ES2294427T3

ES2294427T3 - Procedimiento para aumentar la concentracion de una molecula de acido nucleico.

Info

Publication number: ES2294427T3
Application number: ES04077211T
Authority: ES
Inventors: Andrew Griffiths; Dan Tawfik
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2008-04-01
Anticipated expiration: 2018-06-29
Also published as: US20070077579A1; EP1801214B1; ATE374815T1; ATE358177T1; US20130190189A1; EP1908832A3; EP1801214A3; DE69838521T2; CA2584453A1; EP1482036A2; DE69837453T2; EP1019496B1; EP1496120A2; US8367326B2; CA2792122C; DE69841997D1; US6489103B1; JP4298912B2; DK1801214T3; CA2295324A1

Abstract

Un procedimiento para incrementar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento: (a) la formación de microcápsulas acuosas en una emulsión de agua en aceite, comprendiendo dichas microcápsulas una fase interna acuosa suspendida en forma de gotas discretas en una fase externa hidrófoba y en el que una pluralidad de las microcápsulas incluye una molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende los componentes necesarios para la amplificación del ácido nucleico en la fase interna acuosa; (b) la amplificación de la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias amplificadas adicionales de dicha molécula de ácido nucleico; y (c) el enriquecimiento en dicho ácido nucleico usando un marcador unido a dicho ácido nucleico.

Description

Procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico.

La presente invención se refiere a procedimientos para el uso de bibliotecas moleculares en evolución in vitro. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para incrementar la concentración de ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están unidos por compartimentación.

La evolución requiere la generación de diversidad genética (diversidad en el ácido nucleico) seguida por la selección de aquellos ácidos nucleicos que dan como resultado características beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado de un organismo están físicamente unidas (los ácidos nucleicos estando confinados dentro de las células que codifican) múltiples rondas de mutación y selección pueden dar como resultado la supervivencia progresiva de organismos con aptitudes crecientes. Los sistemas para la evolución rápida de ácidos nucleicos o proteínas in vitro deben mimetizar este proceso a nivel molecular, en el que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado deben estar unidos y la actividad del producto génico debe ser seleccionable.

Avances recientes en biología molecular han permitido que algunas moléculas sean co-seleccionadas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados posteriormente se pueden clonar para un análisis o uso adicional, o se pueden someter a rondas adicionales de mutación y selección.

Común a estos procedimientos es el establecimiento de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos. Las moléculas con las características deseadas (actividad) se pueden aislar a través de regímenes de selección que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo, actividad de unión.

La tecnología de presentación en fagos ha sido muy exitosa para proporcionar un vehículo que permite la selección de una proteína presentada proporcionando la unión esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass y col., 1990; McCafferty y col., 1990; para una revisión véase Clackson y Wells, 1994). Las partículas de fago filamentosas actúan como paquetes de presentación genéticos con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que las codifican en el interior. La fuerte conexión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado es el resultado del ensamblaje del fago dentro de la bacteria. Puesto que las bacterias individuales raramente son infectadas de manera múltiple, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria individual llevarán el mismo elemento genético y presentarán la misma proteína.

No obstante, la presentación en el fago depende de la creación in vivo de bibliotecas de ácidos nucleicos en bacterias. Así, la limitación práctica sobre el tamaño de la biblioteca permitida por la tecnología de presentación en fagos es del orden de 10^{7} a 10^{11}, incluso aprovechando la ventaja de vectores del fago \lambda con replicones de fagos filamentosos escindibles. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección de moléculas con actividad de unión. También se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica usando esta técnica, no obstante, en ningún caso fue una selección directa para la actividad catalítica deseada, sino para la unión a un análogo del estado de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o para la reacción con un inhibidor suicida (Soumillion y col., 1994; Janda y col., 1997).

Se han seleccionado ligandos de péptidos específicos para la unión a receptores mediante selección por afinidad usando grandes bibliotecas de péptidos unidas al Extremo C-terminal del represor lac, Lacl (Cull y col., 1992). Cuando se expresa en E. coli la proteína represora une físicamente el ligando al plásmido codificante por unión a una secuencia del operador lac sobre el plásmido.

También se ha informado de un sistema de presentación en polisoma completamente in vitro (Mattheakis y col., 1994) en el que los péptidos nacientes están unidos físicamente a través del ribosoma al ARN que los codifica.

No obstante, el alcance de los sistemas anteriores está limitado a la selección de proteínas y además no permite la selección directa de actividades distintas a la unión, por ejemplo, la actividad catalítica o reguladora.

La selección y evolución de ARN in vitro (Ellington y Szostak, 1990), a veces denominada SELEX (evolución sistemática ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990) permite la selección tanto por unión como por actividad química, pero sólo para ácidos nucleicos. Cuando la selección es por unión, se incuba un conjunto de ácidos nucleicos con un sustrato inmovilizado. Los no ligantes son arrastrados en el lavado, a continuación los ligantes son liberados, amplificados y se repite todo el proceso en etapas iterativas para enriquecer en mejores secuencias de unión. Este procedimiento también se puede adaptar para permitir el aislamiento de ARN y ADN catalítico (Green y Szostak, 1992; para revisiones véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold y col., 1995; Moore, 1995).

No obstante, la selección para la actividad "catalítica" o de unión usando SELEX sólo es posible debido a que la misma molécula desempeña el doble papel de llevar la información genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Cuando la selección es por "auto-catálisis" la propia molécula también debe desempeñar el tercer papel de ser el sustrato. Puesto que el elemento genético debe desempeñar el papel tanto del sustrato como del catalizador, la selección sólo es posible para casos de conversión únicos. Debido a que el "catalizador" es modificado él mismo en este proceso, no es por definición un verdadero catalizador. Adicionalmente, las proteínas pueden no ser seleccionadas usando el procedimiento SELEX. El espectro de catalizadores, sustratos y reacciones que se pueden seleccionar por tanto está seriamente limitado.

Aquellos de los procedimientos anteriores que permiten rondas iterativas de mutación y selección son mecanismos mimetizados in vitro normalmente atribuidos al proceso de evolución: variación iterativa, selección progresiva para la actividad deseada y replicación. No obstante, ninguno de los procedimientos desarrollados hasta ahora ha proporcionado moléculas de diversidad y eficacia funcional comparables a aquellas que se encuentran en la naturaleza. Adicionalmente, no hay sistemas de "evolución" fabricados por el hombre que puedan evolucionar tanto ácidos nucleicos como proteínas para llevar a cabo el espectro completo de actividades bioquímicas y biológicas (por ejemplo, actividades de unión, catalítica y reguladora) y que puedan combinar varios procesos que den lugar a un producto o actividad deseada.

Así hay una gran necesidad de un sistema in vitro que supere las limitaciones descritas anteriormente.

Oberholzer y col. (1995), Chemistry and Biology, Current Biology, Londres, GB, vol 2 (10), págs. 677-682 informa de la síntesis de ADN en liposomas usando la reacción en cadena de la polimerasa.

Oberholzer Thomas y col. (1995), Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol 207 (1), págs. 250-257 describe la replicación enzimática de ARN en vesículas que se auto-reproducen.

Walde y col. (1994), Journal of the American Chemical Society, Vol. 116 (17), págs. 7541-7547, describe la síntesis enzimática de ácido poli(adenílico) en micelas y vesículas que se auto-reproducen.

El documento WO 93/03151 describe un procedimiento de tratamiento de una población heterogénea de células junto con copias de dos o más secuencias de ácidos nucleicos procedentes de por lo menos algunas de las células, siendo la disposición tal que copias de las secuencias de ADN procedentes de una célula individual se mezclan preferentemente en las proximidades del ácido nucleico del cual proceden las copias.

Breve descripción de la invención y revelación

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para incrementar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento:

(a): la formación de microcápsulas acuosas en una emulsión de agua en aceite, comprendiendo dichas microcápsulas una fase interna acuosa suspendida en forma de gotas discretas en una fase externa hidrófoba y en el que una pluralidad de las microcápsulas incluye una molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende los componentes necesarios para la amplificación del ácido nucleico en la fase interna acuosa;

(b): la amplificación de la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias amplificadas adicionales de dicha molécula de ácido nucleico; y

(c): el enriquecimiento de dicho ácido nucleico usando un marcador unido a dicho ácido nucleico.

Además como un primer aspecto de la descripción se proporciona un procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico con una actividad deseada, que comprende las etapas de:

(a): compartimentación de los elementos genéticos en microcápsulas;

(b): expresión de los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos dentro de las microcápsulas;

(c): clasificación de los elementos genéticos que producen el producto(s) génico con la actividad deseada.

Las microcápsulas según la presente invención compartimentan los elementos genéticos y los productos génicos de manera que permanecen juntos físicamente unidos. Sorprendentemente, la expresión del ácido nucleico aún es posible dentro de las microcápsulas artificiales permitiendo el aislamiento del ácido nucleico en base a la actividad del producto génico que codifica.

Tal como se usa en el presente documento, un elemento genético es una molécula o construcción molecular que comprende un ácido nucleico. Los elementos genéticos de la presente invención pueden comprender cualquier ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o cualquiera de sus análogos, naturales o artificiales). El componente ácido nucleico del elemento genético además puede estar unido, covalente o no covalentemente, a una o más moléculas o estructuras, incluyendo proteínas, entidades y grupos químicos, soportes en fase sólida tales como perlas magnéticas, y similares. Estas estructuras o moléculas se pueden diseñar para ayudar en la clasificación y/o aislamiento del elemento genético que codifica un producto génico con la actividad deseada.

Expresión, tal como se usa en el presente documento, se usa en su significado más amplio, para denotar que un ácido nucleico contenido en el elemento genético se convierte en su producto génico. Así, cuando el ácido nucleico es ADN, la expresión se refiere a la transcripción del ADN en ARN; cuando este ARN codifica para una proteína, la expresión también se puede referir a la traducción del ARN en la proteína. Cuando el ácido nucleico es ARN, la expresión se puede referir a la replicación de este ARN en copias de ARN adicionales, la transcripción inversa del ARN en ADN y opcionalmente la traducción de cualquiera de las especies de ARN producidas en la proteína. Por tanto, la expresión se lleva a cabo preferentemente mediante uno o más procedimientos seleccionados del grupo constituido por transcripción, transcripción inversa, replicación y traducción.

Así, la expresión del elemento genético se puede referir a ADN, ARN o una proteína, o un ácido nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales (el producto génico) dentro de la microcápsula de la invención, de manera que el producto génico está confinado dentro de la propia microcápsula como elemento genético.

El elemento genético y el producto génico así codificados están unidos confinando cada elemento genético y el respectivo producto génico codificado por el elemento genético dentro de la propia microcápsula. De esta forma el producto génico en una microcápsula no puede causar ningún cambio en cualquier otra microcápsula.

El término "microcápsula" se usa en el presente documento de acuerdo con el significado asignado normalmente a ella en la materia y se describe en profundidad a continuación. No obstante, en esencia, una microcápsula es un compartimento artificial cuyos bordes delimitantes restringen el intercambio de los componentes de los mecanismos moleculares descritos en el presente documento que permiten la clasificación de elementos genéticos según la función de los productos génicos que codifican.

Preferentemente, las microcápsulas usadas en el procedimiento de la presente invención serán capaces de ser producidas en números muy grandes, y así compartimentar una biblioteca de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos.

Según una forma de realización preferida del primer aspecto de la presente descripción, la clasificación de elementos genéticos se puede llevar a cabo en una de esencialmente cuatro técnicas.

(I) En una primera forma de realización, las microcápsulas se clasifican según una actividad del producto génico o sus derivados que hace a la microcápsula detectable como un todo. Por consiguiente, la descripción proporciona un procedimiento en el que un producto génico con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula, o una modificación de una o más moléculas dentro de la microcápsula, que permite la clasificación de la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento genético que lo codifica. Por tanto, en esta forma de realización las microcápsulas se clasifican físicamente las unas de las otras según la actividad del producto(s) génico expresado a partir del elemento(s) genético contenido en ellas, que hace posible enriquecer selectivamente las microcápsulas que contienen los productos génicos de la actividad deseada.

(II) En una segunda forma de realización, los elementos genéticos se clasifican después de reunir las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un producto génico con la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica (y que reside en la misma microcápsula) de una forma para hacerlo seleccionable en una etapa posterior. Las reacciones se detienen y a continuación las microcápsulas se rompen de manera que se reúne todo el contenido de las microcápsulas individuales. La selección de los elementos genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el producto(s) génico con la actividad deseada. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un procedimiento en el que en la etapa (b) el producto génico con la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica para permitir el aislamiento del elemento genético. Naturalmente, se debe entender que la modificación puede ser directa, en la que es provocada por la acción directa del producto génico sobre el elemento genético, o indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las cuales implican al producto génico con la actividad deseada, da lugar a la modificación del elemento genético.

(III) En una tercera forma de realización, los elementos genéticos se clasifican después de reunir las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un gen con una actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que contiene el producto génico y en el elemento genético que lo codifica. Este cambio, cuando se detecta, desencadena la modificación del gen dentro del compartimento. Las reacciones se detienen y a continuación las microcápsulas se rompen de manera que se reúne todo el contenido de las microcápsulas individuales. La selección de los elementos genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el producto(s) génico con la actividad deseada. Por consiguiente la descripción proporciona un procedimiento en el que en la etapa (b) el producto génico con la actividad deseada induce un cambio en el compartimento que es detectado y desencadena la modificación del elemento genético dentro del compartimento para así permitir su aislamiento. Se debe entender que el cambio detectado en el compartimento puede estar causado por la acción directa del producto génico, o por la acción indirecta, en el que una serie de reacciones, una o más de las cuales implican al producto génico con la actividad deseada da lugar al cambio detectado.

(IV) En una cuarta forma de realización, los elementos genéticos se pueden clasificar mediante un procedimiento multi-etapa, que supone al menos dos etapas, por ejemplo, para permitir la exposición de los elementos genéticos a condiciones que permiten que se produzcan al menos dos reacciones separadas. Como será evidente para una persona experta en la materia, la primera etapa de microencapsulación de la invención debe dar como resultado condiciones que permitan la expresión de los elementos genéticos - ya sea transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o similares. Bajo estas condiciones, puede no ser posible seleccionar la actividad de un producto génico particular, por ejemplo, debido a que el producto génico puede no ser activo bajo estas condiciones, o debido a que el sistema de expresión contenga una actividad que interfiere. La descripción proporciona, por tanto, un procedimiento según el primer aspecto de la presente invención, en el que la etapa (b) comprende la expresión de los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos dentro de las microcápsulas, la unión de los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican y el aislamiento de los complejos así formados. Esto permite el aislamiento de los elementos genéticos y sus productos génicos asociados a partir de las cápsulas antes de la clasificación según tiene lugar la actividad del producto génico. En una forma de realización preferida, los complejos se someten a una etapa de compartimentación adicional antes del aislamiento de los elementos genéticos que codifican un producto génico con la actividad deseada. Esta etapa de compartimentación adicional, que de manera ventajosa tiene lugar en las microcápsulas, permite la realización de reacciones adicionales, en diferentes condiciones, en un entorno en el que los elementos genéticos y sus respectivos productos génicos están físicamente unidos. La clasificación eventual de elementos genéticos se puede llevar a cabo según la forma de realización (I), (II) o (III) anteriores.

La "encapsulación secundaria" también se puede llevar a cabo con elementos genéticos unidos a productos génicos mediante otros medios, tal como por presentación en fagos, presentación en polisoma, fusión de ARN-péptido o fusión del péptido del represor lac.

El elemento(s) genético seleccionado también se puede someter a la reaplicación posterior, posiblemente con rondas de clasificación más rigurosas en etapas repetidas iterativamente, del procedimiento de la descripción en su totalidad o sólo en etapas seleccionadas. Adaptando adecuadamente las condiciones, se pueden aislar los elementos genéticos que codifican los productos génicos con una mejor actividad optimizada después de cada ronda de selección.

Adicionalmente, los elementos genéticos aislados después de una primera ronda de clasificación se pueden someter a mutagénesis antes de repetir la clasificación por repetición iterativa de las etapas del procedimiento de la descripción como se ha expuesto anteriormente. Después de cada ronda de mutagénesis, algunos elementos genéticos se habrán modificado de tal forma que la actividad de los productos génicos estará potenciada.

Además, los elementos genéticos seleccionados se pueden clonar en un vector de expresión para permitir la caracterización adicional de los elementos genéticos y sus productos.

En un segundo aspecto, la descripción proporciona un producto cuando se selecciona según el primer aspecto de la descripción. Como se usa en este contexto, un "producto" se puede referir a un producto génico, seleccionable según la presente, o el elemento genético (o la información genética comprendida en él).

En un tercer aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para la preparación de un producto génico, que comprende las etapas de:

(a): preparación de un elemento genético que codifica el producto génico;

(b): compartimentación de elementos genéticos en microcápsulas;

(c): expresión de los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos dentro de las microcápsulas;

(d): clasificación de los elementos genéticos que producen el producto(s) génico con la actividad deseada; y

(e): expresión del producto génico con la actividad deseada.

De acuerdo con el tercer aspecto, la etapa (a) comprende preferentemente la preparación de un repertorio de elementos genéticos, en el que cada elemento genético codifica un producto génico potencialmente diferente. Los repertorios se pueden generar mediante técnicas convencionales, tales como aquellas empleadas para la generación de bibliotecas previstas para la selección mediante procedimientos tales como presentación en fagos. Los productos génicos con la actividad deseada se pueden seleccionar del repertorio, según la presente descripción.

En un cuarto aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para seleccionar un compuesto o compuestos capaces de modular la actividad de un producto génico, que comprende las etapas de:

(a): preparación de un repertorio de elementos genéticos que codifican el producto génico;

(b): compartimentación de los elementos genéticos en microcápsulas;

(e): puesta en contacto de un producto génico con la actividad deseada con el compuesto o compuestos y control de la modulación de una actividad del producto génico mediante el compuesto o compuestos.

De manera ventajosa, el procedimiento comprende además la etapa de:

(f): identificación del compuesto o compuestos capaces de modular la actividad del producto génico y síntesis de dicho compuesto o compuestos.

Este sistema de selección se puede configurar para seleccionar moléculas de ARN, ADN o proteínas con actividad catalítica, reguladora o de unión.

Breve descripción de las figuras

Figura 1

Selección génica por compartimentación.

a: Representación esquemática del procedimiento de selección. En la etapa 1, una mezcla de reacción de transcripción/traducción in vitro que contiene una biblioteca de elementos genéticos unida a un sustrato para la reacción que se va a seleccionar se dispersa para formar una emulsión de agua en aceite normalmente con un elemento genético por compartimento acuoso. Los elementos genéticos se transcriben y se traducen dentro de sus compartimentos (etapa 2). Posteriormente (etapa 3), las proteínas (o ARNs) con actividades enzimáticas convierten el sustrato en un producto que permanece unido al elemento genético. La compartimentación previene la modificación de los elementos genéticos en otros compartimentos. A continuación (etapa 4), se rompe la emulsión, todas las reacciones se detienen y los compartimentos acuosos se combinan. Los elementos genéticos que están unidos al producto se enriquecen selectivamente, a continuación se amplifican, y se caracterizan (etapa 5), o se unen al sustrato y se compartimentan para rondas de selección adicionales (etapa 6).

b: Selección para la metilación de ADN específica de diana mediante la HaeIII metilasa. El sustrato es un segmento de ADN que contiene los sitios de restricción/modificación (R/M) de HaeIII. Los elementos genéticos se aíslan por unión a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina y se tratan con la enzima de restricción cognada HaeIII. Solamente los ácidos nucleicos con los sitios de R/M metilados son resistentes a la escisión y posteriormente se amplifican por PCR.

Figura 2a

Distribución del tamaño de gota y actividades de la DHFR y la HaeIII metilasa en emulsiones: distribución de tamaños de los compartimentos acuosos en una emulsión determinada por difracción láser. Las mezclas de reacción de transcripción/traducción in vitro que contienen ADN y deoxicolato sódico se emulsionan por agitación, o por agitación seguido de homogenización a 8.000, 9.500, ó 13.500 rpm. La distribución de tamaños de las partículas acuosas se muestra en porcentaje del volumen acuoso total.

Figura 2b

Actividad de la DHFR formada in situ por transcripción y traducción de su gen (Figura 1b) en compartimentos acuosos de una emulsión. La concentración del gen folA usado (2,5 nM) da una media de un gen por gota en las emulsiones más finas (homogeneizadas a 13.500 rpm). El diámetro medio calculado a partir de los datos de distribución de tamaños (en la Figura 2a) se presenta como una función de la velocidad de homogenización (0k rpm se refiere a la emulsión preparada por agitación sin homogenización adicional). La actividad se presenta como porcentaje de la actividad observada en la mezcla de reacción in vitro no emulsionada bajo las mismas condiciones.

Actividad de la HaeIII metilasa formada in situ por transcripción y traducción de su gen (Figura 1b) en compartimentos acuosos de una emulsión. La concentración del gen M.HaeIII usado (2,5 nM) da una media de un gen por gota en las emulsiones más finas (homogeneizadas a 13.500 rpm). El diámetro medio calculado a partir de los datos de distribución de tamaños (en la Figura 2a) se presenta como una función de la velocidad de homogenización (0k rpm se refiere a la emulsión preparada por agitación sin homogenización adicional). La actividad se presenta como porcentaje de la actividad observada en la mezcla de reacción in vitro no emulsionada bajo las mismas condiciones.

Figura 3

Selecciones para la HaeIII metilasa de ADN.

a: Selección de genes M.HaeIII a partir de genes folA 1000 veces en exceso. Las reacciones se prepararon con 0,2 nM de ADN DIG-folA-3s-Biotina (correspondiente a una media de un gen por compartimento), y se añadió 0,2 pM de DIG-M.HaeIII-3s-Biotina. Las mezclas de reacción se emulsionaron por agitación o se dejaron en disolución. Se capturó el ADN de estas reacciones, se digirió con HaeIII (o con Hhal) y se amplificó por PCR. Este ADN se amplificó posteriormente por PCR anidada con cebadores LMB2-Nest y LMB3-Nest y cinco microlitros de cada PCR anidada se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio. Marcadores, digestión de \phiX174-HaeIII; sin T7, sin ARN polimerasa de T7; sin NadCh, sin deoxicolato sódico.

b: Selecciones en dos rondas. Reacciones que contienen una relación molar de 1:10^{4} a 1:10^{7} de DIG-M.HaeIII-3s-Biotina:DIG folA-3s-Biotina (a 500 pM) se emulsionaron por agitación. El ADN de estas reacciones se digirió con HaeIII y se amplificó por PCR con los cebadores LMB2-Biotina (ID SEC No. 9) y LMB3-DIG (ID SEC No. 10). El ADN amplificado de la primera ronda de selección de una relación de 1:10^{4} y 1:10^{5} (a 20 pM) y las relaciones 1:10^{6} y 1:10^{7} (a 500 pM) se llevó en una segunda ronda de selección. Este ADN se amplificó posteriormente por PCR anidada con cebadores LMB2-Nest y LMB3-Nest y cinco microlitros de PCR anidada de cada ronda de selección se analizaron por electroforesis en gel como anteriormente (panel superior). El mismo ADN se tradujo in vitro y se midió la actividad metilasa resultante. Los resultados se presentan como porcentaje de sustrato de ADN metilado (panel inferior).

Descripción detallada la invención y revelación (A) Descripción general

Las microcápsulas de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas para permitir el funcionamiento de la invención.

Primero, para asegurarse de que los elementos genéticos y productos génicos no pueden difundirse entre microcápsulas, los contenidos de cada microcápsula se deben aislar de los contenidos de las microcápsulas circundantes, de manera que no haya, o haya poco intercambio, de los elementos genéticos y productos génicos entre las microcápsulas a lo largo de la escala de tiempos del experimento.

Segundo, el procedimiento de la presente descripción requiere que solamente haya un número limitado de elementos genéticos por microcápsula. Esto asegura que el producto génico de un elemento genético individual estará aislado de otros elementos genéticos. Así, el acoplamiento entre el elemento genético y el producto génico será muy específico. El factor de enriquecimiento es más grande con una media de un elemento genético, o menos, por microcápsula, siendo la conexión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado tan fuerte como sea posible, puesto que el producto génico de un elemento genético individual estará aislado de los productos de todos los otros elementos genéticos. No obstante, incluso si no se usa la situación teóricamente óptima, de media, de un único elemento genético o menos por microcápsula, se puede demostrar beneficiosa una relación de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más elementos genéticos por microcápsula en la clasificación de una biblioteca grande. Las rondas de clasificación posteriores, incluyendo la encapsulación renovada con una distribución diferente de elementos genéticos, permitirá una clasificación más estricta de los elementos genéticos. Preferentemente, hay un único elemento genético, o menos, por microcápsula.

Tercero, la formación y la composición de las microcápsulas no debe suprimir la función de la maquinaria de expresión de los elementos genéticos y la actividad de los productos génicos.

En consecuencia, cualquier sistema de microencapsulación usado debe cumplir estos tres requerimientos. El sistema(s) apropiado puede variar dependiendo de la naturaleza precisa de los requerimientos en cada aplicación de la descripción, como será evidente para la persona experta.

Están disponibles una amplia variedad de procedimientos de microencapsulación (véase Benita, 1996) y se pueden usar para crear las microcápsulas usadas de acuerdo con la presente invención. De hecho, en la bibliografía hay identificados más de 200 procedimientos de microencapsulación (Finch, 1993).

Éstos incluyen vesículas acuosas revestidas de membrana tales como vesículas de lípidos (liposomas) (New, 1990) y vesículas tensioactivas no iónicas (van Hal y col., 1996). Éstas son cápsulas de membrana cerradas de bicapas únicas o múltiples de moléculas unidas no covalentemente, con cada bicapa separada de su entorno por un compartimento acuoso. En el caso de los liposomas la membrana está compuesta de moléculas de lípidos; normalmente éstos son fosfolípidos, pero también se pueden incorporar en las membranas esteroles tales como el colesterol (New, 1990). Se puede llevar a cabo una variedad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas, incluyendo polimerización de ARN y ADN, dentro de los liposomas (Chakrabarti y col., 1994; Oberholzer y col., 1995a; Oberholzer y col., 1995b; Walde y col., 1994; Wick y Luisi, 1996).

Con un sistema de vesícula recubierto por membrana mucha de la fase acuosa está fuera de las vesículas y por tanto no está compartimentada. Esta fase acuosa continua se debe retirar o los sistemas biológicos en ella se inhibirán o destruirán (por ejemplo, por digestión de ácidos nucleicos con DNasa o RNasa) para que las reacciones estén limitadas a las microcápsulas (Luisi y col., 1987).

También se han demostrado reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas en microcápsulas generadas por una variedad de otros procedimientos. Muchas enzimas son activas en disoluciones micelares inversas (Bru y Walde, 1991; Bru y Walde, 1993; Creagh y col., 1993; Haber y col., 1993; Kumar y col., 1989; Luisi y B., 1987; Mao y Walde, 1991; Mao y col., 1992; Perez y col., 1992; Walde y col., 1994; Walde y col., 1993; Walde y col., 1988) tales como el sistema AOT-isooctano-agua (Menger y Yamada, 1979).

Las microcápsulas también se pueden generar por polimerización interfacial y complejación interfacial (Whateley, 1996). Las microcápsulas de este tipo pueden tener membranas rígidas, membranas no permeables, o membranas semipermeables. Todas las microcápsulas semipermeables rodeadas por membranas de nitrato de celulosa, membranas de poliamida y membranas de lípidos-poliamida pueden soportar reacciones bioquímicas, incluyendo sistemas multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Las microcápsulas de alginato/polilisina (Lim y Sun, 1980), que se pueden formar en condiciones muy suaves, también han demostrado ser muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un procedimiento eficaz de encapsulación de células y tejidos vivos (Chang, 1992; Sun y col., 1992).

También se pueden usar sistemas de microencapsulación no membranosos basados en el reparto de fases de un entorno acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.

Preferentemente, las microcápsulas de la presente invención se forman a partir de emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersa en la otra en forma de gotas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

Las emulsiones se pueden producir a partir de cualquier combinación de líquidos inmiscibles. Preferentemente la emulsión de la presente invención tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotas finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua) y un líquido hidrófobo inmiscible (un "aceite") como la matriz en la que se suspenden estas gotas (la fase no dispersa, continua o externa). Esas emulsiones se denominan "agua en aceite" (W/O). Esto tiene la ventaja de que toda la fase acuosa que contiene los componentes bioquímicos está compartimentada en gotas discretas (la fase interna). La fase externa, que es un aceite hidrófobo, generalmente no contiene ninguno de los componentes bioquímicos y por tanto es inerte.

La emulsión se puede estabilizar mediante la adición de uno o más agentes de superficie activa (tensioactivos). Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes y actúan en la superficie del agua/aceite para prevenir (o al menos retrasar) la separación de las fases. Se pueden usar muchos aceites y muchos emulsionantes para la generación de emulsiones de agua en aceite; una compilación reciente lista más de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites adecuados incluyen aceite mineral blanco ligero y tensioactivos no iónicos (Schick, 1966) tales como monooleato de sorbitán (Span^{TM} 80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitán (Tween^{TM} 80; ICI).

El uso de tensioactivos aniónicos también puede ser beneficioso. Los tensioactivos adecuados incluyen colato sódico y taurocolato sódico. Particularmente preferido es el dioxicolato sódico, preferentemente a una concentración del 0,5% en p/v, o inferior. En algunos casos la inclusión de estos tensioactivos puede incrementar la expresión de los elementos genéticos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada suprime completamente la traducción. Durante la emulsión, no obstante, el tensioactivo se transfiere desde la fase acuosa a la interfase y se restaura la actividad. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas a emulsionar asegura que las reacciones tienen lugar sólo después de la
compartimentación.

La creación de una emulsión generalmente requiere la aplicación de energía mecánica para forzar la unión de las fases. Hay una variedad de formas de hacer esto que utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como agitadores magnéticos, agitadores propelentes y de turbina, dispositivos de palas y batidoras), homogeneizadores (incluyendo homogeneizadores de rotor-estator, homogeneizadores de válvulas a presión elevada y homogeneizadores a chorro), molinillos de coloides, y dispositivos de ultrasonidos y de "emulsión de membranas" (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones de agua en aceite generalmente son estables con poco o ningún intercambio de los elementos genéticos o productos génicos entre microcápsulas. Adicionalmente, hemos demostrado que varias reacciones bioquímicas tienen lugar en las microcápsulas en emulsión. Además, en las microcápsulas en emulsión también están activos procesos bioquímicos complicados, de manera remarcable la transcripción y traducción génica. La tecnología existe para crear emulsiones con volúmenes en todo el intervalo hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

El tamaño de microcápsula preferido variará dependiendo de los requerimientos precisos de cualquier proceso de selección individual que se deba llevar a cabo de acuerdo con la presente invención. En todos los casos, habrá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la biblioteca génica, el enriquecimiento requerido y la concentración de componentes requerida en las microcápsulas individuales para conseguir la expresión y la reactividad eficientes de los productos génicos.

Los procesos de expresión se deben producir dentro de cada microcápsula individual proporcionada por la presente descripción. Tanto la transcripción in vitro como la transcripción-traducción acoplada se vuelve menos eficiente a concentraciones de ADN sub-nanomolares. Debido al requerimiento de que sólo estén presentes en cada microcápsula un número limitado de moléculas de ADN, esto establece un límite superior práctico en el posible tamaño de la microcápsula. Preferentemente, el volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x 10^{-16} m^{3}, (correspondiente a una microcápsula esférica de un diámetro inferior a 10 \mum, más preferentemente inferior a 6,5 x 10^{-17} m^{3} (5 \mum), más preferentemente de 4,2 x 10^{-18} m^{3} aproximadamente (2 \mum) e idealmente de 9 x 10^{-18} m^{3} aproximadamente
(2,6 \mum).

La concentración eficaz de ADN o ARN en las microcápsulas se debe incrementar artificialmente mediante diversos procedimientos que serán muy conocidos por aquellos versados en la materia. Éstos incluyen, por ejemplo, la adición de productos químicos que excluyen volumen tales como polietilenglicoles (PEG) y una variedad de técnicas de amplificación génica, incluyendo la transcripción usando ARN polimerasas, incluyendo aquellas de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts y col., 1975; Rosenberg y col., 1975), eucariotas, por ejemplo, (Weil y col., 1979; Manley y col., 1983) y bacteriófagos tales como T7, T3 y SP6 (Melton y col., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y col., 1988); amplificación de la replicasa Q\beta (Miele y col., 1983; Cahill y col., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev y col., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren y col., 1988; Barany, 1991); y el sistema de replicación de secuencias auto-sostenido (Fahy y col., 1991) y la amplificación por desplazamiento de la cadena (Walker y col., 1992). Se podrían usar incluso técnicas de amplificación génica que requieren ciclos térmicos tales como la PCR y la LCR si las emulsiones y los sistemas de transcripción o de transcripción-traducción acoplados in vitro fueran termoestables (por ejemplo, los sistemas de transcripción-traducción acoplados se podrían preparar a partir de un organismo termoestable tal como Thermus aquaticus).

El incremento de la concentración local eficaz de ácido nucleico permite usar eficazmente microcápsulas más grandes. Esto permite un límite superior práctico preferido para el volumen de la microcápsula de 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondiente a una esfera de un diámetro de 10 \mum).

El tamaño de la microcápsula debe ser suficientemente grande para acomodar todos los componentes necesarios de las reacciones bioquímicas que se necesita que se produzcan dentro de la microcápsula. Por ejemplo, in vitro, tanto las reacciones de transcripción como las reacciones de transcripción-traducción acopladas requieren una concentración total de nucleósido trifosfato de 2 mM aproximadamente.

Por ejemplo, para transcribir un gen a una única molécula corta de ARN de 500 bases de longitud, esto requeriría un mínimo de 500 moléculas de nucleósido trifosfato por microcápsula (8,33 x 10^{-22} moles). Para constituir una disolución 2 mM, este número de moléculas debe estar contenido dentro de una microcápsula de un volumen de 4,17 x 10^{-19} litros (4,17 x 10^{-22} m^{3}) que si fuese esférica tendría un diámetro de 93 nm.

Además, particularmente en el caso de reacciones que implican la traducción, se debe apreciar que los ribosomas necesarios para que se produzca la traducción tienen ellos mismos un diámetro de 20 nm aproximadamente. Por tanto, el límite inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de 0,1 \mum aproximadamente (100 nm).

Por tanto, el volumen de la microcápsula es preferentemente del orden de entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y 5,2 x 10^{-16} m^{3} correspondiente a una esfera de un diámetro de entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de entre 5,2 x 10^{-19} m^{3} y 6,5 x 10^{-17} m^{3} aproximadamente (1 \mum y 5 \mum). Diámetros de esfera de 2,6 \mum aproximadamente son más ventajosos.

No es una coincidencia que las dimensiones preferidas de los componentes (gotas de 2,6 \mum de diámetro medio) se parezcan mucho a aquellas de bacterias, por ejemplo, Escherichia son células cilíndricas de 1,1-1,5 x 2,0-6,0 \mum y Azotobacter son células ovoides de 1,5-2,0 \mum de diámetro. En su forma más simple, la evolución darwiniana está basada en un mecanismo "un genotipo, un fenotipo". La concentración de un único gen compartimentado, o genoma, cae desde 0,4 nM en un compartimento de 2 \mum de diámetro, a 25 pM en un compartimento de 5 \mum de diámetro. La maquinaria de transcripción/traducción procariota ha evolucionado para funcionar en compartimentos de ~1-2 \mum de diámetro, donde los genes únicos están a concentraciones aproximadamente nanomolares. Un único gen, en un compartimento de 2,6 \mum de diámetro está a una concentración de 0,2 nM. Esta concentración del gen es suficientemente elevada para una traducción eficiente. La compartimentación en ese volumen también asegura que incluso si sólo se forma una única molécula del producto génico ésta está presente a 0,2 nM aproximadamente, que es importante si el producto génico debe tener una actividad modificante del propio elemento genético. Así el volumen de la microcápsula se debe seleccionar teniendo en cuenta no sólo los requerimientos para transcripción y traducción del elemento genético, sino también la actividad modificante necesaria del producto génico en el procedimiento de la descripción.

El tamaño de las microcápsulas en emulsión se puede variar simplemente ajustando las condiciones de emulsión usadas para formar la emulsión según los requerimientos del sistema de selección. Cuanto mayor es el tamaño de la microcápsula, mayor es el volumen necesario para encapsular una biblioteca de un elemento genético dado, puesto que el último factor limitante será el tamaño de la microcápsula y así el número de microcápsulas posibles por unidad de volumen.

El tamaño de las microcápsulas se selecciona no sólo teniendo en cuenta los requerimientos del sistema de transcripción/traducción, sino también aquellos del sistema de selección empleado para el elemento genético. Así, los componentes del sistema de selección, tales como un sistema de modificación químico, pueden requerir volúmenes de reacción y/o concentraciones de reactivo que no son óptimos para la transcripción/traducción. Como se ha expuesto en el presente documento, esos requerimientos se pueden acomodar mediante una segunda etapa de re-encapsulación secundaria; además, se pueden acomodar seleccionando el tamaño de la microcápsula para maximizar la transcripción/traducción y la selección como un todo. Se prefiere la determinación empírica del volumen de microcápsula y la concentración de reactivo óptimas, por ejemplo, como se ha expuesto en el presente documento.

Un "elemento genético" de acuerdo con la presente invención es como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, un elemento genético es una molécula o construcción seleccionada del grupo constituido por una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o completamente artificial que consiste en bases exclusivamente sintéticas o una mezcla de bases de origen natural y sintéticas, una cualquiera de las anteriores unida a un polipéptido, o una cualquiera de las anteriores unida a cualquier otro grupo o construcción molecular. De manera ventajosa, el otro grupo o construcción molecular se puede seleccionar del grupo constituido por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo, perlas de poliestireno, sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, marcadores, tales como fluoróforos o marcadores isotópicos, reactivos químicos, agentes de unión tales como macrociclos y similares.

La fracción del ácido nucleico del elemento genético puede comprender secuencias reguladoras adecuadas, tales como aquellas necesarias para la expresión eficiente del producto génico, por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias de poliadenilación, sitios de procesamiento alternativo y similares.

Como será evidente a continuación, en muchos casos el polipéptido o el otro grupo o construcción molecular es un ligando o un sustrato que se une directa o indirectamente a o reacciona con el producto génico para marcar el elemento genético. Esto permite la clasificación del elemento genético en base a la actividad del producto génico.

En ligando o sustrato se puede conectar al ácido nucleico mediante una variedad de medios que serán evidentes para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996). Cualquier marcador que permita la selección posterior del elemento genético será suficiente. La clasificación puede ser mediante cualquier procedimiento que permita la separación, amplificación o supervivencia preferente del elemento genético marcado. Los ejemplos incluyen la selección por unión (incluyendo técnicas basadas en la separación magnética, por ejemplo, usando Dynabeads^{TM}), o por resistencia a la degradación (por ejemplo mediante nucleasas, incluyendo endonucleasas de restricción).

Una manera mediante la cual se puede unir la molécula de ácido nucleico a un ligando o sustrato es por biotinilación. Esto se puede llevar a cabo mediante amplificación por PCR con un cebador con biotinilación en 5' de manera que la biotina y el ácido nucleico estén unidos covalentemente.

El ligando o sustrato que se va a seleccionar se puede unir al ácido nucleico modificado mediante una variedad de medios que serán evidentes para aquellos expertos en la materia. Un ácido nucleico biotinilado se puede acoplar a una microcuenta de poliestireno (de 0,035 a 0,2 \mum de diámetro) que esté recubierta con avidina o estreptavidina, que por tanto se unirá al ácido nucleico con una afinidad muy elevada. Esta perla se puede funcionalizar con un sustrato o ligando mediante cualquier procedimiento adecuado tal como la adición de un sustrato biotinilado o por acoplamiento covalente.

Alternativamente, un ácido nucleico biotinilado se puede acoplar a avidina o estreptavidina complejada a una molécula de proteína grande tal como tiroglobulina (669 kDa) o ferritina (440 kDa). Este complejo se puede funcionalizar con un sustrato o ligando, por ejemplo, por acoplamiento covalente al grupo \varepsilon-amino de lisinas o mediante interacción no covalente tal como biotina-avidina. El sustrato puede estar presente en una forma no unida al elemento genético, pero que contiene un "marcador" inactivo que requiere una etapa adicional para activarlo tal como fotoactivación (por ejemplo, de un análogo de la biotina "enjaulado", (Sundberg y col., 1995; Pirrung y Huang, 1996)). El catalizador que se va a seleccionar a continuación convierte el sustrato en producto. A continuación el "marcador" se podría activar y el sustrato y/o producto "marcado" se podría unir mediante una molécula de unión al marcador (por ejemplo, avidina o estreptavidina) complejada con el ácido nucleico. La relación de sustrato a producto unido al ácido nucleico a través del "marcador" por tanto reflejará la relación del sustrato y el producto en disolución.

Una alternativa es acoplar el ácido nucleico a un anticuerpo específico de producto (u otra molécula específica del producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada microcápsula sin estar unido al elemento genético, pero tiene un "marcador" molecular (por ejemplo, biotina, DIG o DNP). Cuando el catalizador que se va a seleccionar convierte el sustrato en producto, el producto retiene el "marcador" y a continuación es capturado en la microcápsula por el anticuerpo específico de producto. De esta forma, el elemento genético sólo se asocia con el "marcador" cuando codifica o produce una enzima capaz de convertir el sustrato en producto.

Cuando se detienen todas las reacciones y se combinan las microcápsulas, los elementos genéticos que codifican las enzimas activas se pueden enriquecer usando un anticuerpo u otra molécula que se une, o reacciona específicamente con el "marcador". Aunque ambos sustratos y producto tienen el marcador molecular, sólo los elementos genéticos que codifican el producto génico activo se co-purificarán.

En el presente documento se usan los términos "aislamiento", "clasificación" y "selección", así como sus variaciones. El aislamiento, según la presente descripción, se refiere al proceso de separar una entidad de una población heterogénea, por ejemplo una mezcla, de manera que esté exenta de al menos una sustancia a la cual estaba asociada antes del proceso de aislamiento. En una forma de realización preferida, el aislamiento se refiere a la purificación de una entidad esencialmente hasta homogeneidad. La clasificación de una entidad se refiere al proceso de aislar preferentemente entidades deseadas sobre entidades no deseadas. En lo que se refiere al aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislamiento" y "clasificación" son equivalentes. El procedimiento de la presente descripción permite la clasificación de elementos genéticos deseados a partir de conjuntos (bibliotecas o repertorios) de elementos genéticos que contienen el elemento genético deseado. La selección se usa para referirse al proceso (incluyendo el proceso de clasificación) de aislamiento de una entidad según una de sus propiedades particulares.

En una aplicación muy preferida, el procedimiento de la presente descripción es útil para la clasificación de bibliotecas de elementos genéticos. Por consiguiente la descripción proporciona un procedimiento según aspectos precedentes de la descripción, en el que los elementos genéticos se aíslan a partir de una biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos. En el presente documento, los términos "biblioteca", "repertorio" y "conjunto" se usan según el significado ordinario en la materia, de manera que una biblioteca de elementos genéticos codifica un repertorio de productos génicos. En general, las bibliotecas se construyen a partir de conjuntos de elementos genéticos y tienen propiedades que facilitan su clasificación.

La selección inicial de un elemento genético a partir de una biblioteca de elementos genéticos usando la presente descripción en la mayoría de los casos requerirá la selección de un gran número de elementos genéticos variantes. Las bibliotecas de elementos genéticos se pueden crear de una variedad de formas diferentes, incluyendo las siguientes.

Los conjuntos de elementos genéticos de origen natural se puede clonar a partir de ADN o ADNc genómico (Sambrook y col.,1989); por ejemplo, las bibliotecas de anticuerpos de fagos, preparadas mediante amplificación por PCR de repertorios de genes de anticuerpos a partir de donantes inmunizados o no inmunizados han demostrado ser fuentes muy eficaces de fragmentos de anticuerpos funcionales (Winter y col., 1994; Hoogenboom, 1997). Las bibliotecas de genes también se pueden preparar codificando todos (véase, por ejemplo, Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de los genes (véase por ejemplo Lowman y col., 1991) o conjuntos de genes (véase por ejemplo Nissim y col., 1994) mediante un oligonucleótido sintético formado aleatoriamente o dopado. Las bibliotecas también se pueden preparar introduciendo mutaciones "aleatoriamente" en un elemento genético o conjunto de elementos genéticos mediante una variedad de técnicas in vivo, incluyendo el uso de "cepas mutadoras", de bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao y col., 1986; Yamagishi y col., 1990; Low y col., 1996); usando el sistema de hipermutación de anticuerpos de los linfocitos B (Yelamos y col., 1995). Las mutaciones aleatorias también se pueden introducir tanto in vivo como in vitro mediante mutágenos químicos, e ionización o irradiación UV (véase Friedberg y col., 1995), o la incorporación de análogos de bases mutagénicas (Freese, 1959; Zaccolo y col., 1996). Las mutaciones "aleatorias" también se pueden introducir en genes in vitro durante la polimerización, por ejemplo, usando polimerasas propensas a errores (Leung y col., 1989).

Se puede introducir una diversificación adicional usando la recombinación homóloga tanto in vivo (véase Kowalczykowski y col., 1994) como in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).

Según un aspecto adicional de la presente descripción, por tanto, se proporciona un procedimiento de evolución in vitro que comprende las etapas de:

(a): selección de uno o más elementos genéticos a partir de una biblioteca de elementos genéticos según la presente descripción;

(b): mutación del elemento(s) genético seleccionado para generar una biblioteca adicional de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos; y

(c): la repetición iterativa de las etapas (a) y (b) para obtener un producto génico con una actividad potenciada.

Las mutaciones se pueden introducir en el elemento(s) como se ha expuesto anteriormente.

Los elementos genéticos según la invención codifican enzimas de manera ventajosa, preferentemente de interés farmacológico o industrial, activadores o inhibidores, especialmente de sistemas biológicos, tales como mecanismos de transducción de señales celulares, anticuerpos y sus fragmentos, y otros agentes de unión adecuados para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. En un aspecto preferido, por tanto, la descripción permite la identificación y el aislamiento de productos clínica o industrialmente útiles. En un aspecto adicional de la descripción, se proporciona un producto cuando se aísla mediante el procedimiento de la descripción.

Es deseable la selección de condiciones de encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y el tamaño de la biblioteca que se va a seleccionar, puede ser beneficioso ajustar el procedimiento de encapsulación de manera que se encapsule 1 o menos de 1 elemento genético por microcápsula. Esto proporcionará el mayor poder de resolución. Cuando la biblioteca es más grande y/o más compleja, no obstante, esto puede ser impracticable; puede ser preferible encapsular varios elementos genéticos juntos y confiar en la aplicación repetida del procedimiento de la descripción para conseguir la clasificación de la actividad deseada. Se puede usar una combinación de procedimientos de encapsulación para obtener el enriquecimiento deseado.

Estudios teóricos indican que cuanto mayor es el número de variantes del elemento genético creado más probable es que se cree una molécula con las propiedades deseadas (véase Perelson y Oster, 1979 para una descripción de cómo se aplica esto a repertorios de anticuerpos). Recientemente también se ha confirmado de manera práctica que repertorios de fagos-anticuerpos más grandes de hecho dan lugar a más anticuerpos con mejores afinidades de unión que repertorios más pequeños (Griffiths y col., 1994). Para asegurarse de que se generan variantes raras y así son capaces de ser seleccionadas, es deseable un tamaño de biblioteca grande. Así, es beneficioso el uso de microcápsulas óptimamente pequeñas.

El mayor repertorio creado hasta la fecha usando procedimientos que requieren una etapa in vivo (presentación en fagos y sistemas Lacl) ha sido una biblioteca de 1,6 x 10^{11} clones de fagos-péptidos que requieren la fragmentación de 15 litros de bacterias (Fischy col., 1996). Los experimentos SELEX a menudo se llevan a cabo sobre un número muy grande de variantes (hasta 10^{15}).

Usando la presente descripción, a un diámetro de microcápsula preferido de 2,6 \mum, se puede seleccionar un tamaño repertorio de al menos 10^{11} usando 1 ml de fase acuosa en 20 ml de emulsión.

Además de los elementos genéticos descritos anteriormente, las microcápsulas según la descripción comprenderán componentes adicionales necesarios para que tenga lugar el proceso de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán, por ejemplo, aquellos necesarios para la transcripción y/o traducción del elemento genético. Éstos se seleccionan para los requerimientos de un sistema específico entre los siguientes; un tampón adecuado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los principios, enzimas y cofactores necesarios, ARN polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARNs de transferencia, ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés para permitir la selección del producto génico modificado.

Un tampón adecuado será uno en el que todos los componentes deseados del sistema biológico están activos y por tanto dependerá de los requerimientos de cada sistema de reacción específico. Los tampones adecuados para reacciones biológicas y/o químicas son conocidos en la materia y se proporcionan recetas en diversos textos de laboratorio, tal como Sambrook y col., 1989.

El sistema de traducción in vitro normalmente comprenderá un extracto celular, normalmente de bacteria (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley y col., 1991; Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976), o germen de trigo (Anderson y col., 1983). Están disponibles comercialmente muchos sistemas adecuados (por ejemplo, de Promega) incluyendo algunos que permitirán la transcripción/traducción acoplada (todos los sistemas bacterianos y los reticulocitos y los sistemas de extracto de germen de trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de aminoácidos usada si se desea puede incluir aminoácidos sintéticos, para incrementar el número posible o variedad de proteínas producidas en la biblioteca. Esto se puede conseguir cargando ARNt con aminoácidos artificiales y usando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que se va que se va a seleccionar (Ellman y col., 1991; Benner, 1994; Mendel y col., 1995).

Después de cada ronda de selección el enriquecimiento del conjunto de elementos genéticos para aquellos que codifican las moléculas de interés se puede someter a ensayo mediante reacciones de transcripción/replicación no compartimentada o transcripción-traducción acopladas in vitro. El conjunto seleccionado se clona en un vector plásmido adecuado y se produce ARN o una proteína recombinante a partir de los clones individuales para la purificación y el ensayo posteriores.

La descripción además se refiere a un procedimiento para producir un producto génico, una vez se haya clasificado un elemento genético que codifica el producto génico mediante el procedimiento de la descripción. Claramente, el propio elemento genético se puede expresar directamente mediante medios convencionales para producir el producto génico. No obstante, se pueden emplear técnicas alternativas, como será evidente para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la información genética incorporada en el producto génico se puede incorporar en un vector de expresión adecuado, y expresarse a partir de él.

La descripción también describe el uso de técnicas de selección convencionales para identificar compuestos que son capaces de interaccionar con los productos génicos identificados por el primer aspecto de la descripción. En formas de realización preferidas, el producto génico que codifica el ácido nucleico se incorpora a un vector, y se introduce en células hospedadoras adecuadas para producir líneas celulares transformadas que expresan el producto génico. A continuación se pueden producir las líneas celulares resultantes para un análisis cualitativo y/o cuantitativo reproducible del efecto(s) de fármacos potenciales que afectan a la función del producto génico. Así, se pueden emplear células que expresan el producto génico para la identificación de compuestos, particularmente compuestos de bajo peso molecular, que modulan la función del producto génico. Así las células hospedadoras que expresan el producto génico son útiles para la selección de fármacos y es un objeto adicional de la presente descripción proporcionar un procedimiento para identificar compuestos que modulan la actividad del producto génico, comprendiendo dicho procedimiento la exposición de células que contienen ADN heterólogo que codifica el producto génico, en el que dichas células producen el producto génico funcional, a al menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal cuya capacidad para modular la actividad de dicho producto génico se quiere determinar, y a continuación el control de dichas células para cambios provocados por dicha modulación. Ese análisis permite la identificación de moduladores, tales como agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos, del producto génico. Como se usa en el presente documento, un compuesto o señal que modula la actividad del producto génico se refiere a un compuesto que altera la actividad del producto génico de tal forma que la actividad del producto génico es diferente en presencia del compuesto o señal (comparada a la ausencia de dicho compuesto o señal).

Los ensayos de selección basados en células se pueden diseñar construyendo líneas celulares en las que la expresión de una proteína informadora, es decir, una proteína que se puede someter a ensayo fácilmente, tal como \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o luciferasa, depende del producto génico. Ese ensayo permite la detección de compuestos que modulan directamente la función del producto génico, tales como compuestos que antagonizan el producto génico, o compuestos que inhiben o potencian otras funciones celulares necesarias para la actividad del producto génico.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para afectar exógenamente al producto génico que depende de procesos que se producen en las células. Las células hospedadoras, por ejemplo células de mamífero, que producen el producto génico recombinante se pueden poner en contacto con un compuesto de prueba, y a continuación se puede evaluar su efecto(s) modulador comparando la respuesta mediada por el producto génico en presencia y ausencia del compuesto de prueba, o relacionando la respuesta mediada por el producto génico de las células de prueba, o las células control (es decir, células que no expresan el producto génico), a la presencia del compuesto.

En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un procedimiento para optimizar un proceso de producción que supone al menos una etapa que es facilitada mediante un polipéptido. Por ejemplo, la etapa puede ser una etapa catalítica, que es facilitada mediante una enzima. Así, la descripción proporciona un procedimiento para la preparación de un compuesto o compuestos que comprende las etapas de:

(a): proporcionar un protocolo de síntesis en el que al menos una etapa es facilitada por un polipéptido;

(b): preparar elementos genéticos que codifican variantes del polipéptido que facilita esta etapa;

(c): compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas;

(d): expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos dentro de las microcápsulas;

(e): clasificar los elementos genéticos que producen el producto(s) génico polipéptido con la actividad deseada; y

(f): preparar el compuesto o compuestos usando el producto génico polipéptido identificado en (e) para facilitar la etapa de síntesis pertinente.

Por medio de la descripción, se pueden optimizar las enzimas involucradas en la preparación de un compuesto mediante la selección para la actividad óptima. El procedimiento supone la preparación de variantes del polipéptido que se va a seleccionar, que equivale a una biblioteca de polipéptidos como se denomina en el presente documento. Las variantes se pueden preparar de la misma forma que las bibliotecas descritas en cualquier otra parte del presente documento.

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(B) Procedimientos de selección

El sistema se puede configurar para seleccionar moléculas de ARN, ADN o el producto génico proteína con actividad catalítica, reguladora o de unión.

(i) Selección por afinidad

En el caso de la selección de un producto génico con afinidad por un ligando específico, el elemento genético puede estar unido al producto génico en la microcápsula a través del ligando. Por tanto solamente los productos génicos con afinidad por el ligando se unirán al propio elemento genético y por tanto solamente los elementos genéticos que produzcan el producto activo serán retenidos en la etapa de selección. En esta forma de realización, el elemento genético comprenderá un ácido nucleico que codifica el producto génico unido a un ligando para el producto génico.

En esta forma de realización, todos los productos génicos que se va a seleccionar contienen un supuesto dominio de unión, que se debe seleccionar, y una característica común - un marcador. El elemento genético en cada microcápsula está físicamente unido al ligando. Si el producto génico producido a partir del elemento genético tiene afinidad por el ligando, se unirá a él y estará físicamente unido al mismo elemento genético que lo codifica, haciendo que el elemento genético esté "marcado". Al final de la reacción, se combinan todas las microcápsulas, y todos los elementos genéticos y productos génicos se reúnen juntos en un entorno. Los elementos genéticos que codifican los productos génicos que presentan la unión deseada se pueden seleccionar mediante purificación por afinidad usando una molécula que se una específicamente a, o reaccione específicamente con, el "marcador".

En una forma de realización alternativa, los elementos genéticos se pueden clasificar en base a que el producto génico, que se une al ligando, simplemente esconda el ligando de, por ejemplo, parejas de unión adicionales. En este caso, el elemento genético, en lugar de ser retenido durante una etapa de purificación por afinidad, se puede eluir selectivamente mientras están unidos otros elementos genéticos.

En una forma de realización alternativa, la descripción proporciona un procedimiento en el que en la etapa (b) los productos génicos se unen a elementos genéticos que los codifican. Los productos génicos junto con los elementos genéticos unidos se clasifican a continuación como resultado de la unión de un ligando a productos génicos con la actividad deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos pueden contener una región invariante que se une covalente o no covalentemente al elemento genético, y una segunda región que está diversificada para así generar la actividad de unión deseada.

La clasificación por afinidad depende de la presencia de dos miembros de un par de unión en condiciones tales que se pueda producir la unión. Para este propósito se puede usar cualquier par de unión. Como se usa en el presente documento, el término par de unión se refiere a cualquier par de moléculas capaces de unirse entre sí. Los ejemplos de pares de unión que se pueden usar en la presente invención incluyen un antígeno y un anticuerpo o uno de sus fragmentos capaces de unirse al antígeno, el par biotina-avidina/estreptavidina (Savage y col., 1994), un polipéptido de unión dependiente de calcio y su ligando (por ejemplo, calmodulina y un péptido de unión a calmodulina (Stofko y col., 1992; Montigiani y col., 1996), pares de polipéptidos que se unen para formar una cremallera de leucinas (Tripet y col., 1996), histidinas (normalmente péptidos de hexahistidina) y Cu^{2+}, Zn^{2+} y Ni^{2+} quelados, (por ejemplo, Ni-NTA; Hochuli y col., 1987), proteínas de unión a ARN y proteínas de unión a ADN (Klug, 1995) incluyendo aquellas que contienen motivos de dedos de cinc (Klug y Schwabe, 1995) y ADN metiltransferasas (Anderson, 1993), y sus sitios de unión a ácidos nucleicos.

(ii) Catálisis

Cuando la selección es por catálisis, el elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico capaz de actuar como catalizador, el producto génico catalizará la conversión del sustrato en el producto. Por tanto, al final de la reacción el elemento genético está físicamente unido al producto de la reacción catalizada. Cuando las microcápsulas se combinan y los reactivos se reúnen, los elementos genéticos que codifican las moléculas catalíticas se pueden enriquecer mediante la selección de cualquier propiedad específica al producto (Figura 1).

Por ejemplo, el enriquecimiento puede ser mediante purificación por afinidad usando una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) que se une específicamente al producto. De la misma forma, el producto génico puede tener el efecto de modificar un componente del ácido nucleico del elemento genético, por ejemplo, por metilación (o desmetilación) o mutación del ácido nucleico, haciéndolo resistente a o susceptible al ataque por nucleasas, tales como endonucleasas de restricción.

Alternativamente, la selección se puede llevar a cabo indirectamente mediante el acoplamiento de una primera reacción a reacciones posteriores que tienen lugar en la propia microcápsula. Hay dos formas generales de llevar esto a cabo. Primero, el producto de la primera reacción se podría hacer reaccionar con, o unirse mediante, una molécula que no reacciona con el sustrato de la primera reacción. Una segunda reacción acoplada sólo tendrá lugar en presencia del producto de la primera reacción. A continuación se puede purificar un elemento genético activo mediante la selección por las propiedades del producto de la segunda reacción.

Alternativamente, el producto de la reacción que se va a seleccionar puede ser el sustrato o un cofactor para una segunda reacción catalizada por enzimas. La enzima para catalizar la segunda reacción se puede traducir in situ en las microcápsulas o se puede incorporar a la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. La enzima acoplada generará un producto seleccionable sólo cuando la primera reacción tenga lugar.

Este concepto de acoplamiento se puede elaborar para incorporar múltiples enzimas, cada una usando como sustrato el producto de la reacción previa. Esto permite la selección de enzimas que no reaccionarán con un sustrato inmovilizado. También se puede diseñar para incrementar la sensibilidad mediante la amplificación de la señal si un producto de una reacción es un catalizador o un cofactor para una segunda reacción o serie de reacciones que dan lugar a un producto seleccionable (por ejemplo, véase Johannsson y Bates, 1988; Johannsson, 1991). Además un sistema de una cascada de enzimas puede estar basado en la producción de un activador de una enzima o la destrucción de un inhibidor de una enzima (véase Mize y col., 1989). El acoplamiento también tiene la ventaja de que se puede usar un sistema de selección común para todo un grupo de enzimas que generan el mismo producto y permite la selección de transformaciones químicas complicadas que no se pueden llevar a cabo en una sola etapa.

Ese procedimiento de acoplamiento permite así la evolución de nuevas "vías metabólicas" in vitro de forma fraccionada, seleccionando y mejorando la primera etapa y a continuación la siguiente. La estrategia de selección se basa en el producto final de la vía, de manera que todas las etapas previas se pueden evolucionar independiente o secuencialmente sin ajustar un nuevo sistema de selección para cada etapa de la reacción.

Expresado de una forma alternativa, se proporciona un procedimiento de aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico con una actividad catalítica deseada, que comprende las etapas de:

(1) expresión de elementos genéticos para dar sus respectivos productos génicos;

(2) permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato a un producto, que puede ser directamente seleccionable, o no, de acuerdo con la actividad deseada;

(3) opcionalmente el acoplamiento de la primera reacción a una o más reacciones posteriores, estando modulada cada reacción por el producto de las reacciones previas, y dando lugar a la creación de un producto final seleccionable;

(4) unión del producto de catálisis seleccionable a los elementos genéticos mediante cualquiera de:

a): acoplamiento de un sustrato a los elementos genéticos de tal forma que el producto permanece asociado a los elementos genéticos, o

b): reacción o unión del producto seleccionable a los elementos genéticos por medio de un "marcador" molecular adecuado unido al sustrato que permanece sobre el producto, o

c): acoplamiento del producto seleccionable (pero no del sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o la interacción con el producto; y

(5) selección del producto de catálisis, junto con el elemento genético al cual está unido, por medio de una reacción o interacción específicas con el producto, o mediante purificación por afinidad usando un "marcador" molecular adecuado unido al producto de catálisis, en el que en las etapas (1) a (4) cada elemento genético y el respectivo producto génico está contenido dentro de una microcápsula.

(iii) Regulación

Se puede usar un sistema similar para seleccionar propiedades reguladoras de enzimas.

En el caso de la selección de una molécula reguladora que actúa como activadora o inhibidora de un proceso bioquímico, los componentes del proceso bioquímico se pueden traducir in situ en cada microcápsula o se pueden incorporar a la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. Si el elemento genético que se va a seleccionar es para codificar un activador, la selección se puede llevar a cabo para el producto de la reacción regulada, como se ha descrito anteriormente en relación con la catálisis. Si se desea un inhibidor, la selección puede ser para una propiedad química específica del sustrato de la reacción regulada.

Por tanto se proporciona un procedimiento de clasificación de uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta una actividad reguladora deseada, que comprende las etapas de:

(2) permitir a los productos génicos activar o inhibir una reacción bioquímica, o una secuencia de reacciones acopladas, de acuerdo con la actividad deseada, de tal forma que permite la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;

(3) unión de la molécula seleccionable a los elementos genéticos mediante cualquiera de:

a): con la molécula seleccionable, o el sustrato del cual procede, unido a los elementos genéticos, o

b): la reacción o unión del producto seleccionable a los elementos genéticos, por medio de un "marcador" molecular adecuado unido al sustrato que permanece sobre el producto, o

c): acoplamiento del producto de catálisis (pero no del sustrato) a los elementos genéticos, por medio de una reacción o interacción específica de producto con el producto;

(4) selección del producto seleccionable, junto con el elemento genético al cual está unido, por medio de una reacción o interacción específica con el producto seleccionable, o mediante purificación por afinidad usando un "marcador" molecular adecuado unido al producto de catálisis.

en el que en las etapas (1) a (4) cada elemento genético y el respectivo producto génico está contenido dentro de una microcápsula.

(iv) Clasificación de la microcápsula

La descripción proporciona la clasificación de microcápsulas intactas en donde esto es posible mediante las técnicas de clasificación empleadas. Las microcápsulas se pueden clasificar como tales cuando el cambio inducido por el producto génico deseado se produce o se manifiesta él mismo en la superficie de la microcápsula o es detectable desde el exterior de la microcápsula. El cambio puede estar ocasionado por la acción directa del producto génico, o la acción indirecta, en el que una serie de reacciones, de las cuales una o más implican al producto génico con la actividad deseada, da lugar al cambio. Por ejemplo, la microcápsula puede estar configurada de tal manera que el producto génico se presente en su superficie y así es accesible a los reactivos. Cuando la microcápsula es una microcápsula membranosa, el producto génico puede estar dirigido o puede provocar el envío de una molécula a la membrana de la microcápsula. Esto se puede conseguir, por ejemplo, empleando una secuencia de localización de membrana, tales como aquellas procedentes de proteínas de membrana, que favorecerán la incorporación de una molécula fusionada o unida a la membrana de la microcápsula. Alternativamente, cuando la microcápsula se forma mediante el reparto de fases, tal como con emulsiones de agua en aceite, se ordenarán por sí mismas partes de una molécula que son más solubles en la fase extra-capsular de tal forma que estén presentes en los límites de la microcápsula.

No obstante, en un aspecto preferido de la descripción, la clasificación de la microcápsula se aplica a sistemas de clasificación que dependen de un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula, por ejemplo, sus características de absorción o emisión, por ejemplo, la alteración de las propiedades ópticas de la microcápsula que resulta de una reacción que da lugar a cambios en la absorbancia, luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia asociada a la microcápsula. Todas esas propiedades están incluidas en el término "óptico". En ese caso, las microcápsulas se pueden clasificar por clasificación activada por luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una forma de realización muy preferida, se emplea la clasificación activada por fluorescencia para clasificar microcápsulas en las que la producción de un producto génico con una actividad deseada está acompañada por la producción de una molécula fluorescente en la célula. Por ejemplo, el propio producto génico puede ser fluorescente, por ejemplo, una proteína fluorescente tal como la GFP. Alternativamente, el producto génico puede inducir o modificar la fluorescencia de otra molécula, tal como por unión a ella o reaccionando con ella.

(v) Identificación de la microcápsula

Las microcápsulas se pueden identificar en virtud de un cambio inducido por el producto génico deseado que se produce o se manifiesta él mismo en la superficie de la microcápsula o es detectable desde el exterior, como se ha descrito en la sección iii (Clasificación de la microcápsula). Este cambio, cuando se identifica, se usa para desencadenar la modificación del gen dentro del compartimento. En un aspecto preferido de la descripción, la identificación de la microcápsula depende de un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula que resulta de una reacción que da lugar a luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia dentro de la microcápsula. Por ejemplo, la identificación de luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia puede desencadenar el bombardeo del compartimento con protones (u otras partículas u ondas) que da lugar a la modificación del elemento genético. Previamente se ha descrito un procedimiento similar para la clasificación rápida de células (Keij y col., 1994). La modificación del elemento genético puede resultar, por ejemplo, del acoplamiento de un "marcador" molecular, enjaulado mediante un grupo protector fotolábil a los elementos genéticos: el bombardeo con protones de una longitud de onda apropiada da lugar a la eliminación de la jaula. A continuación, todas las microcápsulas se combinan y los elementos genéticos se reúnen juntos en un entorno. Los elementos genéticos que codifican los productos génicos que presentan la actividad deseada se pueden seleccionar mediante purificación por afinidad usando una molécula que se une específicamente a, o reacciona específicamente con, el "marcador".

(vi) Procedimiento multi-etapa

También se apreciará que según la presente descripción, no es necesario que todos los procesos de transcripción/replicación y/o traducción, y selección transcurran en una sola etapa, con todas las reacciones teniendo lugar en una microcápsula. El procedimiento de selección puede comprender dos o más etapas. Primero, la transcripción/replicación y/o traducción de cada elemento genético de una biblioteca de elementos genéticos puede tener lugar en una primera microcápsula. A continuación cada producto génico se une al elemento genético que lo codifica (que reside en la propia microcápsula). A continuación las microcápsulas se rompen, y los elementos genéticos unidos a sus respectivos productos génicos opcionalmente se purifican. Alternativamente, los elementos genéticos pueden estar unidos a sus respectivos productos génicos usando procedimientos que no dependen de la encapsulación. Por ejemplo, la presentación en fagos (Smith, G.P., 1985), presentación en polisoma (Mattheakkis y col., 1994), fusión de ARN-péptidos (Roberts y Szostak, 1997) o fusión del péptido del represor lac (Cull, y col., 1992).

En la segunda etapa del procedimiento, cada elemento genético purificado unido a su producto génico se pone en una segunda microcápsula que contiene los componentes de la reacción que se va a seleccionar. A continuación se inicia esta reacción. Después de completar las reacciones, las microcápsulas se rompen de nuevo y se seleccionan los elementos genéticos modificados. En el caso de reacciones multietapa complicadas en las que están involucrados muchos componentes individuales y etapas de reacción, se pueden llevar a cabo una o más etapas intermedias entre la etapa inicial de creación y la unión del producto génico al elemento genético, y la etapa final de generación del cambio seleccionable en el elemento genético.

(vii) Selección por activación de la expresión de un gen informador in situ

El sistema se puede configurar de manera que la actividad de unión, catalítica o reguladora deseada codificada por un elemento genético da lugar, directa o indirectamente, a la activación de la expresión de un "gen informador" que está presente en todas las microcápsulas. Sólo los productos génicos con la actividad deseada activan la expresión del gen informador. La actividad resultante de la expresión del gen informador permite la selección del elemento genético (o del compartimento que lo contiene) mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento.

Por ejemplo, la activación del gen informador puede ser el resultado de una actividad de unión del producto génico de una forma análoga al "sistema de dos híbridos" (Fields y Song, 1989). La activación también puede ser el resultado del producto de una reacción catalizada por un producto génico deseable. Por ejemplo, el producto de reacción podría ser un inductor transcripcional del gen informador. Por ejemplo, se podría usar arabinosa para inducir la transcripción desde el promotor araBAD. La actividad del producto génico deseable también podría dar como resultado la modificación de un factor de transcripción, dando como resultado la expresión del gen informador. Por ejemplo, si el producto génico deseado es una quinasa o fosfatasa, la fosforilación o desfosforilación de un factor de transcripción puede dar lugar a la activación de la expresión del gen informador.

(viii) Amplificación

Según un aspecto adicional de la presente descripción el procedimiento comprende la etapa adicional de amplificar los elementos genéticos. La amplificación selectiva se puede usar como medio para enriquecer elementos genéticos que codifican el producto génico deseado.

En todas las configuraciones anteriores, el material genético comprendido en los elementos genéticos se puede amplificar y el proceso se puede repetir en etapas iterativas. La amplificación puede ser mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki y col., 1988) o usando una de una variedad de otras técnicas de amplificación de genes incluyendo; amplificación de la replicasa Q\beta (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kumasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren y col., 1988; Barany, 1991); el sistema de replicación de secuencias auto-sostenido (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991) y la amplificación por desplazamiento de la cadena (Walker y col., 1992).

(ix) Compartimentación

Según un aspecto adicional de la presente descripción, se proporciona un procedimiento para compartimentar un elemento genético y expresar el elemento genético para formar su producto génico dentro del compartimento, que comprende las etapas de:

(a): formación de una disolución acuosa que comprende el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo para formar su producto génico;

(b): microencapsulación de la disolución para así formar una microcápsula discreta que comprende el elemento genético; y

(c): exposición de la microcápsula a condiciones adecuadas para que transcurra la expresión del elemento genético para formar su producto génico.

Las técnicas de microencapsulación adecuadas se describen con detalle en la siguiente descripción general.

Preferentemente, se encapsula una biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos mediante el procedimiento expuesto anteriormente, y los elementos genéticos expresados para producir sus respectivos productos génicos, de acuerdo con la invención. En una forma de realización muy preferida, la microencapsulación se consigue formando una emulsión de agua en aceite de la disolución acuosa que comprende los elementos genéticos.

Por consiguiente, la descripción también proporciona una microcápsula obtenible mediante el procedimiento expuesto anteriormente.

En los siguientes ejemplos se ilustran diversos aspectos y formas de realización de la presente invención y de la presente descripción.

Ejemplos Ejemplo 1 Producción de microcápsulas acuosas de 2 \mum en un sistema de emulsión de agua en aceite

Usando un sistema de emulsión de agua en aceite se pueden generar microcápsulas dentro del intervalo de tamaños preferido de la presente invención.

En el presente documento se usa aceite mineral blanco ligero (Sigma; M-3516) como fase continua y la emulsión se estabiliza mediante emulsionantes de monooleato de sorbitán (Span 80, Fluka; 85548) y monooleato de polioxietilensorbitán (Tween 80, Sigma Ultra; P-8074) y en algunos casos también con dioxicolato sódico al 0,5% en p/v (Fluka; 30970).

La fase oleosa se prepara al momento disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; P-8074). Se añaden gradualmente mezclas de reacción in vitro enfriadas en hielo (50 \mul) (en 5 alícuotas de 10 \mul durante ~2 minutos) a 0,95 ml de la fase oleosa enfriada en hielo en un vial Costar Biofreeze (2051) de 5 ml mientras se agita con un agitador magnético (8x3 mm con un anillo pivotante; Scientific Industries International, Loughborough, RU). Se prosigue con la agitación (a 1150 rpm) durante 1 minuto más en hielo. En algunas emulsiones la fase acuosa se suplementa con un tensioactivo aniónico - por ejemplo, dioxicolato sódico, colato sódico, glicocolato sódico, y taurocolato sódico, normalmente al 0,5% (p/v).

Cuando se indique, la emulsión se homogeniza adicionalmente usando un dispersor Ultra-Turrax T25 (IKA) equipado con una herramienta de dispersión de 8 mm de diámetro a 8.000, 9.000 ó 13.500 rpm durante 1 minuto o, a 20.000 rpm durante 1 ó 5 minutos, en hielo. Esto reduce el tamaño de la microcápsula.

Las reacciones se pueden inactivar y la emulsión se rompe como se indica en los ejemplos individuales, por centrifugación a 3.000 g durante 5 minutos y retirando la fase oleosa, dejando la emulsión concentrada en el fondo del vial. Se añade el tampón de inactivación (normalmente, 0,2 ml de 25 \mug/ml de ARN de levadura en tampón W+B: NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM a pH 7,4) y 2 ml de dietiléter saturado con agua y la mezcla se somete al vórtex, se centrifuga brevemente, y se retira la fase etérea. La fase acuosa se lava con éter y se seca (5 minutos en Speedvac a temperatura ambiente).

La distribución de tamaños de las gotas acuosas en las emulsiones se determinó por difracción láser usando un analizador del tamaño de partículas Coulter LS230. Una alícuota de la emulsión, recién diluida (1:10) en aceite mineral, se añade a la cámara de microvolumen que contiene el aceite mineral agitado. Los resultados se analizan con el instrumento incorporado en el modelo óptico de Mie usando índices de refracción de 1,468 para el aceite mineral y 1,350 para la fase acuosa. En la Figura 2 se muestra la distribución de tamaños de las gotas acuosas en la emulsión. La adición de dioxicolato sódico no altera significativamente la distribución de tamaños.

Ejemplo 2 Reacciones de transcripción in vitro eficientes llevadas a cabo en microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite

Para producir ARN a partir de ADN dentro de cada microcápsula, la única molécula de ADN presente dentro de cada microcápsula acuosa del sistema se debe transcribir eficazmente. En el presente documento, se demuestra la transcripción in vitro dentro de las microcápsulas.

El núcleo catalítico del intrón auto-procesado y empalmado de Tetrahymena es una ribozima muy estudiada que puede catalizar una variedad de reacciones de transferencia de fosfoéster (Sag y col., 1986; Sag y Czech, 1986; Sag y Czech, 1986). Por ejemplo, un intrón modificado de Tetrahymena al que le falta la estructura en horquilla P1 del extremo 5', y al que le faltan las estructuras en horquilla P9.1 y P9.2 en 3' puede funcionar como una ligasa de ARN, procesando y empalmando eficazmente juntos dos o más oligonucleótidos alineados sobre una cadena molde (Green y Szostak, 1992).

El ADN que codifica la ribozima de Tetrahymena descrita anteriormente se amplifica mediante PCR usando los cebadores P2T7Ba (que se hibrida a la región del bucle P2 y agrega un promotor de la ARN polimerasa de T7) y P9Fo (que se hibrida a la región del bucle P9). Esto genera un fragmento de ADN de 331 pares de bases que lleva el promotor de la ARN polimerasa de T7. Este fragmento se purifica directamente usando las preparaciones Wizard PCR Preps (Promega) y se usa como molde para una reacción de transcripción in vitro usando la ARN polimerasa de T7.

La transcripción in vitro se somete a ensayo durante un periodo inicial de 10 minutos, durante el cual la velocidad de reacción es esencialmente lineal (Chamberlin y Ring, 1973). Las condiciones de reacción para la transcripción son como las descritas por Wyatt y col., 1991.

La incorporación de UTP [\gamma-^{32}P] se usa para comprobar la progresión de la reacción.

Se prepara una reacción de transcripción en un volumen de \mul y se divide en dos alícuotas, cada una que contiene 3 x 10^{11} moléculas de ADN (5 nM). Se añade una alícuota de 1 ml a 2 ml de aceite mineral ligero Sigma que contiene el 4,5% de Span 80 y el 0,5% de Tween 80 y se homogeniza durante 5 minutos con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 20.000 rpm como en el Ejemplo 1. Basado en el volumen medio por microcápsula en estas emulsiones (2,8 x 10^{-19} m^{3} para una microcápsula de un diámetro de 0,81 \mum) los 100 \mul de reacción se dividirían en 3,6 x 10^{11} microcápsulas. Por tanto, debería haber de media 1 molécula de ADN por microcápsula.

Ambas alícuotas se incuban en un baño de agua a 37ºC. Se retiran sendas muestras de 0,5 ml de la emulsión antes del comienzo de la incubación y después de 10 minutos y se ponen en hielo. Se retiran al mismo tiempo muestras similares de 25 \mul de las reacciones control no emulsionadas. Las emulsiones se rompen y las reacciones se detienen con 0,5 ml de EDTA (50 mM) y 2 ml de dietiléter saturado con agua como se ha descrito en el Ejemplo 1. A continuación se añaden 100 \mul de ADN de esperma de salmón (500 \mug/ml) en EDTA 20 mM. A continuación se retiran 3 alícuotas de 100 \mul de las emulsiones y los controles y el ARN marcado se somete a ensayo por precipitación con TCA y recuento por centelleo.

La velocidad de transcripción se toma como el incremento en las cpm sensibles a ácido durante los 10 minutos de incubación a 37ºC. En la reacción control no emulsionada hay 442.000 cpm de material sensible a ácido comparado con las 147.000 cpm en la emulsión. Por tanto la velocidad de transcripción en la emulsión es el 33% de la encontrada en la reacción control no emulsionada.

Por tanto este procedimiento demuestra que se puede sintetizar eficazmente ARN mediante la ARN polimerasa de T7 en las microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite.

Ejemplo 3 Reacciones eficientes acopladas de transcripción/traducción in vitro llevadas a cabo en las microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite

Para sintetizar proteínas usando el procedimiento de la presente descripción, la traducción debe estar activa en las microcápsulas acuosas de la emulsión de agua en aceite descrita en el presente documento.

Aquí se muestra cómo se puede producir eficazmente una proteína (dihidrofolato reductasa de E. coli) a partir de ADN en las microcápsulas acuosas de un sistema en emulsión de agua en aceite usando un sistema de transcripción/traducción acoplado.

El gen folA de E. coli que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) se amplifica por PCR usando los oligonucleótidos EDHFRFo y EDHFRBa. A continuación este ADN se clona en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y KpnI aguas abajo tanto del promotor lac como del promotor de la ARN polimerasa de T7. El oligonucleótido EDHFRBa añade el sitio de inicio de la traducción eficiente del gen 10 del fago T7 aguas arriba del codón de iniciación de la DHFR.

La secuenciación de ADN identifica un clon que tiene la secuencia correcta de nucleótidos. Se encuentra que la bacteria transformada con este clon (pGEM folA) sobreexpresa la DHFR activa (llevada a cabo a partir del promotor lac) cuando se induce con IPTG.

A continuación el plásmido pGEM folA se amplifica por PCR usando los cebadores LMB2 y LMB3 en las condiciones descritas anteriormente para generar un fragmento de ADN de 649pb que lleva el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen folA. Este fragmento de PCR se purifica directamente usando la preparación Wizard PCR Preps (Promega) y se usa para programar un sistema de transcripción/traducción procariota acoplado in vitro diseñado para moldes lineales (Lesley, Brow y Burgess, 1991).

Se usa una preparación comercial de este sistema (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) suplementado con la ARN polimerasa de T7.

Se prepara una reacción de traducción de 300 \mul en hielo que contiene 3 x 10^{12} moléculas de ADN. Se añade la ARN polimerasa de T7 (10^{4} unidades) para llevar a cabo la transcripción y la proteína traducida se marca mediante la adición de [^{35}S]-metionina. Se añade una alícuota de 150 \mul de esta reacción a 2,85 ml de aceite mineral ligero Sigma que contiene el 4,5% de Span 80 y el 0,5% de Tween 80 y se homogeniza durante 1 minuto con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 20.000 rpm como en el Ejemplo 1. La otra alícuota no se emulsiona.

Basado en el volumen medio por microcápsula en las emulsiones (1,1 x 10^{-18} m^{3} para una microcápsula de un diámetro de 1,29 \mum) los 150 \mul de reacción se dividirían en 1,3 x 10^{11} microcápsulas. Por tanto, debería haber aproximadamente 11 moléculas de ADN por microcápsula.

Se retiran cuatro alícuotas de 0,5 ml de la mezcla de reacción en emulsión. Una alícuota se pone inmediatamente en hielo y las otras tres se incuban en un baño de agua a 25ºC durante 2 horas antes de ponerlas en hielo. También se retiran cuatro muestras de 25 \mul de la mezcla de reacción no emulsionada; una se pone inmediatamente en hielo y las otras tres se incuban en un baño de agua a 25ºC durante 2 horas y a continuación se ponen en hielo.

Las emulsiones se centrifugaron en una microcentrífuga a 13.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC y se retiró el aceite mineral quedando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Después de volver a centrifugar brevemente y retirar cualquier resto de aceite mineral, la emulsión se rompió y toda traducción adicional se detuvo añadiendo 100 \mul de agua que contiene 125 \mug/ml de puromicina, y 1 ml de agua saturada con dietiléter. Esta mezcla se pasó por el vórtex y se volvió a centrifugar en una microcentrífuga a 13.000 rpm durante 1 minuto a 4ºC. A continuación el éter y el aceite mineral disuelto se retiraron por aspiración y la extracción se repitió con 1 ml más de éter. Todo el éter restante se eliminó por centrifugación durante 5 minutos en un Speedvac a temperatura ambiente.

También se añadieron 100 \mul de agua que contiene 125 \mug/ml de puromicina a los 25 \mul de las reacciones control no emulsionadas. A continuación se precipitaron 25 \mul de cada una de las muestras con acetona y se corrieron en un gel SDS-PAGE al 20% según las instrucciones dadas por el fabricante del sistema de transcripción/traducción in vitro (Promega). El gel se secó y se escaneó usando un PhosphorImager (Molecular Dynamics). Se observa una única banda fuerte con el peso molecular esperado de la DHFR (18 kDa) en las reacciones llevadas a cabo en las emulsiones y en los controles. Esta banda se cuantifica de manera precisa.

En las reacciones emulsionadas el área media bajo el pico de 18 kDa es de 15.073 unidades mientras que el área media bajo el mismo pico en las reacciones control no emulsionadas es de 18.990 unidades. Por tanto, se calculó que en las reacciones emulsionadas la cantidad de proteína DHFR es el 79% de aquella encontrada en las reacciones control no emulsionadas. Por tanto esto indica que el sistema de transcripción/traducción es funcional en el sistema de emulsión de agua en aceite de la presente descripción.

Ejemplo 4 La dihidrofolato reductasa producida usando las reacciones acopladas de transcripción/traducción in vitro es activa

Aquí se muestra que se puede producir eficazmente la proteína (dihidrofolato reductasa de E. coli) en una forma catalíticamente activa mediante transcripción/traducción acoplada del gen folA en las microcápsulas acuosas de un sistema en emulsión de agua en aceite. En este ensayo, se usa una emulsión que comprende microcápsulas por debajo del tamaño óptimo; la actividad de la DHFR demuestra ser superior en las microcápsulas de tamaño más grande.

Se preparan \mul de las reacciones de traducción (sin marcar) en hielo que contienen 2 x 10^{11}, 6 x 10^{12} ó 1,8 x 10^{12} moléculas del ADN molde de folA usado en el Ejemplo 3, o sin ADN. Se añade la ARN polimerasa de T7 (6 x 10^{3} unidades) a cada reacción para llevar a cabo la transcripción.

Se añade una alícuota de 100 \mul de cada reacción a 1,9 ml de aceite mineral ligero Sigma que contiene el 4,5% de Span 80 y el 0,5% de Tween 80 y se homogeniza durante 1 minuto con un homogenizador Ultra-Turrax T25 equipado con una herramienta de dispersión de 8 mm de diámetro, a 20.000 rpm como en el Ejemplo 1. Después de la homogenización durante 1 minuto el diámetro medio de las partículas (en volumen) es de 1,30 \mum (1,28 \mum de media). El 98% en volumen de la fase interna (acuosa) está presente en partículas que varían entre 0,63 \mum y 2,12 \mum. Después de la homogenización durante 5 minutos el diámetro medio de las microcápsulas (en volumen) es de 0,81 \mum (0,79 \mum de media) y el 98% en volumen de la fase interna (acuosa) está presente en partículas que varían entre 0,41 \mum y 1,38 \mum.

Basado en el volumen medio por microcápsula en las emulsiones formadas en 1 minuto (1,1 x 10^{-18} m^{3} para una microcápsula de un diámetro de 1,299 \mum) los 100 \mul de reacción se dividirían en 8,7 x 10^{10} microcápsulas. Por tanto, debería haber 1,3, 3,9 ó 11,8 moléculas de ADN por microcápsula aproximadamente.

Basado en el volumen medio por microcápsula en las emulsiones formadas en 5 minutos (2,8 x 10^{-19} m^{3} para una microcápsula de un diámetro de 0,81 \mum) los \mul de reacción se dividirían en 3,6 x 10^{11} microcápsulas. Por tanto, debería haber 0,3, 1,0 ó 2,9 moléculas de ADN por microcápsula aproximadamente.

Las emulsiones, y la mezcla de reacción no emulsionada se incuban en un baño de agua a 25ºC. Se retiran muestras de 0,5 ml de la emulsión inmediatamente antes del comienzo de la incubación y después de 2 horas y se ponen en hielo. Se retiran muestras de 25 \mul de las reacciones control no emulsionadas a los mismos tiempos.

Las emulsiones se centrifugaron en una microcentrífuga a 13.000 rpm durante 5 minutos a 4ºC y el aceite mineral se retiró por aspiración, quedando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Después de volver a centrifugar brevemente y retirar cualquier resto de aceite mineral, la emulsión se rompió y toda traducción adicional se detuvo añadiendo 100 \mul de tampón A (imidazol 100 mM a pH 7,0, \beta-mercaptoetanol 10 mM), que contiene 125 \mug/ml de puromicina y 1 ml de dietiléter saturado con agua. La mezcla se pasó por el vórtex y se volvió a centrifugar en una microcentrífuga a 13.000 rpm durante 1 minuto a 4ºC. A continuación el éter y el aceite mineral disuelto se retiraron por aspiración y la extracción se repitió con 1 ml más de éter. Todo el éter restante se eliminó por centrifugación durante 5 minutos en un Speedvac a temperatura ambiente. También se añadieron 100 \mul de tampón A que contiene puromicina (125 \mug/ml) a los 25 \mul de las reacciones control no emulsionadas.

La actividad dihidrofolato reductasa se sometió a ensayo espectrofotométricamente controlando la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante el transcurso de 10 minutos como se describe por Williams y col., 1979; Ma y col., 1993. Se añadieron 10 \mul de cada reacción de traducción in vitro inactivada a 150 \mul de tampón A (imidazol 100 mM a pH 7,0, \beta-mercaptoetanol 10 mM) y 20 \mul de NADPH 1 mM. Se añadieron \mul de dihidrofolato (1 mM) (H_{2}F) después de 1 minuto y la reacción se controló a 340 nm usando un lector de microplacas ThermoMax (Molecular Devices). La actividad se calcula mediante las velocidades iniciales en condiciones de So>>K_{M} (\mu_{max}). La actividad de fondo en el extracto de S30 se resta de todas las muestras.

La actividad de la DHFR generada en las emulsiones se toma de la diferencia en la actividad medida a las 0 horas y a las 2 horas de incubación. No se produjo incremento de la oxidación de la NADPH entre las muestras de la hora 0 y la hora 2 cuando se añade metotrexato 0,1 \muM (un inhibidor específico de la DHFR), demostrando que todo el incremento observado en la oxidación de la NADPH es debido a la DHFR producida en las reacciones de traducción in vitro.

Usando 1 minuto de homogenización a 20.000 rpm, la actividad de la DHFR generada en las emulsiones es el 31% de aquella encontrada en las reacciones control no emulsionadas con 1,3 moléculas de ADN por microcápsula; el 45% con 3,9 moléculas de ADN por microcápsula; y el 84% con 11,8 moléculas de ADN por microcápsula.

Usando 5 minutos de homogenización a 20.000 rpm, la actividad de la DHFR generada en las emulsiones es el 7% de aquella encontrada en las reacciones control no emulsionadas con 0,3 moléculas de ADN por microcápsula; el 15% con 1 molécula de ADN por microcápsula; y el 35% con 2,9 moléculas de ADN por microcápsula, de media.

Asumiendo que la tasa de conversión de la DHFR es como se describe por Posner y col., 1996, esto corresponde a un rendimiento a la concentración más alta de ADN de 6,3 \mug (340 pmol) de DHFR por 100 \mul de reacción (control no emulsionada), 1,98 \mug (104 pmol) de DHFR por 100 \mul de reacción (emulsionado durante 1 minuto), o 0,46 \mug (24,8 pmol) de DHFR por 100 \mul de reacción (emulsionado durante 5 minuto). Esto equivale a 74 moléculas de DHFR por microcápsula en las emulsiones formadas durante 1 minuto y 44 moléculas por microcápsula en las emulsiones formadas durante 5 minutos (asumiendo que todas las microcápsulas son de tamaño medio).

La actividad de la DHFR resultante de la transcripción/traducción acoplada de los genes folA también se mide en las microcápsulas más grandes producidas sólo por agitación, o por agitación seguido de homogenización adicional con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 8.000 rpm, 9.000 rpm, o 13.500 rpm durante 1 minuto como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Figura 2b. La concentración de genes folA usada (2,5 nM) da una media de 1, 1,5 y 4,8 elementos genéticos por gota en las emulsiones homogenizadas a 13.500 rpm, 9.500 rpm y 8.000 rpm, respectivamente, y una media de 14 elementos genéticos por gota en la emulsión preparada sólo por agitación. La adición de dioxicolato sódico (0,5%) a la mezcla de reacción de traducción in vitro no afecta significativamente a la actividad de la DHFR observada en las emulsiones rotas.

Ejemplo 5 Unión de un sustrato inmovilizado a un elemento genético a través de una proteína de elevado peso molecular

Para unir múltiples moléculas de sustrato inmovilizadas a un fragmento de ADN que comprende el gen folA, primero se biotinila el fragmento de ADN y a continuación se acopla a un complejo de avidina con apoferritina. La apoferritina de bazo de caballo es una molécula de proteína grande, casi esférica, de 12,5 nm de diámetro que por tanto proporciona múltiples sitios que se pueden funcionalizar con el sustrato (por ejemplo, el grupo \varepsilon-amino de lisinas superficiales). El plásmido pGEM folA que codifica la DHFR de E. coli se amplifica por PCR usando los cebadores LMB3 y LMB2 biotinilado en 5' (LMB2-Biotina) para generar un fragmento de ADN biotinilado de 649 pb que lleva el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen folA (véase el Ejemplo 3). El ADN se marca radiactivamente suplementando los 500 \mul de la mezcla de reacción de la PCR con 100 \muCi de [\alpha-^{32}P]dCTP (Amersham; 3000 Ci/mmol). El fragmento biotinilado de la PCR se purifica directamente usando las preparaciones Wizard PCR Preps (Promega) y la concentración se determina espectrofotométricamente. El porcentaje de ADN biotinilado se somete ensayo mediante la unión a Streptavidin M-280 Dynabeads (Dynal) y se recuenta por centelleo. Usando esta técnica se determina que el 83% de ADN está biotinilado.

El hierro secuestrado se retira de un conjugado comercial de avidina y ferritina (Avidin-Ferritin; 1,1 moles de ferritina por mol de avidina aprox.; Sigma) por diálisis durante toda la noche (4ºC) de una disolución de avidina-ferritina en PBS (1 mg/ml) frente a ácido tioglicólico 0,12 M, pH 4,25, seguido de diálisis durante 24 horas frente a PBS (4ºC) como se describe por Kadir y Moore, 1990. La retirada del hierro se comprueba mediante el análisis del espectro de absorbancia (el Fe (III) secuestrado absorbe fuertemente a 310-360 nm).

0,3 pmol de ADN biotinilado marcado radiactivamente se incubaron con relaciones molares variables de avidina-apoferritina en PBS (volumen total 9 \mul) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se retira una alícuota de 4,5 \mul y el porcentaje de ADN complejado con avidina-apoferritina se sometió a ensayo usando un ensayo de desplazamiento de banda en un gel de agarosa al 1,5% como se describe por Berman y col., 1987. A continuación el gel se seca y se escanea usando un Phosphorlmager (Molecular Dynamics). El porcentaje de ADN restante sin desplazar (es decir, no complejado con la avidina-apoferritina) es del 17% (relación molar de avidina-apoferritina:ADN 1:1), del 15% (relación molar de avidina-apoferritina:ADN 5:1), o del 14% (relación molar de avidina-apoferritina:ADN 25:1). Esto significa que incluso a una relación de avidina-apoferritina:ADN de 1:1 básicamente todo el ADN biotinilado está unido. No se observa desplazamiento de la banda cuando el ADN biotinilado se mezcla con apoferritina o cuando el ADN no biotinilado se mezcla con avidina-apoferritina.

Los 4,5 \mul restantes de ADN complejado con avidina-apoferritina se usan como molde para 25 \mul de una reacción de transcripción/traducción in vitro (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega). Después de 2 horas a 25ºC, la reacción se detiene añadiendo 100 \mul de tampón A que contiene puromicina (125 \mug/ml). La actividad dihidrofolato reductasa se somete ensayo como anteriormente controlando espectrofotométricamente la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante el transcurso de 10 minutos.

Se añaden 10 \mul de cada reacción de traducción in vitro a 150 \mul de tampón A y 20 \mul de NADPH (1 mM). Se añaden 20 \mul de dihidrofolato (1 mM) (las emulsiones se rompieron y las reacciones se detuvieron con 0,5 ml de EDTA (50 mM) y 2 ml de dietiléter saturado con agua como se ha descrito en el Ejemplo 1) después de 1 minuto y la reacción se controla a 340 nm usando un lector de microplacas ThermoMax (Molecular Devices). No se encontró diferencia en la actividad de la DHFR incluso a las relaciones más altas de avidina-apoferritina:ADN comparada con el control sin avidina-apoferritina añadida. Esto indica que la gran mayoría del ADN se puede complejar sin comprometer la eficacia de la traducción in vitro.

Ejemplo 6 La transcripción-traducción in vitro y la actividad de la DHFR son compatibles en el mismo sistema

Para seleccionar la actividad de la DHFR producida in situ mediante transcripción-traducción acoplada tanto la reacción de transcripción-traducción como la DHFR deben estar activas en el mismo sistema tamponante.

Un ensayo directo para la actividad de la DHFR en un sistema de traducción in vitro completo de E. coli basado en el control espectrofotométrico de la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm no es práctico debido a la turbidez de los extractos de S30.

No obstante, es posible establecer que la DHFR es activa en el mismo sistema tamponante que en la traducción in vitro. La DHFR de E. coli se obtiene mediante inducción por IPTG de bacterias que contienen el plásmido pGEM-folA y purificado por afinidad sobre una columna de metotrexato-sefarosa (Baccanari y col., 1977).

La actividad de la DHFR se compara en el tampón A como anteriormente o en una mezcla de traducción in vitro completa excepto por la sustitución del tampón de diálisis S30 (Lesley 1995) (Tris-acetato 10 mM a pH 8,0, acetato de magnesio 14 mM, acetato de potasio 60 mM, DTT 1 mM) para la fracción S30. En cada caso el volumen de reacción total es de 200 \mul y la concentración de NADPH y las emulsiones se rompieron y las reacciones se detuvieron con 0,5 ml de EDTA (50 mM) y 2 ml de dietiléter saturado con agua como se ha descrito en el Ejemplo 1, cada uno 0,1 mM. Las reacciones se controlaron espectrofotométricamente a 340 nm. La adición de 1,75 pmol (1,3 mUnidades) de DHFR de E. coli da velocidades iniciales de -25,77 mDO/min (en tampón A) y -11,24 mDO/min (en el tampón de traducción), por tanto la reacción tiene una eficacia del 44% en el tampón de traducción con respecto a un tampón optimizado (tampón A).

Además, la presencia de los sustratos de la DHFR (NADPH y H_{2}F) a una concentración de 0,1 mM (solos o en combinación) no ocasiona ninguna inhibición de la producción de DHFR activa en una reacción de transcripción-traducción acoplada de 2 horas.

Ejemplo 7 La actividad de la DHFR sobre un elemento genético que contiene un sustrato dihidrofolato inmovilizado da lugar a la formación de un producto tetrahidrofolato unido al ácido nucleico que codifica la DHFR

Se sintetizó un péptido que comprende tres ácidos glutámicos unidos a través de sus \gamma-carboxilatos (usando el éster \alpha-bencílico del ácido N-fluorenilmetoxicarbonilglutámico como material de partida) con una lisina en el Extremo C-terminal y biotina unida a su grupo \varepsilon-amino modificando procedimientos publicados (Krumdiek y col., 1980). El ácido fólico se une al Extremo N-terminal y los grupos protectores bencilo y trifluoroacetamida se retiran por hidrólisis alcalina como se ha descrito previamente. El péptido se purifica por HPLC de fase inversa y se caracteriza por espectroscopia de masas y UV. Este péptido del ácido fólico se reduce químicamente al péptido del ácido dihidrofólico correspondiente (usando ditionato y ácido ascórbico) y a continuación al péptido del ácido tetrahidrofólico (usando borohidruro sódico) aplicando los procedimientos publicados (Zakrzewski y col., 1980). Estas transformaciones se caracterizan por espectroscopia UV.

Se construye un elemento genético mediante la unión, de media, de dos a tres moléculas del péptido del ácido fólico a avidina (o estreptavidina) junto con una molécula del ADN amplificado por PCR que codifica la DHFR procedente del plásmido pGEM-folA usando los cebadores LMB2-Biotina (ID SEC No. 9) y LMB3 (véase Ejemplo 3). El ácido fólico inmovilizado se reduce químicamente a dihidrofolato usando ditionato y ácido ascórbico y se purifica por diálisis frente a tampón A. La DHFR de E. coli se obtiene mediante la inducción por IPTG de bacterias que contienen el plásmido pGEM-folA y se purifica por afinidad en una columna de metotrexato-sefarosa. Se demuestra que la DHFR de E. coli reacciona con el ácido dihidrofólico inmovilizado a este elemento genético controlando la oxidación de NADPH a NADP espectrofotométricamente usando 0-10 \muM del péptido del ácido dihidrofólico unido a avidina y 0-50 \muM de NADPH. Por tanto, al final de esta reacción, el producto tetrahidrofolato esta unido al gen folA que codifica para la enzima (es decir, DHFR) que cataliza su formación.

Para aislar aquellos genes unidos al producto tetrahidrofolato hay dos aproximaciones. La primera supone la generación de los anticuerpos de presentación en el fago específicos para el tetrahidrofolato (Hoogenboom, 1997). La segunda aproximación está basada en el uso de un reactivo marcado que reacciona específicamente con el producto inmovilizado, pero no con el sustrato. Hemos sintetizado una molécula que consiste en un marcador de dinitrofenilo (DNP) unido a benzaldehído a través de un espaciador de 14 átomos. El grupo aldehído reacciona específicamente con el tetrahidrofolato para formar un aducto covalente (Kallen y Jencks, 1966) y la purificación por afinidad se puede llevar a cabo usando un anticuerpo anti-DNP.

Ejemplo 8 Procedimiento alternativo de selección para la actividad de la DHFR

La reacción catalizada por la DHFR se puede seleccionar mediante acoplamiento in situ a una segunda reacción, catalizada por la aldehído deshidrogenasa de levadura, con un sustrato "marcado".

En lugar de seleccionar los genes conectados a uno de los productos de la reacción de la DHFR (5,6,7,8-tetrahidrofolato o NADP^{+}) la reacción de la DHFR se acopla a una segunda reacción. La selección en este caso está mediada por la formación del segundo producto de la reacción catalizada por la DHFR - nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP^{+}).

La reacción que hemos escogido para acoplar está catalizada por la aldehído deshidrogenasa de levadura (YAD; EC 1.2.1.5). Esta enzima usa cualquiera de las dos de la NAD^{+} o NADP^{+} en la oxidación de un amplio espectro de aldehídos alifáticos y aromáticos a sus ácidos carboxílicos correspondientes, generando NADH o NADPH en el proceso. La reacción tiene la gran ventaja de ser esencialmente irreversible - a saber, las deshidrogenasas (incluyendo la DHFR y la YAD) no catalizan la reducción del ácido de vuelta al aldehído. Puesto que un gran número de enzimas que catalizan reacciones redox generan NAD^{+} o NADP^{+}, la reacción de la YAD también se puede usar en la selección de estas enzimas, y no está limitada solamente a la selección de la dihidrofolato reductasa.

Se sintetiza un sustrato pentaldehído y se une a un marcador DNP (dinitrofenilo) a través de un enlazador C_{20} (en lo sucesivo, DNP-PA). Se sigue la oxidación del DNP-PA al ácido correspondiente (DNP-PC) y por HPLC (columna de fase inversa C_{18}, gradiente de H_{2}O/CH_{3}CN + ácido trifluoroacético al 0,1%; tiempos de retención: DNP-PA, 5,0 min; DNP-PC, 4,26 min). La conversión de DNP-PA a DNP-PC sólo se observa en presencia de ambas YAD y NADP^{+}. Las reacciones también se siguen espectrofotométricamente; el incremento de la absorbancia a 340 nm indica que la NADP^{+} se convierte simultáneamente a NADPH.

La reacción de la DHFR-YAD acoplada se sigue usando el mismo ensayo de HPLC. La mezcla de reacción inicial contenía los sustratos para la DHFR-NADPH (50 \muM) y 7,8-dihidrofolato (H_{2}F; 50 \muM), YAD (Sigma, 0,5 unidades) y DNP-PA (50 \muM) en tampón a pH 7,7 (imidazol 100 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM y KCl 25 mM). Se observa la conversión de DNP-PA a DNP-PC cuando se añade DHFR a la mezcla de reacción anterior (DHFR 5 nM, 83%; 1,25 nM, 14,5% después de 32 minutos).

La concentración de DHFR obtenida en la traducción compartimentada in vitro es, de hecho, mucho mayor a 5 nM (véase Ejemplo 4). La conversión de DNP-PA a DNP-PC es insignificante en ausencia de DHFR, o cuando está presente el metotrexato (MTX) (10 \muM) - un potente inhibidor de la enzima. Por tanto, la formación del producto secundario, DNP-PC, está ligada a la presencia de la DHFR.

Usando esta reacción acoplada, las proteínas que confieren actividad DHFR se pueden seleccionar mediante: i) la unión de los genes a anticuerpos que unen específicamente el producto carboxílico de DNP-PA, y ii) el aislamiento de estos genes mediante purificación por afinidad usando un anticuerpo anti-DNP.

Esta aproximación se demuestra mediante un inmunoensayo rutinario basado en el catELISA (Tawfik y col., 1993). Placas de microtitulación se recubren con inmunoglobulinas anti-conejo (Sigma, 10 \mug/pocillo) seguido de suero policlonal de conejo que une específicamente derivados del ácido glutárico (Tawfik y col., 1993) diluido a 1:500 en tampón fosfato salino + 1 mg/ml de BSA. Las placas se enjuagan y se bloquean con BSA. Las mezclas de reacción acopladas descritas anteriormente se diluyen en tampón Tris/BSA (Tris 50 mM, cloruro sódico 150 mM, 10 mg/ml de BSA, pH 7,4) y se incuban durante 1 h. La placa se enjuaga y se añade un anticuerpo anti-DNP (SPE21.11 monoclonal de ratón) diluido en el mismo tampón (1:10.000) y se incuba durante una hora. La placa se enjuaga y se añade anticuerpo anti ratón marcado con peroxidasa (Jackson) seguido de un sustrato peroxidasa (BM Blue; Boehringer Mannheim). Sólo se observa una señal específica en las muestras de las reacciones acopladas que contenían la DHFR (además de H_{2}F, NADPH, YAD y DNP-PA).

Se usan anticuerpos anti-ácido carboxílico muy específicos (Tawfik y col., 1993) para la selección en dos formatos.

En el primero, el anticuerpo anti-ácido carboxílico se acopla químicamente a una avidina (o estreptavidina) de elevado peso molecular que contiene un complejo como aquel descrito en el Ejemplo 5. El ADN biotinilado que codifica la DHFR se acopla a este complejo a través de la interacción avidina-biotina como se ha descrito en el Ejemplo 5. A continuación este complejo se usa en un sistema de transcripción/traducción acoplado compartimentado que también contiene YAD y un sustrato de la YAD marcado tal como DNP-PA. Si hay actividad DHFR en el compartimento el DNP-PA se convierte a DNP-PC. Los anticuerpos anti-ácido carboxílico, acoplados al ADN a través del complejo de elevado peso molecular sólo capturarán moléculas de DNP-PC y no moléculas de aldehído. El ADN de estos compartimentos que contienen la DHFR activa (y por tanto que codifican DHFR activa si sólo hay una molécula de ADN por compartimento) a continuación se purifican por afinidad usando anticuerpos anti-DNP.

En el segundo formato, múltiples moléculas de estreptavidina se acoplan juntas en un complejo de elevado peso molecular que se puede acoplar fácilmente a ADN biotinilado que codifica la DHFR (véase Ejemplo 5). Este complejo se usa en un sistema de transcripción/traducción acoplado compartimentado que también contiene la YAD y un sustrato de la YAD tal como MeNPOC-biotina-benzaldehído. El grupo biotina en el MeNPOC-biotina-benzaldehído está "enjaulado" (Sundberg y col., 1995; Pirrung y Huang, 1996), esto es, no puede ser unido por la avidina o estreptavidina hasta que se haya escindido por irradiación con luz un grupo fotoeliminable nitrobencilo. Si hay actividad DHFR en el compartimento el MeNPOC-biotina-benzaldehído se convierte a MeNPOC-biotina-ácido benzoico. Después de que la reacción compartimentada haya transcurrido durante un rato, la reacción se irradia con luz y se retira el grupo nitrobencilo y el compuesto se unirá al complejo de estreptavidina-ADN. El ADN en aquellos compartimentos que contienen la DHFR activa (y por tanto que codifican DHFR activa si sólo hay una molécula de ADN por compartimento) se compleja con biotina-ácido benzoico (en lugar de biotina-benzaldehído) y se puede purificar por afinidad usando anticuerpos anti-ácido benzoico inmovilizados.

La presencia de otras enzimas que pueden catalizar la oxidación de NAD^{+} o NADP^{+} a NADH o NADPH en el sistema de transcripción/traducción in vitro puede, en ciertas circunstancias, hacer difícil el uso de este sistema YAD para la selección directamente en el sistema de transcripción/traducción in vitro compartimentado. En este caso la selección se lleva a cabo usando el sistema de compartimentación en dos etapas descrito anteriormente. Esto es, la DHFR primero se traduce en compartimentos y a continuación se une al ADN en el mismo compartimento por medio de un marcador de afinidad adecuado. La emulsión se rompe, los contenidos de los compartimentos se reúnen y el ADN se purifica por afinidad lejos de los otros componentes del sistema de transcripción/traducción (incluyendo óxido-reductasas contaminantes), usando anticuerpos específicos para un "marcador" digoxigenina unido a un extremo de la molécula de ADN. Las moléculas de ADN purificadas, junto con la proteína DHFR unida, a continuación se ponen en una mezcla de reacción que contenía los sustratos para la DHFR - NADPH (50 \muM) y 7,8-dihidrofolato (H_{2}F; 50 \muM), YAD (Sigma, 0,5 unidades) y DNP-PA (50 \muM) en tampón a pH 7,7 (imidazol 100 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM y KCl 25 mM) y la reacción se vuelve a compartimentar por emulsión para dar sólo una, o como máximo unas pocas, moléculas de ADN por compartimento. Los anticuerpos anti-ácido carboxílico (Tawfik y col., 1993) se usan para la selección en cualquiera de los dos formatos descritos anteriormente.

Ejemplo 9 Metilación de elementos genéticos mediante productos génicos

Las metiltransferasas de ADN, producidas mediante transcripción/traducción in vitro en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite, metilan las moléculas de ADN que las codifican en los compartimentos.

La selección de proteínas con actividades de unión o catalíticas usando el sistema de compartimentación descrito en el presente documento presenta dos requerimientos básicos: i) se expresa una sola molécula de ADN (o como máximo unas pocas moléculas) que codifica las proteínas que se van a seleccionar en una forma biológicamente activa mediante un sistema de transcripción/traducción acoplado en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite; y, ii) la proteína que se va a seleccionar debe ser capaz de modificar el elemento genético que lo codifica de tal forma que lo haga seleccionable en una etapa posterior. En este ejemplo, describimos un grupo de proteínas - metiltransferasas de ADN (tipo II) - que se producen eficazmente en los compartimentos acuosos de un sistema en emulsión de agua en aceite usando un sistema de transcripción/traducción acoplado. Además, las metiltransferasas de ADN traducidas in vitro modifican eficazmente las moléculas de ADN que las codifican in situ en los compartimentos acuosos de manera que se pueden seleccionar y amplificar. Los sitios diana sobre las moléculas de ADN están modificados por metilación de una citosina en posición C5 que hace a los sitios resistentes a la escisión por la endonucleasa de restricción cognada (es decir, HhaI para M.HhaI, y HaeIII para M.HaeIII). Por tanto, el ADN metilado es seleccionable sobre el ADN no metilado en virtud de su resistencia a la escisión por la endonucleasa de
restricción.

El gen que codifica la M.HhaI se amplifica por PCR usando los oligonucleótidos HhaI-Fo2S y HhaI-Bc directamente de Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 10014). El gen que codifica M.HaeIII se amplifica por PCR usando los oligonucleótidos HaeIII-Fo2s y HaeIII-Bc (ID SEC No. 4) directamente de Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC 11116). Ambos fragmentos de PCR se clonan en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y KpnI aguas abajo del promotor lac y del promotor de la ARN polimerasa de T7. Los oligonucleótidos HhaI-Bc y HaeIII-Bc (ID SEC No. 4) llevan el sitio eficiente de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7 aguas arriba del codón de iniciación del gen de la metiltransferasa. El oligonucleótido HhaI-Fo lleva un sitio de metilación/restricción (M/R) de HhaI y un sitio HaeIII (NotI) para funcionar como sustratos para M. HhaI y M.HaeIII, respectivamente. El oligonucleótido HaeIII-Fo lleva un sitio de M/R de NotI/HaeIII que funciona como sustrato para M.HaeIII (el gen M.HaeIII ya contiene dos sitios de M/R de HhaI). La secuenciación de ADN identifica clones con la secuencia de nucleótidos correcta.

Los plásmidos pGEM-M.HhaI y pGEM-M.HaeIII descritos anteriormente se amplifican por PCR usando los cebadores LMB2-Biotina (ID SEC No. 9) y LMB3-DIG (ID SEC No. 10) como anteriormente para generar un fragmento de ADN DIG-M.HhaI-Biotina de 1167 pares de bases o DIG-M.HaeIII-Biotina de 1171 pares de bases, marcados en un extremo por biotina y en el otro extremo por digoxigenina, y que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios de M/R de HaeIII y HhaI. Cada uno de los fragmentos de la PCR se purifica directamente usando las preparaciones Wizard PCR Preps (Promega).

Los genes necesarios para la transcripción-traducción acoplada in vitro de M.EcoRI y M.EcoRV se amplifican por PCR usando los plásmidos pMB1 (Betlach y col., 1976) y pLB1 (Bougueleret y col., 1984) respectivamente, como moldes, un cebador inverso que lleva el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7 y LMB3 aguas arriba del sitio de unión del ribosoma al gen de la metiltransferasa (EcoRI-Bc o EcoRV-Bc) y un cebador directo (EcoRI-Fo o EcoRI-Fo) que lleva LMB2. Estos fragmentos se amplifican posteriormente por PCR usando los cebadores LMB2-Biotina (ID SEC No. 9) y LMB3-DIG (ID SEC No. 10) como se ha descrito anteriormente para generar los fragmentos de ADN DIG-M.EcoRI-Biotina y DIG-M.EcoRV-Biotina que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios de M/R de EcoRI y EcoRV. Cada uno de estos fragmentos de la PCR se purifica directamente usando las preparaciones Wizard PCR Preps (Promega).

Los genes de las ADN-metilasas amplificados por PCR descritos anteriormente se expresan en un sistema procariota de transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para moldes lineales (Lesley y col., 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) suplementado con la ARN polimerasa de T7 y S-adenosil metionina (SAM) a una concentración de 80 \muM.

La metilación se somete a ensayo midiendo la resistencia a la escisión de los fragmentos de ADN marcados con DIG y biotina mediante la enzima de restricción cognada usando el ELISA de DIG-Biotina de Boehringer-Mannheim o con fragmentos de ADN marcados radiactivamente y perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Las mezclas de reacción in vitro que contienen los fragmentos marcados con DIG-Biotina hechos reaccionar in situ por transcripción-traducción acoplada in vitro como se describe a continuación se diluyen en tampón 1xWyB (NaCl 1 M, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) + Tween-20 al 0,1% (la concentración del ADN marcado con DIG/Biotina en el ensayo está en el intervalo de 0-250 pM) y se incuban en placas de microtitulación recubiertas con estreptavidina (de gran capacidad) durante 30-60 minutos. La placa se enjuaga (3 x 2xWyB y finalmente se trata con Tris 50 mM pH 7,4 + MgCl_{2} 5 mM) y se añaden las enzimas de restricción (NEB) (10-50 unidades de enzima en 0,2 ml del tampón correspondiente) y se incuban a 37ºC durante 3-12 horas. La placa se enjuaga y se añaden anticuerpos anti-DIG unidos a peroxidasa (diluidos a 1:1500 en PBS + Tween 20 al 0,1% + 2 mg/ml de BSA) durante 40-60 minutos seguido del sustrato peroxidasa (BM Blue; 70 \mul/pocillo). La absorbancia se mide (a 450 sin 650 nm) después de inactivar con H_{2}SO_{4} 0,5 M (130 \mul/pocillo).

Para el ensayo radiactivo, los plásmidos y los fragmentos de la PCR descritos anteriormente se amplifican por PCR usando los cebadores LMB2-Biotina (ID SEC No. 9) y LMB3 y \alpha-^{32}P-CTP para dar fragmentos de ADN marcados con ^{32}P, marcados en un extremo por biotina y que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios de M/R pertinentes. Estos fragmentos de PCR se purifican directamente usando las preparaciones Wizard PCR Preps (Promega). Las mezclas de reacción que contienen el ADN marcado con biotina ^{32}P reaccionadas in situ por transcripción-traducción acoplada in vitro se diluyen en tampón 1xWyB + Tween 20 al 0,1% y se incuban con perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynal, M-280; 1-5 x10^{6} perlas) durante 30-60 minutos. Las perlas se separan y se enjuagan (3 x 2xWyB + Tween 20 al 0,1% + BSA al 3% y finalmente se tratan con Tris 50 mM pH 7,4 + MgCl_{2} 5 mM). Se añaden las enzimas de restricción (NEB) (10-50 unidades de enzima en 50-150 \mul del tampón correspondiente) y se incuban a 37ºC durante 5-20 horas. Se retira el sobrenadante y las perlas se enjuagan y se resuspenden en 100 \mul de agua. La cantidad de ADN marcado radiactivamente sobre las perlas y en el sobrenadante se determina por centelleo.

Las cuatro metilasas descritas en el presente documento - M.HaeIII, M.HhaI, M.EcoRI y M.EcoRV - se expresan y son activas en la transcripción/traducción acoplada in vitro. Además, la metilasa traducida in vitro puede metilar su propio gen haciéndolo así resistente a la escisión por la metilasa cognada (auto-metilación). Ambos procesos, la transcripción-traducción acoplada in vitro del gen de la metilasa así como su metilación tiene lugar eficientemente en la propia mezcla de reacción. Más específicamente, los fragmentos de ADN (a concentraciones de 0,5 a 10 nM) que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7, un gen de la metiltransferasa y los sitios de M/R de las cuatro metilasas se vuelven resistentes a la escisión por la endonucleasa de restricción cognada. Por ejemplo, el fragmento de ADN que codifica la metiltransferasa M.EcoRI se vuelve resistente a la escisión por EcoRI (75-100% después de 20-90 minutos a 25ºC) cuando se incuba con E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega), SAM (80 \muM) y ARN polimerasa de T7. La resistencia a la escisión como resultado de la metilación es selectiva y específica: bajo las mismas condiciones, no se observa la resistencia a la escisión por HhaI o M.EcoRV; además, no se observa la resistencia a la escisión por EcoRI cuando se inhibe la traducción (por ejemplo, en presencia de puromicina o en ausencia de la ARN polimerasa de T7). Se obtuvieron resultados similares cuando la supervivencia de los genes se somete a ensayo por ELISA de DIG-Biotina o con fragmentos de ADN marcados con biotina ^{32}P como se ha descrito anteriormente. También se observa la metilación en trans, es decir, de fragmentos de ADN (aparte de aquellos que codifican para la metilasa cognada) que llevan los sitios de M/R en el sistema de transcripción-traducción acoplado in vitro S30 de E. coli en presencia de un gen que codifica para una metilasa.

Ambos procesos, la transcripción-traducción acoplada in vitro de los genes de la metilasa así como su auto-metilación tienen lugar eficientemente en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite. Más específicamente, los fragmentos de ADN (a concentraciones de 0,1-10 nM) que llevan el promotor de la ARN polimerasa de T7, el sitio de inicio de la traducción del gen 10 del fago T7, el gen de la metiltransferasa (por ejemplo, M. Hhal) y los sitios de M/R de HaeIII, HhaI y EcoRI se añaden a E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega) en presencia de SAM (80 \muM) y la ARN polimerasa de T7. Las mezclas de reacción enfriadas en hielo se emulsionan homogenizando durante 1 minuto con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 20.000 rpm como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se incuban a 25-30ºC durante 0-180 minutos. La reacción se detiene y la fase acuosa se separa (véase Ejemplo 1) y la metilación de los fragmentos de ADN de DIG-Biotina o marcados con biotina ^{32}P se someten a ensayo como se ha descrito anteriormente. Se observa una metilación de hasta el 20% de los genes compartimentados a escindir por HhaI después de 60-180 minutos de incubación. No se observa resistencia cuando la emulsión enfriada en hielo se rompe justo después de que se prepara y la reacción se inactiva por extracción con éter ("0 minutos"). La metilación es selectiva: en las mismas condiciones, no se observa resistencia a la escisión por HaeIII o EcoRI. Además, el ensayo de los fragmentos de ADN marcados con ^{32}P ha demostrado que la auto-metilación de ambas M.HaeIII y M.HhaI tiene lugar a concentraciones de los genes que corresponden a una media de menos de un gen por compartimento (0,1-0,5 nM; véase Ejemplo 4). Así, la transcripción-traducción acoplada in vitro de los genes de las metilasas, así como su auto-metilación, tiene lugar eficazmente incluso cuando sólo está presente un único elemento genético en los compartimentos acuosos de la emulsión de agua en aceite.

La actividad metilasa de HaeIII que resulta de la transcripción/traducción acoplada de los genes M.HaeIII también se mide en las microcápsulas más grandes producidas sólo por agitación, o por agitación seguida de homogenización adicional con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 8.000 rpm, 9.000 rpm, o 13.500 rpm durante 1 minuto como se ha descrito en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Figura 2b. La concentración de genes M.HaeIII usada (2,5 nM) da una media de 1, 1,5 y 4,8 elementos genéticos por gota en las emulsiones homogenizadas a 13.500 rpm, 9.500 rpm y 8.000 rpm, respectivamente, y una media de 14 elementos genéticos por gota en la emulsión preparada sólo por agitación. La adición de un tensioactivo aniónico - por ejemplo, dioxicolato sódico, normalmente al 0,5% (p/v), a la mezcla de traducción in vitro incrementa significativamente el porcentaje de elementos genéticos metilados en las emulsiones.

Ejemplo 10 Elementos genéticos que codifican metiltransferasas de ADN se pueden seleccionar y amplificar siguiendo su auto-metilación en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite

La metilación de genes que codifican para metilasas de ADN permite que sean aislados y amplificados en una etapa posterior. El ADN metilado es seleccionable sobre el ADN no metilado en virtud de su resistencia a la escisión por las endonucleasas de restricción. Así, los elementos genéticos que permanecen intactos después del tratamiento con la enzima de restricción cognada se pueden amplificar por PCR. No obstante, esa selección obviamente es inviable si están presentes otros genes que contienen el mismo sitio de R/M pero que no codifican para la metilasa en la misma mezcla de reacción. Esto es debido a que la metilación cruzada de los genes no metilasa (que están presentes en un gran exceso) los hará resistentes a la escisión por la enzima de restricción cognada y así amplificables por PCR. Bajo estas condiciones, la selección de genes que codifican la metilasa será posible sólo si están compartimentados - a saber, si sólo uno, o unos pocos genes están presentes en un único compartimento de manera que la auto-metilación es el proceso principal en ese compartimento. Se evita la metilación cruzada puesto que los genes no metilasa que están presentes en compartimentos que no contienen un gen metilasa permanecerán sin metilar.

Los genes usados en el experimento son un fragmento de M.HaeIII de 1194 pares de bases (DIG-M.HaeIII-3s-Biotina) que codifica la metilasa HaeIII y un fragmento folA de 681 pares de bases (DIG-folA-3s-Biotina) que codifica la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) que contienen sitios de restricción/modificación de HaeIII y HhaI adicionales (véase Figura 1b). Ambos fragmentos de ADN están marcados en un extremo con digoxigenina (DIG y en el otro extremo con biotina, y contienen un promotor de la ARN polimerasa de T7 (promotor de T7) y el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 de T7 (rbs) para la expresión in vitro.

El pGEM-4Z-3s se crea hibridando los oligonucleótidos HaeHha-Pl y HaeHha-Mi (ID SEC No. 2) (Tabla 1) y ligándolos a pGEM-4Z (Promega) cortado con HindIII y EcoRI. El gen M.HaeIII se amplifica por PCR a partir de Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC 11116) usando los oligonucleótidos HaeIII-FoNC (ID SEC No. 3) y HaeIII-Bc (ID SEC No. 4) (Tabla 1). El gen folA se amplifica a partir de Escherichia coli usando los cebadores EDHFR-Fo (ID SEC No. 5) y EDHFR-Ba (ID SEC No. 6) (Tabla 1). Ambos genes amplificados se digieren con HindIII y KpnI y se clonan en pGEM-4Z-3s, creando los vectores de expresión pGEM-HaeIII-3s y pGEM-folA-3s. DIG-M.HaeIII-3s-Biotina y DIG-folA-3s-Biotina (véase Figura 1b) se amplifican a partir de estos vectores por PCR con la Pfu polimerasa usando los cebadores LMB2-Biotina (ID SEC No. 9) y LMB3-DIG (ID SEC No. 10) (20 ciclos) y se purifican usando las preparaciones Wizard PCR Preps (Promega). El DIG-D1.3-Biotina, un fragmento de ADN de 942 pb que contiene cuatro sitios de R/M de HaeIII usado como sustrato para someter a ensayo la actividad metilasa de HaeIII, se amplifica a partir de un derivado pUC19 que contiene un gen Fv de cadena simple D1.3 (McCafferty y col., 1990) como anteriormente. Un ADN portador de 558 pb (ADN portador g3; un fragmento interno del gen III del fago fd que no tiene promotor de T7, sitios de R/M HaeIII o HhaI) se amplifica por PCR con la Taq polimerasa a partir de ADN de pHEN1 (Hoogenboom y col., 1991) usando los cebadores G3FRAG-Fo (ID SEC No. 11) y G3FRAG-Ba (ID SEC No. 12) (Tabla 1) y se purifica por extracción en fenol-cloroformo y precipitación en etanol. Este ADN (a \geq 10 nM) se usó como portador en la dilución de todos los ADN usados para las reacciones en este ejemplo.

La Figura 3 demuestra la selección de genes M.HaeIII que codifican la HaeIII metilasa de ADN a partir de un exceso de genes folA (que codifican la DHFR que no metila ADN). Ambos genes tienen las mismas secuencias de R/M de HaeIII unidas para actuar como sustrato (Figura 1b). Después de la traducción en los compartimentos acuosos de una emulsión las secuencias de R/M de HaeIII unidas a los genes metilasa se metilan. Estos genes se vuelven resistentes a la escisión por la endonucleasa HaeIII y posteriormente se amplifican por PCR. Los genes folA, presentes en otros compartimentos, que permanecen sin metilar, son escindidos y no se amplifican. Los productos de la PCR se analizan por electroforesis en gel de agarosa donde el enriquecimiento en los genes M.HaeIII se puede visualizar por la aparición de una banda de 1194 pb (Figura 2b).

Se usa el sistema de extracción S30 para ADN lineal de E. coli (Promega), suplementado con el ADN portador g3 (10 nM), fragmentos de ADN (DIG-M.HaeIII-3s-Biotina y DIG-M. folA-3s-Biotina a las relaciones y concentraciones indicadas a continuación), ARN polimerasa de T7 (10^{4} unidades), dioxicolato sódico (Fluka, al 0,5% en p/v; sólo en reacciones emulsionadas) y S-adenosil metionina (NEB, 80 \muM). Las reacciones se ajustan usando los fragmentos de ADN DIG-M.HaeIII-3s-Biotina y DIG-M. folA-3s-Biotina a una relación de 1:10^{3} y a una concentración total de 200 pM (Figura 3a) y a relaciones de 1:10^{4} a 1:10^{7} y a una concentración total de 500 pM (Figura 3b). Se preparan reacciones de 50 microlitros en hielo y se emulsionan sólo por agitación como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las reacciones se incuban durante 2 horas a 25ºC. Para recuperar las mezclas de reacción, las emulsiones se centrifugan a 3.000 g durante 5 minutos y la fase oleosa se retira dejando la emulsión concentrada en el fondo del vial. Se añade el tampón de inactivación (0,2 ml de 25 \mug/ml de ARN de levadura en tampón W+B: NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM a pH 7,4) y 2 ml de éter saturado con agua y la mezcla se pasa por el vórtex, se centrifuga brevemente, y la fase etérea se retira. La fase acuosa se lava con éter y se seca (5 minutos en un Speedvac a temperatura ambiente). El ADN se captura sobre 100 \mug de M-280 Dynabeads de estreptavidina (2 horas a temperatura ambiente). Las Dynabeads se lavan secuencialmente con: tampón W+B; guanidina-HCl 2,25 M, Tris-HCl 25 mM, pH 7,4; tampón W+B; y, dos veces con tampón de restricción. Las perlas se resuspenden en 100 \mul de tampón de restricción que contiene 10 unidades de HaeIII (o Hhal) y se incuban a 37ºC durante 5 horas. Las perlas se lavan tres veces con tampón W+B, dos veces con KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, Triton X-100 al 0,1%, pH 9,0, y a continuación se resuspenden en 100 \mul del mismo tampón suplementado con MgCl_{2} 1,5 mM (tampón de PCR): las alícuotas de las perlas (2-20 \mul) se amplifican por PCR usando la Taq polimerasa añadida a 94ºC con cebadores LMB2-Biotina y LMB3-DIG (reacciones de 50 \mul; 32 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 2 minutos a 72ºC). Este ADN se purifica usando las preparaciones Wizard PCR Preps y se usa para la segunda ronda de selección (20 pM en las selecciones de 1:10^{4} y 1:10^{5} y 500 pM en las selecciones de 1:10^{6} y 1:10^{7}). Para la electroforesis en gel y los ensayos de actividad este ADN (diluido hasta ~1 pM) se amplifica adicionalmente con los cebadores LMB2-Nest y LMB3-Nest que se hibridan inmediatamente dentro de LMB2 y LMB3 respectivamente (25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 50ºC, 1,5 minutos a 72ºC) y se purifica como anteriormente. Este ADN (a 10 nM), que no tiene unido ni DIG ni biotina, también se traduce in vitro en presencia de DIG-D1.3-Biotina 10 nM, un ADN de 942 pb que contiene cuatro sitios de R/M de HaeIII. La metilación del sustrato de DIG-D1.3-Biotina se determina por ELISA de DIG-Biotina como en el Ejemplo 9.

Una sola ronda de selección de una relación de 1:1000 de genes M.HaeIII:folA en la emulsión da como resultado una relación génica final de aproximadamente 1:1 (Figura 3a). Diversos experimentos control indican que la selección tiene lugar según el mecanismo descrito anteriormente: no se observa la banda correspondiente al gen M.HaeIII cuando la mezcla inicial de genes se amplifica por PCR; ni después de la reacción en disolución (no emulsionada); ni cuando se emulsiona en ausencia de transcripción/traducción (cuando se omite la ARN polimerasa de T7); ni cuando los genes reaccionados se escinden en sitios de R/M distintos de aquellos de HaeIII, por ejemplo, después de la digestión con HhaI. El rendimiento de ADN M.HaeIII después de la selección es inferior al 100% principalmente debido a la digestión incompleta por HaeIII en vez de por la metilación cruzada como indica la gran banda de folA observada en ausencia de la actividad metilasa (cuando no se añade la polimerasa de T7). Durante la digestión, la concentración de ADN cae muy por debajo de la K_{M} de HaeIII (6 nM) y la digestión se vuelve extremadamente ineficiente.

También se vuelve visible una banda correspondiente a los genes M.HaeIII después de una sola ronda de selección partiendo de relaciones de M.HaeIII:folA de 1:10^{4} a 1:10^{5} (Figura 3b), pero no a relaciones inferiores, indicando un factor de enriquecimiento de al menos 5000 veces. La selección de un pequeño número de genes a partir de un gran conjunto (por ejemplo, una biblioteca génica) requiere por tanto rondas de selección adicionales. Cuando el ADN digerido con HaeIII y amplificado procedente de la primera ronda de selección se somete a una segunda ronda de selección, también se hizo visible una banda correspondiente a los genes M.HaeIII a partir de relaciones de partida de 1:10^{6} y 1:10^{7} de M.HaeIII:folA. También se llevó a cabo una segunda ronda de selección sobre el ADN procedente de las relaciones de partida de 1:10^{4} a 1:10^{5} de M.HaeIII:folA. Esto proporciona un enriquecimiento adicional, hasta una relación de 3:1 aproximadamente en favor de los genes M.HaeIII. Los genes se amplifican antes y después de cada ronda de selección, se traducen in vitro y se hacen reaccionar con un sustrato de ADN aparte para someter a ensayo la actividad metilasa de HaeIII. Estos ensayos indican que el enriquecimiento en los genes M.HaeIII tal y como se observa para la electroforesis en gel da como resultado un incremento paralelo en la actividad metilasa de HaeIII (Figura 3b).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Oligonucleótidos

1

El LMB2-biotina tiene una biotina 5' terminal unida por un brazo espaciador de 16 átomos. El LMB3-DTG tiene una digoxigenina 5' terminal unida por un brazo espaciador de 12 átomos. Los oligonucleótidos marcados en el término 5' con biotina o digoxigenina se adquirieron en Eurogentec.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MEDICAL RESEARCH COUNCIL

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 20 PARK CRESCENT

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: LONDON

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: UK

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): WIN 4AL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO DE CLASIFICACIÓN IN VITRO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGÍBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº1.0, Versión nº1.30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTGCATG CCTGCGGTAC CGGCCATGCG CATGGCCTAG CGCATGCGGC CGCTAGCGCG

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 60 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCGCGCT AGCGGCCGCA TGCGCTAGGC CATGCGCATG GCCGGTACCG CAGGCATGCA

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGCTAGAG GTACCTTATT AATTACCTTT ACAAATTTCC AATGCGATT TTAT

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 84 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 49 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGAGCTAGAG GTACCTTATT ACCGCCGCTC CAGAATCTCA AAGCAATAG

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 82 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATTGGATT TAGGTGAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGATTACG CCAAGCTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAGT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGAAACAG CTATGAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTCTGAAT TTACCGTTC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAACTGTTG AAAGTTGTTT AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTATAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGTT ATCAGGCATG CACC

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGCTCCCA TTAAGGAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAGT

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGAAACAG CTATGAC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 83 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 67 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 78 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 54 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCTTATTAC TTTTGTAATC GTTTGTTTTT TATC

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 77 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

106

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 59 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCGATATCT TATTACTCTT CAATTACCAA AATATCCCC

\hfill

59

Claims

1. Un procedimiento para incrementar la concentración de una molécula de ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) la formación de microcápsulas acuosas en una emulsión de agua en aceite, comprendiendo dichas microcápsulas una fase interna acuosa suspendida en forma de gotas discretas en una fase externa hidrófoba y en el que una pluralidad de las microcápsulas incluye una molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende los componentes necesarios para la amplificación del ácido nucleico en la fase interna acuosa;

(b) la amplificación de la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias amplificadas adicionales de dicha molécula de ácido nucleico; y

(c) el enriquecimiento en dicho ácido nucleico usando un marcador unido a dicho ácido nucleico.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende el acoplamiento de dicho ácido nucleico a un soporte en fase sólida.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho soporte en fase sólida comprende una perla.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que dicha perla es una perla de poliestireno o magnética.

5. Un procedimiento según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que dicha perla comprende un recubrimiento seleccionado entre avidina y estreptavidina.

6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que la molécula de ácido nucleico comprende un marcador de biotina.

7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha amplificación del ácido nucleico se lleva a cabo usando ARN polimerasa, amplificación de la replicasa Q\beta, reacción en cadena de la ligasa, replicación de secuencia auto-sostenida o amplificación por desplazamiento de la cadena.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha amplificación del ácido nucleico se lleva a cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa.

9. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicha emulsión incluye al menos un estabilizante de la emulsión.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho estabilizante de la emulsión es un tensioactivo no iónico.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho estabilizante de la emulsión se selecciona entre monooleato de sorbitán y monooleato de polioxietilensorbitán.

12. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que el estabilizante de la emulsión es un tensioactivo aniónico.

13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que el estabilizante de la emulsión se selecciona entre colato sódico, glicocolato sódico, taurocolato sódico, y dioxicolato sódico.

14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la emulsión es termoestable.

15. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que el soporte en fase sólida es una perla, dicha amplificación del ácido nucleico se lleva cabo usando la reacción en cadena de la polimerasa, y la emulsión es termoestable.

16. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que cuando se forma una pluralidad de microcápsulas cada una contiene de media una o menos de una molécula de ácido nucleico.

17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que cuando se forma una pluralidad de las microcápsulas cada una contiene de media entre 5 y 1000 moléculas de ácido nucleico.