ES2230701T3 - Procedimiento de seleccion in vitro. - Google Patents
Procedimiento de seleccion in vitro.Info
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Abstract
Procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes: (a) compartimentalizar los elementos genéticos en microcápsulas; (b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas; y (c) clasificar los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada.
Description
Procedimiento de selección in vitro.
La presente invención se refiere a la utilización
de procedimientos en la evolución in vitro de genotecas
moleculares. En particular, la presente invención se refiere a
procedimientos para seleccionar ácidos nucleicos que codifican
productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del
producto génico codificado están relacionados mediante
compartimentación.
La evolución necesita la generación de diversidad
genética (diversidad en los ácidos nucleicos), seguida de la
selección de aquéllos ácidos nucleicos que dan lugar a
características beneficiosas. A causa de que el ácido nucleico y la
actividad del producto génico codificado de un organismo están
físicamente relacionados (estando confinados los ácidos nucleicos en
el interior de las células que codifican), series múltiples de
mutación y selección pueden llevar a la supervivencia progresiva de
organismos con aptitudes crecientes. Los sistemas para la evolución
rápida de los ácidos nucleicos o de las proteínas in vitro
deben imitar este proceso a nivel molecular, ya que el ácido
nucleico y la actividad del producto génico codificado deban estar
relacionados y esta actividad del producto génico debe poder
seleccionarse.
Avances recientes en biología molecular han
permitido que algunas moléculas sean coseleccionadas según sus
propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los
ácidos nucleicos seleccionados pueden ser clonados subsiguientemente
para un análisis o utilización posterior, o someterse a series
adicionales de mutación y selección.
Común a estos procedimientos es el
establecimiento de voluminosas genotecas de ácidos nucleicos.
Moléculas que poseen las características deseadas (actividad),
pueden aislarse a través de regímenes de selección que seleccionan
la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una
actividad biológica o bioquímica deseada, por ejemplo, la actividad
de unión.
La tecnología de presentación de los fagos ha
tenido mucho éxito, proporcionando un vehículo que permite la
selección de una proteína que se exhibe, proporcionando el enlace
esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico
codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990); McCafferty et
al.,1990; para una revisión, véase Clackson y Wells, 1994).
Partículas fágicas filamentosas actúan como conjuntos de exposición
genética con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que
las codifican en el interior. La estrecha relación entre el ácido
nucleico y la actividad del producto codificado es el resultado del
ensamblaje del fago en el interior de las bacterias. Como las
bacterias individuales se infectan raramente de forma múltiple, en
la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una
bacteria individual, llevarán el mismo elemento genético y exhibirán
la misma proteína.
Sin embargo, la presentación de los fagos depende
de la creación de genotecas de ácidos nucleicos in vivo en
las bacterias. De este modo, la limitación práctica que permite la
tecnología de la presentación fágica respecto al tamaño de la
genoteca es del orden de 10^{7} a 10^{11}, aventajando incluso a
los efectores fágicos \lambda con replicones fágicos filamentosos
extirpables. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección
de moléculas con actividad de unión. También, utilizando esta
técnica, se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad
catalítica, pero en ningún caso, sin embargo, se llevó a cabo
directamente la selección para la actividad catalítica deseada, sino
para la unión a un estado de transición análogo (Widersten y
Mannervik, 1995), o para la reacción con un inhibidor suicida
(Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997).
Se han seleccionado ligandos peptídicos
específicos para la unión a receptores mediante selección por
afinidad, utilizando voluminosas genotecas de péptidos unidos al
extremo C del represor lac Lacl (Cull et al., 1992). Cuando
se expresa en E. coli, la proteína represora une físicamente
el ligando al plásmido codificante mediante la unión a una secuencia
del operador lac en el plásmido.
Se ha informado, asimismo, de un sistema
enteramente in vitro de presentación polirribosómica
(Mattheakis et al., 1994), en el que los péptidos nacientes
se unen físicamente mediante el ribosoma al ARN que los
codifica.
Sin embargo, el alcance de los sistemas
mencionados se limita a la selección de proteínas y no permite
posteriormente la selección directa de actividades distintas a la
unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.
La selección de ARN in vitro y la
evolución (Ellington y Szostak, 1990), a la que a veces se ha
referencia como SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante
enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990), permite la
selección de actividad tanto de unión como química, pero sólo para
los ácidos nucleicos. Cuando la selección es para la unión, un
conjunto de ácidos nucleicos se incuba con sustrato inmovilizado.
Los que no se unen se descartan, y entonces los que se unen se
liberan entonces, se amplifican y el procedimiento se repite en su
totalidad en etapas reiterativas para enriquecer las secuencias que
mejor se unan. Este procedimiento puede también adaptarse para
permitir el aislamiento de ARN catalítico y de ADN (Green y Szostak,
1992; para revisiones, véase Chapman y Szostak, 1994: Joyce, 1994;
Gold et al.,1995; Moore, 1995).
Sin embargo, la selección para la actividad
"catalítica" o de unión utilizando SELEX es sólo posible porque
la misma molécula realiza la función dual de transportar la
información genética y ser el catalizador o molécula de unión
(aptámero). Cuando la selección es para
"auto-catálisis", la misma molécula debe
también llevar a cabo la tercera función de ser un sustrato. Ya que
el elemento genético debe jugar el papel tanto de sustrato como de
catalizador, la selección es sólo posible para los eventos de
recambio único. A causa de que el "catalizador" se modifica él
mismo en este proceso, no constituye por definición un verdadero
catalizador. Además, las proteínas no pueden seleccionarse
utilizando el procedimiento SELEX. El abanico de catalizadores,
sustratos y reacciones que pueden seleccionarse está, por tanto,
severamente limitado.
Aquellos de los procedimientos mencionados que
permiten series reiterativas de mutación y selección imitan in
vitro mecanismos que se atribuyen habitualmente al proceso de la
evolución: variación reiterativa, selección progresiva para una
actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los
procedimientos que se han desarrollado hasta ahora han proporcionado
moléculas de diversidad y eficacia funcional comparables a las que
se encuentran de modo natural. Además, no existen sistemas
"evolutivos" propiciados por el hombre que puedan desarrollar
tanto ácidos nucleicos como proteínas para llevar a cabo el abanico
completo de actividades bioquímicas y biológicas (por ejemplo, las
actividades de unión, catalítica y reguladora) y que puedan combinar
varias procesos que conduzcan a un producto o actividad
deseados.
Existe, por tanto, una gran necesidad de un
sistema in vitro que supere las limitaciones que
anteriormente se han expuesto.
Según un primer aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento para aislar uno o más elementos
genéticos que codifican un producto génico que posee una actividad
deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- compartimentación de elementos genéticos en microcápsulas;
- (b)
- expresión de los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas; y
- (c)
- clasificación de los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada.
Las microcápsulas según la presente invención
compartimentalizan los elementos genéticos y los productos génicos
de forma tal que permanecen unidos juntos físicamente.
Sorprendentemente, la expresión del ácido nucleico sigue siendo
posible en el interior de las microcápsulas artificiales,
permitiendo el aislamiento del ácido nucleico basándose en la
actividad del producto génico que codifica.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
elemento genético es una molécula o constructo molecular que
comprende un ácido nucleico. Los elementos genéticos de la presente
invención pueden incluir cualquier ácido nucleico (por ejemplo, ADN,
ARN o cualquier análogo suyo, natural o artificial). El componente
ácido nucleico del elemento genético puede además unirse,
covalentemente o no, a una o más moléculas o estructuras, incluyendo
proteínas, entidades químicas y grupos, soportes de fase sólida
tales como perlas magnéticas, y similares. En el procedimiento de la
invención, estas estructuras o moléculas pueden diseñarse para
cooperar en la clasificación y/o en el aislamiento del elemento
genético que codifica un producto génico con la actividad
deseada.
Expresión, tal como se utiliza en la presente
memoria, se emplea en su más amplio significado, para significar que
un ácido nucleico contenido en el elemento genético, se convierte en
su producto génico. Así, si el ácido nucleico es ADN, la expresión
se refiere a la transcripción del ADN en ARN; si este ARN codifica
una proteína, la expresión puede también referirse a la traducción
del ARN en la proteína. Si el ácido nucleico es ARN, la expresión
puede referirse a la replicación de este ARN en más copias de ARN, a
la transcripción inversa del ARN en ADN, y opcionalmente, a la
transcripción de este ADN en otra molécula o moléculas de ARN, así
como también a la traducción de cualquiera de los tipos de ARN
producidos, en proteínas. Preferentemente, por tanto, la expresión
se lleva a cabo mediante uno o más procesos seleccionados a partir
del grupo formado por la transcripción, transcripción inversa,
replicación y traducción.
La expresión del elemento genético puede
dirigirse, de esta forma, al ADN, al ARN o a la proteína, o a un
ácido nucleico o proteína que contengan bases o aminoácidos no
naturales (el producto génico) y que se encuentren en el interior de
la microcápsula de la invención, de forma que el producto génico
quede confinado en el interior de la misma microcápsula que el
elemento genético.
El elemento genético y el producto génico por
ello codificado, están unidos mediante confinamiento de cada
elemento genético y del producto génico respectivo codificado por
aquél en el interior de la misma microcápsula. De esta forma, el
producto génico en una microcápsula no puede provocar un cambio en
ninguna de las otras microcápsulas.
El término "microcápsula" tal como se
utiliza en la presente memoria, según el significado que se le
asigna normalmente en la técnica y que se describe a continuación en
la presente memoria. Esencialmente, sin embargo, una microcápsula es
un compartimento artificial cuyos márgenes delimitantes restringen
el intercambio de los componentes de los mecanismos moleculares
descritos en la presente memoria, que permiten la clasificación de
los elementos genéticos según la función de los productos génicos
que codifican.
Preferentemente, las microcápsulas que se
utilizan en el procedimiento de la presente invención, podrán
producirse en grandes cantidades, y por tanto compartimentalizar una
genoteca de elementos genéticos que codifique un repertorio de
productos génicos.
Según una forma de realización preferida del
primer aspecto de la presente invención, la clasificación de
elementos genéticos puede realizarse según una de entre
esencialmente cuatro técnicas.
(I) En una primera forma de realización, las
microcápsulas se clasifican según una actividad del producto génico
o de su derivado, que hace que la microcápsula sea detectable como
un todo. De acuerdo con esto, la invención proporciona un
procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que un
producto génico con la actividad deseada induce un cambio en la
microcápsula, o una modificación de una o más moléculas en su
interior, lo que permite que la microcápsula que contiene el
producto génico y el elemento genético que lo codifica, sea
clasificada. En esta forma de realización, por tanto, las
microcápsulas se clasifican físicamente entre ellas, según la
actividad del producto génico o productos génicos expresados a
partir de los elementos genéticos que en ellas se contienen, lo que
hace posible enriquecer selectivamente las microcápsulas que
contienen los productos génicos de la actividad deseada.
(II) En una segunda forma de realización, los
elementos genéticos se clasifican después de reunir las
microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de
realización, un producto génico que presenta la actividad deseada
modifica al elemento genético que lo codificó (y que reside en la
misma microcápsula), de tal forma que sea capaz de ser seleccionado
en una etapa siguiente. Las reacciones se detienen y las
microcápsulas se fragmentan entonces de forma que todos los
contenidos de las microcápsulas individuales se fusionan. La
selección para los elementos genéticos modificados permite el
enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el producto
o productos génicos que poseen la actividad deseada. De acuerdo con
esto, la invención proporciona un procedimiento según el primer
aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) el p producto
génico que posee la actividad deseada modifica el elemento genético
que lo codifica, para permitir el aislamiento del elemento genético.
Debe tenerse en cuenta, por supuesto, que la modificación puede ser
directa, porque sea causada por la acción directa del producto
génico, o indirecta, en la cual una serie de reacciones, una o más
de las cuales están implicadas en el producto génico que posee la
actividad deseada, conduce a la modificación del elemento
genético.
(III) En una tercera forma de realización, los
elementos genéticos se clasifican después de la reunión de las
microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de
realización, un gen con una actividad deseada induce un cambio en la
microcápsula que contiene el producto génico y el elemento genético
que lo codifica. Este cambio, cuando se detecta, induce la
modificación del gen en el interior del compartimento. Las
reacciones se detienen y las microcápsulas se fragmentan entonces,
de forma que la totalidad de los contenidos de las microcápsulas
individuales se fusionan. La selección de los elementos genéticos
modificados, permite el enriquecimiento de los elementos genéticos
que codifican el producto o productos génicos que poseen la
actividad deseada. De acuerdo con esto, la invención proporciona un
procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que en
la etapa (b) el producto génico que posee la actividad deseada,
induce un cambio en el compartimento que es detectado, e induce la
modificación del elementos genético en el interior del
compartimento, de forma que se permite su aislamiento. Debe tenerse
en cuenta que el cambio detectado en el compartimento puede estar
causado por la acción directa del producto génico, o acción
indirecta, en la cual una serie de reacciones, un o más de las
cuales están implicadas en el producto génico que posee la actividad
deseada, conduce al cambio detectado.
(IV) En una cuarta forma de realización, los
elementos genéticos pueden clasificarse mediante un procedimiento de
pasos múltiples que implica por lo menos dos etapas, por ejemplo,
con objeto de permitir la exposición de los elementos genéticos a
condiciones que permitan, como mínimo, que tengan lugar dos
reacciones separadas. Como será evidente para los expertos en la
materia, la primera etapa de microencapsulación de la invención debe
tener como resultado condiciones que permitan la expresión de los
elementos genéticos, sea mediante transcripción, transcripción y/o
traducción, replicación o similar. Bajo estas condiciones, no puede
ser posible seleccionar una actividad particular del producto
génico, por ejemplo, a causa de que éste puede no ser activo bajo
estas condiciones, o debido a que el sistema de expresión contiene
una actividad interferente. La invención proporciona, por tanto, un
procedimiento según el primer aspecto de la presente invención, en
el que la etapa (b) comprende la expresión de los elementos
genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el
interior de las microcápsulas, uniendo los productos génicos a los
elementos genéticos que los codifican y aislando por ello los
complejos formados. Esto permite que los elementos genéticos y sus
productos génicos asociados se aíslen a partir de las cápsulas antes
de la clasificación, según tenga lugar la actividad del producto
génico. En una forma de realización preferida, los complejos se
someten a otra etapa de compartimentalización, previa al aislamiento
de los elementos genéticos que codifican el producto génico que
posea la actividad deseada. Esta etapa de compartimentalización, que
tiene lugar ventajosamente en las microcápsulas, permite la
ejecución de reacciones ulteriores, bajo distintas condiciones, en
un medioambiente en el que los elementos genéticos y sus respectivos
productos génicos están unidos físicamente. Según las formas de
realización (I), (II) o (III) anteriores, puede llevarse a cabo la
clasificación eventual de elementos genéticos.
La "encapsulación secundaria" puede también
llevarse a cabo con elementos genéticos unidos a productos génicos
mediante otros medios, tales como mediante presentación de fagos,
presentación polirribosómica, fusión ARN-péptido o
fusión del péptido represor lac.
El o los elementos genéticos seleccionados pueden
también someterse a series consecutivas, posiblemente más estrictas,
de clasificación en etapas repetidas reiteradamente, volviendo a
aplicar el procedimiento de la invención, bien completo o sólo en
etapas seleccionadas. Adaptando apropiadamente las condiciones,
pueden aislarse, después de cada serie de selecciones, los elementos
genéticos que codifican productos génicos que poseen la actividad
mejor optimizada.
Además, los elementos genéticos aislados después
de una primera serie de clasificaciones, pueden ser sometidos a
mutagénesis antes de repetir la clasificación repitiendo
reiteradamente las etapas del procedimiento de la invención, tal
como se explicó anteriormente. Después de cada serie de mutagénesis,
algunos elementos genéticos se habrán modificado de tal forma que la
actividad de los productos génicos se potencia.
Además, los elementos genéticos seleccionados
pueden clonarse en un vector de expresión para permitir una ulterior
caracterización de los elementos genéticos y de sus productos.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un producto cuando se selecciona según el primer aspecto de la
invención. Tal como se utiliza en este contexto, un "producto"
puede referirse a un producto génico, capaz de ser seleccionado
según la invención, o al elemento genético (o información genética
contenida en él).
En un tercer aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la preparación de un producto génico, que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- preparación de un elemento genético que codifique el producto génico;
- (b)
- compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas;
- (c)
- expresión de los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas;
- (d)
- clasificación de los elementos genéticos que producen e el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada; y
- (e)
- expresión del producto génico que posee la actividad deseada.
Según el tercer aspecto, la etapa (a) comprende
preferentemente la preparación de un repertorio de elementos
genéticos, en los que cada elemento genético codifica un producto
génico que difiere potencialmente. Los repertorios pueden generarse
mediante técnicas convencionales, tales como las utilizadas para la
generación de genotecas que se tiene la intención de seleccionar
mediante procedimientos tales como presentación de los fagos. Los
productos génicos que poseen la actividad deseada pueden
seleccionarse a partir del repertorio, según la presente
inven-
ción.
ción.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para rastrear un compuesto o compuestos capaces de
modular la actividad de un producto génico, que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- preparación de un repertorio de elementos genéticos que codifiquen productos génicos;
- (b)
- compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas;
- (c)
- expresión de los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas;
- (d)
- Clasificación de los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada; y
- (e)
- puesta en contacto de un producto génico que posee la actividad deseada con el compuesto o compuestos, y control de la actividad del producto génico mediante el compuesto o compuestos.
Este sistema de selección puede configurarse para
seleccionar ARN, ADN o moléculas proteicas con actividad catalítica,
reguladora o de unión.
a Representación esquemática del procedimiento
de selección. En la Etapa 1, una mezcla reactiva in vitro
de transcripción/traducción que contiene una genoteca de elementos
genéticos unidos a un sustrato para la reacción que va a
seleccionarse, se dispersa para formar una emulsión de agua en
aceite con típicamente un elemento genético por compartimento
acuoso. Los elementos genéticos se transcriben y traducen en el
interior de sus compartimentos (Etapa 2). A continuación, (Etapa 3),
proteínas (o ARN) con actividades enzimáticas, convierten al
sustrato en un producto que permanece unido al elemento genético. La
compartimentalización evita la modificación de los elementos
genéticos en otros compartimentos. A continuación (Etapa 4), la
emulsión se fragmenta, todas las reacciones se detienen y los
compartimentos acuosos se combinan. Los elementos genéticos que
están unidos al producto se enriquecen selectivamente, se amplifican
entonces, y se caracterizan (Etapa 5) o se unen al sustrato y se
compartimentalizan para series posteriores de selección (Etapa
6).
b Selección para la metilación del ADN
diana-específico mediante la HaeIII metilasa. El
sustrato es un segmento de ADN que contiene sitios HaeIII de
restricción/modificación (R/M). Los elementos genéticos se aíslan
uniéndolos a perlas magnéticas revestidas con estreptavidina y
tratados con la enzima de restricción similar HaeIII. Sólo
los ácidos nucleicos con sitios metilados R/M son resistentes a la
fragmentación y son amplificados subsiguientemente mediante PCR.
Distribución del tamaño de las gotas y
actividades de DHFR y de la metilasa HaeIII en emulsiones:
distribución del tamaño de los compartimentos acuosos en una
emulsión, determinada por difracción laser. Las mezclas
reactivas in vitro de transcripción/traducción que contienen
ADN y desoxicolato sódico se emulsifican mediante agitación, o
mediante agitación seguido de homogeneización a 8k, 9,5 k ó 13,5 k
r.p.m. La distribución del tamaño de las partículas acuosas se
muestra en porcentaje del volumen acuoso total.
La actividad de DHFR formado in situ
mediante transcripción y traducción de su gen (Fig 1b) en
compartimentos acuosos de una emulsión. La concentración del gen
folA utilizado (2,5 nM) da lugar a un promedio de un gen por
gota en las emulsiones más finas (homogeneizadas a 13,5 k r.p.m.).
El diámetro medio calculado a partir de los datos de distribución
del tamaño (en la Figura 2) se presenta como función de la velocidad
de homogeneización (0k r.p.m. se refiere a la emulsión preparada
mediante agitación sin homogeneización ulterior). La actividad se
presenta como porcentaje de la actividad observada en la mezcla
reactiva in vitro no emulsificada bajo las mismas
condiciones.
Actividad de la metilasa HaeIII formada
in situ mediante transcripción y traducción de su gen (Fig.
1b) en compartimentos acuosos de una emulsión. La concentración
del gen M. HaeIII utilizado (2,5 nM) da lugar a un promedio
de un gen por gotita en las emulsiones más finas (homogeneizadas a
13,5 k r.p.m.). El diámetro principal calculado a partir de los
datos de distribución (en la Figura 2a) se presenta como una función
de la velocidad de homogeneización (0k r.p.m. se refiere a la
emulsión preparada agitando sin homogeneización ulterior). La
actividad se presenta como porcentaje de la actividad observada en
la mezcla reactiva in vitro no emulsificada bajo las mismas
condiciones.
a Selección de genes M.HaeIII a partir de un
exceso de 1000 veces de los genes folA. Las reacciones se
establecieron con 0,2 n nM de
DIG-folA-3s-Biotin ADN (que
corresponde a un promedio de un gen por compartimento), y se
terminaron con 0,2 pM de
IG-M.HaeIII-3s-Biotin.
Las mezclas reactivas se emulsificaron mediante agitación o se
dejaron en solución. El ADN de estas reacciones se capturó, se
digirió con HaeIII (o con HhaI) y se amplificó
mediante PCR. Este ADN se amplificó posteriormente mediante PCR
unida a los iniciadores LMB2-Nest y
LMB3-Nest y cinco microlitros de cada PCR unida se
sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5% que
contenía bromuro de etidio. Marcadores, \phi X174-HaeIII
digerido; menos T7, sin T7 ARN polimerasa; menos NadCh, sin
desoxicolato sódico.
b Selecciones biseriadas. Las reacciones
que contenían una relación molar de 1:10^{4} a 1:10^{7} de
DIG-M.HaeIII-3s-Biotin:DIG-folA-3s-Biotin
(a 500 pM) se emulsificaron mediante agitación. El ADN de estas
reacciones se digirió con HaeIII y se amplificó mediante PCR
con los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y
LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) El ADN amplificado
procedente de la primera selección seriada, de proporciones
1:10^{4} y 1:10^{5} (a 20 pM) y proporciones 1:10^{6} y
1:10^{7} (a 500 pM), se dispuso en una segunda serie de selección.
Este ADN se amplificó ulteriormente mediante PCR unida a los
iniciadores LMB2-Nest y LMB3-Nest y
cinco microlitros de la PCR unida de cada serie de selección se
analizaron mediante electroforesis en gel como antes (cuadro
superior). El mismo ADN se tradujo in vitro y se midió la
actividad metilasa resultante. Los resultados se presentan como
porcentaje del ADN sustrato metilado (cuadro inferior).
Las microcápsulas de la presente invención
requieren propiedades físicas apropiadas para permitir que la
invención se ejecute.
En primer lugar, para asegurar que los elementos
genéticos y los productos génicos no puedan difundirse entre las
cápsulas, el contenido de cada microcápsula debe aislarse del
contenido de las microcápsulas que la rodean, de forma que no exista
o exista poco intercambio de los elementos genéticos y de los
productos génicos entre las microcápsulas a lo largo del tiempo que
dure el experimento.
En segundo lugar, el procedimiento de la presente
invención necesita que exista sólo un número limitado de elementos
genéticos por microcápsula. Esto asegura que el producto génico de
un elemento genético individual quedará aislado de los otros
elementos genéticos. De este modo, el acoplamiento entre el elemento
genético y el producto génico será altamente específico. El factor
de enriquecimiento es el mayor con un término medio de uno o algunos
elementos genéticos por microcápsula, siendo tan estrecha como sea
posible la unión entre el ácido nucleico y la actividad del producto
génico codificado, ya que el producto génico de un elemento genético
individual se aislará de los productos de todos los otros elementos
genéticos. Sin embargo, incluso si no se utiliza la situación
teóricamente óptima de, por término medio, un único elemento
genético o menos por microcápsula, una proporción de 5, 10, 50, 100
ó 1000 o más elementos genéticos por microcápsula, puede resultar
beneficiosa para clasificar una genoteca voluminosa. Series
subsiguientes de clasificación, incluyendo una encapsulación
renovada con una distribución diferente de los elementos genéticos,
permitirá una clasificación más estricta de los elementos genéticos.
Preferentemente, existe un único elemento genético, o menos, por
microcápsula.
En tercer lugar, la formación y la composición de
las microcápsulas no debe abolir la función de la maquinaria de
expresión de los elementos genéticos y la actividad de los productos
génicos.
En consecuencia, cualquier sistema de
microencapsulación utilizado debe cumplir estos tres requerimientos.
El sistema o sistemas apropiados puede variar, dependiendo de la
naturaleza precisa de las necesidades en cada aplicación de la
invención, como será evidente para el experto en la materia.
Se dispone de una amplia variedad de
procedimientos de microencapsulación (véase Benita, 1996) y pueden
utilizarse para crear las microcápsulas utilizadas según la presente
invención. En verdad, se han identificado en la literatura más de
200 procedimientos de encapsulación (Finch, 1993).
Estos incluyen vesículas acuosas envueltas por
membranas tales como vesículas lipídicas (liposomas) (New, 1990), y
vesículas surfactantes no iónicas (van Hal et al., 1996).
Estas consisten en cápsulas cerradas membranosas de bicapas únicas o
múltiples de moléculas ensambladas no covalentemente, con cada
bicapa separada de su vecina mediante un compartimento acuoso. En el
caso de liposomas, la membrana está compuesta de moléculas
lipídicas; estas son habitualmente fosfolípidos, pero también pueden
incorporarse a las membranas esteroles, tales como colesterol (New,
1990). En el interior de los liposomas pueden realizarse diversas
reacciones bioquímicas catalizadas enzimáticamente, incluyendo la
polimerización del ARN y del ADN (Chakrabarti et al., 1994;
Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b;
Walde et al., 1994; Wick y Luisi, 1996).
Con un sistema vesicular envuelto por una
membrana, una gran parte de la fase acuosa se encuentra por fuera de
las vesículas y por tanto, no está compartimentalizada. Esta fase
acuosa continua deberá eliminarse o los sistemas biológicos en ella
se inhibirán o se destruirán (por ejemplo, mediante digestión de los
ácidos nucleicos con DNasa o RNasa), con objeto de que las
reacciones se limiten a las microcápsulas (Luisi et al.,
1987).
También se han demostrado en microcápsulas
generadas por otros diversos procedimientos, las reacciones
bioquímicas catalizadas enzimáticamente. Muchas enzimas son activas
en soluciones micelares inversas (Bru y Walde, 1991; Bru y Walde,
1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar
et al., 1989; Luisi y B, 1987; Mao y Walde, 1991; Mao et
al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994;
Walde et al., 1993; Walde et al., 1988) tales como el
sistema AOT-isooctano-agua (Menger y
Yamada, 1979).
Las microcápsulas pueden también generarse
mediante polimerización y complejización interfacial (Whateley,
1996). Las microcápsulas de este tipo pueden tener membranas rígidas
y no permeables, o semipermeables. Las microcápsulas semipermeables
bordeadas por membranas de nitrato de celulosa, membranas
poliamídicas y por membranas lípido-poliamídicas,
pueden todas sustentar reacciones bioquímicas, incluyendo sistemas
multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Las
microcápsulas de alginato/polilisina (Lim y Sun, 1980), que pueden
formarse bajo condiciones poco rigurosas, han mostrado también que
son muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un
procedimiento efectivo para la encapsulación de las células y
tejidos vivientes (Chang, 1992; Sun et al., 1992).
También pueden utilizarse sistemas no membranosos
de microencapsulación basados en la repartición fásica de un
medioambiente acuoso en un sistema coloidal, tal como una
emulsión.
Preferentemente, las microcápsulas de la presente
invención ese forman a partir de las emulsiones: sistemas
heterogéneos de dos fases líquidas no miscibles, estando una de las
fases dispersa en la otra como gotitas de tamaño microscópico o
coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant,
1984)
Las emulsiones pueden producirse a partir de
cualquier combinación apropiada de líquidos no miscibles.
Preferentemente la emulsión de la presente invención tiene agua (que
contiene los componentes bioquímicos) como fase presente en forma de
gotitas finamente divididas (fase dispersa, interna o discontinua) y
un líquido no miscible, hidrofóbico ("aceite") como matriz en
la que estas gotitas están suspendidas (fase no dispersa, continua o
externa). Dichas emulsiones se denominan "agua en aceite"
(W/O). Esto tiene la ventaja de que la fase acuosa entera que
contiene los componentes bioquímicos se compartimentaliza en gotitas
discretas (la fase interna). La fase externa, siendo un aceite
hidrofóbico, no contiene generalmente ninguno de los componentes
bioquímicos y por tanto, es inerte.
La emulsión puede estabilizarse añadiendo uno o
más agentes activos superficiales (surfactantes). Estos surfactantes
se denominan agentes de emulsificación y actúan en la interfase
agua/aceite para evitar (o por lo menos retrasar) la separación de
las fases. Para generar las emulsiones agua-aceite
pueden utilizarse muchos aceites y emulsificantes; una compilación
reciente listó más de 16.000 surfactantes, muchos de los cuales se
utilizan como agentes emulsificantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites
apropiados incluyen aceite mineral blanco ligero y surfactantes no
iónicos (Schik, 1966) tales como monooleato de sorbitano
(Span^{TM} 80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitano
(Tween^{TM} 80; ICI).
La utilización de surfactantes aniónicos puede
también ser beneficiosa. Surfactantes apropiados incluyen colato
sódico y taurocolato sódico. Particularmente preferido es el
desoxicolato sódico, preferentemente a una concentración de 0,5%
peso/volumen, o inferior. La inclusión de dichos surfactantes puede
en algunos casos aumentar la expresión de los elementos genéticos
y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos
surfactantes aniónicos a una mezcla reactiva no emulsificada
completamente, abolió la traducción. Durante la emulsificación, sin
embargo, el surfactante se transfiere desde la fase acuosa a la
interfase y la actividad se restaura. La adición de un surfactante
aniónico a las mezclas que van a emulsificarse, asegura que las
reacciones tendrán lugar sólo después de la
compartimentalización.
La creación de una emulsión requiere generalmente
la aplicación de energía mecánica para forzar que las fases se
junten. Existen muchas maneras de hacer esto, que utilizan diversos
dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como varillas
agitadoras magnéticas, agitadores de turbina y de propulsión,
dispositivos con paleta y batidores), homogeneizadores (que incluyen
homogeneizadores de estator-rotor, homogeneizador
con válvula de alta presión y homogeneizadores de chorro),
trituradores de coloides, dispositivos de "emulsificación de
membranas" y de ultrasonidos (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones
de agua en aceite son generalmente estables con un escaso
intercambio, si es que alguno tiene lugar, de elementos genéticos o
de productos génicos entre las microcápsulas. Además, se ha
demostrado que diversas reacciones bioquímicas tuvieron lugar en
microcápsulas de emulsión. Además, procesos bioquímicos complicados,
especialmente la transcripción génica y la traducción, son también
activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la tecnología para
crear emulsiones con volúmenes a escala industrial, hasta el final,
de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974;
Lissant, 1984).
El tamaño preferido de la microcápsula variará
dependiendo de las necesidades precisas de cualquier proceso de
selección individual que tenga que llevarse a cabo según la presente
invención. En todos los casos, existirá un equilibrio óptimo entre
el tamaño de la genoteca, el enriquecimiento que se requiera y la
concentración que se necesite de componentes en las microcápsulas
individuales para alcanzar una expresión y reactividad eficiente de
los productos génicos.
Los procedimientos de expresión deben tener lugar
en el interior de cada una de las microcápsulas individuales
proporcionadas por la presente invención. Tanto la transcripción
in vitro como la transcripción-traducción
acopladas se convertirán en menos eficientes a concentraciones
sub-nanomolares de ADN. Debido al requerimiento de
que sólo un número limitado de moléculas de ADN se encuentre en cada
microcápsula, queda fijado, por tanto, un límite superior práctico
respecto al posible tamaño de la microcápsula. Preferentemente, el
volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x 10^{-16}
m^{3}, (que corresponde a una microcápsula esférica con un
diámetro inferior a 10 \mum, más preferentemente menor que 6,5 x
10^{-17} m^{3} (5 \mum), más preferentemente de alrededor de
4,2 x 10^{-18} m^{3} (2 \mum), e idealmente de 9 x 10^{-18}
m^{3} aproximadamente (2,6 \mum).
La concentración efectiva de ADN o de ARN en las
microcápsulas puede aumentarse artificialmente mediante varios
procedimientos, que serán bien conocidos por los expertos en la
materia. Estos incluyen, por ejemplo, la adición de sustancias
químicas que excluyan volumen, tales como polietilenglicoles (PEG) y
diversas técnicas de amplificación génica, incluyendo la
transcripción utilizando ARN polimerasas, incluyendo las de
bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y
Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et
al.,1975), eucariotas por ejemplo (Weil et al., Manley
et al.,1983) y bacteriófagos tal como T7, T3 y SP6 (Melton
et al., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(Saiki et al.,1988); la amplificación por la replicasa
Q\beta (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991;
Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); la reacción
en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany,
1991); y el sistema de replicación secuencial
auto-mantenido (Fahy et al.,1991) y la
amplificación por desplazamiento de las cadenas (Walker et
al., 1992). Pueden utilizarse incluso las técnicas de
amplificación génica que requieran la ciclación térmica, tales como
PCR y LCR, si las emulsiones y la transcripción in vitro o
los sistemas acoplados de transcripción-traducción
pudieran llevarse a cabo a partir de un organismo termoestable, tal
como Thermus aquaticus).
El aumento de la concentración local efectiva de
ácido nucleico permite que puedan utilizarse efectivamente
microcápsulas más voluminosas. Esto permite un límite superior
práctico preferido para el volumen microcapsular de 5,2 x 10^{16}
m^{3} aproximadamente (que corresponde a una esfera de diámetro 10
\mum).
El tamaño de la microcápsula debe ser lo
suficientemente voluminoso para acomodar a todos los componentes
requeridos de las reacciones bioquímicas que es necesario se lleven
a cabo en su interior. Por ejemplo, in vitro, tanto las
reacciones de transcripción como las de acoplamiento de
transcripción-traducción requieren una concentración
total de nucleósido trifosfatos de 2 mM aproximadamente.
Por ejemplo, con objeto de transcribir un gen a
una molécula corta única de ARN de 500 bases de longitud, se
requerirían un mínimo de 500 moléculas de nucleósido trifosfato por
microcápsula (8,33 x 10^{-22} moles). Con objeto de constituir una
solución de 2 mM, este número de moléculas debe estar contenido en
el interior de una microcápsula de un volumen de 4,17 x 10^{-19}
litros (4,17 x 10^{-22} m^{3}) que si fuera esférica tendría un
diámetro de 93 nm.
Además, en el caso, particularmente, de
reacciones relacionadas con la traducción, debe tenerse en cuenta
que los ribosomas necesarios para que ésta tenga lugar, tienen ellos
mismos 20 nm de diámetro, aproximadamente. Por tanto, el límite
inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de 0,1
\mum (100 nm) aproximadamente.
Por tanto, el volumen microcapsular es
preferentemente del orden de entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y 5,2 x
10^{-16} m^{3}, que corresponde a una esfera con un diámetro de
entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de entre 5,2 x
10^{-19} m^{3} y 6,5 x 10^{-17} m^{3} (1 \mum y 5 \mum).
Los diámetros esféricos de alrededor de 2,6 \mum, son más
ventajosos.
No es coincidencia que las dimensiones preferidas
de los compartimentos (gotitas de un diámetro medio de 2,6 \mum)
se parezcan estrechamente a las de las bacterias, por ejemplo,
Escherichia, que constituyen bastones de 1,1 a 1,5 x 2,0 a
6,0 \mum, y Azotobacter, que son células ovoides de 1,5 a
2,0 \mum de diámetro. En su forma más sencilla, la evolución
darviniana se basa en un mecanismo "un genotipo, un fenotipo".
La concentración de un único gen compartimentalizado, o genoma,
disminuye desde 0,4 nM en un compartimento de 2 \mum de diámetro,
a 25 pM en un compartimento de 5 \mum de diámetro. La maquinaria
procariótica de transcripción/traducción ha evolucionado para operar
en compartimentos de aproximadamente 1 a 2 \mum de diámetro, donde
los genes únicos se encuentran a concentraciones aproximadamente
nanomolares. Un gen único, en un compartimento de 2,6 \mum de
diámetro, se encuentra a una concentración de 0,2 nM. Esta
concentración génica es lo bastante alta para una traducción
eficiente. La compartimentalización en tal volumen asegura también
que, incluso si sólo se forma una molécula sencilla del producto
génico, se encuentre presente a 0,2 nM aproximadamente, lo que es
importante, si el producto génico tiene que modificar la actividad
del elemento genético en sí mismo. El volumen de la microcápsula
deberá seleccionarse, pues, teniendo en cuenta no sólo las
necesidades para la transcripción y traducción del elemento
genético, sino también la actividad modificadora que se requiera del
producto génico en el procedimiento de la invención.
El tamaño de las microcápsulas de emulsión puede
variarse simplemente adaptando las condiciones de la emulsión que se
utilizaron para formarla, a los requerimientos del sistema de
selección. Cuanto más voluminoso sea el tamaño microcapsular, mayor
es el volumen que será necesario para encapsular una genoteca de
elementos genéticos dada, ya que el factor limitante, en última
instancia, será el tamaño de la microcápsula, y por tanto, el número
de microcápsulas posible por volumen unitario.
El tamaño de las microcápsulas se selecciona no
sólo teniendo en cuenta los requerimientos del sistema de
transcripción/traducción, sino también los del sistema de selección
utilizado para los elementos genéticos. De este modo, los
componentes del sistema de selección, tales como un sistema de
modificación químico, pueden requerir volúmenes de reacción y/o
concentraciones de reactivos que no sean óptimos para la
transcripción/traducción. Tal como se expone en la presente memoria,
tales requerimientos pueden acomodarse mediante una etapa secundaria
de re-encapsulación; además, pueden acomodarse
seleccionando el tamaño de la microcápsula con objeto de maximizar
la transcripción/traducción y la selección como un todo. La
determinación empírica del volumen microcapsular óptimo y de la
concentración de los reactivos, se prefiere, por ejemplo, tal como
se expone en la presente memoria.
Un "elemento genético" según la presente
invención, es tal como se ha descrito anteriormente.
Preferentemente, un elemento genético es una molécula o constructo
seleccionado a partir del grupo formado por una molécula de ADN, una
molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o
enteramente artificial formada por bases exclusivamente de síntesis
o por una mezcla de éstas y de las que se presentan de modo natural,
cualquiera de las anteriormente mencionadas unidas a un polipéptido,
y cualquiera de las anteriormente mencionadas unidas a cualquier
otro grupo o constructo molecular. Ventajosamente, el otro grupo o
constructo molecular puede ser seleccionado a partir del grupo
formado por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas,
particularmente perlas, por ejemplo, perlas de poliestireno,
sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, marcadores tales
como fluoróforos o marcadores isotópicos, reactivos químicos,
agentes de unión tales como macrociclos y similares.
La parte ácido nucleica del elemento genético
puede incluir secuencias reguladores apropiadas tales como las que
son necesarias para la expresión eficiente del producto génico, por
ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias de iniciación
traduccional, secuencias de poliadenilación, sitios de corte y
empalme y similares.
Tal como se pondrá en evidencia a continuación,
en muchos casos, el polipéptido u otro grupo o constructo molecular
es un ligando o un sustrato que directa o indirectamente se une a o
reacciona con el producto génico, con objeto de marcar al elemento
genético. Esto permite la clasificación del elemento genético
basándose en la actividad del producto génico.
El ligando o sustrato puede conectarse al ácido
nucleico mediante diversos medios que serán evidentes para los
expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996).
Bastará cualquier marcador para permitir la subsiguiente selección
del elemento genético. La clasificación puede llevarse a cabo
mediante cualquier procedimiento que permita la separación
preferente, la amplificación o la supervivencia del elemento
genético marcado. Ejemplos incluyen la selección mediante unión
((incluyendo técnicas basadas en la separación magnética, por
ejemplo, utilizando Dynabeads^{TM}), y mediante la resistencia a
la degradación (por ejemplo, mediante nucleasas, incluyendo
endonucleasas de restricción).
Una forma en la que la molécula de ácido nucleico
puede estar unida a un ligando o sustrato, es mediante la
biotinilación. Esto puede realizarse mediante amplificación PCR con
un iniciador de biotinilación en el extremo 5', de forma que la
biotina y el ácido nucleico están unidos covalentemente.
El ligando o sustrato que va a seleccionarse
puede estar unido al ácido nucleico modificado mediante diversos
medios que serán evidentes para los expertos en la materia. Un ácido
nucleico biotinilado puede acoplarse a una microperla de
poliestireno (de 0,035 a 0,2 \mum de diámetro) que está revestida
con avidina o estreptavidina, que se unirá por tanto al ácido
nucleico con una afinidad muy intensa. Esta perla puede
derivatizarse con un sustrato o ligando mediante cualquier
procedimiento apropiado, tal como la adición de sustrato biotinilado
o mediante enlace covalente.
Alternativamente, un ácido nucleico biotinilado
puede acoplarse a la avidina o a la estreptavidina formando complejo
con una gran molécula proteica tal como la tiroglobulina (669 Kd) o
la ferritina (440 Kd). Este complejo puede derivatizarse con un
sustrato o un ligando, por ejemplo, mediante enlace covalente con el
grupo \varepsilon-amino de lisinas, o mediante una
interacción no covalente tal como biotina-avidina.
El sustrato puede estar presente en forma no unida al elemento
genético, pero que contenga un "marcador" inactivo que requiera
una etapa posterior para activarlo, tal como la fotoactivación (por
ejemplo, de un análogo "enjaulado" de biotina, (Sundberg et
al., 1995; Pirrung y Huang, 1996)). El catalizador que se
selecciona convierte entonces el sustrato a producto. El
"marcador" puede entonces activarse y el sustrato
"marcado" y/o el producto pueden unirse mediante una molécula
de unión al marcador (por ejemplo, la avidina o la estreptavidina)
que forme complejo con el ácido nucleico. La proporción del sustrato
al producto unido al ácido nnucleico mediante el "marcador",
reflejará por tanto la proporción del sustrato y del producto en
solución.
Una alternativa es acoplar el ácido nucleico a un
anticuerpo específico para un producto (u a otra molécula
producto-específica). En este guión, el sustrato (o
uno de los sustratos) no se encuentra unido en cada microcápsula al
elemento genético, pero posee un "marcador" molecular (por
ejemplo, biotina, DIG o DNP). Cuando el catalizador que va a
seleccionarse convierte el sustrato a producto, éste retiene el
"marcador" y es capturado entonces en la microcápsula por el
anticuerpo producto-específico. De esta forma, el
elemento genético sólo llega a asociarse con el "marcador"
cuando codifica o produce una enzima capaz de convertir el sustrato
al producto.
Cuando todas las reacciones se detienen y las
microcápsulas se combinan, los elementos genéticos que codifican
enzimas activas pueden enriquecerse utilizando un anticuerpo u otra
molécula que se une o reacciona específicamente con el
"marcador". Aunque ambos, sustratos y producto, poseen el
marcador molecular, sólo se copurificarán los elementos genéticos
que codifiquen el producto génico activo.
Los términos "aislamiento",
"clasificación" y "selección", así como sus variaciones,
se utilizan en la presente memoria. Aislamiento, según la presente
invención, se refiere al procedimiento de separar una entidad a
partir de una población h heterogénea, por ejemplo una mezcla, de
forma que se libere por lo menos de una sustancia con la que se
asoció antes del proceso de aislamiento. En una forma de realización
preferida, el aislamiento se refiere a la purificación de una
entidad, esencialmente hasta la homogeneidad. La clasificación de
una entidad se refiere al procedimiento de aislar preferentemente
las entidades deseadas respecto a las entidades no deseadas. En la
medida en que esto se refiere al aislamiento de las entidades
deseadas, los términos "aislamiento" y "clasificación",
son equivalentes. El procedimiento de la presente invención permite
la clasificación de los elementos genéticos deseados a partir de
conjuntos (genotecas o repertorios) de elementos genéticos que
contienen el elemento genético deseado. La selección se utiliza para
referirse al procedimiento (que incluye el procedimiento de
clasificación) de aislar una entidad según una propiedad particular
suya.
En una forma de realización muy preferida, el
procedimiento de la presente invención es útil para la clasificación
de genotecas de elementos genéticos. La invención proporciona, de
acuerdo con esto, un procedimiento según aspectos anteriores de la
invención, en el que los elementos genéticos se aíslan a partir de
una genoteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de
productos génicos. En la presente memoria, los términos
"genoteca", "repertorio" y "conjunto" se utilizan
según su significación habitual en la técnica, de forma que una
genoteca de elementos genéticos codifica un repertorio de productos
génicos. En general, las genotecas se construyen a partir de
conjuntos de elementos genéticos que tienen propiedades que
facilitan la clasificación.
La selección inicial de un elemento genético a
partir de una genoteca de elementos genéticos utilizando la presente
invención, requerirá en la mayoría de los casos, el rastreo de un
gran número de elementos genéticos variantes. Pueden crearse, de
distintas maneras, genotecas de elementos genéticos, que incluyen
las siguientes.
Conjuntos de elementos genéticos que se presentan
de modo natural pueden clonarse a partir del ADN genómico o del cADN
(Sambrook et al., 1989); por ejemplo, las genotecas de
anticuerpos fágicos, obtenidas mediante amplificación PCR de
repertorios de genes de anticuerpos, de donadores inmunizados o no,
han probado ser fuentes muy efectivas de fragmentos de anticuerpos
funcionales (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Las
genotecas de genes pueden también obtenerse codificando la totalidad
(véase por ejemplo Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de
los genes (véase por ejemplo Lowman et al., 1991), o
conjuntos de genes (véase por ejemplo Nissim et al., 1994)
mediante un oligonucleótido sintético dopado o escogido al azar. Las
genotecas pueden también obtenerse introduciendo mutaciones en un
elemento genético o en un conjunto de elementos genéticos "al
azar" mediante diversas técnicas in vivo, que incluyen: la
utilización de "cepas mutantes", de bacterias tales como E.
coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et
al., 1990; Low et al., 1996); la utilización del sistema
de hipermutación de anticuerpos de los B-linfocitos
(Yelamos et al., 1995). Las mutaciones al azar pueden también
introducirse tanto in vivo como in vitro mediante
mutágenos químicos, y radiación UV o ionizante (véase Friedberg
et al., 1995), o la incorporación de análogos mutagénicos de
bases (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Las mutaciones
" al azar" pueden asimismo introducirse en los genes in
vitro durante la polimerización, utilizando por ejemplo
polimerasas que sean propensas al error (Leung et al.,
1989).
Puede introducirse una ulterior diversificación
utilizando la recombinación homóloga in vivo (véase
Kowalczykowski et al., 1994 o in vitro (Stemmer,
1994a; Stemmer, 1994b)).
Según otro aspecto de la presente invención, por
tanto, se proporciona un procedimiento de evolución in vitro
que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- Selección de uno o más elementos genéticos a partir de una genoteca de elementos genéticos según la presente invención;
- (b)
- mutación del elemento o elementos genéticos seleccionados para generar otra genoteca de elementos genéticos que codifican un repertorio para los productos génicos; y
- (c)
- repetición iterativa de las etapas (a) y (b), con objeto de obtener un producto génico con potenciación de su actividad .
Las mutaciones pueden introducirse en los
elementos genéticos tal como se expuso a continuación.
Los elementos genéticos según la invención
codifican enzimas ventajosamente, preferentemente de interés
industrial o farmacológico, activadoras o inhibidoras, especialmente
de sistemas biológicos, tales como mecanismos de transducción de
señales celulares, anticuerpos y sus fragmentos, otros agentes de
unión apropiados para diagnóstico y aplicaciones terapéuticas. En un
aspecto preferido, por tanto, la invención permite la identificación
y aislamiento de productos útiles industrial o clínicamente. En otro
aspecto de la invención, se proporciona un producto cuando se aísla
mediante el procedimiento de la invención.
La selección de condiciones apropiadas de
encapsulación es deseable. Dependiendo de la complejidad y tamaño de
la genoteca que vaya a rastrearse, puede ser beneficioso fijar el
procedimiento de encapsulación de forma que un elemento genético o
menos de 1 sea encapsulado por microcápsula. Esto proporcionará el
mayor poder de resolución. Cuando la genoteca es más grande y/o más
compleja, sin embargo, esto puede ser impracticable; puede
preferirse encapsular varios elementos genéticos juntos y depender
de la aplicación repetida del procedimiento de la invención para
alcanzar la clasificación de la actividad deseada, Pudiendo
utilizarse una combinación de procedimientos de encapsulación para
obtener el enriquecimiento deseado.
Los estudios teóricos indican que cuanto más
abundante es el número de variantes creadas de elementos genéticos,
lo más probable es que una molécula sea creada con las propiedades
deseadas (véase Perelson y Oster, 1979, para una descripción de cómo
se aplica esto a repertorios de anticuerpos). Recientemente, también
se ha confirmado prácticamente que repertorios más numerosos de
anticuerpos-fago dan lugar verdaderamente a más
anticuerpos con mejores afinidades de unión que los repertorios más
pequeños (Griffiths et al., 1994). Para asegurar que se
generan variantes raras y por tanto son capaces de ser
seleccionadas, es deseable una genoteca de gran tamaño. Así, la
utilización de microcápsulas óptimamente pequeñas es
beneficiosa.
El repertorio más grande creado hasta la fecha
utilizando los procedimientos que necesitan una etapa in vivo
(presentación fágica y sistemas LacI), ha sido una genoteca
péptido-fágica de 1,6 x 10^{11} clones, que
requirió la fermentación de 15 litros de bacterias (Fish et
al., 1996). Los experimentos SELEX se llevan a cabo a menudo
sobre grandes cantidades de variantes (hasta 10^{15}).
Utilizando la presente invención, en una
microcápsula preferida de 2,6 \mum de diámetro, puede
seleccionarse, utilizando 1 ml de fase acuosa en 20 ml de emulsión,
un tamaño de repertorio de por lo menos 10^{11} .
Además de los elementos genéticos descritos
anteriormente, las microcápsulas según la invención incluirán otros
componentes que se requieren para que el procedimiento de
clasificación tenga lugar. Otros componentes del sistema
comprenderán, por ejemplo, los necesarios para la transcripción y/o
traducción del elemento genético. Éstos son seleccionados para las
necesidades de un sistema específico a partir de los siguientes: un
tampón apropiado, un sistema de transcripción/replicación in
vitro y o un sistema de traducción in vitro que contiene
todos los ingredientes necesarios, enzimas y cofactores, ARN
polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos),
ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la
reacción de interés, con objeto de permitir la selección del
producto génico modificado.
Un tampón apropiado será uno en el que todos los
componentes deseados del sistema biológico son activos y dependerá
por tanto de las necesidades de cada sistema reactivo específico.
Los tampones apropiados para las reacciones biológicas y/o químicas
son conocidos en la técnica y las recetas se proporcionan en varios
textos de laboratorio, tal el de Sambrook et al., 1989.
El sistema de traducción in vitro
comprenderá habitualmente un extracto celular, típicamente de
bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991;
Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976), o
germen de trigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas
apropiados están disponibles comercialmente (por ejemplo, de
Promega), incluyendo algunos que permitirán la
transcripción/traducción conjugadas (todas los sistemas bacterianos
y los sistemas de reticulocitos y de germen de trigo TNT^{TM} son
sistemas de extractos de Promega). La mezcla de aminoácidos que se
utilizan puede incluir aminoácidos sintéticos si se desea, para
aumentar el posible número o variedad de proteínas producidas en la
genoteca. Esto puede llevarse a cabo cargando ARNt con aminoácidos
artificiales y utilizando estos ARNt para la traducción in
vitro de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman et
al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).
Después de cada serie de selección, el
enriquecimiento del conjunto de elementos genéticos para los que
codifican las moléculas de interés, puede ensayarse mediante la
transcripción/replicación in vitro no compartimentalizada, o
mediante reacciones acopladas de
transcripción-traducción. El conjunto seleccionado
se clona en un vector plasmídico apropiado y se produce el ARN o la
proteína recombinante a partir de clones individuales para ulterior
purificación y ensayo.
La invención se refiere además a un procedimiento
para producir un producto génico, una vez que un elemento genético
que codifique el producto génico, se haya clasificado mediante el
procedimiento de la invención. Claramente, el elemento genético en
sí mismo puede expresarse directamente mediante medios
convencionales para producir el producto génico. Sin embargo, pueden
utilizarse técnicas alternativas, como será evidente para los
expertos en la materia. Por ejemplo, la información genética
incorporada en el producto génico puede incorporarse a un vector de
expresión apropiado, y expresada a partir de él.
La invención describe, asimismo, la utilización
de técnicas de rastreo convencional para identificar compuestos que
sean capaces de interactuar con los productos génicos identificados
mediante el primer aspecto de la invención. En formas de realización
preferidas, el ácido nucleico que codifica el producto génico se
incorpora a un vector, y se introduce en células huéspedes
apropiadas para producir progenies celulares transformadas que
expresen el producto génico. Las progenies celulares resultantes
pueden entonces producirse para llevar a cabo un análisis
cuantitativo y/o cualitativo reproducible del efecto o efectos de
los medicamentos potenciales que afecten la función del producto
génico. De este modo, las células que expresan el producto génico
pueden utilizarse para la identificación de compuestos,
particularmente de compuestos de peso molecular bajo, que modulan la
función del producto génico. Así, las células huéspedes que expresan
el producto génico son útiles para el rastreo medicamentoso y
constituye otro objeto de la presente invención proporcionar un
procedimiento para identificar compuestos que modulen la actividad
del producto génico, que comprende la exposición de las células que
contienen ADN heterólogo que codifica el producto génico, en el cual
procedimiento dichas células producen productos génicos funcionales,
hasta por lo menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal, cuya
capacidad para modular la actividad de dicho producto génico se
busca determinar, controlando a continuación dichas células respecto
a los cambios causados por dicha modulación. Dicho ensayo permite la
identificación de moduladores, tales como moduladores agonistas,
antagonistas y alostéricos, del producto génico. Tal como se utiliza
en la presente memoria, un compuesto o señal que module la actividad
del producto génico hace referencia a un producto que altera la
actividad del producto génico, de tal manera, que la actividad del
producto génico es distinta en presencia del compuesto o señal
(comparada con la ausencia de dicho compuesto o señal).
Los ensayos de rastreo basados en células pueden
diseñarse para construir progenies celulares en las que la expresión
de una proteína informadora, es decir, una proteína fácilmente
ensayable, tal como la b galactosidasa, la cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT) o la luciferasa, depende del producto
génico. Dicho ensayo permite la detección de compuestos que modulan
directamente la función del producto génico, tal como compuestos que
antagonizan el producto génico, o compuestos que inhiben o potencial
otras funciones celulares que se requieren para la actividad del
producto génico.
La presente invención proporciona también un
procedimiento para influir exógenamente en los procesos dependientes
del producto génico que tienen lugar en las células. Las células
huésped que producen productos génicos recombinantes, por ejemplo,
las células de mamíferos, pueden ponerse en contacto con un
compuesto de prueba, y su efecto o efectos modulantes pueden
entonces evaluarse comparando la respuesta mediada por el producto
génico en presencia y ausencia del compuesto de prueba, o
relacionando la respuesta mediada por el producto génico de las
células de ensayo, o de las células control(es decir, de
células que no expresan el producto génico), con la presencia del
compuesto.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
método para la optimización de un procedimiento de producción que
implica por lo menos una etapa que es facilitada por un polipéptido.
Por ejemplo, la etapa puede ser una fase catalítica, que es
facilitada por una enzima. Así, la invención proporciona un
rocedimiento para la preparación de un compuesto o compuestos que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar un protocolo de síntesis en el que por lo menos una etapa sea facilitada por un polipéptido;
- (b)
- preparar elementos genéticos que codifican variantes del polipéptido que facilita esta etapa;
- (c)
- compartimentalizar los elementos genéticos en las microcápsulas;
- (d)
- expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas;
- (e)
- clasificar los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos polipeptídicos que tienen la actividad deseada; y
- (f)
- preparar el compuesto o compuestos utilizando el producto génico polipeptídico identificado en (e) para facilitar la etapa relevante de la síntesis.
Mediante la invención, las enzimas implicadas en
la preparación de un compuesto, pueden optimizarse seleccionándolas
respecto a la actividad óptima. El procedimiento implica la
preparación de variantes del polipéptido que va a rastrearse, que se
equiparan a una genoteca de polipéptidos cuando se hace referencia a
ella en la presente memoria. Las variantes pueden prepararse de la
misma forma que las genotecas que se consideraron en otra parte de
la presente memoria.
El sistema puede configurarse para seleccionar
moléculas de ARN, de ADN o de productos génicos proteicos con
actividad catalítica, reguladora o de unión.
En el caso de selección para un producto génico
que presente afinidad por un ligando específico, el elemento
genético puede unirse al producto génico en la microcápsula a través
del ligando. Sólo los productos génicos con afinidad por el ligando
se unirán por lo tanto al elemento genético mismo, y por lo tanto,
sólo elementos genéticos que produzcan producto activo quedarán
retenidos en la etapa selectiva. En esta forma de realización, el
elemento genético comprenderá, de esta forma, un ácido nucleico que
codifique el producto génico unido a un ligando para éste.
En esta forma de realización, todos los productos
génicos que van a ser seleccionados contienen un dominio putativo de
unión, el cual va a seleccionarse, así como una característica
común, un marcador. El elemento genético en cada microcápsula está
unido físicamente al ligando. Si el producto génico producido a
partir del elemento genético posee afinidad por el ligando, se unirá
a éste y llegará a estar unido físicamente al mismo elemento
genético que lo codificó, dando lugar a un elemento genético
"marcado". Al final de la reacción, todas las microcápsulas se
combinan, y todos los elementos genéticos y productos génicos se
agrupan conjuntamente en un mismo medio ambiente. Los elementos
genéticos que codifican los productos génicos que exhiben la unión
deseada, pueden seleccionarse mediante purificación por afinidad,
utilizando una molécula que se une específicamente a, o reacciona
específicamente con "el marcador".
En una forma de realización alternativa, los
elementos genéticos pueden clasificarse basándose en que el producto
génico, que se une al ligando, oculta meramente a éste de, por
ejemplo, otros socios de unión. En esta eventualidad, el elemento
genético, más que quedar retenido durante una etapa de purificación
por afinidad, puede eluirse selectivamente mientras otros elementos
genéticos se unen.
En una forma de realización alternativa, la
invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la
invención, en el que en la etapa (b), los productos génicos se unen
a elementos genéticos que los codifican. Los productos génicos junto
con los elementos genéticos unidos, se clasifican entonces como
resultado de la unión de un ligando a productos génicos que tienen
la actividad deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos
pueden contener una región constante que se une covalentemente o no
al elemento genético, y una segunda región que está diversificada,
de forma que genera la actividad de unión deseada.
La clasificación mediante afinidad depende de la
presencia de dos elementos de un par de unión, en tales condiciones
que la unión puede tener lugar. Cualquier par de unión puede
utilizarse a este respecto. Tal como se utiliza en la presente
memoria, el término par de unión se refiere a cualquier par de
moléculas capaces de unirse a otro. Ejemplos de pares de unión que
pueden utilizarse en la presente invención, incluyen un antígeno y
un anticuerpo o fragmento de éste, capaz de unirse al antígeno, el
par biotina-avidina/estreptavidina (Savage et
al.,1994), un polipéptido de unión dependiente de calcio y su
ligando (por ejemplo, la calmodulina y un péptido de unión a ésta
(Stofko et al.,1992; Montigiani et al., 1996)), pares
de polipéptidos que se ensamblan para formar una cremallera de
leucina (Tripet et al., 1996), histidinas (típicamente
péptidos de hexahistidina) y Cu^{2+}, Zn^{2+} y Ni^{2+}
quelados (por ejemplo, Ni-NTA; Hochuli et
al.,1987), proteínas de unión a ARN y ADN (Klug, 1995),
incluyendo los motivos de dedos de zinc (Klug y Schwabe, 1995) y ADN
metiltransferasas (Anderson, 1993), y sus sitios de unión ácido
nucleicos.
Cuando la selección es para catálisis, el
elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato
de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico
capaz de actuar como un catalizador, el producto génico catalizará
la conversión del sustrato en el producto. Por tanto, al final de la
reacción, el elemento genético está unido físicamente al producto de
la reacción catalizada. Cuando las microcápsulas se combinan y los
reaccionantes se juntan, los elementos genéticos que codifican las
moléculas catalíticas pueden enriquecerse seleccionando cualquier
propiedad que sea específica para el producto (Figura 1).
Por ejemplo, el enriquecimiento puede llevarse a
cabo mediante purificación por afinidad utilizando una molécula (por
ejemplo, un anticuerpo) que se una específicamente al producto.
Igualmente, el producto génico puede tener el efecto de modificar un
componente del ácido nucleico del elemento genético, por ejemplo,
mediante metilación (o desmetilación) o mutación del ácido nucleico,
haciéndolo resistente a, o susceptible al ataque por nucleasas,
tales como las endonucleasas de restricción.
Alternativamente, la selección puede realizarse
indirectamente acoplando una primera reacción a reacciones
subsiguientes que tienen lugar en la misma microcápsula. Existen dos
formas generales por las que esto puede realizarse. En primer lugar,
el producto de la primera reacción podría reaccionar con, o unirse
mediante una molécula que no reacciona con el sustrato de la primera
reacción. En segundo lugar, la reacción acoplada sólo tendrá lugar
en presencia del producto de la primera reacción. Un elemento
genético activo puede entonces purificarse mediante selección
respecto a las propiedades del producto de la segunda reacción.
Alternativamente, el producto de la reacción que
se está seleccionando, puede constituir el sustrato o cofactor para
una segunda reacción catalizada enzimáticamente. La enzima para
catalizar la segunda reacción puede ser traducida in situ en
las microcápsulas, o bien incorporarse a la mezcla reactiva
previamente a la microencapsulación. Sólo cuando la primera reacción
tenga lugar, la enzima unida generará un producto seleccionable.
Este concepto de unión puede elaborarse para
incorporar múltiples enzimas, cada una de ellas utilizando como
sustrato el producto de la reacción anterior. esto permite la
selección de enzimas que no reaccionarán con un sustrato
inmovilizado. También puede diseñarse para proporcionar un aumento
de sensibilidad mediante la amplificación de la señal, si un
producto de una reacción constituye un catalizador o un cofactor
para una segunda reacción o serie de reacciones conducentes a un
producto seleccionable (por ejemplo, véase Johannsson y Bates, 1988;
Johannsson, 1991). Además, un sistema enzimático cascada puede
basarse en la producción de un activador para una enzima, o en la
destrucción del inhibidor enzimático (véase Mize et al.,
1989). La unión tiene también la ventaja de que puede utilizarse
un sistema de selección común para un grupo completo de enzimas que
generan el mismo producto, permitiendo la selección de
transformaciones químicas complicadas que no pueden realizarse en
una sola etapa.
Dicho procedimiento de unión permite así paso a
paso la evolución de nuevos "vías metabólicas" in vitro,
seleccionando y mejorando primero una etapa y entonces, la
siguiente. La estrategia de selección se basa en el producto final
de la vía (metabólica), de modo que todas las etapas previas pueden
evolucionar independientemente o secuencialmente sin fijar un nuevo
sistema de selección para cada etapa de la reacción.
Expresado de una forma alternativa, se
proporciona un procedimiento para el aislamiento de uno o más
elementos genéticos que codifican un producto génico que posee una
actividad catalítica deseada, que comprende las etapas
siguientes:
- (1)
- la expresión de los elementos genéticos para dar lugar a sus productos génicos respectivos;
- (2)
- permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato en un producto, que puede o no seleccionarse directamente, según la actividad deseada;
- (3)
- acoplar opcionalmente la primera reacción a una o más reacciones subsiguientes, modulándose cada una de ellas por el producto de las reacciones previas, llevando a la creación de un producto final seleccionable;
- (4)
- unión del producto catalítico seleccionable a los elementos genéticos mediante:
- (a)
- unión de un sustrato a los elementos genéticos, de tal forma que el producto permanezca asociado a éstos, o
- (b)
- reacción o unión del producto seleccionable a los elementos genéticos mediante una "marcador" molecular apropiado unido al sustrato que permanece sobre el producto, o
- (c)
- unión del producto seleccionable (pero no del sustrato) a los elementos genéticos mediante una reacción producto-específica o la interacción con el producto; y
- (5)
- selección del producto de catálisis, juntamente con el elemento genético al cual está unido, mediante una reacción específica o interacción con el producto, o mediante purificación por afinidad utilizando un "marcador" molecular apropiado unido al producto de catálisis, en el que cada elemento y producto genético respectivo de las etapas (1) a (4) está contenido en el interior de una microcápsula.
Un sistema similar puede utilizarse para
seleccionar las propiedades reguladoras de las enzimas.
En el caso de selección de una molécula
reguladora que actúa como un activador o inhibidor de un proceso
bioquímico, los componentes de éste pueden traducirse in situ
en cada microcápsula o pueden incorporarse a la mezcla reactiva
antes de la microencapsulación. Si el elemento genético seleccionado
codifica un activador, la selección puede realizarse para el
producto de la reacción regulada, tal como se describe anteriormente
en relación con la catálisis. Si se desea un inhibidor, puede
llevarse a cabo la selección para una propiedad química específica
del sustrato de la reacción regulada.
Se proporciona, por tanto, un procedimiento para
clasificar uno o más elementos genéticos que codifican un producto
génico que exhibe una actividad reguladora deseada, que comprende
las etapas siguientes:
- (1)
- expresión de los elementos genéticos para dar lugar a sus respectivos productos génicos;
- (2)
- permitir que los productos génicos activen o inhiban una reacción bioquímica, o secuencias de reacciones acopladas, según la actividad deseada, de tal forma que permitan la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;
- (3)
- enlace de la molécula seleccionable a los elementos genéticos mediante
- (a)
- la unión a los elementos genéticos de la molécula seleccionable o la del sustrato del cual se deriva, o
- (b)
- hacer reaccionar o unir el producto seleccionable a los elementos genéticos, mediante un "marcador" molecular apropiado unido al sustrato que permanece sobre el producto, o
- (c)
- acoplando el producto de catálisis (pero no el sustrato) a los elementos genéticos, mediante una reacción específica del producto, o de la interacción con el producto; y
- (4)
- selección del producto seleccionable junto con el elemento genético al que está unido, mediante una reacción específica o de una interacción con el producto seleccionable, o mediante purificación por afinidad utilizando un "marcador" molecular apropiado unido al producto de catálisis, en el que cada elemento y producto genético respectivo de las etapas (1) a (4) está contenido en el interior de una microcápsula.
La invención proporciona la clasificación de
microcápsulas intactas, permitiendo llevarla a cabo las técnicas de
clasificación que van a utilizarse. Las microcápsulas pueden
clasificarse cuando tiene lugar el cambio inducido por el producto
génico deseado o el mismo cambio se manifiesta en la superficie de
la microcápsula o puede detectarse desde fuera de ésta. El cambio
puede estar causado por la acción directa del producto génico, o
indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las
cuales implican al producto génico que posee la actividad deseada,
conduce al cambio. Por ejemplo, la microcápsula puede estar
configurada de forma que el producto génico se exponga en su
superficie y sea accesible, de esta forma, a los reactivos. Cuando
la microcápsula es membranosa, el producto génico puede ser dirigido
o puede causar que una molécula se dirija a la membrana de la
microcápsula. Esto puede alcanzarse, por ejemplo, utilizando una
secuencia de localización de la membrana, tal como las derivadas de
las proteínas de la membrana, que favorecerán la incorporación de
una molécula fusionada o unida a la membrana de la microcápsula.
Alternativamente, cuando la microcápsula se forma mediante la
división de fases, tal como con las emulsiones
agua-aceite, una molécula que posea partes que sean
más solubles en la fase extra-capsular, se
organizará ella misma de forma que estas partes se encuentren en el
límite de la microcápsula.
En un aspecto preferido de la invención, sin
embargo, la clasificación de las microcápsulas se aplica a los
sistemas de clasificación que dependen de un cambio en las
propiedades ópticas de la microcápsula, por ejemplo, sus
características de absorción o de emisión, por ejemplo, la
alteración en las propiedades ópticas de la microcápsula, que
resulta de una reacción que conduce a cambios en la absorbencia,
luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia asociadas con la
microcápsula. La totalidad de dichas propiedades se incluyen en el
término "óptico". En tal caso, las microcápsulas pueden
clasificarse debido a que la clasificación puede activarse por
luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una forma de
realización muy preferida, la clasificación activada por la
fluorescencia se utiliza para clasificar las microcápsulas en las
que la producción de un producto génico que tenga una actividad
deseada, se acompaña de la producción de una molécula fluorescente
en la célula. Por ejemplo, el producto génico en si mismo puede ser
fluorescente, por una proteína fluorescente tal como GFP.
Alternativamente, el producto génico puede inducir o modificar la
fluorescencia de otra molécula, uniéndose o reaccionando con
ella.
Las microcápsulas pueden identificarse mediante
un cambio inducido por el producto génico deseado, que tiene lugar o
él mismo se manifiesta en la superficie de la microcápsula o es
detectable desde el exterior, tal como se describe en la sección iii
(Clasificación de las Microcápsulas). Este cambio, cuando se
identifica, se utiliza para desencadenar la modificación del gen en
el interior del compartimento. En un aspecto preferido de la
invención, la identificación de las microcápsulas depende de un
cambio en sus propiedades ópticas, resultantes de una reacción que
conduce a la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia en el
interior de la microcápsula. La modificación del gen en el interior
de las microcápsulas será desencadenada por la identificación de la
luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Por ejemplo, la
identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia,
puede desencadenar el bombardeo del compartimento con fotones (u
otras partículas u ondas) que conduce a la modificación del elemento
genético. Un procedimiento similar se ha descrito previamente para
la clasificación de células (Keij et al., 1994). La
modificación del elemento genético puede resultar, por ejemplo, del
acoplamiento de un "marcador" molecular envuelto por un grupo
protector fotolábil para los elementos genéticos: el bombardeo con
fotones de una longitud de onda apropiada conduce a la eliminación
de la envuelta. A continuación, las microcápsulas se combinan y los
elementos genéticos se agrupan juntos en un ambiente determinado.
Los elementos genéticos que codifican productos génicos que muestran
la actividad deseada, pueden seleccionarse mediante purificación por
afinidad utilizando una molécula que se une o reacciona
específicamente con el "marcador".
Asimismo, se apreciará que, según la presente
invención, no es necesario, para todos los procedimientos de
transcripción/replicación y/o traducción y selección continuar en
una única etapa, teniendo lugar en una microcápsula la totalidad de
las reacciones. El procedimiento de selección puede comprender dos o
más etapas. En primer lugar, la transcripción/replicación y/o la
traducción de cada elemento genético de una genoteca de elementos
genéticos puede llevarse a cabo en una primera microcápsula. Cada
producto génico se une entonces al elemento genético que lo codificó
(que se encuentra en la misma microcápsula). Las microcápsulas se
fragmentan entonces, y los elementos genéticos unidos a sus
productos génicos respectivos, se purifican opcionalmente.
Alternativamente, los elementos genéticos pueden unirse a sus
respectivos productos genéticos utilizando procedimientos que no
dependen de la encapsulación. Por ejemplo, la presentación de fagos
(Smith, G.P., 1985), la presentación polisómica (Mattheakkis et
al., 1994), la fusión ARN-péptido (Roberts y
Szostak, 1997), o la fusión del péptido represor lac (Cull, et
al., 1992).
En la segunda etapa del procedimiento, cada
elemento genético purificado que se une al producto génico, se
dispone en una segunda microcápsula que contiene componentes de la
reacción que va a seleccionarse. Esta reacción se inicia entonces.
Después de finalización de las reacciones, las microcápsulas se
fragmentan otra vez y se seleccionan los elementos genéticos
modificados. En el caso de reacciones de múltiples etapas
complicadas, en las que están implicados muchos componentes
individuales y etapas de reacción, una o más de las etapas que
intervienen pueden llevarse a cabo entre la etapa inicial de
creación y la unión del producto génico al elemento genético, y la
etapa final de generación del cambio seleccionable en el elemento
genético.
El sistema puede configurarse de tal forma que la
deseada actividad de unión, catalítica o reguladora codificada por
un elemento genético conduce, directa o indirectamente, a la
activación de la expresión de un "gen informador" que se
encuentra en todas las microcápsulas. Sólo los productos génicos con
la actividad deseada activan la expresión del gen informador. La
actividad resultante de la expresión del gen informador permite la
selección del elemento genético (o del compartimento que lo
contiene) mediante algunos de los procedimientos que se describen en
la presente memoria.
Por ejemplo, la activación del gen informador
puede ser el resultado de la actividad de unión del producto génico
de una forma análoga a la del "sistema de dos híbridos" (Fields
y Song, 1989). La activación podría también resultar del producto de
una reacción catalizada por un producto génico deseable. Por
ejemplo, el producto de reacción podría constituir un inductor
transcripcional del gen informador. Por ejemplo, la arabinosa podría
utilizarse para inducir la transcripción a partir del promotor
araBAD. La actividad del producto génico deseable podría también dar
lugar a la modificación de un factor de transcripción, dando lugar a
la expresión del gen informador. Por ejemplo, si el producto génico
deseado es una quinasa o fosfatasa, la fosforilación o
defosforilación de un factor de transcripción puede conducir a la
activación de la expresión del gen informador.
Según otro aspecto de la presente invención, el
procedimiento comprende la etapa ulterior de amplificación de los
elementos genéticos. La amplificación selectiva puede utilizarse
como un medio para enriquecer los elementos genéticos que codifican
el producto génico deseado.
En todas las configuraciones anteriores, el
material genético incluido en los elementos genéticos puede
amplificarse y repetirse el proceso en etapas reiterativas. La
amplificación puede realizarse mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (Saiki et al.,1988), o utilizando una de las
diversas técnicas de amplificación génica, incluyendo: amplificación
mediante la replicasa Q\beta (Cahill, Foster y Mahan, 1991;
Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov y Spirin, 1995); la
reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al.,
1988; Barany, 1991); el sistema de replicación secuencial
auto-sostenido (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991), y la
amplificación del desplazamiento de las cadenas (Walker et
al., 1992).
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un procedimiento para la compartimentalización y
expresión de un elemento genético con objeto de formar su producto
génico en el interior del compartimento, que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- formación de una solución acuosa que comprenda el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo, para formar su producto génico;
- (b)
- microencapsulación de la solución, de manera que se forme una microcápsula discreta que incluya el elemento genético; y
- (c)
- exposición de la microcápsula a condiciones apropiadas para que el elemento genético se exprese, y se forme su producto génico.
Las técnicas apropiadas de microencapsulación se
describen detalladamente en la descripción general que sigue a
continuación.
Preferentemente, una genoteca de elementos
genéticos que codifican un repertorio de productos génicos, se
encapsula mediante el procedimiento expuesto anteriormente, y los
elementos genéticos se expresan para producir sus respectivos
productos génicos, según la invención. En una forma de realización
muy preferida de la invención, la microencapsulación se obtiene
formando una emulsión agua-aceite a partir de la
solución acuosa que incluye los elementos genéticos.
La invención, de acuerdo con esto, proporciona
también una microcápsula que puede obtenerse mediante el
procedimiento anteriormente expuesto.
Varios aspectos y formas de realización de la
presente invención se ilustran en los ejemplos siguientes.
Las microcápsulas que pertenecen al abanico de
tamaños preferidos de la presente invención, pueden generarse
utilizando un sistema de emulsión agua-aceite.
Aceite mineral blanco ligero (Sigma;
M-3516) se utiliza en la presente memoria como la
fase continua y la emulsión se estabiliza mediante los
emulsificantes monooleato de sorbitán (Span 80, Fluka; 85548) y
monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80, Sigma Ultra;
P-8074) y en algunos casos, también con desoxicolato
sódico al 0,5% peso/vol (Fluka; 30970).
La fase oleosa se preparó en el momento
disolviendo Span 80 al 4,5% (vol/vol) (Fluka) en aceite mineral
(Sigma, #M-5904), seguido por Tween 80 al 0,5%
(vol/vol) (SigmaUltra; #P-8074). Mezclas reactivas
in vitro enfriadas con hielo (50 \mul) se añadieron
gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante 2 minutos
aproximadamente) a 0,95 ml de la fase oleosa enfriada con hielo en
un Vial Costar Biofreeze de 5 ml (#2051), mientras se agitaba con
una varilla magnética (8 x 3 mm con un anillo giratorio; Scientific
Industries International, Loughborough, Gran Bretaña). Se continuó
la agitación en hielo a 1150 r.p.m. durante otro minuto más. En
algunas emulsiones la fase acuosa se suplementó con un surfactante
aniónico, por ejemplo, desoxicolato sódico, colato sódico, glicolato
sódico y taurocolato sódico, típicamente al 0,5% (peso/vol).
Cuando se indicó, la emulsión se homogeneizó
posteriormente utilizando un dispersor Ultra-Turrax
T23 (IKA), equipado con un dispositivo de dispersión de 8 mm de
diámetro a 8 k, 9 k ó 13,5 k r.p.m. durante 1 minuto, o a 20 k
r.p.m. durante 1 ó 5 minutos, en hielo. Esto redujo el tamaño de la
microcápsula.
Las reacciones pudieron extinguirse y la emulsión
fragmentarse, tal como se indica en los ejemplos individuales,
provocando una rotación 3.000 g durante 5 minutos y eliminando la
fase oleosa, dejando que la emulsión se concentrara en el fondo del
vial. Se añadieron tampón de extinción (típicamente, 0,2 ml de 25
\mug/ml de ARN de levadura en tampón W + B: 1 M NaCl, 10 mM
Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4) y 2 ml de éter dietílico
saturado con agua, haciendo rotar la mezcla, centrifugándola
brevemente, y eliminando la fase éter. La fase acuosa se lavó con
éter y se secó (5 minutos en un Speedvac a temperatura
ambiente).
La distribución del tamaño de las gotitas acuosas
en las emulsiones se determinó mediante difracción laser utilizando
un Analizador del Tamaño de Partícula Coulter LS230. Una alícuota de
la emulsión, recién diluida (1:10) en aceite mineral, se añadió a la
cámara de micro-volumen que contenía aceite mineral
sometido a agitación. Los resultados se analizaron con el modelo
óptico Mie basado en el instrumento, utilizando índices de
refracción de 1.468 para el aceite mineral y de 1.350 para la fase
acuosa. La distribución del tamaño de las gotitas de agua en la
emulsión, se muestra en la Figura 2. La adición de desoxicolato
sódico no alteró significativamente la distribución del tamaño.
Con objeto de producir ARN a partir de ADN en el
interior de cada microcápsula, la molécula única de ADN que se
encuentra en el interior de cada microcápsula acuosa del sistema,
debe ser transcrita eficientemente. En la presente memoria, la
transcripción in vitro se demuestra en el interior de las
microcápsulas.
El núcleo catalítico del intrón de Tetrahymena de
auto corte y empalme, es un ribozima muy estudiado que puede
catalizar diversas reacciones de transferencia de fosfoésteres (Sag
et al., 1986; Sag y Czech 1986; Sag y Czech, 1986). Por
ejemplo, un intrón modificado de Tetrahymena al que le falta el
bucle troncal P1 del extremo 5' y los bucles troncales P9.1 y P9.2
del extremo 3', puede funcionar como una ARN ligasa, cortando y
empalmando juntos eficientemente dos o más oligonucleótidos
alineados en una cadena matricial (Green y Szostak,
1992).
1992).
El ADN que codifica el ribozima de Tetrahymena
anteriormente descrito, se amplifica mediante PCR utilizando los
iniciadores P2T7Ba (hibridizándose a la región del bucle P2 y
añadiendo un promotor de la T7 ARN polimerasa) y P9Fo
(hibridizándose a la región del bucle P9). Esto da lugar a un
fragmento de ADN de 331 pares de bases que transporta el promotor de
la T7 ARN polimerasa. Este fragmento se purifica directamente
utilizando Wizard PCR Preps (Promega) y se emplea como matriz para
una reacción de transcripción in vitro utilizando la T7 ARN
polimerasa.
La transcripción in vitro se ensaya
durante un período inicial de 10 minutos durante el cual la
velocidad de la reacción es esencialmente lineal (Chamberlin y Ring,
1973). Las condiciones de la reacción para la transcripción son las
descritas por Wyatt et al., 1991.
La incorporación de [\gamma^{-32} P] UTP se
utiliza para ensayar la progresión de la reacción.
Una reacción de transcripción se limita a un
volumen de 200 \mul y se divide en 2 alícuotas, cada una de las
cuales contiene 3 x 10^{11} moléculas de ADN (5 nM). Una alícuota
de 100 \mul se añade a 2 ml de aceite mineral ligero Sigma que
contiene Span 80 al 4,5% y Tween 80 al 0,5%. homogeneizándose
durante 5 minutos con un dispersor Ultra-Turrax T25
a 20.000 r.p.m. como en el Ejemplo 1. Basándose en el volumen medio
de la microcápsula en estas emulsiones (2,8 X 10^{-19} m^{3}
para un diámetro de la microcápsula de 0,81 \mum) los 100 \mul
de la reacción se dividirán en 3,6 x 10^{11} microcápsulas. Por
tanto, deberá haber, por término medio, 1 molécula de ADN por
microcápsula.
Las dos alícuotas se incubaron en un baño acuoso
a 37ºC. Muestras de 0,5 ml de la emulsión se eliminaron antes del
comienzo de la incubación y después de 10 minutos de transcurrida
ésta, colocándolas en hielo. Al mismo tiempo, se eliminaron muestras
similares de 25 \mul de las reacciones de control no
emulsificadas. Las emulsiones se fragmentaron y las reacciones se
detuvieron con 0,5 ml EDTA (50 mM) y 2 ml de éter dietílico saturado
con agua, tal como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron
entonces 100 \mul de ADN espermático de salmón (500 \mug/ml) en
20 mM EDTA. Se quitaron entonces tres alícuotas de 100 \mul de las
dos emulsiones y de los controles, ensayándose el ARN marcado
mediante precipitación de TCA y contaje de centelleo.
La tasa de transcripción se cuantifica como el
aumento en el contaje de centelleo perceptible del ácido cpm durante
los 10 minutos de incubación a 37ºC. En las reacciones del control
no emulsificado se detecta un contaje de centelleo del material
ácido, perceptible, de 442.000 cpm, comparado con los 147.000 cpm en
la emulsión. Por tanto, la tasa de transcripción en la emulsión es
33% de la encontrada en las reacciones del control no
emulsificado.
Este procedimiento por tanto, muestra que el ARN
puede sintetizarse eficientemente mediante la T17 ARN polimerasa en
las microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite.
Con objeto de sintetizar proteínas utilizando el
procedimiento de la presente invención, la traducción debe ser
activa en las microcápsulas acuosas de la emulsión de agua en aceite
que se describen en la presente memoria.
Aquí se muestra cómo una proteína (la
dihidrofolato reductasa de E. coli) puede sintetizarse
eficientemente a partir del ADN en las microcápsulas acuosas de un
sistema de emulsión de agua en aceite, utilizando un sistema
acoplado de transcripción/traducción.
El gen folA de E. coli que codifica
la dihidrofolato reductasa (DHFR) se amplifica mediante la PCR
utilizando los oligonucleótidos EDHFRFo y EDHFRBa. Este ADN es
clonado entonces en el vector pGEM-4Z (Promega) que
se digiere con HindIII y KpnI por debajo del promotor
de la T7 ARN polimerasa y del promotor lac. El
oligonucleótido EDHFRBa se añade al sitio de inicio traduccional
10 del gen del fago eficiente T7 por encima del codon de
inicio de DHFR.
La secuenciación del ADN identificó un clon que
posee la secuencia nucleótida correcta. Se encontró que las
bacterias transformadas con este clon (pGEM-folA)
sobreexpresan la DHFR activa (comandada a partir del promotor lac)
cuando se indujo con IPTG.
El plásmido pGEM-folA se amplificó
entonces mediante PCR utilizando los iniciadores LMB2 y LMB3 bajo
las condiciones descritas anteriormente, para crear un fragmento de
ADN de 649 pares de bases que transporta el promotor de la T7 ARN
polimerasa, el sitio de inicio traduccional 10 del gen del fago T7 y
el gen folA. Este fragmento PCR se purificó directamente,
utilizando Wizard PCR Preps (Promega) y se utilizó para programar un
sistema procariótico acoplado de transcripción/traducción, in
vitro, diseñado para las matrices lineales (Lesley, Brow y
Burgess, 1991).
Se utilizó una preparación comercial de este
sistema (Sistema de extracto de E. coli S30 para Matrices
Lineales; Promega), suplementado con la T7 ARN polimerasa.
300 \mul de una reacción de traducción se
fijaron en hielo, que contenían 3 x 10^{12} moléculas de ADN. Se
añadieron 10^{4} unidades de T7 ARN polimerasa para dirigir la
transcripción y la proteína traducida se marcó añadiendo
[^{35}S]metionina. Una alícuota de 150 \mul de esta
reacción se añadió a 2,85 ml de aceite mineral ligero Sigma que
contenía Span 80 al 4,5% y Tween 80 al 0,5%, homogeneizándose
durante 1 minuto con un dispersor Ultra-Turrax T25 a
20.000 r.p.m., como en el Ejemplo 1. La otra alícuota no se
emulsificó.
Basándose en el volumen medio de la microcápsula
en las emulsiones (1,1 x 10^{-18} m^{3} para una microcápsula de
un diámetro de 1,29 \mum), la reacción de 150 \mul se dividiría
en 1,3 x 10^{11}, microcápsulas). Por tanto, deberá haber
aproximadamente 11 moléculas de ADN por microcápsula.
Cuatro alícuotas de 0,5 ml se quitaron de la
mezcla reactiva de la emulsión. Una alícuota se dispuso
inmediatamente en hielo y las otras tres se incubaron en un baño
acuoso a 25ºC durante 2 horas antes de depositarlas en hielo. Cuatro
muestras de 25 \mul se quitaron también de la mezcla reactiva no
emulsificada; una se dispuso inmediatamente en hielo y las otras
tres se incubaron en un baño acuoso a 25ºC durante 2 horas,
situándolas entonces en hielo.
Las emulsiones se sometieron a rotación en una
microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC,
depositándose entonces el aceite mineral en el fondo del tubo que
contenía a la emulsión concentrada (pero todavía intacta). Después
de llevar a cabo otra vez, brevemente, la rotación, y eliminando
cualquier otro aceite mineral que pudiera quedar, la emulsión se
fragmentó, deteniéndose cualquier otra traducción posterior mediante
la adición de 100 \mul de agua que contenía 125 \mug/ml de
puromicina y 1 ml de éter dietílico saturado con agua. Esta mezcla
se agitó vorticialmente, sometiéndola a rotación en una
microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 1 minuto a 4ºC. El éter y el
aceite mineral disuelto se eliminaron entonces mediante aspiración,
repitiéndose la extracción con 1 ml adicional de éter. Cualquier
éter que quedara se apartó repitiendo la rotación durante 5 minutos
en una Speedvac a temperatura ambiente.
100 \mul de agua que contenían 125 \mug/ml de
puromicina se añadieron también a las reacciones de control no
emulsificadas de 25 \mul. 25 \mul de cada una de las muestras se
precipitaron entonces con acetona y se procesaron en un gel
SDS-PAGE al 20%, según las instrucciones dadas por
los fabricantes del sistema de transcripción/traducción (Promega).
El gel se secó y sometió a rastreo utilizando PhosphorImager
(Molecular Dynamics). Se apreció una banda única e intensa con el
peso molecular esperado de la DHFR (18 kd) tanto en las reacciones
llevadas a cabo en las emulsiones como en los controles. Esta banda
se cuantificó de forma precisa.
En las reacciones emulsificadas, el área media
bajo el pico de 18 kd es de 15,073 unidades, mientras que el área
media bajo el mismo pico en las reacciones de control no
emulsificadas es de 18,990 unidades. Por tanto, en las reacciones
emulsificadas, la cantidad de proteína DHFR se calcula que es el 79%
de la encontrada en las reacciones de control no emulsificadas. Esto
indica por tanto que el sistema de transcripción/traducción es
funcional en el sistema de emulsión de agua-aceite
de la presente invención.
Aquí se muestra que la proteína (dihidrofolato
reductasa) de E. coli puede sintetizarse eficientemente en
una forma catalíticamente activa mediante una
transcripción/traducción acoplada del gen folA en las
microcápsulas acuosas de un sistema de emulsión de agua en aceite.
En este ensayo, se utiliza una emulsión que comprende microcápsulas
que se encuentran por debajo del tamaño óptimo; se muestra que la
actividad de DHFR es superior en los tamaños más grandes de las
microcápsulas.
175 \mul de reacciones de traducción (no
marcadas) se fijaron en hielo, conteniendo 2 x 10^{11}, 6 x
10^{12} ó 1,8 x 10^{12} moléculas del ADN matriz folA
utilizado en el Ejemplo 3, o sin ADN. Se añadió T7 ARN polimerasa (6
x 10^{3} unidades) a cada reacción para gobernar la
transcripción.
Una alícuota de 100 \mul de cada reacción se
añadió a 1,9 ml de aceite mineral ligero Sigma que contenía Span 80
al 4,5% y Tween 80 al 0,5%, homogeneizándose durante 1 minuto ó 5
minutos mediante un Homogenizador UltraTurrax T25 equipado con un
dispositivo dispersor con un diámetro de 8 mm, a 20.000 r.p.m. como
en el Ejemplo 1. Después de homogeneización durante 1 minuto, el
diámetro medio de las partículas (en volumen) es de 1,30 \mum
(media de 1,28 \mum). El 98% en volumen de la fase (acuosa)
interna se encuentra como partículas que varían entre 0,63 \mum y
2,12 \mum. Después de homogeneización durante 5 minutos, el
diámetro medio de las microcápsulas (en volumen) es de 0,81 \mum
(media de 0,79 \mum) y el 98% en volumen de la fase (acuosa)
interna se encuentra en partículas que varían entre 0,41 \mum y
1,38 \mum.
Basándose en el volumen microcapsular medio en
las emulsiones de 1 minuto (1,1 x 10^{-18} m^{3} para una
microcápsula con un diámetro de 1,299 \mum), los 100 \mul
reactivos deberán dividirse en 8,7 x 10^{10} microcápsulas). Por
tanto, deberán existir aproximadamente 1,3, 3,9 ó 11,8 moléculas de
ADN por microcápsula.
Basándose en el volumen microcapsular medio en
las emulsiones de 5 minutos (2,8 x 10^{-19} m^{3} para una
microcápsula con un diámetro de 0,81 \mum), los 100 \mul
reactivos deberán dividirse en 3,6 x 10^{11} microcápsulas). Por
tanto, deberán existir aproximadamente 0,3., 1,0 ó 2,9 moléculas de
ADN por microcápsula.
Las emulsiones, y la mezcla reactiva no
emulsificada, se incuban en un baño acuoso a 25ºC. Muestras de 0,5
ml de la emulsión, se eliminaron inmediatamente antes del inicio de
la incubación y después de 2 horas, y se situaron en hielo. Muestras
de 25 \mul se eliminaron al mismo tiempo de las reacciones de
control no emulsificadas.
Las emulsiones se hicieron rotar en una
microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos, a 4ºC,
eliminándose el aceite mineral mediante aspiración, dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Después de llevar a cabo otra vez, brevemente, la rotación, y
eliminando cualquier otro aceite mineral que pudiera quedar, la
emulsión se fragmentó, deteniéndose cualquier otra traducción
posterior mediante la adición de 100 \mul de tampón A (100 mM
Imidazol, pH 7,0, 10 mM \beta-mercaptoetanol), que
contenía 125 \mug/ml de puromicina y 1 ml de éter dietílico
saturado con agua. Esta mezcla se agitó vorticialmente, sometiéndola
a rotación en una microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 1 minuto a
4ºC. El éter y el aceite mineral disuelto se eliminaron entonces
mediante aspiración, repitiéndose la extracción con otro ml de éter.
Cualquier éter que quedara se apartó repitiendo la rotación durante
5 minutos en una Speedvac a temperatura ambiente. También se
añadieron 100 \mul de un tampón A que contenía (125 \mug/ml) de
puromicina a los 25 \mul de las reacciones de control no
emulsificadas.
La actividad de la dihidrofolato reductasa se
ensayó mediante espectrofotometría, controlando la oxidación de
NADPH a NADP a 340 nm, durante un tiempo de 10 minutos, tal como se
describe por Williams et al., 1979; Ma et al., 1993.
10 \mul de cada reacción de traducción extinguida, in
vitro, se añadieron a 150 \mul de Tampón A (100 mM Imidazol,
pH 7,0, 10 mM de \beta-mercaptoetanol) y 20 \mul
de 1 mM NADPH. Se añadieron 20 \mul de Dihidrofolato (1 mM)
(H_{2}F) después de 1 minuto y la reacción se controló a 340 nm,
utilizando un lector de microplaca ThermoMax (Molecular Devices). La
actividad se calculó por las velocidades iniciales bajo condiciones
So >> K_{M} (U_{max}). La actividad anterior en el
extracto S30 se substrajo de todas las muestras.
La actividad de DHFR generada en las emulsiones
se obtiene a partir de la diferencia entre la actividad medida a las
0 y a las 2 horas de incubación. No tuvo lugar un aumento en la
oxidación del NADPH entre las muestras a las 0 y las 2 horas, cuando
se añadió 0,1 \mum de metotrexato (un inhibidor específico de
DHFR), mostrando que la totalidad del aumento en la oxidación de
NADPH que se observó, se debe a la DHFR producida en las reacciones
de traducción in vitro.
Realizando una homogeneización de 1 minuto a
20.000 r.p.m., la actividad de DHFR que se generó en las emulsiones,
es el 31% de la encontrada en las reacciones de control no
emulsificadas, con 1,3 moléculas de ADN por microcápsula; el 45% con
3,9 moléculas de ADN por microcápsula; y el 84% con 11,8 moléculas
de ADN por microcápsula.
Realizando una homogeneización de 5 minutos a
20.000 r.p.m., la actividad de DHFR que se generó en las emulsiones,
es el 7% de la encontrada en las reacciones de control no
emulsificadas, con 0,3 moléculas de ADN por microcápsula; el 15% con
1 molécula de ADN por microcápsula; y el 35% con 2,9 moléculas de
ADN por microcápsula, como promedio.
Asumiendo que el recambio de la DHFR es tal como
se describe por Posner et al., 1996, este corresponde, con la
mayor concentración de ADN, a un rendimiento de 6,3 \mug (340
pmoles) de DHFR por 100 \mul reactivos (control no emulsificado),
de 1,98 \mug (104 pmoles) de DHFR por 100 \mul reactivos
(emulsificado durante 1 minuto), o de 0,46 \mug (24,8 pmoles) por
100 \mul reactivos (emulsificado durante 5 minutos). Esto se
equipara con 74 moléculas de DHFR por microcápsula en las emulsiones
de 1 minuto y con 44 moléculas por microcápsula en las emulsiones de
5 minutos (asumiendo que todas las microcápsulas sean del tamaño
medio).
La actividad de la DHFR que resulta de las
transcripciones/traducciones acopladas de los genes folA, se
mide también en las cápsulas más voluminosas producidas mediante
solo agitación, o mediante agitación seguida por la ulterior
homogeneización con un dispersor Ultra-Turrax T25 a
8.000 r.p.m., 9.000 r.p.m., o 13.500 r.p.m., durante 1 minuto, tal
como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la
Figura 2b. La concentración de los genes folA utilizados (2,5
nM), proporciona un promedio de 1, 1,5 y 4,8 elementos genéticos por
gotita en las emulsiones homogeneizadas a 13.500, 9500 y 8.000
r.p.m., respectivamente, y un promedio de 14 elementos genéticos por
gotita en las emulsiones preparadas sólo mediante agitación. La
adición de desoxicolato sódico (0,5%) a la mezcla reactiva de la
traducción in vitro no afecta significativamente a la
actividad DHFR observada en las emulsiones fragmentadas.
Con objeto de unir múltiples moléculas de
sustrato inmovilizadas a un fragmento de ADN que comprende el gen
folA, el fragmento de ADN se somete en primer lugar a
biotinilación, uniéndose entonces a un complejo de avidina con
apoferritina. La apoferritina del bazo del caballo constituye una
molécula proteica casi esférica, voluminosa, de 12,5 nm de diámetro,
que proporciona por tanto, múltiples sitios que pueden ser
derivatizados con sustrato (por ejemplo, el grupo
\varepsilon-amino de las lisinas superficiales).
El plásmido pGEM-folA que codifica la DHFR de E. coli
se amplificó mediante PCR utilizando los iniciadores LMB3 y LMB2
biotinilado en el extremo 5' (LMB2-Biotina), para
crear un fragmento biotinilado de ADN de 649 pares de bases que
transporta el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de
iniciación traduccional 10 del gen del fago T7 y el gen folA
(véase Ejemplo 3). El ADN se marcó radioactivamente suplementando la
mezcla reactiva PCR de 500 \mul con 100 \muCi
[\alpha-^{32}P]dCTP (Amersham; 3000
Ci/mmoles). El fragmento PCR biotinilado se purificó directamente
utilizando Wizard PCR Preps (Promega), determinándose
espectrofotométricamente la concentración. El porcentaje de ADN
biotinilado se ensayó mediante unión a las Streptavidin
M-280 Dynabeads (Dynal) y el contaje de centelleo.
Se determinó que el 83% del ADN estaba biotinilado, utilizando esta
técnica.
El hierro secuestrado se eliminó de un conjugado
comercial de avidina y ferritina (Avidina-Ferritina;
1,1 mol de ferritina por mol de avidina, aproximadamente; Sigma)
mediante diálisis nocturna (4ºC) de una solución de
avidina-ferritina en PBS (1 mg/ml) contra 0,12 M de
ácido tioglicólico, pH 4,25, seguido por 24 horas de diálisis contra
PBS (4ºC), tal como se describe por Kadir y Moore, 1990. La
eliminación del hierro se comprueba mediante análisis del espectro
de absorbencia (el Fe (III) secuestrado absorbe intensamente a 310
-360 nm).
0,3 pmoles de ADN biotinilado y marcado
radioactivamente, se incubaron en PBS con distintas proporciones
molares de avidina-apoferritina (volumen total de 9
\mul) durante 30 minutos a temperatura ambiente. se eliminó una
alícuota de 4,5 \mul, y el porcentaje de ADN formando complejo con
la avidina-apoferritina se ensayó utilizando una
prueba de cambio en un gel de agarosa al 1,5%, tal como se describe
por Berman et al., 1987. El gel se secó entonces y se rastreó
utilizando un PhosphorImager (Molecular Dynamics). El porcentaje de
ADN que no había cambiado (es decir, que no se acomplejaba con la
avidina-apoferritina) era del 17% (proporción molar
avidina-apoferritina:ADN de 1:1, del 15% (proporción
molar avidina-apoferritina:ADN del 5:1) o del 14%
(proporción molar avidina-apoferritina:ADN 25:1).
Esto significa que incluso con una proporción 1:1
avidina-apoferrina:ADN, todo el ADN biotinilado está
básicamente unido. No se observó cambio en la bandas cuando el ADN
biotinilado se mezcló con la apoferrina o cuando el ADN no
biotinilado se mezcló con la
avidina-apoferritina.
El resto de 4,5 \mul del ADN formando complejo
con la avidina-apoferrina, se utiliza como matriz
para una reacción de transcripción/traducción in vitro de 25
\mul (Sistema de Extracto S30 de E. coli para las Matrices
Lineales; Promega). Después de 2 horas a 25ºC, la reacción se detuvo
añadiendo 100 \mul de tampón A que contenía puromicina (125
\mug/ml). La actividad de la dihidrofolato reductasa se ensayó
como anteriormente, mediante espectrofotometría, controlando la
oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante un tiempo de 10
minutos.
10 \mul de cada una de las reacciones de
traducción in vitro se añadieron a 150 \mul del tampón A y
a 20 \mul de NADPH (1mM). 20 \mul de dihidrofolato (ImM) (las
emulsiones se fragmentaron y las reacciones se detuvieron con 0,5 ml
de EDTA (50 mM) y 2 ml de éter dietílico saturado con agua, tal como
se describió en el Ejemplo 1) se añadieron después de un minuto,
controlándose la reacción a 340 nm utilizando un lector de
microplaca ThermoMax (Molecular Devices). No se encontró diferencia
en la actividad de la DHFR a incluso la proporción más alta de
avidina-apoferritina:ADN, comparada con un control
en el que no se había añadido la
avidina-apoferritina. Esto indica que la mayor parte
del ADN puede formar complejo sin comprometer la eficiencia de la
traducción in vitro.
Con objeto de seleccionar la actividad de la DHFR
producida in situ mediante la
transcripción-traducción acopladas, tanto la
reacción de transcripción-traducción como la DHFR
deben ser activos en el mismo sistema tampón.
Un ensayo directo respecto a la actividad de DHFR
en un sistema completo de traducción in vitro de E.
coli basado en el control espectrométrico de la oxidación de
NADPH a NADP a 340 nm, no es práctico, debido a la turbidez de los
extractos S30.
Sin embargo, es posible comprobar que la DHFR es
activa en el mismo sistema tampón que en la traducción in
vitro. La DHFR de E. coli se obtiene mediante inducción
por IPTG de las bacterias que contienen el plásmido pGEM-folA
y que es purificado por afinidad en una columna de
Sepharose-metotrexato (Baccanari et
al.,1977).
La actividad de la DHFR se compara en el tampón A
como anteriormente o en una mezcla de traducción in vitro,
completa, excepto por la sustitución del tampón de diálisis S30
(Lesley, 1995) (10 mM Tris-acetato pH 8,0, 14 mM
acetato de magnesio, 60 mM acetato potásico, ImM DTT) por la
fracción S30. En cada caso el volumen de reacción total es 200
\mul y la concentración de NADPH y la fragmentación de las
emulsiones, la detención de las reacciones con 0,5 ml de EDTA (50
mM) y 2 ml de éter dietílico saturado con agua, es como se describe
en el Ejemplo 1 cada 0,1 mM. Las reacciones se controlaron
espectrofotométricamente a 340 nm. La adición de 1,75 pmoles (1,3 m
Unidades) de DHFR de E. coli da lugar a proporciones
iniciales de -25,77 mOD/min (en el tampón A) y de -11,24 mOD/min (en
el tampón de traducción) por lo que la reacción es un 44% tan
eficiente en el tampón de traducción como en un tampón optimizado
(tampón A).
Además, la presencia de los sustratos de DHFR
(NADPH y H_{2}F) con una concentración de 0,1 mM (solos o
combinados) no provoca ninguna inhibición de la producción de DHFR
activa a partir de una reacción acoplada de
transcripción-traducción durante 2 horas.
Se sintetiza un péptido que comprende tres ácidos
glutámicos que se unen mediante sus
\gamma-carboxilatos (utilizando el éster
\alpha-bencílico del ácido
N-fluorenilmetoxicarbonil-glutámico
como material de partida) con una lisina en el extremo carboxilo y
unidos por la biotina a su grupo
\varepsilon-amino, modificando procedimientos
publicados (Krumdiek et al., 1980). El ácido fólico se une al
extremo amino y se eliminan los grupos protectores bencilo y
trifluoroacetamídicos mediante hidrólisis alcalina como se ha
descrito previamente. El péptido se purifica mediante HPLC de fase
inversa y se caracteriza mediante espectroscopía de masas y UV. Este
péptido de ácido fólico se reduce químicamente al correspondiente
péptido de ácido dihidrofólico (utilizando ditionato y ácido
ascórbico) y entonces, al correspondiente péptido de ácido
tetrahidrofólico (utilizando borohidruro sódico) aplicando
procedimientos publicados (Zakrzewski et al., 1980). Estas
transformaciones se caracterizan mediante espectroscopía UV.
Se construye un elemento genético uniendo, por
término medio, de dos a tres moléculas del péptido ácido fólico a la
avidina (o estreptavidina), conjuntamente con una molécula del ADN
amplificado mediante PCR del plásmido pGEM-folA, que codifica
la DHFR utilizando los iniciadores LMB2-Biotina
(SEC. ID. nº 9) y LMB3 (véase el Ejemplo 3). El ácido fólico
inmovilizado se reduce químicamente a dihidrofolato utilizando
ditionato y ácido ascórbico y purificándose mediante diálisis contra
el tampón A. La DHFR de E. coli se obtiene mediante inducción
IPTG de bacterias que contienen el plásmido pGEM-folA,
purificándose por afinidad en una columna de
Sepharose-metotrexato. Se muestra que la DHFR de
E. coli reacciona con el ácido dihidrofólico inmovilizado en
este elemento genético controlando la oxidación de NADPH a NADP
espectrofotométricamente utilizando entre 0 y10 \mum del péptido
de ácido dihidrofólico unido a la avidina y entre 0 y50 \mum de
NADPH. Por tanto, al final de esta reacción, el producto
tetrahidrofolato se une al gen folA que codifica la enzima
(es decir, DHFR) que cataliza su formación.
Para el aislamiento de aquéllos genes unidos al
producto tetrahidrofolato existen dos métodos de abordaje. El
primero implica la generación de anticuerpos presentados por fagos,
que son específicos para el tetrahidrofolato (Hoogenboom, 1997). La
segunda aproximación se basa en la utilización de un reactivo
dirigido que reacciona específicamente con el producto inmovilizado,
pero no con el sustrato. Se sintetizó una molécula formada por un
marcador dinitrofenilo (DNP) unida a benzaldehído por un espacio de
14 átomos. El grupo aldehído reacciona específicamente con el
tetrahidrofolato para formar un aducto covalente (Kallen y Jencks,
1966), pudiéndose llevar a cabo la purificación por afinidad
utilizando un anticuerpo anti-DNP.
La reacción catalizada por DHFR puede
seleccionarse mediante un acoplamiento in situ a una segunda
reacción, catalizada por la aldehído deshidrogenasa de la levadura,
con un sustrato "diana".
En vez de seleccionar los genes conectados a uno
de los productos de la reacción
DHFR(5,6,7,8-tetrahidrofolato o NADP+), la
reacción DHFR se acopla a una segunda reacción. La selección es
mediada en este caso por la formación del segundo producto de la
reacción catalizada por DHFR, la nicotinamida adenín dinucleótido
fosfato (NADP+).
La reacción que hemos escogido para el
acoplamiento es catalizada por la aldehído deshidrogenasa de la
levadura (YAD; EC 1.2.1.5). Esta enzima utiliza NAD+ ó NADP+ en la
oxidación de una amplia gama de aldehídos alifáticos o aromáticos a
sus ácidos carboxílicos correspondientes, generando NADH o NADHP en
el proceso. La reacción tiene la gran ventaja de ser esencialmente
irreversible -particularmente, las deshidrogenasas (incluyendo DHFR
y YAD) no catalizan la reducción del ácido al aldehído. Ya que un
gran número de enzimas que catalizan reacciones redox general NAD+ ó
NADP+, la reacción YAD puede también utilizarse en la selección de
estas enzimas, y no se limita solamente a la selección de la
Dihidrofolato reductasa.
Un sustrato pentaldehído se sintetiza y une a un
marcador DNP (dinitrofenilo), utilizando un engarce C_{20} (en lo
sucesivo, DNP-PA). La oxidación de
DNP-PA al ácido correspondiente
(DNP-PC) es seguida mediante una HPLC inversa
(columna C_{18} de fase inversa; gradiente de H_{2}O/CH_{3}CN
+ ácido trifluoroacético al 0,1%; tiempos de retención:
DNP-PA, 5,0 minutos; DNP-PC, 4,26
minutos). La conversión de DNP-PA a
DNP-PC se observa sólo en presencia de tanto YAD
como NADP+. Las reacciones también se siguen
espectrofotométricamente; el aumento de absorbencia a 340 nm indicó
que el NADP+ se convierte simultáneamente a NADPH.
La reacción acoplada DHFR-YAD se
sigue utilizando el mismo ensayo HPLC. La mezcla reactiva inicial
contenía los sustratos para DHFR-NADPH (50 \mum) y
7-8-dihidrofolato (H_{2}F; 50
\mum), YAD (Sigma, 0,5 unidades) y DNP-PA (50
\mum) en tampón pH 7,7 (100 mM imidazol, 5 mM
\beta-mercaptoetanol y 25 mM KCl). La conversión
de DNP-PA a DNP-PC se observa cuando
se añade DHFR a la mezcla reactiva anterior (DHFR 5 nM, 83%, 1,25
nM, 14,5% después de 32 minutos).
La concentración de DHFR obtenida en la
traducción in vitro compartimentalizada es, de hecho, mucho
más alta que 5 nM (véase el Ejemplo 4). La conversión de
DNP-PA a DNP-PC es despreciable en
ausencia de DHFR, o cuando el metotrexato (MTX) -un potente
inhibidor de la enzima- está presente (10 \mum). Por tanto, la
formación del producto secundario, DNP-PC, está por
tanto unida a la presencia de DHFR.
Utilizando esta reacción acoplada, las proteínas
que confieren actividad DHFR pueden seleccionarse por: i) uniendo
los genes a anticuerpos que específicamente se unen al producto
carboxílico de DNP-PA, y ii), aislando estos genes
mediante purificación por afinidad, utilizando un anticuerpo
anti-DNP.
Este planteamiento se demuestra mediante un
inmunoensayo rutinario basado en el catELISA (Tawfik et al.,
1993). Placas de microtitulación se revistieron con inmunoglobulinas
anti-conejo (Sigma, 10 \mug/pocillo), seguido por
suero policlonal de conejo que une específicamente a los derivados
del ácido glutárico (Tawfik et al., 1993), diluído 1:500 en
tampón de solución salina fosfato + 1 mg/ml BSA). Las placas se
enjuagaron y se bloquearon con BSA. Las mezclas de la reacción
acoplada descritas anteriormente se diluyeron en tampón Tris/BSA (50
mM Tris, 150 mM cloruro sódico, 10 mg/ml BSA, pH 7,4) y se incubaron
durante 1 hora. La placa se enjuagó y un anticuerpo
anti-DNP (SPE21.11 monoclonal de ratón) que se
diluyó en el mismo tampón (1:10.000) se añadió e incubó durante una
hora. La placa se enjuagó y se añadió un anticuerpo anti ratón
(Jackson) marcado con peroxidasa, seguido por un sustrato
peroxidásico (BM Blue; Boehringer Mannheim). Se observó sólo una
señal específica en las muestras de las reacciones acopladas que
contenían DHFR (además de H_{2}F, NADPH, YAD y
DNP-PA).
Para la selección en dos formatos, se utilizaron
anticuerpos anti-ácido carboxílico altamente específicos (Tawfik
et al., 1993).
En el primero, el anticuerpo anti-ácido
carboxílico se acopló químicamente a una avidina de alto peso
molecular (o estreptavidina) que contenía el complejo de la forma
descrita en el Ejemplo 5. El ADN biotinilado que codifica DHFR se
une a este complejo mediante la interacción
avidina-biotina, tal como se describe en el Ejemplo
5. Este complejo se utilizó entonces en un sistema de
transcripción/traducción acoplado compartimentalizado, que también
contiene YAD y un sustrato YAD diana tal como
DNP-PA. Si existe actividad DHFR en el
compartimento, el DNP-PA se convierte a
DNP-PC. Los anticuerpos anti-ácido carboxílico,
acoplados al ADN mediante el complejo de alto peso molecular,
capturarán sólo las moléculas DNP-PC y no las
moléculas de aldehído. El ADN de estos compartimentos que contiene
DHFR activo (y por tanto que codifica DHFR activo si existe sólo una
molécula de ADN por compartimento), se purifican entonces por
afinidad utilizando anticuerpos anti-DNP.
En el segundo formato, múltiples moléculas de
estreptavidina se conjugan conjuntamente en un complejo de peso
molecular alto que puede fácilmente acoplarse al ADN biotinilado que
codifica DHFR (véase el Ejemplo 5). Este complejo se utiliza en un
sistema de transcripción/traducción acoplado compartimentalizado que
contiene también YAD y un sustrato YAD tal como
MeNPOC-biotin-benzaldehído. El grupo
biotina en MeNPOC-biotin-benzaldhído
se "enjaula" (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang,
1996), es decir, no puede unirse mediante la avidina o la
estreptavidina hasta que un grupo nitrobencilo fotoeliminable se
haya separado mediante irradiación con luz. Si existe actividad DHFR
en el compartimento, el
MeNPOC-biotin-benzaldehído se
convierte a MeNPOC-biotin-ácido benzoico. Después de
que la reacción compartimentalizada haya tenido lugar durante un
tiempo, la reacción es irradiada con luz, eliminándose el grupo
nitrobencilo y uniéndose el compuesto al complejo
estreptavidina-ADN. El ADN en estos compartimentos
que contienen DHFR (y por tanto que codifica DHFR activo si sólo
existe una molécula de ADN por compartimento), forma complejo con la
biotina-ácido benzoico (en vez de la
biotina-benzaldehído) y puede ser purificado por
afinidad utilizando anticuerpos anti-ácido benzoico
inmovilizados.
La presencia de otras enzimas que pueden
catalizar la oxidación NAD+ o NADP+ a NADH o NADPH en el sistema de
transcripción/traducción in vitro, puede, bajo ciertas
circunstancias, dificultar la utilización de este sistema YAD para
realizar la selección directamente en el sistema de
transcripción/traducción in vitro compartimentalizado. En
este caso, la selección se lleva a cabo utilizando el sistema de
compartimentalización de dos etapas que se describió anteriormente.
Es decir, DHFR se traslada primero a compartimentos y entonces se
une al ADN en el mismo compartimento mediante un marcador de
afinidad apropiado. La emulsión se fragmenta, el contenido de los
compartimentos se une y el ADN se purifica por afinidad fuera de
otros componentes del sistema de transcripción/traducción (que
incluye óxido reductasas contaminantes), utilizando anticuerpos
específicos para una digoxigenina "marcador" que se une a un
extremo de la molécula del ADN. Las moléculas del ADN purificado,
conjuntamente con la proteína DHFR unida, se disponen entonces en
una mezcla reactiva que contiene los sustratos para
DHFR-NADPH (50 \mum) y
7-8-dihidrofolato (H_{2}F; 50
\mum), YAD (Sigma, 0,5 unidades) y DNP-PA (50
\mum) en tampón de pH 7,7 (100 mM imidazol, 5 mM
\beta-mercaptoetanol y 25 mM KCl), volviéndose a
compartimentalizar la reacción mediante emulsificación para dar
lugar sólo a una, y como mucho, a algunas, moléculas de ADN por
compartimento. Loa anticuerpos anti-ácido carboxílico (Tawfik et
al., 1993), se utilizan para la selección en cualquiera de los
dos formatos descritos anteriormente.
Las ADN metiltransferasas, producidas mediante
transcripción/traducción in vitro en los compartimentos
acuosos de una emulsión de agua en aceite, metilan las moléculas de
ADN que las codifican en los compartimentos.
La selección de proteínas con actividades de
unión o catalíticas que utilizan el sistema de compartimentalización
descrito en la presente memoria, presenta dos requerimientos
básicos: i) una molécula única de ADN (o como mucho, algunas) que
codifica las proteínas que van a seleccionarse, se expresa en una
forma biológicamente activa mediante un sistema de
transcripción/traducción acoplado en los compartimentos acuosos de
una emulsión de agua en aceite; y ii) la proteína que va a
seleccionarse debe ser capaz de modificar el elemento genético que
la codificó, de tal forma que lo convierta en seleccionable en una
etapa subsiguiente. En este Ejemplo, se describen un grupo de
proteínas -ADN metiltransferasas (tipo II)-, que son producidas
eficientemente en los compartimentos acuosos de un sistema de
emulsión acuosa en aceite, utilizando un sistema de
transcripción/traducción acoplado. Además, las ADN metiltransferasas
traducidas in vitro modifican eficientemente las moléculas de
ADN que las codifican in situ en los compartimentos acuosos,
de forma que pueden seleccionarse y amplificarse. Los sitios diana
en las moléculas de ADN son modificados mediante metilación de una
citosina en posición C5 que vuelve resistentes a los sitios a la
fragmentación mediante la endonucleasa de restricción afín (es
decir, HhaI para M.HhaI, y HaeIII para
M.HaeIII). Por tanto, el ADN metilado es seleccionable
respecto al ADN no metilado en virtud de su resistencia a la
fragmentación mediante la endonucleasa de restricción.
El gen que codifica M.HhaI es amplificado
mediante PCR utilizando los oligonucleótidos
HhaI-Fo2S y HhaI-Bv directamente a
partir de Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 10014). El gen
que codifica M.HaeIII es amplificado mediante PCR utilizando
los oligonucleótidos HaeIII-Fo2s y
HaeIII-Bc (SEC. ID. nº 4) directamente a partir de
Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC
11116). Ambos grupos PCR se clonan en el vector
pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y
KpnI, por debajo del promotor lac y del promotor de la
T7 ARN polimerasa. Los oligonucleótidos HhaI-Bc y
HaeIII-Bc (SEC. ID. nº 4) añaden el sitio eficiente
de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7 por encima
del codon de iniciación del gen de la metiltransferasa. El
oligonucleótido HhaI-Fo añade un sitio HhaI
de metilación/restricción (M/R) y un sitio HaeIII
(/NotI) para funcionar como sustratos para M.HhaI y
M.HaeIII respectivamente. El oligonucleótido
HaeIII-Fo añade un sitio M/R
NotI/HaeIII que funciona como un sustrato para
M.HaeIII (el gen M.HaeIII contiene ya dos sitios M/R
internos HhaI. La secuenciación del ADN identifica clones con
la secuencia nucleótida correcta.
Los plásmidos pGEM-M.HhaI
y pGEM-M.HaeIII descritos anteriormente son
amplificados mediante PCR utilizando los iniciadores
LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y
LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) como anteriormente, para
crear, bien
DIG-M.HhaI-Biotina de 1167
pares de bases o un fragmento
DIG-M.HaeIII-Biotina ADN de
1171 pares de bases, marcados en un extremo por la biotina y el otro
extremo por la digoxigenina, y los cuales transportan el promotor de
la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10
del gen del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios M/R
de HaeIII y HhaI. Cada fragmento PCR se purificó
directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).
Los genes requeridos para la transcripción
-traducción in vitro acoplada de M.EcoRI y
M.EcoRV son amplificados mediante PCR utilizando los
plásmidos pMB1 (Betlach et al., 1976) y pLB1 (Bougueleret
et al., 1984) respectivamente, como matrices, un iniciador
posterior que añade el sitio de iniciación traduccional 10
del gen del fago T7 y LMB3 por encima del sitio de unión ribosómico
del gen de la metiltransferasa (EcoRI-Bc ó
EcoRV-Bc), y un iniciador posterior
(EcoRI-Fo ó EcoRV-Fo) que añade
LMB2. Estos fragmentos se amplificaron posteriormente mediante PCR
utilizando los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº
9) y LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) tal como se
describieron anteriormente para crear los fragmentos
DIG-M.Eco RI-Biotina y
DIG-M.EcoRV-Biotin ADN, que
transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de
iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, el gen de la
metiltransferasa y los sitios M/R de EcoRI y
EcoRV.Cada fragmento PCR se purificó directamente utilizando
Wizard PCR Preps (Promega).
Los genes de ADN-metilasas
amplificados mediante PCR anteriormente descritos se expresan en un
sistema de transcripción/traducción procariótico acoplado in
vitro diseñado para matrices lineales (Lesley et al.,
1991). Se utiliza una preparación comercial de este sistema
(Sistema de extracto S30 de E. coli para Matrices Lineales;
Promega), suplementado con T7 ARN polimerasa y
S-adenosil metionina (SAM) a una concentración de 80
\mum.
La metilación se ensayó midiendo la resistencia
de los fragmentos de ADN marcados con DIG y biotina a la
fragmentación mediante la enzima de restricción similar, utilizando
DIG-Biotin ELISA de
Boehringer-Mannheim o con fragmentos de ADN marcados
radioactivamente y perlas magnéticas revestidas con streptavidina.
Las mezclas reactivas in vitro que contenían fragmentos
marcados con DIG-Biotin reaccionaron in situ
mediante la transcripción-traducción in vitro
acoplada, y tal como se describe seguidamente, se diluyeron en
tampón 1 x W&B (1 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) +
Tween-20 al 0,1% (la concentración del ADN marcado
con DIG-Biotina en el ensayo es del orden de 0 a 250
pM), incubándose en placas de microtitulación revestidas con
streptavidina (alta capacidad) durante 30 a 60 minutos. La placa se
enjuagó (3 veces 2 x W&B) y finalmente con 50 mM Tris pH 7,4 + 5
mM MgCl_{2}), añadiéndose las enzimas de restricción (NEB) (10 a
50 unidades enzimáticas en 0,2 ml del tampón correspondiente),
incubándose a 37ºC durante 3 a 12 horas. La placa se enjuagó y se
añadieron anticuerpos anti-DIG unidos a la
peroxidasa (diluídos 1:1500 en PBS + Tween-20 al
0,1% + 2 mg/ml de BSA) durante 40 a 60 minutos, seguido por el
sustrato de peroxidasa (Azul BM; 70 \mul/pocillo). La absorbencia
(a 450 menos 650 nm) se mide después de extinguir con 0,5 M
H_{2}SO_{4} (130 \mul/pocillo).
Para el ensayo radioactivo, los plásmidos y los
fragmentos PCR descritos anteriormente, se amplificaron mediante PCR
utilizando los iniciadores LMB2-Biotin (SEC. ID. nº
9) y LMB3 y \alpha-P^{32}-CTP
para dar lugar a fragmentos de ADN marcado con P^{32} marcados en
un extremo por la biotina y que transportan el promotor de la T7 ARN
polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen
del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios pertinentes
M/R. Estos fragmentos PCR se purificaron directamente utilizando
Wizard PCR Preps (Promega). Las mezclas reactivas que contenían el
ADN marcado con P^{32} -Biotina reaccionaron in situ
mediante transcripción-traducción acoplada in
vitro, se diluyeron en tampón 1 x W&B +
Tween-20 al 0,1%, y se incubaron con perlas
magnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal,
M-280; 1 a 5 x 10^{6} perlas) durante 30a a60
minutos. Las perlas se separaron y enjuagaron (3 veces 2 x W&B +
Tween-20 al 0,1% + BSA al 3% y finalmente con 50 mM
de Tris pH 7,4 + 5 mM MgCl_{2}). Se añadieron las enzimas de
restricción (NEB) (10 a 50 unidades enzimáticas en 50 a 150 \mul
del tampón correspondiente), incubándose a 37ºC durante 5 a 20
horas. Se eliminó el sobrenadante y las perlas se enjuagaron y se
volvieron a suspender en 100 \mul de agua. La cantidad de ADN
marcado radioactivamente en las perlas, y en los sobrenadantes se
determina mediante centelleo.
La totalidad de las cuatro metilasas descritas en
la presente memoria -M.HaeIII, M.HhaI, M.EcoRI
y M.EcoRV- se expresan y activan en la
transcripción/traducción acoplada in vitro. Además, la
metilasa traducida in vitro puede metilar su propio gen,
haciéndolo de esta forma resistente a la fragmentación por la
metilasa similar (auto-metilación). Ambos procesos,
la transcripción-traducción acoplada in vitro
del gen de la metilasa, así como su metilación, se llevaron a cabo
eficientemente en la misma mezcla reactiva. Más específicamente,
fragmentos de ADN (con concentraciones de 0,5 a 10 nM) que
transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de
iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, un gen de la
metiltransferasa y los sitios M/R de las cuatro metilasas, se
volvieron resistentes a la fragmentación por la endonucleasa de
restricción similar. Por ejemplo, el fragmento de ADN que codifica
la M.EcoRI metiltransferasa se vuelve resistente a la
fragmentación por EcoRI (75 a 100% después de 20 a 90 minutos
a 25ºC) cuando se incubó con el Sistema del Extracto S30 de E.
coli para las Matrices Lineales (Promega), SAM (80 \mum) y T7
ARN polimerasa. La resistencia a la fragmentación como resultado de
la metilación es selectiva y específica: bajo las mismas
condiciones, la resistencia a la fragmentación por HhaI ó
M.EcoRV no se observa; además, la resistencia a la
fragmentación por EcoRI no se observa cuando la traducción es
inhibida (por ejemplo, en presencia de puromicina o en ausencia de
la T7 ARN polimerasa). Resultados similares se obtuvieron cuando
mediante DIG-Biotin ELISA se ensayó la supervivencia
de los genes, o con fragmentos de ADN-P^{32}
-Biotina, tal como se ha descrito anteriormente. La metilación in
trans, es decir, de fragmentos de ADN (distintos a los que
codifican la metilasa similar) que se añaden a los sitios M/R, se
observa también en el sistema de
transcripción-traducción acoplado in vitro
S30 de E. coli en presencia de un gen que codifica una
metilasa.
Ambos procesos, la
transcripción-traducción acoplada in vitro de
los genes de la metilasa, así como su
auto-metilación, tuvieron lugar eficientemente en
los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite. Más
específicamente, los fragmentos de ADN (a concentraciones de 0,1 a
10 nM), que transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el
sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, el
gen de la metiltransferasa (por ejemplo, M.HhaI) y los sitios
M/R de HaeIII, HhaI y EcoRI se añaden al
Sistema del Extracto S30 de E. coli para las Matrices
Lineales (Promega), en presencia de SAM (80 \mum) y T7 ARN
polimerasa. Las mezclas reactivas enfriadas con hielo se
emulsificaron homogeneizando durante 1 minuto con un dispersor
Ultra-Turrax T25 a 20000 r.p.m., tal como se
describe en el Ejemplo 1, incubándose a 25º a 30ºC durante 0 a 180
minutos. La reacción se detiene y la fase acuosa se separa (véase,
Ejemplo 1) y la metilación de los fragmentos de ADN marcados con
P^{32} -Biotina o DIG-Biotina se ensaya tal como
se describió anteriormente. La metilación de hasta el 20% de los
genes compartimentalizados para llevar a cabo la fragmentación
mediante HhaI, se observa después de 60 a 180 minutos de
incubación. No se observa resistencia cuando la emulsión enfriada en
hielo se fragmenta justamente después de haberla confeccionado, y la
reacción se extingue mediante extracción con éter ("0
minutos"). La metilación es selectiva; bajo las mismas
condiciones, la resistencia a la fragmentación por HaeIII o
EcoRI no se observa. Además, el ensayo de los fragmentos del
ADN marcado con P^{32}, ha mostrado que la
auto-metilación de tanto M.HaeIII como
M.HhaI continuó a concentraciones de genes que corresponden a
un promedio de menos de un gen por compartimento (0,1 a 0,5 nM;
véase el Ejemplo 4). Así, la
transcripción-traducción acoplada in vitro de
los genes de las metilasas, así como de su
auto-metilación, continuó eficientemente incluso
cuando sólo un único elemento genético se encuentra en los
compartimentos acuosos de la emulsión de agua en aceite.
La actividad metilasa de HaeIII procedente
de la transcripción-traducción acoplada de los genes
M.HAeIII también se mide en las microcápsulas más voluminosas
producidas agitando solo, y mediante agitación seguida por ulterior
homogeneización con un dispersor Ultra-Turrax T25 a
8.000 r.p.m., 9.000 r.p.m., ó 13.500 r.p.m., durante 1 minuto, tal
como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la
Figura 2b. La concentración de los genes M.HaeIII utilizada
(2,5 nM) da lugar a un promedio de 1, 1,5 y 4,8 elementos genéticos
por gotita en las emulsiones homogeneizadas a 13.500 r.p.m., 9.500 y
8.000 r.p.m., respectivamente, y un promedio de 14 elementos
genéticos por gotita en la emulsión preparada mediante sólo
agitación. La adición de un surfactante aniónico-por
ejemplo, desoxicolato sódico, típicamente al 0,5% (peso/vol), a la
mezcla de traducción in vitro, aumenta significativamente el
porcentaje de elementos genéticos metilados en las emulsiones.
La metilación de genes que codifican las ADN
metilasas les permite ser aislados y amplificados en una etapa
subsiguiente. El ADN metilado es seleccionable respecto al ADN no
metilado en virtud de su resistencia a la fragmentación mediante las
endonucleasas de restricción. Así, los elementos genéticos que
permanecen intactos después del tratamiento con la enzima similar de
restricción, pueden ser amplificados mediante PCR. Sin embargo,
dicha selección no puede alcanzarse obviamente si otros genes que
contienen el mismo sitio R/M pero no codifican la metilasa, se
encuentran en la misma mezcla reactiva. Esto es así debido a que la
metilación cruzada de los genes no metilasa (que se encuentran en un
exceso abundante) les hará resistentes a la fragmentación por la
enzima similar de restricción y, por tanto, amplificables mediante
PCR. Bajo estas condiciones, la selección de genes que codifican la
metilasa se hará posible sólo si ellos están compartimentalizados -
particularmente, si sólo uno, o algunos genes se encuentran en un
único compartimento de forma que la auto metilación sea el proceso
más importante en ese compartimento. La metilación cruzada se evita
desde que los genes no metilasa que se encuentran en compartimentos
que no contienen un gen metilasa, permanezcan no metilados.
Los genes utilizados en el experimento son un
fragmento M. HaeIII de 1194 pares de bases
(DIG-M.HaeIII-3s-Biotina)
que codifica la HaeIII metilasa y un fragmento folA de
681 pares de bases
(DIG-folA-3s-Biotina) que
codifica la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) que contiene
sitios de restricción/modificación adicionales HaeIII y
HhaI (véase la Fig 1b). Ambos fragmentos de ADN están
marcados en un extremo con digoxigenina (DIG) y en el otro con
biotina, y contienen un promotor de la T7 ARN polimerasa (Promotor
T7) y un sitio de iniciación traduccional 10 del gen T7 (rbs)
para la expresión in vitro.
pGEM-4Z-3s se
crea hibridizando los oligonucleótidos HaeHha-Pl y
HaeHha-Mi (SEC.ID. nº2) (Tabla 1) y uniéndolos a
HindIII y a pGEM-4Z cortado por EcoRI
(Promega). El gen M.HaeIII se amplifica mediante PCR a partir
de Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC
11116) utilizando los oligonucleótidos HaeIII-FoNC
(SEC. ID. nº 3) y HaeIII-Bc (SEC. ID. nº 4) (Tabla
1). El gen folA es amplificado a partir de Escherichia
coli utilizando los iniciadores EDHFR-Fo (SEC.
ID. nº 5) y EDHFR-Ba (SEC. ID. nº 6) (Tabla 1).
Ambos genes amplificados son digeridos con HindIII y
KpnI y son clonados en
pGEM-4Z-3s, creando los vectores de
expresión pGEM-HaeIII-3s y
pGEM-folA-3s.
DIG-M.HaeIII-3s-Biotina
y DIG-folA-3s-Biotina (véase
la Fig 1b) se amplificaron a partir de estos vectores mediante PCR
con la polimerasa Pfu, utilizando los iniciadores
LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y
LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) (20 ciclos) y
purificándose utilizando Wizard PCR Preps (Promega).
DIG-D1.3-Biotina, un fragmento de
ADN de 942 pares de bases que contiene cuatro sitios R/M
HaeIII, utilizado como un sustrato para ensayar la actividad
de la HaeIII metilasa, se amplificó a partir de un derivado
pUC19 que contenía un gen Fv de cadena única D1.3 (McCafferty et
al., 1990) como anteriormente. Un ADN transportador de 558 pares
de bases (ADN transportador g3; un fragmento interno del gen III del
fago fd que no tiene promotor T7, sitios R/M HaeIII o
HhaI) se amplificó mediante PCR con Taq polimerasa de
pHEN1 ADN (Hoogenboom et al., 1991) utilizando los
iniciadores G3FRAG-Fo (SEC. ID. nº 11) y
G3FRAG-Ba (SEC. ID. nº 12) (Tabla 1) y se purificó
mediante extracción fenol-clorofórmica y
precipitación etanólica. Este ADN (a \geq 10 nM) se utilizó como
un transportador en dilución de todo el ADN utilizado para las
reacciones en este ejemplo.
La figura 3 demuestra la selección de los genes
M.HaeIII que codifican la ADN metilasa HaeIII a partir
de un exceso de los genes folA (que codifican DHFR que no
metila al ADN). Ambos genes tienen las mismas secuencias
HaeIII R/M añadidas para actuar como un sustrato (Fig 1b).
Después de traducción en los compartimentos acuosos de una emulsión,
las secuencias HaeIII R/M unidas a los genes de la metilasa,
son metiladas. Estos genes se convierten en resistentes a la
fragmentación por la endonucleasa HaeIII y son amplificados
subsiguientemente mediante PCR. Los genes folA, que se
encuentran en otros compartimentos, permanecen sin metilar, son
fragmentados y no se amplifican. Los productos PCR son analizados
mediante electroforesis en gel de agarosa en la que el
enriquecimiento para los genes M.HaeIII puede visualizarse
por la aparición de una banda de 1194 pares de bases (Fig 3).
Se utiliza el sistema de extracto S30 de E.
coli para el ADN lineal (Promega), se suplementa con el ADN
transportador g3 (10 nM), fragmentos de ADN
(DIG-M.HaeIII-3s-Biotina
y DIG-M.folA-3s- Biotina) con
proporciones y concentraciones que se indican más adelante), T7 ARN
polimerasa (10^{4} unidades), desoxicolato sódico (Fluka, 0,5%
peso/vol; sólo en reacciones emulsificadas) y
S-adenosil metionina (NEB, 80 \mum). Las
reacciones se fijaron utilizando fragmentos de ADN
DIG-M.HaeIII-3s-Biotina
y
DIG-M.folA-3s-Biotina
con una proporción de 1:10^{3} y una concentración total de 200 pM
(Fig 3a) y proporciones de 1:10^{4} a 1:10^{7} y una
concentración total de 500 pM (Fig 3b). Se prepararon reacciones de
50 microlitros sobre hielo y se emulsificaron mediante agitación
sólo tal como se describe en el Ejemplo 1. Las reacciones se
incubaron durante 2 horas a 25ºC. Para recuperar las mezclas
reactivas, las emulsiones se hicieron rotar a 3.000 g durante 5
minutos y se eliminó la fase oleosa, abandonando la emulsión
concentrada en el fondo del vial. Se añadieron tampón de extinción
(0,2 ml de 25 \mug/ml de ARN de levadura en tampón W +B: 1 M NaCl,
10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4) y 2 ml de éter
saturado con agua, y la mezcla se agitó vorticialmente, se
centrifugó brevemente y se eliminó la fase etérea. La fase acuosa se
lavó con éter y se secó (5 minutos en un Speedvac a temperatura
ambiente). Se capturó el ADN sobre Dynabeads M-280
de 100 \mug de streptavidina (2 horas a temperatura ambiente). Las
Dynabeads se lavaron secuencialmente con: tampón W + B; 2,25 M
Guanidina-HCl, 25 mM de Tris-HCl, pH
7,4; tampón W +B; y dos veces con tampón de restricción. Las perlas
se volvieron a suspender en 100 \mul de tampón de restricción que
contenía 10 unidades HaeIII (o HhaI)y se incubaron a
37ºC durante 5 horas. Las perlas se lavaron tres veces con tampón W
+ B, dos veces con 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, Triton
X-100 al 0,1%, pH 9,0, y entonces se volvieron a
suspender en 100 \mul del mismo tampón suplementado con 1,5 mM
MgCl_{2} (tampón PCR). Se amplificaron mediante PCR alícuotas de
las perlas (2 a 20 \mul) utilizando Taq polimerasa añadida
a 94ºC con los iniciadores LMB2-Biotina y
LMB3-DIG(reacciones de 50 \mul, 32 ciclos
de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 2 minutos a 72ºC). Este ADN se
purificó utilizando Wizard PCR Preps y se utilizó para la segunda
serie de selección (20 pM en las selecciones 1:10^{4} y 1:10^{5}
y 500 pM en las selecciones 1:10^{6} y 1:10^{7}). Para la
electroforesis en gel y los ensayos de actividad, este ADN (diluído
a 1 pM aproximadamente) se amplificó ulteriormente con los
iniciadores LMB2-Nest y LMB3-Nest,
los cuales se hibridizan inmediatamente en el interior de LMB2 y
LMB3 respectivamente (25 ciclos de 1 minuto a 94º, 1 minuto a 50º,
1,5 minutos a 72º), purificándose como anteriormente. Este ADN (con
10 nM), el cual no se añade a DIG ni a la Biotina, también se
traduce in vitro en presencia de 10 nM de
DIG-D1.3-Biotina, un ADN de 942
pares de bases que contiene cuatro sitios R/M HaeIII. La
metilación del sustrato
DIG-D1.3-Biotina se determina
mediante el DIG-Biotin ELISA como en el Ejemplo
9.
Una única serie de selección de una proporción
1:1000 de los genes M.HaeIII:folA en la emulsión, da
lugar a una proporción génica final aproximada de 1:1 (Fig 3a).
Varios experimentos de control indican que la selección obra según
el mecanismo descrito anteriormente: una banda que corresponde al
gen M.HaeIII no se observa cuando la mezcla inicial de
genes es amplificada mediante PCR; ni después de la reacción en
solución (no emulsificada); ni cuando se produce la emulsificación
en ausencia de la transcripción/traducción (cuando la T7 ARN
polimerasa se omite); ni cuando los genes reaccionantes son
fragmentados en sitios R/M que son distintos a los de HaeIII
-por ejemplo, después de la digestión con HhaI. El
rendimiento de M.HaeIII ADN después de la selección es menor
que el 100%, debido principalmente a la digestión incompleta por
HaeIII, mas que a la metilación cruzada, tal como se indica
por la gran banda folA observada en ausencia de actividad
metilásica (cuando la T7 polimerasa no se añade. Durante la
digestión, la concentración del ADN disminuye por debajo de la
K_{M} de HaeIII (6 nM) y la digestión se vuelve
extremadamente ineficaz.
Una banda que corresponde a los genes M.
HaeIII se vuelve también visible después de una única serie
de selección que empieza a partir de proporciones M.HaeIII:
folA de 1:10^{4} a 1:10^{5} (Fig 3b), pero no a
proporciones inferiores, indicando un factor de enriquecimiento de
por lo menos 5000 veces. La selección de un pequeño número de genes
a partir de un amplio conjunto (por ejemplo, una genoteca), requiere
por tanto ulteriores series de selección. Cuando el ADN digerido por
HaeIII y amplificado a partir de la primera serie de
selección, se somete a una segunda serie de selección, una banda que
corresponde a los genes M.HaeIII también se vuelve visible a
partir de proporciones iniciales 1:10^{6} y 1:10^{7} de
M.HaeIII:folA. Una segunda serie de selección también
se lleva a cabo sobre el ADN derivado de las proporciones iniciales
1:10^{4} a 1:10^{5} de M.HaeII:folA. Esto da lugar
a un enriquecimiento posterior, hasta una proporción de
aproximadamente 3:1 a favor de los genes M. HaeIII. Antes y
después de cada serie de selección, los genes se amplifican, se
traducen in vitro y reaccionan con un sustrato separado de
ADN, para ensayar la actividad HaeIII metilasa. Estos ensayos
indican que el enriquecimiento para los genes M.HaeIII, tal
como se observa mediante electroforesis en gel, da lugar a un
aumento paralelo en la actividad metilásica de HaeIII (Fig
3b).
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: MEDICAL RESEARCH COUNCIL
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 20 PARK CRESCENT
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: LONDON
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: UK
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL: W1N 4AL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 23
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTTGCATG CCTGCGGTAC CGGCCATGCG CATGGCCTAG CGCATGCGGC CGCTAGCGCG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTCGCGCT AGCGGCCGCA TGCGCTAGGC CATGCGCATG GCCGGTACCG CAGGCATGCA
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGCTAGAG CTACCTTATT AATTACCTTT ACAAATTTCC AATGCAGATT TTAT
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGAATTTA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTAGTCTTT TTTCAGGTGC AGGG
\hfill84
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGCTAGAG GTACCTTATT ACCGCCGCTC CAGAATCTCA AAGCAATAG
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 82 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGATCAGT
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGATTGCGG CGTTAGCGGT AG
\hfill82
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTGGATT TAGGTGAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATGATTACG CCAAGCTC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACGAC GGCCAGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGAAACAG CTATGAC
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCTGAAT TTACCGTTCC AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAACTGTTG AAAGTTGTTT AG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTATAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGTT ATCAGGCATG CACC
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGCTCCCA TTAAGGAG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACGAC GGCCAGT
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGAAACAG CTATGAC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGCTAGAG GTACCGCGGC CGCTGCGCTT ATTAATATGG TTTGAAATTT AATGATGAAC
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATG
\hfill65
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 83 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGATTGAA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATAAAAGATA AACAGCTCAC AGG
\hfill83
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAGCTAGAG GTACCGCGGC CGCTGCGCTT ATTAATTACC TTTACAAATT TCCAATGCAG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATTTTAT
\hfill67
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 78 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGAAACAG CTATGACAAG CTTAATACGA CTCACTATAG GGAGATATTT TTTATTTTAA
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAGGTTTTA ATTAATGG
\hfill84
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCTTATTAC TTTTGTAATC GTTTGTTTTT TATC
\hfill54
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 77 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGAAACAG CTATGACAAG CTTAATACGA CTCACTATAG GGAGAAATGG GTTTCTTTGG
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATATTTTTT ACAAATG
\hfill77
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 59 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Nº DE HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCGATATCT TATTACTCTT CAATTACCAA AATATCCCC
\hfill59
Claims (26)
1. Procedimiento para el aislamiento de uno o más
elementos genéticos que codifican un producto génico que posee una
actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- compartimentalizar los elementos genéticos en microcápsulas;
- (b)
- expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas; y
- (c)
- clasificar los elementos genéticos que producen el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que un producto génico con la actividad deseada induce un cambio en
la microcápsula que permite que la microcápsula que contiene el
producto génico y el elementos génico que lo codifica, sean
clasificados.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que un producto génico que presenta la actividad deseada modifica
una o más moléculas en el interior de las microcápsula que permite
que la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento
génico que lo codifica, sean clasificados.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3,
en el que el producto génico que posee la actividad deseada induce
un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula y de este
modo las microcápsulas son clasificadas.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que en la etapa (b) la actividad del producto génico deseado en el
interior de la microcápsula da lugar, directa o indirectamente, a la
modificación del elemento genético que codifica el producto génico,
para permitir el aislamiento del elemento genético.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que el producto génico que posee la actividad deseada induce un
cambio en la microcápsula que, cuando es detectado, provoca la
modificación del elemento genético en el interior del compartimento,
para permitir el aislamiento del elemento genético.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el cambio en la microcápsula es un cambio en sus propiedades
ópticas.
8. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que una parte del elemento genético es un sustrato y la actividad
del producto génico deseado en el interior de la microcápsula da
lugar, directa o indirectamente, a la conversión de dicho sustrato
en un producto que sigue formando parte del elemento genético y
permite su aislamiento.
9. Procedimiento según la reivindicación 5, en el
que una parte del elemento genético es un ligando y el producto
génico deseado en el interior de la microcápsula se une, directa o
indirectamente, a dicho ligando, para permitir el aislamiento del
elemento genético.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la actividad del producto
génico deseado en el interior de la microcápsula da lugar, directa o
indirectamente, a la alteración de la expresión de un segundo gen en
el interior del compartimento y la actividad del producto de dicho
segundo gen, permite el aislamiento del elemento genético.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la etapa (b) comprende: la expresión de elementos genéticos
para producir sus productos génicos respectivos en el interior de
microcápsulas, la unión de los productos génicos a los elementos
genéticos que los codifican y el aislamiento de los complejos así
formados.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que en la etapa (c) los complejos son directamente clasificados
para aislar elementos genéticos que codifican un producto génico que
posee la actividad deseada.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que los complejos son sometidos a una ulterior etapa de
compartimentalización, con objeto de aislar los elementos genéticos
que codifican un producto génico que posee la actividad deseada.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, en
el que las microcápsulas se clasifican según las reivindicaciones 2
a 4.
15. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que los elementos genéticos son clasificados según las
reivindicaciones 5 a 10.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se
aíslan a partir de una genoteca de elementos genéticos que codifica
un repertorio de productos génicos.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional
de:
- (d)
- introducción de una o más mutaciones en el ó los elementos genéticos aislados en la etapa (c).
18. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende además la repetición
reiterativa de una o más de las etapas (a) a (d).
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores que comprende además la amplificación de
los elementos genéticos.
20. Procedimiento para compartimentalizar un
elemento genético y expresar el elemento genético para formar su
producto génico en el interior del compartimento, que comprende las
etapas siguientes:
- (a)
- formación de una solución acuosa que comprende el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo, de modo que forme su producto génico;
- (b)
- microencapsulación de la solución, de forma que se forme una microcápsula discreta que comprende el elemento genético; y
- (c)
- exposición de la microcápsula a condiciones apropiadas para que la expresión del elemento genético forme su producto génico para que éste pueda actuar.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, en
el que una genoteca de elementos genéticos que codifican un
repertorio de productos génicos, se encapsula y cada elemento
genético se expresa para formar su producto génico en el interior de
una microcápsula.
22. Procedimiento según la reivindicación 20 ó
21, en el que la microencapsulación se lleva a cabo formando una
emulsión acuosa en aceite de la solución acuosa en un medio basado
en aceite.
23. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 19, en el que los elementos genéticos se
clasifican mediante purificación por afinidad.
24. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 19, en el que los elementos genéticos se
clasifican mediante ablación selectiva de elementos genéticos que no
codifican el producto génico deseado.
25. Procedimiento para la preparación de un
producto génico, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- aislamiento de un elemento genético que codifica un producto génico según la reivindicación 1; y
- (b)
- expresión del producto génico que posea la actividad deseada.
26. Procedimiento para la preparación de un
compuesto o compuestos, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar un protocolo de síntesis en el que por lo menos una etapa esté catalizada por un polipéptido:
- (b)
- preparación de elementos genéticos que codifiquen variantes del polipéptido que facilite esta etapa;
- (c)
- compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas;
- (d)
- expresión de los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos en el interior de las microcápsulas;
- (e)
- clasificación de los elementos genéticos que producen el o los productos génicos polipeptídicos con la actividad deseada; y
- (f)
- preparación del compuesto o compuestos utilizando el producto génico polipeptídico identificado en (e), para facilitar la correspondiente etapa de síntesis.
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