DE69326230T2

DE69326230T2 - Insertionselemente und amplifizierbare nukleinsäuren

Info

Publication number: DE69326230T2
Application number: DE69326230T
Authority: DE
Inventors: J. Burg
Original assignee: Vysis Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 2000-02-24
Anticipated expiration: 2013-10-09
Also published as: EP0618983A1; DE69326230D1; WO1994009159A2; WO1994009159A3; JPH07503859A; EP0618983B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Insertionselemente, rekombinante Moleküle und amplifizierbare Nucleinsäuren für eine Verwendung bei Nucleinsäurehybridisierungsassays, Verfahren zur Identifizierung solcher Insertionselemente, rekombinanten Moleküle und amplifizierbaren Nucleinsäuren und Verfahren zu ihrer Herstellung.

Stand der Technik

Die Nützlichkeit des Nachweises von Targetnucleinsäuren in der klinischen Diagnostik ist bekannt. Zum Nachweis spezifischer Nucleinsäuretargets als Diagnostik der Anwesenheit eines bestimmten Organismus sind verschiedene Methoden entwickelt worden. Diese umfassen Hybridisierungsassays, die sich auf eine oder mehrere Nucleinsäuresonden stützen, die entwickelt sind, spezifische Sequenzen in der Targetnucleinsäure zu hybridisieren oder an diese zu binden.
Die Empfindlichkeit des Assays ist eine Forderung an alle Assayformate. Viele Formate enthalten spezifische Mittel zur Erhöhung der Empfindlichkeit des Basisassays. So sind beispielsweise Methoden für die Vergrößerung der Targetmenge in der zu analysierenden Probe vor dem Nachweis entwickelt worden. Dies kann durch Anwendung einer Reihe von Verfahren wie der bekannten Polymerasekettenreaktion (PCR), Ligasekettenreaktion (LCR), Multienzym-Amplifikationsreaktion (3SR), strand displacement amplification reaction (SDA) und Target-abhängigen Replikation (TDR) erfolgen.
Die Nachweisempfindlichkeit kann auch durch Amplifikation des detektierten Signals verbessert werden. Dies kann durch die Anzeige eines kontinuierlich erzeugten Signals über die Zeit oder Vergrößerung der Anzahl von Markierungen für den Nachweis erreicht werden. Dies kann wiederum erreicht werden durch die Verwendung zahlreicher Sonden mit Einzelmarkierungen oder von Sonden mit zahlreichen Markierungen. Solche Signale können leicht erzeugt werden durch Radioisotopen- und Enzymmarkierungen oder fluoreszierende Markierungen, die an eine Assaysonde angeheftet werden. Diese Verfahren sind bekannt. Das Assaysignal kann auch durch Amplifikation der Sonde verstärkt werden, an welche sich die Markierung, die das detektierte Signal erzeugt, anheftet. Das wird anschließend für Sandwichhybridisierungsassays erläutert.
Bei Sandwichhybridisierungsassays werden typischerweise zwei getrennte Nucleinsäuresonden eingesetzt. Dabei ist jede Sonde entwickelt, ein gegenseitig ausschließliches Segment in der Targetnucleinsäure zu hybridisieren oder an dieses zu binden. Eine Sonde, die Detektorsonde, ist konstruiert, mit einer Markierungseinheit zu kombinieren. Die Markierungseinheit ist entweder direkt detektierbar oder erlaubt die Erzeugung eines detektierbaren Materials. Geeignete Markierungen umfassen radioisotopisch markierte Nucleotide, Enzym/Substrat-Paare und Fluoreszenzfarbstoffe, die alle aus dem Stand der Technik bekannt sind. Die zweite Sonde, die Fangsonde, ist konstruiert, zusätzlich zum Target an einen Träger zu binden. Die Fangsonde wird verwendet, das Target von überschüssigem und unerwünschtem Material zu trennen. Unter Hybridisierungs- oder Bindungsbedingungen hybridisieren die beiden Sonden mit dem Target, wobei sich ein ternärer Komplex Fangsonde : Target : Detektorsonde bildet. Die Zugabe eines geeigneten Trägers erlaubt das Einfangen des ternären Komplexes durch den Träger. Danach kann der Komplex isoliert und vermessen werden, um das Vorhandensein oder die Menge des Targets, das in der Probe anwesend ist, zu bestimmen.
Bestimmte Sandwich-Assayformate nutzen einen interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff wie Propidiumiodid in Kombination mit einer Replikation der Detektorsonde, um das Signal zu erzeugen.
Solche Assayformate sind in EP-A-0 454 461 beschrieben. Insbesondere können in diesen Assays RNA-Oligonucleotide oder -Moleküle als Detektorsonde verwendet werden. Nach Einfangen und Isolation des Targets wird die Detektorsonde, beispielsweise durch Qβ-Replicase, enzymatisch repliziert und den Replikaten erlaubt, mit dem Farbstoff zu kombinieren, um eine detektierbare Reaktion hervorzurufen.
Um in einem Diagnostik-Assay nützlich zu sein, muß das Amplifikationsverfahren schnell, empfindlich und reproduzierbar sein. Die Amplifikation mit Qβ-Replicase entspricht diesen Charakteristika bei bestimmten Nucleinsäuresubstraten. Tatsächlich kann Qβ-Replicase schnell und reproduzierbar replizieren und damit die Detektion von nur einem Molekül solcher Substrate in weniger als fünfzehn Minuten ermöglichen.
Das Enzym QBeta(Qβ)-Replicase wird als eine Template-spezifische RNA-Polymerase betrachtet. Das Enzym wird aus der Bakteriophage Qβ erhalten. In vivo ist es die primäre Aufgabe des Enzyms, das RNA-Genom der Bakteriophage zu replizieren. Qβ- Replicase ist auch dafür bekannt, daß sie bestimmte andere Substrate in vivo repliziert. Darunter befindet sich eine als midivariante RNA bezeichnete RNA oder MDV-RNA. Midivariante RNA wird auch MDV-1 RNA genannt. Für die Zwecke dieser Patentanmeldung wird als midivariante RNA auch diejenige angesehen, die mutante und anderweitig modifizierte midivariante RNAs umfaßt, die von Qβ-Replicase schnell und reproduzierbar repliziert werden.
Charakteristischerweise sind die Replikationsprodukte der Qβ- Replicase selbst Substrate für die Qβ-Replicase. Deshalb schreitet die Replikation dieser Substrate geometrisch fort und liefert so ein mächtiges Hilfsmittel für die Amplifikation der Menge dieser Substrate in einer Probe. Gekoppelt mit einem geeigneten Detektionssystem erlaubt eine derartige Amplifikation einen leistungsfähigen Diagnostik-Assay, welcher das Potential einer schnellen und reproduzierbaren Detektion von nur einem Targetmolekül bietet.
Qβ-Replicase ist jedoch Template-spezifisch und Modifizierungen zu einem anderweitig geeigneten Substrat können die Replikationseigenschaften des Substrats ernsthaft verschlechtern. Deshalb können MDV-RNAs, die anfänglich für die Replikation durch Qβ-Replicase geeignet sind, für die Replikation durch Qβ- Replicase ungeeignet werden, wenn sie an eine Verwendung als Assaysonden angepaßt werden, weshalb sie dann für eine Verwendung in einem Assay ungeeignet sind.
Im Stand der Technik ist beim Anpassen von Qβ-Replicase- Substraten an eine Verwendung in einem Diagnostik-Assay einiger Erfolg erzielt worden. So können beispielsweise MDV-RNAs angepaßt werden, wobei sie durch Zusatz einer funktionellen Nucleotidsequenz zum Substrat entweder am Ende oder im Inneren Assaysonden bilden, um das Binden an erwünschte Targets zu erlauben. Bis heute ist aber der größte Erfolg, gemessen an der Erhaltung der Replikationseigenschaften des unmodifizierten Substrats, durch Einführung der Target-spezifischen Sequenz in das Substrat erreicht worden. Bisher ist jedoch im Stand der Technik keine Möglichkeit gefunden worden, a priori zu bestimmen, ob eine nützliche Target-spezifische Sequenz erfolgreich mit einem Substrat kombiniert werden kann, um eine nützliche Sonde zu ergeben.
Dementsprechend besteht ein Bedarf an amplifizierbaren Nucleinsäuren, die von Substraten für Enzyme wie Qβ-Replicase angepaßt sind und die Replikationseigenschaften des ursprünglichen Substrats beibehalten. Solche amplifizierbaren Nucleinsäuren sind geeignet, eine funktionelle Nucleotidsequenz zu enthalten, die es dem Substrat erlaubt, an ein erwünschtes Target zu binden und somit als Assaysonde zu dienen.
Deshalb liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, amplifizierbare Nucleinsäuren bereitzustellen, die eine funktionelle Nucleotidsequenz enthalten und für einen Nucleinsäurehybrisie rungsassay nützlich sind. Solche amplifizierbaren Nucleinsäuren behalten die Replikationseigenschaften des ursprünglichen Substrats im wesentlichen bei. Weiterhin ist es eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zur Identifizierung solcher amplifizierbaren Nucleinsäuren bereitzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist festgestellt worden, daß Insertionselemente für eine Verwendung in rekombinanten Molekülen wie amplifizierbaren Nucleinsäuren, die in Nucleinsäurehybrisierungsassays eingesetzt werden, hergestellt werden können. Ein erfindungsgemässes Insertionselement umfaßt eine spezifische Nucleotidsequenz, die von einem oder mehreren Abstandshaltern flankiert ist. Die Abstandshalter umfassen eine Sequenz aus zufällig erzeugten Nucleotiden. Wird das Insertionselement zur Konstruktion einer Sonde für die Hybridisierung an ein Target in einem Hybdridisierungsassay verwendet, wird die funktionelle Nucleotidsequenz ausgewählt, damit sie in der Lage ist, an ein separates Targetnucleotid unter Hybdridisierungsbedingungen zu binden.
Weiterhin ist festgestellt worden, daß die erfindungsgemäßen Insertionselemente derart in ein replizierbares Nucleinsäuresubstrat eingebaut werden können, daß die Replikationseigenschaften des Substrats im wesentlichen erhalten bleiben. Daher ist eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten Moleküle eine amplifizierbare Nucleinsäure, die ein replizierbares Nucleinsäuresubstrat enthält, wobei das Nucleinsäuresubstrat ferner ein erfindungsgemäßes Insertionselement enthält.
Darüber hinaus ist festgestellt worden, daß Bibliotheken aus solchen Insertionselementen, rekombinanten Molekülen und amplifizierbaren Nucleinsäuren hergestellt werden können, was die Identifizierung überlegener erfindungsgemäßer Insertionselemente, rekombinanter Moleküle und amplifizierbarer Nucleinsäuren in hohem Maße erleichtert. Die Insertionselemente, rekombinanten Moleküle, amplifizierbaren Nucleinsäuren und Bibliotheken können durch zahlreiche Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann leicht zugänglich sind. Diese umfassen die Synthese mit Nucleinsäure-Syntheseautomaten und den Einbau einer funktionellen Nucleotidsequenz in eine Vektorbibliothek, welche die zufällig erzeugten Abstandshalter umfaßt. Die funktionellen Nucleotidsequenzen können unter Anwendung herkömmlicher Methoden in Vektoren eingebaut werden.
Die erfindungsgemäßen Bibliotheken sind besonders nützlich bei der Identifizierung amplifizierbarer Nucleinsäuren für eine Verwendung als Sonden in einem Nucleinsäurehybridisierungsassay, worin die Assaysonde durch ein Enzym wie Qβ-Replicase repliziert wird. Vielfach können die erfindungsgemäßen amplifizierbaren Nucleinsäuren direkt als Sonden in einem Nucleinsäurehybridisierungsassay verwendet werden. Derartige Assaysonden können schnell, reproduzierbar und mit hoher Empfindlichkeit repliziert werden, wodurch die Möglichkeit für Diagnostikassays mit einer Empfindlichkeit von einem Targetmolekül geboten wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

- Fig. 1 zeigt eine Nucleotid-Karte von Mlu I # 61 MDV,
- Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Herstellung erfindungsgemäßer Insertionselemente unter Verwendung von Mlu I # 61 MDV und
- Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines zweiten Verfahrens zur Herstellung erfindungsgemäßer Insertionselemente unter Verwendung von Mlu I # 61 MDV.

Spezielle Beschreibung der Erfindung

Es ist festgestellt worden, daß rekombinante Moleküle mit besonders nützlichen Eigenschaften erhalten werden können, wenn sie geeignet sind, ein erfindungsgemäßes Insertionselement zu umfassen. Solche Insertionselemente enthalten eine funktionelle Nucleotidsequenz, die von einem oder mehreren Abstandshaltern flankiert wird. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen rekombinanten Moleküle ist eine amplifizierbare Nucleinsäure mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften zur Verwendung in einem Diagnostikassay. Die neue amplifizierbare Nucleinsäure umfaßt ein neues Insertionselement, das in ein replizierbares Nucleinsäuresubstrat eingebaut wird. Ein neues erfindungsgemäßes Insertionselement enthält eine funktionelle Nucleotidsequenz, die an jeder Seite von einem oder mehreren Abstandshaltern flankiert wird. Die Abstandshalter enthalten eine Sequenz zufällig erzeugter Nucleotide. Die replizierbaren Nucleinsäuresubstrate und damit die neuen amplifizierbaren Nucleinsäuren sind durch Enzyme wie Qβ-Replicase replizierbar. Die amplifizierbaren Nucleinsäuren und Insertionselemente können RNAs oder DNAs sein.
Amplifizierbare Nucleinsäuren werden vorzugsweise so konstruiert, daß die funktionelle Nucleotidsequenz und der/die Abstandshalter eher in das Nucleinsäuresubstrat eingebaut als an dessen eines oder beide Enden angeheftet werden. Beispiele für solche Substrate umfassen folgende Substrate für das Enzym Qβ-Replicase: MDV RNA, Qβ-Phagen-RNA, CT RNA, WS-1 RNA, mikrovariante RNA, RQ120 RNA, RQ135 RNA und funktionelle Äquivalente und Fragmente davon. Qβ-Replicase ist auch für die Replikation von DNA bekannt. Weitere Enzym/Substrat-Kombinationen umfassen T7-RNA-Polymerase und ihre Substrate X- und Y-RNA. Es wird erwartet, daß RNA-Polymerase von anderen RNA-Bakteriophagen wie R17, f2, MS2, fr, M12, SP und u2 ähnliche Nützlichkeit besitzt.
Im weiteren Sinne werden die erfindungsgemäßen Insertionselemente verwendet, um eine funktionelle Nucleotidsequenz in ein Wirtsmolekül einzufügen, wobei sich ein erfindungsgemäßes rekombinantes Molekül bildet. Zusätzlich zu den obengenannten Wirten für amplifizierbare Nucleinsäuren umfassen geeignete Wirte chromosomale und extrachromosomale DNA- und RNA-Spezies wie hnRNA, mRNA, rmA, tRNAs und snRNAs. Außerdem können Insertionselemente in die RNA-Genome von RNA-Bakteriophagen wie R17, f2, MS2, fr, M12, SP und u2 und andere Substrate für die RNA-Polymerasen dieser Organismen eingefügt werden. Insertionselemente können auch in die RNA-Genome und deren Satelliten- RNAs von RNA-Viren von Pflanzen- und Tierzellen eingefügt werden.
Die Insertionselemente versetzen eine funktionelle Nucleotidsequenz in die Lage, vorteilhafterweise in Wirtsmoleküle eingefügt zu werden, wo sich eine direkte Insertion der funktionellen Nucleotidsequenz für den Wirt als nachteilig erweist, d. h. wenn anderweitig erwünschte Eigenschaften des Wirts durch den Zusatz der funktionellen Nucleotidsequenz verloren gehen oder sich verschlechtern. Im allgemeinen wird angenommen, daß von den Abstandshaltern strukturelle Spannungen abgebaut werden, die wegen des Zusatzes der funktionellen Nucleotidsequenz auf dem Wirt lasten.
Die Insertionselemente werden hier beschrieben, daß sie die enzymatische Replikation einer Wirtsnucleinsäure erleichtern. Es wird auch erwartet, daß Insertionselemente die funktionelle Nucleotidsequenz im Wirt stabilisieren. Somit wird erwartet, daß die Abstandshalter Deletionen oder Veränderungen der funktionellen Nucleotidsequenz während der Replikation oder anderer Anwendungen verhindern oder verringern.
Insertionselemente können auch verwendet werden, um eine funktionelle Nucleotidsequenz in ein Gen einzufügen, das für eine spezifisches Protein codiert. Die funktionelle Nucleotidsequenz kann verwendet werden, die Aminosäurestruktur des Proteins zu ergänzen oder zu modifizieren. Die Insertionselemente können verwendet werden, ein mRNA-Transkript des modifizierten Gens zu stabilisieren.
Insertionselemente können auch eingesetzt werden, um die Funktionalität der funktionellen Nucleotidsequenz zu erhöhen. So können beispielsweise, wenn ein Ribosom als funktionelle Nucleotidsequenz verwendet wird, Abstandshalter eingesetzt werden, um die Wechselwirkung zwischen dem Ribosom und seinem RNA-Substrat zu verstärken oder zu stabilisieren.
Die erfindungsgemäßen Insertionselemente werden hier hinsichtlich ihrer Nützlichkeit für amplifizierbare Nucleinsäuren, die als Sonden in Nucleinsäurehybridisierungsassays verwendet werden, diskutiert und erläutert. Die Insertionselemente erlauben jedoch viel breitere Anwendungen. So kann beispielsweise ein Insertionselement zum Einfügen einer funktionellen Nucleotidsequenz in ein Wirtsmolekül verwendet werden, das dann als Target für eine markierte Sonde dient. Die insertierte funktionelle Nucleotidsequenz kann auch als Bindungspartner für ein Protein, einen Antinucleinsäure-Antikörper oder einen anderen Liganden dienen.
Wenn eine erfindungsgemäße amplifizierbare Nucleinsäure als Sonde in einem Hybridisierungsassay verwendet wird, wird die funktionelle Nucleotidsequenz konstruiert, um die erforderlichen Bindungseigenschaften der Sequenz zu erhalten. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß diese typischerweise von den Bedingungen eines Hybridisierungsassays bestimmt werden, in welchem eine Sonde, in die die funktionelle Nucleotidsequenz eingefügt ist, verwendet wird. So kann beispielsweise die funktionelle Nucleotidsequenz entworfen werden, um an eine Polynucleotidsequenz, die für eine einzige Targetspezies spezifisch ist, oder allgemeiner an eine Polynucleotidsequenz, die für eine Vielzahl von Targets spezifisch ist, zu binden. Die funktionelle Nucleotidsequenz kann auch entworfen werden, um an eine Nucleotidsequenz zu binden, die nur für das/die Assaytarget/s charakteristisch und nicht für das/die Target/s spezifisch für ist.
Wenn sie in einem Hybridisierungsassay verwendet wird, wird die funktionelle Nucleotidsequenz typischerweise ein Oligonucleotid enthalten, das zu einem Segment des separaten Targetpolynucleotids komplementär ist. Aus dem Stand der Technik ist bekannt, daß der für die funktionelle Nucleotidsequenz erforderliche Komplementaritätsgrad von den Bedingungen abhängt, unter denen die Bindung oder Hybridisierung eingeleitet wird. So hängt beispielsweise der Komplementaritätsgrad von der Temperatur während der Hybridisierung, den Probenreagentien (beispielsweise Salzgehalt und Charakter des eingesetzten Salzes), der erforderlichen Kinetik und anderen aus dem Stand der Technik bekannten Bedingungen ab. Während vollständige Komplementarität zwischen einer funktionellen Nucleotidsequenz und einem Assaytarget oftmals erwünscht ist, ist vollständige Komplementarität auch auch oftmals nicht erreichbar und oftmals nicht wünschenswert. Darüber hinaus sind die für die Assaysonde erforderlichen Bindungseigenschaften abhängig von der Funktion der Sonde im Assay. So üben beispielsweise in einem Sandwich- Assay die Fangsonde und die Detektorsonde unterschiedliche Funktionen aus, weshalb sich die für die jeweilige Sonde erforderlichen Bindungseigenschaften unterscheiden können. Insbesondere kann die Fangsonde entworfen sein, sehr spezifisch an das Target zu binden, während die Detektorsonde entworfen ist, an das Target zu binden, aber mit viel geringerer Spezifität. Die Spezifität des Assays gegenüber dem Target wird dann von der Fangsonde und nicht von der Detektorsonde bestimmt.
Auf ähnliche Weise ist die Länge der funktionellen Nucleotidsequenz von den funktionellen Eigenschaften abhängig, die für das Sequenznucleotid erforderlich sind. Wenn sie in Sonden für Hybridisierungsassays verwendet werden, sind funktionelle Nucleotidsequenzen jedoch typischerweise etwa 8 bis 60 Nucleotide lang. Gewiß können, wie aus dem Stand der Technik bekannt, auch längere funktionelle Nucleotidsequenzen verwendet werden. Von Fachleuten sind zahlreiche funktionelle Nucleotidsequenzen für viele Assay-Targets identifiziert worden. Auf ähnliche Weise sind von den Fachleuten Methoden zur Identifizierung zusätzlicher funktioneller Nucleotidsequenzen für neue oder bekannte Assay-Targets, falls das wünschenswert erschien, entwickelt worden.
Nachdem eine geeignete funktionelle Nucleotidsequenz identifiziert worden ist, kann sie an eine Verwendung in einer Assay- Sonde angepaßt werden. Wenn das Assayformat eine Amplifikation der Assay-Sonde erfordert, ist darauf zu achten, sicherzustellen, daß die Assay-Sonde genügend amplifizierbar ist.
So ist beispielsweise bekannt, daß native MDV RNA ein ausgezeichnetes Substrat für Qβ-Replicase ist und schnell, reproduzierbar und mit großer Empfindlichkeit durch das Enzym repliziert werden kann. Daher ist es wünschenswert, MDV RNA an eine Verwendung als amplifizierbare Sonde in einem Diagnostik- Assay anzupassen. Dies erfordert, daß MDV RNA modifiziert wird, damit sie eine funktionelle Nucleotidsequenz enthält. Die Replizierbarkeit von MDV RNA verschlechtert sich jedoch oftmals beträchtlich, wenn sie modifiziert wird, um eine exogene Nucleotidsequenz zu enthalten. Deshalb ist ein Mittel erwünscht, durch welches einem angepaßten Substrat die ausgezeichneten Replikationseigenschaften des nativen Substrats erhalten bleiben. Auf ähnliche Weise ist auch ein Mittel zur schnellen und methodischen Identifizierung amplifizierbarer Nucleinsäuren, d. h. replizierbarer Substrate, die angepaßt sind, funktionelle Nucleotidsequenzen zu enthalten, mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften erwünscht. Diese Aufgaben werden durch die erfindungsgemäßen Insertionselemente und amplifizierbaren Nucleinsäuren gelöst. Die Insertionselemente und amplifizierbaren Nucleinsäuren sind leicht zu konstruieren und diejenigen mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften sind leicht zu identifizieren.
Es ist festgestellt worden, daß viele der ausgezeichneten Replikationseigenschaften eines replizierbaren Nucleinsäuresubstrats trotz des Einbaus einer funktionellen Nucleotidsequenz in das Substrat erhalten werden können, wenn die funktionelle Nucleotidsequenz als ein erfindungsgemäßes Insertionselement eingebaut ist. Das heißt, daß ausgezeichnete Replikationseigenschaften erhalten bleiben können, wenn die funktionelle Nucleotidsequenz von einem oder mehreren Abstandshaltern flankiert wird, die eine Sequenz aus zufällig erzeugten Nucleotiden enthalten. Das so modifizierte Nucleinsäuresubstrat ist eine erfindungsgemäße amplifizierbare Nucleinsäure.
Jeder erfindungsgemäße Abstandshalter enthält eine separate Nucleotidsequenz. Zur Zeit werden die Nucleotidsequenzen zufällig ausgewählt. Unter zufälliger Auswahl ist zu verstehen, daß jedes Nucleotid des Abstandshalters ohne eine direkte Beziehung zu einem anderen Nucleotid des Abstandshalters ausgewählt wird. Auf ähnliche Weise werden die einzelnen Nucleotide eines Abstandshalters ohne direkte Korrelation mit der funktionellen Nucleotidsequenz ausgewählt, die von dem Abstandshalter flankiert werden wird. Es ist jedoch selbstverständlich, daß vollständige Insertionselemente ausgesucht werden, um diejenigen zu identifizieren, die optimale Eigenschaften verleihen. So werden beispielsweise, wenn Insertionselemente in amplifizierbaren Nucleinsäüren verwendet werden, die amplifizierbaren Nucleinsäuren untersucht, um diejenigen Kombinationen aus Abstandshaltern und funktionellen Nucleinsäuresequenzen zu identifizieren, die amplifizierbare Nucleinsäuren mit optimalen Replikationseigenschaften ergeben. Danach können große Mengen der optimalen amplifizierbaren Nucleinsäure hergestellt werden.
Eine Sequenz von zufälligen Nucleotiden kann beispielsweise durch Programmierung eines Nucleinsäure-Syntheseautomaten erzeugt werden, um Nucleotide aus einem äquimolaren Gemisch von Nucleotidtriphosphaten zufällig auszuwählen. Dem Fachmann ist bekannt, daß weitere Methoden zur Erzeugung zufälliger Nucleotidsequenzen leicht zugänglich sind.
Die Länge eines Abstandshalters wird nur von seiner Fähigkeit begrenzt, nützliche Replikationseigenschaften zu ermöglichen. Deshalb sind die Abstandshalter mindestens 2 Nucleotide lang. Gegenwärtig sind Abstandshalter von 2 bis 25 Nucleotiden für amplifizierbare Nucleinsäuren bevorzugt. Am meisten bevorzugt sind Abstandshalter von 8 bis 14 Nucleotiden.
Es ist beabsichtigt, daß der/die Abstandshalter die funktionelle Nucleotidsequenz im rekombinanten Molekül flankiert/- flankieren. Dabei ist es bevorzugt, daß die Abstandshalter der funktionellen Nucleotidsequenz unmittelbar benachbart sind. Zusätzlich sollten Abstandshalter nicht mehr als etwa zehn Nucleotide von der funktionellen Nucleotidsequenz entfernt sein. Erfindungsgemäß ist die Verwendung mindestens eines Abstandshalters beabsichtigt, der die funktionelle Nucleotidsequenz flankiert. Wird ein einziger Abstandshalter eingesetzt, kann der Abstandshalter entweder an 3' oder 5' zur funktionellen Nucleotidsequenz liegen. Werden zwei oder mehr Abstandshalter verwendet, ist es bevorzugt, daß die funktionelle Nucleotidsequenz auf jeder Seite von mindestens einem Abstandshalter flankiert wird.
Es sind zahlreiche Insertionselemente und amplifizierbare Nucleinsäuren mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften gefunden worden. Ebenfalls ist jedoch festgestellt worden, daß die Abstandshalter eher spezifisch denn allgemein nützlich sind. Das heißt, ein Abstandshalter kann mit einer funktionellen Nucleotidsequenz und einem Nucleinsäuresubstrat kombinieren, wobei sich eine amplifizierbare Nucleinsäure mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften bildet, aber derselbe Abstandshalter kann nicht mit einer anderen funktionellen Nucleotidsequenz und einem anderen Nucleinsäuresubstrat kombinieren, um eine amplifizierbare Nucleinsäure mit ähnlichen ausgezeichneten Replikationseigenschaften zu bilden. Deshalb müssen nützliche Abstandshalter für jede funktionelle Nucleotidsequenz und jedes Nucleinsäuresubstrat identifiziert werden, die/das in einer amplifizierbaren Nucleinsäure verwendet werden soll.
Die Häufigkeit von Entsprechungen von Abstandshalter/funktioneller Nucleotidsequenz/Nucleinsäuresubstrat, die amplifizierbare Nucleinsäuren mit ausgezeichneten Replikationseigen schaften liefern, variiert mit verschiedenen Faktoren, einschließlich den Abstandshaltern, funktionellen Nucleotidsequenzen und Nucleinsäuresubstraten, den Bedingungen, unter denen die Replikation stattfindet, und den erforderlichen Replikationseigenschaften (beispielsweise Kinetik, Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit). Somit ist ein bedeutendes erfindungsgemäßes Merkmal die Konstruktion von Bibliotheken von erfindungsgemäßen amplifizierbaren Nucleinsäuren und Insertionselementen für jede interessierende funktionelle Nucleotidsequenz. Die Bestandteile einer Bibliothek differieren typischerweise nur in bezug auf den/die Abstandshalter ihrer jeweiligen Insertionselemente. Die Konstruktion von Bibliotheken von Insertionselementen und amplifizierbaren Nucleinsäuren erlaubt eine schnelle und bequeme Konstruktion und Identifikation bevorzugter erfindungsgemäßer Insertionselemente und amplifizierbarer Nucleinsäuren.
Im Prinzip ist die Anzahl der Bestandteile, aus denen sich eine Bibliothek aufbaut, nur durch die Zahl der möglichen betrachteten Abstandshalterkombinationen begrenzt. So erlaubt beispielsweise ein einziger Abstandshalter aus zehn Nucleotiden eine Bibliothek von über einer Million Bestandteile. In der Praxis ist jedoch die Anzahl der für eine Bibliothek konstruierten Bestandteile durch eher praktische Überlegungen wie die Zeit, welche für die Konstruktion und das Abtrennen der einzelnen Bestandteile einer Bibliothek benötigt wird, und den Wirkungsgrad der Stufen im Konstruktionsvorgang begrenzt. Darüber hinaus ist die für die Bewertung der Bibliothekszahlen erforderliche Zeit typischerweise derart, daß nur relativ wenige Bibliotheksbestandteile bewertet werden. So werden beispielsweise, obwohl Bibliotheken von über 100000 Bestandteilen leicht herstellbar sind, typischerweise nur etwa 20 bis 50 Bestandteile bewertet. Somit können nützliche Bibliotheken nur etwa 20 bis 50 Bestandteile umfassen. Der Fachmann erkennt, daß zahlreiche Verfahren für die Konstruktion von Insertionselementen, amplifizierbaren Nucleinsäuren und Biblio theken davon zugänglich sind. Zwei solcher Verfahren werden anschließend beschrieben.

Verfahren zur Herstellung von Insertionselementen, amplifizierbaren Nucleinsäuren und Bibliotheken

Die hier beschriebenen Verfahren zeigen die Herstellung amplifizierbarer Nucleinsäuren, die durch Qβ-Replicase auf überlegene Weise repliziert werden. Die Verfahren geben die Verwendung gentechnisch veränderter midivarianter RNA und DNA wieder, die hier als Mlu I #61 bezeichnet wird, und veranschaulichen die Herstellung von Insertionselementen mit zwei Abstandshaltern auf beiden Seiten der funktionellen Nucleotidsequenz. Die Verfahren sind jedoch von allgemeiner Nützlichkeit und können an die Herstellung von Insertionselementen und amplifizierbaren Nucleinsäuren mit einem oder mehreren Abstandshaltern für andere gentechnisch veränderte MDVs und alternative Insertionsstellen angepaßt werden. Die Verfahren sind auch auf andere replizierbare Substrate anwendbar.
Midivariante RNA ist eine gut untersuchte 222-Nucleotid-RNA, die durch Qβ-Replicase schnell und reproduzierbar repliziert wird. Mlu I #61 ist von nativer MDV RNA durch Insertion einer CGU-Sequenz zwischen die Basen 63 und 64 der nativen MDV RNA abgeleitet. Auf dem Niveau der DNA wird durch diese Insertion eine einzige Schnittstelle (ACG CGT, Seq. ID #1) für das Enzym Mlu I beginnend mit Base 61 der RNA eingeführt. Zusätzlich werden die Nucleotide U, U und A an den Basen 117, 136 und 137 substituiert. Fig. 1 zeigt eine Nucleotid-Karte von Mlu I #61. Zur Darstellung aller hier genannten Nucleotidbasen werden herkömmliche Symbole verwendet: A bedeutet Adenin, T Thymin, U Uracil, G Guanin und C Cytosin. Mlu I #61 RNA kann auf verschiedenen Wegen erzeugt werden, wie dem Fachmann bekannt ist. Ein Verfahren wird in den Beispielen beschrieben.
A. Ein Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von amplifizierbaren Nucleinsäuren, einschließlich einer funktionellen Nucleotidsequenz, die von zwei Abstandshaltern flankiert ist, ist in Fig. 2 schematisch gezeigt. In diesem Verfahren wird ein ein Insertionselement umfassendes DNA-Oligonucleotid so synthetisiert, daß es folgende Segmente enthält: (I) eine spezifische, aber willkürliche (Junk-)Sequenz, (2) die Mlu-I- Erkennungsstelle (ACG CGT, Seq. ID #1), (3) einen ersten Abstandshalter aus zufälligen Nucleotiden, (4) eine funktionelle Nucleotidsequenz, (5) einen zweiten Abstandshalter aus zufälligen Nucleotiden, (6) die Nucleotidsequenz AGT CAC GG (Seq. ID #2), welche die Sequenz zwischen der Mlu-I- und der Nhe-I-Stelle der MDV ist, (7) die Nhe-I-Erkennungssequenz (GCT AGC, Seq. ID #3) und (8) eine Primerbindungsstelle, um die Formulierung doppelsträngiger DNA zu erlauben.
Die willkürliche Sequenz (I) wird auch als "Junksequenz" bezeichnet. Die Junksequenz dient mindestens zwei Zwecken. Zunächst dient sie dazu, die Mlu-I-Stelle davon abzuhalten, sich am äußersten Ende der doppelsträngigen DNA zu befinden, welche durch eine Verlängerungsreaktion erzeugt wird, die das einzelsträngige Oligonucleotid in doppelsträngige DNA umwandelt. Dies ist erwünscht, da viele Restriktionsenzyme DNA ineffizient spalten, wenn sich die Schnittstelle am Ende eines doppelsträngigen DNA-Moleküls oder in dessen Nähe befindet. Die Junksequenz erlaubt auch die Bestimmung, daß der Mlu-I-Spaltvorgang stattgefunden hat. Der Spaltvorgang kann nachgewiesen werden, weil die Länge der verlängerten DNA um die Länge der Junksequenz verkürzt ist und das Junksequenzfragment als Reaktionsprodukt erscheint. Die Länge der Junksequenz kann beliebig sein, liegt aber vorzugsweise zwischen 5 und 20 Nucleotiden.
Die Nucleotide, welche die Abstandshalter (3) und (5) aufbauen, werden zufällig ausgewählt. Die Länge der Abstandshalter kann beliebig sein, beträgt aber vorzugsweise 2 bis 25 Nucleotide. Die funktionelle Nucleotidsequenz (4) wird ausgewählt, um die für die amplifizierbare Nucleinsäure erforderliche Bindungsspezifität zu erreichen.
Die Primerbindungsstelle kann eine Nucleotidsequenz sein, für welche ein komplementärer Oligonucleotidprimer erhältlich ist oder synthetisiert werden kann. Primer und Primerbindungsstelle werden jedoch so gewählt, daß der Primer selbst nicht an einen anderen Teil des DNA-Oligonucleotids bindet, das konstruiert wird. Bevorzugte Primerbindungsstellen sind typischerweise etwa 15 bis 30 Nucleotide lang. Diese umfassen Sequenzen, welche die bekannten T7- und SP6-Promotoren enthalten, für welche Primer leicht zugänglich sind.
Typischerweise sind solche Oligonucleotide insgesamt einhundert oder mehr Nucleotide lang. So ist beispielsweise, wenn das Insertionselement eine Junksequenz von 21 Nucleotiden, zwei Abstandshalter von jeweils 10 Nucleotiden, eine funktionelle Nucleotidsequenz von 35 Nucleotiden und eine Primerbindungsstelle von 27 Nucleotiden umfaßt, das Insertionselement 122 Nucleotide lang. Beispiele solcher Insertionselemente sind folgende:
5' GCT CAT CTG AGT CAT CCA AGT ACG CGT NNN NNN NNN NAG GCC TTT ACC CCA CCA ACT AGC TGA TAT CAC ATA NNN NNN NNN NAG TCA CGG GCT AGC CCT ATA GTG AGT CGT ATT AGC AAG CT 3' (Seq. ID #4).
Das Insertionselement enthält zwei Abstandshalter aus jeweils zehn Nucleotiden. Diese werden dargestellt durch die zwei Blöcke von Ns, worin N G, A, T oder C mit gleicher Wahrscheinlichkeit bedeutet. Die beiden Abstandshalter flankieren eine funktionelle Nucleotidsequenz von 35 Nucleotiden, welche unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an die 16S RNA von Chlamydia trachomatis bindet.
5' GCT CAT CTG AGT CAT CCA AGT ACG CGT NNN NNN NNN NCT GCT GCC TCC CGT AGG AGT TTG GGC CGT GTC TCA GTT CCA GTG TNN NNN NNN NNA GTC ACG GGC TAG CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG CAA GCT 3' (Seq. ID #5), worin N G, A, T oder C mit gleicher Wahrscheinlichkeit bedeutet. Das Insertionselement enthält zwei Abstandshalter aus jeweils zehn Nucleotiden und eine funktionelle Nucleotidsequenz von 45 Nucleotiden, welche unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an die 16S RNA der meisten Eubakterien bindet. 5' GCT CAT CTG AGT CAT CCA AGT ACG CGT NNN NNN NNN NTG GTG CCC TTC CGT CAA TTT CTT TAA GTT TCA GCC TTG CGN NNN NNN NNN AGT CAC GGG CTA GCC CTA TAG TGA GTC GTA TTA GCA AGC T 3' (Seq. ID #6), worin N G, A, T oder C mit gleicher Wahrscheinlichkeit bedeutet. Das Insertionselement enthält zwei Abstandshalter aus jeweils zehn Nucleotiden und eine funktionelle Nucleotidsequenz von 40 Nucleotiden, welche unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen an die 18S RNA der meisten Pilze bindet.
Spezifische Insertionselemente können unter Anwendung herkömmlicher Oligonucleotid-Syntheseverfahren und kommerziell erhältlicher Nucleinsäure-Syntheseautomaten hergestellt werden. Eine. Bibliothek solcher Insertionselemente wird für den Einbau in einen Plasmid-DNA-Vektor hergestellt. Die Bibliothek sollte soviele Insertionselemente wie praktikabel enthalten. Die Anzahl der synthetisierten Insertionselemente wird jedoch durch praktische Überlegungen wie den Wirkungsgrad der einzelnen Stufen, welche für die Konstruktion der Insertionselemente und Bibliotheken erforderlich sind, begrenzt. Typischerweise werden Bibliotheken von etwa 100000 Insertionselementen oder amplifizierbaren Nucleinsäuren hergestellt. Selbstverständlich können Insertionselemente auf einer individuellen Basis hergestellt und bewertet werden. Es ist jedoch beabsichtigt, daß die systematische Synthese und Bewertung einzelner Insertionselemente die Synthese und Bewertung einer erfindungsgemäßen Bibliothek ist.
Die Insertionselemente können in replizierbare Nucleinsäuresubstrate eingebaut werden, um amplifizierbare Nucleinsäuren zu bilden, die dann in geeignete Vektoren eingebaut werden, um wie folgt eine Bibliothek zu bilden. Die Vektoren können durch Klonieren von MDV DNA in einem geeigneten Plasmidvektor wie kommerziell erhältlichen pBR322pUC19-Plasmiden hergestellt werden. Weitere geeignete Plasmide sind das kommerziell erhält liche pGEM- und das pBluescript-II-Plasmid. Diese enthalten eine geeignete Promotorsequenz oder können modifiziert werden, diese zu enthalten. Der Promotor dient als Erkennungsstelle für eine Bakteriophagen-RNA-Polymerase, welche die DNA-Sequenzen zu RNA umwandelt. Geeignete RNA-Polymerasen sind diejenigen aus den Bakteriophagen T7, T3 und SP6. Andere geeignete Arten von Vektoren umfassen beispielsweise Cosmide und Phagenvektoren. Virale Vektoren aus Mammalienzellen können verwendet werden, wenn eukariontische Zellen als Wirte eingesetzt werden.
Die Plasmide werden dann weiter modifiziert, um ein Insertionselement zu enthalten. So kann beispielsweise das MDV-DNA-Insert modifiziert werden, um ein Insertionselement in MDV Mlu I #61 in den Plasmiden wie folgt zu enthalten. Die synthetisierten Insertionselemente werden für das Einfügen in das Plasmid doppelsträngig hergestellt. Insbesondere können sie an das entsprechende Primeroligonucleotid gebunden und mit einer DNA- Polymerase wie Klenow, TAQ und anderen verlängert werden, um doppelsträngige DNA-Moleküle zu erzeugen. Die doppelsträngigen Moleküle werden dann mit Mlu-I- und Nhe-I-Enzymen geschnitten, um große DNA-Fragmente zu erzeugen, die zu der funktionellen Nucleotidsequenz klebrige Mlu-I-Enden 5' und Nhe-I-Enden 3' enthalten. Diese großen Fragmente enthalten ein Insertionselement und können auf einem Polyacrylamid-Gel isoliert werden.
Danach werden die Fragmente in Mlu-I-#61-MDV-Plasmid-DNA, die mit Mlu I und Nhe I geschnitten und Gel-gereinigt worden ist, um die resultierenden kleinen Fragmente zu entfernen, ligiert. Die ligierten Plasmide enthalten jetzt eine erfindungsgemäße amplifizierbare Nucleinsäure. Die neu gebildeten Plasmide werden in Wirtszellen wie E. coli transformiert, um eine Bibliothek herzustellen. Die Zellen werden dann auf selektiven LB-Platten ausgebreitet. Jede resultierende Zellkolonie stellt einen Bestandteil der Bibliothek dar.
Typischerweise werden etwa 100000 Kolonien in einer Bibliothek hergestellt. Die verschiedenen Stufen und Materialien, die bei der Konstruktion der Bibliotheken angewendet werden, sind bekannt und dem Fachmann leicht zugänglich.
Obige Strategie ist zur Erzeugung von Insertionselementen und Bibliotheken von erfindungsgemäßen amplifizierbaren Nucleinsäuren angewendet worden. Dieses Prinzip ist jedoch nicht frei von bestimmten Nachteilen. So werden beispielsweise in der Prozedur relativ lange synthetische Oligonucleotide eingesetzt, die im allgemeinen teuer und zeitaufwendig und oftmals mit schlechten Gesamtausbeuten herzustellen sind. Wenn lange funktionelle Nucleotidsequenzen und/oder Abstandshalter für die Bewertung erforderlich sind, kann es schwierig werden, die entsprechend langen Insertionselemente in für praktische Zwecke ausreichender Menge zu synthetisieren. Deshalb ist das Prinzip eher für eine Anwendung mit kürzeren Insertionselementen und kürzeren oder wenigen Abstandshaltern anwendbar. Dabei ist jedoch festzustellen, daß ergänzende Prinzipien zur Begrenzung der Nachteile, die aus der Oligonucleotid-Gesamtgröße resultieren, entwickelt werden können. So können beispielsweise durch die Synthese kleinerer Oligomerteile, die dann ligiert werden, um ein größeres vollständiges Oligonucleotid zu bilden, Einsparungen erhalten werden.
Die Strategie umfaßt auch zahlreiche zusätzliche Stufen bei der Konstruktion von Bibliotheken und den entsprechenden zusätzlichen Zeitaufwand. Schließlich ist darauf zu achten, daß die funktionelle Nucleotidsequenz keine Restriktionsstelle für die Enzyme Mlu I und Nhe I oder derartige andere Enzyme, die bei der Konstruktion der Bibliothek verwendet werden, enthält.
B. Ein zweites Verfahren zur Herstellung einer Bibliothek von amplifizierbaren Nucleinsäuren ist schematisch in Fig. 3 dargestellt. Durch dieses Verfahren wird eine Vektorbibliothek gebildet, welche die MDV DNA, eine Gebrauchssequenz und zufällige Abstandshalter umfaßt. Die Gebrauchssequenzen werden anschließend durch die funktionelle Nucleotidsequenz ersetzt. Obwohl das Verfahren die Herstellung von Mlu I #61 MDV und zwei flankierenden Abstandshaltern veranschaulicht, ist es leicht an eine Anwendung mit anderen Substraten und anderen Abstandshalterkombinationen anzupassen.
In diesem Verfahren wird ein DNA-Oligonucleotid so konstruiert, daß es (1) eine Junksequenz, (2) die Mlu-I-Erkennungsstelle, (3) einen ersten Abstandshalter aus zufälligen Nucleotiden, (4) eine Gebrauchssequenz von Nucleotiden, (5) einen zweiten Abstandshalter, (6) die Nucleotidsequenz AGT CAC GG (Seq. ID #2) wie zuvor, (7) die Nhe-I-Erkennungssequenz und (8) eine Primerbindungsstelle enthält.
Die Gebrauchssequenz ist entworfen, damit sie Schnittstellen enthält, die einen Spaltvorgang so nah wie möglich an den Abstandshaltern erlauben. So können beispielsweise zwei Bsm-I- Stellen bei den Enden der Sequenz enthalten sein. Zusätzlich kann die Gebrauchssequenz eine Stelle wie eine Eco-RV-Stelle enthalten, um die Verringerung von Hintergrundrekombinanten zu erlauben, die sonst aus der Selbstligation der Vektor-DNA entstünden. Eine Bibliothek von solchen Oligonucleotiden kann wie zuvor unter Anwendung herkömmlicher Verfahren und kommerziell erhältlicher Nucleinsäure-Syntheseautomaten hergestellt werden.
Die Bibliothek von Oligonucleotiden wird wie im ersten Verfahren verarbeitet, so daß doppelsträngige DNAs hergestellt und anschließend mit geeigneten Restriktionsenzymen, beispielsweise Mlu I und Nhe I, geschnitten werden. Die resultierenden Fragmente werden danach in Mlu-I-#61-Plasmid-DNA ligiert. Die Plasmide werden dann in einen geeigneten Wirt, beispielsweise E. coli, transformiert, wobei sich eine Basisplasmidbibliothek bildet, welche die MDV DNA, die Gebrauchssequenz und flankierende Abstandshalter umfaßt.
Danach wird eine funktionelle Nucleotidsequenz in doppelsträngiger Form für die Insertion in jedes Element der Basisbibliothek konstruiert. Dies kann beispielsweise durch Verbinden zweier komplementärer synthetischer DNA-Oligonucleotide mit geeigneten Enden erfolgen. Wenn Mu-I-#61-Plasmide wie beschrieben verwendet werden, werden die Plasmide dann mit geeigneten Enzymen wie Bsm und Eco RV geschnitten und anschließend Gelgereinigt, um die resultierenden kleinen Fragmente zu entfernen. Die doppelsträngigen Konstrukte aus den funktionellen Nucleotidsequenzen werden danach in den Plasmiden ligiert, wobei sich darin eine amplifizierbare Nucleinsäure bildet. Die neu gebildeten Plasmide werden dann in geeignete Wirte, beispielsweise E. coli, transformiert, die dann wie in Verfahren A auf einer Platte ausgebreitet und gezüchtet werden.
Das Verfahren B erlaubt eine schnellere Herstellung von Bibliotheken als Verfahren A, da die Basisbibliothek unabhängig von der funktionellen Nucleotidsequenz hergestellt werden kann. Deshalb ist das Verfahren auch für die Verwendung längerer funktioneller Nucleotidsequenzen geeignet. Darüber hinaus kann die funktionelle Nucleotidsequenz leicht kloniert und können die Bibliotheken ohne Rücksicht auf irgendwelche Schnittstellen, die in der funktionellen Nucleotidsequenz enthalten sein können, konstruiert werden.
Wie bei dem zuvor beschriebenen Verfahren A sollte die Basisbibliothek soviele Bestandteile wie praktikabel enthalten. Die Anzahl der bewerteten Bibliotheksbestandteile wird jedoch immer durch den Zeitraum begrenzt sein, der für Konstruktion und Bewertung der resultierenden amplifizierbaren Nucleinsäuren erforderlich ist.
Dieses Verfahren hat auch einige potentielle Nachteile. Beispielsweise werden die Bibliotheken so hergestellt, daß die Abstandshalter von der funktionellen Nucleotidsequenz um einige Nucleotide getrennt sein können. Wenn die Gebrauchssequenz die zwei weiter oben vorgeschlagenen Bsm-I-Stellen enthält, ist ein Abstandshalter an der 5'-Stelle der funktionellen Nucleotidsequenz von der funktionellen Nucleotidsequenz durch AG getrennt. Auf ähnliche Weise ist ein Abstandshalter an der 3'-Stelle von der funktionellen Nucleotidsequenz durch CA getrennt. Desweiteren werden die obengenannten Einsparungen etwas geringer, wenn unterschiedlich lange Abstandshalter zu bewerten sind. Dann müssen verschiedene Basisbibliotheken hergestellt und in die Bewertung einbezogen werden, wodurch die Arbeit für die Bewertung größer wird.

Bewertung von Bibliotheksbestandteilen

Danach werden die Bibliotheken von amplifizierbaren Nucleinsäuren bewertet, um diejenigen mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften zu identifizieren. Die Bibliotheken können bewertet werden, indem für bestimmte ausgewählte Eigenschaften wie Replikationsempfindlichkeit, Kinetik und Reproduzierbarkeit geeignete Bedingungen angewendet werden. Die Bibliotheken können auch für all diese Eigenschaften kollektiv bewertet werden. Die Bewertung kann einfach auf die interessierenden Eigenschaften zugeschnitten und vom Fachmann leicht durchgeführt werden.
Bibliotheken von amplifizierbaren Nucleinsäuren, die durch obige Verfahren A und B hergestellt worden sind, können auf vielen Wegen bewertet werden. Typischerweise werden einzelne Bibliotheksbestandteile wie folgt bewertet. Eine DNA-Probe von einer Zellkolonie des zu testenden Bibliotheksbestandteils wird durch ein geeignetes Restriktionsenzym geschnitten. Wenn der Probenbestandteil ein Mlu-I-#61-Plasmid wie weiter oben beschrieben enthält, ist das Restriktionsenzym Sma I. Zum Transkribieren des DNA-Konstrukts aus der amplifizierbaren Nucleinsäure zu RNA wird T7-RNA-Polymerase verwendet. Anschließend wird die RNA markiert, beispielsweise mit ³²Pmarkiertem Uridintriphosphat (UTP), um die Quantifizierung der erzeugten RNA zu erlauben. Die Menge an erzeugter RNA kann durch Messung der Menge an ³²P-UTP bestimmt werden, die in die RNA eingebaut ist. Danach wird das RNA-Transkript mit dem geeigneten Enzym, beispielsweise Qβ-Replicase, unter den Bedingungen repliziert, die bei der beabsichtigten Verwendung des Transkripts anzuwenden sind. Diejenigen Transkripte, welche mit akzeptablen Eigenschaften replizieren, werden identifiziert.
So können beispielsweise die Transkripte mit Qβ-Replicase in Anwesenheit des interkalierenden Farbstoffs Propidiumiodid repliziert und kann der Zeitraum, welcher zur Erzeugung einer positiven Fluoreszenzreaktion erforderlich ist, gemessen werden. Insbesondere können Replikationsreaktionen durch serielle Verdünnungen von Molekülen eines zu bewertenden Transkripts initiiert werden. Die Transkripte werden dann auf Replikationsempfindlichkeit und den Zeitraum zur Erzeugung eines detektierbaren Signals bewertet.
Solche Replikationsversuche sollten bei etwa 37ºC ± 0,25ºC stattfinden. Die Proben können mit 510 nm angeregt und bei 610 nm etwa alle 40 Sekunden über einen Zeitraum von 45 Minuten abgelesen werden. Die abgestrahlte Fluoreszenz kann dann numerisch für die Reaktionszeit analysiert werden.
Die Reaktionszeit kann als Schnittpunkt der Fluoreszenzreaktion mit der Grundlinie, die vor der Reaktion erzeugt worden ist, genommen werden. Der Schnittpunkt kann unter Benutzung von Polynomen dritten Grades, um der Fluoreszenzreaktion zu entsprechen, genauer bestimmt werden. Eine so bestimmte Reaktionszeit ist eine quantifizierbare Bestimmung der Anwesenheit von Probentranskript, da sie umgekehrt proportional zum Logarithmus der Anzahl der in der Probe vorhandenen Transkriptmoleküle ist; Cahill et al., Clin. Chem. 37, 1482- 1488, 1991. Nach Identifizierung eines RNA-Transkripts mit erwünschten Replikationseigenschaften können große Mengen an Template-DNA aus der Originalkultur hergestellt werden.
Der Fachmann erkennt auch, daß solche Bewertungen zuvor mit Pools aus mehr als einem Bibliotheksbestandteil durchgeführt werden können. So können beispielsweise Pools, die hunderte oder tausende Bibliotheksbestandteile umfassen, wie zuvor beschrieben verarbeitet werden. Im Falle, daß ein Pool gefunden wird, der eine oder mehrere nützliche erfindungsgemäße amplifizierbare Nucleinsäuren enthält, kann der Pool in immer kleinere Pools unterteilt werden, um die außergewöhnlichsten amplifizierbaren Nucleinsäuren im Originalpool von Bibliotheksbestandteilen zu identifizieren. Dieses Verfahren ist dann besonders vorteilhaft, wenn eine große Anzahl von Bibliotheksbestandteilen zu testen ist und die überlegensten amplifizierbaren Nucleinsäuren erwünscht sind.
Für eine Verwendung in einem Diagnostikassay sollten erfindungsgemäße amplifizierbare Nucleinsäuren ausgezeichnete Replikationseigenschaften bieten, einschließlich (I) Empfindlichkeit, d. h. es ist wünschenswert, daß ein einziges Molekül in der Lage ist, eine detektierbare Replikationsreaktion zu initiieren, (2) Reproduzierbarkeit, d. h. die Replikation sollte auf eine wohldefinierte und konsistente Weise vonstatten gehen, unabhängig von der Anzahl der Moleküle, die zur Initiierung der Replikationsreaktion verwendet werden, (3) Schnelligkeit, d. h. die Detektion sollte in etwa 30 min ermöglicht werden, unabhängig von der Anzahl der Moleküle, die zur Initiierung der Replikationsreaktion verwendet werden, (4) Linearität, d. h. die Reaktionszeiten sollten relativ zum Logarithmus der Anzahl der Moleküle, die zur Initiierung der Replikationsreaktion verwendet werden, linear sein, und (5) Beibehaltung all dieser Eigenschaften bei Bindung an ein Assaytarget. Die hier beschriebenen Verfahren wurden zur Herstellung zahlreicher Bibliotheken und zur Identifizierung vieler erfindungsgemäßer amplifizierbarer Nucleinsäuren mit ausgezeichneten Replikationseigenschaften für verschiedene funktionelle Nucleotidsequenzen angewendet.

Beispiele

Beispiel 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung, Identifizierung und Replikationseigenschaften nützlicher erfindungsge mäßer Insertionselemente und amplifizierbarer Nucleinsäuren und einer erfindungsgemäßen Bibliothek. Die amplifizierbaren Nucleinsäuren und die Bibliothek wurden unter Anwendung des weiter oben beschriebenen Verfahrens A hergestellt.
Als Restriktionsenzyme wurden das Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I und T4-DNA-Ligase, vertrieben von New England BioLabs, verwendet. RNA-Moleküle wurden in vitro unter Verwendung des Riboprobe-Gemini-II-Transkriptionssystems, vertrieben von Promega Corp., transkribiert. Die Ribonucleosid- 5'-triphosphate wurden geliefert von Pharmacia, Desoxyribonucleotid-5'-triphosphate wurden erhalten von Boehringer Mannheim und ³²P-UTP wurde vertrieben von DuPont NEN. Propidiumiodid und Ampicillin wurden vertrieben von Sigma Chemical. Für alle Transformationen wurden kompetente E.-coli-DH5α-Zellen gekauft von Gibco BRL und verwendet. Die Oligonucleotide wurden in einem Syntheseautomaten von Advanced Biosystems, Inc., hergestellt und vor Verwendung auf denaturierenden Polyacrylamidgelen gereinigt. Rekombinante Qβ-Replicase wurde aus einem Lambda-pL-Promotor unter Verwendung des Expressionsvektors pPL- Lambda in E.-coli-N99cI+-Zellen (beide von Pharmacia) exprimiert.

Konstruktion der Bibliothek

Amplifizierbare Nucleinsäuren und Konstruktionen einer Bibliothek wurden unter Verwendung von MDV cDNA hergestellt, die wie folgt erzeugt wurde. Es wurden zwei synthetische Oligonucleotide, die den Plus- und den Minus-Strang der MDV darstellten, hergestellt, wie von Mills et al. in Science 180, 916-927 (1973) beschrieben. Die Stränge wurden so hergestellt, daß sie sich teilweise wie folgt überlappen. Das Plus-Strang- Oligonucleotid enthielt Sequenzen (von 5' bis 3') für eine Hind-III-Stelle, einen T7-Promotor und Nucleotide 1 bis 113 des Plus-Strangs der MDV. Das Minus-Strang-Oligonucleotid enthielt Sequenzen vom 5'-Ende für eine Eco-RI-Stelle, Sma-I-Stelle und die Sequenz, die zu den Nucleotiden 102 bis 222 des Plus- Strangs der MDV komplementär ist. Die Oligonucleotide wurden verbunden, mit dem Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I verlängert, mit Hind III und Eco RI geschnitten und in pUC19- Plasmid-DNA kloniert. Die erhaltene MDV cDNA substituierte U für C an den Basen 117 und 136 und A für G an Base 137 des Plus-Strangs der MDV. Danach wurden die Nucleotide von den Basen 9 bis 71 durch gebundene synthetische Oligonucleotide ersetzt, um die Nucleotide CGT nach Nucleotid 63 einzuführen, wodurch eine einzigartige Mlu-I-Stelle (ACG CGT, Seq. ID #1) erzeugt wurde. Diese DNA wurde mit Mlu I und Nhe I geschnitten und als Vektor in den nachfolgend beschriebenen Kloniervorgängen verwendet.
Die Bibliothek wurde wie folgt konstruiert. Insertionselemente wurden synthetisiert mit den folgenden Grundmerkmalen 5' ACG CGT (N)10-[FNS]-(N)&sub1;&sub0;AGT CAC GGG CTA GC-[Primer-Stelle]3', worin N eines der vier Desoxyribonucleotide ist, die zufällig bei der Synthese ausgewählt sind. Die funktionelle Nucleotidsequenz (FNS) war AGG CCT TTA CCC CAC CAA CTA GCT GAT ATC ACA TA (Seq. ID #7). Diese Nucleotidsequenz bindet an die 16S rmA von Chlamydia trachomatis. Die Primer-Stelle war CCC TAT AGT GAG TCG TAT TAG CAA GCT (Seq. ID #8). Die ersten zwanzig Nucleotide dieser Sequenz sind komplementär zum T7- Promotor-Primer, der zur Bildung der doppelsträngigen DNA verwendet wurde. Danach wurde ein Primer für den T7-Promotor- Primer an die Primer-Stelle gebunden und bei 37ºC in 9 mM Tris, pH 7,5, 90 mM NaCl, 15 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 500 uM Nucleosidtriphosphaten (dGTP, dATP, dTTP, dCTP) und 0,1 U/ul Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I verlängert.
Anschließend wurde das doppelsträngige DNA-Produkt mit Mlu I und Nhe I geschnitten, Gel-gereinigt und in den weiter oben beschriebenen MDV cDNA-Vektor ligiert. Schließlich wurde 1/10 (etwa 2M1) des ligierten Materials in DH5α-E.-coli-Zellen transformiert. Die Zellen wurden für das Screening mit 100 ug/ml Ampicillin auf LB-Platten ausgebreitet.

Replikationsassays

Es wurde ein Screening mit sechsunddreißig einzelnen Bestandteilen der Bibliothek durchgeführt. 10 ml Bakterienkultur wurden in LB-Medien und 100 ug/ml Ampicillin über Nacht gezüchtet. Aus 1,5 ml Kultur wurde Plasmid-DNA isoliert, mit Sma I geschnitten und unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase in Gegenwart einer Spurenmenge von ³²P-UTP zu RNA transkribiert. Die RNA-Transkripte wurden durch Messung des Prozentanteils an Einbau des ³²P-UTP, gemessen durch Retention der Radioaktivität auf DE81-Ionenaustauscherfiltern (Whatman) unter Anwendung von Wäschen mit 0,5 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 7,5, quantifiziert.
Die RNA-Moleküle wurden auf Größe und Integrität durch Elektrophorese mit denaturierendem Polyacrylamidgel untersucht. Danach wurden die RNA-Substrate verdünnt und mit Qβ-Replicase, die frei von endogener MDV RNA gereinigt worden war, zum Duplikat repliziert, wie im US-Patent Nr. 5 141 857, das hiermit als Bezugnahme aufgenommen wird, beschrieben.
Diese RNAs wiesen eine gute Replikationsempfindlichkeit auf; ferner wurde ihre Kinetik durch Herstellung von DNA mit einer CsCl-Bande aus 500 ml Bakterienkultur, Transkribieren mit T7- RNA-Polymerase, wie zuvor beschrieben, und Durchführung weiterer Amplifiaktionsreaktionen mit Qβ-Replicase gemessen.
Die DNA-Sequenz der einzelnen Abstandshalter wurde unter Verwendung des Seguenase Version 1.0 kit (United States Biochemical) und des T7-Promotorprimers, welcher zu der T7- Promotorsequenz hybridisiert, bestimmt.
Die wie beschrieben erhaltenen RNA-Substrate wurden in 50 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA und 0,5% NP40 auf Konzentrationen von 1 · 10n pro 50 ul verdünnt, worin das Superskript n von 0 bis 10 variierte. 50 ul-Proben dieser Verdünnungen wurden zu 50 ul eiskaltem 220 mM Tris, pH 7,8, 34 mM MgCl&sub2;, 0,8 mM GTP, ATP, CTP und UTP, 2,0 ug Propidiumiodid und 25% Glycerin, das etwa 110 ug/ml Qβ-Replicase enthielt, zugegeben.
Die Replikationsreaktionen wurden initiiert, indem diese Materialien vermischt wurden und die Temperatur des Reaktionsgemischs auf 37ºC ± 0,25ºC gebracht wurde, wo sie für die Dauer der Replikation gehalten wurde. Die Materialien wurden innerhalb von etwa 40 Sekunden auf 37ºC gebracht. Die Fluoreszenz der Reaktionsgemische wurde 45 Minuten lang alle 40 Sekunden durch Anregen (510 nm) und Messen (610 nm) gemessen. Zur Bestimmung der Reaktionszeit wurde die abgestrahlte Fluoreszenz numerisch analysiert. Die Reaktionszeit wurde als Schnittpunkt der Fluoreszenzreaktion mit der Grundlinie, die vor der Reaktion erzeugt worden war, genommen. Es wurden Polynome dritten Grades benutzt, um der Fluoreszenzreaktion zu entsprechen und den Schnittpunkt zu bestimmen. Das verwendete Fluoreszenzmeßgerät ist in der Lage, von etwa 51011 Molekülen hervorgerufene Fluoreszenz nachzuweisen. Die Replikationsempfindlichkeit oder Nachweisgrenze wird als kleinste Anzahl Substratmoleküle bestimmt, die zur Erzeugung einer Reaktionszeit ausreicht.
Diese Assays erlauben auch die Ermittlung kinetischer Informationen wie der Zeit für die Replikation jedes Substrats. Die Reaktionszeit ist eine Funktion der Anzahl der Substratmoleküle, die für den Start der Replikation eingesetzt werden, und der Zeit, welche die Qβ-Replicase zur Synthese eines komplementären Strangs benötigt. Die zur Synthese eines komplementären Strangs erforderliche Zeit wird Verdopplungszeit genannt und kann angenähert werden durch die Formel
DT = (RT - 0,7) (log2)/log(5 · 10¹¹/N),
worin DT die Verdopplungszeit,
RT die Reaktionszeit in Minuten und
N die Anzahl der Substratmoleküle zu Reaktionsbeginn bedeutet und
5 · 10¹¹ etwa die Anzahl der bei der Detektion vorhandenen Substratmoleküle ist.
Von der Reaktionszeit werden etwa 40 Sekunden oder 0,7 Minuten abgezogen, um die Zeit zu berücksichtigen, in welcher das Reaktionsgemisch auf 37ºC gebracht wird. Der Fachmann sieht auch, daß Verdopplungszeiten auf Reaktionsbedingungen empfindlich sind und nur für gleiche Reaktionsbedingungen richtig verglichen werden können.

Ergebnisse

Es wurde festgestellt, daß Abstandshalter einen ausgeprägten Effekt auf die Replikationseigenschaften von hier hergestellten RNA-Substraten haben. Dies geht aus den nachfolgenden Tabellen 1 und 2 hervor. In Tabelle 1 sind die Abstandshalter aufgeführt, die in sechs der Substrate eingebaut wurden. Tabelle 1 Abstandshalter für 6 RNA-amplifizierbare Nucleinsäuren
Tabelle 2 gibt Informationen über Empfindlichkeit und Kinetik der Replikation der sechs RNA-Substrate. Tabelle 2 Replikationseigenschaften von 6 RNA-amplifizierbaren Nucleinsäuren
Tabelle 2 veranschaulicht, daß Abstandshalter einen ausgeprägten Effekt auf Empfindlichkeit und Kinetik der Replikation erfindungsgemäßer amplifizierbarer Nucleinsäuren haben können. Wie die Tabelle zeigt, erlaubten jedoch die RNA-Substrate C7, C4 und C22 die nachweisbare Replikation eines Substratmoleküls. Demgegenüber erlaubte das RNA-Substrat C8 die nachweisbare Replikation erst bei 10000 Molekülen oder bei einer Differenz von vier Größenordnungen in der Empfindlichkeit. Tabelle 2 zeigt auch, daß die Verdopplungszeit von C22 etwa 21 Sekunden oder etwa ein Drittel der 61 Sekunden Verdopplungszeit von C8 betrug.
Die RNA-Substrate C7, C4 und C22 wiesen eine ausgezeichnete Replikationsempfindlichkeit auf. Das RNA-Substrat C22 wies auch eine ausgezeichnete Replikationskinetik auf und kann direkt als replizierbare Detektorsonde mit Propidiumiodid in Sandwichhybridisierungsassays für Chlamydia trachomatis verwendet werden.

Beispiel 2

Das Beispiel veranschaulicht die Detektion von Chlamydia trachomatis unter Verwendung einer erfindungsgemäßen amplifizierbaren Nucleinsäure in zwei Assayformaten. Die Assayformate werden als Dual Capture und als Reversible Target Capture (RTC) Assays bezeichnet. Im Dual Capture Assay werden zwei Fangsonden verwendet. Diese waren die B-3018- und die dA-781-Fangsonde. Im RTC-Assay wurde nur die dA-781-Fangsonde verwendet. In beiden Assays wurde die amplifizierbare Nucleinsäure C29 als Detektorsonde verwendet.

Materialien

Zur Verwendung in diesem Beispiel wurden mit Oligo-dT14 derivatisierte paramagnetische Teilchen wie folgt hergestellt. Eisen(III)-oxid-Teilchen von unter einem Mikrometer (Advanced Magnetics, Inc., Cambridge, MA) wurden unter Anwendung der von Morrissey, Anal. Biochem., 181, 345-349 (1989) beschriebenen Methode mit dT14-Oligomeren derivatisiert. Die Kügelchen wurden 4 Stunden lang bei 65ºC im Bead Blocking Buffer [100 mM Tris, 4,9% BSA (Rinder-Serumalbumin, Sigma Fraction 5), 0,5% Sarkosyl (Sigma), 10 mM EDTA, 0,05% Bronopol (Inolex, Philadelphia, PA), 0,01% antifoam (Dow-Corning FG-10], pH 7,9 inaktiviert. Die fertige Teilchensuspension war 0,25% (Gew./Vol.) Feststoff mit einem Bindungsvermögen von 300 umol (Desoxyadenylat) dA50 pro mg. Unmittelbar vor der Verwendung wurden die Teilchen vom Puffer abgetrennt und zu 0,045% in frischem Bead Blocking Buffer und Bead Blocking Buffer plus 4M Guanidinhydrochlorid (GuHCl) aufgefüllt.
Von Promega (Madison, WI) wurden mit Streptavidin derivatisierte paramagnetische Teilchen erhalten. Gereinigte 16S rmA von Chlamydia trachomatis wurde in diesem Beispiel als Target verwendet. Die 16S rmA wurde unter Anwendung herkömmlicher Verfahren gereinigt.
In die in diesem Beispiel verwendeten Sonden wurden bestimmte Nucleinsäuresequenzen eingebaut. Diese waren:
Die Nucleinsäuresequenzen 3018 und 781 wurden unter Anwendung herkömmlicher Betacyanoethylphosphoramidit-Chemie und herkömmlicher Nucleinsäure-Syntheseausrüstung wie dem 380-B Synthesizer von Applied Biosystems, Foster City, CA, hergestellt. Die Sequenzen wurden für eine Verwendung als Fang- und Detektorsonden wie folgt modifiziert.
Die Sequenz 3018 (Sequenz ID #21) wurde biotinyliert, indem zunächst das 5'-Ende der Sequenz 3018 (Sequenz ID #21), um ein primäres Amin zu enthalten, modifiziert wurde, wobei sich die Sonde B-3018 bildete. Dies wurde erreicht durch Zugabe eines Aminopropyl-modifizierten Cytidinphosphoramidits.
Die Schutzgruppen der Phosphate und Nucleotidbasen wurden durch Standardmethoden entfernt. Die rohen Oligonucleotid-Gemische wurden durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Das Amino-modifizierte Oligonucleotid wurde unter Verwendung des Fluo Reporter Biotin Labeling Kit, F-2610 von Molecular Probes, Inc., mit Biotin markiert.
Die Sequenz 781 (Sequenz ID # 22) wurde mit etwa 150 Desoxyadenylatresten am 3'-Ende jeder Sequenz abgeschlossen, wobei sich die Sonde dA-781 bildet. Dies wurde durch Inkubation mit terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase (Life Sciences, Inc.) erreicht, der Methode von Nelson et al., Methods in Enzymology, 68, 41-47 (1979) folgend.
Die RNA C29 (Sequenz ID #23) wurde ohne weitere Modifizierung in allen Assays als Detektorsonde verwendet. C29 (Sequenz ID #23) ist eine erfindungsgemäße amplifizierbare Nucleinsäure. Sie umfaßt das RNA-Transkript derselben funktionellen Nucleotidsequenz, die in den amplifizierbaren RNAs von Beispiel 1 enthalten ist. Die funktionelle Nucleotidsequenz wird flankiert von zwei Abstandshaltern. Der 5'- und der 3'-Abstandshalter ist CGUCGAGUUG (Seq. ID #24) bzw. CUGAAUCUUU (Seq. ID #25). Sie sind in der Sequenz für C29 weiter oben unterstrichen. Es wurde festgestellt, daß C29 bei Anwendung des weiter oben beschriebenen Verfahrens A eine ausgezeichnete amplifizierbare Nucleinsäure ist.
Die hier verwendete C29 (Seq. ID #23) wurde aus einer zur C29 RNA komplentären DNA-Sequenz hergestellt. Die DNA wurde durch herkömmliche Verfahren hergestellt und in einem T7-Transkriptionsvektor kloniert. C29 wurde von der klonierten DNA unter Verwendung eines T7 RNA Polymerase kit von Promega transkribiert.
Die Assays wurden wie folgt durchgeführt. Es wurden zwei Lösungen hergestellt. Lösung 1 wurde so hergestellt, daß sie 700 Mikroliter von 1,4 · 10&sup6; gereinigten Chlamydia-Targetmolekülen, 70 ng B-3018-Fangsonde, 1,4 · 10¹² Moleküle der C29- Detektorsonde in 4 M Guanidinhydrochlorid (GuHCl), 125 mM Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA enthielt.
Lösung 2 wurde so hergestellt, daß sie 700 Mikroliter von 1,4 · 10&sup6; gereinigten Chlamydia-Targetmolekülen, 70 ng dA-781 Fangsonde, 1,4 · 10¹² Moleküle der C29-Detektorsonde in 4 M GuHCl, 125 mlvi Tris pH 7,8 und 16 mM EDTA enthielt.
Es wurden vierundzwanzig Vertiefungen eines 8(A-H) · 12(1- 12)96-Vertiefungen-Gestells für 1, 5-ml-Polypropylenröhrchen (Micronics, Flow Laboratories, Molean, VA) verwendet. Zu vier- undzwanzig der Röhrchen wurden Fünfzig-Mikroliter-Aliquote der Lösungen 1 und 2 wie folgt zugegeben.
50 ul (10&sup5; Targetmoleküle plus Sonden) Lösung 1 wurden zu den Röhrchen A-B 1-6 zugegeben.
50 ul (10&sup5; Targetmoleküle plus Sonden) Lösung 2 wurden zu den Röhrchen A-B 7-12 zugegeben.
Der Inhalt des Gestells kann schematisch wie folgt dargestellt werden:
Gestell-Ansatz:
A ←105 Target + B-3018 + C29→ ←105 Target + dA-781 + C29→ B ←105 Target + B-3018 + C29→ ← 4-105 Target + dA-781 + C29→
Sämtliche Röhrchen wurden 30 min lang bei 37ºC bebrütet, um dem Chlamydia-Target zu ermöglichen, Fang- und Detektorsonde zu hybridisieren. Nach der Inkubation wurde jeweils eine 350 ul Suspension von 0,023% Streptavidin-derivatisierten Teilchen in Bead Blocking Buffer [4% BSA (Rinder-Serumalbumin, Sigma Fraktion 5), 0,5% Sarkosyl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,01% antifoam], pH 8,0 zu den Röhrchen A-B 1-6 zugegeben. Eine 100 ul Suspension von 0,045% dT&sub1;&sub4;-derivatisierten Teilchen in Bead Blocking Buffer, der 4 M GuHCl enthielt, wurde jeweils zu den Röhrchen A-B 7-12 zugegeben. Nach Vermischen auf einem Tischverwirbler wurden die Röhrchen 5 min lange bei 37ºC bebrütet, um die ternären Fangsonde: Target : Detektorsonde-Kom plexe einzufangen. Die Teilchen und die eingefangenen ternären Komplexe wurden an den Seiten der Röhrchen unter Verwendung einer magnetischen Trennvorrichtung wie im US-Patent Nr. 4 988 618 von Li et al. beschrieben, das hiermit als Bezugnahme aufgenommen wird, gesammelt. Die Überstände wurden abgesaugt.
Danach wurden die Teilchen gewaschen, um nicht am Target gebundene Detektorsonde zu entfernen. Jedem Röhrchen wurden zweihundert Mikroliter Waschpuffer [300 mM NaCl, 0,5% Sarkosyl], 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,1% antifoam], pH 8,1 zugegeben. Die Röhrchen wurden 2 min lang bei 37ºC gemischt und bebrütet. Die Teilchen und eingefangenen ternären Komplexe wurden an den Seiten der Röhrchen wie weiter oben beschrieben gesammelt. Die Überstände wurden abgesaugt. Die Teilchen wurden noch zwei Mal auf dieselbe Weise gewaschen.
Danach wurden jeweils 160 ul Guanidinthiocyanat(GuSCN)-Puffer [2,5 M GuSCN, 100 mlvi Tris, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,5% BSA], pH 7, 8 zu den Röhrchen gegeben. Nach dem Vermischen wurden die Röhrchen 5 min lang bei 37ºC bebrütet. Das führte zur Freisetzung des Target : Detektorsonde-Segments des ternären Komplexes in den Röhrchen A-B 1-6 und zur Freisetzung des ternären Komplexes Fangsonde : Target : Detektorsonde in den Röhrchen A-B 7-12. Die B-3018-Fangsonde bleibt an die Streptavidinteilchen in den Röhrchen A-B 1-6- gebunden. Nach 5 min wurden die Teilchen an den Seiten der Röhrchen unter Verwendung einer magnetischen Trennvorrichtung wie weiter oben beschrieben gesammelt. Die Überstände wurden in reine Röhrchen überführt.
Danach wurden 40 ul von 500 ng/ml dA-781-Fangsonde in 10 mM Tris, 1 mM EDTA zu den Überständen der Röhrchen A-B 1-6 gegeben. Zu jedem Oberstand der Röhrchen A-B 7-12 wurden vierzig Mikroliter 10 mM Tris und 1 mM EDTA gegeben. Die Röhrchen wurden 30 min lang bei 37ºC bebrütet, um der dA-781-Fangsonde zu erlauben, das Target : Detektorsonde-Segment in den Röhrchen A-B 1-6 zu hybridisieren. Zu allen Röhrchen wurden dreihundert Mikroliter 0,05% dT&sub1;&sub4;-Teilchen in Bead Blocking Buffer gegeben. Die ternären Komplexe wurden an den dT&sub1;&sub4;-Teilchen eingefangen. Die Teilchen wurden an den Seiten der Röhrchen wie weiter oben beschrieben gesammelt und die Überstände abgesaugt. Anschließend wurden die Teilchen mit Wash Buffer wie weiter oben beschrieben gewaschen, um nicht an das Target gebundene Detektorsonde zu entfernen. Der Überstand wurde abgesaugt.
Danach wurden die ternären Komplexe durch Zugabe von 100 ul Release Buffer [25 mM NaCl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,2% Sarkosyl, 0,05% Bronopol und 0,05% BSA], pH 8,1 wie weiter oben beschrieben von den Teilchen freigesetzt. Die Überstände mit freigesetzten ternären Komplexen wurden in reine Röhrchen überführt.
Danach wurden jeweils 200 ul einer Suspension aus 0,045% Oligo-dT&sub1;4-Teilchen in Puffer A [4% BSA, 4 M GuHCl, 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl und 0,1% antifoam], pH 7,8 zu den freigesetzten Überständen gegeben. Die ternären Komplexe wurden an den Teilchen wie weiter oben beschrieben eingefangen. Die Teilchen wurden an den Seiten der Röhrchen wie weiter oben beschrieben gesammelt und die Überstände abgesaugt.
Anschließend wurden die Teilchen zwei Mal in pre-Amp Wash Buffer [300 mM KCl, 50 mM Tris, 1 mM EDTA], pH 8, 0 gewaschen. Die Überstände wurden abgesaugt. Danach wurden jeweils 150 ul Pre-Amp Release Buffer [50 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40] zu den Röhrchen gegeben. Nach dem Vermischen wurden die Röhrchen bei 37ºC bebrütet. Das führte zur Freisetzung der ternären Komplexe. Die Teilchen wurden von den Überständen wie weiter oben beschrieben abgetrennt.
Das Vorhandensein eines Targets wurde durch Replikation der C29-Detektorsonde mit Qβ-Replicase in Anwesenheit des interkalierenden Farbstoffs Propidiumiodid und Messung der zur Erzeugung einer positiven Reaktion erforderlichen Zeit ermittelt. Insbesondere wurden 100 ul des Überstands von jedem Röhrchen zu 100 ul Gemisch aus 220 mM Tris pH 7,8, 40 mM MgCl&sub2;, 1,2 mM jedes der Nucleotidtriphosphate ATP, CTP, GTP und UTP (Pharmacia), 2 ug/ml Propidiumiodid, 25% Glycerin und 110 ug/ml gereinigter Qβ-Replicase (spezifische Aktivität von etwa 2000 Einheiten/mg) gegeben. Die Qβ-Replicase wurde wie im US-Patent Nr. 5 141 857 beschrieben, das hiermit als Bezugnahme aufgenommen wird, erhalten. Die Röhrchen wurden mit einer Kappe verschlossen und bis zur Messung auf Eis aufbewahrt.
Die Röhrchen wurden gleichzeitig verarbeitet. Jedes Röhrchen wurde auf 37ºC ± 0,25ºC gehalten. Jedes Röhrchen wurde 45 min lang alle 40 s mit 510 nm angeregt und bei 610 nm vermessen. Die abgestrahlte Fluoreszenz wurde hinsichtlich der Reaktionszeit numerisch analysiert. Die Reaktionszeit wurde als der Schnittpunkt der Fluoreszenzreaktion mit der Grundlinie genommen. Der Schnittpunkt wurde ermittelt unter Verwendung von Polynomen dritten Grades, um der Fluoreszenzreaktion zu entsprechen. Die Grundlinie wurde gemittelt.
Es wurden zehn der 12 Röhrchen für das Dual-Capture-Verfahren vermessen. Alle 10 erzeugten eine positive Reaktion. Es wurden elf der 12 Röhrchen für das Standard-RTC-Verfahren vermessen. Alle 11 erzeugten eine positive Reaktion. Damit zeigt das Beispiel, daß beide Assayformate in der Lage sind, das Signal nachzuweisen, das von 10&sup5; Molekülen des Targets 16S rmA unter Verwendung der C29-Detektorsonde erzeugt wird.

Beispiel 3

In Tabelle 3 sind weitere RNA-Insertionselemente aufgeführt, die in erfindungsgemäßen amplifizierbaren Nucleinsäuren nützlich sind. Die Insertionselemente wurden durch Konstruieren von Bibliotheken wie in den Verfahren A und B beschrieben und Beurteilung der Bestandteile der Bibliotheken wie weiter oben beschrieben identifiziert. Die Abstandshalter und die funktionelle Nucleotidsequenz jedes Insertionselements wurden identifiziert. Diese Insertionselemente wurden in MDV Mlu I #61 RNA eingebaut und als replizierbare Detektorsonden in Sandwichhybridisierungsassays verwendet. In Tabelle 3 sind auch der Testorganismus und die Quelle der Nucleinsäure, an welche zu binden die funktionelle Nucleotidsequenz entworfen worden war, genannt. Schließlich ist in Tabelle 3 das allgemeine Verfahren A oder B wie in der speziellen Beschreibung der Erfindung beschrieben, das zur Konstruktion der Bibliothek verwendet wurde, aus welcher die Insertionselemente gefunden wurden, auf geführt.

Claims

1. Insertionselement zum Einfügen in ein replizierbares Substrat für ein RNA-Polymerase-Enzym, wobei das Insertionselement eine von einem oder mehreren Abstandshaltern flankierte funktionelle Nucleotidsequenz umfaßt, die in der Lage ist, an eine Nucleotidsequenz eines Targetpolynucleotids unter Hybridisierungsbedingungen zu binden, und jeder Abstandshalter eine Sequenz von zufälligen Nucleotiden enthält.

2. Insertionselement nach Anspruch 1, wobei das RNA-Polymerase-Enzym Qβ-Replicase ist.

3. Insertionselement nach Anspruch 1 oder 2, wobei die zufällige Nucleotidsequenz jedes Abstandshalters zwei oder mehrere Nucleotide enthält.

4. Insertionselement nach Anspruch 3, wobei die zufällige Nucleotidsequenz jedes Abstandshalters 2 bis 25 Nucleotide und vorzugsweise 8 bis 14 Nucleotide enthält.

5. Bibliothek von Insertionselementen nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

6. Verfahren zur Herstellung eines Insertionselements nach einem der Ansprüche 1 bis 4, welches die Herstellung einer funktionellen Nucleotidsequenz und deren Flankierung mit einem oder mehreren Abstandshaltern umfaßt.

7. Rekombinantes Molekül, das ein replizierbares Substrat für ein RNA-Polymerase-Enzym zusammen mit einem Insertionselement nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält.

8. Rekombinantes Molekül nach Anspruch 7, wobei das RNA- Polymerase-Enzym Qβ-Replicase ist.

9. Rekombinantes Molekül nach Anspruch 8, wobei die funktionelle Nucleotidsequenz des Insertionselements in der Lage ist, an eine Nucleotidsequenz eines separaten Polynucleotids unter Hybridisierungsbedingungen zu binden, und/oder die funktionelle Nucleotidsequenz und ein oder mehrere flankierende Abstandshalter zu dem separaten Polynucleotid komplementär sind.

10. Bibliothek rekombinanter Moleküle nach einem der Ansprüche 7 bis 9.

11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Moleküls nach einem der Ansprüche 7 bis 9, welches den Zusatz einer funktionellen Nucleotidsequenz, die von einem oder mehreren Abstandshaltern flankiert ist, zu einem Molekül, das ein replizierbares Substrat für ein RNA-Polymerase-Enzym enthält, umfaßt.

12. Verfahren zur Identifizierung amplifizierbarer Nucleinsäuren mit selektierten Replikationseigenschaften, wobei die amplifizierbaren Nucleinsäuren

(I) ein durch eine RNA-Polymerase replizierbares Nucleinsäuresubstrat und

(II) eine funktionelle Nucleotidsequenz, die von einem oder mehreren Abstandshaltern flankiert wird, wobei jeder Abstandshalter eine Sequenz zufälliger Nucleotide enthält,

enthalten, wobei das Verfahren die Konstruktion einer Bibliothek aus den amplifizierbaren Nucleinsäuren und das Bewerten der Bibliothek aus den amplifizierbaren Nucleinsäuren mit ausgewählten Eigenschaften umfaßt und die Konstruktion vorzugsweise die Schritte Einfügen jeder der amplifizierbaren Nucleinsäuren in einen separaten Vektor, Züchten der Vektoren, Isolieren der Vektoren, Extraktion der amplifizierbaren Nucleinsäure aus den Vektoren und Bewerten der amplifizierbaren Nucleinsäuren für die ausgewählten Replikationseigenschaften umfaßt.