WO2012020759A1 - 変異型逆転写酵素 - Google Patents

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WO2012020759A1
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residue
amino acid
reverse transcriptase
seq
substitution
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保川　清
國世 井上
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国立大学法人京都大学
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase

Definitions

  • the present invention relates to a mutant reverse transcriptase. More specifically, the present invention relates to a mutant reverse transcriptase, a nucleic acid encoding the same, a reverse transcription method using the mutant reverse transcriptase, the mutant reverse transcriptase, which are useful for gene analysis, disease inspection, and the like. And a method for improving the thermal stability of nucleic acid-related enzymes such as the mutant reverse transcriptase.
  • Reverse transcriptase generally has an activity of synthesizing cDNA using RNA as a template (hereinafter referred to as “RNA-dependent DNA polymerase activity”) and an activity of synthesizing DNA using DNA as a template (hereinafter referred to as “DNA-dependent DNA”). And the activity of degrading the RNA strand in the RNA: DNA hybrid (hereinafter referred to as “RNase H activity”).
  • reverse transcriptase Since such reverse transcriptase has the RNA-dependent DNA polymerase activity, for example, analysis of the base sequence of mRNA that directly reflects the amino acid sequence of the protein expressed in the living body, cDNA library It is used for construction and RT-PCR. Conventionally, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or avian myeloblastosis virus reverse transcriptase is used for such applications.
  • the present invention has been made in view of the above prior art, and an object thereof is to provide a mutant reverse transcriptase having high thermostability and high versatility. Another object of the present invention is to provide a nucleic acid and a method for producing the mutant reverse transcriptase from which the mutant reverse transcriptase can be easily obtained. Another object of the present invention is to provide a versatile reverse transcription reaction kit and detection kit. Furthermore, an object of the present invention is to provide a method for improving the thermal stability of a nucleic acid-related enzyme that can greatly improve the thermal stability of the nucleic acid-related enzyme. It is another object of the present invention to provide a reverse transcription method that is highly versatile and can perform a reverse transcription reaction efficiently.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • a mutant reverse transcriptase, characterized in that it has a DNA interaction region having a larger positive net charge and exhibits reverse transcriptase activity [2]
  • the wild type reverse transcriptase consists of an amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2,
  • the amino acid residue in the DNA interaction region of the wild type reverse transcriptase is an amino acid residue localized in the region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid residue has a conservative substitution of amino acid residues in the region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 of SEQ ID NO: 2.
  • the mutant reverse transcriptase according to [2] or [3] above [5] At least one of the negatively charged amino acid residues among the amino acid residues localized in the region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 of SEQ ID NO: 2 is a positively charged amino acid residue.
  • an amino acid residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 of SEQ ID NO: 2 is substituted with a positively charged amino acid residue or a nonpolar amino acid residue , And exhibiting reverse transcriptase activity, a mutant reverse transcriptase, [7]
  • the amino acid residue in SEQ ID NO: 2 Glutamic acid residue at position 69, Aspartic acid residue at position 108, Glutamic acid residue at position 117, Aspartic acid residue at position 124, Glutamic acid residue at position 286, Glutamic acid residue at position 302, Tryptophan residue at position 313
  • a residue corresponding to at least one of a leucine residue at position 435 and an asparagine residue at position 454 is substituted with a positively charged amino acid
  • a mutant reverse transcription comprising an amino acid sequence having at least one selected from the group consisting of substitution of a residue corresponding to alanine residue or arginine residue, and exhibiting reverse transcriptase activity enzyme, [9] (I) In the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2, the following amino acid residue substitutions (a-1) to (c-1): (A-1) substitution of the residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue; (B-1) substitution of a residue corresponding to the glutamic acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 2 with a lysine residue, and (c-1) a residue corresponding to a leucine residue at position 435 of SEQ ID NO: 2.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has excellent properties such as high heat stability and high versatility. Further, according to the nucleic acid of the present invention and the method for producing the mutant reverse transcriptase of the present invention, the mutant reverse transcriptase can be easily obtained. Moreover, the reverse transcription reaction kit and the detection kit of the present invention have excellent properties such as high versatility. Furthermore, according to the method for improving the thermal stability of the nucleic acid-related enzyme of the present invention, the thermal stability of the nucleic acid-related enzyme can be greatly improved. Further, the reverse transcription method of the present invention is highly versatile, and according to the method, a reverse transcription reaction can be performed efficiently.
  • FIG. 6 is a drawing-substituting photograph showing the result of electrophoresis in Test Example 5.
  • the present inventors introduce positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues into the DNA interaction region of the reverse transcriptase to make the positive net charge larger than the DNA interaction region of the reverse transcriptase before the introduction. Thus, it was found that the thermal stability of reverse transcriptase is greatly improved.
  • the present invention is based on such knowledge.
  • mutant reverse transcriptase In the mutant reverse transcriptase of the present invention, the amino acid residue in the DNA interaction region of wild type reverse transcriptase is substituted with a positively charged amino acid residue or a nonpolar amino acid residue, It has a DNA interaction region having a positive net charge larger than the DNA interaction region of the type reverse transcriptase, and exhibits reverse transcriptase activity.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention Since the mutant reverse transcriptase of the present invention has the DNA interaction region, it exhibits high thermal stability. Therefore, according to the mutant reverse transcriptase of the present invention, the reverse transcription reaction can be performed even at a high reaction temperature. Therefore, even when the RNA has a base sequence that tends to form a secondary structure, the reaction temperature is reduced. By increasing the height, cDNA can be synthesized while suppressing the formation of secondary structure. Therefore, according to the mutant reverse transcriptase, a highly versatile reverse transcription reaction can be performed.
  • wild-type reverse transcriptase refers to a reverse transcriptase in which no artificial mutation has been introduced (hereinafter also referred to as “WTRT”).
  • WTRT include reverse transcriptase having an amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 means the reverse transcription comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 (Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) and the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • An amino acid sequence of an enzyme ortholog eg, avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, human immunodeficiency virus reverse transcriptase).
  • mutant reverse transcriptase refers to a reverse transcriptase into which a mutation has been artificially introduced.
  • MMLV reverse transcriptase “Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase” may be referred to as “MMLV reverse transcriptase”.
  • DNA interaction region refers to a region where amino acid residues that cause an interaction with DNA are localized in reverse transcriptase.
  • “having a positive net charge larger than the DNA interaction region of wild-type reverse transcriptase” means a pH suitable for carrying out a reverse transcription reaction (eg, pH 6.0 to 9.5). ) Means larger than the positive net charge of the DNA interaction region of the wild type reverse transcriptase.
  • the magnitude of the net charge is, for example, “+1” for the charge scores of lysine residues and arginine residues, which are positively charged amino acid residues, and the charges of aspartic acid residues and glutamic acid residues, which are negatively charged amino acid residues.
  • the score is “ ⁇ 1”, based on the number of lysine residues, arginine residues, aspartic acid residues and glutamic acid residues in the DNA interaction region, the formula (I):
  • Effective charge magnitude score (+ 1 ⁇ k) + (+ 1 ⁇ r) + ( ⁇ 1 ⁇ d) + ( ⁇ 1 ⁇ e) (I)
  • k represents the number of lysine residues
  • r represents the number of arginine residues
  • d represents the number of aspartic acid residues
  • e represents the number of glutamic acid residues.
  • the effective charge magnitude score calculated using the above formula (I) is the effective charge in the DNA interaction region of the wild type MMLV reverse transcriptase. It is desirable that positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues are localized so as to be larger than the score (+7).
  • the effective charge magnitude score of the DNA interaction region of the mutant reverse transcriptase of the present invention is usually +8 to +13, preferably +9, from the viewpoint of ensuring high thermal stability and ensuring high specific activity. To +13, more preferably +11 to +13.
  • the positively charged amino acid residue examples include an arginine residue, a lysine residue, and a histidine residue.
  • it is positively charged at a pH suitable for performing a reverse transcription reaction (for example, pH 6.0 to 9.5), and high thermal stability can be secured under such pH conditions.
  • a pH suitable for performing a reverse transcription reaction for example, pH 6.0 to 9.5
  • high thermal stability can be secured under such pH conditions.
  • an arginine residue and a lysine residue Preferably an arginine residue and a lysine residue.
  • nonpolar amino acid residues examples include alanine residues, glycine residues, valine residues, leucine residues, isoleucine residues, methionine residues, cysteine residues, tryptophan residues, phenylalanine residues, and proline residues. Etc. Among these, an alanine residue is preferable because the size of the side chain is small and the shape change caused by substitution is considered to be small.
  • the reverse transcriptase activity can be measured by performing the following steps (1) to (6).
  • Reaction solution [Composition: 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 2 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 12.5 ⁇ M poly (rA) ⁇ p (dT) 15 (p (dT) 15 in terms of concentration), and 0.2 mM [methyl - 3 H] dTTP] steps of incubation at 37 ° C.
  • step (2) collecting 20 ⁇ L of the product obtained in step (1) and spotting it on a glass filter; (3) The glass filter after the step (2) is washed with a cooled 5% by mass trichloroacetic acid aqueous solution for 10 minutes, and then washed with a cooled 95% by volume ethanol aqueous solution three times.
  • WTRT has an amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2, and amino acid residues in the WTRT DNA interaction region. Are preferably amino acid residues localized in a region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 of SEQ ID NO: 2 (hereinafter also referred to as “region T24-P474 ”).
  • region T24-P474 amino acid residues localized in a region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 of SEQ ID NO: 2
  • regions T24-P474 from the viewpoint of ensuring high thermal stability and ensuring sufficient specific activity, a region corresponding to the serine residue at position 60 to the glutamine residue at position 84 of SEQ ID NO: 2.
  • region S60-Q84 an asparagine residue at position 95 to a cysteine residue at position 157 (hereinafter also referred to as “region N95-C157 ”), a glutamine residue at position 190 A region corresponding to an asparagine residue at position 194 (hereinafter also referred to as “region Q190-N194 ”), a region corresponding to a leucine residue at position 220 to a glutamic acid residue at position 233 (hereinafter referred to as “region L220-E233 ”) A region corresponding to a lysine residue at position 257 to a glutamic acid residue at position 275 (hereinafter also referred to as “region K257-E275 ”); a region corresponding to a leucine residue at position 280 to a threonine residue at position 287; (hereinafter referred to as "area L280-T287" Also referred to), the region corresponding to the leu
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has a conservative substitution of an amino acid residue in the region T24-P474 in the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 within a range that does not interfere with the object of the present invention. Also good.
  • the conservative substitution include a specific amino acid residue and an amino acid residue that exerts a function similar to the specific amino acid residue in terms of hydrophobicity, charge, pKa, steric features, and the like. Substitution etc. are mentioned. More specifically, examples of the conservative substitution include substitution of one amino acid residue belonging to any of the following groups I to VI with another amino acid residue belonging to the same group.
  • Group I Glycine and alanine residues
  • Group II Valine, isoleucine and leucine residues
  • Group III Aspartate, glutamate, asparagine and glutamine residues
  • Group IV Serine and Threonine residue
  • Group V Lysine residue and arginine residue
  • Group VI Phenylalanine residue and tyrosine residue
  • mutant reverse transcriptase of the present invention is within a range that does not interfere with the object of the present invention.
  • A Substitution of one or several amino acid residues in the sequence excluding the region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 in the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2
  • An amino acid sequence further having a deletion, insertion or addition and
  • B a sequence excluding the region corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 of SEQ ID NO: 2, by the BLAST algorithm, It has any amino acid sequence of the amino acid sequence having sequence identity of at least 80% obtained by alignment under the conditions of Gap Costs (Existence 11, Extension 1), Expect 10, and Word Size 3. It may be an enzyme exhibiting a coenzyme activity.
  • substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acid residues means substitution, deletion, insertion or addition of a number of amino acid residues within a range that gives a polypeptide exhibiting reverse transcriptase activity. To do. “One or several” specifically refers to 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 3.
  • sequence identity is aligned under the conditions of Gap Costs (Extension 11, Extension 1), Expect 10, and Word Size 3 by the BLAST algorithm from the viewpoint of ensuring high thermal stability and sufficient specific activity.
  • the calculated value is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and particularly preferably 100%.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is characterized in that at least one of the negatively charged amino acid residues among the amino acid residues localized in the region T24-P474 is the positively charged amino acid. It is preferably substituted with a residue or a nonpolar amino acid residue.
  • Examples of the negatively charged amino acid residue include an aspartic acid residue and a glutamic acid residue.
  • Such a negatively charged amino acid residue is such that a polypeptide in which the negatively charged amino acid residue is substituted with the positively charged amino acid residue or the nonpolar amino acid residue in the WTRT amino acid sequence can express reverse transcriptase activity. In this case, it may be a residue present at a position that causes a change in shape.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 as the negatively charged amino acid residue from the viewpoint of ensuring high thermal stability and ensuring sufficient specific activity. :
  • the amino acid residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 of 2 is substituted with the positively charged amino acid residue or the nonpolar amino acid residue, and exhibits reverse transcriptase activity.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is an amino acid residue other than the amino acid residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 among the amino acid residues localized in the region T24-P474 within the range that does not interfere with the object of the present invention. Negatively charged amino acid residues and / or other amino acid residues may be substituted with the positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is an amino acid residue corresponding to SEQ ID NO: 2, in which amino acid residues in SEQ ID NO: 2 are glutamic acid residues at position 69 and aspartic acid residues in position 108.
  • 117-position glutamic acid residue, 124-position aspartic acid residue, 286-position glutamic acid residue, 302-position glutamic acid residue, 313-position tryptophan residue, 435-position leucine residue, and 454-position asparagine residue The enzyme corresponding to at least one of these may be substituted with a positively charged amino acid residue or a nonpolar amino acid residue, and exhibit reverse transcriptase activity.
  • substitution of the glutamic acid residue at position 302 with arginine can improve the thermal stability as compared with WTRT, but from the viewpoint of ensuring higher thermal stability, the substitution of the glutamic acid residue at position 302 is Substitution for arginine is excluded.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has the following amino acid residue substitutions (a) to (i) in the amino acid sequence corresponding to SEQ ID NO: 2 from the viewpoint of ensuring higher thermostability: (A) substitution of the residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue, a lysine residue or an arginine residue; (B) substitution of the residue corresponding to the glutamic acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue or a lysine residue; (C) substitution of the residue corresponding to the leucine residue at position 435 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue, lysine residue or arginine residue; (D) substitution of the residue corresponding to the aspartic acid residue at position 124 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue, a lysine residue or an arginine residue; (E) substitution of the residue corresponding to the gluta
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has one mutation selected from the amino acid residue substitutions (a) to (i) above (that is, when it is a single mutant), it has a higher heat.
  • (A-1) substitution of the residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue (B-1) substitution of a residue corresponding to the glutamic acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 2 with a lysine residue, and (c-1) a residue corresponding to a leucine residue at position 435 of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence having a substitution of a group with an arginine residue and (d-1) an amino acid sequence having either a substitution of a residue corresponding to the aspartic acid residue at position 124 of SEQ ID NO: 2 with an arginine residue And preferably exhibits reverse transcriptase activity.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is higher when it has a plurality of types of mutations selected from the amino acid residue substitutions (a) to (i) (that is, when it is a multiple mutant).
  • the following amino acid residue substitutions (a-1) to (c-1) (A-1) substitution of the residue corresponding to the glutamic acid residue at position 286 of SEQ ID NO: 2 with an alanine residue; (B-1) substitution of a residue corresponding to the glutamic acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 2 with a lysine residue, and (c-1) a residue corresponding to a leucine residue at position 435 of SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence having a substitution of a group with an arginine residue or (II) an arginine of a residue corresponding to the aspartic acid residue at position 124 of (d-1) SEQ ID NO: 2 in the amino acid sequence of (I) above It preferably consists of an amino acid sequence further having substitution to a residue and exhibits reverse transcriptase activity.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is the (e-1) sequence in the amino acid sequence of (I) or (II). It may be any amino acid sequence that further has substitution of the residue corresponding to the aspartic acid residue at position 524 of No. 2 with an alanine residue and that exhibits reverse transcriptase activity.
  • nucleic acid encoding mutant reverse transcriptase The nucleic acid of the present invention is a nucleic acid encoding the mutant reverse transcriptase of the present invention. Since the nucleic acid of the present invention encodes the mutant reverse transcriptase, the mutant reverse transcriptase can be easily obtained by expressing the mutant reverse transcriptase encoded by the nucleic acid.
  • nucleic acid examples include DNA and mRNA, but the present invention is not limited to such examples.
  • the nucleic acid of the present invention is, for example, a site-specific mutation relative to a nucleic acid encoding WTRT so that an amino acid residue in the WTRT DNA interaction region is replaced with a positively charged amino acid residue or a nonpolar amino acid residue. Can be obtained.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention can be obtained by expressing the mutant reverse transcriptase encoded by the nucleic acid using the nucleic acid of the present invention.
  • the present invention also includes a method for producing such a mutant reverse transcriptase.
  • the production method of the present invention is a method for producing the aforementioned mutant reverse transcriptase, (I) a step of culturing cells retaining the nucleic acid of the present invention to express a mutant reverse transcriptase encoded by the nucleic acid to obtain a culture, and (ii) a mutation from the culture obtained in the step
  • the method includes a step of recovering the type reverse transcriptase.
  • cells retaining the nucleic acid of the present invention are cultured to express a mutant reverse transcriptase encoded by the nucleic acid to obtain a culture [“step (i)”].
  • the cell retaining the nucleic acid can be obtained, for example, by transforming a host cell using a carrier for gene introduction containing the nucleic acid.
  • Examples of the host cell include bacterial cells such as E. coli, insect cells, yeast cells, plant cells, and animal cells, but the present invention is not limited to such examples. Among these, a mutant reverse transcriptase can be easily purified, and a large amount of mutant reverse transcriptase can be produced. Therefore, a bacterial cell is preferable, and an E. coli cell is more preferable. Examples of the E. coli cells include BL21 (DE3), but the present invention is not limited to such examples.
  • the carrier for gene introduction may be a biological carrier or a non-biological carrier.
  • biological carriers include vectors such as plasmid vectors, phage vectors, and viral vectors, but the present invention is not limited to such examples.
  • non-biological carrier include gold particles, dextran, and liposomes, but the present invention is not limited to such examples.
  • Such a carrier for gene transfer can be appropriately selected depending on the host cell to be used. For example, when the host cell is Escherichia coli, a plasmid vector or a phage vector can be used as a carrier for gene introduction.
  • the host cell is BL21 (DE3) which is Escherichia coli, a pET plasmid vector can be used. In this case, the mutant reverse transcriptase can be expressed in a large amount, and the mutant reverse transcriptase can be easily purified.
  • the vector may contain elements for facilitating purification of the mutant reverse transcriptase, such as an extracellular secretion signal, a His tag, and the like.
  • the gene introduction carrier When the gene introduction carrier is a plasmid vector, phage vector or virus vector which is the biological carrier, the gene introduction carrier inserts the nucleic acid into a cloning site of a plasmid vector, phage vector or virus vector, and a promoter. It can be produced by operably connecting under the control of
  • “operably linked” means that the expression of a polypeptide encoded by a nucleic acid is linked so that it is expressed in a state exhibiting biological activity under the control of an element such as a promoter.
  • the carrier for gene introduction is the non-biological carrier
  • the carrier for gene introduction is a nucleic acid construct obtained by operably linking the nucleic acid under the control of a promoter, if necessary. , And can be prepared by supporting the non-biological carrier.
  • a nucleic acid construct may appropriately contain elements necessary for expression of a gene such as a replication origin and a terminator.
  • Transformation can be performed by a transformation method according to the type of gene introduction carrier used.
  • transformation methods include an electroporation method, a calcium phosphate method, a DEAE-dextran method, and a particle gun method, but the present invention is not limited to such examples.
  • the culture conditions of the cells holding the nucleic acid can be appropriately set according to the type of host cell used.
  • the nucleic acid is operably linked under the control of an inducible promoter
  • cells that retain the nucleic acid may be cultured under expression-inducing conditions according to the type of the promoter.
  • the mutant reverse transcriptase is recovered from the culture obtained in the step (i) [“step (ii)”].
  • the culture is subjected to centrifugation or the like to recover the cells, and the mutant reverse transcriptase may be isolated from the cells.
  • the cells are disrupted by an ultrasonic disruption method, a lysis method, a freeze disruption method, etc., and the resulting cell extract is centrifuged, ultracentrifuged, ultrafiltration, salting out, dialysis, ion exchange column
  • the mutant reverse transcriptase can be isolated by subjecting it to chromatography, adsorption column chromatography, affinity chromatography, gel filtration column chromatography and the like.
  • the mutant reverse transcriptase when secreted outside the cell, the culture is subjected to centrifugation, filtration or the like, and the culture supernatant is collected, and the mutant reverse transcriptase may be isolated from the culture supernatant.
  • the reverse transcription method of the present invention is characterized by synthesizing cDNA from RNA using the mutant reverse transcriptase of the present invention.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention has a higher thermal stability than the wild type reverse transcriptase. Therefore, according to the reverse transcription method of the present invention, the reverse transcription reaction can be performed in a wide temperature range including a high temperature sufficient to suppress the formation of RNA secondary structure. Therefore, the reverse transcription method of the present invention can perform a reverse transcription reaction efficiently regardless of the type of RNA, and is highly versatile.
  • the mutant reverse transcriptase, RNA, an oligonucleotide primer complementary to the RNA, and four types of deoxyribonucleoside triphosphates are incubated in a reverse transcription reaction buffer.
  • a reverse transcription reaction can be performed.
  • the reaction temperature in the reverse transcription reaction varies depending on the type of RNA used, the type of mutant reverse transcriptase used, etc., and therefore is appropriately set according to the type of RNA used, the type of mutant reverse transcriptase used, etc. It is preferable.
  • the reaction temperature can be set to 37 to 45 ° C., for example, when the RNA used is an RNA that is difficult to form a secondary structure at a reaction temperature suitable for WT.
  • the reaction temperature is, for example, a temperature higher than the reaction temperature suitable for WT, for example, 45 to 60 ° C. when the RNA used is an RNA that easily forms a secondary structure at a reaction temperature suitable for WT.
  • the reverse transcriptase concentration in the reaction system during the reverse transcription reaction varies depending on the use of the reverse transcription method of the present invention, it is preferably set as appropriate according to the use.
  • the concentration of the reverse transcriptase is usually preferably 0.001 to 0.1 ⁇ M.
  • the concentration of the oligonucleotide primer in the reaction system during the reverse transcription reaction is usually preferably 0.1 to 10 ⁇ M.
  • concentrations of the four types of deoxyribonucleoside triphosphates in the reaction system during the reverse transcription reaction differ depending on the concentration and length of the target RNA, the concentration depends on the concentration and length of the target RNA. It is preferable to set appropriately.
  • concentration of the four deoxyribonucleoside triphosphates is usually preferably 0.01 to 1 ⁇ M.
  • the reverse transcription reaction buffer can be appropriately selected according to the type of mutant reverse transcriptase used.
  • the reverse transcription reaction buffer may contain a divalent cation, such as magnesium ion or manganese ion.
  • the reverse transcription reaction buffer is not limited to the purpose of the present invention, and if necessary, a reducing agent (for example, dithiothreitol), a stabilizer (for example, glycerol, trehalose, etc.), organic Components such as a solvent (for example, dimethyl sulfoxide, formamide, etc.) may be contained.
  • the concentration of the divalent cation in the reverse transcription reaction buffer solution varies depending on the type of reverse transcriptase and other components contained in the reverse transcription reaction buffer solution. It is preferable to set appropriately according to other components contained in the buffer solution for the photoreaction.
  • the concentration of the divalent cation is usually 1 to 30 mM.
  • the pH of the reverse transcription reaction buffer varies depending on the type of reverse transcriptase and other components contained in the reverse transcription reaction buffer, it is included in the type of reverse transcriptase and the reverse transcription reaction buffer. It is preferable to set appropriately according to other components.
  • the pH of the reverse transcription reaction buffer is generally 6.0 to 9.5.
  • the reverse transcription reaction kit of the present invention is a kit for carrying out a reverse transcription reaction, and is characterized by containing the mutant reverse transcriptase of the present invention. Since the reverse transcription reaction kit of the present invention contains the mutant reverse transcriptase of the present invention having high thermal stability, a wide temperature range including a high temperature sufficient to suppress the formation of RNA secondary structure. Suitable for reverse transcription reaction in a range. Therefore, the reverse transcription reaction kit of the present invention is highly versatile because the reverse transcription reaction can be efficiently performed regardless of the type of RNA.
  • the reverse transcription reaction kit of the present invention may contain a reagent necessary for performing a reverse transcription reaction in addition to the mutant reverse transcriptase.
  • a reagent necessary for performing a reverse transcription reaction in addition to the mutant reverse transcriptase.
  • examples of such a reagent include RNA used as a template for a reverse transcription reaction, oligonucleotide primers complementary to the RNA, four types of deoxyribonucleoside triphosphates, a buffer for reverse transcription reaction, an organic solvent, and the like.
  • the reverse transcription reaction buffer is the same as the reverse transcription reaction buffer used in the reverse transcription method.
  • the mutant reverse transcriptase may be enclosed in a container containing a storage buffer containing a stabilizer such as glycerol or trehalose.
  • a storage buffer include a buffer having a pH corresponding to the pH stability of the mutant reverse transcriptase.
  • the reagent necessary for performing the reverse transcription reaction may be enclosed in a container different from the container containing the mutant reverse transcriptase, and the progress of the reverse transcription reaction during storage of the reagent. May be enclosed in the same container as the mutant reverse transcriptase.
  • the reagent may be enclosed in a container so as to have an amount suitable for performing a reverse transcription reaction. This eliminates the need for the user to mix each reagent in an amount suitable for the reverse transcription reaction, and is easy to handle.
  • the detection kit of the present invention is a kit for detecting a marker in a sample containing RNA obtained from a living body, and contains the mutant reverse transcriptase and the reagent for detecting the marker. It is a feature. Since the detection kit of the present invention contains the mutant reverse transcriptase having high thermostability, reversal over a wide temperature range including a high temperature sufficient to suppress the formation of RNA secondary structure. Suitable for photoreaction. Therefore, the detection kit of the present invention can be used for various samples and is highly versatile.
  • the marker examples include RNA having a base sequence peculiar to viruses or bacteria contained in a living body, a base sequence peculiar to a disease, and the like.
  • the “base sequence peculiar to a virus or a bacterium” refers to a base sequence that exists in a virus or bacterium but does not exist in a living body.
  • the “base sequence peculiar to a disease” refers to a base sequence that exists in a living body affected with a disease but does not exist in a normal living body that does not suffer from the disease.
  • the virus is not particularly limited, and examples thereof include HPV, HIV, influenza virus, HCV, Norovirus, West Nile virus and the like.
  • examples of the bacterium include Bacillus cereus, Salmonella, enterohemorrhagic Escherichia coli, Vibrio, Campylobacter, and methicillin-resistant Staphylococcus aureus that cause food poisoning.
  • examples of the disease include cancer, diabetes, heart disease, high blood pressure, and infectious diseases.
  • the reagent for detecting the marker examples include a probe that is complementary to the RNA serving as the marker and bound with a fluorescent substance or a radioactive substance, or a fluorescent substance that specifically intercalates with a double-stranded nucleic acid (for example, Ethidium bromide).
  • the detection kit of the present invention includes, for example, four types of deoxyribonucleoside triphosphates, a reverse transcription reaction buffer, an organic solvent, RNA serving as a positive standard, It may contain RNA that is a negative standard.
  • the reverse transcription reaction buffer is the same as the reverse transcription reaction buffer used in the reverse transcription method.
  • the mutant reverse transcriptase may be enclosed in a container containing a storage buffer containing a stabilizer such as glycerol or trehalose.
  • a storage buffer solution is the same as the storage buffer solution in the reverse transcription reaction kit.
  • the four types of deoxyribonucleoside triphosphates, reverse transcription reaction buffer, and the like may be sealed in a container different from the container containing the mutant reverse transcriptase, and the reagent may be stored. As long as the progress of the reverse transcription reaction therein is stopped, it may be enclosed in the same container as the mutant reverse transcriptase. From the same viewpoint as in the case of the reverse transcription reaction kit, the reagent may be enclosed in a container so as to have an amount suitable for performing the reverse transcription reaction.
  • the method for improving the thermal stability of a nucleic acid-related enzyme according to the present invention is a method for improving the thermal stability of a nucleic acid-related enzyme having a nucleic acid interaction region that interacts with a nucleic acid. , Replacing amino acid residues in the nucleic acid interaction region with positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues with respect to the base sequence corresponding to the nucleic acid interaction region in the nucleic acid encoding the wild-type nucleic acid-related enzyme The mutation is introduced to form a nucleic acid interaction region having a positive net charge larger than the nucleic acid interaction region of the wild-type nucleic acid-related enzyme.
  • the nucleic acid-related enzyme has a nucleic acid interaction region that interacts with a nucleic acid. Therefore, as in the case of the mutant reverse transcriptase of the present invention, high thermal stability is ensured by substituting amino acid residues in the nucleic acid interaction region with positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues. Expected to be able to.
  • the nucleic acid-related enzyme may be an enzyme having a nucleic acid interaction region that interacts with a nucleic acid.
  • examples of the nucleic acid-related enzyme include reverse transcriptase, DNA polymerase, restriction enzyme, methylase, RNA polymerase, and telomerase. Of these, reverse transcriptase is preferable because thermal stability can be further improved.
  • the introduction of the mutation into the nucleotide sequence corresponding to the nucleic acid interaction region in the nucleic acid encoding the wild type nucleic acid-related enzyme is such that the amino acid residues in the nucleic acid interaction region of the wild type nucleic acid related enzyme are positively charged amino acid residues or non- PCR can be performed using primers designed to be substituted with polar amino acid residues.
  • the position of the amino acid residue to be mutated differs depending on the type of the nucleic acid-related enzyme, but in the nucleic acid interaction region of the nucleic acid-related enzyme, the position of the nucleic acid-related enzyme is close to the nucleic acid phosphate group. Positions of amino acid residues that do not cause a change in shape that hinders activity, positions of amino acid residues that are close to the negatively charged amino acid residue of reverse transcriptase and do not cause a change in shape that hinders the activity of nucleic acid-related enzymes, etc. Is mentioned.
  • a nucleic acid-related enzyme with improved thermal stability can be produced by using a nucleic acid into which a mutation has been introduced, in the same manner as the method for producing a mutant reverse transcriptase.
  • Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed with the obtained plasmid.
  • the obtained cells were cultured at 30 ° C. in L broth containing 50 ⁇ g / mL ampicillin to obtain transformed cells.
  • the transformed cells were inoculated into 3 mL of L broth containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and incubated at 30 ° C. for 16 hours with shaking. Thereafter, the transformed cells were cultured in an automatic induction system (manufactured by Novagen, trade name: Overnight Express Automation System) to express the protein.
  • an automatic induction system manufactured by Novagen, trade name: Overnight Express Automation System
  • the resulting culture was subjected to a cell lysis reagent (Promega), product name: FastBreak Cell Lysation Reagent, which is included in a protein purification system (Promega, product name: HisLink Spin Protein Purification System). ] was added to lyse the transformed cells.
  • a resin for protein purification (trade name: HisLink Protein Purification Resin, manufactured by Promega) included in the protein purification system was added to the obtained lysate.
  • the lysate containing the resin was transferred to a column [Promega, trade name: HisLink Spin Column]. Thereafter, the resin in the column was washed to remove unbound proteins and the like. Next, the protein adsorbed on the column was eluted with 0.2 mL of an elution buffer (composition, 100 mM hepes-sodium hydroxide buffer (pH 7.5), 500 mM imidazole), and a fraction containing WT was collected. .
  • an elution buffer composition, 100 mM hepes-sodium hydroxide buffer (pH 7.5), 500 mM imidazole
  • the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of WT is as follows: the charge score of each of lysine residues and arginine residues which are positively charged amino acid residues is “+1”, and the aspartic acid residue which is a negatively charged amino acid residue When the charge score of each of the glutamic acid residues is “ ⁇ 1” and calculated according to the above formula (I), it is +7.
  • FIG. 1 shows the localization positions of amino acid residues to be substituted selected in Production Example 2 in wild-type MMLV reverse transcriptase.
  • the site-specific mutagenesis primer is a primer designed to cause substitution of amino acid residues shown in Table 1.
  • Test Example 1 In the incubation solution [composition: 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.6), 2 mM dithiothreitol, 0.2 vol% Triton TM X-100 and 10 vol% glycerol], the WT obtained in Production Example 1 ( 100 nM) or the single mutant (100 nM) obtained in Production Example 2 was subjected to heat treatment by incubation at 50 ° C. for 15 minutes in the presence or absence of 28 ⁇ M poly (rA) ⁇ p (dT) 15 . The WT or the single mutant was then incubated for 30-60 minutes on ice.
  • reaction solution [Composition: 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 2 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 12.5 ⁇ M poly (rA) ⁇ p (dT) 15 [p (dT) 15 concentration in terms], 0.2 mM - were [methyl 3 H] in dTTP (1.85Bq / pmol) [GE Healthcare (GE Healthcare) Co. Ltd.]], the 10 nM WT or alone variant were incubated at 37 ° C..
  • the initial reaction rate was calculated based on the change over time in the dTTP uptake amount.
  • the residual activity was calculated from the initial reaction rate when the heat treatment was not performed (referred to as “initial reaction rate A”) and the initial reaction rate when the heat treatment was performed (referred to as “initial reaction rate B”). .
  • the residual activity is represented by the formula (II):
  • Residual activity (initial reaction rate B / initial reaction rate A) ⁇ 100 (II)
  • the amino acid residue to be substituted provides higher thermal stability than WT by introducing site-specific mutations. Whether it was a residue was evaluated.
  • the evaluation criteria are shown in Table 2, and the evaluation results are shown in Table 3.
  • the results of examining the relationship between the type of amino acid residue substitution and the residual activity in Test Example 1 are shown in FIG.
  • FIG. 2 shows the residual activity of representative examples of WT and single mutants.
  • results shown in FIG. 2 indicate that the residual activity of each of the two single mutants exceeds 15% among the three types of single mutants in which site-specific mutations are introduced into E286. Moreover, it turns out that the residual activity of each of two types of single mutants exceeds 15% among three types of single mutants in which site-specific mutations are introduced into D124.
  • Example 1 From the substitution target amino acid residues evaluated in Test Example 1, the substitution target amino acid residue having an evaluation of AA was selected. Next, four types of mutants (E302K, L435R, D124R, and E286R) were selected from the mutants in which the selected amino acid residue was substituted with another amino acid residue in descending order of residual activity.
  • Production Example 2 a primer designed to cause substitution of four selected amino acid residues was used in place of the primer designed to cause substitution of amino acid residues shown in Table 1. Except for, the same operation as in Production Example 2 was performed to obtain a multiple mutant of MMLV reverse transcriptase (D124R / E286R / E302K / L435R). As a result of SDS-PAGE, the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • the charge scores of lysine residues and arginine residues that are positively charged amino acid residues are “+1”, the charge scores of aspartic acid residues and glutamic acid residues that are negatively charged amino acid residues are “ ⁇ 1”, and DNA Based on the number of lysine residues, arginine residues, aspartic acid residues and glutamic acid residues in the interaction region, the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the multiple mutant is calculated using the above formula (I). The score was calculated. As a result, the score of the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the obtained multiple mutant was +13.
  • Example 2 In Example 1, instead of the primers designed to cause substitution of the four selected amino acid residues, substitution of the four amino acid residues selected in Example 1 and 524 in SEQ ID NO: 2
  • the MMLV reverse transcriptase multiple mutant (D124R / E286R / D) was carried out in the same manner as in Example 1 except that a primer designed so that substitution of Asp to Ala at position (D524A) was used. E302K / L435R / D524A).
  • Asp at position 524 in SEQ ID NO: 2 is an amino acid residue that is located in the active site of the WT RNase H reaction and is essential for catalytic activity.
  • SDS-PAGE analysis the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • the score of the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the obtained multiple mutant was +13.
  • Example 3 Among the four types of amino acid residue substitutions selected in Example 1, substitution of three types of amino acid residues E302K, L435R and E286R was selected. Next, in Example 1, a primer designed to cause substitution of the three types of amino acid residues is used in place of the primer designed to cause substitution of the selected four types of amino acid residues. Except for the above, the same operation as in Example 1 was performed to obtain a multiple mutant of MMLV reverse transcriptase (E286R / E302K / L435R). As a result of SDS-PAGE analysis, the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • the score of the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the obtained multiple mutant was +11.
  • Example 4 In Example 1, in place of the primers designed to cause substitution of the four selected amino acid residues, the substitution of the three amino acid residues selected in Example 3 and D524A occurs. Except that the designed primer was used, the same operation as in Example 1 was performed to obtain a multiple mutant of MMLV reverse transcriptase (E286R / E302K / L435R / D524A). As a result of SDS-PAGE analysis, the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • the score of the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the obtained multiple mutant was +11.
  • Test Example 2 In Test Example 1, the same procedure as in Test Example 1 was performed, except that the multiple mutants obtained in Examples 1 to 4 were used instead of the single mutant obtained in Production Example 2, and the remaining activity was Was calculated.
  • the results of examining the relationship between the type of multiple mutant and the residual activity in Test Example 2 are shown in FIG.
  • 1 is the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 1
  • 2 is the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 2
  • 3 is the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 3.
  • 4 shows the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 4.
  • the white bar indicates the residual activity of the multiple mutant in the absence of the template primer
  • the black bar indicates the residual activity of the multiple mutant in the presence of the template primer.
  • the effective charge magnitude score of the region of the multiple mutant obtained in each of Examples 1 to 4 is +11 to +13, and from the effective charge magnitude score (+7) of the WT region. Is also big. Therefore, from this result, amino acid residues in the DNA interaction region are determined to be positively charged amino acids so that the effective charge magnitude score of the DNA interaction region is larger than the effective charge in the WT DNA interaction region. It can be seen that high thermal stability can be ensured by substituting a residue or a non-polar amino acid residue and localizing a positively charged amino acid residue or a non-polar amino acid residue in the DNA interaction region.
  • Test Example 3 Reaction solution [Composition: 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 2 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, poly (rA) ⁇ p (dT) 15 [p ( dT) 15 in terms of concentration], 0.2 mM [methyl - 3 H] dTTP (1.85Bq / pmol) [in GE Healthcare (GE Healthcare) Co. Ltd.]], multiple mutants obtained in example 3, performed Multiple mutants obtained in Example 4 or WT (Comparative Example 1) (5 nM) were incubated at 37 ° C.
  • the glass filter was dried.
  • the glass filter was placed in 2.5 mL of a liquid scintillation reagent (trade name: Ecoscint H, manufactured by National Diagnostics), and the radioactivity was counted. Based on the radioactivity, dTTP uptake was calculated. Based on the change over time in the amount of dTTP uptake, the initial reaction rate was calculated.
  • a liquid scintillation reagent trade name: Ecoscint H, manufactured by National Diagnostics
  • the k cat / K m values of the multiple mutants obtained in Example 3 and the multiple mutants obtained in Example 4 are the WT k cat / K m values. It can be seen that they are 170% and 130%. From these results, it is suggested that the catalytic efficiency of the multiple mutant obtained in Example 3 and the multiple mutant obtained in Example 4 is higher than the catalytic efficiency of WT.
  • Test Example 4 Multiple mutations obtained in Example 3 in incubation solution [composition: 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.6), 2 mM dithiothreitol, 0.2 vol% Triton TM X-100, 10 vol% glycerol] Or the multiple mutant (100 nM) obtained in Example 4 in the presence of 28 ⁇ M poly (rA) ⁇ p (dT) 15 at 52-58 ° C. for a certain time (1, 2, 5, 10 or 15 minutes) Incubation was followed by heat treatment, followed by incubation on ice for 30-60 minutes.
  • WT Comparative Example 1
  • WT was incubated at 48 to 52 ° C. for a predetermined time (1, 2, 5, 10, or 15 minutes) in the presence of 28 ⁇ M poly (rA) ⁇ p (dT) 15. Then, heat treatment was performed, followed by incubation for 30 to 60 minutes on ice.
  • reaction solution [Composition: 25 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 50 mM potassium chloride, 2 mM dithiothreitol, 5 mM magnesium chloride, 12.5 ⁇ M poly (rA) ⁇ p (dT) 15 [p (dT) 15 equivalent concentration], 0.2 mM [methyl- 3 H] dTTP (1.85 Bq / pmol) [manufactured by GE Healthcare]], multiple mutant obtained in Example 3, Example 4 Multiple mutants obtained in the above or WT (comparative example) (10 nM) were incubated at 37 ° C.
  • the glass filter was dried.
  • the glass filter was placed in 2.5 mL of a liquid scintillation reagent (trade name: Ecoscint H, manufactured by National Diagnostics), and the radioactivity was counted. Based on the radioactivity, dTTP uptake was calculated.
  • a liquid scintillation reagent trade name: Ecoscint H, manufactured by National Diagnostics
  • the initial reaction rate was calculated based on the change over time in the dTTP uptake amount.
  • the residual activity was calculated from the initial reaction rate when the heat treatment was not performed (referred to as “initial reaction rate a”) and the initial reaction rate when the heat treatment was performed (referred to as “initial reaction rate b”).
  • the residual activity is represented by the formula (III):
  • Residual activity (initial reaction rate b / initial reaction rate a) ⁇ 100 (III)
  • Test Example 4 the results of examining the relationship between the incubation time and ln [residual activity (%)] are shown in FIG. FIG. 4 shows the results when heat treatment is performed at 52.degree.
  • ln [residual activity (%)] represents a natural value of the residual activity.
  • the initial activity of each of the multiple mutants obtained in Example 3, the multiple mutants obtained in Example 4 and WT is reduced to 50% after 10 minutes incubation.
  • the temperature T 50 required for the calculation was calculated.
  • the temperature T 50 required to reduce the initial activity of each of the multiple mutants obtained in Example 3, the multiple mutants obtained in Example 4 and WT to 50% after 10 minutes incubation is Were estimated to be 45.1, 54.2 and 55.9 ° C., respectively.
  • the activation energy (E a ) of thermal inactivation of the multiple mutant obtained in Example 3, the multiple mutant obtained in Example 4, and WT, respectively. was calculated.
  • the thermal inactivation activation energies (E a ) of the multiple mutant obtained in Example 3, the multiple mutant obtained in Example 4 and the WT were 240, 298 and 322 kJ / mol, respectively. It was estimated that. From these results, it can be seen that the multiple mutant obtained in Example 3 and the multiple mutant obtained in Example 4 are more stable than WT.
  • coli RNA solution (1.0 ⁇ g / ⁇ L), multiple mutants obtained in Example 3, in Example 4 Enzyme solution of the obtained multiple mutant or WT (Comparative Example 1) [Composition of solvent used in enzyme solution: 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.6), 2 mM dithiothreitol, 0.2 vol% Triton TM X-100, 10 volume% glycerol] 2 ⁇ L was added and mixed to prepare 20 ⁇ L of the reaction mixture.
  • RNA 1014 nucleotide RNA corresponding to the DNA sequence 8353-9366 of the cesA gene (Genbank accession number: DQ360825) of Bacillus cereus was prepared by in vitro transcription. Table 5 shows the base sequence and SEQ ID NO of the RV-R26 primer.
  • the obtained reaction mixture was incubated at 46 to 64 ° C. for 30 minutes, and then heated at 95 ° C. for 5 minutes.
  • 3 ⁇ L of the obtained product 18 ⁇ L of water, 10 ⁇ PCR buffer (composition: 500 mM potassium chloride, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 15 mM magnesium chloride) 3 ⁇ L, 10 ⁇ M F5 primer aqueous solution 1 ⁇ L 1 ⁇ L of 10 ⁇ M RV primer aqueous solution, 3 ⁇ L of 2.0 mM dNTP mixture, and 1 ⁇ L of recombinant Taq polymerase solution (manufactured by Toyobo Co., Ltd., 1 U / ⁇ L) were mixed to prepare 30 ⁇ L of a PCR mixture.
  • 10 ⁇ PCR buffer composition: 500 mM potassium chloride, 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 15 mM magnesium chloride
  • PCR was performed using the obtained PCR mixture. PCR was performed by carrying out 30 cycles of reaction at 95 ° C. for 30 seconds, followed by 30 cycles of 95 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 30 seconds.
  • the base sequences and SEQ ID NOs of the F5 primer and RV primer are as shown in Table 5.
  • the obtained amplification products were separated by electrophoresis using a 1.0% by mass agarose gel and stained with ethidium bromide (1 ⁇ g / mL).
  • the results of electrophoresis in Test Example 5 are shown in FIG.
  • the highest temperature at which the multiple mutant obtained in Example 3 and the multiple mutant obtained in Example 4 exhibit cDNA synthesis activity is 60 ° C.
  • WT Comparative Example
  • the highest temperature at which 1) exhibits cDNA synthesis activity is 54 ° C. From these results, it can be seen that the multiple mutant obtained in Example 3 and the multiple mutant obtained in Example 4 show cDNA synthesis activity at a temperature higher than that of WT.
  • Example 5 Among the mutants in which the amino acid residue to be substituted, which is evaluated as AA in Test Example 1, is substituted with another amino acid residue, except for E302K, the three mutants (L435R, D124R) in descending order of remaining activity. And E286R) were selected.
  • Production Example 2 a primer designed to cause substitution of three selected amino acid residues was used in place of the primer designed to cause substitution of amino acid residues shown in Table 1. Except for the above, the same operation as in Production Example 2 was performed to obtain a multiple mutant of MMLV reverse transcriptase (D124R / E286R / L435R). As a result of SDS-PAGE analysis, the obtained multiple mutants were confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • the score of the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the obtained multiple mutant was +11.
  • Example 6 As a site-specific mutagenesis primer, it was designed to cause substitution of three selected amino acid residues and substitution of Asp at position 524 to Ala (D524A) in SEQ ID NO: 2. The same procedure as in Example 5 was performed except that the primers were used, and a multiple mutant of MMLV reverse transcriptase (D124R / E286R / L435R / D524A) was obtained. As a result of SDS-PAGE analysis, the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • the score of the magnitude of the effective charge in the DNA interaction region of the obtained multiple mutant was +11.
  • Example 7 In Example 5, the same operation as in Example 5 was performed, except that a primer designed to cause substitution of two types of amino acid residues, L435R and E286R, was used as a site-specific mutation primer. Multiple mutants of MMLV reverse transcriptase (E286R / L435R) were obtained. As a result of SDS-PAGE analysis, the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • Example 8 In Example 5, as the primer for site-directed mutagenesis, except that a primer designed to generate substitution of two kinds of amino acid residues selected in Example 7 and D524A was used. The same operation was performed to obtain a multiple mutant of MMLV reverse transcriptase (E286R / L435R / D524A). As a result of SDS-PAGE analysis, the obtained multiple mutant was confirmed to show a single band of 75 kDa.
  • Test Example 6 In Test Example 1, the same procedure as in Test Example 1 was carried out except that the multiple mutants obtained in Examples 5 to 8 were used instead of the single mutant obtained in Production Example 2. Was calculated.
  • FIG. 7 shows the results of examining the relationship between the type of multiple mutant and the residual activity of the multiple mutant in the presence of the template primer in Test Example 6. In the figure, 1 is the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 5, 2 is the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 6, and 3 is the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 7. 4 shows the residual activity of the multiple mutant obtained in Example 8.
  • a region related to the interaction with the template primer in wild type MMLV reverse transcriptase (corresponding to the threonine residue at position 24 to the proline residue at position 474 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2). It is understood that a mutant reverse transcriptase having high thermostability can be obtained by substituting at least E286 with a positively charged amino acid residue or a nonpolar amino acid residue in the region).
  • amino acid residues in the DNA interaction region are defined as positively charged amino acid residues or non-charged amino acid residues such that the effective charge magnitude score of the DNA interaction region is greater than the net charge in the WT DNA interaction region. It can be seen that high thermal stability can be ensured by substituting with polar amino acid residues and localizing positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues in the DNA interaction region.
  • mutant reverse transcriptase (mutant reverse transcriptase of the present invention) has a high thermostability, and therefore has a high reverse transcriptase activity even when used for a reaction at a high reaction temperature. Is expressed. Therefore, according to the mutant reverse transcriptase of the present invention, even when the RNA used as the template contains a sequence that easily forms a secondary structure, the reaction temperature during the reverse transcription reaction is set to a high temperature. Thus, formation of secondary structure can be suppressed and reverse transcription can be performed.
  • the mutant reverse transcriptase of the present invention is not limited to the RNA-containing sample to be used and is a highly versatile analytical reagent (for example, reverse transcription reaction kit), a reagent for detecting viruses, bacteria, diseases, etc. It is suggested to be useful as (for example, a detection kit).
  • a highly versatile analytical reagent for example, reverse transcription reaction kit
  • nucleic acid-related enzymes including reverse transcriptase have a nucleic acid interaction region that interacts with nucleic acid (a DNA interaction region in reverse transcriptase). Therefore, as in the case of the mutant reverse transcriptase of the present invention, high thermal stability is ensured by substituting amino acid residues in the nucleic acid interaction region with positively charged amino acid residues or nonpolar amino acid residues. Expected to be able to.
  • Example 1-10x reverse transcriptase buffer [Composition: 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 500 mM potassium chloride, 20 mM dithiothreitol] -2.0 mM dNTP mixture-10 ⁇ M primer aqueous solution-Standard RNA solution (1.6 pg / ⁇ L)
  • Example 1-10x reverse transcriptase buffer [Composition: 250 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3), 500 mM potassium chloride, 20 mM dithiothreitol] -2.0 mM dNTP mixture-10 ⁇ M RV-R26 primer aqueous solution-Standard RNA solution (1.6 pg / ⁇ L) -E. coli RNA solution (1.0 ⁇ g / ⁇ L)
  • SEQ ID NO: 3 is the sequence of the RV-R26 primer.
  • SEQ ID NO: 4 is the sequence of F5 primer.
  • SEQ ID NO: 5 is the sequence of the RV primer.

Abstract

　熱安定性が高く、汎用性が高い変異型逆転写酵素、その核酸及び変異型逆転写酵素の製造方法、汎用性が高い逆転写反応キット及び検出キット、核酸関連酵素の熱安定性を大きく向上させる核酸関連酵素の熱安定性の向上方法並びに効率よく逆転写反応を行なう逆転写方法を提供する。野生型酵素の核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換し、野生型酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させる。

Description

変異型逆転写酵素
　本発明は、変異型逆転写酵素に関する。さらに詳しくは、本発明は、遺伝子解析、疾患などの検査などに有用な、変異型逆転写酵素、それをコードする核酸、前記変異型逆転写酵素を用いる逆転写方法、前記変異型逆転写酵素を含有する逆転写反応キットおよび検出キット、ならびに前記変異型逆転写酵素などの核酸関連酵素の熱安定性の向上方法に関する。
　逆転写酵素は、一般的に、ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成する活性（以下、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）と、ＤＮＡをテンプレートとしてＤＮＡを合成する活性（以下、「ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性」という）と、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド中のＲＮＡ鎖を分解する活性（以下、「ＲＮａｓｅ　Ｈ活性」という）を有している。
　かかる逆転写酵素は、前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有していることから、例えば、生体で発現しているタンパク質のアミノ酸配列を直接反映しているｍＲＮＡの塩基配列の解析、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ＲＴ－ＰＣＲなどの用途に用いられている。かかる用途には、従来、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素またはトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素が用いられている。
　また、ｍＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合、逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成が前記二次構造によって妨げられることから、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することが望まれる。しかしながら、前記モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素およびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素野生型逆転写酵素は、熱安定性が低く、ＲＮＡの二次構造の形成が抑制されるような温度では、失活してしまうことがある。そこで、耐熱性を向上させた逆転写酵素が提案されている（例えば、特許文献１および非特許文献１を参照）。
特表２００４－５１１２１１号公報
バハラム・アレジ（Ｂａｈｒａｍ　Ａｒｅｚｉ）ら、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素の新たな変異は、テンプレート－プライマーへの強力な結合を介して熱安定性を増加させる（Ｎｏｖｅｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｔｙ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｉｇｈｔｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　ｔｅｍｐｌａｔｅ－ｐｒｉｍｅｒ）」、ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００９年発行（オンライン公開日２００８年１２月４日）、第３７巻、ｐｐ．４７３－４８１
　しかしながら、より高い熱安定性を有し、汎用性の高い逆転写反応を行なうことができる逆転写酵素が求められている。
　本発明は、前記従来技術に鑑みてなされたものであり、熱安定性が高く、汎用性が高い変異型逆転写酵素を提供することを目的とする。また、本発明は、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる、核酸および前記変異型逆転写酵素の製造方法を提供することを目的とする。また、本発明は、汎用性が高い逆転写反応キットおよび検出キットを提供することを目的とする。さらに、本発明は、核酸関連酵素の熱安定性を大きく向上させることができる核酸関連酵素の熱安定性の向上方法を提供することを目的とする。また、本発明は、汎用性が高く、効率よく逆転写反応を行なうことができる逆転写方法を提供することを目的とする。
　すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕　野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基の正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基への置換を有しており、前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有しており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素、
〔２〕　前記野生型逆転写酵素が、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなり、
　前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域中に局在するアミノ酸残基である、前記〔１〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔３〕　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域中にアミノ酸残基の保存的置換を有する、前記〔２〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔４〕　（Ａ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
（Ｂ）配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ　Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　１）、Ｅｘｐｅｃｔ　１０、Ｗｏｒｄ　Ｓｉｚｅ　３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔２〕または〔３〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔５〕　配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかが、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されている、前記〔２〕～〔４〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素、
〔６〕　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の少なくとも２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素、
〔７〕　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２中のアミノ酸残基：
６９位のグルタミン酸残基、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基、３０２位のグルタミン酸残基、３１３位のトリプトファン残基、４３５位のロイシン残基および４５４位のアスパラギン残基
の少なくとも１つに対応する残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており（ただし、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換を除く）、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素、
〔８〕　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ）～（ｉ）：
（ａ）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
（ｃ）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｄ）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｅ）配列番号：２の６９位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｆ）配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｇ）配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
（ｈ）配列番号：２の３１３位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｉ）配列番号：２の４５４位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素、
〔９〕　（Ｉ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ－１）～（ｃ－１）：
（ａ－１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ－１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ－１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、または
（ＩＩ）前記（Ｉ）のアミノ酸配列において、（ｄ－１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔８〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔１０〕　前記（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列において、
（ｅ－１）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、前記〔９〕に記載の変異型逆転写酵素、
〔１１〕　前記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸、
〔１２〕　前記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
　前記〔１１〕に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
　前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む、変異型逆転写酵素の製造方法、
〔１３〕　前記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法、
〔１４〕　逆転写反応を行なうためのキットであって、
　前記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット、
〔１５〕　生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、
　前記〔１〕～〔１０〕のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット、
〔１６〕　核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素の熱安定性を向上させる方法であって、
　野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の前記核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対して、前記核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入して、前記野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させることを特徴とする、核酸関連酵素の熱安定性の向上方法、ならびに
〔１７〕　前記核酸関連酵素が逆転写酵素である、前記〔１６〕に記載の方法
に関する。
　本発明の変異型逆転写酵素は、熱安定性が高く、汎用性が高いという優れた性質を有する。また、本発明の核酸および本発明の変異型逆転写酵素の製造方法によれば、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる。また、本発明の逆転写反応キットおよび検出キットは、汎用性が高いという優れた性質を有する。さらに、本発明の核酸関連酵素の熱安定性の向上方法によれば、核酸関連酵素の熱安定性を大きく向上させることができる。また、本発明の逆転写方法は、汎用性が高く、当該方法によれば、効率よく逆転写反応を行なうことができる。
製造例２で選択された置換対象のアミノ酸残基の野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素中における局在位置を示すリボンモデル図である。 試験例１において、アミノ酸残基の置換の種類と残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例２において、多重変異体の種類と残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例４において、インキュベーション時間とｌｎ［残存活性（％）］との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例４において、温度とｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］との関係を調べた結果を示すグラフである。 試験例５において、電気泳動を行なった結果を示す図面代用写真である。 試験例６において、多重変異体の種類とテンプレートプライマー存在下での多重変異体の残存活性との関係を調べた結果を示すグラフである。
　本発明者らは、逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域に正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基を導入して導入前の逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも正の実効電荷を大きくすることにより、逆転写酵素の熱安定性が大きく向上することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。
１．変異型逆転写酵素
　本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有しており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴としている。
　本発明の変異型逆転写酵素は、前記ＤＮＡ相互作用領域を有するので、高い熱安定性を発現する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素によれば、高い反応温度でも逆転写反応を行なうことができるので、ＲＮＡが二次構造を形成しやすい塩基配列を有する場合であっても、反応温度を高くすることによって二次構造の形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。したがって、当該変異型逆転写酵素によれば、汎用性の高い逆転写反応を行なうことができる。
　なお、本明細書において、「野生型逆転写酵素」とは、人為的に変異が導入されていない逆転写酵素をいう（以下、「ＷＴＲＴ」ともいう）。前記ＷＴＲＴとしては、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなる逆転写酵素などが挙げられる。ここで、「配列番号：２に対応するアミノ酸配列」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）および前記配列番号：２に示されるアミノ酸配列からなる逆転写酵素のオルソログ（例えば、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス逆転写酵素など）のアミノ酸配列をいう。
　また、本明細書において、「変異型逆転写酵素」とは、人為的に変異が導入された逆転写酵素をいう。さらに、「モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素」を、「ＭＭＬＶ逆転写酵素」と表すこともある。
　さらに、本明細書において、「ＤＮＡ相互作用領域」とは、逆転写酵素中において、ＤＮＡとの間で相互作用を生じるアミノ酸残基が局在する領域をいう。
　また、本明細書において、「野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する」とは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨ６．０～９．５）において、野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の正の実効電荷よりも大きいことを意味する。
　実効電荷の大きさは、例えば、正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「－１」とした場合、ＤＮＡ相互作用領域中のリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの数に基づいて、式（Ｉ）：
実効電荷の大きさのスコア
　　＝（＋１×ｋ）＋（＋１×ｒ）＋（－１×ｄ）＋（－１×ｅ）　　　　　（Ｉ）
（式中、ｋはリジン残基の数、ｒはアルギニン残基の数、ｄはアスパラギン酸残基の数、およびｅはグルタミン酸残基の数を示す。）
を用いて算出することができる。
　本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域には、前記式（Ｉ）を用いて算出された実効電荷の大きさのスコアが野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷のスコア（＋７）よりも大きくなるように、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基が局在していることが望ましい。本発明の変異型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさのスコアは、高い熱安定性を確保し、かつ高い比活性を確保する観点から、通常、＋８～＋１３、好ましくは＋９～＋１３、より好ましくは＋１１～＋１３であればよい。
　前記正電荷アミノ酸残基としては、例えば、アルギニン残基、リジン残基、ヒスチジン残基などが挙げられる。これらのなかでは、逆転写反応を行なうに適したｐＨ（例えば、ｐＨ６．０～９．５）において、正に荷電しており、かかるｐＨ条件下で高い熱安定性を確保することができることから、好ましくはアルギニン残基およびリジン残基である。
　前記非極性アミノ酸残基としては、例えば、アラニン残基、グリシン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、システイン残基、トリプトファン残基、フェニルアラニン残基、プロリン残基などが挙げられる。これらのなかでは、側鎖のサイズが小さく、かつ置換によりもたらされる形状の変化が小さいと考えられていることから、好ましくはアラニン残基である。
　前記逆転写酵素活性は、下記ステップ（１）～（６）を行なうことによって測定することができる。
（１）　反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15（ｐ（ｄＴ）15換算濃度）、および０．２ｍＭ　［メチル－3Ｈ］ｄＴＴＰ〕中で逆転写酵素を３７℃でインキュベーションするステップ、
（２）　前記ステップ（１）で得られた産物２０μＬを採取し、ガラスフィルターにスポットするステップ、
（３）　前記ステップ（２）後のガラスフィルターを、冷却された５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した後、冷却された９５体積％エタノール水溶液で洗浄する操作を３回繰り返して、前記ガラスフィルター上の産物からポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去するステップ、
（４）　前記ステップ（３）後のガラスフィルターを乾燥させた後、前記ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントするステップ、
（５）　前記ステップ（４）で得られた放射活性に基づいて、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（以下、「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出するステップ、および
（６）　前記ステップ（５）で算出されたｄＴＴＰ取り込み量に基づいて、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量を求めるステップ。
　本発明においては、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、ＷＴＲＴが、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなり、ＷＴＲＴのＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域（以下、「領域T24-P474」ともいう）中に局在するアミノ酸残基であることが好ましい。前記領域T24-P474のなかでは、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、配列番号：２の６０位のセリン残基～８４位のグルタミン残基に対応する領域（以下、「領域S60-Q84」ともいう）、９５位のアスパラギン残基～１５７位のシステイン残基に対応する領域（以下、「領域N95-C157」ともいう）、１９０位のグルタミン残基～１９４位のアスパラギン残基に対応する領域（以下、「領域Q190-N194」ともいう）、２２０位のロイシン残基～２３３位のグルタミン酸残基に対応する領域（以下、「領域L220-E233」ともいう）、２５７位のリジン残基～２７５位のグルタミン酸残基に対応する領域（以下、「領域K257-E275」ともいう）、２８０位のロイシン残基～２８７位のスレオニン残基に対応する領域（以下、「領域L280-T287」ともいう）、３０１位のアルギニン残基～３３３位のロイシン残基に対応する領域（以下、「領域R301-L333」ともいう）、３５４位のアラニン残基～３７３位のリジン残基に対応する領域（以下、「領域A354-K373」ともいう）、３９４位のチロシン残基～４３６位のアラニン残基に対応する領域（以下、「領域Y394-A436」ともいう）および４５３位のセリン残基～４６２位のアラニン残基に対応する領域（以下、「領域S453-A462」ともいう）が好ましい。
　本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の目的を妨げない範囲で、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、前記領域T24-P474中にアミノ酸残基の保存的置換を有していてもよい。前記保存的置換としては、例えば、特定のアミノ酸残基と、疎水性、電荷、ｐＫａ、立体構造上における特徴などの点で当該特定のアミノ酸残基に類似した機能を発揮するアミノ酸残基との置換などが挙げられる。前記保存的置換としては、より具体的には、例えば、下記グループＩ～ＶＩのいずれかに属する１つのアミノ酸残基を同じグループに属する他のアミノ酸残基に置換することなどが挙げられる。
　グループＩ：グリシン残基およびアラニン残基
　グループＩＩ：バリン残基、イソロイシン残基およびロイシン残基
　グループＩＩＩ：アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基およびグルタミン残基
　グループＩＶ：セリン残基およびスレオニン残基
　グループＶ：リジン残基およびアルギニン残基
　グループＶＩ：フェニルアラニン残基およびチロシン残基
　また、本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の目的を妨げない範囲で、
（Ａ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
（Ｂ）配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ　Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　１）、Ｅｘｐｅｃｔ　１０、Ｗｏｒｄ　Ｓｉｚｅ　３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す酵素であってもよい。
　「１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加」は、逆転写酵素活性を示すポリペプチドが得られる範囲の個数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加を意味する。「１または数個」とは、具体的には、１～３０個、好ましくは１～２０個、さらに好ましくは１～１０個、より好ましくは１～３個をいう。
　前記配列同一性は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ　Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　１）、Ｅｘｐｅｃｔ　１０、Ｗｏｒｄ　Ｓｉｚｅ　３の条件でアラインメントして算出した値として、８０％以上であり、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは１００％である。
　本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保する観点から、前記領域T24-P474に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかが、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されていることが好ましい。
　前記負電荷アミノ酸残基としては、例えば、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基が挙げられる。かかる負電荷アミノ酸残基は、ＷＴＲＴのアミノ酸配列において、当該負電荷アミノ酸残基が前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されたポリペプチドが逆転写酵素活性を発現することができるのであれば、形状の変化をもたらす位置に存在する残基であってもよい。
　本発明の変異型逆転写酵素は、高い熱安定性を確保し、かつ十分な比活性を確保する観点から、前記負電荷アミノ酸残基として、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の少なくとも２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
　また、本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の目的を妨げない範囲で、前記領域T24-P474に局在するアミノ酸残基のうち、２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基以外の負電荷アミノ酸残基および／または他のアミノ酸残基が、前記正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されていてもよい。本発明の変異型逆転写酵素は、具体的には、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２中のアミノ酸残基：６９位のグルタミン酸残基、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基、３０２位のグルタミン酸残基、３１３位のトリプトファン残基、４３５位のロイシン残基および４５４位のアスパラギン残基の少なくとも１つに対応する残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示す酵素であってもよい。なお、この場合、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換は、ＷＴＲＴよりも熱安定性を向上させることができるが、より高い熱安定性を確保する観点から、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換は除かれる。
　本発明の変異型逆転写酵素は、より高い熱安定性を確保する観点から、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ）～（ｉ）：
（ａ）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｂ）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
（ｃ）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｄ）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｅ）配列番号：２の６９位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｆ）配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
（ｇ）配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
（ｈ）配列番号：２の３１３位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
（ｉ）配列番号：２の４５４位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも１つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
　本発明の変異型逆転写酵素は、前記（ａ）～（ｉ）のアミノ酸残基の置換のなかから選択された１つの変異を有する場合（すなわち、単独変異体である場合）、より高い熱安定性を確保する観点から、配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、
（ａ－１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ－１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ－１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、および
（ｄ－１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
のいずれかを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
　本発明の変異型逆転写酵素は、前記（ａ）～（ｉ）のアミノ酸残基の置換のなかから選択された複数種の変異を有する場合（すなわち、多重変異体である場合）、より高い熱安定性を確保する観点から、
（Ｉ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ－１）～（ｃ－１）：
（ａ－１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
（ｂ－１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
（ｃ－１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、または
（ＩＩ）前記（Ｉ）のアミノ酸配列において、（ｄ－１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことが好ましい。
　なお、逆転写酵素として、ＲＮａｓｅ　Ｈ活性を有しない逆転写酵素が望まれる場合、本発明の変異型逆転写酵素は、前記（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列において、（ｅ－１）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示すものであればよい。
２．変異型逆転写酵素をコードする核酸
　本発明の核酸は、本発明の変異型逆転写酵素をコードする核酸である。本発明の核酸は、前記変異型逆転写酵素をコードしているため、当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより、前記変異型逆転写酵素を容易に得ることができる。
　核酸としては、例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　本発明の核酸は、例えば、ＷＴＲＴをコードする核酸に対して、ＷＴＲＴのＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように部位特異的変異を導入することにより得ることができる。
　核酸への部位特異的変異の導入は、例えば、ＷＴＲＴのＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように設計されたプライマーを用いたＰＣＲなどにより行なうことができる。
３．変異型逆転写酵素の製造方法
　本発明の変異型逆転写酵素は、本発明の核酸を用いて当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させることにより得ることができる。本発明には、かかる変異型逆転写酵素の製造方法も包含される。
　本発明の製造方法は、前述した変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
（ｉ）　本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
（ｉｉ）　前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む方法である。
　まず、本発明の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る〔「工程（ｉ）」〕。
　前記核酸を保持する細胞は、例えば、前記核酸を含む遺伝子導入用担体を用いて宿主細胞を形質転換することなどにより得られる。
　前記宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの細菌の細胞、昆虫細胞、酵母細胞、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。これらのなかでは、変異型逆転写酵素の精製が容易であり、変異型逆転写酵素を大量に生産することができることから、好ましくは細菌の細胞、より好ましくは大腸菌の細胞である。前記大腸菌の細胞としては、例えば、ＢＬ２１（ＤＥ３）などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記遺伝子導入用担体は、生物担体であってもよく、非生物担体であってもよい。生物担体としては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクターなどのベクターが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。また、非生物担体としては、例えば、金粒子、デキストラン、リポソームなどが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。かかる遺伝子導入用担体は、用いられる宿主細胞に応じて、適宜選択することができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、遺伝子導入用担体として、プラスミドベクターまたはファージベクターを用いることができる。宿主細胞が大腸菌であるＢＬ２１（ＤＥ３）である場合、ｐＥＴ系プラスミドベクターを用いることができる。この場合、変異型逆転写酵素を大量に発現させることができ、しかも変異型逆転写酵素を容易に精製することができる。
　前記ベクターは、変異型逆転写酵素の精製をより容易にするためのエレメント、例えば、細胞外分泌シグナル、Ｈｉｓタグなどを含有していてもよい。
　前記遺伝子導入用担体が、前記生物担体であるプラスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターである場合、当該遺伝子導入用担体は、プラスミドベクター、ファージベクターまたはウイルスベクターのクローニングサイトに前記核酸を挿入し、プロモーターの制御下に作動可能に連結させることにより作製することができる。なお、本明細書において、「作動可能に連結」とは、核酸によりコードされるポリペプチドの発現が、プロモーターなどのエレメントによる制御下に生物学的活性を示す状態で発現するように連結されていることを意味する。
　一方、前記遺伝子導入用担体が、前記非生物担体である場合、当該遺伝子導入用担体は、必要に応じて、前記核酸を、プロモーターの制御下に作動可能に連結させて得られた核酸構築物を、当該非生物担体に担持させることにより作製することができる。なお、かかる核酸構築物は、複製開始起点、ターミネーターなどの遺伝子の発現に必要なエレメントを適宜含有してもよい。
　形質転換は、用いられた遺伝子導入用担体の種類に応じた形質転換法で行なうことができる。かかる形質転換法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、パーティクルガン法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
　前記工程（ｉ）において、前記核酸を保持する細胞の培養条件は、用いられた宿主細胞の種類などに応じて適宜設定することができる。前記核酸が誘導可能なプロモーターの制御下に作動可能に連結されている場合、かかるプロモーターの種類に応じた発現誘導条件下に、前記核酸を保持する細胞を培養すればよい。
　つぎに、前記工程（ｉ）で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する〔「工程（ｉｉ）」〕。
　変異型逆転写酵素が細胞内に蓄積される場合、工程（ｉｉ）において、培養物を遠心分離などに供して細胞を回収し、細胞から変異型逆転写酵素を単離すればよい。この場合、例えば、前記細胞を超音波破砕法、溶菌法、凍結破砕法などによって破砕し、得られた細胞抽出液を遠心分離、超遠心分離、限外濾過、塩析、透析、イオン交換カラムクロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーなどに供することにより、変異型逆転写酵素を単離することができる。
　一方、変異型逆転写酵素が細胞外に分泌される場合、培養物を遠心分離や濾過などに供して培養上清を回収し、培養上清から変異型逆転写酵素を単離すればよい。
４．逆転写方法
　本発明の逆転写方法は、本発明の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴としている。本発明の変異型逆転写酵素は、野生型逆転写酵素の熱安定性と比べて高い熱安定性を有している。そのため、本発明の逆転写方法によれば、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲で逆転写反応を行なうことができる。したがって、本発明の逆転写方法は、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができ、汎用性が高い。
　本発明の逆転写方法では、前記変異型逆転写酵素と、ＲＮＡと、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーと、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを、逆転写反応用緩衝液中でインキュベーションすることにより逆転写反応を行なうことができる。
　逆転写反応における反応温度は、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などによって異なるため、用いられるＲＮＡの種類、用いられる変異型逆転写酵素の種類などに応じて適宜設定することが好ましい。前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡがＷＴに適した反応温度で二次構造を形成しにくいＲＮＡである場合、３７～４５℃となるように設定することができる。また、前記反応温度は、例えば、用いられるＲＮＡがＷＴに適した反応温度で二次構造を形成しやすいＲＮＡである場合、ＷＴに適した反応温度よりも高い温度、例えば、４５～６０℃となるように設定することができる。
　逆転写反応の際の反応系中における逆転写酵素の濃度は、本発明の逆転写方法の用途に応じて異なるため、前記用途に応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写酵素の濃度は、通常、好ましくは０．００１～０．１μＭである。
　逆転写反応の際の反応系中におけるオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、通常、好ましくは０．１～１０μＭである。
　逆転写反応の際の反応系中における４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて異なるため、標的となるＲＮＡの濃度や長さなどに応じて適宜設定することが好ましい。前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度は、通常、好ましくは０．０１～１μＭである。
　前記逆転写反応用緩衝液は、用いられる変異型逆転写酵素の種類に応じて、適宜選択することができる。前記逆転写反応用緩衝液は、２価の陽イオン、例えば、マグネシウムイオン、マンガンイオンなどを含有してもよい。また、前記逆転写反応用緩衝液は、本発明の目的を妨げない範囲で、必要に応じて、還元剤（例えば、ジチオスレイトールなど）、安定化剤（例えば、グリセロール、トレハロースなど）、有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ホルムアミドなど）などの成分を含有していてもよい。
　前記逆転写反応用緩衝液中における２価の陽イオンの濃度は、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なるため、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記２価の陽イオンの濃度は、通常、１～３０ｍＭである。
　前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて異なるため、逆転写酵素の種類や逆転写反応用緩衝液に含まれる他の成分などに応じて適宜設定することが好ましい。前記逆転写反応用緩衝液のｐＨは、通常、６．０～９．５である。
５．逆転写反応キット
　本発明の逆転写反応キットは、逆転写反応を行なうためのキットであって、本発明の変異型逆転写酵素を含有することを特徴としている。本発明の逆転写反応キットは、高い熱安定性を有する本発明の変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の逆転写反応キットは、ＲＮＡの種類によらず、逆転写反応を効率よく行なうことができるので、汎用性が高い。
　本発明の逆転写反応キットは、前記変異型逆転写酵素に加えて、逆転写反応を行なうのに必要な試薬を含有していてもよい。かかる試薬としては、例えば、逆転写反応のテンプレートとして用いられるＲＮＡ、前記ＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒などが挙げられる。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
　本発明の逆転写反応キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液としては、前記変異型逆転写酵素のｐＨ安定性に応じたｐＨを有する緩衝液が挙げられる。
　また、前記逆転写反応を行なうのに必要な試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、前記試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。これにより、ユーザーが、各試薬を逆転写反応に適した量となるように混合する必要がなくなるので、取り扱いが容易である。
６．検出キット
　本発明の検出キットは、生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、前記変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴としている。本発明の検出キットは、高い熱安定性を有する前記変異型逆転写酵素を含有しているため、ＲＮＡの二次構造の形成を抑制するのに十分な高い温度を含む幅広い温度範囲での逆転写反応に好適である。したがって、本発明の検出キットは、種々の試料に対して用いることができ、汎用性が高い。
　前記マーカーとしては、生体中に含まれるウイルスまたは細菌に特有の塩基配列、疾患に特有の塩基配列を有するＲＮＡなどが挙げられる。なお、本明細書において、「ウイルスまたは細菌に特有の塩基配列」とは、ウイルスまたは細菌には存在するが、生体には存在しない塩基配列をいう。また、「疾患に特有の塩基配列」とは、疾患に罹患した生体には存在するが、疾患に罹患していない正常な生体には存在しない塩基配列をいう。
　前記ウイルスとしては、特に限定されないが、例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、ＨＣＶ、ノロウイルス、ウエストナイルウイルスなどが挙げられる。また、前記細菌としては、例えば、食中毒の原因となるバチルス・セレウス、サルモネラ、腸管出血性大腸菌、ビブリオ、カンピロバクター、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌などが挙げられる。前記疾患としては、癌、糖尿病、心臓病、高血圧、感染症などが挙げられる。
　前記マーカーの検出用試薬としては、例えば、前記マーカーとなるＲＮＡに相補的であり、かつ蛍光物質または放射性物質が結合したプローブ、二本鎖核酸に特異的にインターカレートする蛍光物質（例えば、エチジウムブロマイドなど）などが挙げられる。
　本発明の検出キットは、前記変異型逆転写酵素および前記マーカーの検出用試薬に加えて、例えば、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液、有機溶媒、陽性標準となるＲＮＡ、陰性標準となるＲＮＡなどを含有していてもよい。なお、前記逆転写反応用緩衝液は、前記逆転写方法で用いられる逆転写反応用緩衝液と同様である。
　本発明の検出キットにおいて、前記変異型逆転写酵素は、グリセロール、トレハロースなどの安定化剤を含む保存用緩衝液が入った容器中に封入されていてもよい。かかる保存用緩衝液は、前記逆転写反応キットにおける保存用緩衝液と同様である。
　また、前記４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、逆転写反応用緩衝液などの試薬は、変異型逆転写酵素が入った容器とは異なる容器中に封入されていてもよく、また、かかる試薬の保存中における逆転写反応の進行が停止されているのであれば、前記変異型逆転写酵素と同じ容器に封入されていてもよい。前記試薬は、前記逆転写反応キットの場合と同様の観点から、逆転写反応を行なうのに適した量となるように容器に封入されていてもよい。
７．核酸関連酵素の熱安定性の向上方法
　本発明の核酸関連酵素の熱安定性の向上方法は、核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素の熱安定性を向上させる方法であって、
　野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の前記核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対して、前記核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入して、前記野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させることを特徴としている。
　核酸関連酵素は、核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有している。したがって、本発明の変異型逆転写酵素の場合と同様に、核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることが期待される。
　前記核酸関連酵素は、核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する酵素であればよい。前記核酸関連酵素としては、例えば、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、テロメラーゼなどが挙げられる。なかでも、熱安定性をより一層向上させることができることから、逆転写酵素が好ましい。
　野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対する前記変異の導入は、野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域中のアミノ酸残基が正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されるように設計されたプライマーを用いたＰＣＲなどにより行なうことができる。
　なお、変異の対象となるアミノ酸残基の位置は、核酸関連酵素の種類に応じて異なるが、核酸関連酵素の核酸相互作用領域中において、核酸のリン酸基と近接し、かつ核酸関連酵素の活性を妨げる形状の変化をもたらさないアミノ酸残基の位置、逆転写酵素の負電荷を有するアミノ酸残基と近接し、かつ核酸関連酵素の活性を妨げる形状の変化をもたらさないアミノ酸残基の位置などが挙げられる。
　熱安定性が向上した核酸関連酵素は、変異が導入された核酸を用い、前記変異型逆転写酵素の製造方法と同様の手法により製造することができる。
　以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、かかる実施例のみに限定されるものではない。
（製造例１）
　野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素（以下、単に、「ＷＴ」ともいう）をコードするＤＮＡ（配列番号：１）をｐＥＴ－２２ｂ（＋）プラスミドに挿入して、発現プラスミドｐＥＴ－ＭＲＴを得た。
　得られたプラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。得られた細胞を、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス中、３０℃で培養して、形質転換細胞を得た。
　つぎに、５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬブロス３ｍＬに、形質転換細胞を播種し、振盪しながら３０℃で１６時間インキュベーションした。その後、前記形質転換細胞を自動誘導システム〔ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製、商品名：Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ〕で培養することにより、タンパク質を発現させた。
　得られた培養物に、タンパク質精製システム〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＨｉｓＬｉｎｋ　Ｓｐｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ〕に含まれる菌体溶解用試薬〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＦａｓｔＢｒｅａｋ　Ｃｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ〕を添加して前記形質転換細胞を溶解させた。つぎに、得られた溶解物に、前記タンパク質精製システムに含まれるタンパク質精製用レジン〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＨｉｓＬｉｎｋ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅｓｉｎ〕を添加した。
　その後、前記レジンを含む溶解物をカラム〔プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製、商品名：ＨｉｓＬｉｎｋ　Ｓｐｉｎ　Ｃｏｌｕｍｎ〕に移した。その後、カラム中のレジンを洗浄して未結合のタンパク質などを除去した。つぎに、溶出緩衝液〔組成、１００ｍＭヘペス－水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）、５００ｍＭイミダゾール〕０．２ｍＬを用いて前記カラムに吸着したタンパク質を溶出し、ＷＴを含む画分を回収した。
　得られたＷＴは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　なお、ＷＴのＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさは、正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「－１」とし、前記式（Ｉ）にしたがって算出した場合、＋７である。
（製造例２）
（１）変異のデザイン
　ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域）中の負電荷アミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基（リジン残基もしくはアルギニン残基）または非極性アミノ酸残基（アラニン残基）に置換するために、部位特異的変異用プライマーをデザインした。
　置換対象のアミノ酸残基（負電荷アミノ酸残基）として、前記領域のｆｉｎｇｅｒｓドメインに局在する７つの残基（Ｇｌｕ６９、Ｇｌｎ８４、Ａｓｐ１０８、Ａｓｐ１１４、Ｇｌｕ１１７、Ｇｌｕ１２３およびＡｓｐ１２４）、ｔｈｕｍｂドメインに局在する３つの残基（Ｇｌｕ２８６、Ｇｌｕ３０２およびＴｒｐ３１３）およびｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎドメインに局在する２つの残基（Ｌｅｕ４３５およびＡｓｎ４５４）を選択した。製造例２で選択された置換対象のアミノ酸残基の野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素中における局在位置を図１に示す。
　前記部位特異的変異用プライマーは、表１に示されるアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）ＭＭＬＶ逆転写酵素の単独変異体の調製
　前記ｐＥＴ－ＭＲＴと、部位特異的変異用プライマーと、部位特異的変異用キット〔ストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)社製、商品名：ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅTM　ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ〕とを用い、ｐＥＴ－ＭＲＴ上のＷＴをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入した。なお、得られた変異体発現用プラスミドに含まれるＤＮＡに変異が導入されたかどうかを、ＤＮＡシークエンサー〔（株）島津製作所製、商品名：ＤＳＱ－２０００〕によって確認した。
　つぎに、製造例１において、ｐＥＴ－ＭＲＴの代わりに、前記変異体発現用プラスミドを用いたことを除き、製造例１と同様の操作を行ない、実験番号：１～３６の単独変異体を得た。得られた単独変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、いずれも、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
（試験例１）
　インキュベーション用溶液〔組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM　Ｘ－１００および１０体積％グリセロール〕中、製造例１で得られたＷＴ（１００ｎＭ）または製造例２で得られた単独変異体（１００ｎＭ）を２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15の存在下または非存在下に５０℃で１５分間インキュベーションして熱処理を行なった。その後、前記ＷＴまたは前記単独変異体を氷上で３０～６０分間インキュベーションした。
　つぎに、反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ　［メチル－3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕〕中、１０ｎＭ　ＷＴまたは単独変異体を３７℃でインキュベーションした。
　一定時間（２．５、５．０または７．５分間）インキュベーション後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回繰り返した。
　その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ　Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれた[3Ｈ]ｄＴＴＰの量（「ｄＴＴＰ取り込み量」という）を算出した。
　前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて、初期反応速度を算出した。つぎに、熱処理を行なっていない場合の初期反応速度（「初期反応速度Ａ」という）と、熱処理を行なった場合の初期反応速度（「初期反応速度Ｂ」という）とから、残存活性を算出した。前記残存活性は、式（ＩＩ）：
　残存活性（％）＝（初期反応速度Ｂ／初期反応速度Ａ）×１００　　（ＩＩ）
を用いて算出した。
　既知量のウシ血清アルブミンの標品と、タンパク質定量試薬〔ナカライテスク（株）製、商品名：Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　ＣＢＢ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ〕とを用いてブラッドフォード法に準じて作成された検量線に基づいて、ＷＴおよび実験番号：１～３６の単独変異体それぞれの量を調べた。つぎに、熱処理を行なっていない場合のＷＴおよび実験番号：１～３６の単独変異体それぞれのｄＴＴＰ取り込み量に基づいて、逆転写酵素活性を測定した。なお、逆転写酵素活性における１ユニットは、１０分間にポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを取り込ませる逆転写酵素の量として定義した。その後、ＷＴおよび実験番号：１～３６の逆転写酵素活性それぞれと、ＷＴおよび実験番号：１～３６の単独変異体それぞれの量とから、比活性を算出した。
　前記ＷＴおよび実験番号：１～３６の単独変異体それぞれの残存活性および比活性に基づいて、置換対象のアミノ酸残基が、部位特異的変異を導入することによってＷＴよりも高い熱安定性をもたらす残基であるかどうかを評価した。評価基準を表２に示し、その評価結果を表３に示す。また、試験例１において、アミノ酸残基の置換の種類と残存活性との関係を調べた結果を図２に示す。図２には、ＷＴおよび単独変異体の代表例の残存活性を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３に示された結果から、置換対象のアミノ酸残基のうち、Ｅ６９、Ｄ１０８、Ｅ１１７、Ｄ１２４、Ｅ２８６、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５またはＮ４５４に部位特異的変異が導入された単独変異体の残存活性が、ＷＴの残存活性と比べて高いことがわかる。したがって、配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、Ｅ６９、Ｄ１０８、Ｅ１１７、Ｄ１２４、Ｅ２８６、Ｅ３０２、Ｗ３１３、Ｌ４３５またはＮ４５４に対応するアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、ＷＴと比べて、熱安定性を向上させることができることがわかる。
　さらに、図２に示された結果から、Ｅ２８６に部位特異的変異が導入された３種類の単独変異体のうち２つの単独変異体それぞれの残存活性が１５％を超えていることがわかる。また、Ｄ１２４に部位特異的変異が導入された３種類の単独変異体のうち２種類の単独変異体それぞれの残存活性が１５％を超えていることがわかる。
　これらの結果から、ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、アミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入することにより、高い熱安定性を確保することができる確率が高いことがわかる。
（実施例１）
　試験例１で評価された置換対象のアミノ酸残基のなかから、評価がＡＡである置換対象のアミノ酸残基を選択した。つぎに、選択されたアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体のなかから、残存活性が高い順に、４種類の変異体（Ｅ３０２Ｋ、Ｌ４３５Ｒ、Ｄ１２４ＲおよびＥ２８６Ｒ）を選択した。
　製造例２において、表１に示されるアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　正電荷アミノ酸残基であるリジン残基およびアルギニン残基それぞれの電荷スコアを「＋１」、負電荷アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの電荷スコアを「－１」とし、ＤＮＡ相互作用領域中のリジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基それぞれの数に基づいて、前記式（Ｉ）を用いて、多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアを算出した。その結果、得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１３であった。
（実施例２）
　実施例１において、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、実施例１で選択された４種類のアミノ酸残基の置換と配列番号：２における５２４位のＡｓｐのＡｌａへの置換（Ｄ５２４Ａ）とが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。なお、配列番号：２における５２４位のＡｓｐは、ＷＴのＲＮａｓｅ　Ｈ反応の活性部位に位置し、触媒活性に必須のアミノ酸残基である。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１３であった。
（実施例３）
　実施例１で選択された４種類のアミノ酸残基の置換のなかから、Ｅ３０２Ｋ、Ｌ４３５ＲおよびＥ２８６Ｒの３種類のアミノ酸残基の置換を選択した。つぎに、実施例１において、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、前記３種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
（実施例４）
　実施例１において、選択された４種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、実施例３で選択された３種類のアミノ酸残基の置換とＤ５２４Ａとが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例１と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｅ３０２Ｋ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
（試験例２）
　試験例１において、製造例２で得られた単独変異体の代わりに、実施例１～４で得られた多重変異体を用いたことを除き、試験例１と同様の操作を行ない、残存活性を算出した。試験例２において、多重変異体の種類と残存活性との関係を調べた結果を図３に示す。図中、１は実施例１で得られた多重変異体の残存活性、２は実施例２で得られた多重変異体の残存活性、３は実施例３で得られた多重変異体の残存活性、４は実施例４で得られた多重変異体の残存活性を示す。また、図中、白バーはテンプレートプライマー非存在下での多重変異体の残存活性、黒バーはテンプレートプライマー存在下での多重変異体の残存活性を示す。
　図３に示された結果から、実施例１～４それぞれで得られた多重変異体は、ＷＴと比べて、熱安定性が著しく高いことがわかる。したがって、ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、少なくともＥ２８６を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
　また、実施例１～４それぞれで得られた多重変異体の前記領域の実効電荷の大きさのスコアは、＋１１～＋１３であり、ＷＴの前記領域の実効電荷の大きさのスコア（＋７）よりも大きい。したがって、かかる結果から、ＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさのスコアが、ＷＴのＤＮＡ相互作用領域における実効電荷よりも大きくなるように、ＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換し、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基をＤＮＡ相互作用領域に局在させることにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
（試験例３）
　反応液〔組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、０～２５μＭの範囲の濃度のポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ　［メチル－3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕〕中、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体またはＷＴ（比較例１）（５ｎＭ）を３７℃でインキュベーションした。
　一定時間（２．５、５．０または７．５分間）インキュベーション後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回繰り返した。
　その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ　Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ｄＴＴＰ取り込み量を算出した。前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて、初期反応速度を算出した。
　つぎに、基質〔ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〕濃度、初期反応速度およびグラフ作成ソフトウェア〔シナジー・ソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ）製、商品名：Ｋａｌｅｉｄａ　Ｇｒａｐｈ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　３．５〕を用い、ミカエリス－メンテンの速度式に基づいて非線形最小２乗回帰法にしたがって、ｋcat値、Ｋm値およびｋcat／Ｋm値を算出した。実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴ（比較例１）それぞれのｋcat値、Ｋm値およびｋcat／Ｋm値を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体のＫm値は、それぞれ、ＷＴのＫm値の３０％および４０％であることがわかる。これらの結果から、テンプレートプライマーに対する実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体の親和性が、テンプレートプライマーに対するＷＴの親和性よりも高いことが示唆される。
　一方、表４に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体のそれぞれのｋcat値は、それぞれ、ＷＴのｋcat値の４０％および５０％であることがわかる。
　さらに、表４に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体のｋcat／Ｋm値は、ＷＴのｋcat／Ｋm値の１７０％および１３０％であることがわかる。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体の触媒効率は、ＷＴの触媒効率よりも高いことが示唆される。
（試験例４）
　インキュベーション用溶液〔組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM　Ｘ－１００、１０体積％グリセロール〕中、実施例３で得られた多重変異体または実施例４で得られた多重変異体（１００ｎＭ）を２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15の存在下に５２～５８℃で一定時間（１、２、５、１０または１５分間）インキュベーションして熱処理を行ない、その後、氷上で３０～６０分間インキュベーションした。
　一方、前記インキュベーション用溶液中、ＷＴ（比較例１）を２８μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15の存在下に４８～５２℃で一定時間（１、２、５、１０または１５分間）インキュベーションして熱処理を行ない、その後、氷上で３０～６０分間インキュベーションした。
　つぎに、反応液［組成：２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、２ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ塩化マグネシウム、１２．５μＭポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15〔ｐ（ｄＴ）15換算濃度〕、０．２ｍＭ　［メチル－3Ｈ］ｄＴＴＰ（１．８５Ｂｑ／ｐｍｏｌ）〔ジーイーヘルスケア（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社製〕］中、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体またはＷＴ（比較例）（１０ｎＭ）を３７℃でインキュベーションした。
　一定時間（２．５、５．０または７．５分間）インキュベーション後の産物２０μＬを採取し、すぐに、ガラスフィルター〔ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）社製、商品名：ＧＦ／Ｃ、直径２．５ｃｍ〕にスポットした。つぎに、前記ガラスフィルターを、冷却した５質量％トリクロロ酢酸水溶液で１０分間洗浄した。その後、前記ガラスフィルターを、冷却した９５体積％エタノール水溶液で洗浄した。これにより、ポリ（ｒＡ）・ｐ（ｄＴ）15に取り込まれていない[3Ｈ］ｄＴＴＰを除去した。かかるトリクロロ酢酸水溶液による洗浄は３回繰り返した。また、エタノール水溶液による洗浄は１回繰り返した。
　その後、前記ガラスフィルターを乾燥させた。ガラスフィルターを、液体シンチレーション用試薬〔ナショナル・ダイアグノシス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製、商品名：Ｅｃｏｓｃｉｎｔ　Ｈ〕２．５ｍＬ中に入れ、放射活性をカウントした。前記放射活性に基づいて、ｄＴＴＰ取り込み量を算出した。
　前記ｄＴＴＰ取り込み量の経時的変化に基づいて、初期反応速度を算出した。つぎに、熱処理を行なっていない場合の初期反応速度（「初期反応速度ａ」という）と、熱処理を行なった場合の初期反応速度（「初期反応速度ｂ」という）とから、残存活性を算出した。前記残存活性は、式（ＩＩＩ）：
　残存活性（％）＝（初期反応速度ｂ／初期反応速度ａ）×１００　（ＩＩＩ）
を用いて算出した。つぎに、熱処理におけるインキュベーション時間（熱処理時間）に対する残存活性の対数値をプロットした。つぎに、式（ＩＶ）：
　ｌｎ［Ｂ］＝Ａ－ｋobsｔ　　　　（ＩＶ）
（式中、Ａは定数項を示し、Ｂは残存活性(%)を示し、ｔは熱処理時間を示す）
に基づいて熱不活性化一次速度定数ｋobsを決定した。
　また、熱処理における温度に対するｋobsの対数値をプロットした。つぎに、式（Ｖ）：
　ｌｎ（ｋobs）＝Ａ－（Ｅa／Ｒ）（ｌ／Ｔ）　　　　　　　（Ｖ）
（式中、Ａは定数項を示し、Ｒは気体定数（＝８．３１４Ｊ／Ｋ・ｍｏｌ）を示し、Ｔは絶対温度（Ｋ）である）
により、アレニウスプロットを用い、熱不活性化に対する活性化エネルギーＥaを決定した。アレニウスプロットにより、ｋobs値が１０分間で５０％の残存活性を与える温度としてＴ50を推定した。
　試験例４において、インキュベーション時間とｌｎ［残存活性（％）］との関係を調べた結果を図４に示す。なお、図４は、５２℃で熱処理を行なった場合の結果を示す。また、図中、ｌｎ［残存活性（％）］は、残存活性の自然体数値を示す。
　また、試験例４において、温度とｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］との関係を調べた結果を図５に示す。図中、ｌｎ［ｋobs（ｓ-1）］は、ｋobsの自然対数値を示す。
　図４に示された結果から、ＷＴ（比較例）の残存活性は、５分間のインキュベーションで１０％未満に減少するのに対し、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体それぞれの残存活性は、ほとんど減少しないことがわかる。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体は、ＷＴよりも熱に対して安定であることがわかる。
　図５に示された結果に基づいて、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴそれぞれの最初の活性を１０分間のインキュベーションで５０％に減少させるのに必要な温度Ｔ50を算出した。その結果、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴそれぞれの最初の活性を１０分間のインキュベーションで５０％に減少させるのに必要な温度Ｔ50は、それぞれ、４５．１、５４．２および５５．９℃であると推定された。また、図５に示された結果に基づいて、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴそれぞれの熱不活性化の活性化エネルギー（Ｅa）を算出した。その結果、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体およびＷＴそれぞれの熱不活性化の活性化エネルギー（Ｅa）はそれぞれ、２４０、２９８および３２２ｋＪ／ｍｏｌであると推定された。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体は、ＷＴよりも安定であることがわかる。
（試験例５）
　ＰＣＲ用チューブに、水１２μＬと１０×逆転写酵素緩衝液〔組成：２５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕２μＬと、２．０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物１μＬと、１０μＭ　ＲＶ－Ｒ２６プライマー水溶液１μＬと、標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）１μＬと、大腸菌ＲＮＡ溶液（１．０μｇ／μＬ）１μＬと、実施例３で得られた多重変異体、実施例４で得られた多重変異体またはＷＴ（比較例１）の酵素溶液〔酵素溶液に用いられた溶媒の組成：１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭジチオスレイトール、０．２体積％ＴｒｉｔｏｎTM　Ｘ－１００、１０体積％グリセロール〕２μＬとを入れて混合し、反応混合液２０μＬを調製した。
　なお、標準ＲＮＡは、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）のｃｅｓＡ遺伝子（ジーンバンクアクセッション番号：ＤＱ３６０８２５）のＤＮＡ配列８３５３－９３６６に対応する１０１４ヌクレオチドのＲＮＡをイン・ビトロ転写により調製した。ＲＶ－Ｒ２６プライマーの塩基配列および配列番号を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　得られた反応混合液を４６～６４℃で３０分間インキュベーションし、その後、９５℃で５分間加熱した。つぎに、得られた産物３μＬと、水１８μＬと１０×ＰＣＲ緩衝液〔組成：５００ｍＭ塩化カリウム、１００ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ塩化マグネシウム〕３μＬと、１０μＭ　Ｆ５プライマー水溶液１μＬと、１０μＭ　ＲＶプライマー水溶液１μＬと、２．０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物３μＬと、組換Ｔａｑポリメラーゼ溶液〔東洋紡（株）製、１Ｕ／μＬ〕１μＬとを混合して、ＰＣＲ用混合物３０μＬを調製した。得られたＰＣＲ用混合物を用い、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、９５℃で３０秒間のインキュベーションの後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なうことにより行なった。Ｆ５プライマーおよびＲＶプライマーそれぞれの塩基配列および配列番号は、表５に示されるとおりである。
　得られた増幅産物を、１．０質量％アガロースゲルを用いた電気泳動で分離し、エチジウムブロマイド（１μｇ／ｍＬ）で染色した。試験例５において、電気泳動を行なった結果を図６に示す。
　図６に示された結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体がｃＤＮＡ合成活性を示す最も高い温度は、６０℃であり、ＷＴ（比較例１）がｃＤＮＡ合成活性を示す最も高い温度は、５４℃であることがわかる。これらの結果から、実施例３で得られた多重変異体および実施例４で得られた多重変異体は、ＷＴよりも高い温度でｃＤＮＡ合成活性を示すことがわかる。
（実施例５）
　試験例１における評価がＡＡである置換対象のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された変異体のなかから、Ｅ３０２Ｋを除き、残存活性が高い順に、３種類の変異体（Ｌ４３５Ｒ、Ｄ１２４ＲおよびＥ２８６Ｒ）を選択した。
　製造例２において、表１に示されるアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーの代わりに、選択された３種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、製造例２と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、いずれも７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
（実施例６）
　実施例５において、部位特異的変異用プライマーとして、選択された３種類のアミノ酸残基の置換と、配列番号：２における５２４位のＡｓｐのＡｌａへの置換（Ｄ５２４Ａ）とが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例５と同様の操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｄ１２４Ｒ／Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋１１であった。
（実施例７）
　実施例５において、部位特異的変異用プライマーとして、Ｌ４３５ＲおよびＥ２８６Ｒの２種類のアミノ酸残基の置換が生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例５と同様に操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋９であった。
（実施例８）
　実施例５において、部位特異的変異用プライマーとして、実施例７で選択された２種類のアミノ酸残基の置換とＤ５２４Ａとが生じるようにデザインされたプライマーを用いたことを除き、実施例５と同様に操作を行ない、ＭＭＬＶ逆転写酵素の多重変異体（Ｅ２８６Ｒ／Ｌ４３５Ｒ／Ｄ５２４Ａ）を得た。得られた多重変異体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析の結果、７５ｋＤａの単一のバンドを示すことが確認された。
　得られた多重変異体のＤＮＡ相互作用領域における実効電荷の大きさのスコアは、＋９であった。
（試験例６）
　試験例１において、製造例２で得られた単独変異体の代わりに、実施例５～８で得られた多重変異体を用いたことを除き、試験例１と同様に操作を行ない、残存活性を算出した。試験例６において、多重変異体の種類とテンプレートプライマー存在下での多重変異体の残存活性との関係を調べた結果を図７に示す。図中、１は実施例５で得られた多重変異体の残存活性、２は実施例６で得られた多重変異体の残存活性、３は実施例７で得られた多重変異体の残存活性、４は実施例８で得られた多重変異体の残存活性を示す。
　図７に示された結果から、実施例５～８それぞれで得られた多重変異体は、ＷＴと比べて、熱安定性が著しく高いことがわかる。したがって、ＷＴにおけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、少なくともＥ２８６を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
　以上の結果から、野生型ＭＭＬＶ逆転写酵素におけるテンプレートプライマーとの相互作用に関連する領域（配列番号：２に示されるアミノ酸配列において、２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域）において、少なくともＥ２８６を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を有する変異型逆転写酵素が得られることがわかる。
　したがって、ＤＮＡ相互作用領域の実効電荷の大きさのスコアが、ＷＴのＤＮＡ相互作用領域における実効電荷よりも大きくなるように、ＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換し、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基をＤＮＡ相互作用領域に局在させることにより、高い熱安定性を確保することができることがわかる。
　かかる変異型逆転写酵素（本発明の変異型逆転写酵素）は、高い熱安定性を有していることから、高い反応温度での反応に用いた場合であっても、高い逆転写酵素活性を発現する。そのため、本発明の変異型逆転写酵素によれば、テンプレートとして用いられるＲＮＡが二次構造を形成しやすい配列を含む場合であっても、逆転写反応の際の反応温度を高い温度に設定することで、二次構造の形成を抑制し、かつ逆転写することができる。
　したがって、本発明の変異型逆転写酵素は、用いられるＲＮＡ含有試料に制限されることのない汎用性の高い分析用試薬（例えば、逆転写反応キット）、ウイルス、細菌、疾患などの検出用試薬（例えば、検出キット）などとして有用であることが示唆される。
　なお、逆転写酵素を含む核酸関連酵素には、核酸と相互作用する核酸相互作用領域（逆転写酵素におけるＤＮＡ相互作用領域）が存在している。したがって、本発明の変異型逆転写酵素の場合と同様に、核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換することにより、高い熱安定性を確保することができることが期待される。
処方例
　以下、逆転写反応キットおよび検出キットの例を示す。
（逆転写反応キット）
　－　実施例１で得られた変異型逆転写酵素
　－　１０×逆転写酵素緩衝液
　　〔組成：２５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕
　－　２．０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物
　－　１０μＭプライマー水溶液
　－　標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
（検出キット）
　－　実施例１で得られた変異型逆転写酵素
　－　１０×逆転写酵素緩衝液
　　〔組成：２５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５００ｍＭ塩化カリウム、２０ｍＭジチオスレイトール〕
　－　２．０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物
　－　１０μＭ　ＲＶ－Ｒ２６プライマー水溶液
　－　標準ＲＮＡ溶液（１．６ｐｇ／μＬ）
　－　大腸菌ＲＮＡ溶液（１．０μｇ／μＬ）
　配列番号：３は、ＲＶ－Ｒ２６プライマーの配列である。
　配列番号：４は、Ｆ５プライマーの配列である。
　配列番号：５は、ＲＶプライマーの配列である。

Claims (17)

  1. 　野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基の正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基への置換を有しており、前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するＤＮＡ相互作用領域を有しており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。
  2. 　前記野生型逆転写酵素が、配列番号：２に対応するアミノ酸配列からなり、
    　前記野生型逆転写酵素のＤＮＡ相互作用領域中のアミノ酸残基が、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域中に局在するアミノ酸残基である、請求項１に記載の変異型逆転写酵素。
  3. 　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域中にアミノ酸残基の保存的置換を有する、請求項２に記載の変異型逆転写酵素。
  4. 　（Ａ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における１または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
    （Ｂ）配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、Ｇａｐ　Ｃｏｓｔｓ（Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ　１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　１）、Ｅｘｐｅｃｔ　１０、Ｗｏｒｄ　Ｓｉｚｅ　３の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列
    のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項２または３に記載の変異型逆転写酵素。
  5. 　配列番号：２の２４位のスレオニン残基～４７４位のプロリン残基に対応する領域に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかが、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されている、請求項２～４のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。
  6. 　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２の少なくとも２８６位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。
  7. 　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、配列番号：２中のアミノ酸残基：
    ６９位のグルタミン酸残基、１０８位のアスパラギン酸残基、１１７位のグルタミン酸残基、１２４位のアスパラギン酸残基、２８６位のグルタミン酸残基、３０２位のグルタミン酸残基、３１３位のトリプトファン残基、４３５位のロイシン残基および４５４位のアスパラギン残基
    の少なくとも１つに対応する残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており（ただし、３０２位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換を除く）、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。
  8. 　配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ）～（ｉ）：
    （ａ）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
    （ｂ）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
    （ｃ）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
    （ｄ）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
    （ｅ）配列番号：２の６９位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
    （ｆ）配列番号：２の１０８位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
    （ｇ）配列番号：２の１１７位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
    （ｈ）配列番号：２の３１３位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
    （ｉ）配列番号：２の４５４位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
    からなる群より選択された少なくとも１つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。
  9. 　（Ｉ）配列番号：２に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換（ａ－１）～（ｃ－１）：
    （ａ－１）配列番号：２の２８６位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
    （ｂ－１）配列番号：２の３０２位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
    （ｃ－１）配列番号：２の４３５位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
    を有するアミノ酸配列、または
    （ＩＩ）前記（Ｉ）のアミノ酸配列において、（ｄ－１）配列番号：２の１２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
    をさらに有するアミノ酸配列
    からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項８に記載の変異型逆転写酵素。
  10. 　前記（Ｉ）または（ＩＩ）のアミノ酸配列において、
    （ｅ－１）配列番号：２の５２４位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
    をさらに有するアミノ酸配列
    からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項９に記載の変異型逆転写酵素。
  11. 　請求項１～１０のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸。
  12. 　請求項１～１０のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
    　請求項１１に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
    　前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
    を含む、変異型逆転写酵素の製造方法。
  13. 　請求項１～１０のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてＲＮＡからｃＤＮＡを合成することを特徴とする逆転写方法。
  14. 　逆転写反応を行なうためのキットであって、
    　請求項１～１０のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット。
  15. 　生体から得られたＲＮＡを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、
    　請求項１～１０のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット。
  16. 　核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素の熱安定性を向上させる方法であって、
    　野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の前記核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対して、前記核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入して、前記野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させることを特徴とする、核酸関連酵素の熱安定性の向上方法。
  17. 　前記核酸関連酵素が逆転写酵素である、請求項１６に記載の方法。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014082936A (ja) * 2012-10-19 2014-05-12 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素
JP2014124166A (ja) * 2012-12-27 2014-07-07 Tosoh Corp 酵素のスクリーニング方法
WO2015075842A1 (ja) * 2013-11-25 2015-05-28 国立大学法人京都大学 変異型逆転写酵素
EP2998394A4 (en) * 2013-05-17 2016-12-28 Consejo Superior De Investig Cientificas (Csic) RETROTRANSCRIPTASES OF HIV TYPE 1 GROUP O, ACTIVE AT HIGH TEMPERATURES
JP2017104092A (ja) * 2015-11-27 2017-06-15 国立大学法人京都大学 新規核酸合成法
JP2017131164A (ja) * 2016-01-28 2017-08-03 東洋紡株式会社 改良されたウイルス検出方法
WO2018110595A1 (ja) * 2016-12-14 2018-06-21 タカラバイオ株式会社 耐熱性の逆転写酵素変異体
WO2018198682A1 (ja) * 2017-04-26 2018-11-01 東洋紡株式会社 ウイルスの検査方法およびウイルスの検査用キット
EP3848458A4 (en) * 2019-11-13 2022-11-30 Daan Gene Co., Ltd. THERMOSTABLE REVERSE TRANSCRIPTASE MUTANT AND USE

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
JP2017503521A (ja) * 2014-01-22 2017-02-02 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 高温核酸合成で使用するための新規な逆転写酵素
WO2015139054A1 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Life Technologies Corporation Integrated system for nucleic acid amplification and detection
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2017070632A2 (en) 2015-10-23 2017-04-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
WO2018027078A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
CA3033327A1 (en) 2016-08-09 2018-02-15 President And Fellows Of Harvard College Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
GB2573062A (en) 2016-10-14 2019-10-23 Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
KR20190130613A (ko) 2017-03-23 2019-11-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
WO2019079347A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 The Broad Institute, Inc. USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE
KR20210143230A (ko) 2019-03-19 2021-11-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 뉴클레오티드 서열을 편집하기 위한 방법 및 조성물
CN114174503A (zh) * 2019-07-26 2022-03-11 东洋纺株式会社 稳定性优异的突变型逆转录酶
CN116096873A (zh) 2020-05-08 2023-05-09 布罗德研究所股份有限公司 同时编辑靶标双链核苷酸序列的两条链的方法和组合物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004511211A (ja) 2000-05-26 2004-04-15 インヴィトロジェン　コーポレーション 耐熱性逆転写酵素およびその使用
JP2009504162A (ja) * 2005-08-10 2009-02-05 ストラタジーン カリフォルニア 変異体逆転写酵素および使用方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9783791B2 (en) * 2005-08-10 2017-10-10 Agilent Technologies, Inc. Mutant reverse transcriptase and methods of use
GB0806562D0 (en) * 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004511211A (ja) 2000-05-26 2004-04-15 インヴィトロジェン　コーポレーション 耐熱性逆転写酵素およびその使用
JP2009504162A (ja) * 2005-08-10 2009-02-05 ストラタジーン カリフォルニア 変異体逆転写酵素および使用方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AREZI B. ET AL.: "Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 37, no. 2, 2009, pages 473 - 481, XP002556110 *
BAHRAM AREZI ET AL.: "Novel mutations in Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase increase thermostability through tighter binding to template-primer", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 37, 4 December 2008 (2008-12-04), pages 473 - 481
MIZUNO M. ET AL.: "Insight into the mechanism of the stabilization of moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase by eliminating RNase H activity", BIOSCI.BIOTECHNOL. BIOCHEM., vol. 74, no. 2, 7 February 2010 (2010-02-07), pages 440 - 442, XP055075589 *
See also references of EP2604688A4 *
YASUKAWA K. ET AL.: "Increase in thermal stability of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase by site-directed mutagenesis", J.BIOTECHNOL., vol. 150, no. 3, 8 October 2010 (2010-10-08), pages 299 - 306, XP027483996 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014082936A (ja) * 2012-10-19 2014-05-12 Kyoto Univ 変異型逆転写酵素
JP2014124166A (ja) * 2012-12-27 2014-07-07 Tosoh Corp 酵素のスクリーニング方法
EP2998394A4 (en) * 2013-05-17 2016-12-28 Consejo Superior De Investig Cientificas (Csic) RETROTRANSCRIPTASES OF HIV TYPE 1 GROUP O, ACTIVE AT HIGH TEMPERATURES
WO2015075842A1 (ja) * 2013-11-25 2015-05-28 国立大学法人京都大学 変異型逆転写酵素
JP2017104092A (ja) * 2015-11-27 2017-06-15 国立大学法人京都大学 新規核酸合成法
JP2017131164A (ja) * 2016-01-28 2017-08-03 東洋紡株式会社 改良されたウイルス検出方法
WO2018110595A1 (ja) * 2016-12-14 2018-06-21 タカラバイオ株式会社 耐熱性の逆転写酵素変異体
JPWO2018110595A1 (ja) * 2016-12-14 2019-10-24 タカラバイオ株式会社 耐熱性の逆転写酵素変異体
US11220677B2 (en) 2016-12-14 2022-01-11 Takara Bio Inc. Heat-resistant reverse transcriptase mutant
JP7061078B2 (ja) 2016-12-14 2022-04-27 タカラバイオ株式会社 耐熱性の逆転写酵素変異体
WO2018198682A1 (ja) * 2017-04-26 2018-11-01 東洋紡株式会社 ウイルスの検査方法およびウイルスの検査用キット
JPWO2018198682A1 (ja) * 2017-04-26 2020-03-12 東洋紡株式会社 ウイルスの検査方法およびウイルスの検査用キット
JP7167913B2 (ja) 2017-04-26 2022-11-09 東洋紡株式会社 ウイルスの検査方法およびウイルスの検査用キット
EP3848458A4 (en) * 2019-11-13 2022-11-30 Daan Gene Co., Ltd. THERMOSTABLE REVERSE TRANSCRIPTASE MUTANT AND USE

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