CN112251423A

CN112251423A - 一种新型m-mlv逆转录酶体及其应用

Info

Publication number: CN112251423A
Application number: CN202011420850.9A
Authority: CN
Inventors: 高明; 严兵; 刘淑君; 庄志华; 王春香
Original assignee: Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co ltd; Beijing Jianwei Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co ltd; Beijing Jianwei Medical Laboratory Co ltd
Priority date: 2020-12-08
Filing date: 2020-12-08
Publication date: 2021-01-22
Anticipated expiration: 2040-12-08
Also published as: CN112251423B

Abstract

本发明涉及一种M‑MLV逆转录酶及其应用。本申请发明人设计得到本申请的新M‑MLV逆转录酶是一种具备较低RNase H活性、较高持续合成能力和较强抗抑制能力的新M‑MLV逆转录酶，其具有高持续合成能力和高耐热性。包含本发明M‑MLV逆转录酶的逆转录试剂体系能够兼容多种RNA样本类型，尤其适合于一步法RT‑PCR，具有广泛的应用前景和市场推广价值。

Description

一种新型M-MLV逆转录酶体及其应用

技术领域

本发明主要涉及生物技术领域，具体涉及一种高持续合成能力和高耐热性的MMLV逆转录酶及其应用。

背景技术

逆转录，又称为反转录，是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录。逆转录过程是病毒的复制形式之一，如RNA病毒中的逆转录病毒，DNA病毒中的嗜肝DNA病毒和花椰菜花叶病病毒的复制均需要经过逆转录，而逆转录过程需要由逆转录酶(reversetranscriptase)催化完成。逆转录酶为RNA依赖性DNA聚合酶，是上世纪70年代由威斯康星大学的Howard Temin领导的研究团队和麻省理工大学David Baltimore领导的团队各地独立发现的与RNA病毒（逆转录酶病毒）基因组复制相关的DNA聚合酶。如今人们已经在很多生物体内发现了逆转录酶，包括病毒、细菌和动植物。逆转录酶不仅在生物系统之中发挥功能作用，在生命科学研究和应用领域各个方面都起到了巨大的推动作用，目前已成为一种重要的工具酶。

由于逆转录可为PCR扩增和下游实验提供cDNA模板，因此它是分子生物学实验成功的关键步骤之一。特别是在医学领域，逆转录结合PCR或定量PCR，又称逆转录PCR (RT-PCR/ RT-qPCR)，使RNA检测灵敏度提高了几个数量级，甚至可以检测出基因表达水平超低的RNA，从而为分子诊断应用之中的游离RNA、RNA病毒及癌变基因检测开辟了道路。

逆转录酶是包括RNA和DNA依赖性的DNA聚合活性、催化RNA-DNA杂合链中RNA裂解的RNase H活性的一种具有三种酶活性的多功能酶。而M-MLV和AMV是两种最常用的逆转录酶，M-MLV为来自鼠白血病逆转录酶，被广泛用于许多研究应用中，包括cDNA克隆、逆转录酶-PCR定量、微阵列分析、RACE等。由于逆转录酶的RNase H活性，RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解；此外，RNase H活性可能会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争，降低逆转录效率，因此为了更好地合成cDNA ，RNase H活性是长片段cDNA合成过程中需要规避的因素。已有研究表明，通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变使RNase H活性降低甚至完全消除，可以增加逆转率效率，促进长链cDNA的合成，提高其产量。

逆转录酶的合成能力是指结合到酶的单一结合位点中的核苷酸数目。合成能力高的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链。逆转录酶的合成能力与其对RNA模板的亲和力有关，具有高合成能力的逆转录酶对可能来源于RNA的常见抑制剂具有抗性。逆转录酶的抑制剂包括来自血液和粪便的肝素和胆汁盐，来自土壤和植物的腐殖酸和多酚，以及来自福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）样品的福尔马林和石蜡。这些样本中的抑制剂通常与RNA竞争性结合，间接降低逆转录酶的合成活性。而具备高合成能力的逆转录酶能够更好地克服这种抑制，在面对低质量和低丰度的RNA样品时，高合成能力的逆转录酶仍然表现更好。

除了RNase H活性和合成能力的影响，逆转录酶耐受高温的能力也是cDNA合成的重要影响因素。逆转录过程中采用较高的反应温度，有助于使具有坚固二级结构和/或高GC含量的RNA变性，使得逆转录酶能够读取序列，因此在较高反映温度下的逆转录能够实现全长cDNA合成，产量更高，进而使RNA能够更好地逆转录为cDNA。此外，采用基因特异引物进行逆转录时，较高温度下的逆转录，能够增强引物与目标基因RNA结合的特异性，进而在随后的PCR中增加产量和降低背景干扰。因此，使用热稳定性的逆转录酶更有利于cDNA合成及后续RT-PCR检测。

目前，分子生物学中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。 AMV逆转录酶是实验室中首批用于cDNA合成的酶之一。AMV逆转录酶具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，因此通常产生较短的cDNA片段（<5 kb）。而MMLV逆转录酶是一种分子量为75 kDa的单体结构酶，在应用中更易于进行更简单的克隆和修饰，其反应温度约为37°C。虽然MMLV的热稳定性低于AMV逆转录酶，但其RNA酶H活性较低，因此具有更高的长cDNA（<7kb）合成效率。近些年，为了进一步改善cDNA合成，已经研究设计得到了多种改良的MMLV逆转录酶，改良后的MMLV逆转录酶具有更低的RNase H活性（RNase H–）、更高的热稳定性（高达55℃）和更强的持续合成能力（65倍以上），这些属性可增加cDNA长度和产量，提高灵敏性，改善抑制剂耐受性，并缩短反应时间，因此MMLV逆转录酶目前被广泛用于cDNA合成、制作cDNA探针、测序和RNA的逆转录反应。

而目前逆转录酶应用最广的RT-PCR方法包括一步法和两步法两种方法。两步法RT-PCR包含两个独立反应，首先进行第一链cDNA合成（RT），然后在单个反应管中通过PCR扩增第一步骤中所得cDNA。因此，两步法RT-PCR可用于检测单个RNA样本中的多个基因。而一步法RT-PCR是指在单个反应管中将第一链cDNA合成（逆转录过程）和后续PCR反应结合在一起。一步法RT-PCR简化了大量样本的处理流程，实现工作流程更快速、更简单，需要的移液步骤更少，这样可以最大程度地减少污染，提升数据可重复性，适用于高通量检测应用，是目前研究和应用的热点。

目前逆转录试剂的最主要产品为invitrogen的SuperScript系列产品，几乎垄断了国内主要的科研和诊断试剂市场，但是进口试剂价格贵，成本问题成为国内很多实验室在选择检测原料试剂的重要因素。近年来，随着分子生物学的发展，国内各个厂家也纷纷推出自己的逆转录试剂，但是目前大部分国内试剂只能满足两步法RT-PCR，能同时满足两步法RT-PCR和一步法RT-PCR，并可以同时兼容RNA粗提物或RNA病毒裂解液的逆转录试剂目前还比较缺乏。在目前新冠疫情全球大爆发的当下，亟需一种成本低、兼容性好的逆转录试剂用于各种RNA检测试剂盒的高效逆转录，为RNA病毒检测市场提供有力的物质支撑。

发明内容

本发明的一方面目的在于针对现有技术中的不足，提供一种具备较低RNase H活性、较高持续合成能力和较强抗抑制能力的新M-MLV逆转录酶。

在以往的逆转录酶研究中，通过定点诱变和随机诱变已鉴定出各种增强催化活性或热稳定性的M-MLV逆转录酶突变，如果这些突变的作用是累加的，则具有多个突变的变体逆转录酶将具有更理想的特性。但是，通常情况下酶的活性和稳定性之间存在一个平衡，即增加酶活性的突变可能会降低蛋白质的稳定性，而增加蛋白稳定性的突变可能会降低酶的活性。因此，本发明中我们融合了多个突变变体结构特点，并设计得到一种全新的SuperRT逆转录酶。

本发明的SuperRT逆转录酶序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的SuperRT逆转录酶的RNase H活性缺失，减少了逆转录反应中RNA的降解，并且酶的合成活性和热稳定性达到一个比较好的平衡。本发明的SuperRT逆转录酶具有高持续合成能力，可对极少量RNA模板进行良好的逆转录反应；抗抑制能力强，可确保即使存在常见的抑制剂如胍盐、肝素和盐的情况下，cDNA也能合成；生成完整cDNA所需时间更短，可在10分钟甚至更短时间内完成cDNA合成。

本发明进一步提供一种所述SuperRT逆转录酶的表达纯化方法，所述方法具体包括如下步骤：

（1）质粒构建：构建所述Super RT的表达质粒pET-SRT His，使用引物5'-ATATACATATGCTAAAT ATAGAAGATGAG-3'和5'- ATATCCTCGAGTATGAGGAGGGTAGA -3'从基因合成的模板中扩增出编码SEQ ID NO.1所示的SuperRT逆转录酶的2035bp DNA片段。扩增的DNA用NdeI和XhoI消化，并插入质粒pET-22b（+）中。

（2）重组表达菌株构建：将构建的载体质粒与大肠杆菌感受态细胞Rosetta (DE3)混合，冰浴30min，42℃热激60秒，涂Kana平板，37℃过夜培养；挑取平板单克隆菌，接种到200ml LB中，37℃培养过夜（约16小时）；

（3）蛋白表达过程：按1:100比例将菌种液转接到600ml LB/瓶，37℃培养至OD值约1.0，调温度至16℃，待温度完全稳定后，每瓶LB培养基中加终浓度0.5mM IPTG，诱导过夜，约16小时，诱导完成后，于6℃ 条件下8500rpm离心6min，收集菌体；

（4）蛋白提取纯化过程：按1:25加裂解液（含0.02M Tris-HCl（pH 7.5），2.0mM二硫苏糖醇（DTT），10mM苯基甲基磺酰基氟的10％甘油）约400ml，混合均匀后1000Pa高压匀浆破碎15min（冷冻水循环降温，防止温度过高变性蛋白），破碎完成后的溶液在4℃条件下9500rpm离心30min，取上清，并用镍亲和树脂纯化或CM交换树脂纯化，纯化后溶液加100％甘油等体积混合均匀，并保存在-20°C。

进一步的，本发明提供一种兼容性好的逆转录反应缓冲液，所述反应缓冲液主要包括：50-300mM Tirs-HCl，50-200mM (NH₄)₂SO₄，2-10mM MgCl₂，0.5-1mM dNTPs，0.1-2.5µMOligod(T)₂₀/随机引物，1-5mM DTT。优选地，所述反应缓冲液的组成成分为：150mM Tirs-HCl， 50mM (NH₄)₂SO₄，6mM MgCl₂，0.5 mM dNTPs，2.5µM Oligod(T)₂₀/随机引物，2mM DTT。

本发明的反应缓冲液可维持反应的最佳pH和离子强度，并含有提高逆转录效率和后续PCR反应效率的添加剂。其中Tirs-HCl可以提供pH6.0-9.0稳定的缓冲环境；(NH₄)₂SO₄属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，能形成高盐环境，在反应过程中最大程度的保护酶活性；MgCl₂能增加逆转录酶和DNA聚合酶的活性；dNTPs通常为0.5-1 mM，最好为等摩尔浓度，推荐使用新鲜稀释的高品质dNTP，以确保良好的逆转录； DTT为一种还原剂，通常用于提供最佳的酶活性。

此外，本发明进一步提供一种优化的RNA病毒的RT-PCR检测方法，具体方法包括：

（1）RNA样本提取：

粗处理的RNA样本：采用病毒保存液（康为世纪，货号CWY078）来处理咽拭子样本，具体操作为用咽拭子采集样本后，将拭子头浸入500μl 的病毒保存液中，震荡混匀备用；

提取的RNA样本：待测样本提取采用商品化的病毒RNA提取试剂盒。

（2）反应体系配制：

注意：RNA检测用的引物/探针浓度请以终浓度0.1-1.0 μM作为设定范围的参考，扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。

（3）RT-PCR扩增

将配制好的反应体系放置在PCR仪中，按如下程序进行扩增反应：

本发明采用的Super RT逆转录酶为改良的M-MLV逆转录酶，具有高持续合成能力和高耐热性，生成完整cDNA所需时间更短，可在1-10分钟内完成cDNA合成。本发明提供的逆转录试剂体系能够兼容多种RNA样本类型，包括正常提取的RNA、RNA粗提物或RNA病毒保存液等；该逆转录体系抗抑制能力强，可确保即使存在常见的抑制剂如胍盐、肝素和盐的情况下，cDNA也能合成，并可对最棘手的RNA模板进行反转录，包括低丰度RNA、降解的RNA和具高GC或特殊二级结构的RNA。

本发明的试剂盒尤其适用于一步法RT-PCR，逆转录和后续PCR反应在同一反应体系中进行，反应过程中无需添加试剂，无需打开管盖，在避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率，而且成本低，能满足分子生物学多领域研究和应用中对cDNA总量和质量的需求，具有广泛的应用前景和市场推广价值。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是SuperRT逆转录酶凝胶电泳检测图：泳道 1-4为第一批纯化后的本申请SuperRT逆转录酶分别稀释4、8、16、32倍；泳道 5为第二批纯化后的SuperRT逆转录酶稀释8倍；泳道6为外购superscrip III M-MLV（invitrogen）；

图2是纯化的SuperRT逆转录酶RT-PCR检测结果曲线；

图3是本申请SuperRT与SuperScript™ IV对禽IBV-RNA病毒的RT-PCR检测结果曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：SuperRT逆转录酶克隆、表达纯化与检测

所有DNA操作均使用标准技术进行，特别是使用PCR的克隆，基于PCR的诱变程序以及标准限制性酶切和连接。所有蛋白均在大肠杆菌中表达，Ni-NTA树脂购自Qiagen，CM树脂购自QE公司。本发明SuperRT逆转录酶序列如SEQ ID No.1所示，通过将其克隆至修饰的pET21 +质粒构建重组表达质粒，并转化宿主菌，对宿主菌培养后进行纯化鉴定和保存；具体方法如下：

（1）质粒构建：构建所述Super RT的表达质粒pET-SRTHis，使用引物5'-ATATACATATGCTAAAT ATAGAAGATGAG-3'和5'- ATATCCTCGAGTATGAGGAGGGTAGA -3'从基因合成的模板中扩增出编码SEQ ID NO.1所示的SuperRT逆转录酶的2035bp DNA片段；扩增得到的DNA用NdeI和XhoI消化，并插入质粒pET-22b（+）中。

（2）重组表达菌株构建：将构建的重组质粒与大肠杆菌感受态细胞Rosetta (DE3)混合，冰浴30min，42℃热激60秒，涂Kana平板，37℃过夜培养；挑取平板单克隆菌，接种到200ml LB中，37℃培养过夜（约16小时）得表达菌液；

（3）蛋白表达与收集：按1:100比例将表达菌液转接到600ml LB/瓶，37℃培养至OD值约1.0，调温度至16℃，待温度完全稳定后，每瓶LB培养基中加终浓度0.5mM IPTG，诱导过夜，约16小时，诱导完成后，于6℃ 条件下8500rpm离心6min，收集菌体；

（4）蛋白提取纯化过程：按1:25的比例加裂解液（含0.02M Tris-HCl（pH 7.5），2.0mM二硫苏糖醇（DTT），10mM苯基甲基磺酰基氟的10％甘油），混合均匀后1000Pa高压匀浆破碎15min（冷冻水循环降温，防止温度过高变性蛋白），破碎完成后的溶液在4℃条件下9500rpm离心30min，取上清，先用镍亲和树脂纯化，然后用CM交换树脂纯化，纯化后溶液加等体积甘油混合均匀，并保存在-20°C。

通过SDS凝胶电泳对纯化后的SuperRT逆转录酶进行表征：在还原条件下，在12％聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）；通过在100°C下用2.5％的2-巯基乙醇处理10分钟来还原蛋白质，然后将其施加到凝胶上；施加40mA的恒定电流40分钟；电泳后，蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色。分子量标记试剂盒，包括猪肌球蛋白（200kDa），大肠杆菌β-半乳糖苷酶（116 kDa），兔肌肉磷酸化酶B（97.2kDa），牛血清白蛋白（66.4kDa），鸡蛋清卵白蛋白（44.3kDa）和牛碳酸酐酶（29.0kDa）是Takara Bio Inc（日本大津市）的产品；检测电泳图如图1所示。

如图1所示，不同批次及稀释度的纯化后的SuperRT逆转录酶均具有与superscripIII相同的分子量，表示纯化得到的即为所述SuperRT逆转录酶。

实施例2：纯化后的SuperRT逆转录酶反转录性能检测

以提取好的人总RNA为模板，检测纯化蛋白的逆转录性能。人RNA模板RT反转录成cDNA后，使用指示序列的引物ACTB引物配置PCR反应。具体实验操作如下：

配制cDNA第一链合成反应液，每个反应包括7 μl无核酸酶水，Super RT反应缓冲液，4μl 2.5mM dNTP，2 μl随机引物，1μl待检测SuperRT或外购superscrip III；将配制好的cDNA第一链合成反应液混匀，瞬时离心，分装入各PCR反应管中，每管18μl；向上述每个反应管中分别加入2μl 人RNA模板，混匀，放入PCR仪50℃反应10min，85℃ 5min中止反转录反应。

配制PCR反应体系，每个反应包括7 μl无菌超纯水，10 μl UltraSYBR Mixture（康为世纪，CW0957），1 μl 10μM的ACTB引物（βactin-F：GCGCCGTTCCGAAAGTT，βactin-R：CGGCGGATCGGCAAA）；将配制好的PCR预混液混匀，瞬时离心，分装入96孔PCR板中，每孔18μl；向每个反应管中分别加入2 μl上一步合成好的cDNA模板，在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行核酸检测，反应条件如下： 95℃ 10 min，95 ℃ 15 s, 60℃ 1min ，40个循环，SYBR Green通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cyclingthreshold，CT）进行计算。

结果如图2所示，批次一生产的纯化SuperRT逆转录酶稀释2倍、4倍、32倍的反转录cDNA模板的扩增Ct值依次为22.36、21.55和18.95，批次二生产的纯化SuperRT逆转录酶稀释2倍、4倍的反转录cDNA为模板扩增Ct值依次为23.23、19.49，外购superscrip III反转录cDNA为模板的Ct值为20.33。由此可见，本申请的SuperRT逆转录酶逆转录效果明显优于外购superscrip III逆转录酶，稀释到4倍时，逆转录效果与外购superscrip III基本相当。

实施例3：用SuperRT逆转录反应体系检测禽IBV病毒

使用本发明提供的SuperRT逆转录试剂和反应体系，对2个禽IBV冠状病毒样本（RNA病毒，由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，属于弱毒株，对人不具有感染性与致病性）进行检测，具体包括以下步骤：

1.RNA样本准备

1.1粗处理RNA样本：采用康为世纪生物科技有限公司的病毒保存液（CWY078）分别稀释2个禽IBV病毒原液成10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7和10^-8稀释梯度，即为粗处理RNA样本，进行后续RT-PCR检测操作。

1.2提取RNA样本：取2个禽IBV病毒原液进行RNA提取，推荐使用康为世纪生物科技有限公司病毒核酸提取试剂盒CWY071，按说明书要求步骤进行操作。提取后的RNA分别进行10^-3, 10^-4, 10^-5, 10^-6, 10^-7和10^-8梯度稀释，然后进行本实施例后续RT-PCR检测操作。

2.反应体系配制

将样本RNA模板、RNA病毒检测引物、Super RT反应缓冲液和Super RT酶混合液置于冰上备用，按下表配制反应体系：

3.RT-PCR检测

在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行IBV核酸检测，反应条件如下：50 ℃ 10 min，95℃ 1 min，94 ℃ 15 s，60℃ 30 s，40 个循环，FAM通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，CT）进行计算。

采用Invitrogen商品化的逆转录试剂盒SuperScript™ IV One-Step RT-PCRSystem对本实施例中的禽IBV病毒梯度稀释样本进行RT-PCR检测，作为对照组，具体RT-PCR操作参照SuperScript™ IV One-Step RT-PCR System试剂说明书中操作指南进行，按下表配制反应体系：

在ABI7500（美国Thermofisher公司）型荧光定量PCR仪上进行IBV核酸检测，反应条件如下：50 ℃ 10 min，98℃ 2 min，98℃ 10 s，58℃10 s，72℃ 10 s，40 个循环，FAM通道。所有检测均进行 3 次重复，取平均循环阈值（cycling threshold，CT）进行计算。

4.结果分析

表1. SuperRT与SuperScript™ IV对禽IBV-RNA病毒的RT-PCR检测比较

本实施例检测结果如表1和图3所示，对于用CWY078病毒保存液粗裂解的禽IBV样本，本申请SuperRT与SuperScript™ IV的检出限分别为10^-7稀释梯度与10^-6稀释梯度，相差一个数量级（表1，图3A-3D）;进一步看，与 SuperScript™ IV相比，本申请SuperRT在10^-3至10^-6各个稀释梯度的检测信号起峰明显更早，Ct值相差1-3个循环，差异明显（图3A-3D，表1，p <0.05），说明与SuperScript™ IV相比，本发明专利提供的SuperRT逆转录酶对CWY078病毒保存液粗裂解的禽IBV-RNA样本检测效果更好，对病毒保存液粗裂解样本的兼容性更优。

SuperRT逆转录试剂盒与SuperScript™ IV One-Step RT-PCR System对正常提取的禽IBV- RNA核酸总体检测效果基本相当，检出限都为10^-7稀释梯度，对RNA各个稀释梯度的Ct值也未见明显差异（表1，p > 0.05，图3E-3G）。

实施例4：SuperRT逆转录酶活力比较

对本申请制备的SuperRT逆转录酶和野生型逆转录酶的酶活力进行比较分析；参照上述实施例3的方式，对上述两种酶进行相同样本的检测。结果如表2所示，对病毒保存液粗裂解RNA样本，SuperRT逆转录酶的逆转录效果明显优于野生型逆转录酶。

表2. 逆转录酶活力比较

综合以上结果我们得出，SuperRT逆转录试剂盒检测效果明显优于Invitrogen商品化的逆转录试剂盒SuperScript™ IV One-Step RT-PCR System，可以作为进口试剂的有效替代产品应用于RNA病毒检测，尤其对采用本公司CWY078病毒保存液粗裂解的RNA病毒样本的逆转录检测方面，SuperRT逆转录试剂盒具有更优的表现，对不经提取的粗裂解病毒RNA样本兼容性更好，能更好地应用于大量RNA病毒样本的快速筛查检测中，为疫情的防控防治提供有力的物质支撑。

序列表

<110> 北京健为医学检验实验室有限公司

江苏康为世纪生物科技股份有限公司

<120> 一种新型M-MLV逆转录酶体及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 678

<212> PRT

<213> 逆转录酶(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu

1 5 10 15

Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Phe Pro Ser Asp Phe Pro Gln Ala

20 25 30

Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu

35 40 45

Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr

50 55 60

Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg

65 70 75 80

Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val

100 105 110

Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr

115 120 125

Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln

130 135 140

Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu

145 150 155 160

His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe

180 185 190

Lys Asn Ser Pro Thr Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala

195 200 205

Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Leu

225 230 235 240

Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala

245 250 255

Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Arg Thr Val

275 280 285

Met Thr Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Lys Phe Leu

290 295 300

Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met

305 310 315 320

Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp

325 330 335

Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu

340 345 350

Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu

355 360 365

Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys

370 375 380

Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp

385 390 395 400

Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile

405 410 415

Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Ala Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu

420 425 430

Val Ile Arg Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro

435 440 445

Asp Arg Trp Leu Ser Phe Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu

450 455 460

Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro

465 470 475 480

Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu

485 490 495

Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln

500 505 510

Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Ala Gly Ser Ser Leu

515 520 525

Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr

530 535 540

Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg

545 550 555 560

Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly Lys

565 570 575

Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His

580 585 590

Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly

595 600 605

Lys Glu Ala Leu Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu

610 615 620

Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys

625 630 635 640

Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala

645 650 655

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile

660 665 670

His His His His His His

675

Claims

1.一种新的M-MLV逆转录酶，其特征在于，所述逆转录酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种编码M-MLV逆转录酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序编码的逆转录酶序列如SEQ ID No.1所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的编码序列。

4.一种重组宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种包含M-MLV逆转录酶的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中保护权利要求1所述的M-MLV逆转录酶。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中进一步包含逆转录反应缓冲液，所述缓冲液的组成如下所示：50-300mM Tirs-HCl，50-200mM (NH₄)₂SO₄，2-10mMMgCl₂，0.5-1mM dNTPs，0.1-2.5µM Oligod(T)₂₀/随机引物，1-5mM DTT。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液的组成成分为：150mMTirs-HCl， 50mM (NH₄)₂SO₄，6mM MgCl₂，0.5 mM dNTPs，2.5µM Oligod(T)₂₀/随机引物，2mMDTT。