JP2005192572A - invitro選別法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子にリンクされるように、該遺伝子エレメントを発現させてそれらの対応する遺伝子産物を産生し、遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化し、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する該遺伝子エレメントを選別する。
【選択図】 なし
Description
(a)遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(b)マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(c)所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを選別するステップと、
が含まれる。
(a)遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、
(b)遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(c)マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(d)所望の活性を有する遺伝子産物(1種または複数種)を産生する遺伝子エレメントの選別を行うステップと、
(e)所望の活性を有する遺伝子産物を発現させるステップと、
を含む方法を提供する。
(a)遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製するステップと、
(b)遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(c)マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(d)所望の活性を有する遺伝子産物(1種または複数種)を産生する遺伝子エレメントの選別を行うステップと、
(e)所望の活性を有する遺伝子産物を1種または複数種の化合物と接触させ、該化合物による遺伝子産物の活性の調節をモニターするステップと、
を含む方法を提供する。
(f)遺伝子産物の活性を調節できる1種または複数種の化合物を同定し、該1種または複数種の化合物を合成するステップ、
が含まれる。
本発明のマイクロカプセルは、本発明が実施可能となるように、適切な物理的性質をもつ必要がある。
(a)本発明に従って遺伝子エレメントライブラリーから1種以上の遺伝子エレメントを選択するステップと、
(b)選択された遺伝子エレメント(1種または複数種)を突然変異させて、遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントの更なるライブラリーを作製するステップと、
(c)ステップ(a)および(b)を繰り返して、活性の増大した遺伝子産物を得るステップと、
を含む方法が提供される。
(a)少なくとも1つのステップがポリペプチドにより促進される合成プロトコルを提供するステップと、
(b)このステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、
(c)遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(d)マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(e)所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物(1種または複数種)を産生する遺伝子エレメントを選別するステップと、
(f)合成の関連ステップを促進すべく(e)で同定されたポリペプチド遺伝子産物を用いて1種または複数種の化合物を調製するステップと、
を含む方法を提供する。
RNA、DNA、または触媒活性、調節活性、もしくは結合活性を有するタンパク質遺伝子産物に対して選択を行うべく、系を構成することができる。
特定のリガンドに対して親和性を有する遺伝子産物の選択を行う場合、遺伝子エレメントを、リガンドを介してマイクロカプセル中の遺伝子産物にリンクさせることが可能である。この場合、リガンドに対して親和性を有する遺伝子産物だけが遺伝子エレメント自体に結合するため、活性な産物を産生する遺伝子エレメントだけが選択ステップで保持されるであろう。従って、この実施形態では、遺伝子エレメントには、遺伝子産物用のリガンドにリンクされる遺伝子産物をコードする核酸が含まれるであろう。
触媒作用に対して選択を行う場合、各マイクロカプセル中の遺伝子エレメントには、反応の基質が含まれていてもよい。遺伝子エレメントが、触媒として作用できる遺伝子産物をコードする場合、遺伝子産物は、基質から産物への変換を触媒するであろう。従って、反応の終了時、遺伝子エレメントは、触媒される反応の産物に物理的にリンクされる。マイクロカプセルを合体させて反応体をプール化すると、産物に特異的な任意の性質に対して選択を行うことにより、触媒分子をコードする遺伝子エレメントを濃縮することができる(図1)。
(1)遺伝子エレメントを発現させて該遺伝子エレメントのそれぞれの遺伝子産物を生成させるステップと、
(2)遺伝子産物を用い、所望の活性に従って、基質から、直接選択可能であってもなくてもよい産物への変換を触媒するステップと、
(3)場合により、第1の反応を1つ以上の後続反応と共役させるステップであって、各反応が、前の反応の産物により調節され、最終的に選択可能な産物を生成するステップと、
(4)(a)産物と遺伝子エレメントとの関連が保持されるように基質を遺伝子エレメントにカップリングさせることにより、または
(b)産物に保持される好適な分子「タグ」を基質に結合させることによって、選択可能な産物を遺伝子エレメントと反応させるかもしくはそれに結合させることにより、または
(c)産物特異的反応もしくは産物との相互作用によって、選択可能な産物(基質ではない)を遺伝子エレメントにカップリングさせることにより、
触媒反応の選択可能な産物を遺伝子エレメントにリンクさせるステップと、
(5)産物との特異的反応もしくは相互作用を用いるか、または触媒反応の産物に結合された好適な分子「タグ」を用いたアフィニティー精製により、触媒反応の産物を、それが結合した遺伝子エレメントと共に、選択するステップと、
が含まれ、
ステップ(1)〜(4)で、各遺伝子エレメントおよびそれぞれの遺伝子産物は、マイクロカプセル内に包含される。
類似の系を用いて、酵素の調節特性の選択を行うことができる。
(1)遺伝子エレメントを発現させて該遺伝子エレメントのそれぞれの遺伝子産物を生成させるステップと、
(2)遺伝子産物を用い、所望の活性に従って、選択可能な分子の発生または存在が可能になるように生化学反応または一連の共役反応を活性化または抑制するステップと、
(3)(a)選択可能な分子、またはその分子の誘導に用いられた基質を、遺伝子エレメントに結合させることにより、または
(b)産物に保持される好適な分子「タグ」を基質に結合させることによって、選択可能な産物を遺伝子エレメントと反応させるかもしくはそれに結合させることにより、または
(c)産物特異的反応もしくは産物との相互作用によって、触媒反応の産物(基質ではない)を遺伝子エレメントにカップリングさせることにより、
選択可能な分子を遺伝子エレメントにリンクさせるステップと、
(4)選択可能な産物との特異的反応もしくは相互作用を用いるか、または触媒反応の産物に結合された好適な分子「タグ」を用いたアフィニティー精製により、選択可能な産物を、それが結合した遺伝子エレメントと共に、選択するステップと、
が含まれ、
ステップ(1)〜(4)で、各遺伝子エレメントおよびそれぞれの遺伝子産物は、マイクロカプセル内に包含される。
本発明は、欠陥のないマイクロカプセルの選別法を提供する。ただし、利用する選別法が適用可能な場合にかぎられる。所望の遺伝子産物により誘発される変化が、マイクロカプセルの表面で起こるかもしくはそれが表面に現れるか、またはマイクロカプセルの外側からそれを検出できる場合には、マイクロカプセルの選別を行うことが可能である。この変化は、遺伝子産物の直接的作用により誘発されるものであってもよいし、所望の活性を有する遺伝子産物の関与する反応が1つ以上含まれる一連の反応によって間接的に誘発される変化であってもよい。例えば、遺伝子産物がマイクロカプセルの表面に出現し、試薬に接近できるように、マイクロカプセルを構成してもよい。マイクロカプセルが膜のマイクロカプセルである場合、遺伝子産物をターゲットにしてもよいし、所定の分子をマイクロカプセルの膜までターゲッティングさせてもよい。このことは、例えば、膜タンパク質から誘導される配列のように、融合またはリンクされた分子がマイクロカプセルの膜に優先的に組み込まれるようにする膜局在化配列を利用することにより、達成することができる。このほか、油中水型エマルションのように相分離によりマイクロカプセルを形成する場合、カプセルの外側相に多く溶解する部分を有する分子は、マイクロカプセルの境界に存在するような配置をとるであろう。
第iii節(マイクロカプセルの選別)で述べたように、所望の遺伝子産物により誘発される変化が、マイクロカプセルの表面で起こるかもしくはそれが表面に現れるか、または外側からそれを検出できる場合には、こうした変化を利用してマイクロカプセルの同定を行うことが可能である。同定される場合には、この変化を用いて、コンパートメント内の遺伝子の改変をトリガーすることができる。本発明の好ましい態様では、マイクロカプセルの同定は、マイクロカプセル内でルミネセンス、燐光、または蛍光を誘発する反応の結果として生じるマイクロカプセルの光学的性質の変化に基づくものである。ルミネセンス、燐光、または蛍光を同定することにより、マイクロカプセル内での遺伝子の改変がトリガーされるであろう。例えば、ルミネセンス、燐光、または蛍光を同定することにより、遺伝子エレメントの改変を引き起こすフォトン(または他の粒子もしくは波)によるコンパートメントの照射をトリガーすることができる。細胞の迅速な選別を行うための類似の手順が、既に報告されている(Keij et al., 1994)。例えば、光活性保護基でケージ化された分子「タグ」を遺伝子エレメントにカップリングさせることにより、遺伝子エレメントの改変を起こしてもよい。この場合、適切な波長のフォトンを照射すると、ケージが除去される。その後、マイクロカプセルをすべて合体させ、遺伝子エレメントを1つの環境下で一緒にプールする。所望の活性を呈する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは、「タグ」に対して特異的な結合または特異的な反応を行う分子を用いてアフィニティー精製することにより、選択することができる。
かならずしも、すべての反応を1つのマイクロカプセル中で行い、転写/複製および/または翻訳ならびに選択のプロセスを単一ステップで行う必要がないことは理解されるであろう。選択手順には、2ステップ以上が含まれていてもよい。第1に、遺伝子エレメントライブラリーの各遺伝子エレメントの転写/複製および/または翻訳を第1のマイクロカプセル中で行ってもよい。次に、各遺伝子産物を、それをコードする遺伝子エレメント(同じマイクロカプセル中に存在する)にリンクさせる。その後、マイクロカプセルを破壊し、それぞれの遺伝子産物に結合された遺伝子エレメントを場合により精製する。このほか、遺伝子エレメントは、カプセル化によらない方法を用いて、該遺伝子エレメントのそれぞれの遺伝子産物に結合させることもできる。例えば、ファージディスプレイ(Smith, G.P., 1985)、ポリソームディスプレイ(Mattheakkis et al., 1994)、RNA‐ペプチド融合(Roberts and Szostak, 1997)、またはlacリプレッサーペプチド融合(Cull, et al., 1992)。
遺伝子エレメントがコードする所望の結合活性、触媒活性、または調節活性により、すべてのマイクロカプセル中に存在する「リポーター遺伝子」の発現が直接的または間接的に活性化されるように、系を構成することができる。所望の活性を有する遺伝子産物だけが、リポーター遺伝子の発現を活性化する。リポーター遺伝子発現の結果として生じる活性を利用すると、本明細書に記載の任意の方法により、遺伝子エレメント(または、それを含むコンパートメント)の選択が可能になる。
本発明の更なる態様によれば、本発明の方法には、遺伝子エレメントを増幅する更なるステップが含まれる。所望の遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントに対する濃縮を行う手段として選択的増幅を使用することができる。
本発明の更なる態様によれば、遺伝子エレメントをコンパートメント化し、遺伝子エレメントを発現させて、コンパートメント内で遺伝子産物を形成する方法が提供される。この方法には、
(a)遺伝子エレメントと、それを発現させてその遺伝子産物を形成するのに必要な成分とを含んでなる水溶液を作製するステップと、
(b)遺伝子エレメントを含む離散したマイクロカプセルが形成されるように、溶液をマイクロカプセル化するステップと、
(c)遺伝子産物を形成すべく遺伝子エレメントの発現を進行させるのに好適な条件にマイクロカプセルを暴露するステップと、
が含まれる。
油中水型エマルション系における約2 μm水性マイクロカプセルの作製
本発明の好ましいサイズ範囲内にあるマイクロカプセルは、油中水型エマルション系を用いて作製することができる。
油中水型エマルションの水性マイクロカプセル中で行われる効率的なin vitro転写反応
各マイクロカプセル内でDNAからRNAを産生するために、系の各水性マイクロカプセル内に存在するDNA分子1個を効率的に転写しなければならない。この場合、in vitro転写は、マイクロカプセル内で行われる。
油中水型エマルションの水性マイクロカプセル中で行われる効率的な共役in vitro転写/翻訳反応
本発明の手順を用いてタンパク質を合成するために、本明細書に記載の油中水型エマルションの水性マイクロカプセル中において転写が有効に行われなければならない。
共役in vitro転写/翻訳反応を用いて産生させたジヒドロ葉酸レダクターゼは活性である
この実施例では、油中水型エマルション系の水性マイクロカプセル中でのfolA遺伝子の共役転写/翻訳により、タンパク質(大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ)が触媒活性のある形態で効率的に産生できることが示される。このアッセイでは、最適サイズ未満のマイクロカプセルを含むエマルションを使用する。マイクロカプセルのサイズが大きくなると、DHFR活性は高くなることが分かる。
高分子量タンパク質を介した遺伝子エレメントへの固定化基質のリンケージ
folA遺伝子を含有するDNA断片に多数の固定化基質分子をリンクするために、DNA断片をまずビオチニル化し、次に、アビジンとアポフェリチンとの複合体にカップリングさせる。ウマ脾臓アポフェリチンは、直径12.5 nmの大きなほぼ球形のタンパク質分子であり、従って、基質を用いて誘導体化できる多数の部位を提供する(例えば、表面リシンのε-アミノ基)。プライマーLMB3および5'ビオチニル化LMB2(LMB2-ビオチン)を用いて、大腸菌 DHFRをコードするpGEM-folAプラスミドをPCR増幅し、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳開始部位、およびfolA遺伝子を含有するビオチニル化649bp DNA断片を形成する(実施例3を参照)。500 μl PCR反応混合液に100 μCi [α-32P]dCTP(Amersham; 3000 Ci/mmol)を添加することにより、DNAを放射能標識する。Wizard PCR Prep(Promega)を用いてビオチニル化PCR断片を直接精製し、分光学的に濃度を測定する。ストレプトアビジンM-280ダイナビーズ(Dynal)に結合させ、シンチレーション計数を行うことにより、ビオチニル化DNAのパーセンテージをアッセイする。この方法を用いて、DNAの83%が、ビオチニル化されていることが判明した。
in vitro転写‐翻訳とDHFR活性は共に同一の系で適合性を示す
共役した転写‐翻訳によりin situで産生されるDHFRの活性に対して選択を行うために、転写‐翻訳反応およびDHFRはいずれも、同一の緩衝系で活性でなければならない。
固定化ジヒドロ葉酸基質を含有する遺伝子エレメントに対するDHFRの活性により、DHFRをコードする核酸に結合したテトラヒドロ葉酸産物が形成される
γ-カルボキシレートを介して結合した3個のグルタミン酸を含んでなるペプチドを合成する(出発物質としてN-フルオレニルメトキシカルボニル-グルタミン酸α-ベンジルエステルを使用する)。このペプチドは、カルボキシ末端にリシンを有し、更に、文献記載の手順(Krumdiekら, 1980)に変更を加えることにより、そのε-アミノ基にビオチンが結合する。アミノ末端に葉酸を結合し、既に報告されているように、ベンジルおよびトリフルオロアセトアミド保護基をアルカリ加水分解により除去する。このペプチドを逆相HPLCにより精製し、質量分析法およびUV分光法により特性付けする。文献記載の手順(Zakrzewskiら., 1980)を適用することにより、この葉酸ペプチドを化学的に還元して、対応するジヒドロ葉酸ペプチドとし(ジチオネートおよびアスコルビン酸を用いる)、更に、対応するテトラヒドロ葉酸ペプチドとする(水素化硼素ナトリウムを用いる)。これらの変換を、UV分光法により特性付けする。
DHFR活性に対して選択を行う代替法
酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒され、「タグ付け」された基質を用いて行われる第2の反応に、in situで共役させることにより、DHFR触媒反応に対して選択を行うことができる。
遺伝子産物による遺伝子エレメントのメチル化
油中水型エマルションの水性コンパートメント中でin vitro転写/翻訳により産生されるDNAメチルトランスフェラーゼは、それをコードするDNA分子を該コンパートメント中でメチル化する。
油中水型エマルションの水性コンパートメント中で自己メチル化を行った後、DNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子エレメントの選択および増幅を行うことができる
DNA‐メチラーゼをコードする遺伝子をメチル化することにより、後続のステップでその単離および増幅を行うことが可能になる。メチル化DNAは、制限エンドヌクレアーゼ開裂に対する耐性を有するため、非メチル化DNAと区別することができる。従って、同種制限酵素で処理した後、インタクトなままの遺伝子エレメントをPCRにより増幅することができる。しかしながら、同じR/M部位を含むがメチラーゼをコードしない他の遺伝子が同じ反応混合物中に存在する場合、このような選択を行えないことは自明である。なぜなら、(大過剰に存在する)非メチラーゼ遺伝子の交差メチル化によって、同種制限酵素による開裂に対する耐性が付与され、PCRにより増幅可能になると考えられるからである。こうした状況下では、メチラーゼをコードする遺伝子の選択は、それらがコンパートメント化されている場合だけ、すなわち、自己メチル化がコンパートメント中における主要なプロセスとなるように1個のコンパートメント中にわずか1個または数個の遺伝子が存在する場合だけ、可能になるであろう。メチラーゼ遺伝子を含有しないコンパートメント中に存在する非メチラーゼ遺伝子はメチル化されないまま残るため、交差メチル化は回避される。
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Claims (23)
- 所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1種以上の遺伝子エレメントを単離するための方法であって、
(a)遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子にリンクされるように、該遺伝子エレメントを発現させてそれらの対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(b)遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(c)所望の活性を有する遺伝子産物を産生する該遺伝子エレメントを選別するステップと、
を含む方法。 - 所望の活性を有する前記遺伝子産物が、この遺伝子産物とそれをコードする遺伝子エレメントとを含有するマイクロカプセルの選別を可能にする変化をマイクロカプセル中で誘発する、請求項1に記載の方法。
- 所望の活性を有する前記遺伝子産物がマイクロカプセル内で1種以上の分子を改変し、それにより、この遺伝子産物とそれをコードする遺伝子エレメントとを含有するマイクロカプセルの選別を可能にする、請求項2に記載の方法。
- 所望の活性を有する前記遺伝子産物がマイクロカプセルの光学的性質の変化を誘発し、それにより、マイクロカプセルの選別が行われる、請求項2または3に記載の方法。
- 光学的性質の前記変化が蛍光の変化である、請求項4に記載の方法。
- マイクロカプセル内の前記遺伝子産物の所望の活性により、この遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの改変が直接的または間接的に生じ、それにより、該遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項1に記載の方法。
- 所望の活性を有する前記遺伝子産物がマイクロカプセル中での変化を誘発し、この変化が、検出時に、コンパートメント内の遺伝子エレメントの改変を引き起こし、それにより、該遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項6に記載の方法。
- マイクロカプセル中での前記変化がマイクロカプセルの光学的性質の変化である、請求項7に記載の方法。
- 光学的性質の前記変化が蛍光の変化である、請求項8に記載の方法。
- 前記遺伝子エレメントの一部分が基質であり、マイクロカプセル内の所望の前記遺伝子産物の活性により、該基質から産物への変換が直接的または間接的に生じ、該産物が前記遺伝子エレメントの部分を保持し、それにより、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項6に記載の方法。
- マイクロカプセル内の所望の前記遺伝子産物の活性により、基質から産物への変換が直接的または間接的に生じ、遺伝子エレメントは該産物に結合するリガンドをさらに含み、それにより、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項6に記載の方法。
- 前記遺伝子エレメントがリガンドを含み、マイクロカプセル内の所望の前記遺伝子産物が該リガンドに結合し、それにより、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項6に記載の方法。
- マイクロカプセル内の前記遺伝子産物の活性により、コンパートメント内の第2の遺伝子の発現を変化させ、該第2の遺伝子の産物の活性により、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライブラリーから前記遺伝子エレメントを単離する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- (d)ステップ(c)で単離された遺伝子エレメント(1種または複数種)中に1つ以上の突然変異を導入する追加のステップ、
を更に含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。 - ステップ(a)〜(d)のうちの1つ以上を繰り返して行うステップを更に含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子エレメントを増幅するステップを更に含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 油をベースとする媒体中に水性溶液を含んでなる油中水型エマルションを形成することにより、マイクロカプセル化を行う、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子エレメントがアフィニティー精製により選別される、請求項6〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子エレメントが、所望の遺伝子産物をコードしない遺伝子エレメントの選択的切除により選別される、請求項6〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子産物を調製するための方法であって、
(a)遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、
(b)遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子エレメントにリンクされるように、遺伝子エレメントを発現させてそれらの対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(c)該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(d)所望の活性を有する該遺伝子産物(1種または複数種)を産生する遺伝子エレメントの選別を行うステップと、
(e)所望の活性を有する該遺伝子産物を発現させるステップと、
を含む方法。 - 遺伝子産物の活性を調節することのできる1種または複数種の化合物をスクリーニングするための方法であって、
(a)遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、
(b)該遺伝子エレメントを発現させてそれらの対応する遺伝子産物を産生し、該遺伝子産物をそれらをコードする遺伝子エレメントとリンクさせるステップと、
(c)遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(d)所望の活性を有する該遺伝子産物(1種または複数種)を産生する遺伝子エレメントの選別を行うステップと、
(e)所望の活性を有する遺伝子産物を1種または複数種の化合物と接触させ、該化合物による該遺伝子産物の活性の調節をモニターするステップと、
を含む方法。 - 1種または複数種の化合物を調製するための方法であって、
(a)少なくとも1つのステップがポリペプチドにより促進される合成プロトコルを提供するステップと、
(b)このステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、
(c)遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子エレメントにリンクされるように、該遺伝子エレメントを発現させてそれらの対応する遺伝子産物を産生するステップと、
(d)該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、
(e)所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物(1種または複数種)を産生する遺伝子エレメントの選別を行うステップと、
(f)該合成の関連ステップを促進すべく(e)で同定されたポリペプチド遺伝子産物を用いて1種または複数種の化合物を調製するステップと、
を含む方法。
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