JP5198597B2 - 光学的分取方法 - Google Patents
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Description
(a) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化し;
(b) マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれらのそれぞれの遺伝子産物を産生させ;
(c) 遺伝子エレメントの変化した光学特性に従って所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取する;
ステップを含む前記方法を提供する。
(a) 遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製し;
(b) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化し;
(c) マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれらのそれぞれの遺伝子産物を産生させ、
(d) 遺伝子エレメントの変化した光学特性を用いて、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取し;
(e) 所望の活性を有する遺伝子産物を発現させる;
ステップを含む。
(a) 遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製し;
(b) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル中に区画化し;
(c) マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてそれぞれの遺伝子産物を産生させ、
(d) 遺伝子エレメントの変化した光学特性を使用して、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取し;そして、
(e) 所望の活性を有する遺伝子産物を化合物と接触させ、化合物による遺伝子産物の活性の調節をモニターする;
ステップを含む。
(g) 遺伝子産物の活性を調節することができる化合物を同定し、その化合物を合成する;
ステップを含むことが有利である。
本発明のマイクロカプセルは、本発明の実施を可能とするのに適切な物理的性質を必要とする。
(a) 本発明の遺伝子エレメントライブラリーから遺伝子の1つ以上のエレメントを選択し、
(b) 遺伝子産物へのレパートリーをコードする遺伝子エレメントの別のライブラリーを生成するために選択された遺伝子エレメントに変異を起こさせ、
(c) 増強された活性を有する遺伝子産物を得るためにステップ(a)および(b)を繰り返す、
ステップを含む、in vitroでの進化の方法が提供される。
(a) 少なくとも1つのステップがポリペプチドによって促進される合成プロトコルを提供し、
(b) その発現により直接または間接的に遺伝子エレメントの光学特性の改変を生じる、前記ステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレメントを調製し、
(c) マイクロカプセル中に該遺伝子エレメントを区画化し、
(d) マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させ、各遺伝子産物を産生させ、
(e) 遺伝子エレメントの変化した光学特性を使用して、所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取し、そして、
(f) (g)で合成の当該ステップを促進すると同定されたポリペプチド遺伝子産物を使用して1つ以上の化合物を調製する、
ステップを含む化合物の調製方法を提供する。
系は、触媒、調節または結合活性を有するRNA、DNAあるいはタンパク質遺伝子産物分子を選択するために構成することができる。
特定のリガンドに対するアフィニティを有する遺伝子産物についての選択の場合、マイクロカプセル中で遺伝子エレメントはリガンドを介して遺伝子産物と連結させることができる。すなわち、リガンドに対してアフィニティを有する遺伝子産物だけが遺伝子エレメントに結合し、リガンドを介して結合した遺伝子産物を有する遺伝子エレメントだけが変化した光学特性を獲得し、これにより選択ステップでそれらが保持されるようにされる。従ってこの態様においては、遺伝子エレメントは遺伝子産物に対するリガンドと連結した遺伝子産物をコードする核酸を含む。
選択が触媒作用についてのものである場合、各マイクロカプセル中の遺伝子エレメントは反応の基質を含み得る。遺伝子エレメントが触媒として作用し得る遺伝子産物をコードする場合、遺伝子産物が、基質の生成物への変換を触媒することになる。従って、反応の終了時には、遺伝子エレメントは、触媒された反応の生成物と物理的に連結している。
(1) 例えば、
(a) 異なる光学特性を有する基質及び生成物(多くの蛍光原酵素基質が市販品として利用可能であり(例えば、Haugland, 1996を参照)、グリコシダーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼ及びプロテアーゼ等がある(Craig et al., 1995; Huang et al., 1992; Brynes et al., 1982; Jones et al., 1997; Matayoshi et al., 1990; Wang et al., 1990))、または
(b) 同様の光学特性を有する基質及び生成物であるが、生成物のみが遺伝子エレメントに結合しあるいはそれと反応し、基質はしない、基質及び生成物のために、基質-遺伝子エレメント複合体には見られない光学特性を有する生成物-遺伝子エレメント複合体、
(2) 生成物に特異的に結合するかそれと反応し、それによりその分取を可能とする遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する試薬を添加すること(これらの試薬はマイクロカプセルを破壊し遺伝子エレメントをプールする前あるいは後に添加することができる)、のいずれかにより修飾することができる。試薬は、
(a) 基質及び生成物の両方が遺伝子エレメントに結合している場合は、生成物に特異的に結合するかそれと反応し、基質とはせず、
(b) 生成物のみが遺伝子エレメントに結合し、またはそれと反応し、基質はしない場合は、任意に基質及び生成物の両方に結合する。
(1) 遺伝子エレメントを発現してそれらのそれぞれの遺伝子産物を与え、
(2) 遺伝子産物に、基質から生成物への変換を触媒させ、これは所望の活性に従って直接選択可能なものであってもなくてもよく、
(3) 任意に第1の反応を後続の1以上の反応に結合し、各反応は先の反応の生成物により調節され、最終的な選択可能な生成物を生じるものとし、
(4) 触媒作用の選択可能な生成物を遺伝子エレメントに、
a) 生成物が遺伝子エレメントに結合したままとなるように基質を遺伝子エレメントに結合すること、
b) 生成物上に保持される基質に結合された適当な分子「タグ」により選択可能な生成物を遺伝子エレメントと反応させるかそれに結合すること、あるいは、
c) 生成物特異的反応または生成物との相互作用によって選択可能な生成物(ただし基質ではない)を遺伝子エレメントに結合すること
のいずれかにより連結し、
(5) その特有の光学特性、あるいは生成物に特異的に結合するかそれと特異的に反応し、それにより遺伝子エレメントの光学特性の変化を生起する試薬を加えることのいずれかによって、それが結合する遺伝子エレメントとともに触媒作用の生成物を選択するステップを含み、ステップ(1)〜(4)において各遺伝子エレメント及び各遺伝子産物はマイクロカプセル中に含まれているものとする。
基質特異性あるいは選択性を有する酵素をコードする遺伝子エレメントは、1の基質との反応についてのポジティブ選択、及び別の基質との反応についてのネガティブ選択を行うことにより特異的に濃縮することができる。そのような組み合わされたポジティブ及びネガティブ選択プレッシャーは、部位選択的及び立体選択的酵素(例えば、同じ基質の2つの対掌体を識別することができる酵素)の単離において非常に重要である。例えば、2種の基質(例えば異なる2種の対掌体)を異なるタグ(例えば2種の異なる蛍光団)でそれぞれ標識し、酵素触媒反応によりタグが遺伝子エレメントに結合されるようにする。2種のタグが遺伝子エレメントに異なる光学特性を与える場合、酵素の基質特異性は遺伝子エレメントの光学特性から決定することができ、好ましくない特異性を有する(あるいはない)遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは拒絶される。異なる光学特性を有するタグ特異的リガンド(例えば、異なる蛍光団で標識されたタグ特異的抗体)を加える場合は、光学活性の変化を与えないタグも使用できる。
同様の系を酵素の調節特性についての選択に使用することができる。
(1) 遺伝子エレメントを発現してそれらのそれぞれの遺伝子産物を与え、
(2) 遺伝子産物に、所望の活性に従って、選択可能な分子が生成あるいは生存するように、生化学的反応あるいは一連のつながった反応を活性化あるいは阻害させ、
(3) 選択可能な分子を遺伝子エレメントに、
a) 遺伝子エレメントに結合した、選択可能な分子、またはそれから誘導された基質を有すること、
b) 生成物上に保持された基質に結合された適当な分子「タグ」により、選択可能な生成物を遺伝子エレメントと反応させるかそれに結合すること、あるいは、
c) 生成物特異的反応または生成物との相互作用によって、触媒作用の生成物(ただし基質ではない)を遺伝子エレメントに結合すること
のいずれかにより連結し、
(4) その特有の光学特性、あるいは生成物に特異的に結合するかそれと特異的に反応し、それにより遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する試薬を加えることのいずれかによって、それが結合する遺伝子エレメントとともに選択可能な生成物を選択するステップを含み、ステップ(1)〜(3)において各遺伝子エレメント及び各遺伝子産物はマイクロカプセル中に含まれているものとする。
マイクロカプセル中において、例えば遺伝子エレメントの一部であるリガンドに結合する遺伝子産物の共通のエレメントを介して、遺伝子産物が再び遺伝子エレメントに結合される場合は、遺伝子産物の固有の光学特性について選択することが可能である。遺伝子エレメントをプールした後、結合した遺伝子産物の光学特性を使用して分取することができる。この態様は例えば、改善された蛍光及び/または新規な吸収及び発光スペクトルを有する、グリーン蛍光タンパク質(GFP)(Cormack et al., 1996; Delagrave et al., l995: Ehrig et al., 1995)の変異体を選択するために使用することができる。
本発明の好ましい態様においては、遺伝子エレメントはフローサイトメトリーにより分取される。種々の光学特性を分取を開始するために使用することができ、光散乱(Kerker, 1983)及び蛍光分極(Rolland et al., 1985)等が挙げられる。非常に好ましい態様においては、遺伝子エレメントの光学特性の差が蛍光の差となり、遺伝子エレメントは、蛍光活性化セルソーター(Norman, 1980: Mackenzie and Pinder, 1986)あるいは同様の装置を使用して分取される。非常に好ましい態様においては、 遺伝子エレメントは非蛍光性の非磁性(例えばポリスチレン)あるいは常磁性マイクロビーズ(Fornusek and Vetvicka, 1986参照)に含まれ、それらは最適には0.6〜1.0μmの直径を有し、遺伝子及び蛍光シグナルを発生するのに関与する基の両方が結合される。
本発明によれば、1つのマイクロカプセル内で起こるすべての反応による、転写/複製及び/または翻訳、及び選択のすべてのプロセスを単一のステップにおいて行う必要はないことは理解されるであろう。選択方法は2ステップ以上を含んでもよい。まず、遺伝子エレメントライブラリーの各遺伝子エレメントの転写/複製、及び/または翻訳は、最初のマイクロカプセルにおいて起こるものとすることができる。その後、各遺伝子産物は、例えば、抗体のような遺伝子産物特異的リガンドを介して、それをコードする遺伝子エレメント(同じマイクロカプセル中に存在する)と連結する。その後、マイクロカプセルを破壊し、それらのそれぞれの遺伝子産物に結合された遺伝子エレメントを任意に精製する。あるいは、遺伝子エレメントは、カプセル化に依存しない方法を使用してそれらのそれぞれの遺伝子産物に結合することができる。例えばファージディスプレイ(Smith, G.P., 1985)、ポリソームディスプレイ(Mattheakkis et al., 1994)、RNA-ペプチド融合物(Roberts and Szostak, 1997)あるいはlacリプレッサー-ペプチド融合物(Cull, et al., 1992)等である。
遺伝子エレメントによりコードされる所望の結合、触媒または調節活性が、直接または間接的に、すべてのマイクロカプセル中にある「リポーター遺伝子」の発現の活性化を生じるように系を構成することができる。所望の活性を有する遺伝子産物だけがリポーター遺伝子の発現を活性化する。本明細書に記載した方法のいずれかで、リポーター遺伝子発現から得られた活性により、遺伝子エレメント(あるいはそれを含む区画)の選択が可能となる。
本発明のさらに別の態様によれば、前記方法は遺伝子エレメントを増幅するステップをさらに含む。選択的な増幅を、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの濃縮のための手段として使用することができる。
酵素は、溶液中の遺伝子および常磁性ミクロビーズに結合した遺伝子から同じ効率で発現されうる
光学特性の変化を利用することによる遺伝的エレメントの選択のための1つの方法は、該遺伝子が結合するミクロビーズを該遺伝的エレメントが含むというものである。本実施例においては、酵素(大腸菌(E. coli)ジヒドロ葉酸レダクターゼ)の遺伝子がいかに常磁性ビーズに連結し、溶液中の場合と全く同じ効率でin vitroで翻訳されうるのかを示す。
蛍光タンパク質(GFP)は、油中水型エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子からin vitroで翻訳され、その翻訳された遺伝子産物は該ミクロビーズに再結合してそれを蛍光性にしうる
遺伝的要素の選択のための1つの方法は、ミクロビーズに連結した遺伝子を該遺伝的要素が含み、該産物が該マイクロカプセル中のミクロビーズ上に再結合して、その分取を可能にするミクロビーズの光学特性の変化を直接的または間接的にもたらすというものである。
蛍光タンパク質(GFP)は、油中水型エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子からin vitroで翻訳され、その翻訳された遺伝子産物は該ミクロビーズに再結合し、該ミクロビーズの蛍光の増加はフローサイトメトリーにより検出されうる
150μlのストレプトアビジンコート化ポリスチレンビーズ(直径1μM; Bangs Laboratories, ビーズ2×107個/μl)を5mM Tris 7.4/1M NaCl/0.1% Tween20に懸濁させ、50μlの3つのアリコートに分割した。0.5μlの0.2μM DNA(T7-folAまたはT7-GFP)を各ビーズアリコートに加え、43℃で15分間インキュベートし、25mM NaH2PO4、125mM NaCl、0.1% Tween20(pH7.0)(PBS/0.1% Tween20)中で3回洗浄し、40μlのTBSTに再懸濁させ、10μlの80μMビオチン化プロテインA(Sigma)を加えた(15μMの最終濃度とした)。室温で30分間インキュベートした後、該ビーズをPBS/0.1% Tween20中で3回洗浄し、20μlの1:10希釈ウサギ抗GFPポリクローナル抗体(Clontech)または1mg/ml非免疫化ウサギIgG(Sigma)に再懸濁させた。室温で30分間インキュベートした後、該ビーズをPBS/0.1% Tween20中で3回洗浄し、E. coli S30 Extract System for Linear Templates(Promega)からの15μlのS30予混体に再懸濁させ、超音波浴中で1分間超音波処理し、ついで該S30 in vitro翻訳混合物の残りを加え(氷上)、T7 RNAポリメラーゼ(103単位)を添加した。その50μlの氷冷in vitro翻訳反応液を(10μlの5つのアリコート中で〜2分間かけて)、マグネティックバー(8×3mm、ピボットリング付き; Scientific Industries International, Loughborough, UK)で攪拌しながら、0.95mlの氷冷油相(5mlのCostar Biofreeze Vial (#2051)中、鉱油(Sigma. #M-5904)に4.5% (v/v) Span 80 (Fluka)を、次いで0.5% (v/v) Tween 80(SigmaUltra; #P-8074)を溶解することにより新たに調製したもの)に徐々に加えた。攪拌(1150rpm)を氷上で更に3分間継続した。ついで反応を32℃で3時間インキュベートした。該反応混合物を回収するために、該エマルションを3,000gで5分間遠心し、該油相を除去すると、濃縮されている(が無傷のままである)エマルションが該バイアルの底に残った。PBSおよび2mlの水飽和エーテルを加え、該混合物をボルテックスし、短時間の遠心分離を行い、該エーテル相を除去した。ビーズをPBSで2回洗浄し、最後にPBSにビーズ108個/mlで再懸濁させた。488nmでの励起およびフルオレセイン発光フィルターを用いるFACScaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して、104個のビーズを分析した。該エマルションの水性区画中に封入された単一のミクロビーズに結合した遺伝子から翻訳されたGFPは、該ミクロビーズを抗GFP抗体でコートした場合には該ミクロビーズにin situで結合する。該ミクロビーズへのGFPの結合はそれを蛍光性にし(図2)、GFPが結合しているビーズは、そうでないビーズからフローサイトメトリーにより明らかに区別されうる(図3)。
酵素触媒反応の生成物は常磁性ビーズ上に捕捉され、生成物で誘導体化されたビーズはフローサイトメトリーにより同定されうる
酵素ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼM2-2(GST M2-2)により触媒される反応を行なって、ビオチン化生成物を生じさせた(図4)。使用した2つの基質は、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン(CDNB; Sigma)および還元型ビオチン化グルタチオン(ビオチン-GSH)であった。得られた生成物(ビオチン-GS-DNP)は、ストレプトアビジンコート化常磁性微粒子への結合を可能にするビオチンを一方の末端に有し、そして抗DNP抗体が結合しうる2,4-ジニトロフェノール(DNP)基を有する。1mlのDMF中の100mgのビオチンアミドカプロアートN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ビオチン-NHS; Sigma)を1mlの水、30μlの12.5N NaOHおよび1mlのDMF中の酸化型グルタチオン(Fluka)の溶液に加えることにより、ビオチン-GSHを合成した。該ビオチン-NHSは、100μlのアリコート中、氷上で20分間かけて加えた。ついで該pHを1N NaOHで7.0に調節した。該反応中に生成したシロップ様沈殿物を、室温に加温しボルテックスし300μlの水を加えることにより溶解した。攪拌を室温で2時間継続し、該pHを1N NaOHの添加により7.0に戻し、室温で一晩攪拌した。ついでNaOHを使用して該pHを7.5に戻し、該反応液を室温で更に30分間攪拌し、ついで500μlの1M DTTの添加後に更に30分間インキュベートした。該溶媒を真空下で蒸発させ、該生成物を、C8カラムおよび10〜40%アセトニトリル、0.1% TFAの勾配を用いる逆相HPLCにより精製した。0.1M KH2PO4, 1mM EDTA(pH6.5)中に1μgの精製組換えGST M2-2、500μM CDNBおよび200μMビオチン-GSHを含有する100μlの反応液中、ビオチン-GS-DNPを酵素的に合成した。インキュベーションは25℃で1時間であった。340nmにおける吸光度の増加を追跡することによる判定によれば、該反応は実質的に完了していた。また、対照反応を、1)GSTの不存在下、2)CDNBの不存在下、および3)ビオチン-GSHの不存在下で行なった。反応液を5mM Tris-HCl、0.5mM EDTA、1.0M NaCl(pH7.4)(B/Wバッファー)中に200倍希釈した(1μMビオチンの最終濃度を得た)。50μlの該希釈化反応液を、29.3μg(108微粒子)の0.737μm径Sera-Mag(商標)ストレプトアビジンコート化磁性微粒子(MG-SA; Seradyn)を含有する50μlのB/Wバッファーと混合し、室温で1時間インキュベートした。微粒子を、磁石(Dynal MPC-96)を使用してマイクロタイタープレート(Falcon 3911)中で分離し、10mM Tris-HCl、1mM EDTA、2.0M NaCl(pH7.4)(2×B/Wバッファー)で3回、ついでPBS、0.1% Tween 20で2回洗浄した。該微粒子を、PBS/0.1% Tween 20中のマウス抗ジニトロフェノールモノクローナル抗体SPE 21-11(Zelig Eshhar教授からの贈呈物)の1:2500希釈液に再懸濁させ、室温で45分間インキュベートした。該微粒子をPBS/0.1% Tween 20中で3回洗浄し、15μg/mlフルオレセイン(FITC)結合F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG. F(ab')2フラグメント(Jackson; 115-096-006)を含有するPBS/0.1% Tween 20に再懸濁させ、室温で30分間インキュベートした。該微粒子をPBS/0.1% Tween 20中で4回洗浄し、1mlのPBS/0.1% Tween 20に再懸濁させ、2×105個の微粒子を、FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して分析した。図5から理解されうるとおり、全3個の対照反応(GSTの不存在下、GDNBの不存在下およびビオチン-GSHの不存在下)からのビーズの蛍光強度の分布における相違は存在せず、この場合の平均蛍光は約3である。これとは対照的に、該酵素触媒反応からのビーズは、10倍以上高い34の平均蛍光を有する。実際のところ、示されているゲート(gate)を使用した場合(図5)、該酵素触媒反応からの(かつ該ビオチン化生成物でコートされた)ビーズの81.1%が該ゲート中に存在し、一方、該対照反応においては、ビーズのせいぜい0.06%が該ゲート中に存在するにすぎない。したがって、該GST触媒反応の生成物でコートされたビーズは、そうでないビーズから容易に分取されうる。
グルタチオンS-トランスフェラーゼM2-2(GST M2-2)は基質としてケージドビオチン化グルタチオンを利用し、ついでケージドビオチン化生成物はUV照射により脱ケージされ、アビジンコート化ビーズ上に捕捉され、フローサイトメトリーにより検出されうる
ケージドビオチン(5)およびその誘導体(7)の合成は、公開されているプロトコール(PirrungおよびHuang, 1996; Sundbergら (1995))に基づくものであった。しかしながら、後記のとおり、これらのプロトコールの有意な改変を、該合成のいくつかの工程において行なった。
3',4'-(メチレンジオキシ)-6'-ニトロアセトフェノン(Lancaster; 6.2g, 29.6mmol)を、THF(100ml)とエタノール(100ml)との混合物に溶解した。水素化ホウ素ナトリウム(1.12g, 29.6mmol)を加え、該溶液を室温で3時間攪拌した。TLC(シリカコート化プレート上: 溶媒-DCM中の3%メタノール)は、出発物質(Rf=0.8)から該アルコール(Rf=0.6)への完全な変換を示した。水素の発生が止まるまで、塩酸(1N)をゆっくり加え、該溶媒を真空下で蒸発させた。残留固体をDCM(500ml)に溶解し、ブライン(40ml)で洗浄した。該有機相を乾燥(MgSO4)させ、該溶媒を真空下で除去した。熱DCMおよびへキサンからの再結晶により、6.1gの1(黄色結晶性固体)を得た。
メチルニトロピペロニルアルコール(1.69g, 8mmol)を(いくつかに分けて20分間かけて)、カルボニルジイミダゾール(CDI, 2.6g, 16mmol)のDCM(50ml)溶液に加えた。該溶液を3時間攪拌し、その後、TLCは、該アルコール(DCM中の3%メタノールにおいてRf=0.6)から生成物(Rf=0.45)への完全な変換を示した。DCM(100ml)および水(30ml)を加え、該反応混合物を分液漏斗に移した。該混合物を混合し、該水相のpHが6未満になるまで1N HClを(1mlのアリコートで)加えた。該水相を除去し、更に水(30ml)を加え、混合しながらpH 6まで酸性化した。最後に、該DCM相をブラインで洗浄し、乾燥(MgSO4)し、該溶媒を真空下で除去した。該残留固体を熱DCMおよびへキサンから再結晶して、2.2gの2(黄色結晶性固体)を得た。
水素化ナトリウム(油中の60%懸濁液; 100mg, 2.5mmol)を、氷上の無水DCM(10ml)中のビオチン-OMe(517mg, 2mmol)およびMeNPO-CO-Im(305mg, 1mmol)の攪拌懸濁液に加えた。該溶液を氷上で30分間および室温で30分間攪拌した。TLCは、MeNPO-CO-Im(DCM中の5%メタノールにおいてRf=0.6)の完全な消失および該生成物(Rf=0.45)の出現を示した。痕跡量のアルコール1(Rf=0.7)およびRf=0.95の副生成物(おそらくジ-MeNPO-カーボネート)も観察された(生成物と前記副生成物との比率は調製物によって様々であった。該出発物質を注意深く乾燥させ該反応を氷上で行なうと、一般に、該生成物の収率は、より高くなった)。
MeNPO-CO-ビオチン-OMe(940mg; 1.73mmol)を25mlの0.5N HClおよびジオキサン(4:6; アルゴンでフラッシュされたもの)に溶解した。該溶液を、アルゴン下、44℃で24時間攪拌した。該溶媒を真空下で約1mlまで減少させ、水を加え(10ml)、得られた混合物を凍結乾燥させた。得られた固体を、2%メタノール(20ml)を含有するDCMに溶解し、木炭を加えた。該混合物を数分間煮沸し、濾過した。TLC(DCM中の10%メタノール)は、該加水分解生成物(Rf=0.2)の出現および約5%の出発物質(MeNPO-CO-ビオチン-OMe; Rf=0.9)を示した。該溶媒を真空下で除去して黄色固体を得、それを真空下で乾燥させた(約95%の5および5%の4の860mg)。より高濃度のHCl(例えば、1N)およびより高温(例えば、共溶媒としてのTHFとの還流)は、該メチルエステルの完全な加水分解を引き起こした。しかし、有意な量のアルコール1およびビオチンも認められ、これは、これらの条件下での該カルバマートの加水分解を示している。メチルエステル4および特にその加水分解生成物(5)が酸化に感受性であることが判明したことに注目すべきである。5の溶液の加温または更には保存(空気の存在下)は褐色化を引き起こした。同様に、シリカ上でのクロマトグラフィーによる5(例えば7の誘導体)の精製を試みたところ、酸化による非常に高い損失が生じた。
MeNPO-CO-ビオチン-OH(約5%のMeNPO-CO-ビオチン-Omeを含有する860mg; 約1.6mmol)を20mlの無水DCMに溶解した。β-アラニンtert-ブチルエステル(H-β-Ala-OBut)塩酸塩(Bachem; 362mg; 2mmol)、N-ヒドロキシスクシンイミド(172mg; 1.5mmol)およびトリエチルアミン(280μl; 2mmol)を加えた。該攪拌溶液を氷上で冷却し、EDCIを加えた(420mg; 2.2mmol)。該反応を4℃で24時間および室温で2時間攪拌した。TLC(DCM中の5%メタノール)は、該生成物(Rf=0.3)の出現および残存未反応物MeNPO-CO-ビオチン-OMe(Rf=4.5)を示した。該反応液をDCM(30ml)で希釈し、1M NaH2PO4で3回および飽和NaHCO3で1回抽出した。該有機相を乾燥(Na2SO4)し、該溶媒を真空下で除去した。残留シロップをシリカ上のクロマトグラフィー(DCM中の3.0〜4.5%メタノール)により精製して、640mgの6(黄色泡状物)を得た。
tert-ブチルエステル6(510mg; 0.84mmol)を15mlの0.5N HClおよびジオキサン(4:6; アルゴンでフラッシュされたもの)に溶解した。該溶液を、アルゴン下、52℃で24時間攪拌した。水を加え(10ml)、得られた溶液を凍結乾燥させて、加水分解生成物(7)と出発物質(6; 約10%)とを含有(TLCによる判定)する固体を得た。この混合物を、シリカ上のカラムクロマトグラフィー(アセトン中の10%メタノールおよび0.1%酢酸)により精製して、60mgの7を得た(低収率は、主に、シリカ上での7の酸化の結果であった)。
カルボニルジイミダゾール(20mg, 120μmol)を、MeNPO-CO-ビオチン-β-Ala-OH(7, 49mg, 89μmol)のDMF(1.5ml)溶液に加えた。該溶液を室温で30分間攪拌し、ついで数個のアリコートとして、氷上で攪拌されたDMF(2ml)+水(0.15ml)中の酸化型グルタチオン(62mg, 100μmol)およびトリエチルアミン(55μl, 0.4mmol)の溶液に加えた。該溶液を氷上で30分間、ついで室温で攪拌した。該溶液が透明になるまでトリエチルアミンを加え(25μl)、ついで該反応液を室温で更に2時間攪拌した。ついでDTTを加え(0.25mlの1M溶液; 0.25mmol)、該溶液を室温で10分間攪拌した。前記反応の生成物を、0.1%トリフルオロ酢酸の存在下の水-アセトニトリル勾配を使用するRP-8分取カラム上の逆相HPLCにより精製した。8に対応するピーク(保持時間=28.6分)を集めた。ついで該生成物を凍結乾燥により単離し、逆相HPLC(同じカラムおよび溶媒系を用いるもの)上で再び精製した。分析用逆相HPLCを使用する2回目のHPLC精製の後の該生成物の分析は、8に対応するUVスペクトルを有する生成物(>95%)示した(特に、355nmのλmaxはケージドビオチンのO-メチルニトロピペロニル-カルボニル基の存在を示した)。8の濃度を、該グルタチオンに由来する遊離チオール基の滴定(Hermanson, 1996に記載のとおりにDTNB, 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)を使用するもの)により、そしてまた、355nmの吸光度(該ケージドビオチンに対応)により測定した。これらの互いに独立した測定は共に、実験誤差範囲内の同じ結果を与えた。
油中水型エマルジョンの水滴中に区画化されたグルタチオンS-トランスフェラーゼM2-2(GST M2-2)はケージドビオチン化グルタチオンと4-クロロ-3-ニトロ安息香酸(CNB)との反応を触媒する。生成したケージドビオチン化生成物は区画化されたままであり、ついで該区画中でUV照射により脱ケージされ、同一区画中でアビジンコート化ビーズ上で捕捉され、該生成物コート化ビーズはフローサイトメトリーにより検出されうる。
1.0μm径の非蛍光ニュートラビジン(neutravidin)標識ミクロスフェア(Molecular Probes, F-8777)または0.93μm径のストレプトアビジンコート化ポリスチレンビーズ(Bangs Laboratories)の20μlアリコート(4×108個のビーズ)をそれぞれ、マイクロフュージ中、2,600g(6,500rpm)で3分間遠心した。該上清を除去し、該ビーズを氷上で20μlの0.1M KH2PO4(pH6.5)、1mM EDTA、2mMジチオトレイトール、50μMケージドビオチン-βala-GSH(3μgの精製組換えヒトGST M2-2を含有するか、いずれの酵素も含有しないもの)に再懸濁させた。
a) Bangsビーズ、GST無し
b) Bangsビーズ、+GST
c) Molecular Probesビーズ、GST無し
d) Molecular Probesビーズ、+GST
e) Bangsビーズ、GST無し
F) Molecular Probesビーズ、GST無し。
a) Bangsビーズ、GST無し
b) Bangsビーズ、+GST
c) Molecular Probesビーズ、GST無し
d) Molecular Probesビーズ、+GST
e) Bangsビーズ、GST無し
F) Molecular Probesビーズ、GST無し。
である。したがってビーズ、酵素および反応生成物の区画化は乳化により得られ、酵素を含有する区画中に存在するビーズは、そうでないビーズから、それらの蛍光特性により区別されうる。
ヒトGST M2-2は、油中水型エマルジョンの水性区画中でin vitroで転写および翻訳されることが可能であり、共区画化(co-compartmentalised)ミクロスフェアの蛍光特性の変化を引き起こす反応を触媒する。
ヒトグルタチオンS-トランスフェラーゼM2-2(GST M2-2)をコードする遺伝子を、オリゴヌクレオチドGSTM2-2FoおよびGSTM2-2Bcを使用するPCRにより、pGEM-3Z中のヒトGST M2-2 cDNAクローン(Baezら, 1997)から増幅する。該PCR断片を、lacプロモーターおよびT7 RNAポリメラーゼプロモーターの下流の、HindIIIおよびKpnIで消化されたベクターpGEM-4Z(Promega)中にクローニングする。オリゴヌクレオチドGSTM2-2Bcは、メチルトランスフェラーゼ遺伝子開始コドンの上流に効率的ファージT7遺伝子10翻訳開始部位を付加する。DNA配列決定によって、pGEM-hGSTM2-2と称される正確なヌクレオチド配列を有するクローンを同定する。前記pGEM-hGSTM2-2プラスミドを、前記のとおりにプライマーLMB2およびLMB3を使用するPCRにより増幅して、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳開始部位および該GST遺伝子を保有する826塩基対のPCR断片(GSTM2-2.LMB2-3)を得る。Wizard PCR Perps(Promega)を使用して、該PCR断片を直接精製する。
ミクロビーズに結合した遺伝子はin vitroで発現され、得られた遺伝子産物(酵素)は触媒活性を保有したままミクロビーズに結合する。
遺伝子エレメントの選択のための1つの方法は、マイクロカプセル中で翻訳されるミクロビーズに結合した遺伝子を該遺伝子エレメントが含み、その翻訳された遺伝子産物が該マイクロカプセル中のミクロビーズ上に再結合するというものである。したがって、区画化は、遺伝子産物(例えば、タンパク質または酵素)をコードする遺伝子に結合した該遺伝子産物の複合体の形成につながる。ついでこれらの複合体を、リガンドへの結合に関して(実施例12を参照されたい)、または第2区画化反応を介した酵素活性に関して選択することが可能であろう。
とN-Flagペプチドタグをも有する異なる酵素をコードする遺伝子とを保持する断片、例えばメチルトランスフェラーゼHaeIII - N-Flag-M.HeaIII.LMB3-2ビオチン)を抗体コート化ビーズの懸濁液に加え、該混合物を4℃で一晩インキュベートする。該ビーズを、それをTNTバッファー中で遠心沈殿させ、再懸濁させることにより3回リンスする。
酵素は、ケージドビオチン化基質との反応を触媒し、生成したケージドビオチン化生成物はUV照射により脱ケージされ、ストレプトアビジンコート化ミクロビーズ上で捕捉される。ついでこれらのビーズはフローサイトメトリーにより検出される。
遺伝子エレメントの選択のための1つの方法は、マイクロカプセル中で翻訳されるミクロビーズに結合した遺伝子を該遺伝子エレメントが含み、その翻訳された遺伝子産物が該マイクロカプセル中のミクロビーズ上に再結合するというものである。したがって、区画化は、遺伝子産物(例えば、タンパク質または酵素)をコードする遺伝子に結合した該遺伝子産物の複合体の形成につながる。ついでこれらの複合体を、リガンドへの結合に関して(実施例12を参照されたい)、または第2区画化反応を介した酵素活性に関して選択することが可能であろう。
ジ-tert-ブチルジカーボネート(20.8g; 0.095mol)を、氷上のジクロロメタン(DCM)(200ml)中の5-アミノペンタノール(10.37g; 0.1mol)の攪拌溶液に加える。添加後、該溶液は濁り、シロップが分離する。トリエチルアミン(13.8ml; 0.1mol)を滴下し、得られた溶液を氷上で10分間、ついで室温で一晩攪拌する。該溶媒を真空下で除去し、得られたシロップを酢酸エチル(500ml)に溶解し、1M Na2HPO4(pH4)で3回、飽和NaHCO3で1回、最後にブラインで抽出し、ついでMgSO4で乾燥する。該溶媒を真空下で除去し、主にBoc-5-アミノペンタノールから構成される得られたシロップ(水酸化カリウムの存在下の真空下の十分な乾燥後)を、更なる精製を行なうことなく使用する。
トリエチルアミン(3ml; 22mmol)を、アセトン中のドライアイス上で冷却されたp-ニトロフェニルホスホジクロリダート(5.15g; 20mmol)およびエタノール(1.15ml; 20mmol)の攪拌溶液に30分以内に滴下する。該溶液を室温まで徐々に加温し、さらに90分間攪拌する。ついでBoc-5-アミノペンタノール(4.3g; 約20mmol)およびトリエチルアミン(3ml; 22mmol)のDCM(20ml)溶液を滴下する。該反応を室温で10分間攪拌し、1H-テトラゾールを加え(0.35g; 5mmol)、該反応液を更に2時間攪拌する。DCMを加え(100ml)、該溶液を1M Na2HPO4(pH4)、飽和NaHCO3および最後にブラインで3回抽出し、ついでMgSO4で乾燥させる。該溶媒を真空下で除去してシロップを得、それをシリカ上のカラムクロマトグラフィー(溶媒: DCM中の1%〜2%メタノール)で精製して、3.52gの11(シロップ)を得る。
ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC; 5.15g; 25mmol)を、DCM(200ml)+アセトニトリル(20ml)中の4-N-Boc-アミノメチル安息香酸(Tiger, Monmouth NJ; 5.2g; 25mmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(2.88g; 25mmol)の攪拌懸濁液に加える。該反応液を4℃で一晩、ついで室温で3時間攪拌する。ジシクロヘキシル尿素沈殿物を濾去し、該濾液を真空下で濃縮してシロップを得る。該シロップをクロロホルムおよびDCMに溶解し、活性炭で処理する。エーテルの添加により白色結晶性固体を得る。DCMおよび石油エーテルからの再結晶により、6.2gの4-N-Boc-アミノメチル安息香酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルを得る。
トリフルオロ酢酸(TFA; 4ml)を、11(900mg; 2.07mmol)のDCM(5ml)溶液に加える。該溶液を室温で45分間放置し、該溶媒を真空下で除去する。残留シロップを、それをDCMおよびメタノールに溶解しエーテルを加えることにより粉砕する。得られた12(TFA塩; シロップ)を、水酸化カリウムの存在下、真空乾燥させ、ついで、更に精製することなく直ちに反応させる(後記を参照されたい)。
4-N-Boc-アミノメチル安息香酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(670mg; 2.2mmol)およびトリエチルアミン(0.345ml; 2.5mmol)を、DCM(15ml)中の12(前記を参照されたい)に加える。該溶液を30分間攪拌し、トリエチルアミン(0.1ml; 0.72mmol)を加え、該溶液を更に3時間攪拌する。DCMを加え(20ml)、該溶液を1M Na2HPO4(pH4)で2回、飽和NaHCO3で1回および最後にブラインで抽出し、ついでMgSO4で乾燥させる。該溶媒を真空下で除去してシロップを得、それをシリカ上のカラムクロマトグラフィー(溶媒: DCM中の5%メタノール)で精製して、0.86gの13(シロップ)を得る。
0.84gの13(14 (1.6mmol))を前記のとおりにTFAで処理して14(TFA塩; シロップ)を得、それを後記のとおりに直ちに反応させる。
Boc-Glu(OSu)-OBut(Bachem; 641mg; 1.6mmol)およびトリエチルアミン(0.235ml; 1.7mmol)をDCM(15ml)中の14(前記を参照されたい)に加える。該溶液を1時間攪拌し、トリエチルアミン(60μL; 0.43mmol)を加え、該溶液を1時間攪拌する。DCMを加え(20ml)、該溶液を1M Na2HPO4(pH4)で2回、飽和NaHCO3で1回、そして最後にブラインで抽出し、ついでMgSO4で乾燥させる。該溶媒を真空下で除去してシロップを得、それをシリカ上のカラムクロマトグラフィー(溶媒: DCM中の7%メタノール)で精製して、0.8gの15(白色結晶性固体)を得る。
0.4gの15(0.56mmol)をDCM(5ml)およびTFA(5ml)に溶解する。該溶液を室温で1時間攪拌し、該溶媒を真空下で除去する。残留シロップを、それをメタノールに溶解しエーテルを加えることにより結晶化する。再結晶(メタノールおよびエーテル中)により200mgの16を得る(TFA塩; 白色固体)。
カルボニルジイミダゾール(6mg, 37.5μmol)をMeNPO-CO-ビオチン-OH(5, 17mg, 35μmol)のDMF(1ml)溶液に加える。該溶液を室温で60分間攪拌し、16(20mg, 30μmol)に加える。トリエチルアミン(5.5μl, 40μmol)、DMF(1ml)および水(0.5ml)を該攪拌反応混合物に、それが透明になるまで加える。該溶液を室温で2時間攪拌し、-20℃で保存する。
無水グルタル酸(180mg; 1.6mmol)およびトリエチルアミン(0.22ml; 1.6mmol)を、DCM(15ml)中の12(前記のとおり1.6mmolの11の脱保護により調製したもの)に加える。該溶液を20分間攪拌し、トリエチルアミン(0.12ml; 0.85mmol)を加え、該溶液を更に1時間攪拌する。DCMを加え(20ml)、該溶液を1M Na2HPO4(pH4)で2回抽出し、ついでMgSO4で乾燥させる。該溶媒を真空下で除去してシロップを得、それをシリカ上のカラムクロマトグラフィー(溶媒: DCM中の12.5%メタノール + 0.1%酢酸)で精製して445mgの18(シロップ)を得る。
カルボニルジイミダゾール(CDI; 32mg, 200μmol)を、18(60mg, 134μmol)のDMF(1ml)溶液に加える。該溶液を室温で60分間攪拌する。ついで、活性化された18のアリコートを、0.1Mリン酸塩(pH8.0)中のウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)の5mg/ml溶液に(タンパク質1mg当たり0.5〜4μmolの18となるように)加える。該反応液を室温で1時間攪拌し、得られたタンパク質コンジュゲートを4℃でリン酸緩衝食塩水(PBS)に対して十分に透析する。コンジュゲーションのレベル(ハプテン密度、すなわちHd)を、0.1M水酸化カリウム中で該透析コンジュゲートのサンプルを加水分解し遊離p-ニトロフェノールの量をモニター(405nm)することにより測定する。これらは、該タンパク質サンプルに加えられた活性化された18の量に応じて、BSA 1分子当たり8.5〜24個のEtNPBG分子、およびKLH 1分子当たり14〜63個のEtNPBG分子であることが判明している。
前記のEtNPBG-KLHおよびEtNPBG-KLHコンジュゲートを0.1Mカーボネート(pH11.8)に対して室温で44時間透析し、ついでPBSに対して十分に透析(4℃)する。公開されているプロトコール(Tawfikら, 1993; Tawfikら, 1997)を用いてEtBG-KLH(Hd=14)での免疫により、抗EtBG抗体をウサギにおいて惹起させた(Weizmann Institute of Science, RehovotのZ Eshhar教授からの贈呈物)。血清を、基質コンジュゲートEtNPBG-BSA(Hd=8.5)および対応生成物コンジュゲート(EtBG-BSA; Hd=8.5)の両方への結合に関してELISAにより試験する。該免疫ウサギの一方からの最初の採血は(50倍以上希釈した場合)、該生成物コンジュゲートと共にインキュベートした場合には高いシグナルを及び該基質コンジュゲートでは低いバックグラウンド(<20%)を与える所望の選択性を示す。COVApバッファー(2M NaCl、10g、1 MgSO4・7H2O、0.04% Tween-20、10mMリン酸塩、0.1mM p-ニトロフェノール(pH6.5))中で該血清を希釈すると、選択性が更に増加し、バックグラウンドレベルは5%未満に減少する。HiTrap Protein Aカラム(Pharmacia)を使用して、抗EtBG血清を精製する。その精製されたウサギ抗体を、Alexa Fluor 488タンパク質標識キット(Molecular Probes)で、該製造業者の説明書に従い標識する。
ビーズに結合した遺伝子はin vitroで発現され、得られた遺伝子産物(酵素)は、触媒活性を保有したまま該ミクロビーズ上に固定化される。固定化された酵素は、ケージドビオチン化基質との反応を触媒し、ついで、得られたケージドビオチン化生成物はUV照射により脱ケージされ、その形成を引き起こした酵素をコードする遺伝子と共にこれらのビーズに結合する。ついでこれらのビーズはフローサイトメトリーにより検出される。
遺伝子エレメントの選択のための1つの方法は、マイクロカプセル中で翻訳されるミクロビーズに結合した遺伝子を該遺伝子エレメントが含み、その翻訳された遺伝子産物が該マイクロカプセル中のミクロビーズ上に再結合するというものである。したがって、区画化は、遺伝子産物(例えば、タンパク質または酵素)をコードする遺伝子に結合した該遺伝子産物の複合体の形成につながる。ついでこれらの複合体を、リガンドへの結合に関して(実施例12を参照されたい)、または第2区画化反応を介した酵素活性に関して選択することが可能であろう。
lのPBS、0.1% Tween 20(前記のとおり)で3回洗浄し、ついで200μlのPBS、0.1% Tween 20に再懸濁させる。70μlの前記ビーズ懸濁液(約2×107個)を、PBS、0.1% Tween 20中の40ng/μl FITC標識ヤギ抗ウサギFab(Jackson 115-095-006)溶液50μlに加え、室温で1時間インキュベートする。該ビーズを200μlのPBS、0.1% Tween 20(前記のとおり)で3回洗浄し、ついで1mlのPBS、0.1% Tween 20に再懸濁させ、FACScanフローサイトメーター(Becton Dickinson)を使用して10,000事象を分析する。その結果、図16において理解されるとおり、Flagペプチドでタグ付けされたホスホトリエステラーゼをコードする遺伝子が(Flagペプチドに結合する抗体と共に)結合したビーズは、ホスホトリエステラーゼ活性を有さない酵素(例えば、N-Flag-M.HaeIII)をコードする他の遺伝子が結合した遺伝子から明らかに区別されうるであろう。
in vitroで転写および翻訳された大腸菌(E. coli)BirAは、油中水型エマルジョンの水性区画中の基質標識ミクロスフェアの蛍光特性に変化をもたらす反応を触媒する。
大腸菌(E. coli)においてin vivoでビオチン化されたプロピオニバクテリウム・シャーマニイ(Propionibacterium shermanii)由来のペプチドをコードする遺伝子を、オリゴヌクレオチドBCCP5およびBCCP3を使用してベクターPinpoint Xa-1(Promega)から増幅する。該PCR断片を、BamIIIおよびHindIIIで消化されたベクターpET-23d(FLAG)中、T7 RNAポリメラーゼプロモーターおよびファージT7遺伝子10翻訳開始部位の下流に、N末端のFLAGペプチドコード領域と読み枠を合わせて、クローニングする。このベクターをpET-23d(FLAG-BCCP)と称する。ベクターpET-23d(FLAG)は、後記スキーム2に示すとおり、N末端FLAGペプチドコード領域を含むように改変されたユニークなNcoI部位とBamHI部位との間の領域以外は、ベクターpET-23d(Novagen)と同一である。該タンパク質のC末端にヘキサヒスチジンタグを付加するために、2つのオリゴヌクレオチドBCCPHis+およびBCCPHis-をアニールさせ、ついで、SacIおよびNotIで消化されたベクターpET-23d(FLAG-BCCP)中に連結して、ベクターpET-(FLAG-BCCP-His)を得た。タンパク質FLAG-BCCP-His(FBHと称される)を、株C41(DE3)(MirouxおよびWalker, 1996)中で過剰発現させ、回収し、Ni-NTAアガロース(Qiagen)を用いて該製造業者のプロトコールに従い天然条件下で精製する。洗浄バッファー(50mM NaH2PO4, pH8.0; 300mM NaCl; 20mMイミダゾール)で4℃で1時間かけて予め平衡化した等容量のアビジン-アガロース(Sigma)と共にインキュベートすることにより、ビオチン化タンパク質を枯渇させる。ついでその懸濁液を10,000gで2分間遠心分離し、該上清を貯留し、アリコートに分け、液体窒素中(長期)または4℃で保存する。
遺伝子エレメントの蛍光の変化を用いて、結合活性を有するペプチドをコードする遺伝子エレメントを選択的に富化させることができる。蛍光標識された遺伝子エレメントはフローサイトメトリー分取により単離される。
遺伝子エレメントの選択のための1つの方法は、マイクロカプセル中で翻訳されるマイクロビーズに結合した遺伝子を該遺伝子エレメントが含んでおり、その翻訳された遺伝子産物が該マイクロカプセル中のマイクロビーズ上に再結合するというものである。したがって、区画化は、遺伝子産物をコードする遺伝子に該遺伝子産物が結合した複合体の形成につながる。ついで、該結合相互作用がマイクロビーズの蛍光に変化を引き起こせば、これらの複合体を、フローサイトメトリー分取によりリガンドへの結合に関して選択することができる。
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Claims (35)
- 所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1つ以上の遺伝子エレメントを単離する方法であって、その発現により該遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの光学特性が直接または間接的に改変され得るものであり、
(a) 遺伝子産物がそれらをコードする遺伝子に連結されるように、該遺伝子エレメントを発現させ、それらの各遺伝子産物を産生させるステップ;
(b) 遺伝子エレメントをマイクロカプセル内に区画化するステップ;および、
(c) マイクロカプセルの破壊によって、遺伝子エレメントの光学特性の変化により、所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを分取するステップ;
を含み、前記マイクロカプセルが油をベースとする媒体中で水性溶液の油中水型エマルジョンを形成することによりマイクロカプセル化されたものである、上記方法。 - 所望の遺伝子産物の活性により、直接または間接的に遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントが修飾され、遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの修飾が該遺伝子エレメントの光学特性の変化を誘導する、請求項2に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの一部がリガンドであり、所望の遺伝子産物が直接または間接的に該リガンドに結合することにより、遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項2に記載の方法。
- リガンドもまた遺伝子エレメントによりコードされる、請求項4に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの一部が基質であり、所望の遺伝子産物の活性により該基質が、遺伝子エレメントの一部として保持されることにより該遺伝子エレメントの単離を可能にする生成物に、直接または間接的に変換される、請求項2に記載の方法。
- 所望の遺伝子産物の活性による生成物が、遺伝子エレメントと複合体を形成することにより遺伝子エレメントの単離を可能にする生成物の産生を直接または間接的にもたらす、請求項2に記載の方法。
- 所望の遺伝子産物の活性により、直接または間接的に区画内で第2の遺伝子の発現の変化をもたらし、該第2の遺伝子の産物の活性により、遺伝子エレメントの光学特性の変化を用いる遺伝子エレメントの単離が可能となる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)が;
遺伝子エレメントを発現させ、そのそれぞれの遺伝子産物を産生させ、該遺伝子産物をそれらをコードする遺伝子エレメントに連結させ、その結果形成される複合体を単離することを含む、請求項1に記載の方法。 - ステップ(c)において、前記複合体の変化した光学特性に基づいて該複合体を直接分取し、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離する、請求項9に記載の方法。
- ステップ(c)において、前記複合体がさらに反応して、遺伝子エレメントの光学特性の、複合体中の所望の活性を有する遺伝子産物の存在に依存する条件的変化を誘導する、請求項9に記載の方法。
- 所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離するために前記複合体をさらなる区画化ステップに供する、請求項9に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの光学特性の変化が、特有の光学特性を有する遺伝子産物が遺伝子エレメントに結合することに起因する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの光学特性の変化が、特有の光学特性を有するリガンドが遺伝子産物と結合することに起因する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの光学特性の変化が、リガンドに結合した際の遺伝子産物の光学特性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの光学特性の変化が、遺伝子産物が結合した際のリガンドの光学特性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの光学特性の変化が、結合した際のリガンドおよび遺伝子産物の双方の光学特性の変化に起因する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの光学特性の変化が、選択された反応の基質および生成物の異なる光学特性に起因する、請求項1に記載の方法。
- 基質および生成物の双方が同様の光学特性を有するが、選択された反応の生成物だけが遺伝子エレメントと結合または反応するが、基質はそれと結合または反応せず、そのことにより遺伝子エレメントの光学特性が変化する、請求項1に記載の方法。
- さらに別の試薬が、遺伝子エレメントに結合した生成物と特異的に結合または特異的に反応するが、基質とは結合または反応せず、そのことにより遺伝子エレメントの光学特性を変化する、請求項1に記載の方法。
- 遺伝子産物の所望ではない活性により遺伝子エレメントの所望の活性により生じるものとは異なる光学特性の変化が起こる、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 所望ではない活性により起こる光学的変化を、遺伝子エレメントのネガティブな選択に用いる、請求項21に記載の方法。
- ネガティブな選択をポジティブな選択と組合せて反応特異性を改善する、請求項22に記載の方法。
- 改善される反応特異性が結合特異性の改善である、請求項23に記載の方法。
- 改善される反応特異性が、基質ならびに/または生成物に対する部位および/もしくは立体選択性の改善である、請求項23に記載の方法。
- 遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライブラリーから遺伝子エレメントが単離される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 各遺伝子エレメントが2以上の遺伝子をコードし、各遺伝子産物が、遺伝子エレメントの光学特性が改変されることにより遺伝子エレメントの分取を可能とするような所望の活性を有している、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 各遺伝子エレメントが2以上の遺伝子をコードし、該遺伝子産物が互いに結合し、遺伝子エレメントの光学特性を改変することにより遺伝子エレメントの分取が可能となる、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- 付加的ステップ;
(d) ステップ(c)において単離された遺伝子エレメント中に1つ以上の変異を導入すること、
をさらに含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。 - 遺伝子エレメントを増幅することをさらに含む、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 遺伝子エレメントがマイクロビーズに結合する遺伝子を含む、請求項1に記載の方法。
- マイクロビーズが非磁性、磁性、または常磁性である、請求項31に記載の方法。
- 遺伝子エレメントの蛍光の変化を検出することにより遺伝子エレメントを分取する、請求項1に記載の方法。
- 蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いて、遺伝子エレメントを分取する、請求項33に記載の方法。
- 基質および生成物の異なる蛍光特性が、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によるものである、請求項33に記載の方法。
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