CN103348004A - 具有改善的热稳定性的逆转录酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有改善的热稳定性的逆转录酶，更确切来说，涉及通过用其它氨基酸置换选自于由下述氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而来的具有改善的热稳定性的逆转录酶：M-MLV来源的逆转录酶（由SEQ.ID.NO:1表示）中的第63位的谷氨酰胺（Q63）、第264位的赖氨酸（K264）、第295位的赖氨酸（K295）、第306位的苏氨酸（T306）、第346位的谷氨酸（E346）、第408位的脯氨酸（P408）、第438位的组氨酸（H438）以及第454位的天冬酰胺（N454）。相比于野生型逆转录酶，本发明的突变逆转录酶表现出出色的热稳定性。因此，即便是在有能在高温下形成稳定二级结构的RNA存在的情况下，也有利于以稳定的逆转录活性而获得目标cDNA。

Description

具有改善的热稳定性的逆转录酶
技术领域
本发明涉及逆转录酶，更确切来说涉及通过对组成传统逆转录酶的特定氨基酸残基进行突变而得的具有改善的热稳定性的逆转录酶。
背景技术
已经进行了很多关于RNA肿瘤病毒，尤其是莫洛尼鼠白血病病毒（Moloney-Murine Leukemia Virus，M-MLV）、人HIV、或禽类成髓细胞性白血病病毒（Avian Myeloblastosis Virus，AMV）来源的逆转录酶的研究，并因此已经公开了它们的功能和特性。逆转录酶由于其有助于通过使用RNA作为模板合成互补DNA（cDNA）这一独特特性，已被用于许多分子生物学方法，例如，cDNA文库构建、逆转录和聚合酶链式反应（PCR）等。
主要研究了逆转录病毒的逆转录酶的三种原型（prototype）。莫洛尼鼠白血病病毒来源的逆转录病毒包含78kDa的单个亚基，该亚基具有RNA依赖性的DNA聚合酶活性和RNase H活性。将所述酶克隆并在大肠杆菌（E.coli）中以真实的（authentic）活性形式表达。HIV来源的逆转录酶为p66亚基和p51亚基的异二聚体。p51亚基由对p66亚基进行蛋白水解裂解而生成。p66亚基既包含RNA依赖性的DNA聚合酶结构域、还包含RNase H结构域；但p51亚基仅包含DNA聚合酶结构域。将活性HIV来源的p66/p51逆转录酶克隆并在很多表达宿主（包括大肠杆菌）中表达。在HIV p66/p51异二聚体中，51kDa亚基为催化惰性的；而66kDa亚基显示出DNA聚合酶活性和RNase H活性。与此同时，禽类肉瘤-白血性增生病毒（Avian Sarcoma-Leukosis Virus，ASLV）逆转录酶如Rous肉瘤病毒（RSV）逆转录酶、禽类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶、禽类成红细胞增多症病毒（Avian Erythroblastosis Virus，AEV）辅助病毒（helper virus）MCAV逆转录酶、禽类骨髓细胞瘤病毒（AvianMyelocytomatosis Virus）MC29辅助病毒MCAV逆转录酶、禽类网状内皮组织增生病病毒（Avian Reticuloendotheliosis Virus，REV-T）辅助病毒REV-A逆转录酶、禽类肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV逆转录酶、禽类肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV逆转录酶、Rous相关病毒（RAV）逆转录酶以及成髓细胞性白血病相关病毒（Myeloblastosis Associated Virus，MAV）逆转录酶均为α亚基（约62kDa）和β亚基（约94kDa）两个亚基的异二聚体。α亚基由对β亚基进行蛋白水解裂解而生成。ASLV逆转录酶可存在α/β和β/β两种催化活性结构。由沉淀分析（sediment analysis）证实，所述α/β结构和β/β结构均为二聚体，并且此处的α以介于单体和二聚体的平衡状态存在。ASLVα/β逆转录酶或β/β逆转录酶是迄今为止已知的唯一一种具有三种不同活性（如DNA聚合酶活性、RNase H活性以及DNA核酸内切酶（整合酶）活性）的逆转录病毒逆转录酶。所述α结构既不具有整合酶结构域也无整合酶活性。
将mRNA通过逆转录酶介导的逆转录转变成cDNA在基因表达的研究中非常重要。然而，在许多方面不优选使用未转化的逆转录酶作为中介体（mediator）来进行逆转录。在第一链反应开始之前或当其结束时，逆转录酶有时会通过RNase H活性来降解RNA模板。由于mRNA模板的错误引发（mis-priming），在cDNA的第一链中也存在错误的机会。事实上，在cDNA合成期间，HIV逆转录酶出错多达每3,000-6,000个核苷酸发生1个核苷酸错误；而AMV逆转录酶每10,000个核苷酸发生1个核苷酸错误。
影响逆转录酶效果的另一因素为RNA能否形成二级结构。当RNA分子具有足够的互补性以形成双链RNA时，可形成此类二级结构。一般来说，可通过提高含RNA分子的溶液的温度来减少RNA二级结构的形成。因此，优选在高于37℃下进行RNA逆转录。在远高于37℃的温度下（例如，在50℃下）进行培养时，逆转录酶活性丧失。
现有技术中已报道了各种处理热稳定逆转录酶的方法，所述方法包括使用具有逆转录酶活性的热稳定DNA聚合酶的方法、通过在热稳定DNA聚合酶中诱导突变以增加逆转录酶活性的方法、在热不稳定逆转录酶中诱导突变的方法、在Taq/Tth DNA聚合酶存在的情况下使用Mn2+代替Mg2+的方法、以及将如海藻糖等此类添加剂与热不稳定逆转录酶一起使用的方法。
为了增加DNA或RNA模板聚合的保真度，本领域技术人员已经使用了各种酶组合物和方法。例如，Shevelev等提供了关于3’-5’核酸外切酶的综述文章（Shevelev等，Nature Rev.Mol.Cell Biol.3:364（2002））。Perrino等使用大肠杆菌DNA聚合酶III的υ（upsilon）亚基来增加小牛胸腺（calf thymus）DNA聚合酶α的保真度（Perrino等，PNAS USA，86:3085（1989））。Bakhanashvili阐明了p53蛋白的校正（proofreading）活性（Bakhanashvili，Eur.J.Biochem.268:2047（2001））；而Huang等描述了使用p53来增加DNA复制的保真度（Huang等，Oncogene，17:261（1998））。美国专利公开号2003/0198944A1和美国专利号6,518,19描述了含有一种或多种逆转录酶（各逆转录酶具有不同的转录终止位点）以及另外含有一种或多种DNA聚合酶（如果需要的话）的酶混合物。美国专利公开号2002/0119465A1描述了含有突变的热稳定DNA聚合酶和突变的逆转录酶（例如，突变的Taq DNA聚合酶和突变的MMLV-RT）的组合物。美国专利号6,485,917B1、美国专利公开号2003/0077762以及欧洲专利公开号EP1132470描述了在具有3’-5’核酸外切酶活性的α型DNA聚合酶和具有逆转录酶活性的酶存在的情况下进行cDNA合成的方法。
当除去逆转录酶的RNase H活性时，RNA模板的RNA降解问题可以排除，并可进一步改善逆转录效率。然而，此类逆转录酶（‘RNase H-’型）不能解决如下问题：错误引发和mRNA二级结构生成。传统的逆转录酶热稳定性低，因此仅在相对低的温度下诱发逆转录。因此，不能通过RNA的二级结构的中断（通常在高达至少65℃的高温下形成）来有效地获得逆转录产物。此类限制不仅对于由全长RNA合成cDNA是主要障碍，对于各种需要逆转录的生化实验（例如，RNA检测和分析（profiling））也是主要障碍。因此，高度需要开发即使在高温下也具有稳定逆转录活性的新型逆转录酶。
发明内容
技术问题
提供本发明以解决如上所述的传统逆转录酶的问题。因此，本发明的目的在于提供有效用于稳定生产cDNA的具有改善的热稳定性的逆转录酶，所述逆转录酶通过对M-MLV来源的逆转录酶的特定氨基酸残基进行突变而制备，从而得到甚至在高于使RNA结构改变的温度下仍出色的逆转录活性。
解决问题的技术方案
除非另有说明，在本发明中描述的术语和技术表示本领域技术人员所理解的一般意义。将为了阐释本发明而在本发明中描述的参考文献全部包含在说明书中。
在本发明中，术语“逆转录酶活性”或“逆转录”表示酶使用RNA作为模板合成DNA链（即，互补DNA或cDNA）的能力。在本发明中，“逆转录酶”为通过本说明书中描述的方法或本领域技术人员知晓的任何传统方法对酶活性进行测量时显示出逆转录酶活性的酶。
在本发明中，术语“逆转录活性”或“逆转录酶活性”可互换使用，表示酶使用RNA作为模板合成DNA链（即，cDNA）的能力。
在本发明中，术语“变异（variation）”或“突变”表示为改变由DNA编码的氨基酸序列而在野生型DNA序列中引入的变化。在本文中，包括置换、插入、缺失和点突变等，但不总是限于此。
在本发明中，术语“野生型”表示与从天然来源中分离的基因或基因产物具有相同特性的基因或基因产物。与之不同，术语“修饰的”或“突变的”表示显示出与野生型基因或基因产物相比而言改变的或不同的特性的基因或基因产物。
在本发明中，术语“表达载体”表示表达盒或含有所述表达盒的载体，在所述表达盒中，一种或多种转录调控区域可操作性地连接，必然包含编码序列和启动子。
在本发明中，术语“编码序列”表示编码特定氨基酸或功能RNA的DNA序列。
在本发明中，术语“启动子”表示促使编码序列转录成RNA的区域，尤其是聚合酶和转录因子与之结合的区域。
在本发明中，如表1所示，组成逆转录酶的氨基酸残基以3字母缩写或1字母缩写表示。
表1
丙氨酸 A Ala
半胱氨酸 C Cys
天冬氨酸 D Asp
谷氨酸 E Glu
苯丙氨酸 F Phe
甘氨酸 G Gly
组氨酸 H His
异亮氨酸 I Ile
赖氨酸 K Lys
亮氨酸 L Leu
甲硫氨酸 M Met
天冬酰胺 N Asn
脯氨酸 P Pro
谷氨酰胺 Q Gln
精氨酸 R Arg
丝氨酸 S Ser
苏氨酸 T Thr
硒代半胱氨酸 U Sec
缬氨酸 V Val
色氨酸 W Trp
酪氨酸 Y Tyr
具体实施方式
下文对本发明进行了详细描述。
本发明提供了具有改善的热稳定性的逆转录酶，所述逆转录酶通过用其它氨基酸残基置换选自于由下述氨基酸残基所组成的组中的一个或多个氨基酸残基而提供：M-MLV来源的逆转录酶（由SEQ.ID.NO:1表示）的氨基酸序列的第63位的谷氨酰胺（Q63）、第264位的赖氨酸（K264）、第295位的赖氨酸（K295）、第306位的苏氨酸（T306）、第346位的谷氨酸（E346）、第408位的脯氨酸（P408）、第438位的组氨酸（H438）以及第454位的天冬酰胺（N454）。
本文中氨基酸的置换包括选自于下列置换所组成的组中的一种或多种置换，但不总限于此：用亮氨酸置换第63位的谷氨酰胺（Q63L）、用亮氨酸置换第264位的赖氨酸（K264L）、用谷氨酰胺置换第295位的赖氨酸（K295Q）、用亮氨酸置换第306位的苏氨酸（T306L）、用甲硫氨酸置换第346位的谷氨酸（E346M）、用谷氨酸置换第408位的脯氨酸（P408E）、用酪氨酸置换第438位的组氨酸（H438Y）以及用苯丙氨酸置换第454位的天冬酰胺（N454F）（参见图1）。在本发明的优选实施方式中，证实了分别具有由SEQ.ID.NO:2-SEQ.ID.NO:9表示的氨基酸序列的8种突变逆转录酶的热稳定性，其中，所述8个氨基酸位点发生置换。即便在所述逆转录酶中至少2个氨基酸位点同时发生突变，只要其显示出在高温下的热稳定性，就可涵盖于本发明的精神和保护范围内。
在本发明的优选实施方式中，本发明的突变逆转录酶表现出高于野生型逆转录酶的热稳定性。在这些突变体中，K295Q、T306L以及P408E表现出出色的热稳定性（参见图6）。尤其是，显示出最高热稳定性的突变逆转录酶T306L在60℃、65℃以及70℃的温度下表现出比野生型M-MLV来源的逆转录酶更高的生产cDNA的热稳定性（参见图7）。
本领域技术人员充分了解的是，甚至是当被置换了一次的氨基酸再次被具有相似特性的另一氨基酸替换（即，保守氨基酸置换）时，仍能观察到相似的生理生化特性。氨基酸置换对各种氨基酸性能以及蛋白质结构和功能的作用已被本领域技术人员作为目标。
例如，可考虑氨基酸的亲水指数（hydropathic index）（Kyte&Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157:105-132）。氨基酸的相对亲水特性归因于生成的蛋白质的二级结构，所述相对亲水特性用于测定与其它分子的相互作用。各氨基酸所具有的亲水指数基于其疏水性特征和电荷特征（Kyte&Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157:105-132），所述亲水指数如下：异亮氨酸（+4.5）、缬氨酸（+4.2）、亮氨酸（+3.8）、苯丙氨酸（+2.8）、半胱氨酸/胱氨酸（+2.5）、甲硫氨酸（+1.9）、丙氨酸（+1.8）、甘氨酸（-0.4）、苏氨酸（-0.7）、丝氨酸（-0.8）、色氨酸（-0.9）、酪氨酸（-1.3）、脯氨酸（-1.6）、组氨酸（-3.2）、谷氨酸（-3.5）、谷氨酰胺（-3.5）、天冬氨酸（-3.5）、天冬酰胺（-3.5）、赖氨酸（-3.9）以及精氨酸（-4.5）。在保守置换中，优选使用亲水指数低于±2的氨基酸、更优选使用亲水指数低于±1的氨基酸、最优选使用亲水指数低于±0.5的氨基酸。
对于氨基酸置换，还可考虑氨基酸残基的亲水性（参见美国专利号4,554,101）。各氨基酸残基具有其自己的亲水性值（hydrophilicity value），所述亲水性值如下：精氨酸（+3.0）、赖氨酸（+3.0）、天冬氨酸（+3.0）、谷氨酸（+3.0）、丝氨酸（+0.3）、天冬酰胺（+0.2）、谷氨酰胺（+0.2）、甘氨酸（0）、苏氨酸（-0.4）、脯氨酸（-0.5±1）、丙氨酸（-0.5）、组氨酸（-0.5）、半胱氨酸（-1.0）、甲硫氨酸（-1.3）、缬氨酸（-1.5）、亮氨酸（-1.8）、异亮氨酸（-1.8）、酪氨酸（-2.3）、苯丙氨酸（-2.5）以及色氨酸（-3.4）。优选将氨基酸残基用具有相似亲水性的氨基酸残基替换，但不总限于此。
还可考虑氨基酸侧链的大小。例如，不优选用具有大侧链的氨基酸（例如色氨酸或酪氨酸）替换具有致密（densed）侧链的这类氨基酸（如甘氨酸或丝氨酸）。还可考虑各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的影响。通过从以前的研究中得到的经验，已公开并测定了氨基酸残基对蛋白质结构域二级结构（例如，α螺旋、β折叠或转角）的选择存在影响（Chou& Fasman，1974，Biochemistry，13:222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47:251-276；1979，Biophys.J.,26:367-384）。
基于广泛的实验研究和所述考虑事项，制出保守氨基酸置换表，该表对本领域技术人员来说是众所周知的。一些实例如下：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。其它实例如下：Ala(A)leu，ile，val；Arg(R)gln，asn，lys；Asn(N)his，asp，lys，arg，gln；Asp(D)asn，glu；Cys(C)ala，ser；Gln(Q)glu，asn；Glu(E)gln，asp；Gly(G)ala；His(H)asn，gln，lys，arg；Ile(I)val，met，ala，phe，leu；Leu(L)val，met，ala，phe，ile；Lys(K)gln，asn，arg；Met(M)phe，ile，leu；Phe(F)leu，val，ile，ala，tyr；Pro(P)ala；Ser(S)，thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe，tyr；Tyr(Y)trp，phe，thr，ser；Val(V)ile，leu，met，phe，ala。
对于氨基酸置换，还可考虑目标残基是位于蛋白质内部还是暴露至溶剂。如果所述残基处于内部，保守置换包括如下：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；以及Tyr和Trp。如果所述残基暴露于溶剂，保守置换包括如下：Asp和Asn；Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；以及Phe和Tyr。
在确定氨基酸置换前，优选考虑分子内或分子间结合，例如，相邻半胱氨酸残基间的二硫键、或带正电荷的残基（例如，His、Arg以及Lys）与带负电荷的残基（例如，Asp和Glu）之间的离子键（盐桥）。
本发明还提供了编码所述具有改善的热稳定性的逆转录酶的基因。
所述基因为编码突变逆转录酶的基因，所述突变逆转录酶具有选自于由如下氨基酸置换所组成的组中的一种或多种氨基酸置换：用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第63位的谷氨酰胺（Q63L）、用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第264位的赖氨酸（K264L）、用谷氨酰胺置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第295位的赖氨酸（K295Q）、用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第306位的苏氨酸（T306L）、用甲硫氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第346位的谷氨酸（E346M）、用谷氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第408位的脯氨酸（P408E）、用酪氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第438位的组氨酸（H438Y）、以及用苯丙氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第454位的天冬酰胺（N454F）。在本发明的优选实施方式中，本发明的基因优选为分别具有由SEQ.ID.NO:11-SEQ.ID.NO:18表示的核苷酸序列之一的基因，所述由SEQ.ID.NO:11-SEQ.ID.NO:18表示的核苷酸序列编码分别具有由SEQ.ID.NO:2-SEQ.ID.NO:9表示的氨基酸序列的8种突变逆转录酶，其中，所述8个氨基酸位点被置换。编码具有选自于由如下氨基酸置换所组成的组中的至少2种氨基酸置换的突变逆转录酶的任何随机基因均可涵盖于本发明的精神和保护范围内：M-MLV来源的逆转录酶（由SEQ.ID.NO:1表示）的第63位的谷氨酰胺（Q63）、第264位的赖氨酸（K264）、第295位的赖氨酸（K295）、第306位的苏氨酸（T306）、第346位的谷氨酸（E346）、第408位的脯氨酸（P408）、第438位的组氨酸（H438）以及第454位的天冬酰胺（N454）（参见图2-图5）。
除上文所述的基因外，与所述基因实际上相同或具有相同功能的多核苷酸可包含于本发明中。本文中的短语“实际上相同或具有相同功能”表示当将两种多核苷酸用常见的计算机算法或研究进行适当比对时，其表现出至少70%的同源性、优选至少80%的同源性、更优选至少90%的同源性、以及最优选至少95%的同源性。
本发明还提供了含有所述基因的表达载体。
用于构建本发明的表达载体的母载体不受限制，可使用用于原核生物或真核生物转化的任何传统载体。在本发明的优选实施方式中，通过向PET22b(+)（核外基因载体）插入由SEQ.ID.NO:11-SEQ.ID.NO:18表示的各突变基因来构建重组表达载体。
本发明还提供了由所述表达载体转化而得的转化子。
本发明的转化子可通过将所述表达载体插入随机的原核细胞或真核细胞中来容易地构建。向细胞中导入特定载体的方法是本领域技术人员所熟知的。脂质体方法是所述方法中的一个实例。在本发明的优选实施方式中，将导入有所述突变基因的PET22b(+)载体导入大肠杆菌DH5α中，使得转化子得以构建。
本发明还提供了用于逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含所述逆转录酶。
除所述逆转录酶外，本发明的用于逆转录的试剂盒可另外包含逆转录所需的任何传统组分，例如，特异性与目标基因或寡核苷酸结合以用于扩增的引物对、dNTP、以及反应缓冲液、以及DNA聚合酶（如果需要的话）。
有益效果
相比野生型逆转录酶，本发明的突变逆转录酶表现出了出色的热稳定性。因此，即便是在有能在高温下形成非常稳定的二级结构（其为高效逆转录的障碍）的特定RNA存在的情况下，用本发明的逆转录酶也能诱发稳定的逆转录活性以得到想要的cDNA。
附图说明
参考附图可以最好地理解本发明的优选实施方式的应用，其中：
图1为示出了本发明的突变逆转录酶中所突变的氨基酸的位点和种类的图。
图2-图5为示出了编码本发明的突变逆转录酶的基因中所突变的核苷酸的位点和序列的图。
图6为一组显示逆转录结果的电泳照片，所述逆转录通过使用野生型逆转录酶（SEQ.ID.NO:1）和本发明的突变逆转录酶（SEQ.ID.NO:2-SEQ.ID.NO:9）在42℃、50℃、60℃、65℃以及70℃下诱发。
图7为一组显示逆转录结果的电泳照片，所述逆转录通过使用野生型逆转录酶（SEQ.ID.NO:1）和本发明的T306L突变逆转录酶（SEQ.ID.NO:5）在37℃、42℃、50℃、60℃、65℃以及70℃下诱发。
实施例
如在下列实施例中所示，本发明的操作实施方式和目前优选的实施方式为说明性的。
然而，将理解的是，本发明技术人员在考虑到本公开的基础上，可以在本发明的精神和保护范围内做出修改和改进。
实施例1：编码突变逆转录酶的基因的构建
为了在具有由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列的M-MLV来源的逆转录酶中诱导突变，对编码所述M-MLV来源的逆转录酶的基因的核苷酸序列进行了置换。具体而言，构建了分别具有如下置换的8种突变逆转录酶：用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第63位的谷氨酰胺（Q63L）、用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第264位的赖氨酸（K264L）、用谷氨酰胺置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第295位的赖氨酸（K295Q）、用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第306位的苏氨酸（T306L）、用甲硫氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第346位的谷氨酸（E346M）、用谷氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第408位的脯氨酸（P408E）、用酪氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第438位的组氨酸（H438Y）、以及用苯丙氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的第454位的天冬酰胺（N454F）（参见图1）。为了做到这些，在由SEQ.ID.NO:10表示的基因中诱导突变，所述基因编码具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列的逆转录酶（参见图2～图5）。所述突变基因分别具有由SEQ.ID.NO:11-SEQ.ID.NO:18表示的核苷酸序列之一。所述突变基因的构建过程如下：
为了增加在大肠杆菌中的蛋白表达，对由SEQ.ID.NO:10表示的M-MLV逆转录酶的基因序列进行优化，以符合大肠杆菌的密码子使用，结果获得由SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列。基于优化后的核苷酸序列，合成野生型基因和K295Q突变基因。首先，为了获得由SEQ.ID.NO:19表示的野生型基因的核苷酸序列，设计出退火温度为约60℃（20-40碱基）的正义链和反义链。然后，合成设计出的寡核苷酸（Bioneer，Korea）。所合成的寡核苷酸分别具有由SEQ.ID.NO:20-SEQ.ID.NO:149表示的核苷酸序列。合成的寡核苷酸的连接由Kination-LCR（韩国专利申请号2008-0025050）通过在40℃和60℃下重复反应而引起，使得具有由SEQ.ID.NO:19表示的核苷酸序列的双链全基因得以合成。除了使用分别由SEQ.ID.NO:150和SEQ.ID.NO:151表示的核苷酸序列代替分别由SEQ.ID.NO:77和SEQ.ID.NO:78表示的核苷酸序列外，通过与上述所述相同的方式构建K295Q突变基因。将合成的基因在95℃下热处理5分钟，然后与由SEQ.ID.NO:152和SEQ.ID.NO:153表示的引物进行如下反应：在95℃下1分钟；在65℃下1分钟；以及在72℃下2分30秒。将这一反应循环重复30次并在72℃下引发额外的反应10分钟以扩增所述基因。将扩增的基因连接于pGEM-T easy载体（Promega，USA）中，所述载体用于转化大肠杆菌DH5α（RBC，USA）。结果获得大量的野生型和K295Q突变基因克隆。
通过使用合成的野生型基因作为模板由定点突变诱导突变，从而产生如下突变：Q63L、K264L、T306L、E346M、P408E、H438Y以及N454F。定点突变按照如下进行：首先，合成分别具有由SEQ.ID.NO:154-SEQ.ID.NO:167表示的核苷酸序列的寡核苷酸。将所述突变基因在95℃下热处理5分钟，然后与作为引物的合成的寡核苷酸和pfu DNA聚合酶进行如下反应：在95℃下1分钟；在65℃下1分钟；以及在72℃下5分30秒。将这一反应循环重复30次并在72℃下引发额外的反应10分钟以扩增所述基因。将扩增的突变基因产物通过Kination-self ligation进行自连接，用于转化大肠杆菌DH5α（RBC，USA）。结果，获得大量的Q63L、K264L、T306L、E346M、P408E、H438Y以及N454F突变基因的克隆。
实施例2：突变基因的转化
通过使用细胞核外基因载体PET22b(+)（NOVAGEN CO.）作为重组载体来对在实施例1中构建的8种突变逆转录酶基因进行克隆。为了做到这些，使用下列引物组对通过引入pGEM-T easy载体（Promega）而合成的突变基因（Q63L、K264L、T306L以及E346M）进行PCR。
正义链：5’-GCG CGC CAT ATG CTG AAC ATC GAA GAC GAA CACCGT CTG CAC GAA AC-3’（Nde I）（SEQ.ID.NO:168）
反义链：5’-GCG CGC GCG GCC GCT TAG ATC AGC AGG GTAGAG GTG TCC GGG GTT TC-3’（Not I）（SEQ.ID.NO:169）
还使用下列引物组对其它突变基因（K295Q、P408E、H438Y以及N454Y）进行PCR。
正义链：5’-GCG CGC CAT ATG CTG AAC ATC GAA GAC GAA CACCGT CTG CAC GAA AC-3’（Nde I）（SEQ.ID.NO:170）
反义链：5’-GCG CGC GCG GCC GCG ATC AGC AGG GTA GAGGTG TCC GGG GTT TC-3’（Not I）（SEQ.ID.NO:171）
所述细胞核外基因载体PET22b(+)和由PCR获得的各M-MLV逆转录酶基因片段用Nde I（5’末端）和Not I（3’末端）消化。使用凝胶回收试剂盒（BIONEER CO.）对消化的片段进行纯化。使用T4DNA连接酶（TAKARA CO.）将所述片段在16℃下反应2小时。然后，将各突变基因插入细胞核外基因载体PET22b(+)中。
用引入了所述突变基因的细胞核外基因载体PET22b(+)转化大肠杆菌DH5α，结果制备出重组宿主细胞。本文中的转化通过以下步骤进行：将在-70℃冷冻的DH5α宿主细胞解冻。将解冻的宿主细胞与1μg/μl DNA重组载体进行混合，将所述混合物静置于冰上30分钟，然后42℃热处理90秒。将热处理后的宿主细胞涂在含有氨苄青霉素（50mg/ml）的LB培养基平板上，然后在37℃下培养过夜。结果，获得克隆。通过使用包含下列核苷酸序列的引物组来对所获得的克隆各自的基因序列进行确证。将经确证的克隆的各质粒导入BL21(DE3)宿主细胞中以进行转化，然后获得表达菌株。
T7启动子正义链：5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’（SEQ.ID.NO:172）
T7终止子反义链：5’-GCT AGT TAT TGC TCA GCG G-3’（SEQ.ID.NO:173）。
实施例3：突变逆转录酶的表达
取由转化BL21(DE3)宿主细胞制得的表达菌株的单菌落，并将其转入15ml含有氨苄青霉素（50mg/ml）的LB（Luria-Bertani）培养基中，然后在37℃下培养过夜。结果获得种子细胞（seed cell）。将获得的种子细胞置于1L含有氨苄青霉素的LB培养基中，然后37℃培养2小时，向其中加入0.5mM IPTG（异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷）。再诱导表达2小时。将培养的细胞离心，结果得到沉淀。将所述沉淀保存于-50℃，直至对所述沉淀进行纯化。
实施例4：突变逆转录酶的纯化
将5g在实施例3中获得的冷冻细胞沉淀粉碎，然后在4℃下重悬于裂解缓冲液（25mM Tris-HCl（pH7.6）、1mM EDTA、10%（v/v）β-巯基乙醇、以及苯甲基磺酰氟（PMSF）20ml）中并伴随搅拌30分钟。然后通过使用Fisher超声波仪将所述细胞裂解。将细胞裂解物在4℃以11,000rpm离心1小时，弃去沉淀。在缓冲液（40mM Tris-HCl（pH7.6）、2mM EDTA、28.58mMβ-巯基乙醇、以及100mM KCl）中对剩下的清澈裂解物进行透析。
实施例5：突变逆转录酶的色谱分析
通过使用Amersham FPLC设备进行FPLC，以纯化突变的逆转录酶。此时，将Amersham XK16（1.6cm×30.0cm）用作第一柱。该柱中装有离子交换树脂柱色谱DEAE hyper-D（Pall Co.），将其用250ml含有1MKCl的柱缓冲液进行清洗。然后获得60ml用缓冲液平衡的柱床。以5ml/min的流速向所述柱中上载20ml的清澈细胞裂解物。在上载的裂解物中，收取未被柱吸附的裂解物，然后施加至下一柱中。对所获得的裂解物应用第二色谱。对柱Amersham XK16（1.6cm×30.0cm）进行清洗并平衡。该柱中装有亲和色谱肝素hyper-D（Pall Co.）。结果获得50ml的柱床。将所述柱床用缓冲液平衡。向所述柱中上载裂解物，然后用100‐150ml的0.2M‐0.6M KCl的线性盐梯度柱缓冲液进行洗脱。将洗脱出的裂解物施加至26X60S-200凝胶过滤柱（GE healthcare）。结果获得高纯度的逆转录酶。柱馏分（fraction）继续进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后进行考马斯亮蓝染色。从各馏分中取10μl，在各凝胶泳道上对其进行分析。收集具有类似野生型的分子量（74KDa）的蛋白。为了确保收集到的蛋白的稳定性，将所述蛋白在保藏溶液（conservative solution）（20mM Tris-HCl（pH7.6）、0.1mM EDTA、150mM NaCl、0.1%IGEPAL CA-630（聚乙氧基乙醇）、1mM DTT（二硫苏糖醇）、以及50%甘油）中进行透析，结果获得突变酶，并于-20℃保存。
实施例6：用突变逆转录酶进行的RT-PCR
进行RT-PCR以确证分离的突变逆转录酶的活性。用于RT-PCR的成分如下，并使用浓度为5ng/μl、500pg/μl、50pg/μl、以及5pg/μl的总RNA：
Figure BDA00003644793900141
对于对比实施例，将野生型逆转录酶用于在42℃、50℃、60℃、65℃、以及70℃（对于T306L，增加了在37℃下的反应）下进行的RT-PCR1小时。将生成的cDNA用于PCR。用于扩增的目标基因为GAPDH（500bp），并使用具有如下所示核苷酸序列的引物组：
正义链：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’（SEQ.ID.NO:174）
反义链：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAAGTTG-3’（SEQ.ID.NO:175）
使用具有以下组分的制剂：
PCR premix type（Bioneer）
正义引物：5pmol，1μl
反义引物：5pmol，1μl
DW13μl
cDNA5μl
PCR按照如下程序进行：95℃下30秒；57℃下30秒；以及72℃下30秒（30个循环）。将PCR产物继续进行琼脂糖凝胶电泳以确证所扩增的产物。
结果，本发明的野生型M-MLV来源的突变逆转录酶表现出比野生型逆转录酶更高的热稳定性。尤其是，K295Q、T306L以及P408E突变逆转录酶显示出了出色的热稳定性。野生型M-MLV逆转录酶在60℃下未显示出活性；而K295Q、T306L以及P408E突变逆转录酶在反应温度高达60℃时仍保持有逆转录活性（图6）。显示出最高热稳定性的T306L突变逆转录酶在37℃、42℃以及50℃时表现出与野生型M-MLV逆转录酶等同的热稳定性，但在60℃、65℃、以及70℃时显示出远高于野生型M-MLV逆转录酶的热稳定性。
本领域技术人员将会理解，为了实现与本发明相同的目的，可容易地将在以上描述中所公开的概念和具体实施方式用作基础来修改或设计出其它实施方式。本领域技术人员还将理解的是，此类等同实施方式并未背离在所附权利要求中请求保护的本发明的精神和范围。
Figure IDA00003644794500011
Figure IDA00003644794500021
Figure IDA00003644794500031
Figure IDA00003644794500051
Figure IDA00003644794500071
Figure IDA00003644794500081
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Figure IDA00003644794500531

Claims (11)

1.一种具有改善的热稳定性的逆转录酶，所述逆转录酶通过用其它氨基酸置换选自于由下述氨基酸所组成的组中的一个或多个氨基酸而提供：由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的氨基酸序列的第63位的谷氨酰胺（Q63）、第264位的赖氨酸（K264）、第295位的赖氨酸（K295）、第306位的苏氨酸（T306）、第346位的谷氨酸（E346）、第408位的脯氨酸（P408）、第438位的组氨酸（H438）以及第454位的天冬酰胺（N454）。
2.根据权利要求1所述的逆转录酶，其中，所述氨基酸的置换包括选自于由下列置换所组成的组中的一种或多种置换：用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第63位的谷氨酰胺（Q63L）、用亮氨酸置换第264位的赖氨酸（K264L）、用谷氨酰胺置换第295位的赖氨酸（K295Q）、用亮氨酸置换第306位的苏氨酸（T306L）、用甲硫氨酸置换第346位的谷氨酸（E346M）、用谷氨酸置换第408位的脯氨酸（P408E）、用酪氨酸置换第438位的组氨酸（H438Y）以及用苯丙氨酸置换第454位的天冬酰胺（N454F）。
3.根据权利要求2所述的逆转录酶，其中，所述逆转录酶具有选自于分别由SEQ.ID.NO:2-SEQ.ID.NO:9表示的氨基酸序列所组成的组中的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的逆转录酶，其中，相比于具有由SEQ.ID.NO:1表示的氨基酸序列的野生型M-MLV逆转录酶，所述逆转录酶在60℃-70℃的反应温度下表现出较高的逆转录活性。
5.一种编码权利要求1所述的具有改善的热稳定性的逆转录酶的基因。
6.根据权利要求5所述的编码所述逆转录酶的基因，其中，所述基因为编码如下突变逆转录酶的基因：
所述突变逆转录酶包含选自于如下氨基酸所组成的组中的一种或多种氨基酸的置换：由SEQ.ID.NO:1表示的M-MLV来源的逆转录酶的氨基酸序列的第63位的谷氨酰胺（Q63）、第264位的赖氨酸（K264）、第295位的赖氨酸（K295）、第306位的苏氨酸（T306）、第346位的谷氨酸（E346）、第408位的脯氨酸（P408）、第438位的组氨酸（H438）以及第454位的天冬酰胺（N454）。
7.根据权利要求6所述的编码所述逆转录酶的基因，其中，所述基因为编码如下突变逆转录酶的基因：
所述突变逆转录酶包含选自于由下列氨基酸置换所组成的组中的一种或多种氨基酸置换：用亮氨酸置换由SEQ.ID.NO:1表示的野生型逆转录酶的第63位的谷氨酰胺（Q63L）、用亮氨酸置换第264位的赖氨酸（K264L）、用谷氨酰胺置换第295位的赖氨酸（K295Q）、用亮氨酸置换第306位的苏氨酸（T306L）、用甲硫氨酸置换第346位的谷氨酸（E346M）、用谷氨酸置换第408位的脯氨酸（P408E）、用酪氨酸置换第438位的组氨酸（H438Y）以及用苯丙氨酸置换第454位的天冬酰胺（N454F）。
8.根据权利要求7所述的编码所述逆转录酶的基因，其中，所述基因具有选自于分别由SEQ.ID.NO:11-SEQ.ID.NO:18表示的核苷酸序列所组成的组中的核苷酸序列。
9.一种包含权利要求5所述的基因的表达载体。
10.一种用权利要求9所述的表达载体转化的转化子。
11.一种用于逆转录的试剂盒，所述试剂盒包含权利要求1所述的具有改善的热稳定性的逆转录酶。
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