CN111647576B

CN111647576B - 一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用

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Publication number: CN111647576B
Application number: CN202010589979.6A
Authority: CN
Inventors: 冯速; 贡怡; 徐晓昱; 唐伟; 张晓薇; 刘传军; 曹林; 张力军; 聂俊伟; 瞿志鹏
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2020-06-24
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-06-24
Also published as: CN111647576A

Abstract

本发明公开一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用，所述MMLV逆转录酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，与SEQ ID NO.2具有80％同一性且具MMLV逆转录酶功能和热稳定性增强的蛋白。本发明所述的突变体，活性与母本相当，但热稳定性有显著提高，耐热能力可达到65℃，60℃下反应的活力可以是37℃的1.5倍；在50℃下保温5h，残余活力超过60％，热稳定性比相应母本提高至少4倍。

Description

一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的突变型MMLV逆转录酶及其制备方法和应用。

背景技术

逆转录酶[EC 2.7.7.49]来源于含RNA的逆转录病毒，在结构上是单体(例如莫洛尼鼠白血病病毒，Moloney Murine Leukemia virus,MMLV)或异二聚体(例如禽骨髓成纤维细胞病毒，Avian Myeloblastosis Virus，AMV)逆转录酶。逆转录酶是一种具有三种酶活性的多功能酶，包括RNA和DNA依赖性的DNA聚合活性，以及催化RNA-DNA杂合链中RNA裂解的RNase H活性。MMLV逆转录酶被广泛用于许多研究应用中，包括cDNA克隆，逆转录酶-PCR定量，微阵列分析，RACE等。MMLV逆转录酶的RNase H活性限制了合成长cDNA的效率。通过开发出RNase H活性降低，且完整保留了RNA依赖性DNA聚合酶活性的突变体(H^-MMLV逆转录酶)，克服了这个问题，同时对于全长cDNA的合成有了很大改善，热稳定性也有了一定的提高(Gerard G.F.,Potter R.J.,Smith M.D.,Rosenthal K.,Dhariwal G.,Lee J.andChatterjee D.K.The role of template-primer in protection of reversetranscriptase from thermal inactivation.Nucleic Acids Res.,2002,30,3118–3129.)。逆转录反应的一个主要问题是单链RNA容易自身配对形成发夹等二级结构，该结构会阻止cDNA合成，导致cDNA分子被截断，这个问题可以通过在较高温度下进行cDNA合成来克服，但野生型逆转录酶的热稳定性较差，在高温条件下会失去活性，进一步改造以提高逆转录酶的热稳定性就十分有必要，H^-MMLV逆转录酶热稳定性虽有一定的提高，但还不足以完全克服热稳定性问题。

现有技术多使用改造的热稳定性提高的逆转录酶。通常MMLV逆转录酶的反应温度为37℃(H^-MMLV逆转录酶为42℃)，升高温度(如55℃)则更利于解开RNA二级结构，从而改善有问题序列的转录，但是这对酶的热稳定性就提出了更高的要求。在较高的非PCR温度(最高55-65℃)下进行逆转录，使用禽类逆转录酶(例如AMV逆转录酶)，和使用稳定剂增强MMLV逆转录酶的热活性。尽管AMV逆转录酶在高温下保留的DNA合成活性比MMLV逆转录酶(最适温度为45-50℃；最高60℃)高，但AMV逆转录酶的逆转录产量(cDNA转化效率)显着低于MMLV逆转录酶(AMV为2％，而MMLV为44％)(Yasukawa,K.,Nemoto,D.and Inouye,K.Comparisonof the thermal stabilities of reverse transcriptases from avian myelo-blastosis virus and Moloney murine leukaemia virus.J.Biochem.,2008,143,261–268.)，同时由于MMLV逆转录酶为单体结构，相比较而言更加简单，因此使用MMLV逆转录酶仍是市场的主流方向。

设计具有增加的热稳定性的MMLV逆转录酶突变体的方法已有报道。如ThermoFisher使用核糖体展示(RD)和体外区室化技术(IVC)进行高通量筛选，获得了热稳定性显著提升的突变体(CN107058258A)。但此方法涉及到昂贵的无细胞培养体系，且由于是随机突变，需要构建大容量的多样化文库。现有最高热稳定性的MMLV逆转录酶变体耐热能力(能耐受60℃)也仍较低。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的不足，提供一种重组型高热稳定性的MMLV逆转录酶突变体，及其制备方法和应用。

本发明提供的热稳定性提高的MMLV逆转录酶突变体，所述MMLV逆转录酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中插入、取代、或缺失1个或多个氨基酸，或者在SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的一个或两个末端添加或删除1个或多个氨基酸，与SEQ ID NO.2具有80％同一性且具MMLV逆转录酶功能和热稳定性增强的蛋白。优选的具有90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。

在一些实施例中，氨基酸序列中插入、取代、或缺失的位点选自SEQ ID NO.2中的以下位点中的任意一个或几个：第66位的甲硫氨酸(M66)、第111位的脯氨酸(P111)、第163位的苏氨酸(T163)、第164位的丝氨酸(S164)、第317位的苯丙氨酸(F317)、第418位的缬氨酸(V418)、第580位的缬氨酸(V580)或第623位的丙氨酸(A623)。

在一些实施例中，本发明所述MMLV逆转录酶突变体包含D524G突变。

在一些实施例中，本发明所述MMLV逆转录酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中取代1个或多个氨基酸，与SEQ ID NO.2具有80％同一性且具MMLV逆转录酶功能和热稳定性增强的蛋白。优选的具有90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。在一些具体的实施例中，氨基酸取代位点包括以下一种或几种：用半胱氨酸替换第66位的甲硫氨酸(M66C)、用天冬氨酸替换第111位的脯氨酸(P111D)、用精氨酸替换第163位的苏氨酸(T163R)、用赖氨酸替换第164位的丝氨酸(S164K)、用亮氨酸替换第317位的苯丙氨酸(F317L)、用苏氨酸替换第418位的缬氨酸(V418T)、用异亮氨酸替换第580位的缬氨酸(V580I)或用缬氨酸替换第623位的丙氨酸(A623V)。

在一些实施例中，本发明所述的MMLV逆转录酶突变体在大于37℃的温度具有最佳活性，在一些实施例中，所述MMLV逆转录酶突变体在至少42℃，优选为至少50℃，更优选为至少60℃具有最佳活性。在一些具体的实施例中,所述MMLV逆转录酶突变体在50～65℃下的活性是37℃下活性的至少120％，优选的是，50～65℃下活性是37℃下活性的至少130％，更优选的至少150％。

在一些实施例中，本发明所述的MMLV逆转录酶突变体耐热能力不低于50℃在一些实施例中，本发明所述的MMLV逆转录酶突变体耐热能力不低于60℃。

在一些更为具体的实施中，本发明提供了一种MMLV逆转录酶突变体，以Mut-MMLV表示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或与SEQ ID NO.1所示序列具有80％同一性的具有MMLV逆转录酶活性且热稳定性增强的氨基酸序列；优选的具有85％同一性，更优选的具有90％同一性，更优选的具有95％同一性，最优选的，具有99％同一性。

本发明还提供了编码本发明所述的MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列。本领域技术人员充分了解的是，由于同一氨基酸可能有多种不同的密码子来决定，所以编码上述突变型MMLV逆转录酶的核苷酸序列并不仅仅局限于一种，可以是由SEQ ID NO.1所示MMLV逆转录酶核苷酸序列突变一个或多个核苷酸形成同义突变得到同样可编码本发明所述突变体氨基酸序列的核苷酸序列，也可以根据密码子优化设计能够编码本发明所述突变体氨基酸序列的核苷酸序列。

在一些具体的实施例中，本发明还提供编码突变体Mut-MMLV的核苷酸序列，所述序列可以是如SEQ ID NO.4所示，或者由SEQ ID NO.1所示MMLV逆转录酶核苷酸序列突变一个或多个核苷酸形成同义突变得到同样可编码本发明所述突变体Mut-MMLV氨基酸序列的核苷酸序列，也可以根据密码子优化设计能够编码本发明所述突变体Mut-MMLV氨基酸序列的核苷酸序列。

本发明还提供一种包含编码本发明所述的MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列的重组载体。用于构建本发明的表达载体的母载体不受限制，可使用用于原核生物或真核生物转化的任何传统载体。在本发明的一个实施方案中，通过向pET28a插入由SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列来构建重组载体。

本发明还包含一种重组细胞，可通过将所述重组载体插入随机的原核细胞或真核细胞中来构建，包含可编码本发明所述MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列，或包含可编码所述MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列的载体。在本发明的一个实施方案中，本发明所述重组细胞所使用的宿主细胞为BL21。

另一方面，本发明还提供了本发明所述热稳定性MMLV逆转录酶突变体的获取方法，其步骤如下：

(1)突变体构建：MMLV逆转录酶母本的基因序列见SEQ ID NO.2，使用基因合成获得，合成至载体pET28a上，产生pET28a-MMLV RT质粒，具体合成序列包括3’端添加的纯化标签6×His序列和TAA终止密码子。将此质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行表达宿主构建，该质粒诱导表达后产生C端融合6×His纯化标签的MMLV逆转录酶。逆转录酶突变体的构建以质粒pET28a-MMLV RT为原始模板，在突变位点设计饱和突变引物，使用点突变试剂盒进行定向引入氨基酸替换，每轮定点突变可引入1-5个单点突变，多点突变的构建经多轮突变完成；所构建的突变体质粒序列均经过抽样测序确认正确。

(2)突变体的筛选：挑取平板上的单克隆接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，摇床培养活化至OD值为0.4-0.6，加入终浓度为0.05-0.5mM的诱导剂IPTG在16-25℃下继续培养，诱导酶表达；8-16小时后离心收集发酵菌体；菌体使用Merck BugBuster蛋白提取试剂充分重悬后，室温静置，低温离心取上清，获得逆转录酶突变体粗提液。

在不同温度下进行逆转录活性筛选：以人总RNA为模板，进行逆转录反应；向含有1ug RNA的反应管中按顺序加入以下反应组分：1μL Oligo(dT)₂₀VN引物，2μL 10×RT mix(含有dNTPs)，1μL RNase inhibitor，1uL逆转录酶粗体液，用RNase-free ddH₂O补足20μL，在37-60℃之间的不同反应温度下反应；反应结束后于80-90℃孵育5-60s以终止反应；使用1μL逆转录产物作为模板，使用一对beta-actin基因的特异性引物进行qPCR扩增，检测扩增Ct值，若Ct值低于MMLV RT则认为突变体酶粗提液具有热稳定性优势。

(3)优选逆转录酶突变体表达与纯化：将稳定性筛选结果最佳的突变体在LB液体培养基中诱导培养，具体条件见突变体的筛选中所述。取发酵菌体以Ni亲和层析柱结合缓冲液重悬后，以细胞高压匀浆破碎仪破碎，低温高速离心收集破碎上清液，4℃环境下使用Ni亲和层析纯化柱进行纯化收集，得到MMLV逆转录酶突变体，配制于存储缓冲液中，低温保存。

在一些实施例中，步骤1)中，所用点突变试剂盒为南京诺唯赞的Mut ExpressMultiS Fast Mutagenesis Kit V2(货号C215)。前述8个突变位点的饱和突变使用简并密码子NNK进行突变设计。引物的具体序列见SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.18。

在一些实施例中，步骤2)的优选技术方案是：挑取平板上的单克隆接种到1mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养至OD值为0.4-0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG在25℃下以200rpm摇动培养，10小时后离心收集发酵菌体；菌体使用100μL Merck BugBuster蛋白提取试剂充分重悬后，室温静置20min，低温高速离心取上清，获得逆转录酶突变体粗提液。

在不同温度下进行逆转录活性筛选：以人总RNA为模板，进行逆转录反应；向含有1ug RNA的反应管中按顺序加入以下反应组分，组分来源于诺唯赞公司的

III1stStrand cDNASynthesis Kit(货号：R312)：1μL Oligo(dT)₂₀VN引物，2μL 10×RT mix(含有dNTPs)，1μL RNase inhibitor(40U/μL，南京诺唯赞，货号R301)，1uL逆转录酶粗提液，用RNase-free ddH₂O补足20μL，在37-60℃之间的不同反应温度下反应30min；反应结束后于85℃孵育5s以终止反应；使用1μL逆转录产物作为PCR模板，使用南京诺唯赞的ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix(货号Q711)以及一对beta-actin基因的特异性引物(具体序列见SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)检测扩增Ct值，若Ct值低于MMLV RT则认为突变体酶粗体液具有热稳定性优势。

在一些实施例中，步骤3)中，酶纯化后使用储存缓冲液配方为10mM Tris–HCl，pH7.5，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油，-20℃保存。

本发明还提供所述MMLV逆转录酶突变体、或所述的重组载体、或所述的重组细胞在生物技术领域中的应用。

本发明还提供所述MMLV逆转录酶突变体、或所述的重组载体、或所述的重组细胞在逆转录反应领域中的应用。

本发明的有益效果：本发明找到了新的突变位点，经过采用分子理性设计与功能筛选相结合，在较小范围内筛选后获得热稳定性的MMLV逆转录酶突变体，活性与母本相当，但热稳定性有显著提高，本发明提供的一种具体的MMLV逆转录酶突变体，耐热能力达到65℃，60℃下反应的活力是37℃的1.5倍；在50℃下保温5h，残余活力超过60％，热稳定性比相应母本提高至少4倍。

附图说明

图1pET28a-MMLV-RT质粒图谱。

图2突变型热稳定性MMLV逆转录酶及对应的母本MMLV逆转录酶的热稳定性比较。以不同反应温度为横坐标，ΔCT(ΔCT＝突变型MMLV逆转录酶cDNA扩增CT值–对应的母本MMLV逆转录酶cDNA扩增CT值)为纵坐标绘图。

图3突变型MMLV逆转录酶及母本MMLV逆转录酶的最适反应温度。

图4突变型MMLV逆转录酶和对应的母本逆转录酶在50℃下保温的残余活力曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

如无特殊说明，本发明所述的“母本MMLV逆转录酶”氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例1：突变型热稳定性MMLV逆转录酶的筛选

MMLV逆转录酶具有的RNase H活性对于逆转录反应的产率和DNA合成长度有较大影响，去除RNase H活性后对稳定性也有益处，因此本发明使用的突变母本中已经引入D524G突变以完全去除此活性。根据已有报道，MMLV逆转录酶的热稳定性与其底物结合有密切关系。通过对MMLV逆转录酶的蛋白质结构进行分析，搜索底物结合相关的位点，但由于这些位点可能在改变底物结合时，提高稳定性但损失活力参数，因此本发明选择底物结合位点附近的氨基酸，这些位点不直接接触底物，但可能通过影响与底物直接结合的氨基酸侧链朝向，从而影响其底物结，这些位点包括M66、P111、T163、S164和F317。另外，本发明选择了部分非催化核心区域的疏水核心位点，希望通过提高内部疏水相互作用而提高蛋白值的稳定性，这些位点包括V418、V580和A623。

(1)突变体构建：MMLV逆转录酶母本的基因序列见SEQ ID NO.2，使用基因合成获得，合成至载体pET28a上，产生pET28a-MMLV RT质粒(图1)，具体合成序列包括3’端添加的纯化标签6×His序列和TAA终止密码子，其中设计了D524G突变，从而消除RNase H活性。将此质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行表达宿主构建，该质粒诱导表达后产生C端融合6×His纯化标签的MMLV逆转录酶。逆转录酶突变体的构建以质粒pET28a-MMLV RT为原始模板，在M66、P111、T163、S164、F317、V418、V580、A623处，使用简并密码子NNK设计饱和突变引物，利用基因合成方法合成引物，具体引物序列为SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.18。

使用南京诺唯赞的Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2(货号C215)向母本MMLV逆转录酶定向引入饱和突变，PCR扩增分为7个反应，分别以SEQ ID NO.5和SEQID NO.8，SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12，SEQ ID NO.11和SEQID NO.14，SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.16，SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.18，SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.6为引物，使用Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2(由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产，Vazyme,货号C215)进行高保真扩增，在50μL反应体系中，加入25μL 2×Max Buffer，1μL dNTP Mix(10mM each)，2μL相应的引物(10μM)和1ng pET28a-MMLV RT质粒。扩增条件为95℃30s；30个循环:95℃15s，60℃15s，72℃30s-3min(30s/kb)；72℃继续延伸5min。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测目标条带大小正确，得到目的条带后切胶回收，为第1至第7段PCR产物。

将第1-3个PCR产物和第4-6个PCR产物分别进行PCR连接，使用引物为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.12，以及SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.18，反应体系与前述相同，使用第1-3个PCR产物和第4-6个PCR产物为模板，每个PCR产物添加1μL。扩增条件同前所述。使用1％琼脂糖凝胶电泳检测目标条带大小正确，得到目的条带后切胶回收，为第8和第9段PCR产物。

取第7至第9段PCR产物进行重组反应，在20μL重组体系中，加入4μL 5×CE MultiSBuffer，2μL Exnase MultiS，并按照说明书的要求加入第7、第8和第9段PCR产物。混匀后37℃恒温孵育0.5小时。

取20μL冷却重组反应液，加入到200μL BL21(DE3)感受态细胞(由南京诺唯赞生物科技股份有限公司生产，Vazyme,货号C504)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90秒，冰水浴孵育2min。加入900μL LB培养基，37℃摇菌45min。将菌液均匀涂布在50μg/mL卡那霉素的LB平板上。将平板倒置，于37℃过夜培养。第二天随机挑取单克隆测序鉴定序列正确。

(2)突变体的筛选：将平板上的单克隆接种到1mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养活化至OD值为0.4-0.6，加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG在25℃下继续培养，诱导酶表达；10小时后离心收集发酵菌体；菌体使用100μL MerckBugBuster蛋白提取试剂(货号70584-3)充分重悬后，室温静置20min，低温离心取上清，获得逆转录酶突变体粗提液。

在不同温度下进行逆转录活性筛选：以小鼠总RNA为模板，进行逆转录反应；向含有1ug RNA的反应管中按顺序加入以下反应组分，组分来源于南京诺唯赞公司生产的

III 1st Strand cDNASynthesis Kit(货号：R312)：1μL Oligo(dT)₂₀VN引物，2μL10×RT mix(含有dNTPs)，1μL RNase inhibitor(40U/μL，南京诺唯赞，货号R301)，1uL逆转录酶粗提液，用RNase-free ddH₂O补足20μL，在不同反应温度(37、60℃)反应30min。反应结束后于85℃孵育5s以终止反应。使用1μL逆转录产物作为qPCR模板，使用南京诺唯赞的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(货号Q711)以及一对beta-actin基因的特异性引物(具体序列见SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20)检测扩增Ct值。每个突变体的逆转录反应检测两个复孔，若突变体的Ct值低于母本MMLV RT逆转录酶的Ct值，则认为突变体具有热稳定性优势。

母本MMLV逆转录酶在37℃下有活力，但60℃下无活力。共计筛选了约600个突变体，获得37℃和60℃都有活力的MMLV逆转录酶突变体，命名为Mut-MMLV，其37℃反应活力与相应的母本MMLV逆转录酶相近。将Mut-MMLV进行测序，其核酸序列如SEQ ID NO.4所示，鉴定突变位点氨基酸替代，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

(3)逆转录酶突变体Mut-MMLV的表达与纯化：将突变体Mut-MMLV在含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中诱导培养，具体条件见步骤(2)中所述。取发酵后的菌体以Ni亲和层析柱结合缓冲液重悬后，以细胞高压匀浆破碎仪破碎，低温高速离心收集破碎上清液，4℃环境下使用Ni亲和层析纯化柱进行纯化收集，得到MMLV逆转录酶突变体纯酶。纯酶使用储存缓冲液配方为10mM Tris–HCl，pH 7.5，50mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，50％甘油，-20℃保存。通过在280nm处的吸光度确定浓度。

使用纯化的Mut-MMLV及对应的母本MMLV逆转录酶进行不同温度下的逆转录反应，以比较两者的热稳定性。反应体系同(2)，在37℃和60℃下进行RT-PCR反应，分别比较两者在不同温度下Ct值的差异，如图2所示。显示Mut-MMLV在37℃下逆转录活性较母本相差很小，略微下降(ΔCt<0.5)，而60℃下Mut-MMLV的逆转录活性较母本有显著提高(ΔCt<-10)。

实施例2：最适反应温度测定

20μL反应体系中加入50mM Tris-HCl(pH 8.3)、75mM NaCl，5mM MgCl₂、1mM DTT，0.01％Tween-20、2％海藻糖，1×SYBR Green染料，0.8mM dTTP，0.01μg/μL poly(A)，0.1μMoligo(dT)₂₀引物和5ng逆转录酶。在不同的温度下孵育，每15s测量一次荧光。计算MMLV逆转录酶突变体Mut-MMLV和对应的母本的荧光曲线的初始斜率，以各自37℃的活力为100％，其结果如图3所示。

母本MMLV逆转录酶50℃下初始活力为37℃下的58％，60℃下已基本无活力，而Mut-MMLV逆转录酶在60℃下活力是37℃下的156％，65℃下活力略有下降，但仍有134％活力残留，温度适用范围明显高于母本，最适温度也明显高于母本，显示其热活力及热稳定性相对母本有显著的提高。

实施例3：

取MMLV逆转录酶突变体Mut-MMLV和对应的母本MMLV逆转录酶配置成1mg/mL的溶液，密封放置在50℃水浴中保温，定时取样检测酶的活力，测活方案见实施例2中所述。以两者未保温时的酶活力为100％，测定酶的稳定性曲线如图4所示。

母本在保温60min后残余活力仅20％，而突变体Mut-MMLV在保温60min后，残余活力超过95％，保温300min后，残余活力仍高于60％。

序列表

<110> 南京诺唯赞生物科技股份有限公司

<120> 一种热稳定性逆转录酶突变体及其应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 677

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu

1 5 10 15

Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala

20 25 30

Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu

35 40 45

Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr

50 55 60

Pro Cys Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg

65 70 75 80

Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Asp Val

100 105 110

Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr

115 120 125

Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln

130 135 140

Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu

145 150 155 160

His Pro Arg Lys Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe

180 185 190

Lys Asn Ser Pro Ile Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala

195 200 205

Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr

225 230 235 240

Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala

245 250 255

Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val

275 280 285

Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu

290 295 300

Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Leu Ala Glu Met

305 310 315 320

Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp

325 330 335

Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu

340 345 350

Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu

355 360 365

Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys

370 375 380

Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp

385 390 395 400

Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile

405 410 415

Ala Thr Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu

420 425 430

Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro

435 440 445

Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu

450 455 460

Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro

465 470 475 480

Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu

485 490 495

Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln

500 505 510

Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Gly Gly Ser Ser Leu

515 520 525

Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr

530 535 540

Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg

545 550 555 560

Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Met Ala Glu Gly Lys

565 570 575

Lys Leu Asn Ile Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His

580 585 590

Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly

595 600 605

Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Val Leu

610 615 620

Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys

625 630 635 640

Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala

645 650 655

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile

660 665 670

Glu Asn Ser Ser Pro

675

<210> 2

<211> 677

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys Glu

1 5 10 15

Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln Ala

20 25 30

Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro Leu

35 40 45

Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln Tyr

50 55 60

Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln Arg

65 70 75 80

Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn Thr

85 90 95

Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro Val

100 105 110

Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro Thr

115 120 125

Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His Gln

130 135 140

Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg Leu

145 150 155 160

His Pro Thr Ser Gln Pro Leu Phe Ala Phe Glu Trp Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Met Gly Ile Ser Gly Gln Leu Thr Trp Thr Arg Leu Pro Gln Gly Phe

180 185 190

Lys Asn Ser Pro Ile Leu Phe Asp Glu Ala Leu His Arg Asp Leu Ala

195 200 205

Asp Phe Arg Ile Gln His Pro Asp Leu Ile Leu Leu Gln Tyr Val Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Leu Ala Ala Thr Ser Glu Leu Asp Cys Gln Gln Gly Thr

225 230 235 240

Arg Ala Leu Leu Gln Thr Leu Gly Asn Leu Gly Tyr Arg Ala Ser Ala

245 250 255

Lys Lys Ala Gln Ile Cys Gln Lys Gln Val Lys Tyr Leu Gly Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Glu Gly Gln Arg Trp Leu Thr Glu Ala Arg Lys Glu Thr Val

275 280 285

Met Gly Gln Pro Thr Pro Lys Thr Pro Arg Gln Leu Arg Glu Phe Leu

290 295 300

Gly Thr Ala Gly Phe Cys Arg Leu Trp Ile Pro Gly Phe Ala Glu Met

305 310 315 320

Ala Ala Pro Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Thr Gly Thr Leu Phe Asn Trp

325 330 335

Gly Pro Asp Gln Gln Lys Ala Tyr Gln Glu Ile Lys Gln Ala Leu Leu

340 345 350

Thr Ala Pro Ala Leu Gly Leu Pro Asp Leu Thr Lys Pro Phe Glu Leu

355 360 365

Phe Val Asp Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln Lys

370 375 380

Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu Asp

385 390 395 400

Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala Ile

405 410 415

Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro Leu

420 425 430

Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro Pro

435 440 445

Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu Leu

450 455 460

Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn Pro

465 470 475 480

Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys Leu

485 490 495

Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp Gln

500 505 510

Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Gly Gly Ser Ser Leu

515 520 525

Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu Thr

530 535 540

Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln Arg

545 550 555 560

Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Arg Met Ala Glu Gly Lys

565 570 575

Lys Leu Asn Val Tyr Thr Asp Ser Arg Tyr Ala Phe Ala Thr Ala His

580 585 590

Ile His Gly Glu Ile Tyr Arg Arg Arg Gly Leu Leu Thr Ser Glu Gly

595 600 605

Lys Glu Ile Lys Asn Lys Asp Glu Ile Leu Ala Leu Leu Lys Ala Leu

610 615 620

Phe Leu Pro Lys Arg Leu Ser Ile Ile His Cys Pro Gly His Gln Lys

625 630 635 640

Gly His Ser Ala Glu Ala Arg Gly Asn Arg Met Ala Asp Gln Ala Ala

645 650 655

Arg Lys Ala Ala Ile Thr Glu Thr Pro Asp Thr Ser Thr Leu Leu Ile

660 665 670

Glu Asn Ser Ser Pro

675

<210> 3

<211> 2031

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accctaaata tagaagatga gcatcggcta catgagacct caaaagagcc agatgtttct 60

ctagggtcca catggctgtc tgattttcct caggcctggg cggaaaccgg gggcatggga 120

ctggcagttc gccaagctcc tctgatcata cctctgaaag caacctctac ccccgtgtcc 180

ataaaacaat accccatgtc acaagaagcc agactgggga tcaagcccca catacagaga 240

ctgttggacc agggaatact ggtaccctgc cagtccccct ggaacacgcc cctgctaccc 300

gttaagaaac cagggactaa tgattatagg cctgtccagg atctgagaga agtcaacaag 360

cgggtggaag acatccaccc caccgtgccc aacccttaca acctcttgag cgggctccca 420

ccgtcccacc agtggtacac tgtgcttgat ttaaaggatg cctttttctg cctgagactc 480

caccccacca gtcagcctct cttcgccttt gagtggagag atccagagat gggaatctca 540

ggacaattga cctggaccag actcccacag ggtttcaaaa acagtcccac cctgtttgat 600

gaggcactgc acagagacct agcagacttc cggatccagc acccagactt gatcctgcta 660

cagtacgtgg atgacttact gctggccgcc acttctgagc tagactgcca acaaggtact 720

cgggccctgt tacaaaccct agggaacctc gggtatcggg cctcggccaa gaaagcccaa 780

atttgccaga aacaggtcaa gtatctgggg tatcttctaa aagagggtca gagatggctg 840

actgaggcca gaaaagagac tgtgatgggg cagcctactc cgaagacccc tcgacaacta 900

agggagttcc tagggacggc aggcttctgt cgcctctgga tccctgggtt tgcagaaatg 960

gcagccccct tgtaccctct caccaaaacg gggactctgt ttaattgggg cccagaccaa 1020

caaaaggcct atcaagaaat caagcaagct cttctaactg ccccagccct ggggttgcca 1080

gatttgacta agccctttga actctttgtc gacgagaagc agggctacgc caaaggtgtc 1140

ctaacgcaaa aactgggacc ttggcgtcgg ccggtggcct acctgtccaa aaagctagac 1200

ccagtagcag ctgggtggcc cccttgccta cggatggtag cagccattgc cgtactgaca 1260

aaggatgcag gcaagctaac catgggacag ccactagtca ttctggcccc ccatgcagta 1320

gaggcactag tcaaacaacc ccccgaccgc tggctttcca acgcccggat gactcactat 1380

caggccttgc ttttggacac ggaccgggtc cagttcggac cggtggtagc cctgaacccg 1440

gctacgctgc tcccactgcc tgaggaaggg ctgcaacaca actgccttga tatcctggcc 1500

gaagcccacg gaacccgacc cgacctaacg gaccagccgc tcccagacgc cgaccacacc 1560

tggtacacgg gtggaagcag tctcttacaa gagggacagc gtaaggcggg agctgcggtg 1620

accaccgaga ccgaggtaat ctgggctaaa gccctgccag ccgggacatc cgctcagcgg 1680

gctgaactga tagcactcac ccaggcccta aagatggcag aaggtaagaa gctaaatgtt 1740

tatactgata gccgttatgc ttttgctact gcccatatcc atggagaaat atacagaagg 1800

cgtgggttgc tcacatcaga aggcaaagag atcaaaaata aagacgagat cttggcccta 1860

ctaaaagccc tctttctgcc caaaagactt agcataatcc attgtccagg acatcaaaag 1920

ggacacagcg ccgaggctag aggcaaccgg atggctgacc aagcggcccg aaaggcagcc 1980

atcacagaga ctccagacac ctctaccctc ctcatagaaa attcatcacc c 2031

<210> 4

<211> 2031

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accctaaata tagaagatga gcatcggcta catgagacct caaaagagcc agatgtttct 60

ctagggtcca catggctgtc tgattttcct caggcctggg cggaaaccgg gggcatggga 120

ctggcagttc gccaagctcc tctgatcata cctctgaaag caacctctac ccccgtgtcc 180

ataaaacaat acccctgttc acaagaagcc agactgggga tcaagcccca catacagaga 240

ctgttggacc agggaatact ggtaccctgc cagtccccct ggaacacgcc cctgctaccc 300

gttaagaaac cagggactaa tgattatagg gatgtccagg atctgagaga agtcaacaag 360

cgggtggaag acatccaccc caccgtgccc aacccttaca acctcttgag cgggctccca 420

ccgtcccacc agtggtacac tgtgcttgat ttaaaggatg cctttttctg cctgagactc 480

cacccccgta cccagcctct cttcgccttt gagtggagag atccagagat gggaatctca 540

ggacaattga cctggaccag actcccacag ggtttcaaaa acagtcccac cctgtttgat 600

gaggcactgc acagagacct agcagacttc cggatccagc acccagactt gatcctgcta 660

cagtacgtgg atgacttact gctggccgcc acttctgagc tagactgcca acaaggtact 720

cgggccctgt tacaaaccct agggaacctc gggtatcggg cctcggccaa gaaagcccaa 780

atttgccaga aacaggtcaa gtatctgggg tatcttctaa aagagggtca gagatggctg 840

actgaggcca gaaaagagac tgtgatgggg cagcctactc cgaagacccc tcgacaacta 900

agggagttcc tagggacggc aggcttctgt cgcctctgga tccctgggct ggcagaaatg 960

gcagccccct tgtaccctct caccaaaacg gggactctgt ttaattgggg cccagaccaa 1020

caaaaggcct atcaagaaat caagcaagct cttctaactg ccccagccct ggggttgcca 1080

gatttgacta agccctttga actctttgtc gacgagaagc agggctacgc caaaggtgtc 1140

ctaacgcaaa aactgggacc ttggcgtcgg ccggtggcct acctgtccaa aaagctagac 1200

ccagtagcag ctgggtggcc cccttgccta cggatggtag cagccattgc caccctgaca 1260

aaggatgcag gcaagctaac catgggacag ccactagtca ttctggcccc ccatgcagta 1320

gaggcactag tcaaacaacc ccccgaccgc tggctttcca acgcccggat gactcactat 1380

caggccttgc ttttggacac ggaccgggtc cagttcggac cggtggtagc cctgaacccg 1440

gctacgctgc tcccactgcc tgaggaaggg ctgcaacaca actgccttga tatcctggcc 1500

gaagcccacg gaacccgacc cgacctaacg gaccagccgc tcccagacgc cgaccacacc 1560

tggtacacgg gtggaagcag tctcttacaa gagggacagc gtaaggcggg agctgcggtg 1620

accaccgaga ccgaggtaat ctgggctaaa gccctgccag ccgggacatc cgctcagcgg 1680

gctgaactga tagcactcac ccaggcccta aagatggcag aaggtaagaa gctaaatatt 1740

tatactgata gccgttatgc ttttgctact gcccatatcc atggagaaat atacagaagg 1800

cgtgggttgc tcacatcaga aggcaaagag atcaaaaata aagacgagat cttggcccta 1860

ctaaaagttc tctttctgcc caaaagactt agcataatcc attgtccagg acatcaaaag 1920

ggacacagcg ccgaggctag aggcaaccgg atggctgacc aagcggcccg aaaggcagcc 1980

atcacagaga ctccagacac ctctaccctc ctcatagaaa attcatcacc c 2031

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaaacaata ccccnnktca caagaagcca gactggg 37

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcttcttgt gamnnggggt attgttttat ggac 34

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctaatgatta taggnnkgtc caggatctga gag 33

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ctcagatcct ggacmnncct ataatcatta gtcc 34

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgagactcc accccnnknn kcagcctctc ttcgcctttg 40

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaagagaggc tgmnnmnngg ggtggagtct caggcag 37

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctggatccct gggnnkgcag aaatggcagc cccc 34

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctgccatttc tgcmnnccca gggatccaga ggcg 34

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tagcagccat tgccnnkctg acaaaggatg caggcaag 38

<210> 14

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctgcatcctt tgtcagmnng gcaatggctg ctaccatc 38

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtaagaagc taaatnnkta tactgatagc cgttatg 37

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cggctatcag tatamnnatt tagcttctta ccttctg 37

<210> 17

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggccctacta aaannkctct ttctgcccaa aagac 35

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgggcagaaa gagmnntttt agtagggcca agatc 35

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cttggcttct cagatcattg ctcct 25

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gactcatcgt actcctgctt gctg 24

Claims

1.一种MMLV逆转录酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.包含编码权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列的重组载体。

5.一种重组细胞，通过将权利要求4所述的重组载体插入随机的原核细胞或真核细胞中构建获得。

6.根据权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞所使用的宿主细胞为BL21。

7.权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体的制备方法。

8.权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组细胞在逆转录反应领域中的应用。