PT1496120E - Método de ordenamento in vitro - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE ORDENAMENTO IN VITRO" A presente invenção refere-se a métodos para utilização em bibliotecas moleculares em evolução in vitro. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos de selecção de ácidos nucleicos codificando produtos génicos nos quais o ácido nucleico e a actividade do produto génico codificado são ligadas por compartimentação. A evolução requer a geração de diversidade genética (diversidade em ácido nucleico) seguida pela selecção daqueles ácidos nucleicos que resultem em características benéficas. Em virtude do ácido nucleico e da actividade do produto génico codificado de um organismo estarem fisicamente ligados (estando os ácidos nucleicos confinados no interior das células que codificam), múltiplos ciclos de mutação e selecção podem resultar na sobrevivência progressiva de organismos com aptidão aumentada. Sistemas de evolução rápida de ácidos nucleicos ou proteínas in vitro devem mimetizar este processo ao nivel molecular, na medida em que o ácido nucleico e a actividade do produto génico codificado devem estar ligadas e a actividade do produto génico deve ser seleccionável.
Avanços recentes na biologia molecular permitiram que algumas moléculas fossem co-seleccionadas de acordo com as suas propriedades juntamente com os ácidos nucleicos que as codificam. Os ácidos nucleicos seleccionados podem ser subsequentemente clonados para análise adicional, ou utilizados ou submetidos a ciclos adicionais de mutação e selecção. É comum a estes métodos o estabelecimento de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos. Moléculas possuindo as características desejadas (actividade) podem ser isoladas através de regimes de selecção que seleccionem para a actividade desejada do produto génico codificado, tais como uma actividade bioquímica ou biológica desejada, por exemplo actividade de ligação. A tecnologia de apresentação de fago tem sido extremamente bem sucedida, na medida em que proporciona um veículo que permite a selecção de uma proteína apresentada, proporcionando o elo essencial entre o ácido nucleico e a actividade do produto génico codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; para revisão ver Clackson e Wells, 1994). As partículas do fago filamentoso actuam como invólucros de apresentação genética com proteínas na superfície externa e os elementos genéticos que as codificam no interior. A estreita ligação entre o ácido nucleico e a actividade do produto génico codificado é o resultado da disposição do fago no interior das bactérias. Visto que as bactérias individuais raramente são infectadas de forma múltipla, na maioria dos casos, todos os fagos produzidos a partir de uma bactéria individual transportarão o mesmo elemento genético e apresentarão a mesma proteína.
Contudo, a apresentação de fago depende da criação in vivo de bibliotecas de ácidos nucleicos em bactérias. Deste modo, a limitação prática no tamanho da biblioteca permitida pela tecnologia de apresentação de fago é da ordem de 107 a 1011, 2 mesmo tirando partido de vectores do fago λ com replicões excisáveis do fago filamentoso. A técnica tem sido aplicada principalmente para selecção de moléculas com actividade de ligação. Foi igualmente isolado um pequeno número de proteínas com actividade catalítica utilizando esta técnica, contudo, a selecção não foi em nenhum caso directamente para a actividade catalítica desejada, mas sim para ligação a uma análogo de transição de estado (Widersten e Mannervik, 1995) ou reacção com um inibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997) .
Foram seleccionados ligandos peptídicos específicos para ligação a receptores por selecção de afinidade utilizando extensas bibliotecas de peptídeos ligados à extremidade C terminal do repressor Lacl de lac (Cull et al., 1992). Quando expressa em E. coli, a proteína repressora liga fisicamente o ligando ao plasmídeo de codificação por ligação a uma sequência operadora lac no plasmideo.
Foi igualmente referido um sistema de apresentação de polissoma totalmente in vitro (Mattheakis et al., 1994), em que peptídeos nascentes são ligados fisicamente por meio do ribossoma ao ARN que os codifica.
Contudo, o âmbito dos sistemas supracitados está limitado à selecção de proteínas e, além disso, não permite a selecção directa para actividades, à excepção de ligação, por exemplo actividade catalítica ou reguladora. A selecção e evolução de ARN in vitro (Ellington e Szostak, 1990), por vezes designada como SELEX (evolução sistemática de ligandos por enriquecimento exponencial), (Tuerk e Gold, 1990) 3 permite seleccionar para ligação e para actividade química, mas apenas de ácidos nucleicos. Quando a selecção é para fins de ligação, é incubado um agregado de ácidos nucleicos com substrato imobilizado. Os não ligados são lavados, em seguida os ligados são libertados, amplificados e todo o processo é repetido em etapas iterativas para enriquecimento de melhores sequências de ligação. Este método pode ser igualmente adaptado para permitir o isolamento de ARN catalítico e ADN (Green e Szostak, 1992; para revisões ver Chapman e Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995).
Contudo, a selecção para actividade "catalítica" ou de ligação utilizando SELEX só é possível porque a mesma molécula realiza o duplo papel de transporte da informação genética e de ser o catalisador ou molécula de ligação (aptâmero). Quando a selecção é para "autocatálise" a mesma molécula deve realizar igualmente o terceiro papel de ser um substrato. Uma vez que o elemento genético deve realizar o papel, tanto de substrato como de catalisador, a selecção só é possível para eventos de regeneração simples. Em virtude do "catalisador" ser ele próprio modificado neste processo não é, por definição, um verdadeiro catalisador. Adicionalmente, as proteínas podem não ser seleccionadas utilizando o processo SELEX. A gama de catalisadores, substratos e reacções que podem ser seleccionados encontra-se, por conseguinte, seriamente limitada.
Dos métodos supracitados, aqueles que permitem ciclos iterativos de mutação e selecção mimetizam mecanismos in vitro usualmente imputados ao processo de evolução: variação iterativa, selecção progressiva de uma actividade e replicação desejadas. Contudo, nenhum dos métodos desenvolvidos até agora proporcionou moléculas de diversidade e eficácia funcional 4 comparáveis àquelas que se verificam naturalmente. Adicionalmente, não existem sistemas de "evolução" feitos pelo homem que consigam fazer evoluir, tanto ácidos nucleicos como proteínas, para efectuar a gama completa de actividades bioquímicas e biológicas (por exemplo, actividades de ligação, catalíticas e reguladoras) e que consigam conjugar diversos processos conduzindo a um produto ou actividade desejada.
Walde Peter et. al. J. Am. Chem. Soc. 116, 17 (1994) p 7541-7547 descrevem a polimerização enzimática de ADP numa micela invertida.
Hanes e Pluckthun P.N.A.S. 94 (1997) p 4937-4942 descrevem um método in vitro de selecção e evolução de proteínas funcionais utilizando a apresentação de ribossoma. 0 documento DE 19646372C descreve um composto compreendendo a unidade estrutural A (genótipo) e unidade estrutural B (fenótipo) em que o genótipo e fenótipo estão permanentemente ligados entre si.
Existe, deste modo, uma grande necessidade para um sistema in vitro que supere as limitações acima discutidas.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para o isolamento de um ou mais elementos genéticos codificando um produto génico possuindo uma actividade desejada, compreendendo as etapas de: 5 (a) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos genes que os codificam; (b) compartimentar elementos genéticos em microcápsulas; (c) ordenar os elementos genéticos que produzem produto (s) génico(s) possuindo a actividade desejada;
As microcápsulas compartimentam elementos genéticos e produtos génicos de modo a que permaneçam fisicamente ligados uns aos outros. Surpreendentemente, a expressão de ácido nucleico continua a ser possivel no interior das microcápsulas artificiais, permitindo o isolamento de ácido nucleico com base na actividade do produto génico que o codifica.
Como aqui utilizado, um elemento genético é uma molécula ou construção molecular compreendendo um ácido nucleico. Os elementos genéticos podem compreender qualquer ácido nucleico (por exemplo, ADN, ARN ou um seu qualquer análogo, natural ou artificial). 0 componente de ácido nucleico do elemento genético pode ser ligado, covalentemente ou não covalentemente, a uma ou mais moléculas ou estruturas, incluindo proteínas, entidades químicas e grupos, suportes de fase sólida tal como esferas magnéticas, e semelhantes. No método da invenção, estas estruturas ou moléculas podem ser concebidas para auxiliar na ordenação e/ou isolamento do elemento genético codificando um produto génico com a actividade desejada. A expressão, como aqui utilizada, é utilizada no seu sentido mais amplo, para significar que um ácido nucleico contido no elemento genético é convertido no seu produto génico. 6
Deste modo, se o ácido nucleico for ADN, a expressão refere-se à transcrição do ADN em ARN; se este ARN codificar para proteína, a expressão pode igualmente referir-se à tradução do ARN em proteína. Se o ácido nucleico for ARN, a expressão pode referir-se à replicação deste ARN em cópias adicionais de ARN, à transcrição reversa do ARN em ADN e, em opção, à transcrição deste ADN em molécula (s) adicional (is) de ARN, bem como, opcionalmente, à transcrição de qualquer das espécies de ARN produzidas em proteínas. Por conseguinte, de um modo preferido, a expressão é realizada por um ou mais processos seleccionados do grupo consistindo de transcrição, transcrição reversa, replicação e tradução.
Deste modo, a expressão do elemento genético no interior da microcápsula pode ser direccionada para ADN, ARN ou proteína, ou para um ácido nucleico ou proteína contendo bases ou aminoácidos não naturais (o produto génico), para que o produto génico seja confinado ao interior da mesma microcápsula que o elemento genético. 0 elemento genético e o produto génico assim codificado são ligados confinando, no interior da mesma microcápsula cada elemento genético e respectivo produto génico codificado pelo elemento genético. Desta forma, o produto génico numa microcápsula não pode causar uma alteração em quaisquer outras microcápsulas. 0 termo "microcápsula" é aqui utilizado em conformidade com o significado que lhe está normalmente atribuído na técnica e adicionalmente abaixo descrito. Contudo, uma microcápsula é essencialmente um compartimento artificial cujas fronteiras delimitantes restringem a troca dos componentes dos mecanismos 7 moleculares aqui descritos que permitem a ordenação de elementos genéticos de acordo com a função dos produtos génicos que codificam.
De um modo preferido, as microcápsulas utilizadas no método da presente invenção serão capazes de ser produzidas em grandes quantidades e, desse modo, compartimentar uma biblioteca de elementos genéticos que codifica um repertório de produtos génicos.
De acordo com uma forma de realização preferida do primeiro aspecto da presente invenção, a ordenação de elementos genéticos pode ser realizada essencialmente por uma de quatro técnicas. (I) Numa primeira forma de realização, as microcápsulas são ordenadas de acordo com uma actividade do produto génico ou seu derivado que torna a microcápsula detectável como um todo. Consequentemente, a invenção proporciona um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção em que um produto génico com a actividade desejada induz uma alteração na microcápsula, ou uma modificação de uma ou mais moléculas no interior da microcápsula, que possibilita que a microcápsula contendo o produto génico e o elemento genético que o codifica seja ordenada. Por conseguinte, nesta forma de realização, as microcápsulas são fisicamente ordenadas umas das outras de acordo com a actividade do(s) produto(s) génico(s) expresso(s) a partir do(s) elemento(s) genético (s) contido(s) naquelas(s), o que torna possível enriquecer selectivamente as microcápsulas contendo produtos génicos da actividade desejada. (II) Numa segunda forma de realização, os elementos genéticos são ordenados após a mistura das microcápsulas num ou mais compartimentos comuns. Nesta forma de realização, um produto génico possuindo a actividade desejada modifica o elemento genético que o codificou (e que reside na mesma microcápsula) num modo que o torne seleccionável numa etapa subsequente. As reacções são paradas e as microcápsulas são então quebradas para que seja agregado todo o conteúdo das microcápsulas individuais. A selecção para os elementos genéticos modificados possibilita o enriquecimento dos elementos genéticos codificando o(s) produto(s) génico(s) possuindo a actividade desejada. Consequentemente, a invenção proporciona um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, em que na etapa (b) o produto génico possuindo a actividade desejada modifica o elemento genético que o codifica, para possibilitar o isolamento do elemento genético. É claro que deve ser entendido que aquela modificação pode ser directa, na medida em que é causada pela acção directa do produto génico sobre o elemento genético, ou indirecta, em que uma série de reacções, uma ou mais das quais envolve o produto génico possuindo a actividade desejada, conduz à modificação do elemento genético. (III) Numa terceira forma de realização, os elementos genéticos são ordenados após a agregação das microcápsulas num ou mais compartimentos comuns. Nesta forma de realização, um gene com uma actividade desejada induz uma alteração na microcápsula contendo o produto génico e o elemento genético que o codifica. Esta alteração, quando detectada, desencadeia a modificação do gene no interior do compartimento. As reacções são paradas e as microcápsulas são então quebradas para que seja misturado todo o conteúdo das microcápsulas individuais. A selecção para os elementos genéticos modificados possibilita o enriquecimento dos elementos genéticos codificando o(s) produto(s) génico(s) possuindo a actividade desejada. 9
Consequentemente, a invenção proporciona um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, onde na etapa (b) o produto génico possuindo a actividade desejada induz uma alteração no compartimento que é detectada e desencadeia a modificação do elemento genético no interior do compartimento de forma a permitir o seu isolamento. Deve ser entendido que a alteração detectada no compartimento pode ser causada pela acção directa do produto génico, ou acção indirecta, na qual uma série de reacções, uma ou mais das quais envolve o produto génico possuindo a actividade desejada, conduz à alteração detectada. (IV) Numa quarta forma de realização, os elementos genéticos podem ser ordenados por um processo multi-etapa, que envolve pelo menos duas etapas, por exemplo, para permitir a exposição dos elementos genéticos a condições que permitam que ocorram pelo menos duas reacções separadas. Como será evidente para especialistas na técnica, a primeira etapa de microencapsulação da invenção deve resultar em condições que permitam a expressão dos elementos genéticos - seja transcrição, transcrição e/ou tradução, replicação ou semelhante. Nestas condições, pode não ser possível seleccionar para uma actividade particular de um produto génico porque, por exemplo, o produto génico pode não estar activo nestas condições, ou porque o sistema de expressão contém uma actividade interferente. É, por conseguinte, descrito um método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção, em que a etapa (b) compreende a expressão dos elementos genéticos para produzirem os seus respectivos produtos génicos no interior das microcápsulas, ligando os produtos génicos aos elementos genéticos que os codificam e isolando os complexos assim formados. 0 que permite que os elementos genéticos e os seus produtos génicos associados sejam isolados das cápsulas antes da realização da ordenação, de 10 acordo com a actividade do produto génico. Os complexos podem ser submetidos a uma etapa adicional de compartimentação, antes do isolamento dos elementos genéticos, codificando um produto génico possuindo a actividade desejada. Esta etapa de compartimentação adicional, que se realiza de um modo vantajoso nas microcápsulas, permite o desempenho de reacções adicionais, em diferentes condições, num ambiente onde os elementos genéticos e seus respectivos produtos génicos estão fisicamente ligados. A ordenação eventual de elementos genéticos pode ser realizada de acordo com a forma de realização (I) , (II) ou (III) acima. A "encapsulação secundária" pode ser igualmente realizada com elementos genéticos ligados a produtos génicos por outros meios, tais como por apresentação de fago, apresentação de polissoma, fusão ARN-peptideo ou fusão peptideo repressor lac. 0(s) elemento(s) genético(s) seleccionado(s) pode(m) ser igualmente submetido(s) a ciclos de ordenação subsequentes, possivelmente mais estringentes, em etapas repetidas iterativamente, reaplicando o método da invenção na sua totalidade ou apenas em etapas seleccionadas. Adequando as condições apropriadamente, os elementos genéticos codificando produtos génicos possuindo uma actividade melhor optimizada podem ser isolados após cada ciclo de selecção.
Adicionalmente, os elementos genéticos isolados após um primeiro ciclo de ordenamento podem ser submetidos a mutagénese antes da repetição da ordenação por repetição iterativa das etapas do método da invenção como acima exposto. Após cada ciclo de mutagénese, alguns elementos genéticos terão sido modificados de tal modo que é melhorada a actividade dos produtos génicos. 11
Além disso, os elementos genéticos seleccionados podem ser clonados num vector de expressão para permitir a caracterização adicional dos elementos genéticos e seus produtos. É igualmente descrito um produto quando seleccionado de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Como utilizado neste contexto, um "produto" pode referir-se a um produto génico, seleccionável de acordo com a invenção, ou ao elemento genético (ou informação genética compreendida neste).
Num terceiro aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de um produto génico, compreendendo as etapas de: (a) preparar um elemento genético codificando o produto génico; (b) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos elementos genéticos que os codificam no seu interior; (c) compartimentar elementos genéticos em microcápsulas; (d) ordenar os elementos genéticos que produzem o(s) produto(s) génico(s) possuindo a actividade desejada; e (e) expressar o produto génico possuindo a actividade desejada.
Em conformidade com o terceiro aspecto, a etapa (a) compreende, de um modo preferido, a preparação de um repertório de elementos genéticos, em que cada elemento genético codifica 12 um produto génico potencialmente diferente. Os repertórios podem ser gerados por técnicas convencionais, tais como aquelas empregues para a geração de bibliotecas planeadas para selecção por métodos, tal como, apresentação de fago. Os produtos génicos possuindo a actividade desejada podem ser seleccionados a partir do repertório, de acordo com a presente invenção.
Num quarto aspecto, a invenção proporciona um método para rastreio de um composto ou compostos capazes de modular a actividade de um produto génico, compreendendo as etapas de: (a) preparar um repertório de elemento genético codificando produto génico; (b) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos e ligar os produtos génicos aos elementos genéticos que os codificam; (c) compartimentar elementos genéticos em microcápsulas; (d) ordenar os elementos genéticos que produzem o(s) produto(s) génico(s) possuindo a actividade desejada; e (e) colocar um produto génico possuindo a actividade desejada em contacto com o composto ou compostos e monitorizar a modulação de uma actividade do produto génico pelo composto ou compostos.
De um modo vantajoso, o método compreende adicionalmente a etapa de: 13 (f) identificar o composto ou compostos capazes de modular a actividade do produto génico e sintetizar o referido composto ou compostos.
Este sistema de selecção pode ser configurado para seleccionar para ARN, ADN ou moléculas proteicas com actividade catalítica, reguladora ou de ligação.
Num quinto aspecto, a invenção proporciona um método de preparação de um composto ou compostos, compreendendo as etapas de: (a) proporcionar um protocolo de síntese, em que pelo menos uma etapa é catalisada por um polipeptídeo; (b) preparar elementos genéticos codificando variantes do polipeptídeo que facilitem esta etapa; (c) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos elementos genéticos que os codificam; (d) compartimentar os elementos genéticos em microcápsulas; (e) ordenar os elementos genéticos que produzem produto(s) génico(s) polipeptídico(s) possuindo a actividade desejada; e (f) preparar o composto ou compostos utilizando o produto génico polipeptídico identificado em (e) para facilitar a etapa relevante da síntese. 14
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1
Selecção génica por compartimentação. a Representação esquemática do processo de selecção. Na Etapa 1, uma mistura de reacção de transcrição/tradução in vitro contendo uma biblioteca de elementos genéticos ligados a um substrato para a reacção a ser seleccionada é dispersa para formar uma emulsão de água-em-óleo, tipicamente com um elemento genético por compartimento aquoso. Os elementos genéticos são transcritos e traduzidos no interior dos seus compartimentos (Etapa 2) . Subsequentemente (Etapa 3) , proteínas (ou ARNs) com actividades enzimáticas convertem o substrato num produto que permanece ligado ao elemento genético. A compartimentação impede a modificação de elementos genéticos noutros compartimentos. Em seguida (Etapa 4), a emulsão é quebrada, todas as reacções são paradas e combinam-se os compartimentos aquosos. Elementos genéticos que estão ligados ao produto são selectivamente enriquecidos, depois amplificados e, ou são caracterizados (Etapa 5), ou são ligados ao substrato e compartimentados para ciclos adicionais de selecção (Etapa 6) . b Selecção para metilação de ADN específica de alvo por HaelII metilase. 0 substrato é um segmento de ADN contendo sítios de restrição/modificação (R/M) HaelII. Os elementos genéticos são isolados por ligação a esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e tratados com a enzima de restrição cognata HaelII. Apenas os ácidos nucleicos com sítios R/M metilados são resistentes a clivagem e subsequentemente amplificados por PCR. 15
Figura 2a
Distribuição de tamanho de gotícula e actividades de DHFR e HaelII metilase em emulsões: distribuição de tamanho dos compartimentos aquosos numa emulsão determinada por difracção laser. As misturas de reacção de transcrição/tradução in vitro contendo ADN e desoxicolato de sódio são emulsionadas por agitação, ou por agitação seguida por homogeneização a 8k, 9,5k ou 13,5k rpm. A distribuição de tamanho das partículas aquosas é apresentada em percentagem do volume aquoso total.
Figura 2b A actividade de DHFR formada in situ por transcrição e tradução do seu gene (Fig. 1b) em compartimentos aquosos de uma emulsão. A concentração utilizada do gene folh (2,5 nM) dá uma média de um gene por goticula nas emulsões mais finas (homogeneizadas a 13,5 K rpm). 0 diâmetro médio calculado a partir dos dados de distribuição de tamanho (na Figura 2) é apresentado como função da velocidade de homogeneização (OK rpm refere-se à emulsão preparada por agitação sem homogeneização adicional). A actividade é apresentada como percentagem da actividade observada na mistura de reacção in vitro não emulsionada nas mesmas condições. A actividade de HaelII metilase formada in situ por transcrição e tradução do seu gene (Fig. 1b) em compartimentos aquosos de uma emulsão. A concentração utilizada do gene de M.HaelII (2,5 nM) dá uma média de um gene por goticula nas emulsões mais finas (homogeneizadas a 13,5 K rpm). 0 diâmetro médio calculado a partir dos dados de distribuição de tamanho 16 (na Figura 2a) é apresentado como função da velocidade de homogeneização; (Ok rpm refere-se à emulsão preparada por agitação sem homogeneização adicional) . A actividade é apresentada como percentagem da actividade observada na mistura de reacção in vitro não emulsionada nas mesmas condições.
Figura 3
Selecções para HaelII ADN metilase. a Seleccionando genes de M.HaelII a partir de um excesso de 1000 vezes de genes folA. As reacções foram preparadas com ADN de DIG-folA-3s-Biotina a 0,2 nM (correspondendo em média a um gene por compartimento), com adição de DIG-M.HaeIII-3s-Biotina a 0,2 pM. As misturas de reacção foram emulsionadas por agitação, ou foram deixadas em solução. Foi capturado o ADN destas reacções, digerido com HaelII (ou com Hhal) e amplificado por PCR. Este ADN foi adicionalmente amplificado por PCR de iniciadores internos com os iniciadores LMB2-Nest e LMB3-Nest e cinco microlitros de cada PCR de iniciadores internos foram submetidos a electroforese num gel de agarose a 1,5% contendo brometo de etideo. Marcadores, digestão cpX174-HaeIII; menos T7, sem T7 ARN polimerase; menos NadCh, sem desoxicolato de sódio. b Selecções de dois ciclos. Reacções contendo uma razão molar de 1:104 a 1:107 de DIG-M.HaelII-3s-Biotina:DIG-folA-3s-Biotina (a 500 pM) são emulsionadas por agitação. O ADN destas reacções é digerido com HaelII e amplificado por PCR com iniciadores LMB2-Biotina (SEQ. ID. N° 9) e LMB3-DIG (SEQ. ID. N° 10). O ADN amplificado do primeiro ciclo de selecção de razões 1:104 e 1:105 (a 20 pM) e as razões 1:106 e 1:107 (a 500 pM) é integrado num 17 segundo ciclo de selecção. Este ADN foi adicionalmente amplificado por PCR de iniciadores internos com os iniciadores LMB2-Nest e LMB3-Nest e cinco microlitros de cada PCR de iniciadores internos de cada ciclo de selecção são analisados por electroforese em gel de agarose como acima (painel superior). 0 mesmo ADN foi traduzido in vitro e foi medida a actividade de metilase resultante. Os resultados são apresentados como a percentagem de ADN de substrato metilado (painel inferior).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
(A) DESCRIÇÃO GERAL
As microcápsulas requerem propriedades físicas apropriadas de forma a permitir o funcionamento da invenção.
Em primeiro lugar, de forma a assegurar que os elementos genéticos e produtos génicos não possam difundir entre microcápsulas, o conteúdo de cada microcápsula deve ser isolado do conteúdo das microcápsulas circundantes, para que não exista nenhuma ou pouca troca dos elementos genéticos e produtos génicos entre as microcápsulas durante o período de tempo da experiência.
Em segundo lugar, o método da presente invenção requer que exista apenas um número limitado de elementos genéticos por microcápsula. 0 que assegura que o produto génico de um elemento genético individual será isolado de outros elementos genéticos. Deste modo, a ligação entre elemento genético e produto génico será altamente específica. 0 factor de enriquecimento é maior, 18 em média, com um ou menos elementos genéticos por microcápsula, sendo a ligação entre ácido nucleico e a actividade do produto génico codificado tão firme quanto seja possível, uma vez que o produto génico de um elemento genético individual será isolado dos produtos de todos os outros elementos genéticos. Contudo, mesmo se não for utilizada a situação teoricamente óptima de, em média, um único elemento genético ou menos por microcápsula, uma razão de 5, 10, 50, 100 ou 1000 ou mais elementos genéticos por microcápsula poderá revelar-se benéfica na ordenação de uma biblioteca extensa. Ciclos subsequentes de ordenamento, incluindo encapsulação renovada com distribuição de diferentes elementos genéticos, permitirão uma ordenação mais estringente dos elementos genéticos. De um modo preferido, existe um único elemento genético, ou menos, por microcápsula.
Em terceiro lugar, a formação e a composição das microcápsulas não deve suprimir a função da maquinaria de expressão dos elementos genéticos e a actividade dos produtos génicos.
Consequentemente, qualquer sistema de microencapsulação utilizado deve preencher estes três requisitos. 0(s) sistema(s) apropriado (s) pode(m) variar, dependendo da natureza exacta dos requisitos em cada aplicação da invenção, como será evidente para o especialista.
Está disponível uma ampla variedade de processos de microencapsulação (ver Benita, 1996) e podem ser utilizados para criar as microcápsulas utilizadas em conformidade com a presente invenção. De facto, foram identificados na literatura mais de 200 métodos de microencapsulação (Finch, 1993). 19
Estes incluem vesículas aquosas envolvidas por membrana, tais como vesículas lipídicas (lipossomas) (New, 1990) e vesículas de tensioactivos não iónicos (van Hal et al., 1996). Estas são cápsulas membranosas fechadas de bicamadas simples ou múltiplas de moléculas reunidas não covalentemente, com cada bicamada separada da sua vizinha por um compartimento aquoso. No caso dos lipossomas, a membrana é composta de moléculas lipídicas; estas são normalmente fosfolípidos, mas esteróis podem ser igualmente incorporados nas membranas, tais como colesterol (New, 1990) . No interior dos lipossomas podem ser realizadas uma variedade de reacções bioquímicas catalisadas por enzimas, incluindo polimerização de ARN e ADN (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
Com um sistema de vesícula envolvida por membrana, a maior parte da fase aquosa está no exterior das vesículas e, por conseguinte, não está compartimentada. Esta fase aquosa contínua deve ser removida ou os sistemas biológicos dentro dela inibidos ou destruídos (por exemplo, por digestão de ácidos nucleicos com ADNase ou ARNase) de modo a que as reacções sejam limitadas às microcápsulas (Luisi et al., 1987).
Foram igualmente demonstradas reacções bioquímicas catalisadas por enzimas em microcápsulas geradas por uma variedade de outros métodos. Muitas enzimas são activas em soluções micelares invertidas (Bru & Walde, 1991; Bru & Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988) tal como o sistema AOT-isooctano-água (Menger & Yamada, 1979) . 20
As microcápsulas podem ser igualmente geradas por polimerização interfacial e complexação interfacial (Whateley, 1996). Microcápsulas desta espécie podem possuir membranas rigidas, não permeáveis, ou membranas semipermeáveis.
Microcápsulas semipermeáveis delimitadas por membranas de nitrato de celulose, membranas de poliamida e membranas de lípido-poliamida, podem todas elas sustentar reacções bioquímicas, incluindo sistemas multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Microcápsulas de alginato/polilisina (Lim & Sun, 1980) , que podem ser formadas sob condições muito moderadas, deram provas de ser igualmente muito biocompatíveis, proporcionando, por exemplo, um método eficaz de encapsulação de células e tecidos vivos (Chang, 1992; Sun et al., 1992).
Podem ser igualmente utilizados sistemas de encapsulação não membranosos baseados em partição de fases de um ambiente aquoso num sistema coloidal, tal como uma emulsão.
De um modo preferido, as microcápsulas são formadas a partir de emulsões; sistemas heterogéneos de duas fases líquidas imiscíveis com uma das fases dispersa na outra sob a forma de gotículas de tamanho microscópico ou coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984) .
Podem ser produzidas emulsões a partir de qualquer
combinação adequada de líquidos imiscíveis. De um modo preferido, a emulsão possui água (contendo os componentes bioquímicos) como a fase presente na forma de gotículas finamente divididas (a fase dispersa, interna ou descontínua) e um líquido hidrofóbico imiscível (um 'óleo' ) como a matriz onde estas gotículas são suspensas (a fase não dispersa, contínua ou externa) . Tais emulsões são designadas 'água-em-óleo' (W/O). O 21 que tem como vantagem que toda a fase aquosa contendo os componentes bioquímicos está compartimentada em gotículas discretas (a fase interna) . A fase externa, sendo um óleo hidrofóbico, não contém geralmente nenhum dos componentes bioquímicos e é, por este motivo, inerte. A emulsão pode ser estabilizada pela adição de um ou mais agentes activos de superfície (tensioactivos). Estes tensioactivos são designados agentes emulsionadores e actuam na interface água/óleo para impedir (ou, pelo menos, atrasar) a separação das fases. Podem ser utilizados muitos óleos e muitos emulsionantes para a geração de emulsões de água-em-óleo; uma recente compilação listou mais de 16000 tensioactivos, muitos dos quais utilizados como agentes emulsionadores (Ash e Ash, 1993). Óleos adequados incluem óleo mineral branco leve e tensioactivos não iónicos (Schick, 1966), tais como monooleato de sorbitano (Span™80; ICI) e monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween™ 80; ICI).
Pode ser igualmente benéfica a utilização de tensioactivos aniónicos. Tensioactivos adequados incluem colato de sódio e taurocolato de sódio. É particularmente preferido o desoxicolato de sódio, de um modo preferido a uma concentração de 0,5% p/v, ou menor. A inclusão de tais tensioactivos pode, em alguns casos, aumentar a expressão dos elementos genéticos e/ou a actividade dos produtos génicos. A adição de alguns tensioactivos aniónicos a uma mistura de reacção não emulsionada suprime completamente a tradução. Contudo, durante a emulsificação, o tensioactivo é transferido da fase aquosa para a interface e é restaurada a actividade. A adição de um tensioactivo aniónico às misturas a emulsionar assegura que as reacções prossigam apenas após a compartimentação. 22 A criação de uma emulsão requer geralmente a aplicação de energia mecânica para forçar a junção das fases. 0 que pode ser feito através de uma variedade de formas que utilizam uma variedade de dispositivos mecânicos, incluindo agitadores (tais como barras de agitação magnéticas, agitadores de hélice e turbina, dispositivos de pás e batedores), homogeneizadores (incluindo homogeneizadores rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta pressão e homogeneizadores a jacto), moinhos de coloidização, dispositivos ultra-sónicos e de 'emulsificação de membrana' (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
As microcápsulas aquosas formadas em emulsões de água-em-óleo são normalmente estáveis com pouca, se é que existe alguma, troca de elementos genéticos ou produtos génicos entre microcápsulas. Adicionalmente, demonstrou-se que diversas reacções bioquímicas prosseguem em microcápsulas de emulsão. Além disso, estão igualmente activos em microcápsulas de emulsão complicados processos bioquímicos, especialmente transcrição e tradução génicas. A tecnologia existe para criar emulsões com volumes até ao nível de escalas industriais de milhares de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984) . 0 tamanho preferido da microcápsula variará, dependendo dos requisitos exactos de qualquer processo de selecção individual que deve ser realizado de acordo com a presente invenção. Quaisquer que sejam as circunstâncias, deverá existir um equilíbrio óptimo entre tamanho de biblioteca de gene, o enriquecimento requerido e a concentração requerida de componentes nas microcápsulas individuais, de forma a alcançar expressão e reactividade eficiente dos produtos génicos. 23
Os processos de expressão podem ocorrer no interior de cada microcápsula individual. Tanto a transcrição como a transcrição-tradução conjugada in vitro tornam-se menos eficientes a concentrações sub-nanomolares de ADN. Devido ao requisito de apenas estar presente em cada microcápsula um número limitado de moléculas de ADN coloca, por conseguinte, um limite prático superior ao tamanho possível da microcápsula. De um modo preferido, o volume médio das microcápsulas é menor que 5.2 x 10“16 m3, (correspondendo a uma microcápsula esférica de diâmetro menor que 10ym, de um modo mais preferido menor que 6,5 x IO”17 m3 (5ym), de um modo mais preferido cerca de 4.2 x 10~18 m3 (2ym) e de um modo ideal cerca de 9 x IO”18 m3 (2,6ym). A concentração efectiva de ADN ou ARN dentro das microcápsulas pode ser artificialmente aumentada por vários métodos, que serão bem conhecidos dos entendidos na técnica. Estes incluem, por exemplo, a adição de químicos de exclusão de volume tais como polietilenoglicóis (PEG) e uma variedade de técnicas de amplificação génica, incluindo transcrição utilizando ARN polimerases incluindo aquelas de bactérias tais como E. coli (Roberts, 1969; Blattner e Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), eucariotas e. g. (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) e bacteriófagos tais como T7, T3 e SP6 (Melton et al., 1984); a reacção de polimerização em cadeia (PCR) (Saiki et al., 1988); amplificação de Οβ replicase (Miele et al., 1983; Ca-hill et al., 1991; Chetverin e Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); a reacção de ligase em cadeia (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); e sistema de replicação de sequência auto-sustentado (Fahy et al., 1991) e amplificação de deslocamento de cadeia (Walker et al., 1992). Poderiam mesmo ser utilizadas técnicas de amplificação génica 24 que requerem ciclização térmica, tais como PCR e LCR, caso as emulsões e os sistemas de transcrição ou transcrição-tradução conjugados in vitro fossem termoestáveis (por exemplo, os sistemas conjugados de transcrição-tradução poderiam ser preparados a partir de um organismo termoestável, tal como o Thermus aquaticus) .
Aumentando a concentração efectiva local de ácido nucleico possibilita que se utilizem eficazmente microcápsulas maiores. 0 que permite um limite prático superior preferido do volume da microcápsula de cerca de 5,2 x IO”16 m3 (correspondendo a uma esfera de 10ym de diâmetro). 0 tamanho de microcápsula deve ser suficientemente grande para acomodar a totalidade dos componentes requeridos das reacções bioquímicas que necessitam de ocorrer no interior da microcápsula. Por exemplo, tanto as reacções de transcrição, como as reacções conjugadas de transcrição-tradução requerem, in vitro, uma concentração total de trifosfato nucleosídeo de cerca de 2mM.
Por exemplo, para transcrever um gene numa única curta molécula de ARN de 500 bases de comprimento, requereria um mínimo de 500 moléculas de trifosfato nucleosídeo por microcápsula (8,33 x 10“22 moles). Para constituir uma solução de 2mM, este número de moléculas deve estar contido no interior da microcápsula de volume 4,17 x 10’19 litros (4,17 x 10’22 m3) que, se fosse esférica, teria um diâmetro de 93nm.
Além disso, particularmente no caso de reacções envolvendo tradução, deve ser notado que os próprios ribossomas necessários para que ocorra a tradução possuem aproximadamente 20nm de 25 diâmetro. Por este motivo, o limite inferior preferido para microcápsulas é um diâmetro de aproximadamente 0,1 ym (lOOnm).
Por conseguinte, o volume de microcápsula é, de um modo preferido, da ordem de entre 5,2 x 10“22 m3 e 5,2 x 10“16 m3 correspondendo a uma esfera de diâmetro entre 0,lym e lOym, de um modo mais preferido de entre cerca de 5,2 x 10~19 m3 e 6,5 x 10~17 m3 (lym e 5ym) . São mais vantajosos diâmetros esféricos de cerca de 2,6 ym. Não é por acaso que as dimensões preferidas dos compartimentos (goticulas de 2,6ym de diâmetro médio) se assemelham estreitamente às das bactérias, por exemplo, Escherichia são bastonetes de 1,1-1,5 x 2,0-6,0 μηα e Azotobacter são células ovoides de 1,5-2,0 ym de diâmetro. Na sua forma mais simples, a evolução Darwiniana baseia-se num mecanismo de 'um genótipo um fenótipo'. A concentração de um único gene ou genoma compartimentado cai de 0,4 nM, num compartimento de 2 ym de diâmetro, para 25 pM num compartimento de 5 ym de diâmetro. A maquinaria procariótica de transcrição/tradução evoluiu para operar em compartimentos de ~ 1-2 ym de diâmetro, onde genes simples se encontram aproximadamente em concentrações nanomolares. Um único gene, num compartimento de 2,6 ym de diâmetro está a uma concentração de 0,2 nM. Esta concentração génica é suficientemente elevada para uma tradução eficiente. A compartimentação num tal volume assegura igualmente que mesmo se apenas uma única molécula do produto génico for formada ela está presente a cerca de 0,2 nM, que é importante se o produto génico tiver de possuir uma actividade de modificação do próprio elemento genético. Deste modo, o volume da microcápsula deve ser seleccionado tendo em conta, não apenas os requisitos para transcrição e tradução do elemento genético, mas também a 26 actividade de modificação requerida do produto génico no método da invenção. 0 tamanho de microcápsulas de emulsão pode ser alterado adequando simplesmente as condições da emulsão utilizadas para formar a emulsão de acordo com os requisitos do sistema de selecção. Quanto maior for o tamanho da microcápsula, maior será o volume requerido para encapsular uma dada biblioteca de elementos genéticos visto que, em última análise, o factor limitante será o tamanho da microcápsula e, deste modo, o número de microcápsulas possível por unidade de volume. 0 tamanho das microcápsulas é seleccionado, não apenas tendo em conta os requisitos do sistema de transcrição/tradução, mas também aqueles do sistema de selecção empregue para o elemento genético. Deste modo, os componentes do sistema de selecção, tal como um sistema de modificação química, podem requerer volumes de reacção e/ou concentrações de reagentes que não sejam óptimas para transcrição/tradução. Como aqui exposto, tais requisitos podem ser acomodados por uma etapa de reencapsulação secundária; além disso, podem ser acomodados seleccionando o tamanho da microcápsula para maximizar a transcrição/tradução e selecção como um todo. É preferida, como aqui exposto, por exemplo, a determinação empírica de volume e concentração de reagente óptimas de microcápsula.
Um "elemento genético" em conformidade com a presente invenção é como acima descrito. De um modo preferido, um elemento genético é uma molécula ou construção seleccionada a partir do grupo consistindo de uma molécula de ADN, uma molécula de ARN, uma molécula de ácido nucleico, parcial ou totalmente artificial, consistindo de bases exclusivamente sintéticas ou de 27 uma mistura de naturais e sintéticas, qualquer um dos precedentes ligado a um polipeptídeo, e qualquer um dos precedentes ligado a qualquer outro grupo molecular ou construção. De um modo vantajoso, o outro grupo molecular ou construção pode ser seleccionado a partir do grupo consistindo de ácidos nucleicos, substâncias poliméricas, particularmente esferas, por exemplo esferas de poliestireno, substâncias magnéticas tais como esferas magnéticas, marcadores, tais como fluoróforos ou marcadores isotópicos, reagentes químicos, agentes de ligação tais como macrociclos e afins. A porção de ácido nucleico do elemento genético pode compreender sequências reguladoras adequadas, tais como aquelas requeridas para expressão eficiente do produto génico, por exemplo promotores, estimuladores, sequências de iniciação de tradução, sequências de poliadenilação, sítios de corte e semelhantes.
Como será evidente a partir do seguinte, em muitos casos o polipeptídeo ou outro grupo molecular ou construção é um ligando ou um substrato que se liga, directa ou indirectamente, ou reage com o produto génico, com o objectivo de marcar o elemento genético. 0 que permite a ordenação do elemento genético com base na actividade do produto génico. 0 ligando ou substrato pode ser ligado ao ácido nucleico por intermédio de uma variedade de meios que serão evidentes aos especialistas na técnica (ver, por exemplo, Hermanson, 1996). Será suficiente qualquer marca que permita a selecção subsequente do elemento genético. A ordenação pode ser por qualquer método que permita a separação, amplificação ou sobrevivência preferencial do elemento genético marcado. 28
Exemplos incluem a selecção por ligação (incluindo técnicas baseadas na separação magnética, por exemplo utilizando esferas Dynabeads™), e por resistência à degradação (por exemplo por nucleases, incluindo endonucleases de restrição) .
Uma forma pela qual a molécula de ácido nucleico pode ser ligada a um ligando ou substrato é através de biotinilação. 0 que pode ser feito por amplificação de PCR com um iniciador de biotinilação em 5' , de modo a que a biotina e o ácido nucleico sejam ligados covalentemente. 0 ligando ou substrato a seleccionar pode ser ligado ao ácido nucleico modificado por uma variedade de meios que serão evidentes aos especialistas na técnica. Um ácido nucleico biotinilado pode ser conjugado a uma microsfera de poliestireno (0,035 a 0,2 ym em diâmetro) que é revestida com avidina ou estreptavidina que, por conseguinte, se ligará ao ácido nucleico com afinidade muito elevada. Esta esfera pode ser derivatizada com substrato ou ligando por qualquer método adequado, tal como pela adição de substrato biotinilado ou por conjugação covalente.
Alternativamente, um ácido nucleico biotinilado pode ser conjugado a avidina ou estreptavidina complexada a uma grande molécula proteica, tal como tiroglobulina (669 Kd) ou ferritina (440 Kd) . Este complexo pode ser derivatizado com substrato ou ligando, por exemplo por conjugação covalente ao grupo ε-amino de lisinas ou através de uma interacção não covalente, tal como biotina-avidina. O substrato pode estar presente numa forma desligada do elemento genético mas contendo uma "marca" inactiva que requer uma etapa adicional para o activar, tal como fotoactivação (e. g., de um análogo de biotina "enjaulado" 29 (Sundberg et al., 1995; Pirrung e Huang, 1996)). 0 catalisador a seleccionar converte então o substrato em produto. A "marca" poderia depois ser activada e o substrato e/ou produto "marcado" ligado por uma molécula de ligação à marca (e. g., avidina ou estreptavidina) complexada com o ácido nucleico. A razão entre substrato e produto ligado ao ácido nucleico por meio da "marca" reflectirá, por conseguinte, a razão do substrato e produto em solução.
Uma alternativa consiste em conjugar o ácido nucleico a um anticorpo específico de produto (ou outra molécula específica de produto). Neste cenário, o substrato (ou um dos substratos) está presente em cada microcápsula desligado do elemento genético, mas possui uma "marca" molecular (por exemplo, biotina, DIG ou DNP). Quando o catalisador a seleccionar converte o substrato em produto, o produto retém a "marca" e é depois capturado na microcápsula pelo anticorpo especifico de produto. Desta forma, o elemento genético só fica associado à "marca" quando codifica ou produz uma enzima capaz de converter substrato em produto.
Quando todas as reacções são paradas e as microcápsulas são combinadas, os elementos genéticos codificando enzimas activas podem ser enriquecidos utilizando um anticorpo ou outras moléculas que se ligam ou reagem especificamente com a "marca". Embora tanto o substrato como o produto possuam a marca molecular, apenas co-purificarão os elementos genéticos codificando o produto génico activo. São aqui utilizados os termos "isolamento", "ordenação" e "selecção", bem como suas variações. Isolamento, de acordo com a presente invenção, refere-se ao processo de separação de uma entidade de uma população heterogénea, por exemplo uma mistura, 30 de modo a que esteja isenta de, pelo menos, uma substância com a qual estava associada antes do processo de isolamento. Numa forma de realização preferida, o isolamento refere-se essencialmente a purificação de uma entidade até homogeneidade. Ordenação de uma entidade refere-se, de um modo preferido, ao processo de isolamento de entidades desejadas em vez de entidades indesejadas. Os termos "isolamento" e "ordenação" são equivalentes, desde que tal se refira ao isolamento das entidades desejadas. 0 método da presente invenção permite a ordenação de elementos genéticos desejados a partir de agregados (bibliotecas ou repertórios) de elementos genéticos que contenham o elemento genético desejado. Selecção é utilizada para referência ao processo (incluindo o processo de ordenação) de isolamento de uma entidade de acordo com uma sua propriedade particular.
Numa aplicação extremamente preferida, o método da presente invenção é útil para ordenação de bibliotecas de elementos genéticos. A invenção proporciona, por conseguinte, um método de acordo com aspectos precedentes da invenção, em que os elementos genéticos são isolados a partir de uma biblioteca de elementos genéticos codificando um repertório de produtos génicos. Os termos "biblioteca", "repertório" e "agregado" são aqui utilizados de acordo com o seu significado usual na técnica, de modo a que uma biblioteca de elementos genéticos codifique um repertório de produtos génicos. Em geral, as bibliotecas são construídas a partir de agregados de elementos genéticos e possuem propriedades que facilitam a ordenação. A selecção inicial de um elemento genético a partir de uma biblioteca de elementos genéticos utilizando a presente invenção requererá, na maioria dos casos, a pesquisa de um grande número 31 de elementos genéticos variantes. As bibliotecas de elementos genéticos podem ser criadas de várias formas diferentes, incluindo a seguinte.
Agregados de elementos genéticos naturais podem ser clonados a partir de ADN ou ADNc genómico (Sambrook et al., 1989); por exemplo, bibliotecas de anticorpos de fagos, preparados por repertórios de amplificação de PCR de genes de anticorpos de dadores, imunizados ou não imunizados, revelaram-se fontes muito eficazes de fragmentos de anticorpos funcionais (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). As bibliotecas de genes podem ser igualmente preparadas codificando a totalidade (ver, por exemplo, Smith, 1985; Parmley e Smith, 1988) ou parte de genes (ver, por exemplo, Lowman et al., 1991) ou agregados de genes (ver, por exemplo, Nissim et al., 1994) por intermédio de um oligonucleotídeo sintético aleatório ou dopado. As bibliotecas podem ser igualmente preparadas 'aleatoriamente' pela introdução de mutações num elemento genético ou agregado de elementos genéticos por intermédio de diversas técnicas in vivo, incluindo; utilizando 'estirpes mutator', de bactérias tais como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); utilizando o sistema de hiperpermutação de anticorpo de linfócitos B (Yelamos et al., 1995). Podem ser igualmente introduzidas mutações, tanto in vivo como in vitro, por agentes mutagénicos quimicos, e irradiação ionizante ou UV (ver Friedberg et al., 1995), ou incorporação de análogos mutagénicos de bases (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Mutações 'aleatórias' podem ser igualmente introduzidas em genes in vitro durante a polimerização utilizando, por exemplo, polimerases propensas a erros (Leung et al., 1989). 32
Pode ser introduzida diversificação adicional utilizando a recombinação homóloga in vivo (ver Kowalczykowski et al., 1994) ou in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b)).
Podem ser introduzidas mutações no(s) elemento(s) genético (s) como acima exposto.
Os elementos genéticos codificam, de um modo vantajoso, enzimas, de um modo preferido de interesse farmacológico ou industrial, activadores ou inibidores, especialmente de sistemas biológicos, tais como mecanismos de transdução de sinal celular, anticorpos e seus fragmentos, outros agentes de ligação adequados para aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Por conseguinte, podem ser identificados e isolados produtos clinicamente ou industrialmente úteis. É desejável a selecção de condições adequadas de encapsulação. Dependendo da complexidade e tamanho da biblioteca a pesquisar, pode ser benéfico implementar o processo de encapsulação de modo a que 1 ou menos que 1 elemento genético seja encapsulado por microcápsula. 0 que proporcionará o maior poder de resolução. Contudo, se a biblioteca for maior e/ou mais complexa, tal pode ser impraticável; pode ser preferível encapsular vários elementos genéticos em conjunto e confiar na aplicação repetida do método da invenção para alcançar a ordenação da actividade desejada. Pode ser utilizada a combinação de processos de encapsulação para obter o desejado enriquecimento.
Estudos teóricos indicam que, quanto maior for o número de variantes de elementos genéticos criado, maior será a probabilidade de uma molécula ser criada com as propriedades 33 desejadas (ver Perelson e Oster, 1979 para uma descrição de como esta se aplica a repertórios de anticorpos). Foi igualmente recentemente confirmado na prática que, de facto, maiores repertórios de anticorpos de fago dão origem a mais anticorpos com melhores afinidades de ligação que repertórios mais pequenos (Griffiths et al., 1994). Para garantir que são gerados variantes raros e sejam, deste modo, capazes de ser seleccionados, é desejável uma biblioteca de grande tamanho. Deste modo, é benéfica a utilização de microcápsulas optimamente pequenas. 0 maior repertório criado até à data, utilizando métodos que requerem uma etapa in vivo (sistemas de apresentação de fago e LacI) , foi uma biblioteca de 1,6 x 1011 clones de peptideos de fago que requereu a fermentação de 15 litros de bactérias (Fisch et ai., 1996). Experiências de SELEX são frequentemente efectuadas com números muito grandes de variantes (até 1015) .
Utilizando a presente invenção, a um diâmetro de microcápsula preferido de 2,6 ym, pode ser seleccionado um tamanho de repertório de pelo menos 1011 utilizando lmL de fase aquosa numa emulsão de 20 mL.
Além dos elementos genéticos acima descritos, as microcápsulas compreenderão componentes adicionais requeridos para a realização do processo de ordenamento. Outros componentes do sistema podem compreender, por exemplo, aqueles necessários para transcrição e/ou tradução do elemento genético. Estes são seleccionados tendo em vista os requisitos de um sistema específico a partir do seguinte; um tampão adequado, um sistema de transcrição/replicação in vítro e/ou um sistema de tradução in vitro contendo todos os ingredientes necessários, enzimas e 34 ácidos nucleicos cofactores, ARN polimerase, nucleotídeos, (naturais ou sintéticos), ARNs de transferência, ribossomas e aminoácidos, e os substratos da reacção de interesse para permitir a selecção do produto génico modificado.
Um tampão adequado será aquele em que todos os componentes desejados do sistema biológico estejam activos e dependerão, por conseguinte, dos requisitos de cada sistema de reacção especifico. São conhecidos na técnica tampões adequados para reacções biológicas e/ou quimicas e são proporcionados métodos em diversos textos de laboratório, tais como Sambrook et al., 1989. 0 sistema de tradução in vitro compreenderá, normalmente, um extracto celular, tipicamente de bactérias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), reticulócitos de coelho (Pelham e Jackson, 1976), ou gérmen de trigo (Anderson et al., 1983). Estão disponíveis comercialmente muitos sistemas adequados (por exemplo de Promega) incluindo alguns que permitirão a transcrição/tradução conjugada (todos os sistemas bacterianos e os sistemas de reticulócito e extracto TNT™ de gérmen de trigo de Promega). A mistura utilizada de aminoácidos pode incluir, se desejado, aminoácidos sintéticos, para aumentar o possível número ou variedade de proteínas produzidas na biblioteca. Isto pode ser realizado carregando tARNs com aminoácidos artificiais e utilizando estes tARNs na tradução in vitro das proteínas a seleccionar (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).
Após cada ciclo de selecção, o enriquecimento do agregado de elementos genéticos daqueles codificando as moléculas de interesse pode ser ensaiado por transcrição/replicação in vitro 35 não compartimentada ou por reacções conjugadas de transcrição/tradução. 0 agregado seleccionado é clonado num vector plasmídico adequado e é produzido ARN ou proteína recombinante a partir dos clones individuais para purificação e ensaio adicionais.
Descreve-se igualmente um método de produção de um produto génico, após ter sido ordenado um elemento genético codificando o produto génico pelo método da invenção. 0 próprio elemento genético pode, manifestamente, ser directamente expresso por meios convencionais para produzir o produto génico. Contudo, podem ser empregues técnicas alternativas, como será evidente para os especialistas na técnica. Por exemplo, a informação genética incorporada no produto génico pode ser incorporada num vector de expressão adequado, e expressa a partir deste.
Descreve-se igualmente a utilização de técnicas convencionais de rastreio para identificar compostos que sejam capazes de interagir com os produtos génicos identificados pelo primeiro aspecto da invenção. Um produto génico codificando ácido nucleico pode ser incorporado num vector e introduzido em células hospedeiras adequadas para a produção de linhas celulares transformadas que expressam o produto génico. As linhas celulares resultantes podem depois ser produzidas para fins de análise qualitativa e/ou quantitativa reproduzível do(s) efeito(s) de potenciais fármacos afectando a função de produto génico. Deste modo, células de expressão de produto génico podem ser empregues para a identificação de compostos, particularmente compostos de baixo peso molecular, que modulam a função de produto génico. Deste modo, células hospedeiras expressando produto génico são úteis para o rastreio de fármacos. Descreve-se igualmente um método para a identificação de compostos que 36 modulam a actividade do produto génico, o referido método compreendendo a exposição das células contendo ADN heterólogo codificando produto génico, em que as referidas células produzem produto génico funcional, a pelo menos um composto ou mistura de compostos ou de sinal cuja capacidade para modular a actividade do referido produto génico se procura determinar, e monitorizar subsequentemente as referidas células para alterações causadas pela referida modulação. Um tal ensaio possibilita a identificação de moduladores, tais como agonistas, antagonistas e moduladores alostéricos do produto génico. Como aqui utilizado, um composto ou sinal que modula a actividade de produto génico refere-se a um composto que altera a actividade de produto génico de tal modo que a actividade de produto génico seja diferente na presença do composto ou do sinal (em comparação à ausência do referido composto ou sinal).
Ensaios de rastreio baseados em células podem ser concebidos pela construção de linhas celulares em que a expressão de uma proteína repórter, i. e., uma proteína facilmente ensaiável, tal como b galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT) ou luciferase, está dependente do produto génico. Um tal ensaio possibilita a detecção de compostos que modulam directamente a função de produto génico, tal como compostos que antagonizam o produto génico, ou compostos que inibem ou potenciam outras funções celulares requeridas para a actividade de produto génico. É igualmente descrito um método para afectar de modo exógeno processos dependentes de produto génico ocorrendo em células. Células hospedeiras recombinantes produtoras de produto génico, e. g., células de mamífero, podem ser colocadas em contacto com um composto de teste, e o(s) seu(s) efeito (s) 37 modulador(es) podem, depois, ser avaliados pela comparação da resposta mediada por produto génico na presença e ausência de composto de teste, ou relacionando a resposta mediada por produto génico de células de teste, ou células de controlo (i. e., células que não expressam produto génico), com a presença do composto.
Descreve-se igualmente um método de optimização de um processo de produção que envolve, pelo menos, uma etapa a qual é facilitada por um polipeptideo. Por exemplo, a etapa pode ser uma etapa catalítica, a qual é facilitada por uma enzima. Deste modo, a invenção proporciona um método de preparação de um composto ou compostos compreendendo as etapas de: (a) proporcionar um protocolo de síntese em que pelo menos uma etapa é catalisada por um polipeptideo; (b) preparar elementos genéticos codificando variantes do polipeptideo que facilitem esta etapa; (c) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos elementos genéticos que os codificam; (d) compartimentar os elementos genéticos em microcápsulas; (e) ordenar os elementos genéticos que produzem produto(s) génico(s) polipeptidico(s) possuindo a actividade desejada; e (f) preparar o composto ou compostos utilizando o produto génico polipeptidico identificado em (e) para facilitar a etapa relevante da sintese. 38
Segundo a invenção, enzimas envolvidas na preparação de um composto podem ser optimizadas por selecção para actividade óptima. 0 processo envolve a preparação de variantes do polipeptideo a rastrear, que se equipara a uma biblioteca de polipeptideos como aqui referido. Os variantes podem ser preparados da mesma forma que as bibliotecas aqui discutidas em qualquer outra parte.
(B) PROCESSOS DE SELECÇÃO 0 sistema pode ser configurado para seleccionar para ARN, ADN ou moléculas proteicas de produto génico com actividade catalítica, reguladora ou de ligação.
(i) SELECÇÃO DE AFINIDADE
No caso de selecção para um produto génico com afinidade para um ligando especifico, o elemento genético pode ser ligado ao produto génico na microcápsula por meio do ligando. Por conseguinte, apenas os produtos génicos com afinidade para o ligando se ligarão ao próprio elemento genético e, por conseguinte, apenas os elementos genéticos que produzam produto activo serão retidos na etapa de selecção. Nesta forma de realização, o elemento genético compreenderá, deste modo, um ácido nucleico codificando o produto génico ligado a um ligando para o produto génico.
Nesta forma de realização, a totalidade dos produtos génicos a seleccionar contém um putativo domínio de ligação, para o qual devem ser seleccionados, e uma característica comum 39 - uma marca. 0 elemento genético em cada microcápsula está fisicamente ligado ao ligando. Se o produto génico produzido a partir do elemento genético possuir afinidade para o ligando, ligar-se-á a ele e ficará fisicamente ligado ao mesmo elemento genético que o codificou, tendo como resultado a 'marcação' do elemento genético. No fim da reacção, todas as microcápsulas são combinadas, e todos os elementos genéticos e produtos génicos são agregados conjuntamente num ambiente. Elementos genéticos codificando produtos génicos exibindo a ligação desejada podem ser seleccionados por purificação de afinidade utilizando uma molécula que se liga especificamente, ou que reage especificamente, com a "marca".
Numa forma de realização alternativa, os elementos genéticos podem ser ordenados com base em que o produto génico, que se liga ao ligando, apenas oculta o ligando, por exemplo, de agentes de ligação adicionais. Nesta eventualidade, o elemento genético, em vez de ser retido durante uma etapa de purificação de afinidade, pode ser selectivamente eluido enquanto outros elementos genéticos estão ligados.
Os produtos génicos, juntamente com os elementos genéticos ligados, são ordenados como resultado da ligação de um ligando a produtos génicos possuindo a actividade desejada. Por exemplo, todos os produtos génicos podem conter uma região invariante que se liga, covalentemente ou não covalentemente, ao elemento genético e uma segunda região que é diversificada, de forma a gerar a actividade de ligação desejada. A ordenação por afinidade está dependente da presença de dois membros de um par de ligação, em condições tais que a ligação possa ocorrer. Pode ser utilizado qualquer par de 40 ligação para o efeito. Como aqui utilizado, o termo par de ligação refere-se a qualquer par de moléculas capazes de se ligarem uma à outra. Exemplos de pares de ligação que podem ser utilizados na presente invenção incluem um antigénio e um anticorpo ou seu fragmento capaz de se ligar ao antigénio, o par biotina-avidina/estreptavidina (Savage et al., 1994), um polipeptideo de ligação dependente de cálcio e seu ligando (e. g. calmodulina e um peptideo de ligação a calmodulina (Stofko et al., 1992; Montigiani et al., 1996)), pares de polipeptideos que se reúnem para formar um zipper de leucina (Tripet et al., 1996), histidinas (tipicamente peptideos de hexa-histidina) e Cu2+, Zn2+ e Ni2+ quelados, (e. g. Ni-NTA; Hochuli et al., 1987), proteínas de ligação a ARN e de ligação a ADN (Klug, 1995) incluindo aquelas contendo motivos dedo de zinco (Klug e Schwabe, 1995) e ADN metiltransferases (Anderson, 1993), e seus sítios de ligação de ácidos nucleicos.
(ii) CATÁLISE
Quando a selecção é para catálise, o elemento genético em cada microcápsula pode compreender o substrato da reacção. Se o elemento genético codificar um produto génico capaz de actuar como catalisador, o produto génico catalisará a conversão do substrato em produto. Por conseguinte, no fim da reacção, o elemento genético está fisicamente ligado ao produto da reacção catalisada. Quando as microcápsulas são combinadas e os reagentes agregados, os elementos genéticos codificando moléculas catalíticas podem ser enriquecidos pela selecção para qualquer propriedade específica do produto (Figura 1). 41
Por exemplo, o enriquecimento pode ser por purificação de afinidade utilizando uma molécula (e. g., um anticorpo) que se liga especificamente ao produto. Igualmente, o produto génico pode possuir o efeito de modificação de um componente de ácido nucleico do elemento genético, por exemplo por metilação (ou desmetilação) ou mutação do ácido nucleico, tornando-o resistente ou susceptível ao ataque por nucleases, tais como endonucleases de restrição.
Alternativamente, a selecção pode ser realizada indirectamente pela ligação de uma primeira reacção a reacções subsequentes que tenham lugar na mesma microcápsula. 0 qual pode ser realizado através de duas formas gerais. Na primeira, o produto da primeira reacção poderia ser reagido ou ligado por uma molécula que não reage com o substrato da primeira reacção. Uma segunda reacção conjugada apenas prosseguirá na presença do produto da primeira reacção. Um elemento genético activo poderia, então, ser purificado por selecção para as propriedades do produto da segunda reacção.
Alternativamente, o produto da reacção seleccionada pode ser o substrato ou cofactor para uma segunda reacção catalisada por enzima. A enzima a catalisar a segunda reacção pode ser traduzida in situ nas microcápsulas ou incorporada na mistura de reacção antes da microencapsulação. Só quando prosseguir a primeira reacção é que a enzima conjugada gerará um produto seleccionável.
Este conceito de conjugação pode ser elaborado para incorporar múltiplas enzimas, utilizando cada uma como substrato o produto da reacção anterior. 0 que permite a selecção de enzimas que não reagirão com um substrato imobilizado. Pode ser 42 igualmente concebido para conferir sensibilidade aumentada por amplificação de sinal, se um produto de uma reacção for um catalisador ou um cofactor para uma segunda reacção ou série de reacções conduzindo a um produto seleccionável (ver, por exemplo, Johannsson e Bates, 1988; Johannsson, 1991) . Além disso, um sistema de cascata enzimática pode ser baseado na produção de um activador para uma enzima ou na destruição de um inibidor enzimático (ver Mize et al., 1989). A conjugação possui igualmente a vantagem de que um sistema de selecção comum pode ser utilizado para todo um grupo de enzimas que geram o mesmo produto e permite a selecção de transformações químicas complicadas que não podem ser realizadas numa única etapa.
Um tal método de conjugação possibilita, deste modo, a evolução de novas "vias metabólicas" in vitro numa forma progressiva, seleccionando e melhorando, primeiro uma etapa e depois a próxima. A estratégia de selecção baseia-se no produto final da via, para que todas as etapas antecedentes possam ser desenvolvidas independentemente ou sequencialmente sem estabelecer um novo sistema de selecção para cada etapa da reacção.
Expresso de forma alternativa, descreve-se um método de isolamento de um ou mais elementos genéticos codificando um produto génico possuindo uma actividade catalítica desejada, compreendendo as etapas de: (1) expressar os elementos genéticos para dar os seus respectivos produtos génicos; (2) permitir que os produtos génicos catalisem a conversão de um substrato num produto, que pode ou não ser 43 directamente seleccionável, de acordo com a actividade desejada; (3) conjugar facultativamente a primeira reacção a uma ou mais reacções subsequentes, sendo cada reacção modulada pelo produto das reacções anteriores, e conduzindo à criação de um produto final seleccionável; (4) ligar o produto seleccionável de catálise aos elementos genéticos por: a) conjugar um substrato aos elementos genéticos, de tal modo que o produto permaneça associado com os elementos genéticos, ou b) reagir ou ligar o produto seleccionável aos elementos genéticos por meio de uma "marca" molecular adequada ligada ao substrato que permanece no produto, ou c) conjugar o produto seleccionável (mas não o substrato) aos elementos genéticos por meio de uma reacção especifica de produto ou interacção com o produto; e (5) seleccionar o produto de catálise, juntamente com o elemento genético ao qual está ligado por meio de uma reacção específica ou interacção com o produto, ou por purificação de afinidade utilizando uma "marca" molecular adequada ligada ao produto de catálise, em que nas etapas (1) a (4) cada elemento genético e respectivo produto génico estão contidos no interior de uma microcápsula. 44
(iii) REGULAÇÃO
Um sistema semelhante pode ser utilizado para seleccionar para propriedades reguladoras de enzimas.
No caso de selecção para uma molécula reguladora que actua como um activador ou inibidor de um processo bioquímico, os componentes do processo bioquímico podem ser traduzidos in situ em cada microcápsula ou podem ser incorporados na mistura de reacção antes da microencapsulação. Se o elemento genético seleccionado for para codificar um activador, a selecção pode ser realizada para o produto da reacção regulada, como acima descrito em relação à catálise. Se for desejado um inibidor, a selecção pode ser para uma propriedade química específica do substrato da reacção regulada.
Descreve-se, por conseguinte, um método de ordenamento de um ou mais elementos genéticos codificando para um produto génico exibindo uma actividade reguladora desejada, compreendendo as etapas de: (1) expressar elementos genéticos para dar os seus respectivos produtos génicos; (2) permitir aos produtos génicos activar ou inibir uma reacção bioquímica, ou sequência de reacções conjugadas, em conformidade com a actividade desejada, num modo que permita a geração ou sobrevivência de uma molécula seleccionável; 45 (3) ligar a molécula seleccionável aos elementos genéticos por a) ter a molécula seleccionável, ou o substrato a partir do qual deriva, ligada aos elementos genéticos, ou b) reagir ou ligar o produto seleccionável aos elementos genéticos, por meio de uma "marca" molecular adequada ligada ao substrato que permanece no produto, ou c) conjugar o produto de catálise (mas não o substrato) aos elementos genéticos, por meio de uma reacção especifica de produto ou interacção com o produto; (4) seleccionar o produto seleccionável, juntamente com o elemento genético ao qual está ligado, por meio de uma reacção especifica ou interacção com o produto seleccionável, ou por purificação de afinidade utilizando uma "marca" molecular adequada ligada ao produto de catálise, em que nas etapas (1) a (4) cada elemento genético e respectivo produto génico estão contidos no interior de uma microcápsula.
(iv) ORDENAÇÃO DE MICROCÁPSULA A invenção proporciona para a ordenação de microcápsulas intactas, nos casos em que é possibilitada pelas técnicas de ordenamento empregues. As microcápsulas podem ser ordenadas como 46 tal quando a alteração induzida pelo produto génico desejado ocorre ou se manifesta ela própria à superfície da microcápsula ou é detectada a partir do exterior da microcápsula. A alteração pode ser causada pela acção directa do produto génico, ou indirecta, em que uma série de reacções, uma ou mais das quais envolve o produto génico possuindo a actividade desejada, conduz à alteração. Por exemplo, a microcápsula pode ser configurada de modo a que o produto génico seja apresentado à sua superfície e, deste modo, acessível a reagentes. No caso da microcápsula ser uma microcápsula membranosa, o produto génico pode ser alvejado ou pode causar o alvejamento de uma molécula para a membrana da microcápsula. 0 que pode ser alcançado, por exemplo, empregando a um sequência de localização de membrana, tais como aquelas derivadas de proteínas de membrana, que favorecerão a incorporação de uma molécula fusionada ou ligada à membrana da microcápsula. Alternativamente, no caso da microcápsula ser formada por partição de fases, tal como com emulsões de água-em-óleo, uma molécula possuindo partes que sejam mais solúveis na fase extra-capsular organizar-se-ão elas próprias de modo a estarem presentes na fronteira da microcápsula.
Contudo, num aspecto preferido da invenção, a ordenação de microcápsulas é aplicada a sistemas de ordenamento que se baseiam numa alteração nas propriedades ópticas da microcápsula, por exemplo características de absorção ou de emissão destas, por exemplo alteração nas propriedades ópticas da microcápsula resultantes de uma reacção conduzindo a alterações na absorvência, luminescência, fosforescência ou fluorescência associadas à microcápsula. Todas estas propriedades estão incluídas no termo "ópticas". Num tal caso, as microcápsulas podem ser ordenadas por luminescência, fluorescência ou ordenamento activada por fosforescência. Numa forma de 47 realização extremamente preferida, é empregue a ordenação activada por fluorescência para ordenar microcápsulas em que a produção de um produto génico possuindo uma actividade desejada é acompanhada pela produção de uma molécula fluorescente na célula. Por exemplo, o próprio produto génico pode ser fluorescente, por exemplo uma proteína fluorescente tal como GFP. Alternativamente, o produto génico pode incluir ou modificar a fluorescência de outra molécula, tal como ligando-se a ela ou reagindo com ela.
(v) IDENTIFICAÇÃO DE MICROCÁPSULA
As microcápsulas podem ser identificadas em virtude de uma alteração induzida pelo produto génico desejado que ocorre ou se manifesta ela própria à superfície da microcápsula ou é detectada a partir do exterior como descrito na secção iii (Ordenamento de Microcápsula). Esta alteração, quando identificada, é utilizada para desencadear a modificação do gene no interior do compartimento. Num aspecto preferido da invenção, a identificação da microcápsula baseia-se numa alteração nas propriedades ópticas da microcápsula resultantes de uma reacção conduzindo a luminescência, fosforescência ou fluorescência no interior da microcápsula. A modificação do gene no interior das microcápsulas seria desencadeada pela identificação de luminescência, fosforescência ou fluorescência. Por exemplo, a identificação de luminescência, fosforescência ou fluorescência pode desencadear o bombardeamento do compartimento com fotões (ou outras partículas ou ondas) que conduz a modificação do elemento genético. Um processo semelhante foi descrito anteriormente para a ordenação rápida de células (Keij et al., 1994). A modificação do elemento genético pode resultar, por 48 exemplo, da acoplagem de uma "marca" molecular, enjaulada por um grupo protector fotolábil aos elementos genéticos: o bombardeamento com fotões de um comprimento de onda apropriado conduz à remoção da jaula. Posteriormente, todas as microcápsulas são combinadas e os elementos genéticos são agregados conjuntamente num ambiente. Elementos genéticos codificando produtos génicos exibindo a actividade desejada podem ser seleccionados por purificação de afinidade utilizando uma molécula que se liga especificamente, ou que reage especificamente, com a "marca".
(vi) PROCESSO MULTI-ETAPA
Será igualmente entendido que, de acordo com a presente invenção, não é necessário que todos os processos de transcrição/replicação e/ou tradução, e selecção se processem numa única etapa, com todas as reacções a ter lugar numa microcápsula. 0 processo de selecção pode compreender duas ou mais etapas. Na primeira, a transcrição/replicação e/ou tradução de cada elemento genético de uma biblioteca de elementos genéticos pode realizar-se numa primeira microcápsula. Cada produto génico é, então, ligado ao elemento genético que o codificou (que reside na mesma microcápsula). As microcápsulas são depois quebradas e os elementos genéticos ligados aos seus respectivos produtos génicos opcionalmente purificados. Alternativamente, os elementos genéticos podem ser ligados aos seus respectivos produtos génicos utilizando métodos que não se baseiam na encapsulação. Por exemplo, apresentação de fago (Smith, G.P., 1985), apresentação de polissoma (Mattheakkis et al., 1994), fusão ARN-peptideo (Roberts e Szostak, 1997) ou fusão peptideo repressor lac (Cull, et al., 1992). 49
Na segunda etapa do processo, cada elemento genético purificado ligado ao seu produto génico é integrado numa segunda microcápsula contendo componentes da reacção a seleccionar. Esta reacção é, então, iniciada. Após a conclusão das reacções, as microcápsulas são quebradas outra vez e são seleccionados os elementos genéticos modificados. No caso de complicadas reacções multi-etapa em que estão envolvidos muitos componentes individuais e etapas de reacção, uma ou mais etapas intermédias podem ser realizadas entre a etapa inicial de criação e ligação de produto génico ao elemento génico, e a etapa final de geração da alteração seleccionável no elemento genético.
(vii) SELECÇÃO POR ACTIVAÇÃO DE EXPRESSÃO DE GENE REPÓRTER
IN SI TU 0 sistema pode ser configurado de modo a que a desejada actividade de ligação, catalítica ou reguladora codificada por um elemento genético conduza, directa ou indirectamente, à activação da expressão de um "gene repórter" que está presente em todas as microcápsulas. Apenas produtos génicos com a actividade desejada activam a expressão do gene repórter. A actividade resultante de expressão do gene repórter permite a selecçâo do elemento genético (ou do compartimento que o contém) por algum dos métodos aqui descritos.
Por exemplo, a activação do gene repórter pode ser o resultado de uma actividade de ligação do produto génico de maneira análoga, de certo modo, ao "sistema de duplo híbrido" (Fields e Song, 1989) . A activação pode, igualmente, resultar do produto de uma reacção catalisada por um produto génico 50 desejável. Por exemplo, o produto de reacção poderia ser um indutor transcricional do gene repórter. Por exemplo, poderia ser utilizada a arabinose para induzir a transcrição do promotor araBAD. A actividade do produto génico desejável poderia igualmente resultar na modificação de um factor de transcrição, resultando na expressão do gene repórter. Por exemplo, se o produto génico desejado for uma cinase ou fosfatase, a fosforilação ou desfosforilação de um factor de transcrição pode conduzir a activação de expressão do gene repórter.
(viii) AMPLIFICAÇÃO
De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, o método compreende a etapa adicional de amplificação dos elementos genéticos. A amplificação selectiva pode ser utilizada como um meio de enriquecimento dos elementos genéticos codificando o produto génico desejado.
Em todas as configurações supracitadas, o material genético compreendido nos elementos genéticos pode ser amplificado e o processo repetido em etapas iterativas. A amplificação pode ser pela reacção de polimerização em cadeia (Saiki et al., 1988) ou pela utilização de uma diversidade de outras técnicas de amplificação génica incluindo; amplificação de ζ)β replicase (Ca-hill, Foster e Mahan, 1991; Chetverin e Spirin, 1995; Katanaev, Kumasov e Spirin, 1995); a reacção de ligase em cadeia (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); o sistema de replicação de sequência auto-sustentado (Fahy, Kwoh e Gingeras, 1991) e amplificação de deslocamento de cadeia (Walker et al., 1992). 51
(ix) COMPARTIMENTAÇÃO
Descreve-se igualmente um método para compartimentação de um elemento genético e expressão do elemento genético para formar o seu produto génico no interior do compartimento, compreendendo as etapas de: (a) formar uma solução aquosa compreendendo o elemento genético e os componentes necessários à sua expressão para formar o seu produto génico; (b) microencapsular a solução de forma a formar uma microcápsula discreta compreendendo o elemento genético; e (c) expor a microcápsula a condições adequadas para a expressão do elemento genético para prosseguir com a formação do seu produto génico. Técnicas de microencapsulação adequadas estão descritas pormenorizadamente na descrição geral precedente.
Uma biblioteca de elementos genéticos codificando um repertório de produtos génicos pode ser encapsulado pelo método acima exposto, e os elementos genéticos expressos para produzirem os seus respectivos produtos génicos, em conformidade com a invenção. A microencapsulação pode ser alcançada pela formação de uma emulsão de água-em-óleo da solução aquosa compreendendo os elementos genéticos.
Diversos aspectos e formas de realização da presente invenção são ilustrados nos exemplos seguintes. Será entendido 52 que a modificação de pormenor pode ser feita sem contudo alterar o âmbito da invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1. A produção de microcápsulas aquosas de aprox. 2 pm num sistema de emulsão de água-em-óleo.
Microcápsulas dentro da gama preferida de tamanhos da presente invenção podem ser geradas utilizando um sistema de emulsão de água-em-óleo. Óleo mineral branco leve (Sigma; M-3516) é aqui utilizado como a fase contínua e a emulsão é estabilizada por emulsionantes de monooleato de sorbitano (Span 80, Fluka; 85548) e monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80, Sigma Ultra; P-8074) e, nalguns casos, igualmente com desoxicolato de sódio a 0,5% p/v (Fluka; 30970). A fase oleosa é preparada de fresco pela dissolução de 4,5% (v/v) de Span 80 (Fluka) em óleo mineral (Sigma, #M-5904) seguida por 0,5% (v/v) de Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074). Misturas de reacção arrefecidas em gelo in vitro (50 pL) são progressivamente adicionadas (em 5 aliquotas de 10 pL durante ~ 2 minutos) a 0,95 mL de fase oleosa arrefecida em gelo num frasquinho de vidro de 5 mL, da Costar Biofreeze Vial (#2051), agitando simultaneamente com uma barra magnética (8x3 mm com um anel central; Scientific Industries International, Loughborough, UK) . Continua-se a agitar (a 1150 rpm) durante 1 minuto 53 adicional em gelo. Em algumas emulsões, a fase aquosa é suplementada com um tensioactivo aniónico - e. g., desoxicolato de sódio, colato de sódio, glicolato de sódio, e taurocolato de sódio, tipicamente a 0,5% (p/v).
Quando indicado, a emulsão é adicionalmente homogeneizada utilizando um dispersor Ultra-Turrax T25 (IKA) equipado com um instrumento de dispersão de 8 mm de diâmetro a 8K, 9K ou 13,5K rpm durante 1 minuto ou a 20K rpm durante 1 ou 5 minutos, em gelo. O que reduz o tamanho da microcápsula.
As reacções podem ser paradas e a emulsão quebrada como indicado nos exemplos individuais, por rotação a 3000 g durante 5 minutos e removendo a fase oleosa, deixando a emulsão concentrada no fundo do frasquinho de vidro. É adicionado tampão de paragem (tipicamente, 0,2 mL de ARN de levedura a 25 yg/mL em tampão W+B: NaCl a 1 M, Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,4) e são adicionados 2 mL de éter dietilico saturado de água e a mistura é sujeita a vórtice, brevemente centrifugada e a fase de éter removida. A fase aquosa é lavada com éter e seca (5 minutos num dispositivo Speedvac à temperatura ambiente). A distribuição de tamanho das goticulas aquosas nas emulsões foi determinada por difracção laser utilizando um instrumento Coulter LS230 Particle Size Analyser. Uma alíquota de emulsão, diluída de fresco (1:10) em óleo mineral, é adicionada à câmara de micro-volume contendo óleo mineral agitado. Os resultados são analisados com o modelo óptico de Mie incorporado no instrumento utilizando coeficientes de refracção de 1,468 para o óleo mineral e 1,350 para a fase aquosa. A distribuição de tamanho das goticulas aquosas na emulsão é 54 apresentada na Figura 2. A adição de desoxicolato de sódio não altera significativamente a distribuição de tamanho.
Exemplo 2.
Reacções de transcrição in vitro eficientes realizadas nas microcápsulas aquosas de uma emulsão de água-em-óleo.
Para produzir ARN a partir de ADN no interior de cada microcápsula, a única molécula de ADN presente no interior de cada microcápsula aquosa do sistema deve ser transcrita de forma eficiente. É aqui demonstrada a transcrição in vitro no interior das microcápsulas. 0 núcleo catalítico do intrão de auto-corte de Tetrahymena é uma ribozima muito estudada que pode catalisar uma diversidade de reacções de transferência de fosfoéster (Sag et al., 1986; Sag e Czech, 1986; Sag e Czech, 1986) . Por exemplo, um intrão modificado de Tetrahymena, sem o gancho ascendente PI da extremidade 5' e sem os ganchos ascendentes P9.1 e P9.2 em 3', pode funcionar como uma ARN ligase, ajustando eficientemente conjuntamente dois ou mais oligonucleotídeos alinhados numa cadeia molde (Green e Szostak, 1992). ADN codificando a ribozima Tetrahymena acima descrita é amplificado por PCR utilizando os iniciadores P2T7Ba (que se híbrida à região em gancho de P2 e acrescenta um promotor da T7 ARN polimerase) e P9Fo (que se híbrida à região em gancho de P9) . 0 que cria um fragmento de ADN de 331 pares de bases transportando o promotor da T7 ARN polimerase. Este fragmento é directamente purificado utilizando preparações Wizard PCR Preps 55 (Promega) e utilizado como molde para uma reacção de transcrição in vitro utilizando a T7 ARN polimerase. A transcrição in vitro é ensaiada durante um periodo inicial de 10 minutos durante o qual a taxa de reacção é essencialmente linear (Chamberlin e Ring, 1973). As condições de reacção para a transcrição são como descrito por Wyatt et al., 1991. É utilizada a incorporação de [γ 32P] UTP para ensaiar a progressão da reacção.
Uma reacção de transcrição é preparada num volume de 200pL e dividida em 2 aliquotas, contendo cada 3 x 1011 moléculas de ADN (5 nM) . Uma aliquota de lOOpL é adicionada a 2 mL de óleo mineral leve da Sigma contendo 4,5% de Span 80 e 0,5% de Tween 80 e homogeneizada durante 5 minutos com um dispersor Ultra-Turrax T25 a 20000 rpm como no Exemplo 1. Com base no volume médio de microcápsula nestas emulsões (2,8 x 10‘19 m3 para uma microcápsula de 0,81 pm de diâmetro) a reacção de 100 pL seria dividida em 3,6 x 1011 microcápsulas. Deste modo, deverá existir, em média, 1 molécula de ADN por microcápsula.
Ambas as aliquotas são incubadas em banho-maria a 37 °C. Amostras de 0,5 mL da emulsão são removidas, não só antes do inicio da incubação, e também 10, minutos após, e colocadas em gelo. Simultaneamente, amostras semelhantes de 25pL são removidas das reacções de controlo não emulsionadas. As emulsões são quebradas e as reacções paradas com 0,5 mL de EDTA (50 mM) e 2 mL de éter dietilico saturado de água como descrito no Exemplo 1. São depois adicionados lOOpL de ADN de esperma de salmão (500 pg/mL) em EDTA a 20 mM. São depois removidas três aliquotas 56 de lOOpL, tanto das emulsões como de controlos, e o ARN marcado é ensaiado por precipitação de TCA e contagem de cintilação. A taxa de transcrição é obtida como o aumento de cpm perceptivel como ácido durante a incubação de 10 minutos a 37 °C. Na reacção de controlo não emulsionada existem 442000 cpm de material perceptivel como ácido comparado com 147000 cpm na emulsão. Deste modo, a taxa de transcrição na emulsão é 33% da verificada na reacção de controlo não emulsionada.
Por conseguinte, este processo demonstra que o ARN pode ser eficientemente sintetizado por T7 ARN polimerase nas microcápsulas aquosas de uma emulsão de água-em-óleo.
Exemplo 3.
Reacções conjugadas de transcrição/tradução in vitro eficientes realizadas nas microcápsulas aquosas de uma emulsão de água-em-óleo.
Para sintetizar proteinas utilizando o processo da presente invenção, a tradução deve estar activa nas microcápsulas aquosas da emulsão de água-em-óleo aqui descrita. É aqui mostrado como uma proteina (di-hidrofolato redutase de E. coli) pode ser eficientemente produzida a partir de ADN nas microcápsulas aquosas de um sistema de emulsão de água-em-óleo utilizando um sistema conjugado de transcrição/tradução. O gene folA de E. coli codificando a di-hidrofolato redutase (DHFR) é amplificado por PCR utilizando os 57 oligonucleotídeos EDHFRFo e EDHFRBa. Este ADN é depois clonado no vector pGEM-4Z (Promega) digerido com HindiII e Kpnl a jusante, tanto do promotor lac, como do promotor de T7 ARN polimerase. 0 oligonucleotideo EDHFRBa acrescenta o eficiente sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7 a montante do codão de iniciação de DHFR. A sequenciação de ADN identifica um clone que possui a sequência nucleotidica correcta. Verifica-se que as bactérias transformadas com este clone (pGEM-folA), quando induzidas com IPTG, superexpressam DHFR activa (dirigida a partir do promotor lac) . 0 plasmideo pGEM-folA é em seguida amplificado por PCR utilizando os iniciadores LMB2 e LMB3 nas condições acima descritas para criar um fragmento de ADN de 649pb transportando o promotor de T7 ARN polimerase, o sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7 e o gene folA. Este fragmento de PCR é directamente purificado utilizando preparações Wizard PCR Preps (Promega) e utilizado para programar um sistema conjugado de transcrição/tradução procariótico in vitro concebido para moldes lineares (Lesley, Brow e Burgess, 1991) . É utilizada uma preparação comercial deste sistema (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) suplementada com T7 ARN polimerase. É preparada em gelo uma reacção de tradução de 300 μ L contendo 3 x 1012 moléculas de ADN. É adicionada T7 ARN polimerase (104 unidades) para dirigir a transcrição e a proteina traduzida é marcada pela adição de metionina [35S]. Uma aliquota de 150 pL desta reacção é adicionada a 2,85 mL de óleo mineral 58 leve da Sigma contendo 4,5% de Span 80 e 0,5% de Tween 80 e homogeneizada durante 1 minuto com um dispersor Ultra-Turrax T25 a 20000 rpm, como no Exemplo 1. A outra alíquota não é emulsionada.
Com base no volume médio de microcápsula nas emulsões (1,1 x 10"18 m3 para uma microcápsula de 1,29 pm de diâmetro) a reacção de 150 pL seria dividida em 1,3 x 1011 microcápsulas) . Deste modo, deverão existir aproximadamente 11 moléculas de ADN por microcápsula. São removidas da mistura de reacção da emulsão quatro aliquotas de 0,5 mL. Uma aliquota é imediatamente colocada em gelo e as outras três, antes de serem colocadas em gelo, são incubadas em banho-maria a 25 °C durante 2 horas. São igualmente removidas da mistura de reacção não emulsionada quatro amostras de 25 μL; uma é imediatamente colocada em gelo e as outras três são incubadas em banho-maria a 25 °C durante 2 horas e a seguir colocadas em gelo.
As emulsões são rotacionadas numa microcentrifugadora a 13000 r.p.m. durante 5 minutos a 4 °C e o óleo mineral removido deixando a emulsão concentrada (mas ainda intacta) no fundo do tubo. Após uma breve re-rotação e remoção de qualquer óleo mineral adicional, a emulsão é quebrada e qualquer tradução adicional parada pela adição de 100 pL de água contendo puromicina a 125 pg/mL, e 1 mL de éter dietilico saturado de água. Esta mistura é sujeita a vórtice e re-rotacionada numa microcentrifugadora a 13000 r.p.m. durante 1 minuto a 4 °C. Em seguida, o éter e o óleo mineral dissolvido são removidos por aspiração e a extracção repetida com 1 mL adicional de éter. 59
Qualquer éter remanescente é afastado por rotação num dispositivo Speedvac durante 5 minutos à temperatura ambiente. São igualmente adicionados às reacções de controlo de 25 pL não emulsionadas 100 pL de água contendo puromicina a 125 pg/mL. 25 pL de cada uma das amostras são, em seguida, precipitados com acetona e corridos num gel de SDS-PAGE a 20%, de acordo com as instruções fornecidas pelos fabricantes do sistema de transcrição/tradução in vitro (Promega). O gel é seco e sondado utilizando um dispositivo Phosphorimager (Molecular Dynamics). É vista uma única banda forte com o esperado peso molecular de DHFR (18 Kd) , tanto nas reacções realizadas em emulsões, como nas de controlo. Esta banda é rigorosamente quantificada.
Nas reacções emulsionadas, a área média sob o pico de 18 Kd tem 15073 unidades, enquanto a área média sob o mesmo pico nas reacções de controlo não emulsionadas tem 18990 unidades. Deste modo, calcula-se uma quantidade de proteína de DHFR nas reacções emulsionadas que é 79% da verificada nas reacções de controlo não emulsionadas. O que indica, por conseguinte, que o sistema de transcrição/tradução está funcional no sistema de emulsão de água-em-óleo da presente invenção. 60
Exemplo 4. A Di-hidrofolato redutase produzida utilizando as reacções conjugadas de transcrição/tradução in vitro está activa. É aqui demonstrado que a proteína (di-hidrofolato redutase de E. coli) pode ser eficientemente produzida numa forma cataliticamente activa por transcrição/tradução conjugada do gene folA nas microcápsulas aquosas de um sistema de emulsão de água-em-óleo. Neste ensaio, é utilizada uma emulsão compreendendo microcápsulas abaixo do tamanho óptimo; demonstra-se que a actividade de DHFR é mais elevada nos tamanhos maiores de microcápsula.
Reacções de tradução de 175 pL (não marcadas) são preparadas em gelo contendo 2 x 1011, 6 x 1012 ou 1,8 x 1012 moléculas de ADN do molde de folA utilizado no Exemplo 3, ou sem ADN. É adicionada a cada reacção T7 ARN polimerase (6 x 103 unidades) para dirigir a transcrição.
Uma alíquota de 100 μL de cada reacção é adicionada a 1,9 mL de óleo mineral leve da Sigma contendo 4,5% de Span 80 e 0,5% de Tween 80 e homogeneizada durante 1 minuto ou 5 minutos com um homogeneizador Ultra-Turrax T25 equipado com um instrumento de dispersão de 8 mm de diâmetro, a 20000 rpm como no Exemplo 1. Após homogeneização durante 1 minuto, o diâmetro médio de partículas (em volume) é de 1,30 pm (1,28 pm de mediana). 98% em volume da fase interna (aquosa) está presente em partículas variando desde 0,63 pm a 2,12 pm. Após homogeneização durante 5 minutos, o diâmetro médio de microcápsulas (em volume) é de 0,81 pm (0,79 pm de mediana) e 98% em volume da fase interna 61 (aquosa) está presente em partículas, variando desde 0,41 ym a 1,38 ym.
Com base no volume médio de microcápsula nas emulsões de 1 minuto (1,1 x 10“18 m3 para uma microcápsula de 1,299 ym de diâmetro) a reacção de 100 yL seria dividida em 8,7 x IO10 microcápsulas). Deste modo, deverão existir aproximadamente 1,3, 3,9 ou 11,8 moléculas de ADN por microcápsula.
Com base no volume médio de microcápsula nas emulsões de 5 min (2,8 x 10”19 m3 para uma microcápsula de 0,81 ym de diâmetro) a reacção de 100 yL seria dividida em 3,6 x 1011 microcápsulas). Deste modo, deverão existir aproximadamente 0,3, 1,0 ou 2,9 moléculas de ADN por microcápsula.
As emulsões e a mistura de reacção não emulsionada são incubadas em banho-maria a 25 °C. Amostras de 0,5 mL da emulsão são removidas imediatamente antes do início da incubação e após 2 horas e colocadas em gelo. Simultaneamente, amostras de 25 yL são removidas das reacções de controlo não emulsionadas.
As emulsões são rotacionadas numa microcentrifugadora a 13000 r.p.m. durante 5 min. a 4 °C e o óleo mineral removido por aspiração, deixando a emulsão concentrada (mas ainda intacta) no fundo do tubo. Após uma breve re-rotação e remoção de qualquer óleo mineral adicional, a emulsão é quebrada e qualquer tradução adicional parada pela adição de lOOyL de Tampão A (Imidazole a 100 mM, pH 7,0, β-mercaptoetanol a 10 mM), contendo puromicina a 125 yg/mL e 1 mL de éter dietílico saturado de água. A mistura é sujeita a vórtice e rotacionada numa microcentrifugadora a 13000 r.p.m. durante 1 min. a 4 °C. O éter e o óleo mineral dissolvido 62 são removidos por aspiração e a extracção repetida com 1 mL adicional de éter. Qualquer éter remanescente é afastado por rotação num dispositivo Speedvac durante 5 minutos a temperatura ambiente. São igualmente adicionados às reacções de controlo de 25 pL não emulsionadas 100 pL de Tampão A contendo puromicina (125 pg/mL). A actividade de di-hidrofolato redutase é ensaiada pela monitorização espectrofotométrica da oxidação de NADPH a NADP a 340 nm durante um período de tempo de 10 minutos como descrito por Williams et al., 1979; Ma et al., 1993. São adicionados 10 pL de cada reacção de tradução in vitro parada a 150 pL de Tampão A (Imidazole a 100 mM, pH 7,0, β-mercaptoetanol a 10 mM) e 20 pL de NADPH a lmM. 1 minuto depois são adicionados 20 pL de di-hidrofolato (1 mM) (H2F) e a reacção monitorizada a 340 nm utilizando um leitor de microplacas, modelo ThermoMax (Molecular Devices). A actividade é calculada pelas velocidades iniciais sob condições de So » KM (umax) · A actividade de fundo no extracto S30 é subtraída de todas as amostras. A actividade de DHFR gerada nas emulsões obtém-se a partir da diferença na actividade medida às 0 horas e 2 horas de incubação. Não ocorreu nenhum aumento na oxidação de NADPH entre as amostras da hora 0 e hora 2 quando é adicionado metotrexato (um inibidor específico de DHFR) a 0,1 pM, demonstrando que todo o aumento observado na oxidação de NADPH se deve à DHFR produzida nas reacções de tradução in vitro.
Utilizando homogeneização de 1 minuto a 20000 rpm, a actividade de DHFR gerada nas emulsões é 31% da verificada nas reacções de controlo não emulsionadas com 1,3 moléculas de ADN 63 por microcápsula; 45% com 3,9 moléculas de ADN por microcápsula; e 84% com 11,8 moléculas de ADN por microcápsula.
Utilizando homogeneização de 5 minutos a 20000 rpm, a actividade de DHFR gerada nas emulsões é 7% da verificada nas reacções de controlo não emulsionadas com 0,3 moléculas de ADN por microcápsula; 15% com 1 molécula de ADN por microcápsula; e 35% com 2,9 moléculas de ADN por microcápsula, em média.
Assumindo que o número de regeneração de DHFR é como descrito por Posner et ai., 1996, esta corresponde a um rendimento à concentração mais elevada de ADN de 6,3 yg (340pmole) de DHFR por 100 yL de reacção (controlo não emulsionado), 1,98 yg (104 pmole) de DHFR por lOOyL de reacção (emulsionada durante 1 minuto), ou 0,46 yg (24,8 pmole) por 100 yL de reacção (emulsionada durante 5 minutos). O que equivale a 74 moléculas de DHFR por microcápsula na emulsões de 1 minuto e 44 moléculas por microcápsula nas emulsões de 5 minutos (assumindo que todas as microcápsulas são de tamanho médio) . A actividade de DHFR resultante da transcrição/tradução conjugada de genes folA é igualmente medida nas microcápsulas maiores produzidas apenas por agitação, ou por agitação seguida de homogeneização adicional com um dispersor Ultra-Turrax T25 a 8000 rpm, 9000 rpm, ou 13500 rpm durante 1 minuto como descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Figura 2b. A concentração utilizada de genes folA (2,5 nM) dá uma média de 1, 1,5 e 4,8 elementos genéticos por goticula nas emulsões homogeneizadas a 13500 rpm, 9500 rpm e 8000 rpm, respectivamente, e uma média de 14 elementos genéticos por goticula na emulsão preparada apenas por agitação. A adição de 64 desoxicolato de sódio (0,5%) à mistura de reacção de tradução in vitro não afecta significativamente a actividade de DHFR observada nas emulsões quebradas.
Exemplo 5.
Ligação de um substrato imobilizado a um elemento genético por meio de uma proteína de elevado peso molecular.
Para ligar múltiplas moléculas de substrato imobilizadas a um fragmento de ADN compreendendo o gene folA, o fragmento de ADN é, em primeiro lugar, biotinilado e depois conjugado a um complexo de avidina com apoferritina. A apoferritina de baço de cavalo é uma molécula proteica grande, quase esférica, de 12,5 nm de diâmetro que proporciona, por conseguinte, múltiplos sítios que podem ser derivatizados com substrato (e. g., o grupo ε-amino de lisinas de superfície). 0 plasmídeo pGEM-folA codificando DHFR de E. coli é amplificado por PCR utilizando os iniciadores LMB3 e LMB2 biotinilado em 5' (LMB2-Biotina) para criar um fragmento de ADN biotinilado de 649 pb transportando o promotor de T7 ARN polimerase, o sítio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7 e o gene folA (ver Exemplo 3) . O ADN é marcado radioactivamente suplementando a mistura de reacção de PCR de 500 yL com 100 pCi [a-32P]dCTP (Amersham; 3000 Ci/mmol). O fragmento de PCR biotinilado é directamente purificado utilizando preparações Wizard PCR Preps (Promega) e a concentração determinada espectrofotometricamente. A percentagem de ADN biotinilado é ensaiada pela ligação a Streptavidin M-280 Dynabeads (Dynal) e contagem de cintilação. Utilizando esta técnica, determinou-se que 83% do ADN é biotinilado. 65 0 ferro sequestrado é removido a partir de um conjugado comercial de avidina e ferritina (Avidina-Ferritina; aprox. 1,1 mole de ferritina por mole de avidina; Sigma) por diálise, de um dia para o outro (4°C), de uma solução de avidina-ferritina em PBS (1 mg/mL) contra ácido tioglicólico a 0,12 M, pH 4,25, seguida por diálise de 24 horas contra PBS (4°C) como descrito por Kadir e Moore, 1990. A remoção de ferro é verificada por análise dos espectros de absorvência (Fe (III) sequestrado absorve fortemente a 310-360 nm) . São incubadas 0,3 pmole de ADN biotinilado marcado radioactivamente com diversas razões molares de avidina-apoferritina em PBS (9 pL de volume total) durante 30 minutos a temperatura ambiente. É removida uma aliquota de 4,5 pL e a percentagem de ADN complexado com avidina-apoferritina ensaiada utilizando um ensaio de deslocamento de banda num gel de agarose a 1,5% como descrito por Berman et al., 1987. O gel é depois seco e sondado utilizando um dispositivo Phosphorlmager (Molecular Dynamics). A percentagem de ADN permanecendo não deslocado (i. e. não complexado com avidina-apoferritina) é de 17% (avidina-apoferritina:ADN de razão molar 1:1), 15% (avidina-apoferritina : ADN de razão molar 5:1) ou 14% (avidina- apoferritina: ADN de razão molar 25:1). O que significa que mesmo a uma razão molar de 1:1 de avidina-apoferritina: ADN todo o ADN biotinilado está basicamente ligado. Não se observa deslocamento de banda quando o ADN biotinilado é misturado com apoferritina ou quando o ADN não biotinilado é misturado com avidina-apoferritina .
Os restantes 4,5 pL de ADN complexado com avidina-apoferritina são utilizados como molde para uma reacção de transcrição/tradução in vitro de 25 pL (E. coli S30 Extract 66
System for Linear Templates; Promega). Após 2 horas a 25 °C, a reacção é parada pela adição de 100 pL de Tampão A contendo puromicina (125 pg/mL). A actividade de di-hidrofolato redutase é ensaiada como acima pela monitorização espectrofotométrica da oxidação de NADPH a NADP a 340 nm durante um período de tempo de 10 minutos. São adicionados 10 pL de cada reacção de tradução in vitro a 150pL de Tampão A e 20 pL de NADPH (1 mM). 1 minuto depois são adicionados 20 pL de Di-hidrofolato (1 mM) (As emulsões foram quebradas e as reacções paradas com 0,5 mL de EDTA (50 mM) e 2 mL de éter dietílico saturado de água como descrito no Exemplo 1) e a reacção monitorizada a 340 nm utilizando um leitor de placas, modelo ThermoMax (Molecular Devices). Não se verificaram diferenças na actividade de DHFR, mesmo na razão mais elevada de avidina-apoferritina:ADN, em comparação com um controlo sem avidina-apoferritina adicionada. O que indica que a grande maioria do ADN pode ser complexado sem comprometer a eficiência da tradução in vitro.
Exemplo 6.
Tanto a transcrição-tradução in vitro como a actividade de DHFR são compatíveis no mesmo sistema.
Para seleccionar para a actividade de DHFR produzida in situ por transcrição-tradução conjugada, tanto a reacção de transcrição-tradução, como a DHFR devem estar activas no mesmo sistema tampão. 67
Um ensaio directo para actividade de DHFR num sistema completo de tradução in vitro de E. coli baseado na monitorização espectrofotométrica da oxidação de NADPH a NADP a 340 nm não é exequível em virtude da turbidez dos extractos de S30.
Contudo, é possível comprovar que a DHFR está activa no mesmo sistema tampão que na tradução in vitro. A DHFR de E. coli é obtida por indução de IPTG de bactérias contendo o plasmídeo pGEM-folA e purificada por afinidade numa coluna de metotrexato-Sepharose (Baccanari et al.r 1977). A actividade de DHFR é comparada em Tampão A como acima, ou numa mistura de tradução in vitro completa, com excepção da substituição de tampão de diálise de S30 (Lesley 1995) (Tris-acetato a 10 mM, pH 8,0, acetato de magnésio a 14 mM, acetato de potássio a 60 mM, DTT a lmM) pela fracção de S30. Em cada caso, o volume total de reacção é de 200 pL e a concentração de NADPH e Emulsões foram quebradas e as reacções foram paradas com 0,5 mL de EDTA (50 mM) e 2 mL de éter dietílico saturado de água como descrito no Exemplo 1 a 0,1 mM cada. As reacções são monitorizadas espectrofotometricamente a 340 nm. A adição de 1,75 pmole (1,3 m Unidades) de DHFR de E. coli dá taxas iniciais de -25,77 mOD/min (em Tampão A) e -11,24 mOD/min (em tampão de tradução), deste modo, a reacção é 44% tão eficiente no tampão de tradução como num tampão optimizado (tampão A).
Além disso, a presença dos substratos de DHFR (NADPH e H2F) à concentração de 0,1 mM (isolados ou em combinação) não causa qualquer inibição da produção de DHFR activa a partir de uma reacção conjugada de transcrição-tradução de 2 horas. 68
Exemplo 7. A actividade de DHFR num elemento genético contendo um substrato de di-hidrofolato imobilizado conduz à formação de um produto de tetra-hidrofolato ligado a ácido nucleico codificando DHFR. É sintetizado um peptideo compreendendo três ácidos glutâmicos ligados por meio dos seus γ-carboxilatos (utilizando éster α-benzílico do ácido glutâmico N-fluorenilmetoxicarbonilo como material de partida) com uma lisina na extremidade carboxilica e biotina ligada ao seu grupo ε-amino pela modificação de processos publicados (Krumdiek et al., 1980). É ligado ácido fólico na extremidade amino e são removidos os grupos protectores benzilo e trifluoroacetamida por hidrólise alcalina como anteriormente descrito. O peptideo é purificado por HPLC de fase reversa e caracterizado por espectroscopia de massa e UV. Este peptideo de ácido fólico é reduzido quimicamente ao peptideo correspondente de ácido di-hidrofólico (utilizando ditionato e ácido ascórbico) e depois ao peptideo correspondente de ácido tetra-hidrofólico (utilizando boro-hidreto de sódio) pela aplicação de processos publicados (Zakrzewski et al., 1980). Estas transformações são caracterizadas por espectroscopia de UV.
É construído um elemento genético pela ligação, em média, de duas a três moléculas do peptideo de ácido fólico a avidina (ou estreptavidina) juntamente com uma molécula de DHFR codificando ADN amplificado por PCR a partir do plasmídeo pGEM-folA utilizando os iniciadores LMB2-Biotina (SEQ. ID. N° 9) e LMB3 (ver Exemplo 3) . O ácido fólico imobilizado é reduzido 69 quimicamente a di-hidrofolato utilizando ditionato e ácido ascórbico e purificado por diálise contra tampão A. DHFR de E. coli é obtida por indução de IPTG em bactérias contendo o plasmideo pGEM-folA e purificada por afinidade numa coluna de metotrexato-Sepharose. Demonstra-se que a DHFR de E. coli reage com o ácido di-hidrofólico imobilizado a este elemento genético pela monitorização da oxidação de NADPH a NADP espectrofotometricamente utilizando 0-10 μΜ do peptideo de ácido di-hidrofólico ligado a avidina e 0-50 μΜ de NADPH. Deste modo, no fim desta reacção, o produto tetra-hidrofolato está ligado ao gene folA que codifica para a enzima (í. e., DHFR) que catalisa a sua formação.
Existem duas abordagens para isolar aqueles genes ligados ao produto de tetra-hidrofolato. A primeira envolve a geração de anticorpos de apresentação de fago específicos para o tetra-hidrofolato (Hoogenboom, 1997). A segunda abordagem baseia-se na utilização de um reagente marcado, que reage especificamente com o produto imobilizado, mas não com o substrato. Sintetizou-se uma molécula consistindo de uma marca de dinitrofenilo (DNP) ligada a benzaldeído por meio de um espaçador de 14 átomos. O grupo aldeído reage especificamente com o tetra-hidrofolato para formar uma adução covalente (Kallen e Jencks, 1966) e a purificação de afinidade pode ser realizada utilizando um anticorpo anti-DNP. 70
Exemplo 8.
Um método alternativo de selecção para actividade de DHFR A reacção catalisada por DHFR pode ser seleccionada por conjugação in situ a uma segunda reacção, catalisada por Aldeído Desidrogenase de Levedura, com um substrato 'marcado'.
Em vez de seleccionar para genes ligados a um dos produtos da reacção de DHFR (5,6,7,8-tetra-hidrofolato ou NADP+) , a reacção de DHFR é conjugada a uma segunda reacção. Neste caso, a selecção é mediada pela formação do segundo produto da reacção catalisada por DHFR - fosfato dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADP+) . A reacção escolhida para conjugar é catalisada pela Aldeído Desidrogenase de Levedura (YAD; EC 1.2.1.5). Esta enzima utiliza NAD+ ou NADP+ na oxidação de uma vasta gama de aldeídos alifáticos e aromáticos aos seus ácidos carboxílicos correspondentes, gerando NADH ou NADPH no processo. A reacção possui a grande vantagem de ser essencialmente irreversível -nomeadamente, as desidrogenases (incluindo DHFR e YAD) não catalisam a redução do ácido de volta ao aldeído. Uma vez que um grande número de enzimas catalisando reacções redox gera NAD+ ou NADP+, a reacção de YAD também pode ser utilizada na selecção destas enzimas, e não está unicamente limitada a selecção para Di-hidrofolato Redutase.
Um substrato de pentaldeído é sintetizado e ligado a uma marca de DNP (dinitrofenilo) por meio de um ligante C2o (mais abaixo, DNP-PA). Segue-se a oxidação de DNP-PA ao ácido correspondente (DNP-PC) e por HPLC (coluna de fase reversa Ci8; 71 gradiente de H20/CH3CN + 0,1% de ácido trifluoroacético; tempos de retenção: DNP-PA, 5,0 min; DNP-PC, 4,26 min). A conversão de DNP-PA em DNP-PC observa-se apenas na presença de YAD e NADP+. As reacções são igualmente seguidas espectrofotometricamente; o aumento de absorvência a 340 nm indicou que NADP+ é convertido simultaneamente em NADPH. A reacção conjugada DHFR-YAD é seguida utilizando o mesmo ensaio de HPLC. A mistura de reacção inicial continha os substratos para DHFR - NADPH (50 μΜ) e 7-8-di-hidrofolato (H2F; 50 μΜ), YAD (Sigma, 0,5 unidades) e DNP-PA (50 μΜ) em tampão pH 7,7 (imidazole a 100 mM, β-mercaptoetanol a 5 mM e KC1 a 25 mM). A conversão de DNP-PA em DNP-PC é observada quando DHFR é adicionada à mistura de reacção supracitada (DHFR a 5 nM, 83%; 1,25 nM, 14,5% após 32 min). A concentração de DHFR obtida na tradução in vitro compartimentada é, de facto, muito mais elevada que 5 nM (ver Exemplo 4) . A conversão de DNP-PA em DNP-PC na ausência de DHFR é negligenciável, ou quando o metotrexato (MTX) - um inibidor potente da enzima - está presente (10 μΜ). Deste modo, a formação do produto secundário, DNP-PC, está, por conseguinte, ligada à presença da DHFR.
Utilizando esta reacção conjugada, proteínas conferindo actividade de DHFR podem ser seleccionadas por: i) ligando os genes a anticorpos que se ligam especificamente ao produto carboxílico de DNP-PA, e ii) isolando estes genes por purificação de afinidade utilizando um anticorpo anti-DNP.
Esta abordagem é demonstrada por um imunoensaio de rotina baseado no catELISA (Tawfik et al., 1993). Placas de 72 microtitulação são revestidas com imunoglobulinas anti-coelho (Sigma, 10 yg/poço) seguido por soro policlonal de coelho que se liga especificamente a derivados do ácido glutárico (Tawfik et al., 1993) diluído 1:500 em tampão de fosfatos salino + BSA a 1 mg/mL). As placas são depois enxaguadas e bloqueadas com BSA. As misturas de reacção conjugadas acima descritas são diluídas em tampão Tris/BSA (Tris a 50 mM, cloreto de sódio a 150 mM, BSA a 10 mg/mL BSA, pH 7,4) e incubadas durante 1 h. A placa é enxaguada e um anticorpo anti-DNP (SPE21.il monoclonal de murganho) diluído no mesmo tampão (1:10000) é adicionado e incubado durante uma hora. A placa é enxaguada e é adicionado anticorpo anti coelho marcado com peroxidase (Jackson) seguido por um substrato de peroxidase (BM Blue; Boehringer Mannheim). É observado um sinal específico apenas nas amostras de reacções conjugadas que continham DHFR (além de H2F, NADPH, YAD e DNP-PA).
Anticorpos anti-ácido carboxílico altamente específicos (Tawfik et al., 1993) são utilizados para selecção em dois formatos.
No primeiro, o anticorpo anti-ácido carboxílico é conjugado quimicamente a uma avidina de elevado peso molecular (ou estreptavidina) contendo complexo, tal como aquele descrito no Exemplo 5. ADN biotinilado codificando DHFR é conjugado a este complexo por meio da interacçâo avidina-biotina como descrito no Exemplo 5. Este complexo é então utilizado num sistema conjugado de transcrição/tradução compartimentado que contém igualmente YAD e um substrato de YAD marcado, tal como DNP-PA. Se existir actividade de DHFR no compartimento, o DNP-PA é convertido em DNP-PC. Os anticorpos anti-ácido carboxílico, conjugados ao ADN por meio do complexo de elevado peso molecular capturarão apenas moléculas de DNP-PC e não moléculas de aldeído. O ADN daqueles 73 compartimentos contendo DHFR activa (e, deste modo, codificando DHFR activa se existir apenas uma molécula de ADN por compartimento) são em seguida purificados por afinidade pela utilização de anticorpos anti-DNP.
No segundo formato, múltiplas moléculas de estreptavidina são conjugadas conjuntamente num complexo de elevado peso molecular que pode ser facilmente conjugado a ADN biotinilado codificando DHFR (ver Exemplo 5) . Este complexo é utilizado num sistema conjugado de transcriçâo/tradução compartimentado que contém igualmente YAD e um substrato de YAD marcado, tal como MeNPOC-biotina-benzaldeido. 0 grupo biotina em MeNPOC-biotina-benzaldeído está "enjaulado" (Sundberg et al., 1995; Pirrung e Huang, 1996), ou seja, não pode ser ligado por avidina ou estreptavidina até que um grupo de nitrobenzilo foto-removível tenha sido clivado por irradiação com luz. Se existir actividade de DHFR no compartimento, o MeNPOC-biotina-benzaldeido é convertido em MeNPOC-biotina-ácido benzóico. Após a reacção compartimentada ter decorrido durante algum tempo, a reacção é irradiada com luz e o grupo nitrobenzilo removido e o composto ligar-se-á ao complexo estreptavidina-ADN. 0 ADN naqueles compartimentos contendo DHFR activa (e, deste modo, codificando DHFR activa se existir apenas uma molécula de ADN por compartimento) está complexado com biotina-ácido benzóico (em vez de biotina-benzaldeído) e pode ser purificado por afinidade utilizando anticorpos imobilizados anti-ácido benzóico. A presença de outras enzimas que podem catalisar a oxidação de NAD+ ou NADP+ a NADH ou NADPH no sistema de transcrição/tradução in vitro pode, em determinadas circunstâncias, dificultar a utilização deste sistema YAD para selecção directamente no sistema de transcrição/tradução in 74 vitro compartimentado. Nesse caso, a selecção é efectuada utilizando o sistema de compartimentação de duas etapas descrito anteriormente. Ou seja, primeiro, a DHFR é traduzida em compartimentos e depois ligada ao ADN no mesmo compartimento por meio de uma marca de afinidade adequada. A emulsão é quebrada, o conteúdo dos compartimentos agregado e o ADN purificado por afinidade separando-o dos outros compostos do sistema de transcrição/tradução (incluindo óxido-redutases contaminantes), pela utilização de anticorpos específicos para uma 'marca' de digoxigenina ligada a uma extremidade da molécula de ADN. As moléculas de ADN purificadas, juntamente com a proteína DHFR ligada, são então integradas numa mistura de reacção contendo os substratos para DHFR - NADPH (50 μΜ) e 7-8-di-hidrofolato (H2F; 50 μΜ), YAD (Sigma, 0,5 unidades) e DNP-PA (50 μΜ) em tampão pH 7,7 (imidazole a 100 mM, β-mercaptoetanol a 5 mM e KC1 a 25 mM) e a reacção recompartimentada por emulsificação para dar apenas uma, ou no máximo algumas, moléculas de ADN por compartimento. Os anticorpos anti-ácido carboxílico (Tawfik et al., 1993) são utilizados para selecção em qualquer dos dois formatos acima descritos.
Exemplo 9.
Metilação de elementos genéticos por produtos génicos ADN metiltransferases, produzidas por transcrição/tradução in vitro nos compartimentos aquosos de uma emulsão de água-em-óleo, metilam as moléculas de ADN que as codificam nos compartimentos. 75 A selecção de proteínas com actividades de ligação ou catalíticas utilizando o sistema de compartimentação aqui descrito apresenta dois requisitos básicos: i) uma única molécula de ADN (ou no máximo algumas moléculas) codificando as proteínas a seleccionar é expressa numa forma biologicamente activa por um sistema conjugado de transcrição/tradução nos compartimentos aquosos de uma emulsão de água-em-óleo; e, ii) a proteína a seleccionar deve ser capaz de modificar o elemento genético que a codificou num modo que a torne seleccionável numa etapa subsequente. Neste Exemplo, descreve-se um grupo de proteínas - ADN metil transferases (tipo II) - que são produzidas eficientemente nos compartimentos aquosos de um sistema de emulsão de água-em-óleo utilizando um sistema conjugado de transcrição/tradução. Além disso, as ADN metiltransferases traduzidas in vitro modificam eficientemente as moléculas de ADN que as codificam in situ nos compartimentos aquosos para que possam ser seleccionadas e amplificadas. Os sítios alvo nas moléculas de ADN são modificados por metilação de uma citosina na posição C5 que torna os sítios resistentes a clivagem pela endonuclease de restrição cognata (i. e. Hhal para M.Hhal, e HaelII para M.HaelII). Deste modo, o ADN metilado é seleccionável, em vez do ADN não metilado, em virtude da sua resistência a clivagem de endonuclease de restrição. 0 gene codificando M.Hhal é amplificado por PCR utilizando os oligonucleotídeos HhaI-Fo2S e Hhal-Bc directamente a partir de Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 10014). O gene codificando M.HaelII é amplificado por PCR utilizando os oligonucleotídeos HaeIII-Fo2s e Haelll-Bc (SEQ. ID. N° 4) directamente a partir de Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC 11116). Ambos os fragmentos de PCR são clonados no vector pGEM-4Z (Promega) digerido com HíndIII e Kpnl a jusante do promotor lac e do 76 promotor de T7 ARN polimerase. Os oligonucleotídeos Hhal-Bc e HaelII-Bc (SEQ. ID. N° 4) acrescentam o eficiente sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7 a montante do codão de iniciação do gene da metiltransferase. 0 oligonucleotideo Hhal-Fo acrescenta um sitio de metilação/restrição Hhal (M/R) e um sitio Haelll (INotl) para funcionarem como substratos para U.Hhal e M.HaelII respectivamente. 0 oligonucleotideo HaelII-Fo acrescenta um sitio M/R Notl/Haelll que funciona como substrato para M.HaelII (o gene de M.HaelII já contém dois sitios M/R Hhal internos). A sequenciação de ADN identifica clones com a sequência nucleotidica correcta.
Os plasmideos pGEM-M.Hbal e pGEM-M.Haelll acima descritos são amplificados por PCR utilizando os iniciadores LMB2-Biotina (SEQ. ID. N° 9) e LMB3-DIG (SEQ. ID. N° 10) como acima para criar um fragmento de ADN de 1167 pares de bases DIG-M.HHal-Biotina ou um de 1171 pares de bases DIG-M. HaelII-Biotina, marcados numa extremidade por biotina e na outra extremidade por digoxigenina, e que transportam o promotor da T7 ARN polimerase, o sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7, o gene da metiltransferase e sitios M/R Haelll e Hhal. Cada um dos fragmentos de PCR é directamente purificado utilizando preparações Wizard PCR Preps (Promega).
Os genes requeridos para a transcrição/tradução conjugada in vitro de M.HcoRI e M.HcoRV são amplificados por PCR pela utilização dos plasmideos pMBl (Betlach et al., 1976) e pLBl (Bougueleret et al., 1984) como moldes, respectivamente, um iniciador inverso acrescentando o sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7 e LMB3 a montante do sitio de ligação do ribossoma do gene da metiltransferase (EcoRI-Bc ou EcoRV-Bc) e um iniciador directo (EcoRI-Eo ou EcoRI-Fo) acrescentando LMB2. 77
Estes fragmentos são adicionalmente amplificados por PCR utilizando os iniciadores LMB2-Biotina (SEQ. ID. N° 9) e LMB3-DIG (SEQ. ID. N° 10) como acima descrito para criar os fragmentos de ADN DIG-M.EcoRI-Biotina e DIG-M.EcoRV-Biotina que transportam o promotor da T7 ARN polimerase, o sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7, o gene da metiltransferase e sítios M/R EcoRI e EcoRV. Cada um destes fragmentos de PCR é directamente purificado utilizando preparações Wizard PCR Preps (Promega).
Os genes de ADN metilases amplificados por PCR acima descritos são expressos num sistema conjugado de transcrição/tradução in vitro procariótico concebido para moldes lineares (Lesley et al., 1991). É utilizada uma preparação comercial deste sistema (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) suplementada com T7 ARN polimerase e S-adenosil-metionina (SAM) à concentração de 80 μΜ. A metilação é ensaiada pela medição da resistência de fragmentos de ADN marcados com DIG e biotina à clivagem pela enzima de restrição cognata utilizando o ELISA DIG-Biotina da Boehringer-Mannheim ou com fragmentos de ADN marcados radioactivamente e esferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Misturas de reacção in vitro contendo fragmentos marcados com DIG-Biotina reagiram in situ por transcrição/tradução conjugada in vitro como abaixo descrito e foram diluídas em tampão lxW&B (NaCl a 1 M, Tris a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,4) + 0,1% de Tween-20 (a concentração do ADN marcado com DIG/Biotina no ensaio está na gama de 0-250 pM) e incubadas em placas de microtitulação revestidas com estreptavidina (elevada capacidade) durante 30-60 min. A placa é enxaguada (3 vezes em 2xW&B e finalmente com Tris a 50 mM, pH 7,4 + MgCl2 a 78 5 mM) e as enzimas de restrição (NEB) são adicionadas (10-50 unidades de enzima em 0,2 mL do tampão correspondente) e incubada a 37° durante 3-12 hrs. A placa é enxaguada e são adicionados anticorpos anti-DIG ligados a peroxidase (diluídos 1:1500 em PBS + 0,1% de Tween-20 + BSA a 2 mg/mL) durante 40-60 min seguidos pelo substrato da peroxidase (BM Blue; 70 pL/poço) . É medida a absorvência (a 450 menos 650 nm) após paragem com H2S04 a 0,5 M (130 pL/poço).
Para o ensaio de radioactividade, os plasmídeos e fragmentos de PCR acima descritos são amplificados por PCR utilizando os iniciadores LMB2-Biotina (SEQ. ID. N° 9) e LMB3 e a-P32-CTP para dar fragmentos de ADN marcados com P32, marcados numa extremidade por biotina e que transporta o promotor da T7 ARN polimerase, o sítio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7, o gene da metiltransferase e sítios M/R relevantes. Estes fragmentos de PCR são directamente purificados utilizando preparações Wizard PCR Preps (Promega). As misturas de reacção contendo o ADN marcado com Biotina-P32 reagidas in situ por transcrição/tradução conjugada in vitro são diluídas em tampão lxW&B + 0,1% de Tween-20 e incubadas com esferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dynal, M-280; 1-5 x 106 esferas) durante 30-60 min. As esferas são separadas e enxaguadas (3 vezes em 2xW&B + 0,1% de Tween-20 + 3% de BSA e finalmente com Tris a 50 mM, pH 7,4 + MgCl2 a 5 mM) . As enzimas de restrição (NEB) são adicionadas (10-50 unidades de enzima em 50-150 pL do tampão correspondente) e incubadas a 37° durante 5-20 h. O sobrenadante é removido e as esferas enxaguadas e ressuspensas em 100 pL de água. A quantidade de ADN marcado radioactivamente nas esferas e nos sobrenadantes é determinada por cintilação. 79
Todas as quatro metilases aqui descritas - M.EaelII, U.Hhal, M.EcoRI e M.EcoRV - são expressas e estão activas na transcrição/tradução conjugada in vítro. Além disso, a metilase traduzida in vitro pode metilar o seu próprio gene tornando-o, deste modo, resistente a clivagem pela metilase cognata (auto-metilação). Ambos os processos, a transcrição/tradução conjugada in vitro do gene da metilase bem como a sua metilação, prosseguem eficientemente na mesma mistura de reacção. Mais especificamente, fragmentos de ADN (a concentrações de 0,5 a 10 nM) que transportam o promotor da T7 ARN polimerase, o sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7, um gene da metiltransferase e sítios M/R de todas as quatro metilases tornam-se resistentes a clivagem pela endonuclease de restrição cognata. Por exemplo, o fragmento de ADN codificando a M.EcoRI metiltransferase torna-se resistente a clivagem por EcoRI (75-100% após 20-90 minutos a 25 °C) quando incubado com E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega), SAM (80 μΜ) e T7 ARN polimerase. A resistência à clivagem em consequência da metilação é selectiva e específica: nas mesmas condições, não se observa resistência à clivagem por Hhal ou M.EcoRV; além disso, não é observada resistência a clivagem por .EcoRI quando a tradução é inibida (e. g., na presença de puromicina ou na ausência de T7 ARN polimerase) . Foram obtidos resultados semelhantes quando a sobrevivência dos genes é ensaiada por ELISA DIG-Biotina ou com fragmentos de ADN marcados com Biotina-P32 como acima descrito. A metilação em trans, i. e., de fragmentos de ADN (à excepção daqueles codificando para a metilase cognata) acrescentando sítios M/R é igualmente observada no sistema conjugado de transcrição/tradução in vitro da E. coli S30 na presença de um gene codificando para uma metilase. 80
Ambos os processos, a transcrição/tradução conjugada in vitro dos genes da metilase bem como a sua auto-metilação, prosseguem eficientemente nos compartimentos aquosos de uma emulsão de água-em-óleo. Mais especificamente, fragmentos de ADN (a concentrações de 0,1-10 nM) que transportam o promotor da T7 ARN polimerase, o sitio de iniciação de tradução do gene 10 do fago T7, um gene da metiltransferase (por exemplo, U.Hhal) e os sítios M/R HaeIII, Hhal e EcoRI são adicionados a E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega) na presença de SAM (80 μΜ) e T7 ARN polimerase. As misturas de reacçâo, arrefecidas em gelo são emulsionadas pela homogeneização, durante 1 minuto com um dispersor Ultra-Turrax T25 a 20000 rpm, como descrito no Exemplo 1 e incubadas a 25°-35° durante 0-180 min. A reacção é parada e a fase aquosa é separada (ver Exemplo 1) e a metilação dos fragmentos de ADN marcados com DIG-Biotina ou Biotina-P32 é ensaiada como acima descrito. A metilação de até 20% dos genes compartimentados para clivagem por Hhal é observada após 60-180 min de incubação. Não se observa resistência quando a emulsão fria é quebrada imediatamente após ser preparada e a reacção parada por extracção com éter (Ό min'). A metilação é selectiva: nas mesmas condições, não é observada a resistência a clivagem por HaelII ou EcoRI. Além disso, o ensaio de fragmentos de ADN marcados com P32 demonstrou que a auto-metilação de M.HaelII e M.Hhal prossegue a concentrações de genes que correspondem a uma média de menos de um gene por compartimento (0,1-0,5 nM; ver Exemplo 4). Deste modo, a transcrição/tradução conjugada in vitro dos genes de metilases, bem como a sua auto-metilação, prossegue eficientemente mesmo quando apenas um único elemento genético está presente nos compartimentos aquosos de uma emulsão de água-em-óleo. 81 A actividade de HaelII metilase resultante da transcrição/tradução conjugada de genes de M.HaelII é igualmente medida nas microcápsulas maiores produzidas apenas por agitação, e por agitação seguida por homogeneização adicional com um dispersor Ultra-Turrax T25 a 8000 rpm, 9000 rpm, ou 13500 rpm durante 1 minuto como descrito no Exemplo 1. Os resultados são apresentados na Figura 2b. A concentração utilizada de genes de M. HaelII (2,5 nM) dá uma média de 1, 1,5 e 4,8 elementos genéticos por goticula nas emulsões homogeneizadas a 13500 rpm, 9500 rpm e 8000 rpm, respectivamente, e uma média de 14 elementos genéticos por goticula na emulsão preparada apenas por agitação. A adição de um tensioactivo aniónico - e. g., desoxicolato de sódio, tipicamente a 0,5% (p/v), à mistura de tradução in vitro aumenta significativamente a percentagem de elementos genéticos metilados nas emulsões.
Exemplo 10.
Elementos genéticos codificando ADN metiltransferases podem ser seleccionados e amplificados no seguimento da sua auto-metilação nos compartimentos aquosos de um emulsão de água-em-óleo. A metilação de genes codificando para ADN metilases permite o seu isolamento e amplificação numa etapa subsequente. O ADN metilado é seleccionável, em vez do ADN não metilado, em virtude da sua resistência a clivagem de endonuclease de restrição. Deste modo, os elementos genéticos que permanecem intactos após tratamento com a enzima de restrição cognata podem ser amplificados por PCR. Contudo, uma tal selecção é obviamente inatingível se outros genes que contêm o mesmo sitio R/M, mas 82 não codificam para a metilase, estiverem presentes na mesma mistura de reacção. Isso ocorre porque a metilação cruzada dos genes não metilados (que estão presentes em grande excesso) irá torná-los resistentes a clivagem pela enzima de restrição cognata e, deste modo, amplificáveis por PCR. Nestas condições, a selecção de genes codificando a metilase será apenas possivel se estiverem compartimentados - nomeadamente, se apenas um, ou alguns genes estiverem presentes num único compartimento para que a auto-metilação seja o principal processo nesse compartimento. A metilação cruzada é evitada uma vez que genes de não-metilase que estiverem presentes nos compartimentos que não contenham um gene de metilase permanecerão não metilados.
Os genes utilizados na experiência são um fragmento de M.HaelII de 1194 pares de bases (DIG-M.HaeIII-3s-Biotina) codificando a HaelII metilase e um fragmento folA de 681 pares de bases (DIG-folA-3s-Biotina) codificando a enzima di- hidrofolato redutase (DHFR) contendo sitios de restrição/modificação HaeIII e Hhal adicionais (Ver Fig. lb). Ambos os fragmentos de ADN são marcados numa extremidade com digoxigenina (DIG)e na outra com biotina, e contêm um promotor da T7 ARN polimerase (Promotor T7) e o sitio de iniciação de tradução do gene 10 de T7 (rbs) para expressão ín vítro. pGEM-4Z-3s é criado por hibridação dos oligonucleotideos
HaeHha-PI e HaeHha-Mi (SEQ. ID. N° 2) (Tabela 1) e ligando-os por corte com Hindlll e EcoRI a pGEM-4Z (Promega) . 0 gene de M.HaelII é amplificado por PCR a partir de Haemophílus influenzae (biogrupo aegyptíus) (ATCC 11116) utilizando os oligonucleotideos HaelII-FoNC (SEQ. ID. N° 3) e HaelII-Bc (SEQ. ID. N° 4) (Tabela 1) . 0 gene folA é amplificado a partir de
Escherichia coli utilizando os iniciadores EDHFR-Fo 83 (SEQ. ID. N° 5) e EDHFR-Ba (SEQ. ID. N° 6) (Tabela 1). Ambos os genes amplificados são digeridos com HindiII e Kpnl e clonados em pGEM-4Z-3s, criando os vectores de expressão pGEM-Haelll-3s e pGEM-folA-3s. DIG-M.HaeIII-3s-Biotina e DIGfolA-3s-Biotina (ver Fig. lb) são amplificados a partir destes vectores por PCR com Pfu polimerase utilizando os iniciadores LMB2-Biotina (SEQ. ID. N° 9) e LMB3-DIG (SEQ. ID. N° 10) (20 ciclos) e purificados utilizando preparações Wizard PCR Preps (Promega). DIG-Dl.3-Biotina, um fragmento de ADN de 942 pb contendo quatro sítios R/M HaelII, utilizado como substrato para ensaiar a actividade de HaelII metilase, é amplificado a partir de um derivado de pUC19 contendo um gene Fv de cadeia simples Dl.3 (McCafferty et al., 1990) como acima. Um ADN transportador de 558 pb (ADN transportador g3; um fragmento interno do gene III do fago fd que não possui nenhum promotor T7, HaelII ou sítios R/M Hhal) é amplificado por PCR com Taq polimerase a partir de ADN de pHENl (Hoogenboom et al., 1991) utilizando os iniciadores G3FRAG-F0 (SEQ. ID. N° 11) e G3FRAG~Ba (SEQ. ID. N° 12) (Tabela 1) e purificado por extracção com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol. Este ADN (a HO nM) foi utilizado como transportador na diluição de todo o ADN utilizado nas reacções neste exemplo. A Figura 3 demonstra a selecção de genes de M. HaelII codificando a ADN metilase HaelII a partir de um excesso de genes folA (codificando DHFR que não metila ADN). Ambos os genes possuem as mesmas sequências R/M HaelII acrescentadas para actuarem como substrato (Fig. lb) . Após a tradução nos compartimentos aquosos de uma emulsão, as sequências R/M HaelII ligadas a genes de metilase são metiladas. Estes genes tornaram-se resistentes a clivagem por endonuclease HaelII e são subsequentemente amplificados por PCR. Genes folA, presentes 84 noutros compartimentos, permanecem não-metilados, são clivados e não são amplificados. Os produtos de PCR são analisados por electroforese em gel de agarose onde o enriquecimento para os genes de M.HaelII pode ser visualizado pelo aparecimento de uma banda de 1194 pb (Fig. 3). É utilizado o sistema de extracção de E. coli S30 para ADN linear (Promega), suplementado com ADN transportador g3 (10 nM), fragmentos de ADN (DIG-M.tfaeIII-3s-Biotina e DIG-M. folA-3s-Biotina a razões e concentrações abaixo indicadas), T7 ARN polimerase (104 unidades), desoxicolato de sódio (Fluka, 0,5% p/v; apenas nas reacções emulsionadas) e S-adenosil-metionina (NEB, 80 μΜ) . As reacções são preparadas utilizando fragmentos de ADN DIG-M. HaeIII-3s-Biotina e DiG-M. folA-3s-Biotina a uma razão de 1:103 e uma concentração total de 200 pM (Fig. 3a) e razões de 1:104 a 1:107 e uma concentração total de 500 pM (Fig. 3b) . São preparadas reacções de cinquenta microlitros em gelo e emulsionadas apenas por agitação, como descrito no Exemplo 1. As reacções são incubadas durante 2 horas a 25 °C. Para recuperar as misturas de reacção, as emulsões são rotacionadas a 3000 g durante 5 minutos e a fase oleosa removida, deixando a emulsão concentrada no fundo do frasquinho de vidro. É adicionado tampão de paragem (0,2 mL de ARN de levedura a 25 pg/mL em tampão W+B: NaCl a 1 M, Tris-HCl a 10 mM, EDTA a 1 mM, pH 7,4) e são adicionados 2 mL de éter saturado de água e a mistura é sujeita a vórtice, brevemente centrifugada e a fase de éter removida. A fase aquosa é lavada com éter e seca (5 minutos num dispositivo Speedvac a temperatura ambiente). O ADN é capturado em 100 pg de esferas de estreptavidina M-280 Dynabeads (2 horas a temperatura ambiente). As esferas Dynabeads são lavadas sequencialmente com: tampão W+B; Guanidina-HCl a 2,25 M, Tris-HCl a 25 mM, pH 7,4; tampão W+B; e, duas vezes com 85 tampão de restrição. As esferas são ressuspensas em 100 pL de tampão de restrição contendo 10 unidades de HaelII (ou Hhal) e incubadas a 37°C durante 5 horas. As esferas são lavadas três vezes com tampão W+B, duas vezes com KC1 a 50 mM, Tris-HCl a 10 mM, 0,1% de Triton X-100, pH 9,0, e depois ressuspensas em 100 yL do mesmo tampão suplementado com MgCl2 a 1,5 mM (tampão de PCR) . Alíquotas das esferas (2-20 pL) são amplificadas por PCR utilizando Taq polimerase adicionada a 94°C com os iniciadores LMB2-Biotina e LMB3-DIG (reacções de 50 pL; 32 ciclos de 1 minuto a 94°, 1 minuto a 55°, 2 minutos a 72°) . Este ADN é purificado utilizando preparações Wizard PCR Preps e é utilizado no segundo ciclo de selecção (20 pM nas selecções 1:104 e 1:105 e 500 pM nas selecções 1:106 e 1:107) . Para os ensaios de electroforese em gel e de actividade, este ADN (diluído para ~ lpM) é adicionalmente amplificado com os iniciadores LMB2-Nest e LMB3-Nest que se hibridam imediatamente dentro de LMB2 e LMB3, respectivamente (25 ciclos de 1 minuto a 94°, 1 minuto a 50°, 1,5 minutos a 72°) e purificado como acima. Este ADN (a 10 nM), que não possui DIG nem Biotina acrescentada, é igualmente traduzido in vitro na presença de DIG-D1.3-Biotina a 10 nM, um ADN de 942 pb contendo quatro sítios R/M HaelII. A metilação do substrato de DIG-D1.3-Biotina é determinada por ELISA de DIG-Biotina como no Exemplo 9.
Um único ciclo de selecção de uma razão de 1:1000 de M.HaelII:genes folA na emulsão resulta numa razão génica final de aproximadamente 1:1 (Fig. 3a). Diversas experiências de controlo indicam que a selecção prossegue de acordo com o mecanismo acima descrito: uma banda correspondendo ao gene de M.HaelII não é observada quando a mistura inicial de genes é amplificada por PCR; nem após reacção em solução (não-emulsionada); nem quando emulsionada na ausência de 86 transcrição/tradução (quando é omitida a T7 ARN polimerase); nem quando os genes reagidos são clivados nos sítios R/M à excepção daqueles de HaelII - e. g., após digestão com Hhal. 0 rendimento de ADN de M.HaelII após selecção é menor que 100%, essencialmente devido a digestão incompleta por HaelII, em vez de metilação cruzada, como indicado pela grande banda de folA observada na ausência de actividade de metilase (quando não é adicionada T7 polimerase). Durante a digestão, a concentração de ADN cai bem abaixo do KM de HaeIII (6 nM) e a digestão torna-se extremamente ineficiente.
Uma banda correspondendo aos genes de M.HaelII torna-se igualmente visível após um único ciclo de selecção com início a partir de razões M. HaelII: folA de 1:104 a 1:105 (Fig. 3b), mas não a razões mais baixas, indicando um factor de enriquecimento de pelo menos 5000 vezes. A selecção de um número menor de genes a partir de um grande agregado (e. g., uma biblioteca de genes) requer, por conseguinte, ciclos adicionais de selecção. Quando o ADN amplificado e digerido por HaelII do primeiro ciclo de selecção é submetido a um segundo ciclo de selecção, uma banda correspondendo aos genes de M.HaelII tornou-se igualmente visível desde razões de partida de 1:106 e 1:107 de M.HaelII:folA. É igualmente realizado um segundo ciclo de selecção sobre o ADN derivado das razões de partida 1:104 e 1:105 de M. HaelII: folA. O que dá um enriquecimento adicional, até uma razão de aproximadamente 3:1 a favor dos genes de M.HaelII. Antes e após cada ciclo de selecção, os genes são amplificados, traduzidos in vitro e reagidos com um substrato de ADN separado para ensaiar para actividade de HaelII metilase. Estes ensaios indicam que o enriquecimento para os genes de M.HaelII, como observado por electroforese em gel, resulta num aumento paralelo na actividade de HaelII metilase (Fig. 3b). 87
Tabela 1 Oligonucleotídos
HaeHha-P1 HaeHha-Mi Haelll-FoNC Haelll-Bc EDHFR-Fo EDHFR-Ba LMB2-Nest LMB3-Nest LMB2-Biotina LMB3-DIG G3FRAG-FO G3FRAG-Ba P2T7Ba P9Fo LMB2 LMB3 Hhal-Fo2S Hhal-Bc Haelll-Fo2s EcoRI-Bc EcoRI-Fo EcoRV-Bc EcoRV-Fo 5’-AGCTTG CATGCCTGCGGT ACCGGC.CATGCG CATGGCCTAGCG CATGCG GCC GCT AGCGCG-3’ (SEQ. ID. No. 1) 5’-AAT TCG CGC TAG CGG CCG CAT GCG CTA GGC CAT GCG CAT GGC CGG TAC CGC AGG CAT GCA-3’ (SEQ. ID. No. 2) 5’-CGA GCT AGA GGT ACC TTA TTA ATT ACC TTT ACA AAT TTC CAA TGC AGA TTT TAT-3’ (SEQ. ID. No. 3) 5’-GCA TCT GAC AAG CTT AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG AAT TTA ATT AGT CTT TTT TCA GGT GCA GGG-3’ (SEQ. ID. No. 4) 5’-CGA GCT AG A GGT ACC TTA TTA CCG CCG CTC CAG AAT CTC AAA GCA ATA G-3’ (SEQ. ID. No. 5) 5’-GCA TCT GAC AAG CTT AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG ATC AGT CTG ATT GCG GCG TTA GCG GTA G-3’ (SEQ. ID. No. 6) 5’-GAATTG GAT TTA GGT GAC-3’ (SEQ. ID. No. 7) 5'-CAT GAT TAC GCC AAG CTC-3’ (SEQ. ID. No. 8) 5'-Biotin-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’ (SEQ. ID. No. 9) 5'-Digoxigenina -CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’ (SEQ. ID. No. 10) 5'-GTC TCT GAA TTT ACC GTT CCA G-3’ (SEQ. ID. No. 11) 5'-GAA ACT GTT GAA AGT TGT TTA G-3’ (SEQ. ID. No. 12) 5'-ATT ATA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GTT ATC AGG CAT GCA CC - 3’ (SEQ. ID. No. 13) 5'-CTA GCT CCC ATT AAG GAG-3’ (SEQ. ID. No. 14) 5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’ (SEQ. ID. No. 15) 5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’ (SEQ. ID. No. 16) 5'-CGA GCT AGA GGT ACC GCG GCC GCT GCG CTT ATT AAT ATG GTT TGA AAT TTA ATG ATG AAC CAA TG-3’ (SEQ. ID. No. 17) 5’-GCA TCT GAC AAG CTT AAT AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GAT ATA CAT ATG ATT GAA ATA AAA GAT AAA CAG CTC ACA GG-3’ (SEQ. ID. No. 18) 5’- CGA GCT AGA GGT ACC GCG GCC GCT GCG CTT ATT AAT TAC CTT TAC AAA TTT CCA ATG CAG ATTTTAT-3’ (SEQ. ID. No. 19) 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA AGC TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA TAT TTT TTA TTT TAA TAA GGT TTT AAT TAA TGG-3’ (SEQ. ID. No. 20) 5’-GTA AAA CGA CGG CCA GTG AAT TCT TAT TAC TTT TGT AAT CGT TTG TTT TTT ATC-3’ (SEQ. ID. No. 21) 5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACA AGC TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA AAT GGG TTT CTT TGG CAT ATT TTT TAC AAA TG-3’ (SEQ. ID. No. 22) 5’-GTA AAA CG A CGG CCA GTG AAT TCG ATA TCT TAT TAC TCT TCA ATT ACC AAA ATA TCC CC-3’ (SEQ. ID. No. 23) LMB2-Biotina possui uma biotina na extremidade 5' ligada através de um braço espaçador de 16 átomos. LMB3-DIG possui uma digoxigenina na extremidade 5' ligada através de um braço espaçador de 12 átomos.
Os oligonucleotideos marcados na extremidade 5' com Biotina ou Digoxigenina foram adquiridos a Eurogentec. 88
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Zubay, G. (1973) Annu Rev Genet, 7, 267-87.
Zubay, G (1980) Methods Enzymol, 65, 856-77. 102 LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÕES GERAIS: (i) REQUERENTE:
(A) NOME: MEDICAL RESERCH COUNCIL (B) RUA: PARK CRESCENT, 20
(C) CIDADE: LONDRES
(E) PAÍS: GB
(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): WIN 4AL
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODO DE ORDENAÇÃO IN VITRO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 23 (iv) SUPORTE INFORMÁTICO: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Edição #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO 103 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: AGCTTGCATG CCTGCGGTAC CGGCCATGCG CATGGCCTAG CGCATGCGGC CGCTAGCGCG 60 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleic (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO" (B)
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: AATTCGCGCT AGCGGCCGCA TGCGCTAGGC CATGCGCATG GCCGGTACCG CAGGCATGCA 60 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 1U 4 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 3: CGAGCTAGAG GTACCTTATT AATTACCTTT ACAAATTTCC AATGCAGATT TTAT 54 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 84 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4: GCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGAATTTA 60 ATTAGTCTTT TTTCAGGTGC AGGG 84 105 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 4 9 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQ ID N°: 5: 49
CGAGCTAGAG GTACCTTATT ACCGCCGCTC CAGAATCTCA AAGCAATAG (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 82 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO 106 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6: GCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGATCAGT 60 CTGATTGCGG CGTTAGCGGT AG 82 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: GAATTGGATT TAGGTGAC 18 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 107 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 8: CATGATTACG CCAAGCTC 18 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 9: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 10: 108 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 10: CAGGAAACAG CTATGAC 17 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO 109 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 11: GTCTCTGAAT TTACCGTTCC AG 22 (2) INFORMAÇÃO RELATIVA A SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 12: GAAACTGTTG AAAGTTGTTT AG 22 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO" 110
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: ATTATAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGTT ATCAGGCATG CACC 44 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 14: CTAGCTCCCA TTAAGGAG 18 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 111 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 15: GTAAAACGAC GGCCAGT 17 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 16: 18
CAGGAAACAG CTATGAC 112 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 65 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 17: CGAGCTAGAG GTACCGCGGC CGCTGCGCTT ATTAATATGG TTTGAAATTT AATGATGAAC 60 CAATG 65 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 83 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO 113 (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 18: GCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGATTGAA 60 ATAAAAGATA AACAGCTCAC AGG 83 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 67 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 19: CGAGCTAGAG GTACCGCGGC CGCTGCGCTT ATTAATTACC TTTACAAATT TCCAATGCAG 60 ATTTTAT 67 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 20: 114 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 78 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 20: CAGGAAACAG CTATGACAAG CTTAATACGA CTCACTATAG GGAGATATTT ΤΤΤΑΤΊΤΤΑΑ 60 TAAGGTTTTA ATTAATGG 78 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 54 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO 115 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 21: GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCTTATTAC TTTTGTAATC GTTTGTTTTT TATO 54 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 77 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO"
(iii) HIPOTÉTICO: NÃO
(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 22: CAGGAAACAG CTATGACAAG CTTAATACGA CTCACTATAG GGAGAAATGG GTTTCTTTGG 60 CATATTTTTT ACAAATG 77 (2) INFORMAÇÃO DA SEQ ID N°: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 116 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = "OLIGONUCLEOTÍDEO SINTÉTICO" (iii) HIPOTÉTICO: NÃO (iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 23: GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCGATATCT TATTACTCTT CAATTACCAA AATATCCCC 59
Lisboa, 16 de Abril de 2007 117

Claims (23)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para o isolamento de um ou mais elementos genéticos codificando um produto génico possuindo uma actividade desejada, compreendendo as etapas de: (a) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos genes que os codificam; (b) compartimentar os elementos genéticos em microcápsulas; (c) ordenar os elementos genéticos que produzem produto(s) génico (s) possuindo a actividade desejada;
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que um produto génico com a actividade desejada induz uma alteração na microcápsula que possibilita que a microcápsula contendo o produto génico e o elemento genético que o codifica seja ordenada.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 2 em que um produto génico possuindo a actividade desejada modifica uma ou mais moléculas no interior da microcápsula que possibilita que a microcápsula contendo o produto génico e o elemento genético que o codifica seja ordenada.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou reivindicação 3 em que o produto génico possuindo a actividade desejada 1 induz uma alteração nas propriedades ópticas da microcápsula e as microcápsulas são, desse modo, ordenadas.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a alteração nas propriedades ópticas é uma alteração na fluorescência.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a actividade desejada do produto génico no interior da microcápsula resulta, directa ou indirectamente, na modificação do elemento genético codificando o produto génico para possibilitar o isolamento do elemento genético.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o produto génico possuindo a actividade desejada induz uma alteração na microcápsula que, quando detectada, desencadeia a modificação do elemento genético no interior do compartimento para possibilitar o isolamento do elemento genético.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a alteração na microcápsula é uma alteração nas suas propriedades ópticas.
  9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a alteração nas propriedades ópticas é uma alteração na fluorescência.
  10. 10. Método de acordo com a reivindicação 6, em que uma parte do elemento genético é um substrato e a actividade do produto génico desejado no interior da microcápsula resulta, directa ou indirectamente, na conversão do referido substrato num produto que permanece parte do elemento genético e possibilita o seu isolamento. 2
  11. 11. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a actividade do produto génico desejado no interior da microcápsula resulta, directa ou indirectamente, na conversão de um substrato num produto, e o elemento genético compreende adicionalmente um ligando que se liga ao referido produto e possibilita o seu isolamento.
  12. 12. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o elemento genético compreende um ligando, e o produto génico desejado no interior da microcápsula, liga-se ao referido ligando para possibilitar o isolamento do elemento genético.
  13. 13. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a actividade do produto génico no interior da microcápsula resulta na alteração da expressão de um segundo gene no interior do compartimento e a actividade do produto do referido segundo gene possibilita o isolamento do elemento genético.
  14. 14. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que os elementos genéticos são isolados de uma biblioteca de elementos genéticos codificando um repertório de produtos génicos.
  15. 15. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente compreendendo ainda a etapa adicional de: (d) introduzir uma ou mais mutações no(s) elemento(s) genético(s) isolado(s) na etapa (c). 3
  16. 16. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente compreendendo ainda repetir iterativamente uma ou mais das etapas (a) a (d).
  17. 17. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente compreendendo ainda a amplificação dos elementos qenéticos.
  18. 18. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a microencapsulação é alcançada pela formação de uma emulsão de água-em-óleo de uma solução aquosa num meio à base de óleo.
  19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 18, em que os elementos genéticos são ordenados por purificação de afinidade.
  20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 18, em que os elementos genéticos são ordenados por ablação selectiva de elementos genéticos que não codificam o produto génico desejado.
  21. 21. Método de preparação de um produto génico, compreendendo as etapas de: (a) preparar um elemento genético codificando o produto génico; (b) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos elementos genéticos que os codificam; 4 (c) compartimentar elementos genéticos em microcápsulas; (d) ordenar os elementos genéticos que produzem o(s) produto(s) génico(s) possuindo a actividade desejada; e (e) expressar o produto génico possuindo a actividade desejada.
  22. 22. Método para rastrear de um composto ou compostos capazes de modular a actividade de um produto génico, compreendendo as etapas de: (a) preparar um elemento genético codificando o produto génico; (b) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos e ligar os produtos génicos aos elementos genéticos que os codificam; (c) compartimentar elementos genéticos em microcápsulas; (d) ordenar os elementos genéticos que produzem o(s) produto(s) génico(s) possuindo a actividade desejada; e (e) colocar um produto génico possuindo a actividade desejada em contacto com o composto ou compostos e monitorizar a modulação de uma actividade do produto génico pelo composto ou compostos. 5
  23. 23. Método de preparação de um composto ou compostos compreendendo as etapas de: (a) proporcionar um protocolo de síntese em que pelo menos uma etapa é catalisada por um polipeptídeo; (b) preparar elementos genéticos codificando variantes do polipeptídeo que facilitem esta etapa; (c) expressar os elementos genéticos para produzir os seus respectivos produtos génicos de modo a que os produtos génicos sejam ligados aos elementos genéticos que os codificam; (d) compartimentar os elementos genéticos em microcápsulas; (e) ordenar os elementos genéticos que produzem produto(s) génico(s) polipeptídico(s) possuindo a actividade desejada; e (f) preparar o composto ou compostos utilizando o produto génico polipeptídico identificado em (e) para facilitar a etapa relevante da síntese. Lisboa, 16 de Abril de 2007 6
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