DE602004012881T2

DE602004012881T2 - Cst (compartmentalised self tagging)

Info

Publication number: DE602004012881T2
Application number: DE602004012881T
Authority: DE
Inventors: Philipp Holliger; Zoryana Oliynyk
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2003-11-03
Filing date: 2004-11-03
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2024-11-04
Also published as: US7691576B2; ATE391188T1; DK1680516T3; WO2005045072A1; ES2303959T3; DE602004012881D1; US20070134682A1; US20100184071A1; EP1680516B1; ZA200603523B; US8133673B2; GB0325653D0; EP1680516A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Selektion Nukleinsäure-prozessierender und anderer Enzyme. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Selektion von Nukleinsäurepolymerasen und anderen Enzymen mit gewünschten Eigenschaften, basierend auf dem Verfahren der kompartimentierten Selbst-Markierung.
Hintergrund
Kompartimentierungsverfahren, die auf Wasser-in-Öl-Emulsionen basieren, sind jüngst für die Verwendung bei Repertoire-Selektionsverfahren entwickelt worden (Griffiths 98/Ghadessy 01/Sepp 02/Griffith). Die Kompartimentierung segregiert einzelne Gene und ihre codierten Produkte (ausgeliefert entweder über Zellen (Ghadessy) oder in situ exprimiert (Griffith/Sepp)) in voneinander abgegrenzte, physikalisch getrennte wässrige Kompartimente, was somit die Verbindung von Genotyp und Phänotyp während des Selektionsprozesses sicherstellt. Nach der Selektion werden Gene, die die gewünschten enzymatischen Aktivitäten codieren, isoliert, dies entweder durch Modifikation (z. B. Methylierung), durch Präsentation auf Kügelchen (Beads) (Sepp/Griffith) oder durch Amplifikation (Ghadessy 01).
Amplifikation (CSR) und Einfangen durch Beads (IVC) sind beispielhaft genannt worden für die Selektion neuer enzymatischer Aktivitäten, d. h. Varianten von Taq-Polymerase, die entweder thermostabiler oder resistenter gegenüber dem Inhibitor Heparin sind (Ghadessy 01), oder Varianten von Phosphotriesterase (Griffith 03), die einen gesteigerten Umsatz zeigen. Jedoch sind beide Verfahren abhängig von einem hohen katalytischen Umsatz (und/oder einer hohen Prozessivität im Falle von Polymerasen) und scheinen für die Selektion von Enzymen mit einem geringen Umsatz schlecht geeignet zu sein. Obwohl ein starker Selektionsdruck für einen hohen enzymatischen Umsatz erstrebenswert als ein Endpunkt ist, schränkt es den Typ der katalytischen Aktivitäten ein, der unter Verwendung des Systems zugänglich ist. Insbesondere ist es so, dass, selbst wenn von einem hochaktiven Enzym ausgegangen wird, wesentliche Modifikationen der Substratspezifität oder sogar des katalytischen Mechanismus mit hoher Wahrscheinlichkeit in einem stark reduzierten katalytischen Umsatz resultieren können, da hochaktive Enzyme viele Mutationen von der Ausgangssequenz entfernt liegen können und daher möglicherweise nicht innerhalb der Grenzen der molekularen Repertoires, die realistischerweise durch CSR (oder IVC) gehandhabt werden können (10¹⁰), zugänglich sind. Beispiel: Bei kinetischen Studien an E. coli DNA-Polymerase I steigerten Mutationen wie etwa E710A die Affinität und den Einbau von Ribonukleotiden auf Kosten geringerer katalytischer Geschwindigkeitsraten und geringerer Affinität für wildtypische Substrate (Desoxyribonukleotide) (1). Die entsprechende Mutante von Taq DNA-Polymerase I, E615A, könnte Ribonukleotide effizienter einbauen als wildtypische Polymerase. Jedoch war sie nur in der Lage, sehr kurze Fragmente und nicht das Taq-Gen voller Länge zu synthetisieren (J. L. Ong, P. H., unveröffentlichte Ergebnisse). Bei einem anderen Selektionsversuch, bei dem Beta-Glucuronidase zu Beta-Galactosidase weiter entwickelt wurde, wurde der gewünschte Phänotyp nach mehreren Runden der Selektion erhalten, jedoch auf Kosten der katalytischen Aktivität. Es wurde außerdem herausgefunden, dass ausgewählte Varianten bei den anfänglichen Runden der Selektion in der Lage waren, die Umsetzung mehrerer verschiedener Substrate zu katalysieren, die von keinem der Elternenzyme verwendet wurden, und dies bei viel geringeren katalytischen Geschwindigkeitsraten (2). Es ist somit für viele Selektionszielsetzungen (z. B. veränderte Substratspezifität) wahrscheinlich, dass Zwischenprodukte entlang des evolutionären Wegs hin zum neuen Phänotyp eine reduzierte katalytische Aktivität besitzen werden. Es wäre daher erstrebenswert, ein Verfahren zu besitzen, um Polymerase-Aktivität (und andere enzymatische Aktivitäten) mit einem geringeren Schwellenwert der Selektion selektieren zu können (wobei idealer Weise nur ein einziges Umsetzungsereignis benötigt wird).
Für die Selektion von Polymerasen mit geringerer katalytischer Aktivität oder Prozessivität haben die vorliegenden Erfinder zuvor eine Modifikation von CSR vorgeschlagen, die als „Short-Patch-CSR" (spCSR) bezeichnet wird, und bei der nur eine kleine Region (ein „Patch") des untersuchten Gens einer Zufallsveränderung (Randomisierung) und Replikation unterzogen wird (siehe ursprüngliches CSR-Patent). spCSR hat die Selektion von Varianten der Taq-Polymerase ermöglicht, die befähigt sind, Ribonukleotid- anstelle von Desoxyribonukleotid-Triphosphaten als Substrate zu verwenden, und die unter Verwendung von Standard-CSR nicht isoliert werden konnten. Jedoch erfordert die spCSR nach wie vor hunderte bis tausende von Umsetzungsereignissen, damit das Enzym selektierbar wird.
Theoretisch kann das Verfahren der CSR, das Biotin-markierte Nukleotide nutzt (allgemein beschrieben in der PCT/GB98/01889 ), verwendet werden, um einzelne Umsetzungsereignisse von Enzymen, z. B. Polymerasen, zu detektieren. In der Praxis haben die vorliegenden Erfinder jedoch herausgefunden, dass dieses Verfahren aus mehreren Gründen nicht optimal effizient ist:

– Die In situ-Expression von Polymerasen (in Kompartimenten) ausgehend von einem linearen DNA-Fragment, welches das Polymerase-Gen und z. B. einen T7-Promotor umfasst, kann unter Verwendung eines In vitro-Transkriptions-/Translationssystems (ivt) (wie etwa den kommerziell erhältlichen) erreicht werden. Wir haben jedoch herausgefunden, dass die Anwesenheit biotinylierter Nukleotide (Biotin-dNTP) in der Markierung der 3'-Enden des linearen Fragments mit Biotin resultiert, und zwar unabhängig von der Aktivität der exprimierten Polymerase und unabhängig von der Natur des 3'-Endes (5'-Überhang, glatt oder 3'-Überhang). Dies resultiert in einem solch hohen Hintergrund, dass ein einzelnes Umsetzungsereignis einer interessierenden Polymerase nicht oberhalb hiervon detektierbar ist.

Die vorliegenden Erfinderdenken, dass die Gründe hierfür folgende sind:

– dass einige ivt-Extrakte selbst endogene Terminale Transferase-Aktivität (TT) enthalten,
– T7 RNA Pol selber wesentliche TT-Aktivität besitzt (siehe z. B. McGinness et al (2002) Chem. Biol., 9, 585–596) und vorliegt, selbst bevor irgendwelche interessierende Polymerase exprimiert wurde und daher einen Vorsprung beim Modifizieren freier 3'-Enden besitzt
– DNA-Polymerasen (soweit sie von den vorliegenden Erfindern getestet wurden) durch ivt-Systeme nur schwach exprimiert werden,
– DNA-Polymerasen in den ivt-Puffern geringe Aktivität zeigen (soweit durch die vorliegenden Erfinder getestet).

Mögliche technische Lösungen hierfür beinhalten folgende:

1) Konditional geblockte 3'-Enden. Das Problem bei diesem Ansatz ist, dass die Chemie anspruchsvoll ist. Zusätzlich löst dieses Verfahren nicht das Problem, dass die Polymerasen durch ivt-Systeme schwach exprimiert werden und in ivt-Puffern nur schwach aktiv sind.
2) Das 2-Schritt-Verfahren, das im Namen der vorliegenden Erfinder in der PCT/GB01/04108 beschrieben ist: 2-Schritt-ivt, gefolgt vom Test, ob die resultierende Polymerase DNA verlängert. Der Nachteil bei diesem Verfahren besteht darin, dass es zeitaufwändig durchzuführen ist. Zusätzlich löst es nicht das Problem, dass DNA-Polymerasen durch ivt-Systeme schwach exprimiert werden.

Andere Verfahren für die Selektion von Polymerasen beinhalten das Verfahren der „benachbarten Kopplung" (Proximity Coupling), wie sie beim Phage-Display verwendet wird. Ein solches Verfahren beinhaltet das in Nachbarschaft erfolgende Präsentieren sowohl von Substrat als auch von Enzym auf dem Phagenpartikel (Neri 99, Schultz 00). Dieses Konzept stützt sich auf die in cis erfolgende Umsetzung von Substrat zu Produkt oder, im Falle von Polymerasen, auf den Einbau eines markierten Nukleotids in ein Matrizen-Primer-Duplex-Substrat, das an dem Phagenpartikel angebunden ist (Jestin 01, Xia 02). Jüngst ist das Verfahren erfolgreich verwendet worden, um auf eine Variante der Taq-Polymerase, Stoffel-Fragment, hin zu selektieren, die Ribonukleosid-Triphosphate (rNTPs) mit Effizienzen einbaut, die denen von wildtypischem Enzym für dNTP-Substrate nahe kommen (Xia 02). Jedoch sind mehrere Probleme mit der Verwendung dieses Verfahrens verbunden. Wichtiger Weise müssen die Selektionsbedingungen mit der Lebensfähigkeit des Phagen kompatibel sein, und die intramolekulare Anbindung des Substrats kann die Selektion von Polymerasen mit geringer Affinität für die Matrizen-Primer-Duplex und mit geringer Prozessivität begünstigen.
Daher verbleibt in der Technik ein Bedarf für die Bereitstellung eines Verfahrens für die Selektion von Nukleinsäure-prozessierenden Molekülen, insbesondere DNA-Polymerasen, die einen geringen katalytischen Umsatz und/oder eine geringe Prozessivität besitzen, wobei das Verfahren nicht durch Selektionsbedingungen eingeschränkt wird, die für die Phagen-Lebensfähigkeit benötigt werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben zuvor ein Verfahren für die Selektion Nukleinsäureprozessierender Enzyme, die eine gewünschte Aktivität besitzen, entworfen. Ein solches Verfahren ist als gesteuerte Evolution bekannt, und ein solches Verfahren verwendet die Technik der kompartimentierten Selbstreplikation (CSR). Beide Prozeduren sind in der PCT/01/04108 und GB/002/005216 beschrieben.
Die vorliegenden Erfinder haben nun ein alternatives, auf der Technik der „kompartimentierten Selbstreplikation (CSR)" basierendes Verfahren für die Selektion Nukleinsäure-prozessierender Enzyme, insbesondere von Polymerasen, entworfen, das besonders geeignet für die Isolierung von Enzymen mit geringerem katalytischem Umsatz sein kann. Dieses Verfahren wird als CST (kompartimentierte Selbst-Markierung) bezeichnet. Es basiert auf dem Einfangen eines Plasmids, das für die Polymerase oder ein anderes Bindemittel codiert, mittels aktivitätsabhängiger Markierung mit einem Oligonukleotid.
Ein solches Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber Verfahren aus dem Stand der Technik, die für die Selektion Nukleinsäure-prozessierender Enzyme verwendet werden. Das heißt, es vereint die entsprechenden Vorteile von CSR und benachbarter Kopplung:

– Es selektiert nicht auf diejenigen Enzyme, die eine geringe Affinität für das Substrat (Primer-Matrizen-Doppelstrang) besitzen und die daher einen begrenztem praktischen Nutzen haben können, und
– die Selektionsbedingungen des Verfahrens sind nicht auf diejenigen beschränkt, die für die Phagen-Lebensfähigkeit notwendig sind, was es somit einem viel größeren Spektrum von Enzymen erlaubt, selektiert zu werden, als es bei Verfahren aus dem Stand der Technik der Fall ist, die sich auf die Technik des Phage-Displays stützen.
– Gleichzeitig ist es nicht abhängig von der vollständigen Replikation des Polymerasecodierenden Gens. Tatsächlich kann die Primerwirkung irgendwo auf dem Plasmid oder dem linearen DNA-Fragment erfolgen, das die Polymerase codiert, und es ist möglich, dass die Selektion nur den Einbau weniger Nukleotide erfordert.
– CST ist anders als CSR geeignet für die Selektion von Polymerasen mit einer hohen Fehlerrate (bei willkürlicher Definition einer hohen Fehlerrate als etwa 1/N Fehler pro Replikationszyklus für ein Polymerase-Gen von N Basen). Bei solchen Polymerasen führt CSR zu einer Akkumulation schädlicher Mutationen während der Selbstreplikation. Als ein Ergebnis wird ein großer Anteil der „Nachkommen"-Gene Polymerasen codieren, die aufgrund der Mutationen eine eingeschränkte Aktivität besitzen. Dieser Effekt ist besonders ausgeprägt bei Polymerasen, die eine große Anzahl von Leserasterverschiebungsfehlern erzeugen, da für die Mehrheit von diesen erwartet werden kann, dass sie die Aktivität der betroffenen Klone vollständig zerstören. Im Gegensatz dazu ist es bei der CST so, dass es das Elternplasmid ist, welches die Gensequenz der selektierten Polymerase bereitstellt, d. h. diese codiert. Das tatsächliche Produkt der Primer-Verlängerung dient nur als eine Markierung, über die das Elternplasmid isoliert wird. Daher werden sämtliche Fehler, die während der Primer-Verlängerung eingebaut werden, nicht auf die „Nachkommenschaft" übertragen.
– CST ist der CSR im Hinblick auf die Evolution und Selektion von Polymerasen überlegen, die modifizierte Nukleotide oder andere Substrate einbauen, bei den Fällen, bei denen diese Modifikationen die Replikation der Verlängerungsprodukte durch verfügbare Polymerasen ausschließen. Mit anderen Worten wäre die Amplifikation der Nachkommen-Gene aus der CSR unmöglich, da diese die Replikation blockierende Modifikationen an der DNA-Chemie enthalten würden. Im Gegensatz dazu müssen die Selektionsprodukte bei der CST nicht „erneut amplifizierbar" sein. Es ist das Elternplasmid, das die Gensequenz der selektierten Polymerase bereitstellt. Das tatsächliche Produkt der Primer-Verlängerung dient nur als eine Markierung, über welche das Elternplasmid isoliert wird. Daher verhindert kein blockierendes modifiziertes Nukleotid oder andere während der Primer-Verlängerung eingebaute Substrate die Gewinnung und erneute Amplifikation der „Nachkommen"-Gene. Tatsächlich müssen die Verlängerungsprodukte den Nukleinsäuren nicht chemisch nahe stehend oder nicht einmal mit diesen verwandt sein.

Somit stellt die vorliegende Erfindung bei einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Selektieren eines Enzyms bereit, das in der Lage ist, ein Oligonukleotid direkt oder indirekt zu modifizieren, wobei das Verfahren nicht von der vollständigen Replikation des Gens, welches das das Oligonukleotid modifizierende Enzym codiert, abhängig ist, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:

(a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Elternplasmiden, die ein oder mehrere interessierende Enzyme codieren, bereitstellt, wobei das Elternplasmid die Gensequenz des ausgewählten interessierenden Enzyms bereitstellt,
(b) diese Plasmide nach Stufe (a) kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit dem einen oder mehreren von dem Plasmid codierten Enzymen und ein Oligonukleotid, welches für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist, umfasst,
(c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation des Oligonukleotids nach Stufe (b) mit einem Bereich des Plasmids auftreten kann,
(d) solche Bedingungen bereitstellt, dass die Modifikation des Oligonukleotids nach Stufe (b) unter Verwendung des von dem Plasmid codierten Enzyms auftreten kann und dass das resultierende modifizierte Oligonukleotid eine molekulare Markierung umfasst, und
(e) den modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex einfängt.

Gemäß den hier beschriebenen Verfahren ist/sind das „eine oder die mehreren Nukleinsäuremoleküle nach Stufe (a)" bevorzugt eine Mehrzahl von Nukleinsäuremolekülen.
Vorteilhafterweise kann das Verfahren der Erfindung für die Selektion von Enzymen verwendet werden, die eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzen: geringer katalytischer Umsatz (unter den Selektionsbedingungen), geringe Prozessivität (unter den Selektionsbedingungen), Polymerasen, die modifiziertes, Replikations-blockierendes Nukleotid oder andere Substrate einbauen, die nicht repliziert werden können, sowie Polymerasen mit einer hohen Fehlerrate (etwa > 1/N Fehler für ein Polymerase-Gen von N Basen).
Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren bezieht sich der Begriff „ein Oligonukleotid" auf jedwede Sequenz einer einzelsträngigen Nukleinsäure. Ein Oligonukleotid kann ein teilweise oder vollständig künstliches einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül sein, das ausschließlich aus synthetischen Basen oder aus einem Gemisch natürlich vorkommender und synthetischer Basen besteht, wobei beliebige der vorstehend Genannten in Verbindung mit einem Polypeptid, und beliebige der vorstehend Genannten in Verbindung mit irgendeiner anderen molekularen Gruppe oder irgendeinem anderen Konstrukt stehen können. Vorteilhafterweise kann die andere molekulare Gruppe oder das andere Konstrukt ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Beads, z. B. Polystyrol-Beads, magnetischen Substanzen, wie etwa magnetischen Beads, Markierungen, wie etwa Fluorophoren oder Isotopenmarkierungen, chemischen Reagenzien, Bindemitteln wie etwa Makrozyklen und dergleichen. Gemäß der hier beschriebenen Erfindung ist ein Oligonukleotid zur Verwendung gemäß dem Verfahren zur spezifischen Hybridisierung mit einer Region auf einem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung befähigt, dies entweder vor der Modifikation des Oligonukleotids oder nach der Modifikation des Oligonukleotids. Vorteilhafterweise ist ein Oligonukleotid zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung zur spezifischen Hybridisierung mit einer Region auf dem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung befähigt, bevor die Modifikation des Oligonukleotids erfolgt. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Fachmann erkennen, dass jedwedes Oligonukleotid, das für die Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung geeignet ist, für Polymerasen außerdem „verlängerbar" sein muss, d. h. entweder von Anfang an oder nach geeigneter Prozessierung ein freies und zugängliches 3'-Ende besitzen muss.
Wie hier in Bezug genommen, bezieht sich der Begriff „Modifikation eines Oligonukleotids" auf eine Veränderung in der Struktur des Oligonukleotids. Solche Veränderungen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, irgendeine oder mehrere aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Verlängerung des Oligonukleotids (entweder 5' oder 3'); Ligation eines Oligonukleotids an eine andere Einheit, insbesondere an ein weiteres Oligonukleotid; Phosphorylierung des Oligonukleotids, gefolgt von Markierungs-Ligation, wie hier beschrieben, Umsetzen einer mit dem Oligonukleotid verbundenen Einheit zu einer anderen Einheit, z. B. Umsetzen eines mit dem Oligonukleotid verbundenen Substrats zu einem Produkt; Anheften einer molekularen Gruppe an das Oligonukleotid, z. B. H₂O₂, HRP-Biotin-Tyramid; die Modifikation von Antennenmolekülen/Scavanger-Molekülen, die mit dem Oligonukleotid verbunden sind.
Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren kann die Modifikation des Oligonukleotids direkt oder indirekt sein. Jedoch ist es in jedem Fall ein essentielles Merkmal der Erfindung, dass das Ergebnis der Oligonukleotid-Modifikation darin besteht, dass eine molekulare Markierung/Einfang-Markierung z. B. durch Einbau an dem Oligonukleotid erzeugt wird. Diese molekulare Markierung/Einfang-Markierung erlaubt das nachfolgende Einfangen des Plasmid/Oligonukleotid-Komplexes.
Geeignete molekulare Markierungen/Einfang-Markierungen sind in der detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die Details des Verfahrens der Erzeugung molekularer Markierungen an einem Oligonukleotid gemäß der Erfindung von den Eigenschaften des interessierenden Enzyms abhängen werden.
In dem Fall, dass das interessierende Enzym eine DNA-Polymerase ist, wird der Einbau eines oder mehrerer markierter Nukleotide in das 3'-Ende der DNA-Sequenz verwendet, um eine Einfangmarkierung/molekulare Markierung als Teil des Oligonukleotids unter Verwendung der DNA-Polymerase zu erzeugen. Weiterhin, in dem Fall, dass das interessierende Enzym eine Ligase ist, wird die molekulare Markierung über die Ligation eines zweiten, markierten Oligonukleotids an das mit dem Plasmid gemäß der Erfindung assoziierte Oligonukleotid in das Oligonukleotid eingebaut. Weiterhin, in dem Fall, dass das interessierende Enzym eine Polynukleotidkinase ist, erfolgt der Einbau einer molekularen Markierung über die 5'-Phosphorylierung und die Ligation eines zweiten Oligonukleotids, das eine molekulare Markierung trägt. Fachleute werden erkennen, dass diese Liste nicht als erschöpfend gedacht ist.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung sind Enzyme, die besonders geeignet für die Selektion unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung sind, solche, die unter Verwendung des Verfahrens der CSR nicht erfolgreich selektiert werden können. Wie zuvor beschrieben, beinhalten diese, ohne hierauf beschränkt zu sein, Enzyme mit irgendeiner oder mehreren der folgenden Eigenschaften: geringer katalytischer Umsatz, geringe Substrat-Prozessivität, Polymerasen, die modifizierte Nukleotidsubstrate einbauen, und Polymerasen mit einer hohen Fehlerrate (etwa 1/N Fehler für ein Polymerase-Gen von N Basen).
Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass diese Enzyme durch CSR schwer zu selektieren sind, da sie sich schwer tun, sich unter den Selektionsbedingungen selbst zu replizieren und/oder (zum Beispiel im Falle von S. solfataricus Dpo4) so fehleranfällig sind, dass sie bei der Selbstreplikation ihre eigene codierende Information verderben. Daher erweitert das Verfahren der Erfindung das Spektrum der Polymerasen, die selektiert werden können, über diejenigen hinaus, die für die Selektion unter Verwendung von CSR verfügbar sind.
Somit beinhalten geeignete Enzyme zur Selektion unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung irgendeines oder mehrere derjenigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Nukleinsäure-prozessierende Enzyme, Enzyme, die auf ein oder mehrere Substrate von Nukleinsäure-Replikasen einwirken (d. h. Enzyme, die indirekt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt sind), Enzyme, die die Aktivität von Replikase-Inhibitoren modulieren (d. h. Enzyme, die indirekt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt sind), Enzyme, die direkt auf ein Substratmolekül einwirken, das mit einem Oligonukleotid verbunden ist, wobei das Oligonukleotid zur stabilen Assoziation mit einem Bereich eines Plasmids befähigt ist, welches das Enzym gemäß dem Verfahren der Erfindung codiert, oder Enzyme, die indirekt auf ein Substratmolekül einwirken, das mit einem Oligonukleotid verbunden ist, wobei das Oligonukleotid zur stabilen Assoziation mit einem Bereich eines Plasmids befähigt ist, welches das Enzym gemäß dem Verfahren der Erfindung codiert.
Entsprechend werden Fachleute erkennen, dass der Ausdruck (Modifikation des Oligonukleotids) "unter Verwendung des Enzyms, das durch das Plasmid codiert wird, stattfinden kann" in seinem Schutzumfang die direkte Verwendung eines durch das Plasmid codierte Enzyms zur Erzeugung einer molekularen Markierung in dem Oligonukleotid (beispielsweise durch den Einbau markierter Nukleotide in ein Oligonukleotid, für den Fall, dass das Enzym eine Nukleinsäure-Replikase ist) beinhaltet. Zusätzlich beinhaltet der Ausdruck (Modifikation des Oligonukleotids) "unter Verwendung des Enzyms, das durch das Plasmid codiert wird, stattfinden kann" in seinem Schutzumfang die indirekte Verwendung eines interessierenden Enzyms, um das Oligonukleotid zu markieren, das mit dem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung assoziiert ist. Eine solche indirekte Verwendung wäre zum Beispiel die Umsetzung eines mit einem Oligonukleotid verbundenen Substrats zu einem Produkt in Gegenwart eines von dem Plasmid codierten Enzyms. In diesem Fall ist die „molekulare Markierung/Einfang-Markierung", wie sie hier definiert ist, das Produkt.
Es ist jedwedes Plasmid für die Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung geeignet. Geeignete Plasmide sind in der detaillierten Beschreibung der Erfindung angegeben.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung bezieht sich der Begriff „stabile Assoziation" (eines Oligonukleotids, das für einen Bereich auf dem Plasmid spezifisch ist, mit dem Plasmid) auf die stabile Hybridisierung eines Oligonukleotids mit dem Plasmid, sodass ein Plasmid, das das interessierende Enzym codiert, unter Verwendung der an dem Oligonukleotid vorliegenden molekularen Markierung eingefangen werden kann.
Geeignete Verfahren zum Einfangen des modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplexes beinhalten die Selektion unter Verwendung eines Bindemittels für die molekulare Markierung/Einfang-Markierung, wobei das Bindemittel an einen festen Träger angeheftet ist. Solche Bindemittel beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Antikörper, die für die molekulare Markierung spezifisch sind. In dem Fall, dass die molekulare Markierung Biotin ist, ist ein geeignetes Bindemittel für die molekulare Markierung Streptavidin. Fachleuten werden weitere geeignete molekulare Markierungen/Einfang-Markierungen und Bindemittel für molekulare Markierungen/Einfangmarkierungen bekannt sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des obigen Aspekts der Erfindung ist das Verfahren zum Selektieren Nukleinsäure-prozessierender Enzyme vorgesehen, wobei das Verfahren nicht von der vollständigen Replikation des Gens, welches das Nukleinsäureprozessierende Enzym codiert, abhängig ist, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:

(a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Elternplasmiden, die ein oder mehrere interessierende Nukleinsäure-prozessierende Enzyme codieren, bereitstellt, wobei das Elternplasmid die Gensequenz des ausgewählten interessierenden Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms bereitstellt,
(b) diese Plasmide nach Stufe (a) kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit dem einen oder den mehreren von dem Plasmid codierten Nukleinsäureprozessierenden Enzymen umfasst,
(c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation eines Oligonukleotids, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (b) spezifisch ist, mit diesem Bereich des Plasmids auftreten kann,
(d) solche Bedingungen bereitstellt, dass die Verlängerung des Oligonukleotids nach Stufe (c) unter Verwendung des Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms in Gegenwart eines oder mehrerer modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung umfassen, auftreten kann und
(e) den modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex einfängt.

Geeignete Nukleinsäure-prozessierende Enzyme zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung beinhalten beliebige von denen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Replikasen, insbesondere DNA-Replikasen; DNA-Ligasen, RNA-Ligasen, Polynukleotid-Kinasen, Enzyme, die indirekt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt sind.
Geeignete DNA-Replikasen beinhalten sämtliche der DNA-Replikasen aus den Familien polA, polB, polC, polD, polt & polX oder RT. Das Verfahren kann besonders geeignet für Mitglieder dieser Familien sein, die eine geringere Prozessivität oder Aktivität (unter den Selektionsbedingungen) besitzen, was es schwierig macht, diese durch CSR zu selektieren.
In dem Fall, dass das Verfahren der Erfindung für die Selektion von DNA-Polymerasen vorgesehen ist, die eine niedrige Prozessivität und/oder einen niedrigen katalytischen Umsatz besitzen, umfasst das Verfahren die folgenden Stufen, bei denen man:

(a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Plasmiden bereitstellt, die eine oder mehrere DNA-Polymerasen codieren,
(b) diese Plasmide nach Stufe (a) kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit der einen oder den mehreren DNA-Polymerasen, die von dem Plasmid codiert werden, umfasst, und ein Oligonukleotid, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist,
(c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation des Oligonukleotids, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist, mit diesem Bereich des Plasmids auftreten kann,
(d) solche Bedingungen bereitstellt, dass das 3'-Ende des Oligonukleotids nach Stufe (b) verlängert werden kann, in dem man die DNA-Polymerase nach Stufe (a) in der Gegenwart von einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden, die eine molekulare Markierung umfassen, verwendet, und
(e) den 3'-verlängerten modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex einfängt.

Im Falle der Selektion von Polymeraseaktivität beinhaltet die CST in ihrer einfachsten Form drei Schritte:

1) Hybridisierung: Ein für eine Region auf einem Plasmid spezifisches Oligonukleotid wird mit dem Plasmid hybridisiert (z. B. durch Aufschmelzen oder Strang-Invasion einer definierten DNA-Region und Anhybridisieren an einen der Stränge) und wird somit stabil mit diesem assoziiert (1).
2) Markierung (Tagging): Das Oligonukleotid wird durch die interessierende Polymerase, die durch das Plasmid codiert und von diesem exprimiert wird, modifiziert (z. B. 3'-verlängert). Die Modifikation bringt z. B. die Verlängerung des 3'-Endes des Oligonukleotids durch die Polymerase in Gegenwart modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung (z. B. Biotin) tragen, mit sich (1).
3) Einfangen: Der Einbau der markierten Nukleotide erlaubt nachfolgend das Einfangen der Plasmide, die eine aktive Polymerase codieren, z. B. auf mit Streptavidin beschichteten Kügelchen (Beads), in dem Fall, wenn die molekulare Markierung Biotin ist (1B). Plasmide, die inaktive Polymerasen codieren, werden keine Verlängerung ihrer assoziierten Oligonukleotide aufweisen und werden daher nicht eingefangen und aus dem Genpool verloren gehen. Eingefangene Plasmide können von den Kügelchen eluiert und direkt erneut transformiert werden. Alternativ kann das Polymerase-Gen mittels PCR direkt von den Kügelchen aus amplifiziert und erneut kloniert werden, wie in 1B gezeigt. Details werden in der detaillierten Beschreibung der Erfindung angegeben.

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann besonders geeignet sein für die Selektion von DNA-Polymerasen, die natürlich distributiv oder schwach prozessiv sind, wie etwa Mitglieder der polY- oder polX-Familie, oder niedrig-prozessive Varianten hoch-prozessiver Polymerasen, wie etwa das Stoffel-Fragment von Taq-Polymerase, oder T7-DNA-Polymerase in Abwesenheit von Thioredoxin. Alternativ, ausgehend von einer hochaktiven und prozessiven Polymerase, kann CST evolutionäre Wege erlauben, die mit Varianten von stark reduziertem Umsatz und/oder stark reduzierter Prozessivität bevölkert sind, wie diese wahrscheinlich vorgefunden werden, wenn Veränderungen an der Substrat- oder Verlängerungschemie durchgeführt werden.
Gemäß dem Verfahren der Erfindung bezeichnet der Begriff „Substrat-Prozessivität/Prozessivität" die Anzahl an Nukleotiden, die während eines einzelnen Zyklus der Bindung der Primer/Matrizen-Duplex und der Verlängerung vor der Dissoziation eingebaut werden.
Wie hier in Bezug genommen, bezeichnet der Begriff „katalytischer Umsatz/Umsatz" die Anzahl an Nukleotiden, die in einer bestimmten Zeit in ein Produkt eingebaut werden. Bei niedrigen Enzym- und/oder Matrizen-Konzentrationen ist die Prozessivität wichtig, da die Bindung des Matrizen-Primer-Duplex-Substrats zu einem die Reaktionsgeschwindigkeit begrenzenden Schritt wird. Im Gegensatz dazu kann eine geringe Prozessivität bei hohen Enzym- und/oder Matrizenkonzentrationen wenigstens teilweise durch eine schnelle erneute Bindung des Enzyms an die Primer-Matrizen-Duplex kompensiert werden.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung ist dieses Verfahren für die Selektion von Polynukleotid-Kinasen vorgesehen. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung wird das Oligonukleotid in Gegenwart von Polynukleotid-Kinase über die Phosphorylierung des 5'-Endes des Oligonukleotids, gefolgt vom Einbau eines oder mehrerer markierter Nukleotide am 5'-Ende des Oligonukleotids (Markierungs-Ligation) verlängert. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung umfasst jedes Kompartiment das Plasmid, das die Polynukleotid-Kinase codiert, die Kinase selbst, und ein oder mehrere Oligonukleotide, die zur stabilen Assoziation mit dem Plasmid befähigt sind. Zusätzlich umfasst das Kompartiment außerdem eine Ligase, die für die Verlängerung des 5'-phosphorylierten Oligonukleotids benötigt wird.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des obigen Aspekts der Erfindung ist das Verfahren für die Selektion von Nukleinsäure-Ligasen vorgesehen. Geeignete Ligasen für die Selektion beinhalten DNA- und RNA-Ligasen. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung umfasst jedes Kompartiment ein oder mehrere Oligonukleotide, die zur Assoziation mit einem Plasmid, das die Ligase codiert, befähigt sind, ein Plasmid, das die interessierende Ligase codiert, die durch das Plasmid codierte Ligase und ein oder mehrere markierte Nukleotide in Form markierter Oligonukleotide für die Ligation an das Oligonukleotid. Vorteilhafter Weise, gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung, wird ein unmarkiertes Oligonukleotid, das stabil mit dem Plasmid assoziiert ist, das dieses codiert, über die Ligation eines markierten Oligonukleotids an das unmarkierte Oligonukleotid-3'-Ende markiert werden. Auf diese Weise wird die Selektion des Oligonukleotid/Ligase/Plasmid-Komplexes erreicht.
Alternativ kann die Selektion einer Ligase unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung die 3'-Ligation von zwei oder mehr Oligos (wovon wenigstens einer eine molekulare Markierung trägt) beinhalten, die in isoliertem Zustand nicht zur stabilen Assoziation mit einem die Ligase codierenden Plasmid befähigt wären. Jedoch, sobald die Ligation erfolgt ist, ist das resultierende markierte Oligonukleotid zur stabilen Assoziation mit dem die Ligase codierenden Plasmid befähigt, und somit kann der Ligase/Oligonukleotid/Plasmid-Komplex über die molekulare Markierung selektiert werden.
Somit wird bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ein Verfahren für die Selektion einer Oligonukleotid-Ligase bereitgestellt, wobei das Verfahren nicht von der vollständigen Replikation des Gens, welches das Oligonukleotid-Ligase-Enzym codiert, abhängig ist, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:

(a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Elternplasmid(en), das/die eine oder mehrere Oligonukleotid-Ligasen codiert/codieren, bereitstellt, wobei das/die Elternplasmid(e) die Gensequenz der ausgewählten interessierenden Ligase bereitstellt/bereitstellen,
(b) diese Plasmide nach Stufe (a) kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment folgendes umfasst: ein Plasmid gemeinsam mit der einen oder den mehreren von dem Plasmid codierten Ligasen, zwei oder mehr Oligonukleotide, welche für einen Bereich auf dem Plasmid spezifisch sind, wovon wenigstens eines eine molekulare Markierung trägt, wobei jedes Oligonukleotid im isolierten Zustand nicht zur stabilen Assoziation mit dem Plasmid befähigt ist, bei Ligation dagegen zur stabilen Assoziation mit dem Plasmid befähigt ist,
(c) ein Oligonukleotid, das für einen Bereich auf dem Plasmid gemäß Stufe (a) spezifisch ist, mit diesem Bereich des Plasmids stabil assoziiert,
(d) das Oligonukleotid gemäß Stufe (a) unter Verwendung des Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms in Gegenwart eines oder mehrerer modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung umfassen, verlängert, und
(e) den modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex unter Verwendung der molekularen Markierung/Einfangmarkierung einfängt.

Bei einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren der Erfindung für die Selektion von Enzymen verwendet werden, die direkt auf ein Substratmolekül einwirken, das mit einem Oligonukleotid verbunden ist, und dieses zu einem Produkt umsetzen, welches nachfolgend das Einfangen des Produkt/Oligonukleotid/Plasmid-Komplexes erlaubt.
Bei wiederum einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des obigen Aspekts der Erfindung kann das Verfahren der Erfindung für die Selektion von Enzymen verwendet werden, die nicht bereitwillig auf Substratmoleküle einwirken, die mit einem Oligonukleotid verbunden sind. In diesem Fall ist das Substrat frei, in einem Kompartiment gemäß der Erfindung zu diffundieren. Das Substrat ist jedoch mit einem eingeschlossenen Biotin verbunden, und das Produkt kann (nach dem Aufbrechen des Eingeschlossenseins) durch ein Streptavidin-Oligonukleotid-Hybrid eingefangen werden. Alternativ kann/können ein Produkt oder Produkte, das/die durch das Enzym erzeugt wurde(n), (direkt oder indirekt) in der Modifikation eines Oligonukleotids resultieren, z. B. unter Verwendung von H₂O₂, HRP-Biotin-Tyramid) und/oder in der Modifikation von Antennenmolekülen (Scavenger-Molekülen), die mit dem Oligonukleotid verbunden sind.
Wie oben beschrieben, kann das Verfahren der Erfindung für die Selektion von Enzymen verwendet werden, die nicht direkt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt sind, die jedoch die funktionelle Aktivität eines Enzyms modulieren oder durch Modulieren der funktionellen Aktivität eines Inhibitors des Enzyms wirken.
Somit wird bei einer alternativen Ausführungsform des obigen Aspekts der Erfindung ein Verfahren zur Selektion eines Enzyms, welches indirekt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt ist, bereitgestellt, wobei das Verfahren nicht von der vollständigen Replikation des Gens, welches das Nukleinsäure-prozessierende Enzym codiert, abhängig ist, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:

(a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Plasmiden bereitstellt, die ein oder mehrere Enzyme, die indirekt an der Nukleinsäureprozessierung beteiligt sind, codieren, wobei das/die Elternplasmid/e die Gensequenz des ausgewählten Nukleinsäureprozessierenden Enzyms von Interesse bereitstellt/bereitstellen,
(b) diese Plasmide nach Stufe (a) kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit dem einen oder den mehreren Enzymen, die von dem Plasmid codiert werden, ein oder mehrere modifizierte Substrate des von dem Plasmid codierten Enzyms und ein oder mehrere Nukleinsäure-prozessierende Enzyme umfasst,
(c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation eines Oligonukleotids, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist, mit diesem Bereich des Plasmids in diesem Kompartiment auftreten kann,
(d) solche Bedingungen bereitstellt, dass die Verlängerung des 3'-Endes des Oligonukleotids nach Stufe (a) unter Verwendung des Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms in Gegenwart von einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden, die eine molekulare Markierung umfassen, erfolgen kann, und
(e) irgendeinen oder mehrere der resultierenden 3'-verlängerten Oligonukleotid/Plasmid-Komplexe unter Verwendung der molekularen Markierung aus Stufe (d) einfängt.

Gemäß der obigen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung beinhaltet „ein Enzym, das indirekt an der Nukleinsäureprozessierung beteiligt ist" solche, die an der Erzeugung Nukleinsäure-prozessierender Enzymsubstrate aus einem geblockten oder inaktiven Substrat beteiligt sind. Bei dieser Ausführungsform des obigen Aspekts der Erfindung ist es so, dass in dem Fall, wenn ein Enzym, das wirksam bei der Erzeugung von aktivem Polymerasesubstrat ist, in einem bestimmten Kompartiment exprimiert wird, die Modifikation eines Oligonukleotids gemäß dem Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines aktiven Nukleinsäureprozessierenden Enzyms, das ebenfalls in diesem Kompartiment vorliegt, in Gegenwart eines oder mehrerer modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung umfassen, ablaufen kann; und die nachfolgende Selektion eines Plasmid/Oligonukleotid-Komplexes kann dann unter Verwendung der molekularen Markierung stattfinden.
„Ein Enzym, das indirekt an der Nukleinsäureprozessierung beteiligt ist" beinhaltet in seinem Schutzumfang auch diejenigen Enzyme, die an der funktionellen Inaktivierung eines oder mehrerer Inhibitoren eines Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms beteiligt sind. Auf diese Weise ist es so, dass, wenn ein Enzym in einem Kompartiment exprimiert wird, das befähigt ist, einen oder mehrere Inhibitoren von Nukleinsäure-prozessierendem Enzym funktionell zu inaktivieren, dann die Modifikation eines Oligonukleotids gemäß dem Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines aktiven Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms, das ebenfalls in diesem Kompartiment vorhanden ist, in Gegenwart eines oder mehrerer modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung umfassen, ablaufen kann; und die nachfolgende Selektion eines Plasmid/Oligonukleotid-Komplexes kann dann unter Verwendung der molekularen Markierung stattfinden.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Verfahren die Verwendung eines mit einem Einschnitt („nick") versehenen doppelsträngigen Plasmids und keines separaten Oligonukleotids. Dort, wo das Enzym eine Ligase ist, selektiert man auf Plasmide ohne Einschnitt (Beispielsweise durch Interkalieren eingeschnittener Plasmide mit EtBr und Sucrose-Dichte-Zentrifugation zur Auftrennung eingeschnittener und nicht-eingeschnittener Plasmide). Dort, wo das Enzym eine Polymerase ist, führt man Polymerisation (z. B. dort, wo nur eine Base zwischen den Enden des eingeschnittenen Strangs fehlt) in Gegenwart einer Ligase durch. Wiederum wird auf Plasmide ohne Einschnitt hin selektiert. Zur Markierung (z. B. mit Biotin) übernimmt man einen ähnlichen Ansatz, wobei die Markierung an ein Ende nahe dem Einschnitt angefügt wird.
Fachleuten auf dem Gebiet werden weitere Prozeduren zur Verwendung des Verfahrens der Erfindung zur Selektion von Enzymen, die indirekt an der Nukleinsäureprozessierung beteiligt sind, ersichtlich sein.
Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass das Verfahren der Erfindung die Durchführung multipler Selektionsrunden erlaubt, ohne dass die Notwendigkeit der erneuten Amplifizierung und erneuten Klonierung besteht, einfach durch Einfangen des Plasmids und erneute Transformation. Dies reduziert sowohl den Zeitbedarf als auch die Menge der Hintergrundmutationen des Selektionsprozesses. Alternativ kann das Gen von Interesse (oder Teile hiervon) aus dem eingefangenen Plasmid erneut amplifiziert und erneut kloniert werden.
Zusammen mit CSR und spCSR sollte CST ein volles Spektrum der Selektionsstringenz für die Polymeraseaktivität und -Prozessivität bereitstellen, reichend von distributiver Einzelumsatz-Katalyse, die typisch für polt-Polymerasen wie E. coli polV ist, bis hin zu der hochgradig prozessiven 1000 Basen/sec betragenden katalytischen Leistung des Replisoms. Gemäß der hier beschriebenen Erfindung sollte CST wichtiger Weise – anders als CSR, die die Replikation des gesamten für die Polymeraseaktivität (oder eine andere enzymatische Aktivität) codierenden Gens (für gewöhnlich > 1000 bp) erfordert, und als spCSR, die die Replikation eines Teilabschnitts hiervon (für gewöhnlich > 50 bp) erfordert – nur ein einziges Einbauereignis erfordern.
Es ist ein essentielles Merkmal der Erfindung, dass die eine oder die mehreren Polymerasen von Interesse über eine Nukleinsäure exprimiert werden, die ein Plasmid umfasst. Auf diese Weise kann die Polymerase-Expression in Zellen durchgeführt werden, im Gegensatz zu den oben diskutierten in vitro-Transkriptions-/Translationssystemen. Auf diese Weise werden sowohl die oben diskutierten Probleme im Bezug auf in vitro-Transkriptions-/Translationssysteme als auch diejenigen, die beim Exprimieren von Polymerasen über lineare DNA auftreten, überwunden.
Die vorliegenden Erfinder haben ausgedehnte Versuche durchgeführt, die auf die Optimierung von Bedingungen abzielen, um die Effizienz des Plasmid-Einfangens zu verbessern und dadurch die Empfindlichkeit der Technik zu steigern. Diese Versuche sind hier detailliert in den Beispielen 10 bis 14 und auch in der detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben.
Insbesondere haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass die Effizienz des Plasmid-Einfangens gesteigert werden kann, indem man irgendeine oder mehrere der Techniken in der Liste, bestehend aus den folgenden, verwendet: durch Steigerung der Tm des Oligonukleotid/Plasmid-Hybrids; durch Verlängern des Oligonukleotids um mehr als 3 Basen; durch die Verwendung eines mehr als 40 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid, und durch die Verwendung eines Oligonukleotids von mehr als 10 Basen Länge.
Spezifischer ausgedrückt, gemäß den von den Erfindern durchgeführten Versuchen, wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens gesteigert, indem man die Tm des Oligonukleotid/Plasmid-Hybrids unter Verwendung beliebiger Basen in der Liste, bestehend aus den folgenden, erhöht: LNA-Basen und andere geeignete Basen-Typen. Vorteilhafter Weise fassen die Verfahren der Erfindung die Verwendung von LNA-Basen ins Auge, um die Tm des Oligonukleotid-Hybrids zu erhöhen.
Andere geeignete Basen zur Verwendung gemäß den Verfahren der Erfindung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Diaminopurin (um A zu ersetzen), G-Klammern (Matteucci 99), LNA (Jepsen et al (2004), Oligonucleotides, 14, 130), INA (Christensen & Pedersen (2002), Nucleic Acid Res, 30, 4918) oder irgendwelche anderen Basen- oder Rückgratmodifikationen, die die Tm erhöhen. Andere Möglichkeiten zur Steigerung der Tm beinhalten Hybrid-Oligonukleotide (Ishihara & Corey 99), einschließlich DNA-PNA- oder DNA-Peptid-Hybriden oder kovalenter Vernetzung mit dem Matrizenstrang unter Verwendung eines Psoralen-Moleküls, das stabil in das Oligonukleotid eingebaut wurde.
Die vorliegenden Erfinder haben außerdem herausgefunden, dass die Effizienz des Plasmid-Einfangens dadurch gesteigert wird, dass man das Oligonukleotid um mehr als 20 Basen verlängert. Vorteilhafter Weise wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens gesteigert, indem man das Oligonukleotid um mehr als 50 Basen oder um mehr als 100 Basen verlängert.
Weiterhin haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass die Effizienz des Plasmid-Einfangens durch die Verwendung eines mehr als 50 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid gesteigert wird. Vorteilhafterweise wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens durch die Verwendung eines mehr als 70 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid gesteigert. Am vorteilhaftesten wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens durch die Verwendung eines mehr als 100 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid gesteigert.
Definitionen
Der Ausdruck „ein Oligonukleotid" bezieht sich auf jedwede Sequenz einzelsträngiger Nukleinsäure. Ein Oligonukleotid kann ein teilweise oder vollständig künstliches einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül sein, das ausschließlich aus synthetischen oder aus einem Gemisch natürlich vorkommender und synthetischer Basen besteht, wobei jedwedes der vorstehend genannten mit einem Polypeptid in Verbindung stehen kann, und jedwedes der vorstehend genannten mit einer beliebigen anderen molekularen Gruppe oder einem anderen Konstrukt in Verbindung stehen kann. Vorteilhafterweise kann die andere molekulare Gruppe oder das andere Konstrukt ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Beads, z. B. Polystyrol-Beads, magnetischen Substanzen, wie etwa magnetischen Beads, Markierungen, wie etwa Fluorophoren oder Isotopenmarkierungen, chemischen Reagenzien, Bindemitteln wie etwa Makrozyklen und dergleichen. Gemäß der hier beschriebenen Erfindung ist ein Oligonukleotid zur Verwendung gemäß dem Verfahren zur spezifischen Hybridisierung mit einem Bereich auf einem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung befähigt, dies entweder vor der Modifikation des Oligonukleotids oder nach der Modifikation des Oligonukleotids. Vorteilhafterweise ist ein Oligonukleotid zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung zur spezifischen Hybridisierung mit einem Bereich auf einem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung befähigt, bevor die Modifikation des Oligonukleotids erfolgt. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Fachmann erkennen, dass jedwedes Oligonukleotid, das für die Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung geeignet ist, auch „verlängerbar" sein muss, d. h. entweder von Anfang an oder nach geeigneter Weiterverarbeitung ein freies und zugängliches 3'-Ende besitzt.
Der Begriff „Modifikation eines Oligonukleotids" gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf eine Veränderung in der Struktur des Oligonukleotids. Solche Veränderungen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine beliebige oder mehrere aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Verlängerung des Oligonukleotids (entweder 5' oder 3'); Ligation des Oligonukleotids an eine andere Einheit, insbesondere ein weiteres Oligonukleotid; Phosphorylierung des Oligonukleotids, gefolgt von Markierungs-Ligation, wie hier beschrieben, Umsetzen einer mit dem Oligonukleotid verbundenen Einheit zu einer anderen Einheit, z. B. Umsetzen eines mit dem Oligonukleotid verbundenen Substrats zu einem Produkt; Anheften einer molekularen Gruppe an das Oligonukleotid, z. B. H₂O₂, HRP-Biotin-Tyramid; die Modifikation von Antennenmolekülen/Scavanger-Molekülen, die mit dem Oligonukleotid verbunden sind. Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren kann die Modifikation des Oligonukleotids direkt oder indirekt sein. Jedoch ist es in jedem Fall ein essentielles Merkmal der Erfindung, dass das Ergebnis der Oligonukleotid-Modifikation darin besteht, dass eine molekulare Markierung/Einfang-Markierung in das Oligonukleotid eingebaut wird. Diese molekulare Markierung/Einfang-Markierung erlaubt das nachfolgende Einfangen des Enzym/Plasmid/Oligonukleotid-Komplexes.
Der Begriff „Substrat-Prozessivität/Prozessivität" bezeichnet die Anzahl an Nukleotiden, die während eines einzelnen Zyklus der Bindung von Primer-Matrizen-Duplex und Verlängerung vor der Dissoziation eingebaut werden. Wie hier in Bezug genommen, bezeichnet der Begriff „katalytischer Umsatz/Umsatz" die Anzahl an Nukleotiden, die in einer bestimmten Zeit in ein Produkt eingebaut werden.
Nach Erfahrung des Erfinders ist bei niedrigen Enzym- und/oder Matrizen-Konzentrationen die Prozessivität wichtig, da die Bindung des Substrats zu dem die Reaktionsgeschwindigkeit begrenzenden Schritt wird. Im Gegensatz dazu kann eine geringe Prozessivität bei hohen Enzym- und/oder Matrizenkonzentrationen wenigstens teilweise durch eine schnelle erneute Bindung des Enzyms an die Primer-Matrizen-Duplex kompensiert werden.
„Ein Enzym, das indirekt an der Nukleinsäureprozessierung beteiligt ist" beinhaltet diejenigen, die an der Produktion von Nukleinsäure-prozessierenden Enzymsubstraten aus einem geblockten oder inaktiven Substrat beteiligt sind. Bei dieser Ausführungsform des obigen Aspekts der Erfindung ist es so, dass in dem Fall, wenn ein Enzym, das wirksam bei der Erzeugung von aktivem Polymerasesubstrat ist, in einem bestimmten Kompartiment exprimiert wird, die Modifikation eines Oligonukleotids gemäß dem Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines aktiven Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms, das ebenfalls in diesem Kompartiment vorliegt, dann in Gegenwart eines oder mehrerer modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung umfassen, ablaufen kann; und die nachfolgende Selektion eines Plasmid/Oligonukleotid-Komplexes kann dann unter Verwendung der molekularen Markierung stattfinden. „Ein Enzym, das indirekt an der Nukleinsäureprozessierung beteiligt ist" beinhaltet in seinem Schutzumfang auch diejenigen Enzyme, die an der funktionellen Inaktivierung eines oder mehrerer Inhibitoren eines Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms beteiligt sind. Auf diese Weise ist es so, dass, wenn ein Enzym in einem Kompartiment exprimiert wird, das befähigt ist, einen oder mehrere Inhibitoren von Nukleinsäure-prozessierendem Enzym funktionell zu inaktivieren, dann die Modifikation eines Oligonukleotids gemäß dem Verfahren der Erfindung unter Verwendung eines aktiven Nukleinsäure-prozessierenden Enzyms, das ebenfalls in diesem Kompartiment vorhanden ist, in Gegenwart eines oder mehrerer modifizierter Nukleotide, die eine molekulare Markierung umfassen, ablaufen kann; und die nachfolgende Selektion eines Plasmid/Enzym/Oligonukleotid-Komplexes kann dann unter Verwendung der molekularen Markierung stattfinden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist der Begriff „Kompartiment" synonym mit dem Begriff „Mikrokapsel". Die Struktur und Herstellung von Mikrokapseln ist in der detaillierten Beschreibung der Erfindung angegeben.
Der Ausdruck (Modifikation des Oligonukleotids) "unter Verwendung des Enzyms, das durch das Plasmid codiert wird, stattfinden kann" beinhaltet in seinem Schutzumfang die direkte Verwendung eines durch das Plasmid codierten Enzyms zum Einbau einer molekularen Markierung in das Oligonukleotid (beispielsweise den Einbau markierter Nukleotide in ein Oligonukleotid, für den Fall, dass das Enzym eine Nukleinsäure-Replikase ist). Zusätzlich beinhaltet der Ausdruck (Modifikation des Oligonukleotids) "unter Verwendung des Enzyms, das durch das Plasmid codiert wird, stattfinden kann" in seinem Schutzumfang die indirekte Verwendung eines interessierenden Enzyms, um das Oligonukleotid zu markieren, das mit dem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung assoziiert ist. Eine solche indirekte Verwendung wäre zum Beispiel die Umsetzung eines mit einem Oligonukleotid verbundenen Substrats zu einem Produkt in Gegenwart eines von dem Plasmid codierten Enzyms. In diesem Fall ist die „molekulare Markierung/Einfang-Markierung", wie sie hier definiert ist, das Produkt.
Der Begriff "stabile Assoziation" (eines Oligonukleotids, das für eine Region auf dem Plasmid spezifisch ist, mit dem Plasmid) bezieht sich auf die stabile Hybridisierung eines Oligonukleotids mit dem Plasmid, sodass das Plasmid, das das interessierende Enzym codiert, unter Verwendung der molekularen Markierung, die an dem Oligonukleotid vorhanden ist, eingefangen werden kann.
Kurze Beschreibung der Figuren
1, 1B: Schema der CST-Selektion

1) Hybridisierung: Bakterienzellen, die Polymerase von einem geeigneten Vektor (z. B. Plasmid) aus exprimieren, werden kompartimentiert, wie zuvor für die CSR beschrieben (Ghadessy et al. 01), mit Reagenzien, die für die Polymerase-Reaktion benötigt werden, (1× Polymerase-Reaktionspuffer, dNTPs), sowie mit einem CST-Primer und einem markierten Nukleotid (z. B. Biotin-16-dUTP). Der CST-Primer ist komplementär zu einer Sequenz irgendwo auf dem Plasmidvektor (und kann Modifikationen, wie etwa einen die Affinität steigernden Peptid-Tag, enthalten oder nicht enthalten). Ein thermischer Denaturierungsschritt (z. B. 94°C für 5 min) setzt das Plasmid und die Polymerase aus der Bakterienzelle frei, denaturiert Hintergrund-Polymeraseaktivitäten und schmilzt den Plasmid-DNA-Doppelstrang auf, sodass der CST-Primer an seine Zielsequenz hybridisieren kann. Ein Anhybridisierungsschritt (z. B. 50°C für 5 min) erlaubt es dem CST-Primer, an seine Zielsequenz zu hybridisieren.
2) Markierung: Ein Verlängerungsschritt (z. B. 72°C für 1–5 min) erlaubt die Verlängerung des CST-Primers und den Einbau eines oder mehrerer markierter Nukleotide.
3) Einfangen: Nach dem Aufbrechen der Emulsion (wie zuvor für die CSR beschrieben (Ghadessy et al. 01)) wird der Komplex aus Plasmid/verlängertem CST-Primer isoliert und auf einer festen Oberfläche (z. B. mit Streptavidin beschichtete Magnetkügelchen) mittels der Biotin-Gruppierungen, die bei der Primer-Verlängerungsreaktion eingebaut werden, eingefangen. Plasmide, die keinerlei Biotin-Markierungen enthalten (und somit Kompartimente widerspiegeln, in denen es keine Primer-Verlängerung und somit keine aktive Polymerase gab), werden weg gewaschen. Die Waschbedingungen werden optimiert, um die Dissoziation des CST-Primer-Verlängerungsprodukts von dem Plasmid zu minimieren.
4) Flution: Eingefangene Plasmide werden entweder von den Beads eluiert bzw. direkt erneut transformiert. Für eine höhere Empfindlichkeit werden selektierte Polymerasegene (befindlich auf den eingefangenen Plasmiden) bevorzugt direkt von den magnetischen Beads aus oder alternativ von den eluierten Plasmiden aus amplifiziert und für eine weitere Runde der CST-Selektion erneut kloniert.

2: Eine Modifikation an dem CST-Schema aus 1

A: Um das CST-Primer-Verlängerungsprodukt zu stabilisieren, kann der CST-Primer eine „Schloss"-Sonde mit einem phosphorylierten 5'-Ende sein.
B: Somit baut die Primer-Verlängerung markierte Nukleotide ein und schließt die Lücke zwischen dem Schloss-3'- und 5'-Ende.
C: Das Schloss wird dann durch DNA-Ligation geschlossen. Das geschlossene Schloss stellt einen nicht-dissoziierbaren Plasmid-CST-Primer-Komplex dar, der stringente Bead-Waschbedingungen erlaubt (siehe 1).

3: CST-Selektion enzymatischer Aktivitäten, die keine Polymerasen sind

A: Das Substrat des ausgewählten Enzyms (weißes Sechseck) wird an das 3'-Ende des CST-Primers angehängt und blockiert die Verlängerung durch die Polymerase. Aktives Enzym X wandelt Substrat X unter Erzeugung eines verlängerbaren 3'-Endes (z. B. OH) an dem CST-Primer-Ende um. Es folgen Standard-Primer-Verlängerung und CST-Selektion.
B: Die Substrate (X & Y) für das gewählte Enzym (weißes Sechseck) werden an das 3'- und 5'-Ende der beiden Primer angeheftet, wobei beide hiervon zu kurz sind, um alleine stabil mit dem Plasmid zu hybridisieren und somit nicht durch die Polymerase verlängert werden können. Aktives Enzym reagiert mit X & Y unter Verbindung der beiden Primer, wobei eine stabil hybridisierte CST-Primer-Verlängerung erzeugt wird, die es erlaubt, dass die CST-Selektion voranschreiten kann.
C: Die Substrate (X & Y) für das ausgewählte Enzym (weißes Sechseck) werden an die 3'- und 5'-Enden von zwei Oligonukleotiden angeheftet, wobei beide hiervon zu kurz sind, um alleine stabil mit dem Plasmid zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid (oder beide) trägt eine Einfangmarkierung (z. B. Biotin). Aktives Enzym reagiert mit X & Y unter Verbindung der beiden Oligonukleotide und unter Erzeugung eines stabil hybridisierten Oligonukleotids, welches das Einfangen und die Selektion ohne die Notwendigkeit einer Primer-Verlängerung durch eine Polymerase erlaubt.
D: Die Substrate (X) für das gewählte Enzym (weißes Sechseck) werden an ein Oligonukleotid angeheftet. Aktives Enzym reagiert mit X unter Erzeugung eines mit Produkt P behängten Oligonukleotids, welches das Einfangen über einen geeigneten Rezeptor für P (z. B. Anti-P-Antikörper) erlaubt.
E: Die Substrate (X) für das gewählte Enzym (weißes Sechseck) werden an eine Markierung angehängt. Aktives Enzym reagiert mit X unter Erzeugung eines markierten Produkts (weißer Kreis). Die Produkte reagieren spontan mit einem geeigneten Scavenger-Molekül, das an ein Oligonukleotid angeheftet ist, was das Einfangen erlaubt.

4: CST-Selektion auf Protein-Protein-Interaktion
Die Moleküle (X & Y), für die geeignete hochaffine Rezeptoren (Rezeptor Y und Rezeptor X) verfügbar sind, werden an die Enden von zwei Oligonukleotiden angeheftet, von denen beide zu kurz sind, um alleine stabil mit dem Plasmid zu hybridisieren. Ein Oligonukleotid (oder beide) tragen eine Einfang-Markierung (z. B. Biotin).

A: Ihre Hybridisierung wird in Gegenwart von zwei Köder- und Beute-Fusionsproteinen, d. h. einem Rezeptor-Y-Köder und einer Rezeptor-X-Beute, nur dann stabilisiert, wenn Köder und Beute interagieren.
B: Molekül (Y), für das ein Rezeptor (Rezeptor Y) mit geeignet hoher Affinität verfügbar ist, wird an das Ende eines Oligonukleotids angeheftet, das zu kurz ist, um alleine stabil an das Plasmid zu hybridisieren. Das Oligonukleotid trägt außerdem eine Einfang-Markierung (z. B. Biotin). Die Hybridisierung wird in Gegenwart von zwei Köder- und Beute-Fusionsproteinen, d. h. eines Rezeptor-Y-Köders und einer DBD-Beute, nur dann stabilisiert, wenn Köder und Beute interagieren. DBD bezeichnet eine DNA-Bindungsdomäne, die entweder zur spezifischen Erkennung einer geeigneten, in der Nähe befindlichen Zielsequenz befähigt ist, oder die zu einer hinreichenden nichtspezifischen DNA-Bindung befähigt ist, um den Komplex zu stabilisieren.

5: PCR-Detektion eines eingefangenen Plasmids bei der CST
A: CST-Testreaktion +/– Polymerase in Lösung
Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch die PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus den gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 2,5 U an Taq-Polymerase, + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 2,5 U an Taq-Polymerase. „Eingabe" bezeichnet die CST-Reaktion, die vor dem Waschen auf den Beads eingefangen wird, „Waschung" bezeichnet den Überstand der zweiten Bead-Waschung.
B: CST unter Verwendung von 2 verschiedenen Primern: 24G (linke Tafel) & Oligo 3 (rechte Tafel)
Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch die PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus den gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 2,5 U an Taq-Polymerase, + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 2,5 U an Taq- Polymerase. Die Ergebnisse zeigen, dass die CST unabhängig davon ist, wo auf dem Plasmid der CST-Primer anhybridisiert.
6: PCR-Detektion von eingefangenem Plasmid II bei der CST
Kontrollversuch, um zu testen, dass die Amplifikationsbande von eingefangenem Plasmid herrührt und nicht von eingefangenem Primer-Verlängerungsprodukt. Dpn verdaut nur dammethylierte DNA, wie etwa Plasmide, die in einem dam⁺-Stamm repliziert werden.
Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch die PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 2,5 U an Taq-Polymerase, + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 2,5 U an Taq-Polymerase. Die Beads werden vor der Amplifikation mit (linke Tafel) oder ohne (rechte Tafel) Dpnl vorinkubiert. Dpnl beseitigt nahezu vollständig die Amplifikation des bla-Gens, was anzeigt, dass das beobachtete Amplifikationsprodukt in überwältigendem Maße von eingefangenem Plasmid und nicht von eingefangenem Primer-Verlängerungsprodukt abgeleitet ist.
7: PCR-Detektion von eingefangenem Plasmid III bei der CST
Kontrollversuch, um zu testen, dass CST mit sowohl Plasmid als auch aktiver Taq-Polymerase, die aus Bakterienzellen stammt, funktioniert. Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration), + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration). Die Ergebnisse zeigen, dass das Plasmid nur in Gegenwart von dNTP-Substrat eingefangen wird.
Die rechte Tafel zeigt die Kontrollamplifikation aus dem Überstand der Bead-Waschfraktionen. Es wird gezeigt, dass nicht-markiertes Plasmid in unspezifischer Weise an den Beads anhaftet, jedoch effizient weg gewaschen wird, während dies bei markiertem Plasmid nicht der Fall ist. (Waschschritte 1 & 2: BBB-Waschen, Waschschritte 3 & 4: 10 mM Tris pH 8 Waschschritt).
8: CST in Emulsion: PCR-Detektion von eingefangenem Plasmid III
Kontrollversuch, um zu testen, dass CST mit sowohl Plasmid als auch aktiver Taq-Polymerase, die aus Bakterienzellen stammt, in Emulsion funktioniert. Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration), + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration). Die Ergebnisse zeigen, dass das Plasmid nur in Gegenwart von dNTP-Substrat eingefangen wird.
9: Vergleich der Einfangeffizienz verschiedener Polymerasen bei der CST

A, B: Kontrollversuch, um die Einfangeffizienz verschiedener Polymerasen bei der CST zu testen. Die exprimierten Polymerasen und das codierende Plasmid stammen aus Bakterienzellen. Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration), + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration). Die Ergebnisse zeigen, dass aktive Taq-Polymerase und das weniger prozessive Taq-Stoffel-Fragment und Dpo4 (aus S. solfataricus P2 (B)) eingefangen werden, während die instabile Deletionsvariante Taq Δ442 und die inaktive Taq 611 dies nicht werden. Das Einfangen der inaktiven Taq 611 erfolgt rettungsweise durch die Zugabe exogener Taq-Polymerase (2,5 U).

10: CST-Selektion von aktiver Polymerase (Taq wt) gegenüber inaktiven Polymerasen (Taq 611)

A: Kontrollversuch, um die Selektionseffizienz von aktiver Polymerase (Taq wt) gegenüber inaktiven Polymerasen (Taq 611) bei der CST in Emulsion zu testen. Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch die PCR-Amplifikation eines Teils des Taq-Gens direkt aus gewaschenen Dynabeads detektiert. 1/10² und 1/10³ zeigen an, dass die Bakterienexpression von Taq wt vor der Selektion mit einem Überschuss von 1/100 oder 1/1000 an Bakterienexpression von Taq 611 versetzt wird. Taq 611 enthält eine singuläre BgIII-Stelle in dem amplifizierten Segment des Taq-Gens. Es werden die Amplifikationsprodukte vor (linke Tafel) und nach der BgI II-Inkubation (rechte Tafel) aufgelöst. Die Gegenwart der unteren Bande zeigt die Menge an Taq 611-Gen in den Amplifikationsprodukten an.

Die Ergebnisse zeigen, dass die aktive Taq-Polymerase auf bis zu etwa 1/10 in dem 1/100-Ansatz und auf bis zu etwa 1/3 in dem 1/1000-Ansatz angereichert wird. Wie bei der CSR zu sehen, ist die Selektionseffizienz bei der höheren Verdünnung größer (vermutlich aufgrund der Reduzierung des Anteils von Kompartimenten mit zwei Zellen, von denen eine aktive Taq wt enthält).

B: Kontrollversuch, um die Selektionseffizienz von aktiver Polymerase (Taq wt) gegenüber inaktiven Polymerasen (Taq 611) bei der CST in Emulsion zu testen. Taq wt wird vor der Selektion zu einem Überschuss von 1/10⁴ oder 1/10⁶ an Bakterienexpression von Taq 611 hinzugegeben. Die Selektionseffizienz wird durch die Bestimmung der Anzahl aktiver Taq-Klone (bei der PCR) nach der CST-Selektion bewertet.

Es gibt 47/95 an aktiven Klonen nach der Selektion für den 10⁴-Ansatz und 21/95 an aktiven Klonen nach der Selektion für den 10⁶-Ansatz, Taq bezeichnet die Taq wt-Kontrolle. Aktive Taq-Polymerase wird gegenüber der inaktiven Taq 611 durch die CST um einen Faktor von > 10⁴ angereichert.
11: Unterscheidung der Substratspezifität durch CST
Kontrollversuch, um die Einfangeffizienz verschiedener Polymerasen bei der CST in Abhängigkeit von der Substratspezifität zu testen. Die exprimierten Polymerasen und das codierende Plasmid stammen aus bakteriellen Zellen. Die Menge an eingefangenem Plasmid wird durch PCR-Amplifikation des bla-Gens direkt aus gewaschenen Dynabeads detektiert. – bezeichnet die Reaktion in Abwesenheit von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration), + bezeichnet die Reaktion in Gegenwart von 0,25 mM dNTP (Endkonzentration).
Linke Tafel: Unterscheidung der Einfangeffizienz bei der CST, wobei der CST-Primer ein 5-Nitroindol-Basenanalogon als seine 3'-Base besitzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Taq-Mutante M1 eine gesteigerte Befähigung aufweist, eine Verlängerung ausgehend von einem ein 5-Nitroindol tragenden Primer bei der CST vorzunehmen, wenn man dies mit Taq wt vergleicht, wie sie zuvor bekannt war.
Rechte Tafel: Unterscheidung der Einfang-Effizienz bei der CST, wobei dATP durch ATP ersetzt wird. Die Ergebnisse zeigen, dass sich die Taq-Mutante R22 als stark gesteigert zeigte, trotz schwachem Einfangen im Vergleich zu Taq wt. R22 war bekanntermaßen in der Lage, Ribonukleotide mit stark erhöhter Effizienz einzubauen.
12: LNA-B – 5'-biotinyliertes Oligonukleotid mit 44% LNA-Basen, LNA – nicht-biotinyliertes Oligonukleotid mit 44% LNA-Basen, DNA-B – 5'-biotinyliertes DNA-Oligonukleotid (24G – mit einer G-Klammer), DNA – nicht-biotinyliertes DNA-Oligonukleotid 24G. A. Berechnete Anzahl an Plasmid-Molekülen, die mit jedem Primer eingefangen werden, B. Beispiel der Rohdaten, die mit der qPCR erhalten wurden.
13: Wirkung der Verlängerungslänge auf das Plasmid-Einfangen bei Verwendung von LNA-DNA-Oligonukleotid (A) und reinem DNA-Oligonukleotid (B). 0 – keine Verlängerung, 3 – Verlängerung um 3 Basen, 9 – Verlängerung um 9 Basen, 1000 – volle Verlängerung (hunderte bis tausende von Basen).
14: Effizienz des Plasmid-Einfangens bei Verwendung von 5'-biotinyliertem Primer mit einem 108-Atom-Linker zwischen Biotin und einer Base (B-108-DNA) und einem 5'-biotinylierten Primer mit einem 16-Atom-Linker zwischen Biotin und einer Base (B-16-DNA). 1088-Primer 5'-Biotin-108-Atom-Linker-GATCTTCACCTAGATCCT-3'.
15: Auswirkung der Länge des Primers auf die Einfangeffizienz.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
(A) ALLGEMEINE STRATEGIE DES VERFAHRENS DER ERFINDUNG
Verfahren für die Selektion eines Enzyms, das befähigt ist, ein Oligonukleotid direkt oder indirekt zu modifizieren
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Selektieren eines Enzyms bereit, das in der Lage ist, ein Oligonukleotid direkt oder indirekt zu modifizieren, wobei das Verfahren nicht von der vollständigen Replikation des Gens, welches das das Oligonukleotid modifizierende Enzym codiert, abhängig ist, wobei das Verfahren die Stufen umfasst, bei denen man:

Das Verfahren der Erfindung kann in seiner einfachsten Form durch mehrere Schritte zusammengefasst werden:
– Expression eines interessierenden Enzyms über Plasmide, bevorzugt in ganzen Zellen.
– Hybridisieren eines für das Plasmid spezifischen Oligonukleotids an diese Region eines Plasmids.
– Modifikation dieses Oligonukleotids in Gegenwart des Enzyms von Interesse.
– Einfangen des modifizierten Oligonukleotids/Plasmids unter Verwendung der Markierung.
Das Verfahren der Erfindung besitzt mehrere wichtige Merkmale: Wichtiger Weise bedeutet die Verwendung von Plasmiden zum Exprimieren des Enzyms von Interesse, dass eine derartige Expression in ganzen Zellen erfolgen kann, die die gesamte Maschinerie umfassen, die für die Expression und Prozessierung des interessierenden Enzyms benötigt wird. Daher besteht gemäß dem Verfahren der Erfindung kein Erfordernis zur Verwendung von In vitro-Transkriptions-/Translationssystemen.
Weiterhin werden durch das Exprimieren des interessierenden Enzyms ausgehend von Plasmiden viele der Probleme überwunden, die sich stellen, wenn man ein solches Selektionsverfahren unter Verwendung linearer DNA versucht. Beispielsweise resultiert die in situ-Expression von Polymerasen (im Inneren von Kompartimenten) ausgehend von linearen DNA-Fragmenten bei einem In vitro-Transkriptions-/Translationssystem (ivt) in Gegenwart biotinylierter Nukleotide (Bio-dNTP) nach Erfahrungen des Erfinders in einem hohen Hintergrund der Markierung der 3'-Enden des linearen Fragments mit Bio-dNTP, und zwar ungeachtet der Aktivität der exprimierten Polymerase und ungeachtet der Natur des 3'-Endes (5'-Überhang, glatt oder 3'-Überhang).
Weiterhin besitzt das Verfahren der Erfindung mehrere wichtige Vorteile gegenüber dem CSR-Verfahren, das jüngst durch die vorliegenden Erfinder beschrieben wurde.
„Ein Oligonukleotid"
Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren bezieht sich der Ausdruck „ein Oligonukleotid" auf jedwede Sequenz aus einzelsträngiger Nukleinsäure. Ein Oligonukleotid kann ein teilweise oder vollständig künstliches einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül sein, das ausschließlich aus synthetischen oder aus einem Gemisch natürlich vorkommender und synthetischer Basen besteht, wobei jedwedes der vorstehend genannten mit einem Polypeptid in Verbindung stehen kann, und jedwedes der vorstehend genannten mit einer beliebigen anderen molekularen Gruppe oder einem anderen Konstrukt in Verbindung stehen kann. Vorteilhafterweise kann die andere molekulare Gruppe oder das andere Konstrukt ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Beads, z. B. Polystyrol-Beads, magnetischen Substanzen, wie etwa magnetischen Beads, Markierungen, wie etwa Fluorophoren oder Isotopenmarkierungen, chemischen Reagenzien, Bindemitteln, wie etwa Makrozyklen, und dergleichen. Gemäß der hier beschriebenen Erfindung ist ein Oligonukleotid zur Verwendung gemäß dem Verfahren zur spezifischen Hybridisierung mit einem Bereich auf einem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung befähigt, dies entweder vor der Modifikation des Oligonukleotids oder nach der Modifikation des Oligonukleotids. Vorteilhafterweise ist ein Oligonukleotid zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung zur spezifischen Hybridisierung mit einem Bereich auf einem Plasmid gemäß dem Verfahren der Erfindung befähigt, bevor die Modifikation des Oligonukleotids erfolgt.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung werden Fachleute erkennen, dass die Länge des Oligonukleotids, das für die Verwendung geeignet ist, von den Selektionsbedingungen und außerdem vom GC-Gehalt des Oligonukleotids abhängt. Vorteilhafterweise wird ein Oligonukleotid, das für die Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung geeignet ist, eine Länge von mehr als 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Nukleotiden besitzen.
„Modifikation eines Oligonukleotids"
Der Begriff „Modifikation eines Oligonukleotids" bezieht sich auf eine Veränderung in der Struktur des Oligonukleotids. Solche Veränderungen beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine beliebige oder mehrere aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Verlängerung des Oligonukleotids (entweder 5' oder 3'); Ligation eines Oligonukleotids an eine andere Einheit, insbesondere ein weiteres Oligonukleotid; Phosphorylierung des Oligonukleotids, gefolgt von Markierungs-Ligation, wie hier beschrieben, Umsetzen einer mit dem Oligonukleotid verbundenen Einheit zu einer anderen Einheit, z. B. Umsetzen eines mit dem Oligonukleotid verbundenen Substrats zu einem Produkt; Anheften einer molekularen Gruppe an das Oligonukleotid, z. B. H₂O₂, HRP-Biotin-Tyramid; oder die Modifikation von Antennenmolekülen/Scavanger-Molekülen, die mit dem Oligonukleotid verbunden sind.
Gemäß dem hier beschriebenen Verfahren kann die Modifikation des Oligonukleotids direkt oder indirekt sein. Jedoch ist es in jedem Fall ein essentielles Merkmal der Erfindung, dass das Ergebnis der Oligonukleotid-Modifikation darin besteht, dass eine molekulare Markierung/Einfang-Markierung in das Oligonukleotid eingebaut wird. Diese molekulare Markierung/Einfang-Markierung erlaubt das nachfolgende Einfangen des Enzym/Plasmid/Oligonukleotid-Komplexes.
„Molekulare Markierungen/Einfang-Markierungen"
Fachleute werden erkennen, dass die Details des Verfahrens des Einbaus molekularer Markierungen in ein Oligonukleotid gemäß der Erfindung von den Eigenschaften des interessierenden Enzyms abhängen werden.
(i) Markierte Nukleotide/Oligonukleotide
In dem Fall beispielsweise, dass das interessierende Enzym eine DNA-Polymerase ist, wird der Einbau eines oder mehrerer markierter Nukleotide in das 3'-Ende der DNA-Sequenz verwendet, um eine Einfangmarkierung/molekulare Markierung unter Verwendung der DNA-Polymerase in das genetische Element einzubauen. Weiterhin, in dem Fall, dass das interessierende Enzym eine Ligase ist, wird die molekulare Markierung über die Ligation eines zweiten, markierten Oligonukleotids in das mit dem Plasmid gemäß der Erfindung assoziierte Oligonukleotid in das Oligonukleotid eingebaut. Weiterhin, in dem Fall, dass das interessierende Enzym eine Polynukleotidkinase ist, erfolgt der Einbau einer molekularen Markierung über die 5'-Phosphorylierung und die Ligation eines zweiten Oligonukleotids, das eine molekulare Markierung trägt. Fachleute werden erkennen, dass diese Liste nicht als erschöpfend gedacht ist.
In dem Fall, in dem die molekulare Markierung/Einfang-Markierung ein markiertes Nukleotid ist, wird/werden zu dem Nukleotid-Triphosphat-Mix in einem Kompartiment gemäß der Erfindung ein (oder mehrere) Nukleotid/e hinzugefügt, die mit einer molekularen Markierung modifiziert sind, z. B. mit Biotin-dUTP. Nach der Verlängerung und dem Einbau ist der Plasmid-Oligonu kleotid-Komplex mit Markierungsmolekülen (z. B. Biotin) behangen, was sein Einfangen erlaubt (1, 1B).
Markierte Nukleotide selbst können nicht-natürliche Substrate (wie z. B. eine veränderte Base, wie etwa 5-Nitroindol, oder ein Ribonukleotid) sein, und somit kann ihr Einbau direkt auf den gesuchten Phänotyp hin selektieren. Alternativ kann der Einbau eine Anzeige für Polymeraseaktivität unter den Selektionsbedingungen oder einer Fähigkeit zur Verlängerung eines modifizierten 3'-Endes darstellen.
Geeignete molekulare Markierungen/Einfangmarkierungen beinhalten Biotin, Digoxigenin (DIG), Fluorescein (FITC), Di-Nitrophenol (DNP) etc., welche unter Verwendung von Avidin/Streptavidin oder geeigneten Antikörpern eingefangen werden können. Alternativ kann das Nukleotid modifiziert werden, um eine freie Aminogruppe (NH₂) zu präsentieren, die nach der Verlängerung spezifisch mit einer geeigneten Markierung modifiziert werden kann. Fachleute werden erkennen, dass diese Liste nicht als erschöpfend gedacht ist und werden andere geeignete molekulare Markierungen kennen.
Multiple Markierungen können die Möglichkeit von Zwei-(oder Mehrfach-)Stufen-Einfang- und Selektionsschemata eröffnen, oder Einfangschemata mit Kombinationen von Selektionserfordernissen, z. B. das Einfangen aller Moleküle mit A oder B, oder aller Moleküle mit A und B, oder von Molekülen mit A, jedoch ohne B.
Mit einem Oligonukleotid als einer Einfangmarkierung verbundenes Produkt
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann das Verfahren der Erfindung für die Selektion von Enzymen verwendet werden, die direkt auf ein mit einem Oligonukleotid verbundenes Substratmolekül einwirken und dieses zu einem Produkt umsetzen, welches nachfolgend das Einfangen des Produkt/Oligonukleotid/Plasmid-Komplexes erlaubt. Somit ist es gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung so, dass die Einfangmarkierung/molekulare Markierung, das Produkt ist, das mit einem Oligonukleotid verbunden ist.
Enzyme für die Selektion gemäß dem Verfahren der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben herausgefunden, dass das Verfahren der Erfindung besonders geeignet für die Selektion von Enzymen ist, insbesondere Nukleinsäureprozessierenden Enzymen, die eine beliebige oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzen: geringer katalytischer Umsatz, niedrige Substrat-Prozessivität, Nukleinsäureprozessierende Enzyme, die modifizierte Nukleotidsubstrate einbauen, und Polymerasen mit einer hohen Fehlerrate (etwa 1/N Fehler für ein Polymerasegen von N Basen).
Geeignete Enzyme zur Selektion unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung beinhalten irgendeines oder mehrere derjenigen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Nukleinsäure-prozessierende Enzyme, Enzyme, die auf ein oder mehrere Substrate von Nukleinsäure-Replikasen einwirken (d. h. Enzyme, die indirekt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt sind), Enzyme, die die Aktivität von Replikasen modulieren (d. h. Enzyme, die indirekt an der Nukleinsäure-Prozessierung beteiligt sind), Enzyme, die direkt auf ein Substratmolekül einwirken, das mit einem Oligonukleotid verbunden ist, wobei das Oligonukleotid zur stabilen Assoziation mit einem Bereich eines Plasmids befähigt ist, welches das Enzym gemäß dem Verfahren der Erfindung codiert, oder Enzyme, die indirekt auf ein Substratmolekül einwirken, das mit einem Oligonukleotid verbunden ist.
Geeignete Nukleinsäure-prozessierende Enzyme zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung beinhalten beliebige von denen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden: Replikasen, insbesondere DNA-Replikasen; DNA-Ligasen, RNA-Ligasen, Polynukleotid-Kinasen.
CST ist besonders nützlich für die Selektion von Polymerasen, die natürlich distributiv oder schwach prozessiv sind, wie etwa Mitglieder der polY- oder polX-Familie oder niedrigprozessive Varianten hoch-prozessiver Polymerasen, wie etwa das Stoffel-Fragment von Taq-Polymerase, oder T7-DNA-Polymerase in Abwesenheit von Thioredoxin. Alternativ, ausgehend von einer hochaktiven und prozessiven Polymerase, kann CST evolutionäre Wege erlauben, die mit Varianten von stark reduziertem Umsatz und/oder stark reduzierter Prozessivität bevölkert sind, wie diese wahrscheinlich vorgefunden werden, wenn Veränderungen an der Substrat- oder Verlängerungschemie durchgeführt werden.
CST sollte außerdem die Durchführung multipler Runden der Selektion erlauben, ohne dass die Notwendigkeit der erneuten Amplifikation und Klonierung besteht, unter Reduzierung sowohl der Zeit als auch der Menge an Hintergrundmutationen des Selektionsprozesses. Zusammen mit CSR und spCSR sollte CST ein volles Spektrum der Selektionsstringenz für die Polymeraseaktivität und -Prozessivität bereitstellen, reichend von distributiver Einzelumsatz-Katalyse, die typisch für polY- oder polX-Polymerasen ist, bis zu der hochgradig prozessiven 1000 Basen/sec betragenden katalytischen Leistung des Replisoms.
Plasmide
Geeignete Plasmide zur Verwendung gemäß dem Verfahren der Erfindung werden Fachleuten auf dem Gebiet vertraut sein. Vorteilhafterweise werden dies kleine Plasmide sein, im Größenbereich von weniger als 10 kB, und mit einer hohen Kopienzahl. Solche Plasmide beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, beliebige oder mehrere der folgenden: colE1 oder p15 Replikationsursprung, wie etwa Derivate von pUC, pBR322, pACYC184 oder pACYC177.
Kompartimente/Mikrokapseln
Die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung erfordern geeignete physikalische Eigenschaften, um die Durchführung der Erfindung zu erlauben.
Erstens, um sicherzustellen, dass die genetischen Elemente und Genprodukte nicht zwischen den Mikrokapseln diffundieren können, muss der Inhalt jeder Mikrokapsel vom Inhalt der umgebenden Mikrokapseln isoliert werden, sodass es keinen oder wenig Austausch der genetischen Elemente und Genprodukte zwischen den Mikrokapseln über den Zeitverlauf des Versuchs gibt.
Zweitens erfordert das Verfahren der vorliegenden Erfindung, dass es nur einen Typ von genetischem Element pro Kompartiment gibt. Es kann mehrere Kopien geben, jedoch müssen diese identisch sein, d. h. jedes Kompartiment enthält einen Klon (eine oder mehrere Kopien eines genetischen Elements A, jedoch kein Gemisch der genetischen Elemente A, B, C, etc.) der genetischen Elemente pro Mikrokapsel/Kompartiment. Dies stellt sicher, dass das Genprodukt eines einzelnen genetischen Elements von anderen genetischen Elementen isoliert sein wird. Somit wird die Kopplung zwischen dem genetischen Element und dem Genprodukt hochspezifisch sein. Der Anreicherungsfaktor ist am größten mit im Durchschnitt einem oder weniger an genetischen Elementen pro Mikrokapsel, mit einer möglichst engen Verbindung zwischen der Nukleinsäure und der Aktivität des codierten Genprodukts, da das Genprodukt eines einzelnen genetischen Elements von den Produkten aller anderen genetischen Elemente isoliert werden wird. Jedoch, selbst wenn die theoretisch optimale Situation eines im Mittel einzelnen genetischen Elements oder weniger pro Mikrokapsel nicht verwendet wird, so kann sich ein Verhältnis von 5, 10, 50, 100 oder 1000 oder mehr genetischen Elementen pro Mikrokapsel als günstig beim Sortieren einer großen Bibliothek erweisen. Nachfolgende Runden der Sortierung, einschließlich erneuter Einkapselung mit differierender genetischer Element-Verteilung, wird ein stringenteres Sortieren der genetischen Elemente erlauben.
Drittens dürfen die Ausbildung und die Zusammensetzung der Mikrokapseln nicht die Funktion der Maschinerie der Expression der genetischen Elemente und die Aktivität der Genprodukte aufheben.
Folglich müssen alle verwendeten Mikroeinkapselungssysteme diese drei Erfordernisse erfüllen. Das/die geeignete/n System/e können in Abhängigkeit von der genauen Natur der Erfordernisse bei jeder Anwendung der Erfindung variieren, wie dem Fachmann erkennbar sein wird.
Es ist eine breite Vielzahl von Mikroeinkapselungsprozeduren verfügbar (siehe Benita, 1996) und kann verwendet werden, um die Mikrokapseln zu erzeugen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Tatsächlich sind über 200 Mikroeinkapselungs-Verfahren in der Literatur identifiziert worden (Finch, 1993).
Diese beinhalten Membran-eingehüllte wässrige Vesikel, wie etwa Lipid-Vesikel (Liposomen) (New, 1990) und nicht-ionische Tensid-Vesikel (van Hal et al., 1996). Dies sind geschlossen-membranöse Kapseln aus Einzel- oder Mehrfach-Doppelschichten aus nicht-kovalent verbundenen Molekülen, wobei jede Doppelschicht von ihrem Nachbarn durch ein wässriges Kompartiment getrennt ist. Im Fall von Liposomen setzt sich die Membran aus Lipidmolekülen zusammen; dies sind für gewöhnlich Phospholipide, jedoch können Sterole, wie etwa Cholesterol, ebenfalls in die Membranen eingebaut werden (New, 1990). Es kann eine Vielzahl Enzym-katalysierter biochemischer Reaktionen, einschließlich RNA- und DNA-Polymerisation, in Liposomen durchgeführt werden (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
Bevorzugt werden die Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung aus Emulsionen gebildet; heterogenen Systemen aus zwei unmischbaren flüssigen Phasen, wobei eine der Phasen als Tröpfchen mikroskopischer oder kolloidaler Größe in der anderen dispergiert ist (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Emulsionen können aus jeder geeigneten Kombination unmischbarer Flüssigkeiten erzeugt werden. Bevorzugt besitzt die Emulsion der vorliegenden Erfindung Wasser (enthaltend die biochemischen Komponenten) als diejenige Phase, die in Form fein verteilter Tröpfchen vorliegt (die disperse, innere oder diskontinuierliche Phase), und eine hydrophobe unmischbare Flüssigkeit (ein „Öl") als Matrix, in der diese Tröpfchen suspendiert werden (die nicht-disperse, kontinuierliche oder äußere Phase). Solche Emulsionen werden als Wasser-in-Öl (W/O) bezeichnet. Dies hat den Vorteil, dass die gesamte wässrige Phase, die die biochemischen Komponenten enthält, in einzelne Tröpfchen (die innere Phase) kompartimentiert wird. Die äußere Phase, die ein hydrophobes Öl ist, enthält im Allgemeinen keine der biochemischen Komponenten und ist somit inert.
Die Emulsion kann durch die Zugabe eines oder mehrerer Oberflächen-aktiver Mittel (Tenside) stabilisiert werden. Diese Tenside werden als Emulgatoren bezeichnet und dienen als Wasser/Öl-Grenzfläche zur Verhinderung (oder zumindest Verzögerung) einer Auftrennung der Phasen. Viele Öle und viele Emulgatoren können für die Erzeugung von Wasser-in-Öl-Emulsionen verwendet werden; eine kürzlich erfolgte Aufstellung listete über 16.000 Tenside auf, von denen viele als Emulgatoren verwendet werden (Ash und Ash, 1993). Geeignete Öle beinhalten leichtes weißes Mineralöl und nicht-ionische Tenside (Schick, 1966), wie etwa Sorbitan-Monooleat (Span^TM 80; ICI) und Polyoxyethylensorbitan-Monooleat (Tween^TM 80; ICI).
Die Verwendung anionischer Tenside kann ebenfalls günstig sein. Geeignete Tenside beinhalten Natriumcholat und Natriumtaurocholat. Besonders bevorzugt ist Natrium-Deoxycholat, bevorzugt in einer Konzentration von 0,5% w/v oder darunter. Die Einbeziehung solcher Tenside kann in einigen Fällen die Expression der genetischen Elemente und/oder die Aktivität der Genprodukte steigern. Die Zugabe einiger anionischer Tenside zu einem nicht-emulgierten Reaktionsgemisch hebt die Translation vollständig auf. Beim Emulgieren jedoch wird das Tensid aus der wässrigen Phase in die Grenzfläche übertragen, und die Aktivität wird wieder hergestellt. Die Zugabe eines anionischen Tensids zu den zu emulgierenden Gemischen stellt sicher, dass die Reaktionen erst nach der Kompartimentierung voranschreiten.
Die Erzeugung einer Emulsion erfordert allgemein die Anwendung mechanischer Energie, um die Phasen zusammen zu zwingen. Es gibt eine Vielzahl von Wegen, dies zu tun, die eine Vielzahl von mechanischen Vorrichtungen verwenden, einschließlich Rührern (wie etwa magnetischen Rührstäbchen, Propeller und Turbinen-Rührern, Rührarmvorrichtungen und Rührbesen), Homogenisatoren (einschließlich Rotor-Stator-Homogenisatoren, Hochdruck-Ventil-Homogenisatoren und Jet-Homogenisatoren), Kolloidmühlen, Ultraschall- und Membran-Emulgiervorrichtungen (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Wässrige Mikrokapseln, die sich in „Wasser-in-Öl-Emulsionen" bilden, sind im Allgemeinen stabil, mit wenig, falls überhaupt Austausch der genetischen Elemente oder Genprodukte zwischen den Mikrokapseln. Zusätzlich haben wir demonstriert, dass mehrere biochemische Reaktionen in Emulsionsmikrokapseln ablaufen. Die Technologie existiert, um Emulsionen zu erzeugen, mit Volumina in der gesamten Spanne bis hin zu industriellen Größenmaßstäben von tausenden von Litern (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Die bevorzugte Mikrokapselgröße wird in Abhängigkeit von den genauen Erfordernissen jedes einzelnen Selektionsprozesses, der gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden soll, variieren. In allen Fällen wird es ein optimales Gleichgewicht zwischen der Größe der Genbibliothek, der erforderlichen Anreicherung und der erforderlichen Konzentration der Komponenten in den einzelnen Mikrokapseln geben, um eine effiziente Reaktivität der Genprodukte zu erreichen.
In Abhängigkeit von der Anwendung wird das mittlere Volumen der Mikrokapseln weniger als 5,2 × 10^–16 m³ betragen (was einer kugeligen Mikrokapsel mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm entspricht), bevorzugter weniger als 6,5 × 10^–17 m³ (5 μm), bevorzugter etwa 4,2 × 10^–18 m³ (2 μm), und idealer Weise etwa 9 × 10^–18 m³ (2,6 μm).
Die thermostabilen Emulsionen, die bei der CSR oder der Emulsions-PCR verwendet werden, besitzen eines mittleren Durchmesser von 15 μm, und dies kann für eine korrekte Aktivität erforderlich sein, wenn Zellen kompartimentiert werden.
Die Mikrokapselgröße muss hinreichend groß sein, um alle erforderlichen Komponenten der biochemischen Reaktionen unterzubringen, für die es notwendig ist, dass sie innerhalb der Mikrokapsel ablaufen.
In dem Fall, dass CST-Gen und exprimiertes Enzym unter Verwendung von Zellen colokalisiert werden, die 100–500 Kopien des Plasmids + 1000–100.000 Kopien der Polymerase enthalten, werden die Zellen z. B. unter Verwendung von 1× Taq-Puffer + 0,2 mM dNTP Endkonzentration emulgiert.
Oligonukleotid-Hybridisierung: Ausbildung eines künstlichen Primosoms
Die Hybridisierung erfordert die Öffnung einer Region von doppelsträngiger DNA und eine Strang-Einwanderung des Oligonukleotids, um mit einem oder beiden Strängen der aufgeschmolzenen Duplex-DNA-„Blase” zu hybridisieren. Diese Struktur kann dann als ein künstliches Primosom für eine DNA-Polymerase fungieren, die entlang des Matrizenstrangs (an den das Oligo anhybridisiert ist) bis zur nächsten Duplex-Region (oder weiter durch Strang-Verdrängung) weiter verlängern kann.
Wie in den Beispielen gezeigt, liefert eine einfache Oligonukleotid-Hybridisierung an eine Zielsequenz hinreichende Stabilität zum Einfangen des Oligo-Plasmid-Komplexes nach der Verlängerung.
Es sind verschiedene Technologien verfügbar, um die Stabilität des Oligo-Plasmid-Komplexes zu erhöhen (1), einschließlich Sequenzen, die zur Triplex-Bildung befähigt sind, der Verwendung modifizierter Basen, wie etwa Diaminopurin (zum Ersetzen von A), G-Klammern (Matteucci 99), LNA (ref), INA (ref), Hybrid-Oligonukleotiden (Ishihara & Corey 99), einschließlich DNA-PNA oder DNA-Peptid-Hybriden (Corey) oder UV-Vernetzung unter Verwendung von Psoralen (ref). Alternativ kann das hybridisierende Oligonukleotid als eine „Schloss-Sonde" („padlock probe") (Landegren) mit einer definierten Sequenzlücke zwischen den beiden „klebrigen Füßen" ausgestaltet sein. Die Verlängerung, gefolgt von Ligation, würde ein praktisch nicht-dissoziierbares Oligo-Plasmid-Catenan erzeugen (2).
Das Aufschmelzen des Doppelstrangs, die Strang-Invasion und die Hybridisierung können durch RecA oder durch die Verwendung so genannter „PNA-Öffner” erleichtert werden. Beispielsweise ist für RecA zusammen mit αS-ATP gezeigt worden, dass es die Ausbildung eines stabilen Nukleoprotein-Komplexes mit einer einzelsträngigen biotinylierten Sonde und homologen Sequenzen in zirkulärer, doppelsträngiger DNA unterstützt (Hakvoort et al. 96, Zhumabayeva et al. 99), der dann nachfolgend an magnetischen Beads eingefangen werden kann. Diese Technologie ist erfolgreich für die Isolierung von cDNAs angewendet worden. Kurze Homopyridin-PNA-Oligomere sind befähigt, mit komplementären Sequenzen in Duplex-DNA einzuwandern, was P-Schleifen ergibt (Nielsen 91, Demidov 95), und diese können als künstliche Transkriptions-Promotoren bei linearer Duplex-DNA wirken (Mollegaard 94). Alle diese Strang-Öffnungsreaktionen werden durch negatives Supercoiling in der Plasmid-DNA erleichtert, jedoch sind wenigstens einige davon auch auf nicht mit Supercoil versehene lineardoppelsträngige DNA anwendbar.
Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass es andere Verfahren geben mag, um dasselbe Ergebnis zu erreichen.
Einfangen der Markierung
Ein Markierungs-spezifisches Einfangen des Plasmid-Oligonukleotid-Komplexes erfordert die Unterscheidung der mit der Markierung modifizierten Komplexe von unmodifizierten Komplexen. Unter Verwendung geeigneter Waschbedingungen kann es sogar möglich sein, Ausmaße des Markierungseinbaus zu unterscheiden.
Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die genauen Details des Markierungs-Einfangens von der Natur der Markierung abhängen werden. In dem Fall beispielsweise, dass die Einfang-Markierung ein Produkt der vom interessierenden Enzym katalysierten Reaktion ist, kann das Einfangen der Markierung unter Verwendung eines für den Antikörper spezifischen Antikörpers bewerkstelligt werden. In konventioneller Weise können mit Biotin markierte Komplexe an mit Streptavidin beschichteten Beads eingefangen werden.
In allen Fällen ist es wichtig, dass während des Waschprozesses, der erforderlich ist, um nicht-markierte Plasmid-Oligonukleotid-Komplexe zu entfernen, solche Komplexe stabil bleiben, d. h., dass das nicht-kovalent assoziierte Plasmid und das Oligonukleotid nicht dissoziieren. Die Waschbedingungen können in Abhängigkeit vom Typ des Plasmid-Oligonukleotid-Komplexes derart eingestellt werden, dass ein solcher Komplex stabilisiert wird, d. h. niedrige Salzbedingungen im Fall von PNA-DNA-Komplexen.
Unter geeigneten Bedingungen können solche Komplexe sehr stabil sein und haben z. B. das Affinitätseinfangen und die Wiedergewinnung mikrobieller DNA bei femtomolaren Konzentrationen selbst in Gegenwart eines Überschusses an exogener DNA erlaubt (Chandler et al., 2000).
(B) MODULIEREN DER EFFIZIENZ DES PLASMID-EINFANGENS/DER EMPFINDLICHKEIT DES VERFAHRENS
Die vorliegenden Erfinder haben ausgedehnte Versuche durchgeführt, die abzielen auf eine Optimierung der Bedingungen zur Verbesserung der Effizienz des Plasmid-Einfangens und daher zur Steigerung der Empfindlichkeit der Technik. Diese Versuche sind im Detail in den hier vorliegenden Beispielen 10 bis 14 beschrieben.
Insbesondere haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass die Effizienz des Plasmid-Einfangens unter Verwendung irgendeiner oder mehrerer der Techniken in der Liste gesteigert werden kann, wobei diese Liste aus folgenden besteht: durch Steigern der Tm des Oligonukleotid/Plasmid-Hybrids; durch Verlängern des Oligonukleotids um mehr als 3 Basen; durch die Verwendung eines Linkers von mehr als 40 Atomen Länge zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid, und durch die Verwendung eines Oligonukleotids von mehr als 10 Basen Länge.
Spezifischer ausgedrückt, gemäß den von den Erfindern durchgeführten Versuchen, wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens gesteigert, indem man die Tm des Oligonukleotid/Plasmid-Hybrids unter Verwendung beliebiger Basen in der Liste, bestehend aus den folgenden, erhöht: LNA-Basen und andere geeignete Basentypen.
Andere geeignete Basen für die Verwendung gemäß den Verfahren der Erfindung beinhalten, ohne hierauf beschränkt zu sein, Diaminopurin (um A zu ersetzen), G-Klammern (Matteucci 99), LNA (Jepsen et al (2004), Oligonucleotides, 14, 130), INA (Christensen & Pedersen (2002), Nucleic Acid Res, 30, 4918) oder irgendwelche anderen Basen- oder Rückgratmodifikationen, die die Tm erhöhen. Andere Möglichkeiten zur Steigerung der Tm beinhalten Hybrid-Oligonukleotide (Ishihara & Corey 99), einschließlich DNA-PNA- oder DNA-Peptid-Hybriden oder kovalenter Vernetzung mit dem Matrizenstrang unter Verwendung eines Psoralen-Moleküls, das stabil in das Oligonukleotid eingebaut wurde.
Die vorliegenden Erfinder haben außerdem herausgefunden, dass die Effizienz des Plasmid-Einfangens gesteigert wird, indem man das Oligonukleotid um mehr als 20 Basen verlängert. Vorteilhafterweise wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens gesteigert, indem man das Oligonukleotid um mehr als 50 Basen oder um mehr als 100 Basen verlängert.
Weiterhin haben die vorliegenden Erfinder herausgefunden, dass die Effizienz des Plasmid-Einfangens durch die Verwendung eines mehr als 50 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid gesteigert wird. Vorteilhafterweise wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens durch die Verwendung eines mehr als 70 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid gesteigert. Am vorteilhaftesten wird die Effizienz des Plasmid-Einfangens durch die Verwendung eines mehr als 100 Atome langen Linkers zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid gesteigert.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in den folgenden Beispielen veranschaulicht. Es wird erkennbar sein, dass eine Modifikation am Detail vorgenommen werden kann, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen.
Alle im Text genannten Dokumente werden durch Referenz einbezogen.
Beispiele
Beispiel 1
Materialien und Methoden
DNA-Manipulation und Proteinexpression: DNA-Manipulation erfolgte gemäß Sambrook, solange nicht anders spezifiziert. Taq-Polymerase, Taq-Stoffelfragment, ☐422 Taq, 611 FrS Taq wurden ausgehend von pASK75 exprimiert, wie zuvor beschrieben (Ghadessy 01, Meth. Mol. Biol. (Manuskript angefügt)). Die Amplifikation von S. solfataricus Dpo4 erfolgte aus pET22b:Dpo4 (freundlicher Weise zur Verfügung gestellt von Dr. R. Woodgate, NIH, USA) unter Verwendung der Primer 1 und 2, über Klonierung mittels Xba I/Sal I in pASK75 und Transformation in RW392. Für die Expression wurden RW392-Zellen, die pASK:Dpo4 enthalten, in 2xIY/Amp (01 μg/ml)/1% Glucose bis auf eine OD₆₀₀ = 0,8 herangezüchtet, durch die Zugabe von Anhydrotetracyclin bis auf 0,2 μg/ml Endkonzentration induziert und für 4h bei 37°C exprimiert.
Emulgieren: Nach dem Exprimieren wurden die Zellen emulgiert wie zuvor beschrieben (Ghadessy et al 01, Meth. Mol. Biol. (Manuskript angefügt)).
Primer-Verlängerung: in vitro: Plasmid (colE1, z. B. pUC oder pASK75) (10 ng) wurde gemischt mit Primer (10–100 pMs gesamt), dNTP-Gemisch (250 μM (Endkonzentration) von jedem dNTP, supplementiert mit 40–10 μM (Endkonzentration) Biotin-16-dUTP (Roche) und 2,5U Taq DNA-Polymerase (HT Biotechnology) in 1× Taq-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% TritonX-100, 1,5 mM MgCl₂) und wie folgt inkubiert: 94°C 5 min, 50°C 5 min, 72°C 10 sec–5 min. Alternativ wurden 2 × 10⁸ Expressor-Zellen (zweimal in 1× Taq-Puffer gewaschen) mit Primer (10–100 pM), dNTP-Gemisch (250 μM (Endkonzentration) von jedem dNTP, supplementiert mit 40–10 μM (Endkonzentration) Biotin-16-dUTP (Roche) in 1× Taq-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% TritonX-100, 1,5 mM MgCl₂) gemischt und wie folgt inkubiert: 94°C 5min, 50°C 5min, 72°C 10 sec–5 min.
Plasmid-Einfangen: Plasmid-Oligonukleotid-Komplexe (POC) wurden aus dem Reaktionsgemisch gereinigt, entweder durch die Passage durch eine ChromaSpin1000-Säule (Clontech) gemäß Herstelleranweisungen, Reinigen mit Qiagen PCR-Reinigungskit nach Herstelleranweisungen oder bevorzugt mit Ethanol-Präzipitation (3 v/v Ethanol, 1/10 v/v 3M NaAc) in Gegenwart von Muskel-Glykogen (Roche) als einem Träger, und in einem äquivalenten Volumen an Bead-Bindepuffer (BBB: 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,2 M NaCl) resuspendiert.
20 μl Dynabeads-280 (Dynal) wurden zweimal in BBB gewaschen, mit 0,5% Casein oder 1 mg/ml BSA für 30 min bei 22°C geblockt, in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml zu POC hinzugegeben und für 2 h auf einem Overhead-Rotor bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Die Beads wurden zweimal mit BBB und zweimal mit 10 mM Tris pH 8,0 (oder für weniger stringente Waschbedingungen zweimal mit Hochsalz-BBB 10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 M NaCl und einmal mit 10 mM Tris pH 8,0) gewaschen und in 50 μl 10 mM Tris pH 8,0 resuspendiert.
Plasmid-Detektion durch PCR: 1 μl Dynabeads wurden direkt zu 20 μl PCR-Gemisch, umfassend die Primer 4 und 5 (Amplifikation des bla-Gens), alle 4 dNTPs (mit je 250 μM Endkonzentration) und 2,5U an Taq DNA-Polymerase (HT Biotechnology) in 1× Taq-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 0,1% TritonX-100, 1,5 mM MgCl₂) hinzugegeben, und das Thermocycling erfolgte wie folgt: 94°C 5 min, 15 × (94°C 15sec, 50°C 15sec, 72°C 1,5 min), 65°C 2 min.
Plasmiddetektion mittels qPCR: Die Anzahl der Plasmid-Moleküle, die an den Dynabeads eingefangen wurden, wurde unter Verwendung quantitativer Echtzeit-PCR quantifiziert. Die Amplifikation eines kurzen Amplikons aus dem Matrizenplasmid wurde unter Messen der Fluoreszenz detektiert, die durch den Einbau von CybrGreen-Farbstoff erzeugt wird, wobei hierfür Opticon 2 (GRI Molecular Biology Ltd.) verwendet wird. Die Bedingungen wurden so verwendet, wie vom Hersteller empfohlen, mit Ausnahme der Verdopplung der Konzentration an CybrGreen-Farbstoff in dem Reaktionsgemisch. Es wurde 1 mkl an Dynabeads direkt zu 20 mkl an PCR-Gemisch, umfassend die Primer gPCRf und gPCRr, die das 100bp-Fragment des Plasmids pASK75 amplifizieren, alle 4dNTPs mit jeweils 200 mkM, und 2,5 U an SuperTaq DNA-Polymerase in 1× Taq-Puffer (HT Biotechnology), hinzugegeben. Wir waren zur verlässlichen Detektion und Unterscheidung zwischen 10⁴ und 10⁹ Plasmid-Kopien in der Lage.
Plasmidelution & Transformation: Für die Plasmidelution wurden die Beads in 200 μl Bead-Elutionspuffer (BEB: 1 mM EDTA, 0,1 M NaOH) für < 5 min inkubiert. Die Beads wurden an dem Magneten eingefangen, und das Plasmid in dem Überstand wurde durch die Zugabe von 1/10 V an 3M NaAc, 3V an Ethanol und Muskel-Glykogen (Roche) als Träger präzipitiert. Das Plasmid wurde durch die Präzipitation in einer Tisch-Zentrifuge präzipitiert, das Pellet wurde einmal in 96% Ethanol bei RT gewaschen, getrocknet, und in Wasser resuspendiert und durch Elektroporation transformiert.
Plasmiddetektion aus den Beads: Die Gegenwart von an den Beads gebundenem Plasmid wurde durch direkte PCR-Amplifikation aus den Beads unter Verwendung der Primer 4 und 5 und unter Verwendung von 1 μl Beads als Matrize sowie des folgenden Programms detektiert: 94°C 5 min, 17 × (94°C 15 sec, 50°C 15 sec, 72°C 1,5 min), 65°C 2 min. Oligonukleotid-Primer:
(basierend auf Oligo 24 aus JACS (1999), 121, 2012–2020, 2 zusätzliches 5' AA, 5 = G-Klammer wie in PNAS (1999), 96, 3513–3518 für erhöhte Tm (freundlicher Weise zur Verfügung gestellt von S. Holmes, MRC LMB), jedoch mit 2' Ome)
24GB: 5'-6 AAG 5AT CTT CAC CTA GAT CCT-3'
(basierend auf Oligo 24 aus JACS (1999), 121, 2012–2020, 2 zusätzliches 5' AA, 5 = G-Klammer wie in PNAS (1999), 96, 3513–3518 für erhöhte Tm (freundlicher Weise zur Verfügung gestellt von S. Holmes, MRC LMB), jedoch mit 2' Ome), 6 = Biotin
24DAP: 5'-C5A 5A5 GG5 TCT TCA CCT AGA TCC T-3'
(basierend auf Oligo 24 aus JACS (1999), 121, 2012–2020, zusätzliche 5'-Sequenz CAAAAA, 5 = 2,6-Diaminopurin für erhöhte Tm
24DAPB: 5'-6 C5A 5A5 GG5 TCT TCA CCT AGA TCC T-3'
(basierend auf Oligo 24 aus JACS (1999), 121, 2012–2020, zusätzliche 5'-Sequenz CAAAAA, 5 = 2,6-Diaminopurin für erhöhte Tm, 6 = Biotin
(basierend auf Oligo 24 aus JACS (1999), 121, 2012–2020, zusätzliche 5'-Sequenz, CAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCT, 5 = 2,6-Diaminopurin für erhöhte Tm, 6 = Biotin
Beispiel 2
Auf Aktivität basierendes Plasmid-Einfangen aufgrund des Einbaus von Biotin-16-dUTP
24G (oder Oligo-3) wurde für die In vitro-Primerverlängerung an pUC119-Plasmid unter Verwendung von Biotin-16-dUTP als Markierung verwendet. (Die Verlängerungen erfolgten in Gegenwart (+ Fraktion) oder Abwesenheit (– Fraktion) von Taq-Polymerase. Plasmid-Oligo-Komplexe wurden an ChromaSpin1000 gereinigt, nach der Verlängerung an mit Streptavidin beschichteten magnetischen Beads eingefangen, und die Gegenwart von eingefangenem Plasmid an den Beads wurde unter Verwendung von PCR aus den Beads bestimmt (5A). Wie zu sehen ist, wird das Plasmid nur in Gegenwart einer aktiven Polymerase an den Beads eingefangen, während die Waschlösung Plasmid sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Polymerase enthält. Der Vergleich der zwei verschiedenen Primer (24G vs. Oligo 3 (88)), von denen beide Primer-Wirkung an pASK zeigen, zeigte wenig Unterschied bei der Effizienz des Einfangens (5B), trotz der Tatsache, dass Oligo 24 zuvor als besonders wirkungsstark bei der Strang-Invasion identifiziert wurde (Ishihara & Corey, 99).
Das Plasmid wurde auch durch die Flution von den Beads und die erneute Transformation detektiert (Tabelle 1).

+ Polymerase – Polymerase

113 Kolonien 23 Kolonien
Obwohl enttäuschend bei der Ausbeute, gibt es einen klaren (etwa 5-fach) Unterschied bei der Menge an eluiertem Plasmid.
Beispiel 3
Es wird Plasmid und nicht Verlängerungsprodukt eingefangen.
Der Versuch in Beispiel 2 wurde wiederholt, jedoch um zu zeigen, dass die PCR-Amplifikation aus den Beads tatsächlich zur Detektion von eingefangenem Plasmid führte, und nicht nur zur Produktion und zum Einfangen biotinylierter Verlängerungsprodukte; dabei wurden die Beads vor der Amplifikation mit 20 U Dpnl (New England Biolabs) für 2 h bei 37°C inkubiert. Dpnl verdaut nur methylierte DNA, daher führt die Selektivität zur Zerstörung der Plasmid-DNA, nicht jedoch der Verlängerungsprodukte. Wie aus 6 ersichtlich, führt der Vorverdau mit Dpnl zu einer drastischen Reduzierung der Menge an erhaltenem PCR-Produkt, was anzeigt, dass die PCR eingefangenes Plasmid und nicht eingefangene Verlängerungsprodukte detektiert.
Beispiel 4
Einfangen von Plasmid aus Zellen
Der Einfang-Versuch wurde unter Verwendung bakterieller Zellen wiederholt, die aktive Taq-Polymerase aus pASK exprimieren, im Gegensatz zur Verwendung rekombinanter Taq-Polymerase und fremd zugegebenem pASK-Plasmid. Die Durchführung der Versuche erfolgte in Gegenwart (+ Fraktion) oder Abwesenheit (– Fraktion) von dNTP-Gemisch. Wie zuvor war es so, dass nur dann Einfangen erfolgt, wenn die Polymerase das hybridisierte Oligonukleotid verlängern und markieren kann (7). Signifikanter Weise schien das Plasmid-Einfangen aus Zellen nahezu ebenso effizient zu sein wie das Plasmid-Einfangen aus der Lösung, was anzeigt, dass der anfängliche Schritt des Erhitzens hinreichend ist, um Plasmid aus den Zellen freizusetzen (7). Die PCR-Analyse der Bead-Waschlösungen zeigt an, dass, obwohl anfänglich große Mengen an Plasmid in einer unspezifischen Weise an den Beads anhaften, diese weg gewaschen werden können, wenn sie nicht markiert sind (wie zu sehen an der größeren Menge an Plasmid, die in den Waschlösungen der – Fraktion vorhanden ist).
Beispiel 5
Plasmid-Einfangen aus Zellen in Emulsion
Der Versuch aus Beispiel 5 wurde wiederholt, jedoch unter Verwendung von Emulgierung der Verlängerungsreaktion, die Expressorzellen, Oligonukleotid 24G und dNTP-Gemisch einschließlich Biotin-16-dUTP in 1× Taq-Puffer umfasst. Wiederum ist es so, dass nur dann Einfangen erfolgt, wenn die Polymerase das hybridisierte Oligonukleotid verlängern und markieren kann (8).
Beispiel 6
Polymerasen mit geringer Prozessivität oder Aktivität können effizient unter Verwendung von CST eingefangen werden.
Der Einfang-Versuch aus Beispiel 5 wurde unter Verwendung bakterieller Zellen wiederholt, die verschiedene Polymerasen mit variablen Aktivitäten (V_max/KM) oder Prozessivitäten exprimieren. Diese beinhalteten Taq-Polymerase (hohe Aktivität, hohe Prozessivität), Taq Stoffel-Fragment (hohe Aktivität, niedrige Prozessivität), Taq ☐442 (niedrige Aktivität, niedrige Prozessivität, niedrige Stabilität), Taq 611 (inaktiv), Tag611+ (Tag611 mit zugegebener rekombinanter Taq) und S. solfataricus P2 Dpo4 (mittlere Aktivität, mittlere bis niedrige Prozessivität).
Die PCR-Analyse des Plasmid-Einfangens zeigt, dass die CST ein effizientes Einfangen von Taq (9A, 9B) und Dpo4 (9B) erlaubt, sowie in einem geringeren Ausmaß beim Stoffel-Fragment (9A, 9B), wogegen Taq ☐442 (9A, 9B) oder die inaktive Tag611 (9A) nicht eingefangen werden. Tag611+ (Tag611 mit zugegebener rekombinanter Taq ( 9A)) wird effizient eingefangen, was belegt, dass die Unterschiede beim Einfangen nicht durch Unterschiede in der Polymerase-Gensequenz begründet sind, sondern durch die Aktivität und die Prozessivitäten der codierten Polymerasen.
Beispiel 7
Selektion aktiver Polymerasen unter Verwendung von CST.
Um zu bestimmen, ob CST verwendet werden kann, um auf Polymeraseaktivität aus einem Repertoire von Klonen zu selektieren, wurden Zellen, die aktive Taq wt-Polymerase exprimieren, einem Überschuss an Zellen (10²-fach, 10³-fach, 10⁴-fach und 10⁶-fach) zugesetzt, die inaktive Taq 611-Polymerase exprimieren, dies wurde emulgiert, und die CST-Selektion wurde durchgeführt. Die eingefangene Plasmid-Zusammensetzung wurde unter Verwendung von PCR aus den Beads analysiert.
Bei der 10²- und 10³-Beimischung wurde nur die 611-Region amplifiziert, bevor und nachdem die Selektion erfolgte, und Taq wt und 611 Taq unterschieden sich im Restriktionsverdau (Taq 611 besitzt BgI II-Restriktionsstellen, die im Taq wt-Enzym fehlen). Wie aus 10A ersichtlich, gab es eine klare Anreicherung sowohl bei der 10²- als auch bei der 10³-Beimischung, wie dies am Erscheinen einer BgI II-resistenten Fraktion nach der Selektion ersichtlich ist.
Bei der 10⁴- und 10⁶-Beimischung wurde das gesamte Taq-Polymerasegen unter Verwendung der Primer 6, 7 aus den Beads amplifiziert und für die Expression erneut über XbaI/SalI in pASK kloniert, wonach 100 Klone im Hinblick auf ihre Aktivität bewertet wurden. Wie in 10B ersichtlich ist, gab es 47/95 an aktiven Klonen nach der Selektion bei der 10⁴-Beimischung und 21/95 an aktiven Klonen nach der Selektion für die 10⁶-Beimischung, was einen Selektionsfaktor von > 10⁴-fach anzeigt.
Beispiel 8
Unterscheidung der Polymerase-Substrat-Spezifität unter Verwendung von CST
Um zu bestimmen, ob die CST zwischen verschiedenen Polymerase-Aktivitäten im Hinblick auf die Verlängerung und den Einbau nicht-natürlicher Substrate unterscheiden kann, wurden CST-Experimente durchgeführt wie in Beispiel 2, dies unter Verwendung rekombinanter Taq ebenso wie der rekombinanten Taq-Mutanten M1 und R22. M1 besitzt eine gesteigerte Befähigung, das hydrophobe Basen-Analogon 5-Nitroindol zu verlängern, wogegen R22 eine gesteigerte Befähigung besitzt, Ribonukleotide einzubauen. Wie 11 zeigt, zeigt M1 eine gesteigerte Befähigung, ausgehend von Primer 3 zu verlängern, der ein 3'-Analogon, 5-Nitroindol, trägt, wogegen R22 sich stark erhöht zeigt, jedoch mit schwachem Einfangen, wenn die Verlängerung in einem Nukleotidgemisch durchgeführt wird, bei dem dATP vollständig durch ATP (äquimolar) ersetzt wurde.
Beispiel 9
Die einfache Hybridisierung biotinylierter Oligonukleotide an das Plasmid kann für das Einfangen hinreichend sein.
Das Einfangen des Plasmids durch die Verwendung eines Oligonukleotids mit einem 5'-Biotin wurde mit dem Plasmid-Einfangen durch identisches, nicht-biotinyliertes Oligonukleotid verglichen. Im Gegensatz zu Beispiel 2 zeigte die einfache Hybridisierung (Inkubation bei 95°C für 5 min, Anhybridisieren bei 50°C für 5 min) von 10 pM Oligo und 10 fM Plasmid pASK75 das Einfangen von 10⁷ Kopien an Plasmid mit dem biotinylierten Oligonukleotid, während nur etwa 10⁵ Kopien des Plasmids unspezifisch an magnetischen Beads eingefangen wurden, wenn nicht-biotinyliertes Oligonukleotid verwendet wurde (12). Dies beruht auf der Verwendung einer Hochsalz-Aufbereitung von Plasmid-Oligonukleotid-Komplexen (Qiagen PCR Prep Kit) anstelle einer Niedrigsalz-Aufbereitung (ChromaSpin). Bei einem typischen Versuch beträgt eine Ausgangszahl der Plasmide etwa 10⁸ Kopien, und etwa 5–10% von diesen können durch Bindung an die Beads wiedergewonnen werden.
Anmerkung: Das bei diesem Versuch verwendete DNA-Oligonukleotid (24G) wird durch die Einbeziehung einer G-Klammer stabilisiert.
Es kann geschlussfolgert werden, dass ein einzelnes Biotin hinreichend für das Einfangen an Dynabeads ist.
Beispiel 10
Vergleich von DNA-Oligonukleotiden und DNA-LNA-Oligonukleotiden
Oligonukleotide, die 5'-Biotin und etwa 30% LNA-Basen enthalten (was zu gesteigerter Tm eines Primer-Matrizen-Hybrids führt) wurden in vitro auf das Plasmid-Einfangen hin getestet. Es wurde herausgefunden, dass eine gesteigerte Stabilität des LNA-Primer-Plasmid- Komplexes zu einer etwa 5–50-fachen Steigerung des Plasmid-Einfangens durch Hybridisierung führt (ohne Verlängerung), wenn man dies mit den reinen DNA-Oligonukleotiden (mit oder ohne G-Klammer) vergleicht (11, 12). Diese Steigerung ist größer, wenn man sie mit dem rein aus DNA bestehenden Standard-Oligonukleotid 24 vergleicht (12) als wenn man sie mit einem modifizierten DNA-Oligonukleotid, 24G, vergleicht (11).
Beispiel 11
Auswirkung der Verlängerungslänge auf das Plasmid-Einfangen
Ein 5'-biotinyliertes DNA-(24) oder DNA-LNA-Oligonukleotid (24LNA: 5'-GAT CTT CAC CTA GAT CCT-3', unterstrichene Nukleotide: LNA) wurde in vitro um 3, 9 oder hunderte von Basen verlängert, und das Plasmid-Einfangen wurde mit demjenigen bei einer einfachen Hybridisierung verglichen. Es war eine begrenzte Verlängerung unter Verwendung der Primer 24 und 24 LNA möglich, die ihre Primer-Wirkung so ausüben, dass die Matrizensequenz repliziert wird: 3'-AAATTTGATCACTTC-5'), wobei entweder nur dTTP bereitgestellt wird (was die Verlängerung auf drei Basen beschränkt (Matrizensequenz 3'-AAATTTGATCACTTC-5', Matrizenbasen in Fettdruck) oder wobei dTTP, dATP, dCTP bereitgestellt wird (9 Nukleotide, (Matrizensequenz 3'-AAATTTGATCACTTC-5', Matrizenbasen in Fettdruck) oder wobei alle 4 dNTPs bereitgestellt wurden (unbegrenzte Verlängerung, hunderte von Basen Verlängerung).
Es wurde herausgefunden, dass es für das DNA-Oligonukleotid eine Korrelation zwischen der Verlängerungslänge und dem Plasmid-Einfangen gibt (je länger die Verlängerung, umso mehr Plasmid wird eingefangen, 13B), während bei dem DNA-LNA-Oligonukleotid eine Verlängerung um 3 oder 9 Basen nicht zu einem signifikanten Anstieg des Plasmid-Einfangens führt, wenn man dies mit einfacher Hybridisierung vergleicht (13A). Eine unbegrenzte Verlängerung jedoch führt zu einem Anstieg der Menge an Plasmid, das auf den Dynabeads eingefangen wird.
Diese Ergebnisse liefern einen Beweis dafür, dass bei der OST-Selektion eine verbesserte katalytische Effizienz der Polymerase (und daher eine größere Verlängerung des Primers) zu einer gesteigerten Wahrscheinlichkeit führt, dass das Plasmid eingefangen wird. In diesem Fall besitzt der verwendete DNA-Primer keine G-Klammer, und daher ist der Unterschied zwischen LNA/DNA- und reinem DNA-Primer bei fehlender Verlängerung näher an 50fach als an 5fach, wie bei 24G in Beispiel 11.
Beispiel 12
Vergleich der verschiedenen Primer zur Verwendung bei der CST
Primer mit Primer-Wirkung in verschiedenen Regionen von pASK75 (24G, pASK2 5'-GATCTTCACCTAGATCCT-3', pASK3 5'-CATGCCATCCGTAAGATGC-3', pASK4 5'-GTTCCTGGCCTTTTGCTGG-3' und pASK5 5'-ACGTAGTGGGCCATCG-3') wurden im Hinblick auf ihre Effizienz des Plasmid-Einfangens hin verglichen. Wie bereits in Beispiel 2 zu sehen, gab es wenig Unterschied bei der Effizienz des Plasmid-Einfangens in Abhängigkeit von der Sequenz oder Position des Primers (Daten nicht gezeigt).
Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Parameter bei der CST-Selektion (z. B. die zu replizierende Sequenz) frei gewählt werden können.
Die Verwendung eines Gemischs von 5 Primern (mit derselben Endkonzentration (100 pM)) führt zu einem etwa 2–3-fachen Anstieg der Menge an Plasmid, die auf den Beads eingefangen wird, was nahelegt, dass alle Plasmide für die Ausübung der Primerfunktion verfügbar sind, und dass eine Plasmid-Markierung an multiplen Stellen erreicht werden kann.
Beispiel 13
Verbesserung der Empfindlichkeit der CST
Die Effizienz des Biotin-Einfangens und somit die Empfindlichkeit der CST-Selektion kann auf das bis zu 100-fache verbessert werden, wenn ein sehr langer Linker zwischen dem Biotin-Molekül und dem Primer verwendet wird, wie zuvor durch Hybridisierungsversuche nahe gelegt (Shchepinov et al., NAR, Vol 25, Issue 6, 1997). Dieses Dokument wird hier durch Referenz in Bezug genommen. In einem Testversuch wurde die Effizienz des Plasmid-Einfangens mit den Primern 24GB und 1086 verglichen. Der 1088-Primer besitzt 5'-Biotin an einem 108 Atome langen Linker, wogegen der 24GB-Primer 5'-Biotin an einem 16 Atome langen Linker besitzt. Die Effizienz des Plasmid-Einfangens nach einem einfachen Hybridisierungsversuch (wie in Beispiel 11) war bis zu 100-fach höher, wenn der 108B-Primer verwendet wurde (14).
Beispiel 14
Minimallänge des DNA-Primers, die für das Einfangen erforderlich ist
Die Primer 18 (5'GATCTTCACCTAGATCCT-3'), 14 (5'TTCACCTAGATCCT-3') 12 (5'CACCTAGATCCT-3'), 10 (5'CCTAGATCCT-3') und 8 (5'TAGATCCT-3') mit 18, 14, 12, 10 bzw. 8 bp Länge wurden in vitro auf die Effizienz des Plasmid-Einfangens nach der Verlängerung mit dNTPs hin getestet. Es wurde bemerkt, dass die Länge des Primers die Effizienz des Plasmid-Einfangens nicht beeinflusste, solange der/das Primer/Oligonukleotid mehr als 10 Basen lang war (15).

Claims

Verfahren zum Selektieren eines Enzyms, das in der Lage ist, ein Oligonukleotid direkt oder indirekt zu modifizieren, wobei das Verfahren nicht von der vollständigen Replikation des Gens, welches das das Oligonukleotid modifizierende Enzym kodiert, abhängig ist, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt, bei denen man: (a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Elternplasmiden, die ein oder mehrere interessierende Enzyme kodieren, bereitstellt, wobei das Elternplasmid die Gensequenz des ausgewählten interessierenden Enzyms bereitstellt, (b) diese Plasmide nach Stufe (a) kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit dem einen oder mehreren von dem Plasmid kodierten Enzymen und ein Oligonukleotid, welches für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist, umfasst, (c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation des Oligonukleotids nach Stufe (b) mit einem Bereich des Plasmids auftreten kann, (d) solche Bedingungen bereitstellt, dass die Modifikation des Oligonukleotids nach Stufe (b) unter Verwendung des von dem Plasmid kodierten Enzyms auftreten kann und dass das resultierende modifizierte Oligonukleotid eine molekulare Markierung umfasst, und (e) den modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex einfängt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das ausgewählte Enzym eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften besitzt: eine niedrige katalytische Umsatzrate (unter den Selektionsbedingungen), eine niedrige Prozessivität (unter den Selektionsbedingungen), die Inkorporation von modifizierten Substraten, die ein nukleinsäureähnliches Polymer erzeugen, welches nicht reamplifiziert werden kann.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Enzym ein Nukleinsäure verarbeitendes Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 3, welches die Stufen umfaßt, bei denen man: (a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Elternplasmiden, die ein oder mehrere Nukleinsäurepolymerasen kodieren, bereitstellt, wobei das/die Elternplasmid/e die Gensequenz des interessierenden Nukleinsäure verarbeitenden Enzyms bereitstellt/bereitstellen, (b) diese Plasmide nach Stufe (a) in Kompartimente kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit der einen oder den mehreren Nukleinsäurepolymerasen, die von dem Plasmid kodiert werden, umfasst, (c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation eines Oligonukleotids, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (b) spezifisch ist, mit diesem Bereich des Plasmids auftreten kann, (d) das Oligonukleotid nach Stufe (b) extendiert, wobei man das Nukleinsäure verarbeitende Enzym in der Gegenwart von einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden, die eine molekulare Markierung umfassen, verwendet, und (e) den modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex einfängt.
Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das Nukleinsäure verarbeitende Enzym ausgewählt ist unter einem beliebigen von denjenigen innerhalb der Gruppe, die aus den Folgenden besteht: polY-Familie der DNA-Polymerasen, polX-Familie der DNA-Polymerasen, Varianten mit niedriger Prozessivität von Polymerasen mit hoher Prozessivität, DNA-Ligasen, RNA-Ligasen, Polynukleotidkinasen.
Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das Nukleinsäure verarbeitende Enzym eine DNA-Polymerase ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst, bei denen man: (a) ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle in Form von Elternpasmiden, die eine oder mehrere DNA-Polymerasen kodieren, bereitstellt, wobei das/die Elternplasmid/e die Gensequenz der interessierenden Polymerase bereitstellt/bereitstellen, (b) diese Plasmide nach Stufe (a) in Kompartimente kompartimentiert, so dass jedes Kompartiment ein Plasmid gemeinsam mit der einen oder den mehreren DNA-Polymerasen, die von Plasmid kodiert werden, umfasst, und ein Oligonukleotid, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist, (c) solche Bedingungen bereitstellt, dass eine stabile Assoziation des Oligonukleotids, das für einen Bereich auf dem Plasmid nach Stufe (a) spezifisch ist, mit diesem Bereich des Plasmids auftreten kann, (d) solche Bedingungen bereitstellt, dass das 3'-Ende des Oligonukleotids nach Stufe (b) extendiert werden kann, in dem man die DNA-Polymerase nach Stufe (a) in der Gegenwart von einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden, die eine molekulare Markierung umfassen, verwendet, und (e) den 3'-extendierten modifizierten Oligonukleotid/Plasmid-Komplex einfängt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Nukleinsäure verarbeitende Enzym eine Polynukleotidkinase ist, und wobei die Stufe der Oligonukleotidmodifikation die Phosphorylierung des 5'-Endes des Oligos umfasst, gefolgt von der Markierungs-Ligation eines weiteren, mit einer molekularen Markierung verknüpften Oligonukleotids.
Verfahren nach Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 5, wobei das Verfahren zum Selektieren von DNA-Ligasen ist, und wobei jedes Kompartiment ein oder mehrere Plasmide, die die interessierende Ligase kodieren, ein oder mehrere Oligonukleotide, die in der Lage sind, mit einem die interessierende Ligase kodierenden Plasmid zu assoziieren, die Ligase, die von dem Plasmid kodiert wird, und ein oder mehrere mit einer Markierung versehene Oligonukleotide in Form von mit einer Markierung versehenen Nukleotiden umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder Anspruch 5, welches verwendet wird zum Selektieren von Enzymen, die direkt auf ein mit einem Oligonukleotid verknüpftes Substratmolekül wirken.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder Anspruch 5, wobei das Enzym eines ist, welches beim Verarbeiten einer Nukleinsäure indirekt involviert ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei jedes Kompartiment ein Plasmid, welches ein Enzym, welches beim Verarbeiten einer Nukleinsäure indirekt involviert ist, kodiert, ein oder mehrere Enzyme, die von dem Plasmid kodiert werden, ein oder mehrere DNA-Replikasen und ein oder mehrere modifizierte Substrate des von dem Plasmid kodierten Enzyms umfasst.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Enzym, welches beim Verarbeiten einer Nukleinsäure indirekt involviert ist, entweder bei der Produktion von Nukleinsäurereplikasesubstraten aus einem geblockten oder inaktiven Substrat (das modifizierte Substrat eines Enzyms) involviert ist, oder es bei der funktionellen Inaktivierung von Nukleinsäurereplikaseinhibitoren (das modifizierte Substrat), die in dem Kompartiment vorliegen, involviert ist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Enzym bei der Produktion von Nukleinsäurereplikasesubstraten aus einem geblockten oder inaktiven Substrat involviert ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 4 bis 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man eine oder mehrere der Techniken in der Liste, die aus dem Folgenden besteht, verwendet: durch Erhöhung der Tm des Oligonukleotid/Plasmid-Hybrids, durch Extendieren des Oligonukleotids um mehr als 3 Basen, durch die Verwendung eines Linkers, der mehr als 40 Atome lang ist, zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid, durch die Verwendung eines Oligonukleotids, das mehr als 10 Basen lang ist.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man die Tm des Oligonukleotid/Plasmid-Hybrids erhöht, indem man beliebige Basen aus der Liste, die aus dem Folgenden besteht, verwendet: LNA-Basen, Diaminopurin (zum Austausch von A), G-clamps (G-Klammern), INA oder beliebige andere Basen oder Gerüstmodifikationen, die die Tm erhöhen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man das Oligonukleotid um eine Base oder mehr extendiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man das Oligonukleotid um 3 Basen oder mehr extendiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man das Oligonukleotid um 9 Basen oder mehr extendiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man das Oligonukleotid um mehr als 20 Basen extendiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man das Oligonukleotid um mehr als 50 Basen extendiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man das Oligonukleotid um mehr als 100 Basen extendiert.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man einen Linker, der mehr als 50 Atome lang ist, zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid verwendet.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man einen Linker, der mehr als 70 Atome lang ist, zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid verwendet.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Effizienz des Plasmideinfangs erhöht wird, indem man einen Linker, der mehr als 100 Atome lang ist, zwischen der molekularen Markierung und dem Oligonukleotid verwendet.