ES2303959T3

ES2303959T3 - Cst (automarcado compartimentalizado).

Info

Publication number: ES2303959T3
Application number: ES04798378T
Authority: ES
Inventors: Philipp MRC Lab. of Molecular Biology HOLLIGER; Zoryana Domantis Limited OLIYNYK
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2003-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2008-09-01
Anticipated expiration: 2024-11-03
Also published as: DE602004012881D1; DE602004012881T2; EP1680516A1; ATE391188T1; US20070134682A1; US8133673B2; ZA200603523B; WO2005045072A1; US7691576B2; DK1680516T3; US20100184071A1; EP1680516B1; GB0325653D0

Abstract

Procedimiento para la selección de una enzima capaz de modificar directa o indirectamente un oligonucleótido, en el que el procedimiento no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima que modifica el oligonucleótido, procedimiento que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar una o más moléculas de ácido nucleico en forma de plásmidos progenitores que codifican una o más enzimas de interés, en el que el plásmido progenitor proporciona la secuencia génica de la enzima de interés seleccionada. (b) Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con una o más de las enzimas codificadas por el plásmido y un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a). (c) Proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la asociación estable del oligonucleótido según la etapa (b) con una región del plásmido; (d) proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la modificación del oligonucleótido según la etapa (b) usando la enzima codificada por el plásmido, y de forma que el oligonucleótido modificado resultante comprenda un marcador molecular; y (e) capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido.

Description

CST (automarcado compartimentalizado).

Campo de la invención

La presente invención se refiere al desarrollo de un nuevo procedimiento para la selección del procesamiento de ácidos nucleicos y la selección de otras enzimas. En particular, la invención se refiere a un procedimiento para la selección de polimerasas de ácidos nucleicos y otras enzimas con propiedades deseadas, basándose en el procedimiento del automarcado compartimentalizado.

Antecedentes

Los procedimientos de compartimentalización basados en emulsiones de agua en aceite se han desarrollado recientemente para el uso en procedimientos de selección de repertorios (Griffiths98/Ghadessy01/Sepp02/Griffiths). La compartimentalización segrega genes individuales y sus productos codificados (suministrados como células (Ghadessy) o expresados in situ (Griffiths/Sepp)) en compartimientos acuosos discretos, físicamente separados, asegurando así la relación de genotipo y fenotipo durante el proceso de selección. Tras la selección, los genes que codifican las actividades enzimáticas deseadas son aislados a través de modificación (por ejemplo, metilación), mediante presentación en perlas (Sepp/Griffiths) o mediante amplificación (Ghadessy 01).

La amplificación (CSR) y la captura en perlas (IVC) se han puesto como ejemplos para la selección de nuevas actividades enzimáticas, es decir, variantes de Taq polimerasa que son más termoestables o resistentes al inhibidor heparina (Ghadessy 01), o variantes de fosfotriesterasa (Griffiths 03) que muestran un mayor ciclo metabólico. Sin embargo, ambos procedimientos dependen de un ciclo catalítico elevado (y/o procesabilidad en el caso de polimerasas), y parece que son poco adecuados para la selección de enzimas con un bajo ciclo metabólico. Aunque es deseable como punto final una fuerte presión selectiva para un elevado ciclo enzimático, limita el tipo de actividades catalíticas que se pueden acceder usando el sistema. En particular, partiendo incluso de una enzima muy activa, es probable que las modificaciones sustanciales de la especificidad de sustrato o incluso del mecanismo catalítico den como resultado un ciclo catalítico más reducido, debido a que las enzimas de actividad elevada pueden estar alejadas muchas mutaciones desde la secuencia de partida, y por lo tanto pueden no ser accesibles dentro de los límites de los repertorios moleculares que se pueden manejar de forma realista por CSR (o IVC) (10^{10}). Por ejemplo, a partir de estudios cinéticos de ADN polimerasa I de E. coli, las mutaciones tales como E710A aumentaron la actividad y la incorporación de ribonucleótidos a costa de menores velocidades catalíticas y menos afinidad por sustratos de tipo natural (desoxirribonucleótidos) (1). El mutante correspondiente de ADN polimerasa I de Taq, E615A, pudo incorporar ribonucleótidos de forma más eficiente que la polimerasa de tipo natural. Sin embargo, sólo fue capaz de sintetizar fragmentos muy cortos, y no el gen de Taq de longitud completa (J.L. Ong, P.H. resultados sin publicar). En otro experimento de selección en el que la beta-glucuronidasa se convirtió en una beta-galactosidasa, el fenotipo deseado se obtuvo después de varias rondas de selección, pero a expensas de la actividad catalítica. También se encontró que las variantes seleccionadas en las rondas iniciales de selección fueron capaces de catalizar la conversión de varios sustratos diferentes no utilizados por ninguna enzima progenitora, y a velocidades catalíticas mucho menores (2). De este modo, para muchos objetivos de selección (por ejemplo especificidad alterada del sustrato), es probable que los intermedios, junto con la trayectoria evolutiva hacia el nuevo fenotipo, tendrán una actividad catalítica reducida. Por lo tanto, sería deseable tener un procedimiento para la selección de actividades de polimerasa (y otras actividades enzimáticas) con un menor umbral de selección (que requiera de forma ideal sólo un único suceso de renovación).

Para la selección de polimerasas con una menor actividad catalítica o procesabilidad, los inventores han propuesto previamente una modificación de CSR, denominada CSR de parche corto (spCSR), en la que sólo se aleatoriza y se replica una pequeña región ("un parche") del gen bajo investigación (véase la patente original de CSR). spCSR ha permitido la selección de variantes de Taq polimerasa capaces de utilizar como sustratos ribonucleótidos en lugar de trifosfatos de desoxirribonucleótidos, que no se podrían aislar usando CSR estándar. Sin embargo, spCSR aún requiere cientos a miles de sucesos de recambio para que la enzima sea seleccionable.

Teóricamente, el procedimiento de CSR que usa nucleótidos marcados con biotina (descrito en general en el documento PCT/GB98/01889) se puede usar para detectar sucesos individuales de renovación de enzimas, por ejemplo polimerasas. Sin embargo, en la práctica, los inventores han descubierto que este procedimiento no es eficaz de forma óptima por varias razones:

-: la expresión in situ de polimerasas (dentro de compartimientos), a partir de un fragmento de ADN lineal que comprende un gen de polimerasa y por ejemplo un promotor de T7, se puede lograr usando un sistema de transcripción/traducción in vitro (ivt) (tal como los comercialmente disponibles). Sin embargo, se ha encontrado que la presencia de nucleótidos biotinilados (biotina-dNTP) da como resultado el marcado de los extremos 3' del fragmento lineal con biotina, independientemente de la actividad de la polimerasa expresada e independientemente de la naturaleza del extremo 3' (proyección hacia fuera de 5', romo, o proyección hacia fuera de 3'). Esto da como resultado dicho fondo de nivel elevado que por encima de él no es detectable un suceso de una única renovación de una polimerasa de interés. Los inventores consideran que las razones de ello son:

-: que algunos extractos de ivt contienen ellos mismos actividad de transferasa terminal (TT) endógena,

-: el propio ARN pol de T7 tiene una actividad de TT sustancial (véase, por ejemplo, McGinness et al (2002) Chem. Biol., 9, 585-596), y está presente incluso antes de que se haya expresado cualquier polimerasa de interés y de esta manera tiene una ventaja de comienzo a la hora de modificar los extremos 3' libres

-: las ADN polimerasas (hasta ahora ensayadas por los presentes inventores) son expresadas de forma mala por los sistemas de ivt,

-: las ADN polimerasas son muy poco activas en los tampones de ivt (las ensayadas hasta ahora por los presentes inventores).

Las posibles soluciones técnicas a esto incluyen lo siguiente:

1): extremos 3' bloqueados de forma condicional. El problema con este enfoque es que es fascinante. Además, este procedimiento no resuelve el problema de que las polimerasas son expresadas de forma pobre por sistemas de ivt y de que son muy poco activas en tampones de ivt.

2): El procedimiento de 2 etapas descrito en el documento PCT/GB01/04108 de los presentes inventores: ivt de 2 etapas seguido del ensayo en busca de la polimerasa resultante para extender el ADN. La desventaja con este procedimiento es que consume tiempo para llevarlo a cabo. Además, no resuelve el problema de que las ADN polimerasas son expresadas de forma pobre por los sistemas de ivt.

Otros procedimientos para la selección de polimerasas incluyen el procedimiento de "acoplamiento por proximidad" usado en la presentación de fagos. Dicho procedimiento implica la presentación próxima de tanto el sustrato como la enzima en la partícula fágica (Neri 99, Schultz 00). Este concepto descansa en la conversión cis del sustrato al producto, o, en el caso de polimerasas, de la incorporación de un nucleótido marcado en un sustrato de dúplex de molde-cebador fijado a la partícula fágica (Jestin 01, Xia 02). Recientemente, el procedimiento se ha usado con éxito para seleccionar una variante del fragmento Stoffel de Taq polimerasa que incorpora trifosfatos de ribonucleósidos (rNTP) con eficacias que se aproximan a las de la enzima de tipo natural para sustratos de dNTP (Xia 02). Sin embargo, hay varios problemas asociados con el uso de este procedimiento. De forma importante, las condiciones de selección han de ser compatibles con la viabilidad del fago, y la fijación intramolecular del sustrato puede favorecer la selección de polimerasas con una baja afinidad por el dúplex del molde-cebador y una mala
procesabilidad.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de la provisión de un procedimiento para la selección de moléculas que procesen ácidos nucleicos, en particular ADN polimerasas que posean un bajo intercambio catalítico y/o procesabilidad, procedimiento el cual no esté constreñido por condiciones de selección que son requeridas para la viabilidad del fago.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han concebido previamente un procedimiento para la selección de enzimas que procesan ácidos nucleicos, las cuales poseen una actividad deseada. Dicho procedimiento es conocido como evolución directa, y dicho procedimiento usa la técnica de la autorreplicación compartimentalizada (CSR). Ambos procedimientos se describen en los documentos PCT/01/04108 y GB/002/005216.

Los inventores han inventado un procedimiento alternativo basado en la técnica de la "autorreplicación compartimentalizada" (CSR) para la selección de enzimas que procesan ácidos nucleicos, particularmente polimerasas que pueden ser muy adecuadas para el aislamiento de enzimas con una menor renovación catalítica. El procedimiento se denomina CST (automarcado compartimentalizado). Se basa en la captura de un plásmido que codifica la polimerasa u otro agente de unión en virtud del marcado, dependiente de la actividad, con un oligonucleótido.

Tal procedimiento tiene varias ventajas con respecto a los procedimientos de la técnica anterior usados para la selección de enzimas que procesan ácidos nucleicos. Esto es, une las ventajas respectivas de CSR y del acoplamiento por proximidad:

-: no selecciona las enzimas que tienen una baja afinidad por el sustrato (dúplex de cebador-molde) y que por lo tanto pueden tener usos prácticos limitados, y

-: las condiciones de selección del procedimiento no están restringidas a las que se requieren para la viabilidad del fago, permitiendo seleccionar de este modo un intervalo mucho mayor de enzimas que los procedimientos de la técnica anterior que se basan en la técnica de la presentación de fagos.

-: Al mismo tiempo, no depende de la replicación completa del gen que codifica la polimerasa. De hecho, el cebado se puede producir en cualquier parte en el plásmido o fragmento de ADN lineal que codifica la polimerasa, y la selección puede requerir la incorporación de unos pocos nucleótidos.

-: El CST, a diferencia de la CSR, es adecuado para la selección de polimerasas con una tasa de error elevada (si arbitrariamente una tasa de error elevado se define como aproximadamente 1/N errores por ciclo de replicación para un gen de polimerasa de N bases). Para dichas polimerasas, la CSR conduce a una acumulación de mutaciones perniciosas durante la autorreplicación. Como resultado, una gran proporción de los genes "descendientes" codificará polimerasa con una actividad comprometida debido a las mutaciones. Este efecto es particularmente pronunciado para polimerasas que cometen un gran número de errores de desplazamiento del marco, ya que se puede esperar que la mayoría de estos destruyan completamente la actividad en los clones afectados. Por el contrario, en CST, el plásmido progenitor es el que proporciona, es decir, codifica, la secuencia génica de la polimerasa seleccionada. El producto de extensión del cebador real sólo sirve como un "marcador" mediante el cual se aísla el plásmido progenitor. Por lo tanto, cualesquiera errores incorporados durante la extensión del cebador no se transfieren a la "descendencia".

-: El CST es superior a la CSR para la evolución y selección de polimerasas que incorporan un nucleótido modificado u otros sustratos, en los casos en los que las modificaciones excluyen la replicación de los productos de extensión mediante polimerasas disponibles. En otras palabras, la amplificación de los genes descendientes a partir de CSR sería imposible debido a que estos contendrían modificaciones que bloquean la replicación a la química de ADN. Por el contrario, en CST, no es necesario que los productos de selección sean "reamplificables". El plásmido progenitor es el que proporciona la secuencia génica de la polimerasa seleccionada. El producto de extensión del cebador real sólo sirve como un "marcador" mediante el cual se aísla el plásmido progenitor. Por lo tanto, cualesquiera nucleótidos modificados bloqueantes u otros sustratos incorporados durante la extensión del cebador no evitan la recuperación y reamplificación de los genes "descendientes". De hecho, no es necesario que los productos de extensión estén químicamente próximos o ni siquiera relacionados con los ácidos nucleicos.

De este modo, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la selección de una enzima capaz de modificar directa o indirectamente un nucleótido, en el que el procedimiento no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima que modifica el oligonucleótido, procedimiento el cual comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar una o más moléculas de ácido nucleico en forma de plásmidos progenitores que codifican una o más enzimas de interés, en el que el plásmido progenitor proporciona la secuencia génica de la enzima de interés seleccionada.

(b): Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con la una o más enzimas codificadas por el plásmido y un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a).

(c): Proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la asociación estable del oligonucleótido según la etapa (b) con una región del plásmido;

(d): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la modificación del oligonucleótido según la etapa (b) usando la enzima codificada por el plásmido, y de forma que el oligonucleótido modificado resultante comprenda un marcador molecular; y

(e): capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido.

Según los procedimientos descritos en la presente memoria, preferentemente la "una o más moléculas de ácido nucleico" según la etapa (a) es una pluralidad de moléculas nucleicas.

Ventajosamente, el procedimiento de la invención se puede usar para la selección de enzimas que comprenden una o más de las siguientes propiedades: una baja renovación catalítica (en las condiciones de selección), una baja procesabilidad (en las condiciones de selección), polimerasas que incorporan un nucleótido modificado que bloquea la replicación, u otros sustratos que no se pueden replicar, y polimerasas con una tasa de error elevado (aproximadamente >1/N errores para un gen de polimerasa de N bases).

Según el procedimiento descrito en la presente memoria, la expresión "un oligonucleótido" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico monocatenario. Un oligonucleótido puede ser una molécula de ácido nucleico monocatenario parcial o totalmente artificial, que consiste en bases exclusivamente sintéticas o en una mezcla de bases de origen natural y sintéticas, cualquiera de los anteriores enlazado a un polipéptido, y uno cualquiera de los anteriores enlazado a cualquier otro grupo molecular o constructo. Ventajosamente, el otro grupo molecular o constructo se puede seleccionar de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo perlas de poliestireno, sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, etiquetas, tales como etiquetas isotópicas o fluoróforos, reactivos químicos, agentes de unión tales como macrociclos y similares. Según la invención descrita en la presente memoria, un oligonucleótido para uso según el procedimiento es capaz de una hibridación específica con una región en un plásmido según el procedimiento de la invención, ya sea antes de la modificación del oligonucleótido o después de la modificación del oligonucleótido. Ventajosamente, un oligonucleótido para uso según el procedimiento de la invención es capaz de una hibridación específica con una región en un plásmido según el procedimiento de la invención antes de la modificación del oligonucleótido. Según el procedimiento de la presente invención, el experto en la materia apreciará que cualquier oligonucleótido adecuado para uso según el procedimiento de la invención para polimerasas también debe ser "extensible", por ejemplo tiene, ya sea desde el comienzo o después del procesamiento adecuado, un extremo 3' libre o accesible.

Como se cita en la presente memoria, la expresión "modificación de un oligonucleótido" se refiere a una alteración en la estructura del oligonucleótido. Dichas alteraciones incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más del grupo que consiste en lo siguiente: extensión del oligómero (ya sea 5' ó 3'); ligación de un oligonucleótido a cualquier entidad, en particular a otro oligonucleótido; fosforilación del oligonucleótido seguido de la ligación a un marcador como se describe en la presente memoria, conversión de una entidad enlazada al oligonucleótido en una entidad diferente, por ejemplo conversión de un sustrato enlazado al oligonucleótido en un producto; unión de un grupo molecular al oligonucleótido, por ejemplo H2O2, HRP biotintiramida; la modificación de moléculas de antena/moléculas depuradoras enlazadas al oligonucleótido.

Según el procedimiento descrito en la presente memoria, la modificación del oligonucleótido puede ser directa o indirecta. Sin embargo, en cualquier caso, es una característica esencial de la invención que el resultado de la modificación oligonucleotídica sea que se genere un marcador molecular/marcador de captura sobre el oligonucleótido, por ejemplo mediante incorporación. Este marcador molecular/marcador de captura permite la captura subsiguiente del complejo del plásmido/oligonucleótido.

Los "marcadores moleculares/marcadores de captura" adecuados se describen en la descripción detallada de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que los detalles del procedimiento de la generación de marcadores moleculares sobre un oligonucleótido según la invención dependerán de las propiedades de la enzima de interés.

En el caso de que la enzima de interés sea una ADN polimerasa, entonces se usa la incorporación de uno o más nucleótidos marcados, en el extremo 3' de la secuencia de ADN, para generar un marcador de captura/marcador molecular como parte del oligonucleótido usando la ADN polimerasa. Además, en el caso de que la enzima de interés sea una ligasa, entonces el marcador molecular se incorpora en el oligonucleótido vía la ligación de un segundo oligonucleótido marcado al oligonucleótido que está asociado con el plásmido según la invención. Además, en el caso de que la enzima de interés sea una polinucleótido quinasa, entonces la incorporación de un marcador molecular se produce vía la fosforilación de 5' y la ligación de un segundo oligonucleótido, que contiene un marcador molecular. Los expertos en la materia apreciarán que esta lista no pretende ser exhaustiva.

Según el procedimiento de la invención, las enzimas que son particularmente adecuadas para la selección usando el procedimiento de la presente invención son las que no se pueden seleccionar con éxito usando el procedimiento de CSR. Como se describe anteriormente, estas incluyen pero no se limitan a enzimas con una cualquiera o más de las siguientes propiedades: una baja renovación catalítica, una baja procesabilidad del sustrato, polimerasas que incorporan sustratos nucleotídicos modificados, y polimerasas con una tasa de error elevado (aproximadamente 1/N errores para un gen de polimerasa de N bases).

Los presentes inventores han descubierto que estas enzimas son difíciles de seleccionar mediante CSR debido a que se resisten a autorreplicarse en las condiciones de selección y/o (por ejemplo, en el caso de Dpo4 de S. solfataricus) tienen tanta tendencia al error que con la autorreplicación corrompen su propia información codificante. Por lo tanto, el procedimiento de la invención extiende el intervalo de polimerasas que se puede seleccionar, más allá y por encima de las disponibles para la selección usando CSR.

De este modo, las enzimas adecuadas para selección usando el procedimiento de la invención incluyen una cualquiera o más de las seleccionadas de entre el grupo constituido por lo siguiente: enzimas que procesan ácidos nucleicos, enzimas que actúan sobre uno o más sustratos de ácido nucleico replicasas (esto es, enzimas implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos), enzimas que modulan la actividad de inhibidores de replicasa (esto es, enzimas implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos), enzimas que actúan directamente sobre una molécula de sustrato enlazada a un oligonucleótido, en el que el oligonucleótido es capaz de una asociación estable con una región de un plásmido que codifica esa enzima según el procedimiento de la invención, o enzimas que actúan indirectamente sobre una molécula de sustrato enlazada a un oligonucleótido, en el que el oligonucleótido es capaz de una asociación estable con una región de un plásmido que codifica esa enzima según el procedimiento de la invención.

En consecuencia, los expertos en la materia apreciarán que la expresión "es capaz de producirse (la modificación del oligonucleótido) usando la enzima codificada por el plásmido" incluye, dentro de su alcance, el uso directo de una enzima codificada por el plásmido para generar un marcador molecular en el oligonucleótido (por ejemplo mediante la incorporación de oligonucleótidos marcados en un oligonucleótido en el caso en el que la enzima sea una ácido nucleico replicasa). Además, la expresión "es capaz de producirse (la modificación del oligonucleótido) usando la enzima codificada por el plásmido" incluye, dentro de su alcance, el uso indirecto de una enzima de interés para marcar el oligonucleótido asociado con el plásmido según el procedimiento de la invención. Dicho uso indirecto sería, por ejemplo, la conversión de un sustrato enlazado a un oligonucleótido en un producto en presencia de una enzima codificada por el plásmido. En este caso, el "marcador molecular/marcador de captura", como se define en la presente memoria, es el producto.

Cualquier plásmido es adecuado para uso según el procedimiento de la invención. Los plásmidos adecuados se dan en la descripción detallada de la invención.

Según el procedimiento de la invención, la expresión "asociación estable" (de un oligonucleótido específico para una región en el plásmido con el plásmido) se refiere a la hibridación estable de un oligonucleótido con el plásmido, de forma que se pueda capturar un plásmido que codifica la enzima de interés usando el marcador molecular presente en el oligonucleótido.

Los procedimientos adecuados para capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido incluyen la selección usando un agente de unión al marcador molecular/marcador de captura, unido a un soporte sólido. Dichos agentes de unión incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos específicos para el marcador molecular. En el caso en el que el marcador molecular sea biotina, entonces un agente de unión al marcador molecular adecuado es estreptavidina. Los expertos en la materia estarán al tanto de otros marcadores moleculares/marcadores de captura adecuados y agentes de unión a marcadores moleculares/marcadores de captura.

En una realización preferida del aspecto anterior de la invención, el procedimiento sirve para la selección de enzimas que procesan ácidos nucleicos, procedimiento el cual no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima que procesa ácidos nucleicos, procedimiento el cual comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar una o más moléculas de ácido nucleico en forma de plásmidos progenitores que codifican una o más enzimas de interés que procesan ácidos nucleicos, en el que el plásmido progenitor proporciona la secuencia génica de la enzima de interés que procesa ácidos nucleicos seleccionada.

(b): Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con la una o más enzimas que procesan ácidos nucleicos codificadas por el plásmido;

(c): proporcionar condiciones de forma que sea capaz de producirse la asociación estable de un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (b) con esa región del plásmido;

(d): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la extensión del oligonucleótido según la etapa (c) usando la enzima que procesa ácidos nucleicos en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y

(e): capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido.

Las enzimas adecuadas que procesan ácidos nucleicos, para uso según el procedimiento de la invención, incluyen cualquiera de las seleccionadas de entre el grupo constituido por las siguientes: replicasas, en particular ADN replicasas; ADN ligasas, ARN ligasas, polinucleótido quinasas, enzimas que están implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos.

Las ADN replicasas adecuadas incluyen cualquiera de las ADN replicasas procedentes de las familias polA, polB, polC, polD, polY y polX o RT. El procedimiento puede ser particularmente adecuado para miembros de estas familias, que tienen una menor procesabilidad o actividad (en las condiciones de selección), lo que los hacen difíciles de seleccionar mediante CSR.

En el caso en el que el procedimiento de la invención sea para la selección de ADN polimerasas que poseen una baja procesabilidad y/o renovación catalítica, el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a): proporcionar una o más moléculas de ácidos nucleicos en forma de plásmidos que codifican una o más ADN polimerasas;

(b): compartimentalizar esos plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con la una o más ADN polimerasas codificadas por el plásmido; y un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a) con esa región del plásmido

(c): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la asociación del oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a) con esa región del plásmido;

(d): proporcionar condiciones de forma que el extremo 3' del oligonucleótido según la etapa (b) sea capaz de ser extendido usando la ADN polimerasa según la etapa (a) en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y

(e): capturar el complejo, extendido en 3', del oligonucleótido modificado/plásmido.

En el caso de la selección de la actividad de polimerasa, en su forma más simple el CST implica tres etapas:

1): hibridación: un oligonucleótido específico para una región en un plásmido se hibrida al plásmido (por ejemplo fundiendo o mediante invasión de hebra de una región definida de ADN, e hibridando a una de las hebras), y de este modo se asocia establemente con él (Fig. 1)

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2): marcado: el oligonucleótido se modifica (por ejemplo se extiende en 3') mediante la polimerasa de interés codificada por el plásmido y se expresa a partir de él. La modificación supone por ejemplo la extensión del extremo 3' del oligonucleótido mediante la polimerasa en presencia de nucleótidos modificados que cortan un marcador molecular (por ejemplo biotina) (Fig. 1)

3): captura: la incorporación de los nucleótidos marcados permite subsiguientemente la captura de los plásmidos que codifican una polimerasa activa, por ejemplo en perlas revestidas con estreptavidina en el caso en el que el marcador molecular es biotina. (Fig. 1B). Los plásmidos que codifican polimerasas inactivas no tienen extendidos sus oligonucleótidos asociados, y por lo tanto no serán capturados y se perderán del conjunto génico. Los plásmidos capturados se pueden eluir de las perlas y retransformar directamente. Como alternativa, el gen de la polimerasa se puede amplificar mediante PCR directamente a partir de las perlas y se puede reclonar, como se muestra en la Fig. 1B. Se darán detalles en la descripción detallada de la invención.

El procedimiento de la presente invención puede ser particularmente adecuado para la selección de ADN polimerasas que son naturalmente distributivas o pobremente procesadas, tales como los miembros de la familia polY o polX o variantes de baja procesabilidad de polimerasas de elevada procesabilidad tales como el fragmento Stoffel de Taq polimerasa o ADN polimerasa de T7 en ausencia de tiorredoxina. Como alternativa, partiendo de una polimerasa muy activa y procesable, el CST puede permitir trayectorias evolutivas que están pobladas con variantes de renovación y/o procesabilidad muy reducidas, tal como es probable que se encuentren cuando se realicen cambios al sustrato o química de extensión.

Según el procedimiento de la invención, la expresión "procesabilidad del sustrato/procesabilidad" significa el número de nucleótidos incorporados durante un único ciclo de dúplex de unión de cebador/molde y extensión antes de la disociación.

Como se cita en la presente memoria, la expresión "renovación catalítica/renovación" significa el número de nucleótidos incorporados en el producto en una cierta cantidad de tiempo. A bajas concentraciones de enzima y o de molde, la procesabilidad es importante ya que la unión del sustrato del dúplex molde-cebador se convierte en una etapa limitante de la velocidad. Por el contrario, a concentraciones elevadas de enzima y/o molde, la baja procesabilidad se puede compensar por lo menos parcialmente mediante una reunión rápida de la enzima al dúplex de cebador-molde.

Según una realización alternativa de la invención, el procedimiento sirve para la selección de polinucleótido quinasas. En esta realización de la invención, el oligonucleótido se extiende en presencia de la polinucleótido quinasa vía fosforilación del extremo 5' del oligonucleótido, seguido de la incorporación de uno o más oligonucleótidos marcados en el extremo 5' del oligonucleótido (ligación del marcador). En esta realización de la invención, cada compartimiento comprende el plásmido que codifica la polinucleótido quinasa, la propia quinasa, uno o más oligonucleótidos que son capaces de una asociación estable con el plásmido. Además, el compartimiento también comprende una ligasa que se requiere para la extensión del oligonucleótido fosforilado en 5'.

En una realización adicional preferida del aspecto anterior de la invención, el procedimiento sirve para la selección de ligasas de ácidos nucleicos. Las ligasas adecuadas para la selección incluyen ADN y ARN ligasas. Según este aspecto de la invención, cada compartimiento comprende uno o más oligonucleótidos capaces de asociarse con un plásmido que codifica la ligasa, un plásmido que codifica la ligasa de interés, la ligasa codificada por el plásmido y uno o más nucleótidos marcados en forma de oligonucleótidos marcados para ligación al oligonucleótido. Ventajosamente, según esta realización de la invención, un oligonucleótido no marcado que esté asociado establemente con el plásmido que lo codifica se marcará vía la ligación de un oligonucleótido marcado al extremo 3' del oligonucleótido no marcado. De esta manera, se logra la selección del complejo de oligonucleótido/ligasa/plásmido.

Como alternativa, la selección de una ligasa usando el procedimiento de la invención puede implicar la ligación en 3' de dos o más oligos (por lo menos uno de los cuales tiene un marcador molecular) que aislados son incapaces de una asociación estable con un plásmido que codifica la ligasa. Sin embargo, una vez ligado, el oligonucleótido marcado resultante es capaz de una asociación estable con el plásmido que codifica la ligasa, y de esta manera el complejo de ligasa/oligonucleótido/plásmido se puede seleccionar vía el marcador molecular.

De este modo, en una realización adicional preferida del procedimiento de la invención, se proporciona un procedimiento para la selección de una oligonucleótido ligasa, en el que el procedimiento no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima de oligonucleótido ligasa

(a): proporcionando una o más moléculas de ácidos nucleicos en forma de un plásmido o plásmidos progenitores que codifican una o más oligonucleótido ligasas, en el que el plásmido o plásmidos progenitores proporcionan la secuencia génica de la ligasa seleccionada de interés.

(b): Compartimentalizando los plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con la una o más ligasas codificadas por el plásmido, dos o más oligonucleótidos que son específicos para una región en el plásmido, por lo menos uno de los cuales contiene un marcador molecular, en el que cada oligonucleótido aislado no es capaz de una asociación estable con el plásmido, pero en la ligación es capaz de una asociación estable con el plásmido.

(c): Asociando establemente un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a) con esa región del plásmido;

(d): extendiendo el oligonucleótido según la etapa (a) usando la enzima que procesa ácidos nucleicos en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y

(e): capturando el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido usando el marcador molecular/marcador de captura.

En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención se puede usar para la selección de enzimas que actúan directamente sobre una molécula de un sustrato enlazada a un oligonucleótido, y convertirlos en un producto, que subsiguientemente permite la captura del complejo de producto/oligonucleótido/plásmido.

En aún una realización adicional preferida del aspecto anterior de la invención, el procedimiento de la invención se puede usar para la selección de enzimas que no actúan fácilmente sobre moléculas sustrato enlazadas a un oligonucleótido. En este caso, el sustrato es libre de difundirse dentro de un compartimiento según la invención. Sin embargo, el sustrato está enlazado a biotina enjaulada, y el producto se puede capturar (después de desenjaularlo) mediante un híbrido de estreptavidina-oligonucleótido. Como alternativa, el producto o productos generados mediante una enzima puede dar como resultado (directa o indirectamente) la modificación de un oligonucleótido, por ejemplo usando H2O2, HRP biotintiramida) y/o la modificación de moléculas antena (moléculas depuradoras) enlazadas al oligonucleótido.

Como se describe anteriormente, el procedimiento para la invención se puede usar para la selección de enzimas que no están implicadas en el procesamiento de ácidos nucleicos directamente, sino que modulan la actividad funcional de una enzima, o modulando la actividad funcional de un inhibidor de la enzima.

De este modo, en una realización alternativa del aspecto anterior de la invención, se proporciona un procedimiento para la selección de una enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos, en el que el procedimiento no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima que procesa ácidos nucleicos, y en el que el procedimiento comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar una o más moléculas de ácidos nucleicos en forma de plásmidos que codifican una o más enzimas que están implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos, en el que el plásmido o plásmidos progenitores proporcionan la secuencia génica de la enzima seleccionada de interés que procesa ácidos nucleicos.

(b): Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con una o más enzimas codificadas por el plásmido, uno o más sustratos modificados de la enzima codificada por el plásmido, y una o más enzimas que procesan ácidos nucleicos,

(c): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir, dentro de ese compartimiento, la asociación estable de un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a) con esa región del plásmido;

(d): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la extensión del extremo 3' del oligonucleótido según la etapa (a) usando la enzima que procesa ácidos nucleicos en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y

(e): capturar uno cualquiera o más complejos resultantes del oligonucleótido extendido en 3'/plásmido usando el marcador molecular de la etapa (d).

Según la realización anterior del procedimiento de la invención, "una enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos" incluye las que están implicadas en la producción de sustratos enzimáticos que procesan ácidos nucleicos procedentes de un sustrato bloqueado o inactivo. En esta realización del aspecto anterior de la invención, en el caso de que una enzima que es eficaz generando el sustrato de polimerasa activo se exprese dentro de un compartimiento particular, entonces se pueda producir la modificación de un oligonucleótido según el procedimiento de la invención usando una enzima activa que procesa ácidos nucleicos la cual también está presente dentro de ese compartimiento en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y la selección subsiguiente de un complejo de plásmido/oligonucleótido puede tener lugar entonces usando el marcador molecular.

"Una enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos" también incluye dentro de su alcance las enzimas que están implicadas en la inactivación funcional de uno o más inhibidores de una enzima que procesa ácidos nucleicos. De esta manera, cuando una enzima se expresa dentro de un compartimiento que es capaz de inactivar funcionalmente uno o más inhibidores de una enzima que procesa ácidos nucleicos, entonces se puede producir la modificación de un oligonucleótido según el procedimiento de la invención usando una enzima que procesa ácidos nucleicos la cual también está presente dentro de ese compartimiento en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y la selección subsiguiente de un complejo de plásmido/oligonucleótido puede tener lugar entonces usando el marcador molecular.

En una realización alternativa de la invención, el procedimiento implica el uso de un plásmido bicatenario cortado en una hebra, y un oligo no separado. Cuando la enzima es una ligasa, se seleccionan plásmidos no cortados en una hebra (por ejemplo intercalando plásmidos cortados en una hebra con EtBr y centrifugación mediante densidad de sacarosa para separar los plásmidos cortados y no cortados). Cuando la enzima es una polimerasa, se realiza una polimerización (por ejemplo, cuando sólo hay una base perdida entre los extremos de la hebra cortada) en presencia de una ligasa. Nuevamente, se seleccionan plásmidos no cortados. Para el marcado (por ejemplo, con biotina), se adopta un enfoque similar, añadiéndose la etiqueta a un extremo próximo al corte.

Los expertos en la materia serán conscientes de otros procedimientos para usar el procedimiento de la invención para la selección de enzimas que están implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos.

Los expertos en la materia apreciarán que el procedimiento de la invención permite que se realicen múltiples rondas de selección sin la necesidad de una reamplificación y reclonaje, simplemente capturando el plásmido y mediante retransformación. Esto reduce tanto el tiempo como el nivel de mutaciones de fondo del proceso de selección. Como alternativa, el gen de interés (o sus porciones) se puede reamplificar a partir del plásmido capturado, y se puede volver a clonar.

Junto con CSR y spCSR, el CST debería de proporcionar un espectro completo de restricción de selección para la actividad de polimerasa y la procesabilidad, oscilando desde una catálisis de recambio individual distributiva típica para polY polimerasas como polV de E. coli hasta una capacidad catalítica de 1.000 bases/segundo muy activo del replisoma. Según la invención descrita en la presente memoria, de forma importante, mientras que CSR requiere la replicación de todo el gen (habitualmente >1.000 pb) que codifica la actividad de polimerasa (u otra actividad enzimática), y spCSR requiere la replicación de parte del mismo (habitualmente >50 pb), CST debería de requerir tan poco como un único suceso de incorporación.

Es una característica esencial de la invención que se expresen una o más polimerasas de interés a partir del ácido nucleico que comprende un plásmido. De esta manera, la expresión de la polimerasa se puede realizar dentro de células, en oposición a los sistemas de transcripción/traducción in vitro explicados anteriormente. De esta manera, se superan tanto los problemas explicados anteriormente que se refieren a los sistemas de transcripción/traducción in vitro así como los encontrados en la expresión de polimerasas a partir de ADN lineal.

Los presentes inventores han realizado muchos experimentos dirigidos a optimizar las condiciones para mejorar la eficacia de la captura del plásmido, y por lo tanto potenciar la sensibilidad de la técnica. Estos experimentos se describen con detalle en la presente memoria

\hbox{en los Ejemplos 10 a 14 y
también en la descripción detallada  de la invención.}

En particular, los presentes inventores han descubierto que la eficacia de la captura del plásmido se puede aumentar usando una cualquiera o más de las técnicas en la lista que consiste en las siguientes: aumentando la Tm del híbrido del oligonucleótido/plásmido; extendiendo el oligonucleótido en más de 3 bases; mediante el uso de un ligador de más de 40 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido, y mediante el uso de un oligonucleótido de más de 10 bases de longitud.

Más específicamente, según los experimentos realizados por los presentes inventores, la eficacia de la captura del plásmido se incrementa aumentando la Tm del híbrido del oligonucleótido/plásmido usando cualquiera de las bases en la lista que consisten en las siguientes: bases de LNA y otros tipos de bases adecuadas. Ventajosamente, los procedimientos de la invención contemplan el uso de bases de LNA, a fin de aumentar la Tm del híbrido del oligonucleótido.

Otras bases adecuadas para uso según los procedimientos de la invención incluyen pero no se limitan a diaminopurina (para sustituir A), abrazaderas G (Matteucci 99), LNA (Jepsen et al (2004), Oligonucleotides, 14, 130), INA (Christensen y Pedersen (2002), Nucleic Acid Res, 30, 4918) o cualquier otra modificación de base o esqueleto que aumente la Tm. Otras posibilidades para aumentar la Tm incluyen oligonucleótidos híbridos (Ishihara y Corey 99), incluyendo híbridos de ADN-PNA o ADN-péptido, o reticulaciones covalentes a la hebra del molde usando una molécula de psoraleno incorporada establemente en el oligonucleótido.

Los presentes inventores han descubierto asimismo que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en más de 20 bases. Ventajosamente, la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en más de 50 bases, o más de 100 bases.

Además, los presentes inventores han descubierto que la eficacia de la captura del plásmido aumenta mediante el uso de un ligador de más de 50 átomos de longitud entre el marcador molecular y el oligonucleótido. Ventajosamente, la eficacia de la captura del plásmido aumenta mediante el uso de un ligador de más de 70 átomos de longitud entre el marcador molecular y el oligonucleótido. De forma más ventajosa, la eficacia de la captura del plásmido aumenta mediante el uso de un ligador de más de 100 átomos de longitud entre el marcador molecular y el oligonucleótido.

Definiciones

La expresión "un oligonucleótido" se refiere a cualquier secuencia de un ácido nucleico monocatenario. Un oligonucleótido puede ser una molécula de ácido nucleico monocatenario parcial o totalmente artificial que consiste en bases exclusivamente sintéticas o en una mezcla de bases de origen natural y sintéticas, una cualquiera de las anteriores enlazada a un polipéptido, y una cualquiera de las anteriores enlazada a cualquier otro grupo o constructo molecular. Ventajosamente, el otro grupo o constructo molecular se puede seleccionar de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo perlas de poliestireno, sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, etiquetas, tales como fluoróforos o etiquetas isotópicas, reactivos químicos, agentes de unión tales como macrociclos y similares. Según la invención descrita en la presente memoria, un oligonucleótido para uso según el procedimiento es capaz de una hibridación específica con una región en un plásmido según el procedimiento de la invención, ya sea antes de la modificación del oligonucleótido o posteriormente a la modificación del oligonucleótido. Ventajosamente, un oligonucleótido para uso según el procedimiento de la invención es capaz de una hibridación específica con una región en un plásmido según el procedimiento de la invención antes de la modificación del oligonucleótido. Según el procedimiento de la presente invención, el experto en la materia apreciará que cualquier oligonucleótido adecuado para uso según el procedimiento de la invención debe ser también "extensible", por ejemplo debe tener, desde el comienzo o después del procesamiento adecuado, un extremo 3' libre y accesible.

La expresión "modificación de un oligonucleótido", según la presente invención, se refiere a una alteración en la estructura del oligonucleótido. Dichas alteraciones incluyen pero no se limitan a uno cualquiera o más del grupo que consiste en lo siguiente: extensión del oligonucleótido (ya sea 5' ó 3'); ligación del oligonucleótido a otra entidad, en particular un oligonucleótido adicional; fosforilación del oligonucleótido seguido de la ligación al marcador como se describe en la presente memoria, conversión de una entidad enlazada al oligonucleótido en una entidad diferente, por ejemplo conversión de un sustrato enlazado al oligonucleótido en un producto; unión de un grupo molecular al oligonucleótido, por ejemplo H2O2, HRP biotintiramida; la modificación de moléculas de antena/moléculas depuradoras enlazadas al oligonucleótido. Según el procedimiento descrito en la presente memoria, la modificación del oligonucleótido puede ser directa o indirecta. Sin embargo, en cualquier caso, es una característica esencial de la invención que el resultado de la modificación del oligonucleótido sea que se incorpore en el oligonucleótido un marcador molecular/marcador de captura. Este marcador molecular/marcador de captura permite la captura subsiguiente del complejo de enzima/plásmido/oligonucleótido.

La expresión "procesabilidad del sustrato/procesabilidad" significa el número de nucleótidos incorporados durante un único ciclo de unión del dúplex de cebador-molde y extensión antes de la disociación. Como se cita en la presente memoria, la expresión "renovación catalítica/renovación" significa el número de nucleótidos incorporado en un producto en una cierta cantidad de tiempo.

Según la experiencia del inventor, a bajas concentraciones de enzima y o de molde, la procesabilidad es importante puesto que la unión del sustrato se convierte en la etapa que limita la velocidad. Por el contrario, a concentraciones elevadas de enzima y/o molde, la baja procesabilidad puede ser compensada, por lo menos parcialmente, mediante una reunión rápida de la enzima al dúplex de cebador-molde.

"Una enzima que está indirectamente implicada en el procesamiento de ácidos nucleicos" incluye las que están implicadas en la producción de sustratos enzimáticos que procesan ácidos nucleicos a partir de un sustrato bloqueado o inactivo. En esta realización del aspecto anterior de la invención, en el caso de que una enzima que sea eficaz en la generación de un sustrato activo de polimerasa se exprese dentro de un compartimiento particular, entonces es capaz de introducirse la modificación de un oligonucleótido según el procedimiento de la invención usando la enzima activa que procesa ácidos nucleicos la cual también está presente dentro de ese compartimiento en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y la selección subsiguiente de un complejo de plásmido/oligonucleótido puede tener entonces lugar usando el marcador molecular. "Una enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos" también incluye, dentro de su alcance, las enzimas que están implicadas en la inactivación funcional de uno o más inhibidores de una enzima que procesa ácidos nucleicos. De esta manera, cuando una enzima se expresa dentro de un compartimiento que es capaz de inactivar funcionalmente uno o más inhibidores de una enzima que procesa ácidos nucleicos, entonces se puede producir la modificación de un oligonucleótido según el procedimiento de la invención usando una enzima activa que procesa ácidos nucleicos la cual también está presente dentro de ese compartimiento en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y la selección subsiguiente de un complejo de plásmido/enzima/oligonucleótido puede tener lugar entonces usando el marcador molecular.

Según la presente invención, el término "compartimiento" es sinónimo del término "microcápsula". La estructura y preparación de microcápsulas se dan en la descripción detallada de la invención.

La expresión "es capaz de ocurrir (la modificación del oligonucleótido) usando la enzima codificada por el plásmido" incluye, dentro de su alcance, el uso directo de una enzima codificada por el plásmido para incorporar un marcador molecular en el oligonucleótido (por ejemplo la incorporación de nucleótidos marcados en un oligonucleótido en el caso en el que la enzima sea una replicasa de ácido nucleico. Además, la expresión "es capaz de producirse (la modificación del oligonucleótido) usando la enzima codificada por el plásmido" incluye, dentro de su alcance, el uso indirecto de una enzima de interés para marcar el oligonucleótido asociado con el plásmido según el procedimiento de la invención.

Dicho uso indirecto sería, por ejemplo, la conversión de un sustrato enlazado a un oligonucleótido en un producto, en presencia de una enzima codificada por el plásmido. En este caso, el "marcador molecular/marcador de captura", como se define en la presente memoria, es el producto.

La expresión "asociación estable" (de un oligonucleótido específico para una región en el plásmido con el plásmido) se refiere a la hibridación estable de un oligonucleótido con el plásmido, de forma que un plásmido que codifica la enzima de interés puede ser capturado usando el marcador molecular presente en el oligonucleótido.

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Breve descripción de las figuras

Fig. 1, 1B: esquema de selección mediante CST:

1): Hibridación: las células bacterianas que expresan polimerasa a partir de un vector adecuado (por ejemplo plásmido) se compartimentalizan como se describe previamente para CSR (Ghadessy et al 01) con reactivos requeridos para la reacción de polimerasa (1 x tampón de reacción de polimerasa, dNTP) y un cebador de CST y un nucleótido marcado (por ejemplo, biotina-16-dUTP). El cebador de CST es complementario a la secuencia en cualquier parte en el vector plasmídico (y puede o no contener modificaciones tales como un marcador peptídico que potencie la afinidad). Una etapa de desnaturalización térmica (por ejemplo 94ºC, 5 minutos) libera plásmido y polimerasa a partir de la célula bacteriana, desnaturaliza las actividades de polimerasa de fondo y funde la doble hebra del ADN plasmídico, de forma que el cebador de CST se puede hibridar a su secuencia diana. Una etapa de hibridación (por ejemplo 50ºC, 5 minutos) permite que el cebador de CST se hibride a su secuencia diana.

2): Marcado: una etapa de extensión (por ejemplo 72ºC 1-5 minutos) permite la extensión del cebador de CST, y la incorporación de uno o más nucleótidos marcados.

3): Captura: después de romper la emulsión (como se describe previamente para CSR (Ghadessy et al 01)), el complejo de cebador de CST extendido-plásmido se aísla y se captura en una superficie sólida (por ejemplo perlas magnéticas revestidas con estreptavidina), en virtud de los restos de biotina incorporados en la reacción de extensión del cebador. Los plásmidos que no contienen ningún marcador de biotina (y por lo tanto que reflejan compartimientos en los que no hubo extensión del cebador y por tanto ninguna polimerasa activa) son eliminados por lavado. Las condiciones de lavado se optimizan para minimizar la disociación del producto de extensión del cebador de CST a partir del plásmido.

4): Elución: los plásmidos capturados se eluyen de las perlas y se retransforman directamente. Para una mayor sensibilidad, los genes de polimerasa seleccionados (que residen en los plásmidos capturados) se amplifican preferentemente de forma directa a partir de las perlas magnéticas, o alternativamente a partir de plásmidos eluidos, y se vuelven a clonar para otra ronda de selección mediante CST.

Fig. 2: una modificación en el esquema de CST de la Fig. 1

A:: A fin de estabilizar el producto de extensión del cebador de CST, el cebador de CST puede ser una sonda "candado" con un extremo 5' fosforilado.

B:: De este modo, la extensión del cebador incorpora nucleótidos marcados y cierra el espacio entre el extremo 3' y 5' candado.

C:: El candado se cierra entonces mediante ligación de ADN. El candado cerrado representa un complejo no disociable de plásmido-cebador de CST, que permite condiciones restrictivas de lavado de las perlas (véase la Fig. 1).

Fig. 3: selección mediante CST de actividades enzimáticas distintas de polimerasas

A:: El sustrato para la enzima de elección (hexágono blanco) se une al extremo 3' del cebador de CST y bloquea la extensión mediante la polimerasa. La enzima activa X convierte el sustrato X creando un extremo 3' extensible (por ejemplo OH) en el término del cebador de CST. Le sigue la extensión estándar del cebador y la selección mediante CST.

B:: Los sustratos (X e Y) para la enzima de elección (hexágono blanco) se unen a los extremos 3' y 5' de dos cebadores, cada uno de los cuales es demasiado corto para hibridarse establemente al plásmido por sí mismo y de este modo no se pueden extender por la polimerasa. La enzima activa reacciona con X e Y enlazando los dos cebadores y creando una extensión del cebador de CST establemente hibridado de lo cual se permite que se produzca la selección mediante CST.

C:: Los sustratos (X e Y) para la enzima de elección (hexágono blanco) se unen a los extremos 3' y 5' de dos oligonucleótidos, cada uno de los cuales es demasiado corto para hibridarse de forma estable al plásmido por sí mismo. Un oligonucleótido (o ambos) contienen un marcador de captura (por ejemplo biotina). La enzima activa reacciona con X e Y enlazando los dos oligonucleótidos y creando un oligonucleótido hibridado de forma estable que permite la captura y selección sin la necesidad de la extensión del cebador mediante una polimerasa.

D:: Los sustratos (X) para la enzima de elección (hexágono blanco) se unen a un oligonucleótido. La enzima activa reacciona con X creando un oligonucleótido decorado con el producto P, lo que permite la captura vía un receptor adecuado para P (por ejemplo un anticuerpo anti-P).

E:: Los sustratos (X) para la enzima de elección (hexágono blanco) se unen a un marcador. La enzima activa reacciona con X creando un producto marcado (círculo blanco). El producto reacciona de forma espontánea con una molécula depuradora adecuada unida a un oligonucleótido, lo que permite la captura.

Fig. 4: selección mediante CST de la interacción proteína-proteína

Las moléculas (X e Y), para las cuales hay disponibles receptores de alta afinidad adecuados (receptor Y y receptor X), se unen a los extremos de dos oligonucleótidos, cada uno de los cuales es demasiado corto para hibridarse de forma estable al plásmido por sí mismo. Un oligonucleótido (o ambos) contiene un marcador de captura (por ejemplo biotina).

A:: Su hibridación se estabiliza en presencia de dos proteínas de fusión de cebo y presa, es decir un cebo del receptor Y y una presa del receptor X solamente si el cebo y la presa interaccionan.

B:: La molécula (Y), para la cual hay disponible un receptor de alta afinidad adecuado (receptor Y), se une al extremo de un oligonucleótido, que es demasiado corto para hibridarse de forma estable al plásmido por sí mismo. El oligonucleótido también contiene un marcador de captura (por ejemplo biotina). La hibridación se estabiliza en presencia de dos proteínas de fusión de cebo y presa, es decir un cebo de receptor Y y una presa de DBD solamente si el cebo y la presa interaccionan. DBD significa un dominio de unión a ADN capaz de un reconocimiento específico de una secuencia diana próxima adecuada, o capaz de una unión a ADN no específica suficiente para estabilizar el complejo.

Fig. 5: detección mediante PCR de plásmido capturado en CST

A:: Reacción de ensayo de CST +/- polimerasa en disolución.

Una cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR del gen bla directamente de las Dynabeads lavadas. - significa una reacción en ausencia de 2,5 U de Taq polimerasa, + significa reacción en presencia de 2,5 U de Taq polimerasa. "Entrada" significa la reacción de CST capturada sobre perlas antes del lavado, "lavado" significa sobrenadante del segundo lavado de perlas.

B: CST usando 2 cebadores diferentes: 24G (panel izquierdo) y oligo 3 (panel derecho)

La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR del gen bla directamente de Dynabeads lavadas. - significa reacción en ausencia de 2,5 U de Taq polimerasa, + significa reacción en presencia de 2,5 U de Taq polimerasa.

Los resultados muestran que CST es independiente de en qué lugar sobre el plásmido se hibrida el cebador de CST.

Fig. 6: detección mediante PCR de plásmido capturado II en CST

Experimento de control para ensayar que la banda de amplificación deriva del plásmido capturado, no del producto de extensión de un cebador capturado. Dpn digiere sólo ADN metilado de dam, tales como plásmidos replicados en una cepa dam^{+}.

La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por el PCR del gen bla directamente de Dynabeads lavadas. - significa reacción en ausencia de 2,5 U de Taq polimerasa, + significa reacción en presencia de 2,5 U de Taq polimerasa. Las perlas se preincuban con (panel izquierdo) o sin (panel derecho) DpnI antes de la amplificación. Dpn elimina casi completamente la amplificación del gen bla, indicando que el producto de amplificación observado deriva arrolladoramente del plásmido capturado y no del producto de extensión del cebador capturado.

Fig. 7: detección mediante PCR de plásmido capturado III en CST

Experimento de control para ensayar que CST funciona tanto con plásmido como con Taq polimerasa activa que deriva de células bacterianas. La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR del gen bla directamente de Dynabeads lavadas. - significa reacción en ausencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final), + significa reacción en presencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final). Los resultados muestran que el plásmido es capturado sólo en presencia de sustrato de dNTP.

El panel derecho muestra la amplificación del control a partir del sobrenadante de las fracciones de lavado de perlas. Muestra que el plásmido no marcado se adhiere de forma no específica a las perlas, pero es eliminado por lavado de forma eficaz, mientras que no ocurre así con el plásmido marcado. (Lavado 1 y 2: lavado con BBB, lavado 3 y 4: lavado con 10 mM de Tris pH 8).

Fig. 8: CST en emulsión: detección mediante PCR de plásmido capturado III

Experimento de control para ensayar que CST funciona tanto con plásmido como con Taq polimerasa activa que deriva de células bacterianas en emulsión. La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR del gen bla directamente de Dynabeads lavadas. - significa reacción en ausencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final), + significa reacción en presencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final). Los resultados muestran que el plásmido es capturado solamente en presencia de sustrato de dNTP.

Fig. 9: comparación de la eficacia de captura de diferentes polimerasas en CST

A, B: Experimento de control para ensayar la eficacia de la captura de diferentes polimerasas en CST. Las polimerasas expresadas y el plásmido codificado derivan de células bacterianas. La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR del gen bla directamente de Dynabeads lavadas. - significa reacción en ausencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final), + significa reacción en presencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final). Los resultados muestran que la Taq polimerasa activa y el fragmento Stoffel de Taq menos procesable y Dpo4 (procedente de S. solfataricus P2 (B)) son capturados, mientras que la variante de supresión inestable Taq \Delta442 y Taq 611 inactivo no lo son. La captura de Taq 611 inactivo se rescata mediante adición de Taq polimerasa exógena (2,5 U).

Fig. 10: selección mediante CST de polimerasa activa (Taq de tipo natural) frente a polimerasas inactivas (Taq 611)

A: Experimento de control para ensayar la eficacia de selección de polimerasa activa (Taq de tipo natural) frente a polimerasas inactivas (Taq 611) en CST en emulsión. La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR de parte del gen de Taq directamente de Dynabeads lavadas. 1/10^{2} y 1/10^{3} significan que la expresión bacteriana de Taq de tipo natural se ha visto añadida en un exceso de 1/100 ó 1/1000 de la expresión bacteriana de Taq 611 antes de la selección. Taq 611 contiene un Bgl II único en el segmento amplificado del gen de Taq. Los productos de amplificación antes (panel izquierdo) y después de la incubación con Bgl II (panel derecho) están resueltos. La presencia de las bandas inferiores indica la cantidad de gen de Taq 611 en los productos de amplificación.

Los resultados muestran que la Taq polimerasa activa está enriquecida en aproximadamente 1/10 en la adición de 1/100, y en aproximadamente 1/3 en la adición de 1/1000. Como se puede ver con la CSR, la eficacia de la selección es mayor a mayor dilución (presumiblemente debido a la reducción de la fracción de los compartimientos que comprenden dos células, una de las cuales contiene Taq de tipo natural activa).

B: Experimento de control para ensayar la eficacia de la selección de polimerasa activa (Taq de tipo natural) frente a polimerasas inactivas (Taq 611) en CST en emulsión. A la Taq de tipo natural se le añade 1/10^{4} ó 1/10^{6} exceso de expresión bacteriana de Taq 611 antes de la selección. La eficacia de la selección se puntúa determinando el número de clones de Taq activos (en PCR) posterior a la selección mediante CST.

Hay 47/95 clones activos tras la selección para la adición de 10^{4}, y 21/95 clones activos tras la selección para la adición de 10^{6}, Taq representa el control de Taq de tipo natural. La Taq polimerasa activa está enriquecida con respecto a Taq 611 inactiva mediante CST por un factor de >10^{4}.

Fig. 11: discriminación de la especificidad del sustrato mediante CST

Experimento de control para ensayar la eficacia de la captura de diferentes polimerasas en CST dependiendo de la especificidad del sustrato. Las polimerasas expresadas y el plásmido codificado derivan de células bacterianas. La cantidad de plásmido capturado se detecta mediante amplificación por PCR del gen bla directamente de Dynabeads lavadas. - significa reacción en ausencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final), + significa reacción en presencia de 0,25 mM de dNTP (concentración final).

Panel izquierdo: discriminación de la eficacia de captura en CST en el que el cebador de CST tiene un análogo de base de 5-nitroindol como su base de 3'. Los resultados muestran que el mutante M1 de Taq presenta una mayor capacidad para extenderse desde un cebador que contiene un 5-nitroindol en CST, en comparación con Taq de tipo natural como se conoce previamente.

Panel derecho: discriminación de la eficacia de captura en CST en el que dATP se sustituye por ATP. Los resultados muestran que el mutante R22 de Taq muestra un mayor aumento, aunque una débil captura en comparación con Taq de tipo natural. Se sabe que R22 es capaz de incorporar ribonucleótidos con una eficacia mucho mayor.

Figura 12. LNA-B - oligonucleótido biotinilado en 5' con 44% de bases de LNA, LNA - oligonucleótido no biotinilado con 44% de bases de LNA, ADN-B - oligonucleótido de ADN biotinilado en 5' (24G - con una abrazadera G), ADN - oligonucleótido de ADN no biotinilado 24G. A. Número calculado de moléculas de plásmido capturadas con cada cebador, B - ejemplo de datos sin procesar obtenidos con qPCR.

Figura 13. Efecto de la longitud de extensión en la captura del plásmido con el uso de oligonucleótido LNA-ADN (A) y oligonucleótido de sólo ADN (B). 0 - sin extensión, 3 - extensión mediante 3 bases, 9 - extensión mediante 9 bases, 1000 - extensión completa (cientos a miles de bases).

Figura 14. Eficacia de la captura del plásmido con el uso de cebador biotinilado de 5' con un enlazador de 108 átomos entre la biotina y una base (B-108-ADN) y un cebador biotinilado en 5' con un ligador de 16 átomos entre biotina y una base (B-16-ADN). 108B cebador 5'-biotina-ligador de 108 átomos-GATCTTCACCTAGATCCT-3'.

Figura 15. El efecto de la longitud del cebador sobre la eficacia de la captura.

Descripción detallada de la invención (A) Estrategia general del procedimiento de la invención Un procedimiento para la selección de una enzima capaz de modificar directa o indirectamente un oligonucleótido.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la selección de una enzima capaz de modificar directa o indirectamente un oligonucleótido, en el que el procedimiento no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima que modifica el oligonucleótido, procedimiento el cual comprende las etapas siguientes:

(e): capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido.

El procedimiento de la invención se puede resumir en su forma más simple mediante varias etapas:

-: expresión de una enzima de interés a partir de plásmidos, preferentemente en células completas.

-: Hibridación de un oligonucleótido específico para el plásmido a esa región de un plásmido.

-: Modificación de ese nucleótido en presencia de la enzima de interés.

-: Captura del oligonucleótido modificado/plásmido vía el uso del marcador.

El procedimiento de la invención tiene varias características importantes:

de forma importante, el uso de plásmidos para expresar la enzima de interés significa que dicha expresión puede ocurrir dentro de células completas que comprenden toda la maquinaria requerida para la expresión y procesamiento de la enzima de interés. Por lo tanto, según el procedimiento de la invención, no hay ningún requisito para el uso de sistemas de transcripción/traducción in vitro.

Además, expresando la enzima de interés a partir de plásmidos, se resuelven muchos de los problemas planteados al intentar dicho procedimiento de selección usando ADN lineal. Por ejemplo, la expresión in situ de polimerasas (dentro de compartimientos) a partir de un fragmento de ADN lineal en un sistema de transcripción/traducción in vitro (ivt) en presencia de nucleótidos biotinilados (Bio-dNTP) da como resultado, según la experiencia del inventor, una gran cantidad de fondo de marcado de los extremos 3' del fragmento lineal con Bio-dNTP, independientemente de la actividad de la polimerasa expresada, e independientemente de la naturaleza del extremo 3' (proyección hacia fuera de 5', romo, o proyección hacia fuera de 3').

Además, el procedimiento de la invención tiene varias ventajas importantes con respecto al procedimiento de CSR previamente descrito por los presentes inventores.

"Un oligonucleótido"

Según el procedimiento descrito en la presente memoria, la expresión "un oligonucleótido" se refiere a cualquier secuencia de un ácido nucleico monocatenario. Un oligonucleótido puede ser una molécula de ácido nucleico monocatenario parcial o completamente artificial, que consiste en bases exclusivamente sintéticas o en una mezcla de bases de origen natural y sintéticas, una cualquiera de las anteriores enlazada a un polipéptido, y una cualquiera de las anteriores enlazada a cualquier otro grupo o constructo molecular. Ventajosamente, el otro grupo o constructo molecular se puede seleccionar de entre el grupo constituido por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo perlas de poliestireno, sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, etiquetas, tales como fluoróforos o etiquetas isotópicas, reactivos químicos, agentes de unión tales como macrociclos, y similares. Según la invención descrita en la presente memoria, un oligonucleótido para uso según el procedimiento es capaz de una hibridación específica con una región en un plásmido según el procedimiento de la invención, ya sea antes de la modificación del oligonucleótido o después de la modificación del oligonucleótido. Ventajosamente, un oligonucleótido para uso según el procedimiento de la invención es capaz de una hibridación específica con una región en un plásmido según el procedimiento de la invención antes de la modificación del oligonucleótido.

Según el procedimiento de la presente invención, los expertos en la materia apreciarán que la longitud del oligonucleótido adecuado para uso depende de las condiciones de selección y también del contenido de GC del oligonucleótido. Ventajosamente, un oligonucleótido adecuado para uso según el procedimiento de la invención tendrá una longitud mayor que 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucleótidos.

"Modificación de un oligonucleótido"

La expresión "modificación de un oligonucleótido" se refiere a una alteración en la estructura del oligonucleótido. Dichas alteraciones incluyen pero no se limitan a uno cualquiera o más del grupo que consiste en lo siguiente: extensión del oligómero (ya sea 5' ó 3'); ligación de un oligonucleótido a otra entidad, en particular a otro oligonucleótido; fosforilación del oligonucleótido seguido de la ligación al marcador como se describe en la presente memoria, conversión de una entidad enlazada al oligonucleótido en una entidad diferente, por ejemplo conversión de un sustrato enlazado al oligonucleótido en un producto; unión de un grupo molecular al oligonucleótido, por ejemplo H2O2, HRP biotintiramida; la modificación de moléculas antena/moléculas depuradoras enlazadas al oligonucleótido.

Según el procedimiento descrito en la presente memoria, la modificación del oligonucleótido puede ser directa o indirecta. Sin embargo, en cualquier caso, es una característica esencial de la invención que el resultado de la modificación del oligonucleótido sea que se incorpore en el oligonucleótido un marcador molecular/marcador de captura. Este marcador molecular/marcador de captura permite la captura subsiguiente del complejo de enzima/plásmido/oligonucleótido.

Marcadores moleculares/marcadores de captura

Los expertos en la materia apreciarán que los detalles del procedimiento de incorporación de marcadores moleculares en un oligonucleótido según la invención dependerá de las propiedades de la enzima de interés.

(i) Nucleótidos/oligonucleótidos marcados

Por ejemplo, en el caso de que la enzima de interés sea una ADN polimerasa, entonces se usa la incorporación de uno o más nucleótidos marcados en el extremo 3' de la secuencia de ADN para incorporar un marcador de captura/marcador molecular en el elemento genético usando la ADN polimerasa. Además, en el caso de que la enzima de interés sea una ligasa, entonces el marcador molecular se incorpora en el oligonucleótido vía la ligación de un segundo oligonucleótido marcado al oligonucleótido que está asociado con el plásmido según la invención. Además, en el caso de que la enzima de interés sea una polinucleótido quinasa, entonces la incorporación de un marcador molecular se produce vía la fosforilación de 5' y la ligación de un segundo oligonucleótido que contiene un marcador molecular. Los expertos en la materia apreciarán que esta lista no pretende ser exhaustiva.

En el caso en el que el marcador molecular/marcador de captura sea un nucleótido marcado, la mezcla del trifosfato de nucleótido dentro de un compartimiento según la invención es mezclada con un nucleótido (o varios) modificado con un marcador molecular, por ejemplo biotin-dUTP. Después de la extensión e incorporación, el complejo de plásmido-oligonucleótido se decora con moléculas marcadoras (por ejemplo biotina), lo que permite su captura (Fig. 1, 1B).

Los propios nucleótidos marcados pueden ser sustratos no naturales (tal como, por ejemplo, una base alterada como 5-nitroindol o un ribonucleótido), y de este modo su incorporación se puede seleccionar directamente para buscar el fenotipo. Como alternativa, la incorporación puede ser una indicación de la actividad de polimerasa en las condiciones de selección, o una capacidad para entender un extremo 3' modificado.

Los marcadores moleculares/marcadores de captura adecuados incluyen biotina, digoxigenina (DIG), fluoresceína (FITC), dinitrofenol (DNP), etc., que se pueden capturar usando avidina/estreptavidina o anticuerpos adecuados. Como alternativa, el nucleótido se puede modificar para que presente un grupo amino libre (NH2), que se puede modificar específicamente con un marcador adecuado después de la extensión. Los expertos en la materia apreciarán que esta lista no pretende ser exhaustiva y sabrán que existen otros marcadores moleculares adecuados.

Múltiples marcadores pueden ofrecer la posibilidad de esquemas de captura y selección de dos (o múltiples) etapas, o esquemas de captura con combinaciones de requisitos de selección, por ejemplo captura de todas las moléculas de A o B, o todas las moléculas con A y B, o moléculas con A pero no con B.

Producto enlazado a oligonucleótido como un marcador de captura

En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención se puede usar para la selección de enzimas que actúan directamente sobre una molécula sustrato enlazada a un oligonucleótido, y los convierten en un producto, que subsiguientemente permite la captura del complejo del producto/oligonucleótido/plásmido. De este modo, según esta realización de la invención, el marcador de captura/marcador molecular es el producto enlazado a un oligonucleótido.

Enzimas para selección según el procedimiento de la invención

Los presentes inventores han descubierto que el procedimiento de la invención es particularmente adecuado para la selección de enzimas, particularmente enzimas que procesan ácidos nucleicos que tienen una cualquiera o más de las siguientes características: una renovación catalítica baja, una baja procesabilidad del sustrato, enzimas que procesan ácidos nucleicos las cuales incorporan sustratos nucleotídicos modificados y polimerasas con una tasa de error elevado (aproximadamente 1/N errores para un gen de polimerasa de N bases).

Las enzimas adecuadas para selección usando el procedimiento de la invención incluyen una cualquiera o más de las seleccionadas de entre el grupo constituido por lo siguiente: enzimas que procesan ácidos nucleicos, enzimas que actúan sobre uno o más sustratos de replicasas de ácidos nucleicos (esto es, enzimas implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos), enzimas que modulan la actividad de replicasas (esto es, enzimas implicadas indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos), enzimas que actúan directamente sobre una molécula sustrato enlazada a un oligonucleótido, en el que el oligonucleótido es capaz de una asociación estable con una región de un plásmido que codifica esa enzima según el procedimiento de la invención, y enzimas que actúan indirectamente sobre una molécula sustrato enlazada a un oligonucleótido.

Las enzimas adecuadas que procesan ácidos nucleicos para uso según el procedimiento de la invención incluyen cualquiera de las seleccionadas de entre el grupo constituido por los siguientes: replicasas, en particular ADN replicasas; ADN ligasas, ARN ligasas, polinucleótido quinasas.

En particular, el CST es útil para la selección de polimerasas, que son naturalmente distributivas o malamente procesables, tales como miembros de la familia de polY o polX, o variantes de baja procesabilidad de polimerasas de alta procesabilidad, tales como el fragmento Stoffel de Taq polimerasa o ADN polimerasa de T7 en ausencia de tiorredoxina. Como alternativa, partiendo de una polimerasa muy activa y procesable, el CST puede permitir trayectorias evolutivas que están pobladas con variantes de renovación enormemente reducida y/o procesabilidad, tales como las que se pueden encontrar cuando se realizan cambios al sustrato o química de extensión.

El CST también debería de permitir que se realizasen múltiples rondas de selección sin la necesidad de la reamplificación y del reclonado, reduciendo tanto el tiempo como el nivel de mutaciones de fondo del proceso de selección. Junto con CSR y spCSR, el CST debería proporcionar un espectro completo de restricción de selección para la actividad y procesabilidad de polimerasas que oscila desde una catálisis de renovación única distributiva típica para polimerasas de poliY o poliX hasta una capacidad catalítica altamente procesable de 1000 bases/segundo del replisoma.

Plásmidos

Los plásmidos adecuados para uso según el procedimiento de la invención serán familiares a los expertos en la materia. Ventajosamente serán plásmidos pequeños, del orden de menos de 10 kB, y tendrán un elevado número de copias. Dichos plásmidos incluyen pero no se limitan a uno cualquiera o más de los siguientes: origen de replicación de colE1 o p15, tales como los derivados de pUC, pBR322, pACYC184 o pACYC177.

Compartimientos/microcápsulas

Las microcápsulas de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas que permitan el funcionamiento de la invención.

En primer lugar, para asegurar que los elementos genéticos y los productos génicos no se puedan difundir entre las microcápsulas, los contenidos de cada microcápsula se deben de aislar de los contenidos de las microcápsulas que los rodean, de forma que no haya intercambio, o haya muy poco, de los elementos genéticos y productos génicos entre las microcápsulas a lo largo de la escala de tiempo del experimento.

En segundo lugar, el procedimiento de la presente invención requiere que sólo haya un tipo de elemento genético por compartimiento. Puede haber múltiples copias, pero es necesario que sean idénticas, es decir, cada compartimiento contiene un clon (una o muchas copias de un elemento genético A, pero no una mezcla de elementos genéticos A, B, C, etc.) de elementos genéticos por microcápsula/compartimiento. Esto asegura que el producto génico de un elemento genético individual se aislará de otros elementos genéticos. De este modo, el acoplamiento entre elemento genético y producto génico será muy específico. El factor de enriquecimiento es el mayor, de media, con uno o muy pocos elementos genéticos por microcápsula, siendo la relación entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado lo más estrecha posible, puesto que el producto génico de un elemento genético individual se aislará de los productos de otros elementos genéticos. Sin embargo, incluso si no se usa la situación teóricamente óptima de, en promedio, un único elemento genético o menos por microcápsula, una relación de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más elementos genéticos por microcápsula puede ser beneficiosa a la hora de clasificar una gran librería. Rondas subsiguientes de clasificación, incluyendo un encapsulamiento renovado con una diferente distribución de elementos genéticos, permitirán una clasificación más restrictiva de los elementos genéticos.

En tercer lugar, la formación y la composición de las microcápsulas no debe eliminar la función de la maquinaria, la expresión de los elementos genéticos ni la actividad de los productos génicos.

En consecuencia, cualquier sistema de microencapsulamiento usado debe satisfacer estos tres requisitos. El sistema o sistemas apropiados pueden variar dependiendo de la naturaleza precisa de los requisitos en cada aplicación de la invención, como será manifiesto para la persona experta.

Existe una gran variedad de procedimientos de microencapsulamiento (véase Benita, 1996), y se pueden usar para crear las microcápsulas usadas según la presente invención. De hecho, en la bibliografía se han identificado más de 200 procedimientos de microencapsulamiento (Finch, 1993).

Estos incluyen vesículas acuosas envueltas en membranas, tales como vesículas lipídicas (liposomas) (New, 1990) y vesículas de tensioactivos no iónicos (van Hal et al., 1996). Éstas son cápsulas membranosas cerradas de bicapas individuales o múltiples de moléculas ensambladas no covalentemente, con cada bicapa separada de su vecina mediante un compartimiento acuoso. En el caso de liposomas, la membrana está compuesta de moléculas lipídicas; éstas son habitualmente fosfolípidos, pero también se puede incorporar en las membranas esteroles tales como colesterol (New, 1990). Dentro de los liposomas se puede realizar una variedad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas, incluyendo la polimerización de ARN y ADN (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick y Luisi, 1996).

Preferentemente, las microcápsulas de la presente invención se forman a partir de emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles, con una de las fases dispersa en la otra como gotitas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

Las emulsiones se pueden producir a partir de cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. Preferentemente, la emulsión de la presente invención tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotitas finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua), y un líquido hidrófobo, inmiscible (un "aceite") como la matriz en la que se suspenden estas gotitas (la fase no dispersa, continua o externa). Dichas emulsiones se denominan "agua en aceite" (W/O). Esto tiene la ventaja de que toda la fase acuosa que contiene los componentes bioquímicos está compartimentalizada en gotitas discretas (la fase interna). La fase externa, que es un aceite hidrófobo, generalmente no contiene ninguno de los componentes bioquímicos, y por tanto es inerte.

La emulsión se puede estabilizar mediante adición de uno o más agentes activos superficialmente (tensioactivos). Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes, y actúan como la interfaz de agua/aceite para evitar (o por lo menos retrasar) la separación de las fases. Para la generación de emulsiones de agua en aceite se pueden usar muchos aceites y muchos emulsionantes; una recopilación reciente enumera alrededor de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites adecuados incluyen parafina líquida ligera y tensioactivos no iónicos (Schick, 1966) tales como monooleato de sorbitán (Span^{TM} 80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitán (Tween^{TM} 80; ICI).

También puede ser beneficioso el uso de tensioactivos aniónicos. Los tensioactivos adecuados incluyen colato de sodio y taurocolato de sodio. Se prefiere particularmente desoxicolato de sodio, preferentemente a una concentración de 0,5% p/v, o inferior. La inclusión de dichos tensioactivos puede aumentar en algunos casos la expresión de los elementos genéticos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada elimina completamente la traducción. Sin embargo, durante el emulsionamiento, el tensioactivo se transfiere desde la fase acuosa a la interfaz, y se restaura la actividad. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas a emulsionar asegura que las reacciones transcurran sólo después de la compartimentalización.

La creación de una emulsión requiere generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar a que las fases estén juntas. Hay una variedad de formas para hacer esto, que utiliza una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como barras de agitación magnética, agitadores con palas y de turbinas, dispositivos con paletas y batidores), homogeneizadores (incluyendo homogeneizadores de rotor-estator, homogeneizadores de válvulas de alta presión y homogeneizadores de chorro), molinos de coloides, dispositivos de ultrasonidos y de "emulsionamiento de membranas" (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones de agua en aceite generalmente son estables con poco intercambio, si lo hay, de elementos genéticos o productos génicos entre las microcápsulas. Adicionalmente, se ha demostrado que varias reacciones bioquímicas transcurren en microcápsulas en emulsión. La tecnología existe para crear emulsiones con volúmenes hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

El tamaño preferido de las microcápsulas variará dependiendo de los requisitos precisos de cualquier proceso de selección individual que se va a realizar según la presente invención. En todos los casos, habrá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la librería génica, el enriquecimiento requerido y la concentración requerida de componentes en las microcápsulas para lograr la reactividad eficiente de los productos génicos.

Dependiendo de la aplicación, el volumen medio de las microcápsulas es menor que 5,2 x 10^{-16} m^{3}, (que corresponde a una microcápsula esférica de un diámetro menor que 10 \mum, más preferentemente menor que 6,5 x 10^{-17} m^{3} (5 \mum), más preferentemente alrededor de 4,2 x 10^{-18} m^{3} (2 \mum), e idealmente alrededor de 9 x 10^{-18} m^{3} (2,6 \mum)).

Las emulsiones termoestables usadas en CSR o PCR en emulsión tienen un diámetro medio de 15 \mum, y esto puede ser necesario para la actividad apropiada cuando se compartimentalizan células.

El tamaño de las microcápsulas debe ser suficientemente grande para acomodar todos los componentes requeridos de las reacciones bioquímicas que son necesarios para que se produzcan dentro de la microcápsula.

En el caso de CST, el gen y la enzima expresada se colocalizan usando células que contienen 100-500 copias de plásmido + 1000-100000 copias de polimerasa, y las células se emulsionan, por ejemplo usando 1 x tampón de Taq + 0,2 mM de dNTP de concentración final.

Hibridación del oligonucleótido: formando un primosoma artificial

La hibridación requiere la apertura de una región del ADN dúplex y la invasión de la hebra del oligonucleótido para hibridarse a una de las dos hebras de la "burbuja" de ADN dúplex fundida. Esta estructura puede actuar entonces como un primosoma artificial para una ADN polimerasa, que se puede extender posteriormente a lo largo de la hebra del molde (a la cual se hibrida el oligómero) hasta la siguiente región del dúplex (o más allá mediante desplazamiento de la hebra).

Como se muestra en los ejemplos, la hibridación del oligonucleótido simple a una secuencia diana proporciona una estabilidad suficiente para la captura del complejo de oligómero-plásmido después de la extensión.

Existen diversas tecnologías para incrementar la estabilidad del complejo de oligómero-plásmido (Fig. 1), incluyendo secuencias capaces de una formación de un tríplex, el uso de bases modificadas tales como diaminopurina (para sustituir A), abrazaderas G (Matteucci 99), LNA (ref), INA (ref), oligonucleótidos híbridos (Ishihara y Corey 99), incluyendo híbridos de ADN-PNA o ADN-péptido (Corey) o reticulación mediante UV usando psoraleno (ref). Como alternativa, el oligonucleótido que se hibrida se puede designar como una "sonda de candado" (Landegren), con un salto de secuencia definido entre los dos "pies pegajosos". La extensión, seguido de la ligación, generaría un catenano de oligómero-plásmido virtualmente no disociable (Fig. 2).

La fusión del dúplex, la invasión de la hebra y la hibridación se pueden facilitar a través de RecA o el uso de los denominados "abridores de PNA". Por ejemplo, se ha demostrado que RecA junto con \alphaS-ATP promueven la formación de un complejo de nucleoproteína estable con una sonda biotinilada monocatenaria y secuencias homólogas en ADN bicatenario circular (Hakvoort et al 96, Zhumabayeva et al 99), que se pueden capturar subsiguientemente en perlas magnéticas. Esta tecnología se ha aplicado con éxito para el aislamiento de los ADNc. Los oligómeros de PNA de homopiridina cortos son capaces de invadir secuencias complementarias en ADN dúplex, produciendo bucles de P (Nielsen 91, Demidov 95), y estos pueden actuar como promotores artificiales de la transcripción en ADN dúplex lineal (Mollegaard 94). Todas estas reacciones de apertura de hebras se facilitan mediante el superenrollamiento negativo en ADN plasmídico, pero por lo menos algunas también son aplicables a ADN bicatenario lineal no superenrollado.

Los expertos en la materia apreciarán que puede haber otros procedimientos para lograr el mismo resultado.

Captura del marcador

La captura específica del marcador del complejo de plásmido-oligonucleótido requiere la discriminación de los complejos modificados con el marcador de los complejos no modificados. Usando condiciones de lavado apropiadas, incluso puede ser posible discriminar grados de incorporación del marcador.

Los expertos en la materia apreciarán que los detalles precisos de la captura del marcador dependerán de la naturaleza del marcador. Por ejemplo, en el caso de que el marcador de captura sea un producto de la reacción catalizada por la enzima de interés, entonces la captura del marcador se puede producir usando un anticuerpo específico para el anticuerpo. De forma conveniente, los complejos marcados con biotina se pueden capturar en perlas revestidas con estreptavidina.

En todos los casos, es importante que durante el proceso de lavado, requerido para eliminar los complejos no marcados de plásmido-oligonucleótido, dichos complejos permanezcan estables, es decir, el plásmido y el nucleótido asociados no covalentemente no se disocien. Las condiciones de lavado se pueden ajustar dependiendo del tipo de complejo de plásmido-oligonucleótido, de tal forma que dicho complejo se estabilice, por ejemplo condiciones de baja concentración de sal en el caso de los complejos de PNA-ADN.

En las condiciones apropiadas, dichos complejos pueden ser muy estables y han permitido, entre otros, la captura por afinidad y la recuperación de ADN microbiano a concentraciones femtomolares, incluso en presencia de ADN exógeno (Chandler et al. 2000).

(B) Modulando la eficacia de la captura del plásmido/sensibilidad del procedimiento

Los presentes inventores han realizado intensos experimentos dirigidos a optimizar las condiciones para mejorar la eficacia de la captura del plásmido, y por lo tanto potenciar la sensibilidad de la técnica. Estos experimentos se describen con detalle en en la presente memoria en los Ejemplos 10 a 14.

En particular, los presentes inventores han descubierto que la eficacia de la captura del plásmido se puede incrementar usando una cualquiera o más de las técnicas en la lista que consiste en lo siguiente: incrementando la Tm del híbrido de oligonucleótido/plásmido; extendiendo el oligonucleótido en más de 3 bases; mediante el uso de un ligador de una longitud de más de 40 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido, y mediante el uso de un oligonucleótido de una longitud de más de 10 bases.

De forma más específica, según los experimentos realizados por los inventores, la eficacia de la captura del plásmido se ve incrementada aumentando la Tm del híbrido de oligonucleótido/plásmido usando cualquiera de las bases en la lista que consiste en lo siguiente: bases de LNA y otros tipos de bases adecuados.

Otras bases adecuadas para uso según los procedimientos de la invención incluyen pero no se limitan a diaminopurina (para sustituir A), abrazaderas G (Matteucci 99), LNA (Jepsen et al (2004), Oligonucleotides, 14, 130), INA (Christensen y Pedersen (2002), Nucleic Acid Res, 30, 4918) o cualesquiera otras modificaciones de bases o de cadenas principales que aumenten la Tm. Otras posibilidades para aumentar la Tm incluyen oligonucleótidos híbridos (Ishihara y Corey 99), incluyendo híbridos de ADN-PNA o ADN-péptido, o la reticulación covalente a la hebra del molde usando una molécula de psoraleno incorporada de forma estable en el oligonucleótido.

Los presentes inventores han descubierto asimismo que la eficacia de la captura del plásmido se incrementa extendiendo el oligonucleótido en más de 20 bases. De forma ventajosa, la eficacia de la captura del plásmido se incrementa extendiendo el oligonucleótido en más de 50 bases, o más de 100 bases.

Además, los presentes inventores han descubierto que la eficacia de la captura del plásmido se incrementa mediante el uso de un ligador de una longitud de más de 50 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido. De forma ventajosa, la eficacia de la captura del plásmido se incrementa mediante el uso de un ligador de más de 70 átomos de longitud entre el marcador molecular y el oligonucleótido. De la forma más ventajosa, la eficacia de la captura del plásmido se incrementa mediante el uso de un ligador de más de 100 átomos de longitud entre el marcador molecular y el oligonucleótido.

En los siguientes ejemplos se ilustran diversos aspectos y realizaciones de la presente invención. Se apreciará que se puede realizar una modificación del detalle sin separarse del alcance de la invención.

Todos los documentos mencionados en el texto se incorporan como referencia.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y procedimientos

Manipulación del ADN y expresión de proteínas: la manipulación del ADN se realizó según Sambrook, excepto que se especifique de otro modo. La Taq polimerasa, el fragmento Stoffel de Taq, D422 Taq, 611FrS Taq se expresaron a partir de pASK75 como se ha descrito previamente (Ghadessy 01, Meth Mol Biol (manuscrito adjunto)). Se amplificó Dpo4 de S. solfataricus a partir de pET22b:Dpo4 (proporcionado amablemente por el Dr. R. Woodgate, NIH, USA), usando los cebadores 1 y 2, Xba I/Sal I clonado, en pASK75, y se transformó en RW392. Para la expresión, se hicieron crecer hasta OD_{600} = 0,8 células de RW392 que producen pASK:Dpo4, en 2xTY/Amp (0,1 \mug/ml)/1% de glucosa, inducido mediante adición de anhidrotetraciclina hasta 0,2 \mug/ml final, y se expresaron durante 4 h a 37ºC.

Emulsionamiento: después de la expresión, las células se emulsionaron como se ha descrito previamente (Ghadessy et al 01, Meth Mol Biol (manuscrito adjunto).

Extensión del cebador: in vitro: se mezcló plásmido (colE1, por ejemplo pUC o pASK75) (10 ng) con cebador (10-100 pMs total), mezcla de dNTP (250 \muM (final) de cada dNTP, suplementado con 40-10 \muM (final) de biotin-16-dUTP (Roche) y 2,5 U de ADN polimerasa de Taq (HT biotechnology) en 1x de tampón de Taq (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% de Triton X-100, 1,5 mM de MgCl_{2}), y se incubó a 94ºC 5 min, 50ºC 5 min, 72ºC 10 segundos-5 min. Como alternativa, se mezclaron 2 x 10^{8} células expresoras (lavadas dos veces en 1x de tampón de Taq) con cebador (10-100 pM), mezcla de dNTP (250 \muM (final) de cada dNTP, suplementado con 40-10 \muM (final) de biotin-16-dUTP (Roche) en 1x de tampón de Taq (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% de Triton X-100, 1,5 mM de MgCl_{2}), y se incubó a 94ºC 5 min, 50ºC 5 min, 72ºC 10 segundos-5 min.

Captura del plásmido: los complejos de plásmido-oligonucleótido (POC) se purificaron a partir de la mezcla de reacción mediante paso a través de una columna ChromaSpin 1000 (Clontech) según las instrucción del fabricante, se purificaron con un kit de purificación mediante PCR de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante, o preferentemente se precipitaron en etanol (3 v/v de etanol, 1/10 v/v de 3M de NaAc) en presencia de glucógeno de mejillón (Roche) como portador, y se resuspendieron en un volumen igual de tampón de unión a perla (BBB: 10 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA, 0,2 M de NaCl).

Se lavaron dos veces 20 \mul de Dynabeads-280 (Dynal) en BBB, se bloquearon con 0,5% de caseína o 1 mg/ml de BSA durante 30 min a 22ºC, se añadieron a POC en un volumen total de 0,5 ml y se incubaron durante 2 h en un girador de parte superior a temperatura ambiente (RT). Las perlas se lavaron dos veces con BBB, y dos veces con 10 mM de Tris pH 8,0 (o, para condiciones de lavado menos restrictivas, dos veces con BBB con alto contenido de sal 10 mM de Tris pH 7,5, 1 mM de EDTA, 1 M de NaCl, y una vez con 10 mM de Tris pH 8,0), y se resuspendieron en 50 \mul de 10 mM de Tris pH 8,0.

Detección del plásmido mediante PCR: se añadieron directamente 1 \mul de Dynabeads a 20 \mul de mezcla de PCR que comprende los cebadores 4 y 5 (que amplifican el gen bla), los 4 dNTP (a una concentración final cada uno de 250 \muM) y 2,5 U de Taq 2,5 U de ADN polimerasa de Taq (HT biotechnology) en 1x de tampón de Taq (50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% de Triton X-100, 1,5 mM de MgCl_{2}), y se ciclaron a 94ºC 5 min, 15 x (94ºC 15 segundos, 50ºC 15 segundos, 72ºC 1,5 min), 65ºC 2 min.

Detección del plásmido mediante qPCR: el número de moléculas plasmídicas capturadas en las Dynabeads se cuantificó usando PCR de tiempo real cuantitativa. La amplificación de un amplicón corto a partir del plásmido molde se detectó midiendo la fluorescencia generada a partir de la incorporación de tinte CybrGreen usando Opticon 2 (GRI Molecular Biology Ltd.). Se usaron las condiciones según las recomendó el fabricante, excepto para el doblaje de la concentración del colorante CybrGreen en la mezcla de reacción. Se añadieron directamente 1 mkl de Dynabeads directamente a 20 mkl de mezcla de PCR que comprende los cebadores qPCRf y qPCRr que amplifican el fragmento de 100 pb del plásmido pASK75, los 4 dNTP a 200 mkM cada uno, y 2,5 U de SuperTaq ADN polimerasa en tampón 1 x Taq (HT biotechnology). Fue posible detectar de forma fiable y discriminar entre 10^{4} y 10^{9} copias de
plásmidos.

Elución y transformación de plásmidos: para la elución de plásmidos, se incubaron perlas en 200 \mul de tampón de elución de perlas (BEB: 1 mM de EDTA, 0,1 M de NaOH) durante <5 min Las perlas se capturaron en el imán, y el plásmido en el sobrenadante precipitó mediante adición de 1/10 V de 3M de NaAc, 3V de etanol y glucógeno de mejillón (Roche) como portador. El plásmido se precipitó mediante centrifugación en una centrífuga de mesa de laboratorio, el pelete se lavó una vez en 96% de etanol a RT, se secó y se resuspendió en H_{2}O, y se transformó mediante electroporación.

Detección de los plásmidos a partir de las perlas: la presencia del plásmido unido a las perlas se detectó mediante amplificación por PCR directa a partir de perlas que usan los cebadores 4 y 5 usando 1 \mul de perlas como molde, y el siguiente programa: (94ºC 5 min, 17 x (94ºC 15 segundos, 50ºC 15 segundos, 72ºC 1,5 min), 65ºC 2 min).

Cebadores de oligonucleótidos

100

24G: 5'-AAG 5AT CTT CAC CTA GAT CCT-3' (basado en el oligo 24 de JACS (1999), 121, 2012-2020, 2 extra 5' AA, 5= abrazadera G como en PNAS (1999), 96, 3513-3518 para una mayor Tm (proporcionada amablemente por S. Holmes, MRC LMB) pero con 2' Ome)

24GB: 5'-6 AAG 5AT CTT CAC CTA GAT CCT-3' (basado en el oligo 24 de JACS (1999), 121, 2012-2020, 2 extra 5' AA, 5= abrazadera G como en PNAS (1999), 96, 3513-3518 para una mayor Tm (proporcionada amablemente por S. Holmes, MRC LMB) pero con 2' Ome), 6=biotina

24DAP: 5'-C5A 5A5 GG5 TCT TCA CCT AGA TCC T-3' (basado en el oligo 24 de JACS (1999), 121, 2012-2020, secuencia 5' extra CAAAAA, 5= 2,6-diaminopurina para una mayor Tm

24DAPB: 5'-6 C5A 5A5 GG5 TCT TCA CCT AGA TCC T -3' (basado en el oligo 24 de JACS (1999), 121, 2012-2020, secuencia 5' extra CAAAAA, 5= 2,6-diaminopurina para una mayor Tm, 6=biotina

26DAP24B: 5'-6 GGT C5T G5G 5TT 5TC 5AA AAG GAT CTT CAC CTA GAT CCT-3' (basado en el oligo 24 de JACS (1999), 121, 2012-2020, secuencia 5' extra, CAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCT, 5= 2,6-diaminopurina para una mayor Tm, 6=biotina

101

24LNA: 5'-GAT CTT CAC CTA GAT CCT-3' las bases subrayadas fueron LNA (MRC oligoservice) 24 5'-GAT CTT CAC CTA GAT CCT-3'

102

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Ejemplo 2

Actividad basada en la captura del plásmido debido a la incorporación de biotin-16-dUTP

Se usaron 24 G (u oligo 3) para la extensión del cebador in vitro sobre el plásmido pUC119, usando biotin-16-dUTP como el marcador. Las extensiones se llevaron a cabo en presencia (fracción +) o ausencia (fracción -) de Taq polimerasa. Los complejos de plásmido-oligómero se purificaron en ChromaSpin 1000, se capturaron después de la extensión sobre perlas magnéticas revestidas con estreptavidina, y la presencia del plásmido capturado sobre las perlas se determinó usando PCR a partir de las perlas (Fig. 5A). Como se puede observar, sólo en la presencia de una polimerasa activa es cuando el plásmido es capturado en las perlas, mientras que el lavado contiene plásmido tanto en presencia como en ausencia de polimerasa. La comparación de dos cebadores diferentes (24G frente al oligo 3 (88)), los cuales ceban sobre pASK, mostraron poca diferencia en la eficacia de la captura (Fig. 5B), a pesar del hecho de que el oligo 24 se había identificado previamente como especialmente potente en la invasión de la hebra (Ishihara y Corey, 99).

El plásmido también se detectó mediante elución de las perlas y retransformación (Tabla 1)

1

Aunque con un rendimiento desalentador, hay una clara diferencia (aproximadamente 5 veces) en la cantidad de plásmido eluido.

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Ejemplo 3

El plásmido es capturado, y el producto de extensión no es capturado

Se repitió el experimento en el ejemplo 2, pero a fin de mostrar que la amplificación mediante PCR de las perlas detectó realmente plásmido capturado y no simplemente la producción y captura de productos de extensión biotinilados, las perlas se incubaron con 20 U de DpnI (New England Biolabs) durante 2 h a 37ºC, antes de la amplificación. DpnI sólo digiere ADN metilado, y por lo tanto destruye selectivamente ADN plasmídico pero no los productos de extensión. Como se puede observar a partir de la Fig. 6, la predigestión con DpnI reduce drásticamente la cantidad de producto de PCR obtenido, indicando que la PCR detecta plásmido capturado y no productos de extensión
capturados.

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Ejemplo 4

Captura de plásmido a partir de las células

Se repitió el experimento de la captura usando células bacterianas que expresan Taq polimerasa activa a partir de pASK, en oposición al uso de Taq polimerasa recombinante y plásmido pASK añadido desde fuera. Se llevaron a cabo experimentos en presencia (fracción +) o ausencia (fracción -) de la mezcla de dNTP. Como antes, sólo existe captura cuando la polimerasa puede extender y marcar el oligonucleótido hibridado (Fig. 7). De forma significativa, la captura del plásmido a partir de células parece que es casi eficiente como la captura de plásmido en disolución, indicando que la etapa inicial de calentamiento es suficiente para liberar el plásmido de la célula (Fig. 7). El análisis mediante PCR de los lavados de las perlas indica que, aunque inicialmente se adhieren a las perlas grandes cantidades de plásmido de forma no específica, éstas se pueden eliminar por lavado si no están marcadas (como se puede ver a partir de la mayor cantidad de plásmido presente en los lavados procedentes de la fracción -).

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Ejemplo 5

Captura de plásmido a partir de células en emulsión

Se repitió el experimento del ejemplo 5 pero usando el emulsionamiento de la reacción de extensión que comprende células expresoras, oligonucleótido 24G, mezcla de dNTP que incluye biotin-16-dUTP en 1x de tampón de Taq. Nuevamente, sólo existe captura cuando la polimerasa puede extender y marcar el oligonucleótido hibridado (Fig. 8).

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Ejemplo 6

Polimerasas con una baja procesabilidad o actividad cuando son capturadas eficientemente usando CST

Se repitió el experimento de captura del ejemplo 5 usando células bacterianas que expresan diferentes polimerasas con actividades variables (V_{max}/K_{M}) o procesabilidades. Aquellas incluyen Taq polimerasa (elevada actividad, elevada procesabilidad), fragmento Stoffel de Taq (elevada actividad, baja procesabilidad), Taq\Box442 (baja actividad, baja procesabilidad, baja estabilidad), Taq611 (inactiva), Taq611+ (Taq611 con Taq recombinante añadida) y Dpo4 de S. solfataricus P2 (actividad media, procesabilidad media a baja). El análisis mediante PCR del plásmido de captura muestra que CST permite una captura eficaz de Taq (Fig. 9A, 9b) y Dpo4 (Fig. 9B), y en menos extensión del fragmento Stoffel (Fig. 9A, 9B), mientras que Taq\Box442 (Fig. 9A, 9B) o la Taq611 inactiva (Fig. 9A) no son capturadas. Taq611+ (Taq611 con Taq recombinante añadida (Fig. 9A)) es capturada de forma eficaz con la condición de que las diferencias en la captura no sean debidas a diferencias en las secuencias génicas de la polimerasa, sino debidas a la actividad y procesabilidades de las polimerasas codificadas.

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Ejemplo 7

Selección de polimerasas activas usando CST

A fin de determinar si CST se pudiera usar para seleccionar la actividad de polimerasa a partir de un repertorio de clones, se añadieron células que expresan Taq polimerasa de tipo natural activa a un exceso (10^{2} veces, 10^{3} veces, 10^{4} veces y 10^{6} veces) de células que expresan Taq611 polimerasa inactiva emulsionada, y se llevó a cabo la selección mediante CST. La composición del plásmido capturado se analizó usando PCR a partir de las perlas.

Para la adición de 10^{2} y 10^{3}, sólo se amplificó la región de 611 antes y después de la selección, y Taq de tipo natural y Taq611 se distinguieron mediante digestión por restricción (Taq611 tiene un sitio de restricción de Bgl II que falta en la enzima de Taq de tipo natural). Como se puede ver a partir de la Fig. 10A, hay un claro enriquecimiento tanto en la adición de 10^{2} como en la de 10^{3}, como es evidente en la aparición de una fracción resistente a Bgl II tras la selección.

Para la adición de 10^{4} y 10^{6}, el gen de Taq polimerasa completo se amplificó usando los cebadores 6, 7 a partir de las perlas, y se reclonó mediante Xba I/Sal I en pASK para la expresión, después de lo cual se puntuaron 100 clones para determinar la actividad. Como se muestra en la Fig. 10B, habían 47/95 clones activos después de la selección para la adición de 10^{4}, y 21/95 clones activos después de la selección para la adición de 10^{6}, indicando un factor de selección de >10^{4} veces.

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Ejemplo 8

Discriminación de la especificidad del sustrato de polimerasa usando CST

A fin de evaluar si CST podría discriminar entre distintas actividades de polimerasa con respecto a la extensión o incorporación de sustratos no naturales, se realizaron experimentos de CST como en el ejemplo 2 usando Taq recombinante, así como los mutantes M1 y R22 de Taq recombinante. M1 tiene una mayor capacidad para extender el análogo de base hidrófoba 5-nitroindol, mientras que R22 tiene una mayor capacidad para incorporar ribonucleótidos. Como muestra la Figura 11, M1 presenta una mayor capacidad para extenderse a partir del cebador 3 que contiene un análogo de 3' de 5-nitroindol, mientras que R22 muestra una captura mucho mayor, aunque débil, cuando la extensión se lleva a cabo en una mezcla nucleotídica en la que dATP está completamente sustituido por ATP
(equimolar).

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Ejemplo 9

La hibridación simple de oligonucleótidos biotinilados al plásmido puede ser suficiente para la captura

La captura del plásmido mediante uso de un oligonucleótido con una biotina en 5' se comparó con la captura del plásmido mediante un oligonucleótido no biotinilado idéntico. Contrariamente al ejemplo 2, la hibridación simple (incubación a 95ºC durante 5 min, hibridación a 50ºC durante 5 min) de 10 pM de oligómero y 10 fM de plásmido pASK75 mostró una captura de las 10^{7} copias de plásmido con el oligonucleótido biotinilado, mientras que sólo se capturaron alrededor de 10^{5} copias del plásmido sobre perlas magnéticas de forma no específica cuando se usó oligonucleótido no biotinilado (Figura 12). Esto es debido al uso de un tratamiento con una concentración elevada de sal de los complejos de plásmido-oligonucleótido (kit de preparación de PCR de Qiagen), en lugar de un tratamiento con un bajo contenido en sal (ChromaSpin). En un experimento típico, un número de partida de plásmidos es alrededor de 10^{8} copias, y alrededor de 5-10% de esos se pueden recuperar mediante unión a las perlas.

Nota: el oligonucleótido de ADN usado en este experimento (24G) se estabiliza mediante inclusión de una abrazadera de G.

Se puede concluir que una única biotina es suficiente para capturar sobre Dynabeads.

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Ejemplo 10

Comparación de oligonucleótidos de ADN y oligonucleótidos de ADN-LNA

Se ensayaron in vitro para la captura de plásmido oligonucleótidos que contienen biotina en 5' y alrededor de 30% de bases de LNA (lo que conduce a una mayor Tm de un híbrido de cebador-molde). Se encontró que el aumento de estabilidad del complejo de cebador-plásmido de LNA condujo a un incremento de alrededor de 5-10 veces en la captura del plásmido por hibridación (sin extensión), cuando se compara con todos los oligonucleótidos de ADN (con o sin abrazadera de G) (Figura 11, 12). El incremento es mayor cuando se compara con un oligonucleótido 24 de ADN estándar, Figura 12), que cuando se compara con un oligonucleótido 24G de ADN modificado (Figura 11).

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Ejemplo 11

Efecto de la longitud de extensión sobre la captura del plásmido

Se extendió in vitro un ADN biotinilado en 5' (24) o un oligonucleótido de ADN-LNA (24LNA: 5'-GAT CTT CAC CTA GAT CCT-3', nucleótidos de LNA subrayados) en 3, 9 o cientos de bases, y se comparó la captura del plásmido con la de una hibridación simple. La extensión limitada fue posible usando el cebador 24 y 24LNA, el cual ceba para replicar la secuencia del molde: 3'-AAATTTGATCACTTC-5') y suministrando sólo dTTP (que limita la extensión a tres bases (secuencia del molde 3'-AAATTTGATCACTTC-5', las bases de los moldes en negrita), o dTTP, dATP, dCTP (9 nucleótidos, (secuencia del molde 3'-AAATTTGATCACTTC-5', bases de los moldes en negrita)) o los 4 dNTP (extensión no limitada, cientos de bases de extensión).

Se encontró que para el oligonucleótido de ADN hay una correlación entre la longitud de extensión y la captura del plásmido (cuanto mayor es la extensión, mayor plásmido se captura, Figura 13B), mientras que para la extensión del oligonucleótido de ADN-LNA mediante 3 ó 9 bases no se produce un aumento significativo en la captura del plásmido en comparación con una hibridación simple (figura 13A). Sin embargo, la extensión no limitada conduce a un aumento en la cantidad de plásmido que es capturado en las Dynabeads.

Estos resultados proporcionan una prueba de que, en la selección mediante CST, la eficacia catalítica mejorada de la polimerasa (y, por lo tanto, la mayor extensión del cebador) conduce a una mayor probabilidad de que el plásmido sea capturado. En este caso, el cebador de ADN usado no tuvo una abrazadera de G y por lo tanto la diferencia entre LNA/ADN y el cebador de sólo ADN sin extensión es próxima a 50 veces en lugar de 5 veces como es el caso para 24G en el ejemplo 11.

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Ejemplo 12

Comparación de diferentes cebadores para uso en CST

Los cebadores que ceban en diferentes regiones de pASK75 (24G, pASK2 5'-GATCTTCACCTAGATCCT-3', pASK3 5'-CATGCCATCCGTAAGATGC-3', pASK4 5'-GTTCCTGGCCTTTTGCTGG-3' y pASK5 5'-ACGTAGT
GGGCCATCG-3') se compararon en cuanto a su eficacia de la captura del plásmido. Como ya se ha observado en el ejemplo 2, hubo muy poca diferencia en la eficacia de la captura del plásmido dependiendo de la secuencia o localización del cebador (dato no mostrado).

Este resultado sugiere que, en la selección mediante CST, los parámetros (por ejemplo secuencia a replicar) se pueden elegir libremente.

El uso de una mezcla de 5 cebadores (con la misma concentración final (100 pM)) condujo a un incremento de alrededor de 2-3 veces en la cantidad de plásmido que es capturado en las perlas, lo que sugiere que todo el plásmido está disponible para el cebado, y que el marcado del plásmido se puede lograr en múltiples sitios.

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Ejemplo 13

Mejora de la sensibilidad del CST

La eficacia de la captura mediante biotina, y de este modo la sensibilidad de la selección mediante CST, se puede mejorar hasta 100 veces con el uso de un ligador muy largo entre la molécula de biotina y el cebador, como se ha sugerido previamente mediante experimentos de hibridación (Shchepinov et al., NAR, Vol. 25, número 6, 1997). Este documento se incorpora en la presente memoria como referencia. Se comparó en un ensayo la eficacia del experimento de la captura del plásmido con cebadores 24GB y 108B. El cebador 108B tiene biotina en 5' en un ligador de 108 átomos de longitud, mientras que el cebador de 24GB tiene una biotina en 5' en un ligador de 16 átomos de longitud. La eficacia de la captura del plásmido tras un experimento de hibridación simple (como en el ejemplo 11) fue hasta 100 veces mayor cuando se usó el cebador de 108B (Figura 14).

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Ejemplo 14

La longitud mínima del cebador de ADN requerida para la captura

Se ensayaron in vitro los cebadores 18 (5'GATCTTCACCTAGATCCT-3'), 14 (5'TTCACCTAGATCCT-3'), 12 (5'CACCTAGATCCT-3'), 10 (5'CCTAGATCCT-3') y 8 (5'TAGATCCT-3') de 18, 14, 12, 10 y 8 pb de longitud, respectivamente, para determinar la eficacia de la captura del plásmido tras la extensión con los dNTP. Se observó que la longitud del cebador no afecta a la eficacia en la captura del plásmido en tanto que el cebador/oligonucleótido tenía más de 10 bases de longitud (Figura 15).

Claims

1. Procedimiento para la selección de una enzima capaz de modificar directa o indirectamente un oligonucleótido, en el que el procedimiento no depende de la replicación completa del gen que codifica la enzima que modifica el oligonucleótido, procedimiento que comprende las etapas siguientes:

(b): Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a), de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con una o más de las enzimas codificadas por el plásmido y un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a).

(e): capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima seleccionada posee una o más de cualquiera de las siguientes propiedades: una renovación catalítica baja (en las condiciones de selección), una baja procesabilidad (en las condiciones de selección), la incorporación de sustratos modificados, que genera un polímero similar a un ácido nucleico que no se puede reamplificar.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la enzima es una enzima que procesa ácidos nucleicos.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, que comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar una o más moléculas de ácidos nucleicos en forma de plásmidos progenitores que codifican una o más polimerasas de ácidos nucleicos, en el que el plásmido o plásmidos progenitores proporcionan la secuencia génica de la enzima de interés que procesa ácidos nucleicos.

(b): Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a) en compartimientos, de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con una o más de las polimerasas de ácidos nucleicos codificadas por el plásmido;

(c): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la asociación estable de un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (b) con esa región del plásmido;

(d): extender el oligonucleótido según la etapa (b) usando la enzima que procesa ácidos nucleicos, en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y

(e): capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que la enzima que procesa ácidos nucleicos se selecciona de entre cualquiera de las comprendidas en el grupo constituido por: ADN polimerasas de la familia de polY, ADN polimerasas de la familia polX, variantes de baja procesabilidad de polimerasas de alta procesabilidad; ADN ligasas, ARN ligasas, polinucleótido quinasas.

6. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, en el que la enzima que procesa ácidos nucleicos es una ADN polimerasa.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a): proporcionar una o más moléculas de ácidos nucleicos en forma de plásmidos progenitores que codifican una o más ADN polimerasas, en el que el plásmido o plásmidos progenitores proporcionan la secuencia génica de la polimerasa de interés.

(b): Compartimentalizar los plásmidos según la etapa (a) en compartimientos, de forma que cada compartimiento comprenda un plásmido junto con una o más ADN polimerasas codificadas por el plásmido; y un oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a) con esa región del plásmido

(c): proporcionar condiciones de forma que se pueda producir la asociación estable del oligonucleótido específico para una región en el plásmido según la etapa (a) con esa región del plásmido;

(d): proporcionar condiciones de forma que el extremo 3' del oligonucleótido según la etapa (b) es capaz de ser extendido usando la ADN polimerasa según la etapa (a) en presencia de uno o más nucleótidos modificados que comprenden un marcador molecular; y

(e): capturar el complejo de oligonucleótido modificado/plásmido extendido en 3'.

8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la enzima que procesa ácidos nucleicos es una polinucleótido quinasa, y la etapa de modificación del oligonucleótido implica la fosforilación del extremo 5' de los oligómeros seguido por la ligación del marcador de un oligonucleótido adicional enlazado a un marcador molecular.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 5, en el que el procedimiento está destinado para la selección de ADN ligasas, y cada compartimiento comprende uno o más plásmidos que codifican la ligasa de interés, uno o más oligonucleótidos capaces de asociarse con un plásmido que codifica la ligasa de interés, la ligasa codificada por el plásmido, y uno o más oligonucleótidos marcados en forma de nucleótidos marcados.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 5, que se usa para la selección de enzimas que actúan directamente sobre una molécula sustrato enlazada a un oligonucleótido.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, 2 ó 5, en el que la enzima es una enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que cada compartimiento comprende un plásmido que codifica una enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos, una o más enzimas que están codificadas por el plásmido, una o más ADN replicasas, y uno o más sustratos modificados de la enzima codificada por el plásmido.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que la enzima que está implicada indirectamente en el procesamiento de ácidos nucleicos está implicada en la producción de sustratos de replicasas de ácidos nucleicos a partir de un sustrato bloqueado o inactivo (el sustrato modificado de una enzima), o está implicada en la inactivación funcional de inhibidores de replicasas de ácidos nucleicos (el sustrato modificado) presentes dentro del compartimiento.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que la enzima está implicada en la producción de sustratos de replicasas de ácidos nucleicos a partir de un sustrato bloqueado o inactivo.

15. Procedimiento según una o varias de las reivindicaciones 4 a 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta usando una o varias de cualquiera de las técnicas en la lista que consiste en las siguientes: incrementando la Tm del híbrido de oligonucleótido/plásmido; extendiendo el oligonucleótido en más de 3 bases; mediante el uso de un ligador de una longitud superior a 40 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido; mediante el uso de un oligonucleótido de una longitud superior a 10 bases.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta incrementando la Tm del híbrido de oligonucleótido/plásmido usando cualquier base en la lista que consiste en las siguientes: bases de LNA; diaminopurina (para reemplazar A), abrazaderas de G; INA, o cualquier otra modificación de bases o de cadena principal que aumenten la Tm.

17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en una base o más.

18. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en 3 bases o más.

19. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en 9 bases o más.

20. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en más de 20 bases.

21. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en más de 50 bases.

22. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta extendiendo el oligonucleótido en más de 100 bases.

23. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta mediante el uso de un ligador de una longitud superior a 50 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta mediante el uso de un ligador de una longitud superior a 70 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido.

25. Procedimiento según la reivindicación 23, en el que la eficacia de la captura del plásmido aumenta mediante el uso de un ligador de una longitud superior a 100 átomos entre el marcador molecular y el oligonucleótido.