控制在1.5以下；而野生型 M-MLV逆转录酶组，对逆转录的影响也随用量的增加不断增大，且CT变化幅度较大(1.93～7.11)，严重影响后续的目标物的检出。因此，使用本公开实施例1获得的突变型M-MLV逆转录酶进行逆转录能够有效提高对抑制剂的耐受性，合成更高质量的cDNA。
试验例4
对实施例1提供的突变型M-MLV逆转录酶进行一步法RT-PCR验证，其中，本试验例的体系参照试验例1中的PCR反应体系，不同之处在于，将表4中的各组cDNA模板替换为RNA模板，并且添加突变型M-MLV逆转录酶1U。
反应程序如下：
第一阶段：62℃、10分钟、1循环；
第二阶段：95℃、2分钟、1循环；
第三阶段：95℃、10秒、64℃、60秒、信号采集、45循环；
第四阶段：64℃至95℃，每增加1℃，采集荧光5秒、1个循环。
验证结果如图3～5所示，其中，图3为PCR扩增曲线图，如图4所示为标准曲线图，如图5所示为熔解曲线图。从图3～5中，可以看出，本公开实施例获得的突变型M-MLV逆转录酶参与的一步法RT-PCR可精准的检出单拷贝靶标，证明了该突变型M-MLV逆转录酶可用于一步法RT-PCR中。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
序列表
<110> 厦门通灵生物医药科技有限公司
<120> 一种耐高温的突变型逆转录酶及其制备方法
<130> LZXM22050503CN01
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2013
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
acgctgaata tcgaggacga acaccgtctg cacgaaacca gcaaggagcc ggacgttagt 60
ctgggtagca cgtggctgag cgattttcca caagcgtggg cggaaaccgg tggtatgggt 120
ctcgccgttc gccaagcccc actcattatc ccactgaaag ccacgagcac gccggtgagc 180
atcaagcagt acccgaaaag ccaaggcgcc cgcctcggca ttaaaccgca tattcagcgt 240
ctgctggacc aaggcattct ggtgccgtgc cagagtccgt ggaatacgcc actgctcccg 300
gttaagaagc cgggcaccaa cgattatcgc ccggttcaag acctccgcga agtgaacaag 360
cgcgtggaag atatccatcc gaccgtgcca aatccgtaca atctgctgag tggcctcccg 420
ccgagtcatc aatggtacac cgtgctggat ctcaaggatg cgtttttctg cctccgtctg 480
catccaacca gccagccact ctttgcgttt gagtggcgcg acccagaaat gggtatcagc 540
ggtcaactga cgtggacgcg tctgccgcaa ggcttcaaaa acagcccggt gctgttcgat 600
gaggccctcc atcgcgatct ggcggatttc cgtatccagc atccagatct gattctgctg 660
cagtacgttg acgatctgct cctcgcggcc accagtgaac tggattgcca gcaaggtacc 720
cgtgcgctgc tgcagacgct gggcaatctg ggctaccgtg ccagcgcgaa aaaggcgcaa 780
atctgccaga agcaagttaa gtacctcggt tatctgctga aagagggtca acgctggctg 840
accgaggcgc gtaaagagac ccgtatgggt aaacgtacgc caaagacgcc acgccagctc 900
cgcaaatttc tgggtaccgc cggcttctgt cgtctgttta ttccgggctt cgcggaaatg 960
gcggcgccac tctactatct gaccaaaacc ggtaccctca gcaattgggg cccagatcag 1020
cagaaggcct accaagaaat taaacaagcg ctgctcaccg cgccggccct cggtctccca 1080
gatctgacca aaccgtttga gctgttcgtg gacgagaagc aaggctacgc caaaggcgtg 1140
ctgacccaga aactcggtcc atggcgtcgt ccggtggcct acctcagtaa gaaactggat 1200
ccagttgcgg cgggttggcc gccatgtctc cgtatggtgg cggcgattgc cgttctgacc 1260
aaagacgccg gcaaactcac catgggtcag ccgctggtta ttctcgcccc acatgcggtg 1320
gaagcgctgg ttaaacaacc gccagaccgc tggctgagca atgcccgcat gacccattat 1380
caagcgctgc tgctggacac cgaccgcgtt cagttcggtc cggtggttgc gctgaatcca 1440
gcgacgctgc tgccgctgcc agaagaaggt ctgcagcaca actgtctgga cattctggcc 1500
gaggcccatg gcacccgtcc agatctcacc gatcagccac tgccagacgc cgatcatacg 1560
tggtacaccg tgggtagtag tctgctgcaa gaaggtcaac gtaaagcggg tgccgcggtg 1620
acgacggaaa ccgaggtgat ctgggccaaa gcgctgccag cgggtaccag cgcgcaacgt 1680
gcggaactga tcgcgctgac ccaagcgctc aaaatggccg agggcaagaa actcaacgtg 1740
tacaccgaca gtcgctacgc gtttgcgacc gcgcacatcc acggtgagat ttatcgccgc 1800
cgtggtctgc tcacgagcga aggtaaggag atcaagaata aggacgagat cctcgcgctg 1860
ctgaaagccc tctttctgcc gaaacgtctg agcatcatcc attgcccggg tcaccagaag 1920
ggccacagtg cggaagcgcg cggtaatcgc atggccgatc aagccgcgcg caaagcggcg 1980
attacggaaa ccccggatac gagcacgctg ctg 2013
<210> 2
<211> 671
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu
1 5 10 15
Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala
20 25 30
Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu
35 40 45
Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr
50 55 60
Pro Lys Ser Gln Gly Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg
65 70 75 80
Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr
85 90 95
Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val
100 105 110
Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr
115 120 125
Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln
130 135 140
Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu
145 150 155 160
His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu
165 170 175
Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe
180 185 190
Lys Asn Ser Pro Val Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala
195 200 205
Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp
210 215 220
Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr
225 230 235 240
Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala
245 250 255
Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu
260 265 270
Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Arg
275 280 285
Met Gly Lys Arg Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Lys Phe Leu
290 295 300
Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Phe Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met
305 310 315 320
Ala Ala Pro Leu Tyr Tyr Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Ser Asn Trp
325 330 335
Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu
340 345 350
Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu
355 360 365
Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys
370 375 380
Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp
385 390 395 400
Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile
405 410 415
Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu
420 425 430
Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro
435 440 445
Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu
450 455 460
Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro
465 470 475 480
Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu
485 490 495
Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln
500 505 510
Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Val Gly Ser Ser Leu
515 520 525
Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr
530 535 540
Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg
545 550 555 560
Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys
565 570 575
Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His
580 585 590
Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly
595 600 605
Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu
610 615 620
Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys
625 630 635 640
Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala
645 650 655
Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu
660 665 670
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ccacatggaa atggcttgat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
tgctagttgg gtgatgcgta 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
ccacatggaa atggcttgat 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
tgatgatggt gctaggagag tgtgg 25

Claims (9)

1.一种耐高温的突变型逆转录酶，其特征在于，所述突变型逆转录酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种耐高温的突变型逆转录酶，其特征在于，所述突变型逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种逆转录酶核酸分子，其特征在于，包含编码如权利要求1或2所述的突变型逆转录酶的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，含有如权利要求3所述的逆转录酶核酸分子。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，含有如权利要求4所述的重组表达载体。
6.一种突变型逆转录酶的制备方法，其特征在于，包括：
构建如权利要求4所述的重组表达载体；
将所述重组表达载体转化到宿主细胞中，并对转化后的所述宿主细胞进行诱导表达；
对诱导表达后的所述宿主细胞进行收集、破碎和纯化后，得到所述突变型逆转录酶。
7.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的突变型逆转录酶。
8.一种合成cDNA的方法，其特征在于，包括：
获取模板RNA；
使用如权利要求1或2所述的突变型逆转录酶合成与所述模板RNA互补的cDNA。
9.根据权利要求8所述的合成cDNA的方法，其特征在于，所述突变型逆转录酶的逆转录工作温度为60~64℃。
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Address before: 361000 Floor 3 and 4 of Building B10, Xiamen Biomedical Industrial Park, 2068 Wengjiao West Road, Haicang District, Xiamen City, Fujian Province

Patentee before: XIAMEN TALENT BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.

Country or region before: China