JP2020143015A - 粒子標識用試薬、粒子染色方法、及び顕微鏡システム - Google Patents

粒子標識用試薬、粒子染色方法、及び顕微鏡システム Download PDF

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Abstract

【課題】発光特性が低く、水溶性が向上した粒子標識用試薬を提供すること。
【解決手段】下記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬を提供する。

（上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
【選択図】なし

Description

本技術は、粒子標識用試薬、粒子染色方法、及び顕微鏡システムに関する。
粒子の染色は、それを観察する上では欠かせない工程の一つである。目的粒子を染色することによって、当該目的粒子とそうでない他の粒子との区別を明確にすることができる。
粒子を染色する方法の中でも、代表的なものとしてアビジン-ビオチンシステムを利用した手法が知られており、このシステムを利用した染色方法について、近年、様々な研究成果が報告されている。例えば、非特許文献１では、水溶性の高いビオチン標識用色素であるbiotion-4-Fluorescein（以下、「B4F」と称する。）と蛍光標識であるストレプトアビジンで染色する方法が開示されている。この方法では、B4Fの光褪色を利用して細胞膜にビオチンを局在化させた後、標識色素の異なるストレプトアビジンを用いることで２色染色を実現している。
その他の方法として、ケージドビオチンNHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）エステルを用いる方法も知られている（非特許文献２）。この方法では、ケージドビオチンNHSエステルにより細胞染色を行い、光照射することによってケージ解除し、これによりストレプトアビジンの吸着を可能とすることで染色できるようになる。
Binan, L. et al., Nat. Commun., 7, 11636, 2016 Terai, T. et al., Chem. Biol., 18, 1261, 2011
しかしながら、B4Fを用いる方法では、励起又は発光波長が重なる標識色素を選択するとB4Fの蛍光と重なってしまい、バックグラウンドノイズが増大してしまうという問題があった。また、ケージドビオチンNHSエステルを用いる方法では、当該エステルは水溶性が低いため、有機溶剤を用いなければならないという問題があった。
このような実情のもと、本技術では、発光特性が低く、水溶性が向上した粒子標識用試薬を提供することを主目的とする。
まず、本技術では、下記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬を提供する。
（上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
本技術に係る粒子標識試薬において、前記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中のＬ２及び／又はＬ３は、２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基であるものとすることができる。この場合、前記２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基は、下記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかで表された１価の基であるものとすることができる。
（上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ１及びＲ６は、水素原子又は１価の基である。Ｒ１及びＲ６は、同一でも異なっていてもよい。
上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は１価の基であるか、又は、互いに結合して形成される環構造である。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同一でも異なっていてもよい。
上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、＊は結合手である。）
また、この場合、前記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中のＲ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群のいずれか一以上は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基であるものとすることができる。
本技術に係る粒子標識用試薬において、前記一般式（Ｉ−１）中のＬ１は、スクシンイミド環を含む（ｐ＋１）価の基であるものとすることができる。
また、本技術に係る粒子標識用試薬において、前記一般式（Ｉ−１）中のＬ１は、ポチエチレングリコール鎖を含む（ｐ＋１）価の基であるものとすることができる。
更に、本技術に係る粒子標識用試薬において、前記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の脂溶性官能基であるものとすることができる。
加えて、本技術に係る粒子標識用試薬において、前記一般式（Ｉ−２）中のＬ４は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基であるものとすることができる。
また、本技術に係る粒子標識用試薬において、前記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価のカチオン性官能基あるものとすることができる。
また、本技術では、目的粒子を上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色し、染色された目的粒子に光を照射する一次標識工程と、前記一次標識工程を経た目的粒子に色素標識されたビオチン結合タンパク質にて染色する二次標識工程と、を行う、粒子染色方法も提供する。
本技術に係る粒子染色方法において、前記一次標識工程は、光の照射により前記光分解性保護基が分解し、ビオチンがビオチン結合タンパク質と結合可能な状態となる結合可能化工程を更に含むものとすることができる。
また、本技術に係る粒子染色方法において、前記一次標識工程と前記二次標識工程とを繰り返し行い、異なる前記二次標識工程におけるビオチン結合タンパク質は、異なる色素で標識されたものとすることができる。
更に、本技術では、粒子捕捉領域中のウェルに目的粒子を捕捉する粒子捕捉部と、前記捕捉された目的粒子の画像を取得する画像取得部と、前記画像取得部より取得された目的粒子の画像を解析する解析部と、を有し、前記解析部により解析された目的粒子は、上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色されたものである、顕微鏡システムも提供する。
本技術に係る顕微鏡システムは、光を照射する光照射部、を更に有し、前記染色された目的粒子は、前記光照射部により光を照射されることで一次標識され、前記一次標識された目的粒子は色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合可能となるものとすることができる。
また、本技術に係る顕微鏡システムは、目的粒子を分取する粒子分取部、を更に有し、前記粒子分取部は、前記色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合した前記目的粒子を分取するものとすることができる。
ケージドビオチンと蛍光標識ストレプトアビジンを用いた位置選択的な細胞標識の例を示す図である。 多種蛍光標識ストレプトアビジンを用いた位置選択的なマルチカラー染色の例を示す図である。 本技術に係る顕微鏡システム１００のブロック図である。 MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester soduim saltの合成スキームを示す図である。 biotin-OMe (2) の1H-NMRチャートを示す図である。 biotin-OMe (2) のTOF MS分析結果を示す図である。 MeNPOC-ONP (4) の1H-NMRチャートを示す図である。 回収サンプル（MeNPOC-biotin-OMe (5) 及び夾雑物）の1H-NMRチャートを示す図である。 回収サンプル（MeNPOC-biotin-OMe (5) 及び夾雑物）のTOF MS分析結果を示す図である。 MeNPOC-biotin-OH (6) の1H-NMRチャートを示す図である。 MeNPOC-biotin-OH (6) のMALDI-TOF MS分析結果を示す図である。 MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester Na (7) の1H-NMRチャートを示す図である。 MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester Na (7) のMALDI-TOF MS分析結果を示す図である。 UV照射による1H-NMRスペクトルの変化を示す図である。 HABA法によるビオチン定量の原理を示す図である。 HABA法によるD-biotin濃度を見積もりを示す図である。 MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester Naによる細胞染色及びUV照射有無によるAlexa Fluor-488標識ストレプトアビジン吸着量を比較した図である。 本技術に係る粒子染色方法の一例を示すフローチャートである。
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。
以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。

１．粒子標識用試薬
（１）上記一般式（Ｉ−１）で表される化合物
（２）上記一般式（Ｉ−２）で表される化合物
２．粒子染色方法
（１）一次標識工程
（２）二次標識工程
（３）その他の工程
３．顕微鏡システム１００
（１）粒子捕捉部１
（２）画像取得部２
（３）解析部３
（４）光照射部４
（５）粒子分取部５
（５−１）関連付け部
（５−２）粒子排出部
（５−３）識別情報取得部
（５−４）確認部
（５−５）その他
（６）観察部６
（７）制御部７
（８）記憶部８
（９）表示部９
１．粒子標識用試薬
本技術に係る粒子標識用試薬は、上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する。
本技術に係る粒子標識用試薬を用いて標識される粒子としては、例えば、細胞、微生物、生体由来固形成分、リポソーム等の生物学的微小粒子、ラテックスビーズ、ゲルビーズ、磁気ビーズ、及び量子ドット等の合成粒子等を挙げることができるがこれらに限定されない。また、前記細胞には、動物細胞及び植物細胞が含まれ得る。前記動物細胞としては、例えば、腫瘍細胞、血液細胞等を挙げることができる。前記微生物には、大腸菌等の細菌類、イースト菌等の菌類等が含まれ得る。前記生体由来固形成分としては、例えば、生体中で生成される固形物結晶類等を挙げることができる。前記合成粒子としては、例えば、有機若しくは無機高分子材料又は金属等からなる粒子であり得る。前記有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート等が含まれ得る。前記無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料等が含まれ得る。前記金属には、金コロイド、アルミ等が含まれ得る。また、粒子は、例えば、二つ、三つ等の複数の粒子の結合物であってもよい。更に、粒子は、二次元平面上に固着している必要はなく、浮遊性のものであってもよい。なお、本明細書では、染色されるべき粒子を「目的粒子」と称する。
本技術に係る粒子標識用試薬は、発光特性が低いため、当該試薬の蛍光と重なってバックグラウンドノイズが増大するという問題が生じない。したがって、次段の標識色素の利用波長範囲を狭めないという特徴がある。また、水溶性が高く、水への溶解に有機溶剤を必要としないため、粒子へのダメージ等も防ぐことができる。
（１）上記一般式（Ｉ）で表される化合物
上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数であるが、ｐは１〜２であることが好ましく、１であることがより好ましい。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。前記金属原子としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属；マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム等のアルカリ土類金属；アルミニウム、鉄等が挙げられる。本技術では、前記金属原子として、アルカリ金属が好ましく、本技術では、これらの中でも、ナトリウム、カリウムが好ましい。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）の基であるが、（ｐ＋１）価の基であることが好ましく、２〜３価の基であることがより好ましく、２価の基であることが更に好ましい。なお、本技術において、「単結合」とは、連結する置換基同士を直接結合するものである。
Ｌ１は、アミン反応性を有する（ｐ＋１）価の基であることが好ましい。前記アミン反応性を有する（ｐ＋１）価の基としては、Ｌ１と結合するカルボニル基を含めてアミン反応性を獲得していてもよく、具体的には、例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、NHS（N-ヒドロキシスクシンイミド）エステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物、フルオロエステル等を含む（ｐ＋１）価の基が挙げられる。
本技術では、これらの中でも、前記アミン反応性を有する（ｐ＋１）価の基として、スクシンイミド環を含む（ｐ＋１）価の基であることが好ましい。具体的には、例えば、下記一般式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）で表される基が挙げられる。なお、下記一般式（ＩＩＩ−１）〜（ＩＩＩ−３）中、＊は、上記一般式（Ｉ−１）中のカルボニル炭素との結合部位であり、＊＊は、上記一般式（Ｉ−１）中の硫黄原子との結合部位である。
上記一般式（ＩＩＩ−３）中、ｎは、ポリエチレングリコール鎖の繰り返し単位数を示し、１以上の整数である。本技術では、上記一般式（ＩＩＩ−３）に示すように、Ｌ１は、ポチエチレングリコール鎖を含む（ｐ＋１）価の基であるものとすることができる。ｎは、１〜１０００であることが好ましく、２〜５００であることがより好ましく、３〜２３０であることが更に好ましい。これにより、水溶液中での安定性を向上させることができる。
上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。このように、光分解性保護基を導入することで、光照射によってその活性をオン（又はオフ）にすることができる。
前記光分解性保護基は、２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基とすることが好ましい。前記２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基としては、例えば、上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかで表された１価の基とすることができる。なお、上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、＊は結合手である。
上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ１及びＲ６は、水素原子又は１価の基である。Ｒ１及びＲ６は、同一でも異なっていてもよい。前記１価の基としては、例えば、１価の鎖状炭化水素基（アルキル、アルケニル、アルキニル等）、１価の脂環式炭化水素基（シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル等）、１価の芳香族炭化水素基（フェニル、ナフチル等のアリール等）、１価の芳香族複素環基（ピレニル、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル等）、１価の非芳香族複素環基（オキシラニル、アジリジニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、ピロリジニル、ジヒドロフラニル、テトラヒドロフラニル等）、及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。
Ｒ１及びＲ６は、置換基を有していてもよく、前記置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等）、カルボキシ、スルホ、シアノ、ニトロ、メルカプト、オキソ、グアニジノ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキルカルボニルオキシ、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ（アミノ等）、アルキルでモノ若しくはジ置換されていてもよいアミノ−カルボニル（アミド等）等が挙げられる。
Ｒ１又はＲ６は、水素原子又は炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましく、水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましい。前記炭素数１〜５のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基等の直鎖状のアルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソアミル基等の分岐状のアルキル基等が挙げられる。
上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は１価の基であるか、又は、互いに結合して形成される環構造である。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同一でも異なっていてもよい。前記１価の基としては、Ｒ１及びＲ６の説明で述べたものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
前記環構造は、例えば、環員数３〜１０の環構造とすることができる。前記環員数３〜１０の環構造としては、例えば、シクロプロパン構造、シクロブタン構造、シクロペンタン構造、シクロヘキサン構造、ノルボルナン構造、アダマンタン構造等のシクロアルカン構造；オキサシクロブタン構造、オキサシクロペンタン構造、オキサシクロヘキサン構造、オキサノルボルナン構造、オキサアダマンタン構造等のオキサシクロアルカン構造；ベンゼン環構造、ナフタレン環構造等の芳香環構造等が挙げられる。これらの環構造には、前記置換基が結合していてもよい。また、前記環構造の炭素−炭素間に、−Ｏ−、−ＣＯＯ−、−ＳＯ２Ｏ−、−ＮＲａＳＯ２、−ＮＲａＣＯ−等が含まれていてもよい。ここで、Ｒａとしては、例えば、水素原子又は炭素数１〜１０の炭化水素基とすることができる。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群のいずれか一以上は、置換若しくは無置換のアルコキシ基であるか、又はＲ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群のいずれか二以上は、置換若しくは無置換のアルコキシ基が互いに結合して環構造を形成していることが好ましい。
上記一般式（ＩＩ−１）或いは（ＩＩ−２）中のＲ１と結合する炭素原子との結合部位、又は上記一般式（ＩＩ−３）中のＲ１と結合する窒素原子との結合部位には、2-Nitrobenzyl基、4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl基、2-Nitrophenethyl基、α-Carboxy-2-nitrobenzyl基、α-Methyl-4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl基、α-Methyl-6-nitro-piperonyl基からなる群より選ばれるいずれか一の基、又は下記一般式（ＩＶ）で表される基が結合していることが好ましい。なお、下記一般式（ＩＶ）中、＊は、上記一般式（ＩＩ−１）或いは（ＩＩ−２）中のＲ１と結合する炭素原子との結合部位、又は上記一般式（ＩＩ−３）中のＲ１と結合する窒素原子との結合部位である。
上記一般式（ＩＶ）中、ｎは、ポリエチレングリコール鎖の繰り返し単位数を示し、１以上の整数である。本技術では、上記一般式（ＩＶ）に示すように、上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中のＲ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群のいずれか一以上は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基であるものとすることができる。ｎは、１〜１０００であることが好ましく、２〜５００であることがより好ましく、３〜２３０であることが更に好ましい。これにより、水溶液中での安定性を向上させることができる。
上記一般式（Ｉ−１）で表される化合物の具体例を下記化学式（Ｉ−１―１）〜（Ｉ−１−４）に示す。
（２）上記一般式（Ｉ−２）で表される化合物
上記一般式（Ｉ−２）で表される化合物は、上記特徴に加えアミド結合を有するため、水溶液中で安定である。
上記一般式（Ｉ−２）におけるＬ２及びＬ３は、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。前記１価の基としては、１価の脂溶性官能基、又は１価のカチオン性官能基であることが好ましい。前記１価の脂溶性官能基としては、例えば、リン脂質を有する基、ステロイド骨格を有する基、飽和又は不飽和で直鎖状又は分枝状の炭化水素鎖を有する基等が挙げられる。
前記リン脂質を有する基としては、例えば、DLPE:1,2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DMPE:1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DPPE:1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DSPE:1,2-Distearoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine、DOPE:1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DLoPE:1,2-Dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine。DEPE:1,2-Dierucoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、POPE:1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineを含む基等が挙げられる。
前記ステロイド骨格を有する基としては、例えば、ステロール残基等である。前記ステロール残基としては、例えば、コレステロール、フィトステロール（α−、β−、又はγ−シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、スピナステロール、ブラシカステロールなど）、エストリオール、エストロン、アルドステロン、コルチコステロン、コルチゾン、コール酸、グリココール酸、シマリン、ルミステロール、コレスタノール（ジヒドロコレステロール）、β−シトスタノール（ジヒドロシトステロール）、スピナスタノール（ジヒドロスピナステロール）等のステロールのヒドロキシ基から水素原子を除いた基等が挙げられる。
また、本技術において、Ｌ４は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基であるものとすることができる。ポリエチレングリコース鎖の繰り返し単位数は、１〜１０００であることが好ましく、２〜５００であることがより好ましく、３〜２３０であることが更に好ましい。これにより、水溶液中での安定性を向上させることができる。
前記１価のカチオン性官能基としては、例えば、スペルミジン、スペルミン、直鎖型又は分岐型のポリエチレンイミン、アミノエチルアクリルポリマー（ポリメント（登録商標）；日本触媒株式会社製）、塩基性アミノ酸（リシン、アルギニン、オルニチン、シトルリン等）のアルキルエステルを含む基等とすることができる。また、本技術では、Ｌ４がこれらの官能基を含む場合、上記一般式（Ｉ−２）で表される化合物は、塩であってもよく、例えば、これらの塩酸塩、臭素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機塩、グリコール酸塩、酢酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、酸性アミノ酸塩等の有機酸塩等とすることができる。
具体的には、例えば、下記一般式（Ｖ−１）〜（Ｖ−９）のいずれかで表された１価の基とすることができる。なお、下記一般式（Ｖ−１）〜（Ｖ−９）中、＊は、上記一般式（Ｉ−２）中の窒素原子との結合部位である。
上記一般式（Ｖ−５）中、ｘ、ｙ、及びｚは、１以上の任意の整数である。また、上記一般式（Ｖ−６）〜（Ｖ−９）中、Ｒｂは、１価の基である。前記１価の基としては、Ｒ１及びＲ６の説明で述べたものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。Ｒｂは、炭素数１〜５のアルキル基であることが好ましく、炭素数１〜３のアルキル基であることがより好ましい。
上記一般式（Ｉ−２）で表される化合物の具体例を下記化学式（Ｉ−２−１）〜（Ｉ−２−１４）に示す。
上記一般式（Ｉ−２−５）中、ｘ、ｙ、及びｚは、１以上の任意の整数である。上記一般式（Ｉ−２−１０）〜（Ｉ−２−１４）中、ｎは、ポリエチレングリコール鎖の繰り返し単位数を示し、１以上の整数である。また、ｍは、１以上の整数である。
２．粒子染色方法
本技術に係る粒子染色方法は、一次標識工程と、二次標識工程と、を行う。また、必要に応じてその他の工程が行われてもよい。以下、各工程について詳細に説明する。
（１）一次標識工程
一次標識工程は、目的粒子を上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色し、染色された目的粒子に光を照射する工程である。前記粒子標識用試薬については、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
染色された目的粒子に照射される光（ケージ解除光）としては、例えば、前記光分解性保護基を分解させるために適当な波長及び強度のレーザー光が用いられる。レーザー光源には、例えば、従来公知のフローサイトメータが備えるレーザー光と同様の光源を用いることができ、水銀ランプやキセノンランプ、各種レーザー光源（固体レーザー、ガスレーザー、半導体レーザー等）を用いることができる。また、レーザー光の波長は、３００〜４５０ｎｍであることが好ましい。
本技術において、一次標識工程は、光の照射により前記光分解性保護基が分解し、ビオチンがビオチン結合タンパク質と結合可能な状態となる結合可能化工程を更に含んでいることが好ましい。前記ビオチン結合タンパク質としては、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン様タンパク質等が挙げられる。本技術において、これらのビオチン結合タンパク質は、後述するように、色素標識されたものである。
結合可能化工程では、図１に示すように、任意の領域（例えば、ウェル毎の領域）に対してのみ光の照射を行って一部の粒子に対してのみケージ解除させ、局所的にビオチン結合タンパク質との親和性を向上させることができる。これにより、目的とする範囲に存在する粒子のみに色素標識されたビオチン結合タンパク質が吸着し、位置選択的な粒子標識が可能となる。また、後述する粒子分取工程を行う場合、光学的に粒子を選別することも可能となる。
（２）二次標識工程
二次標識工程は、一次標識工程を経た目的粒子に色素標識されたビオチン結合タンパク質にて染色する工程である。
用いることができる色素は、発光特性を有する色素であり、具体的には、例えば、CF Dyes（Biotium, Inc.）、DY（Dyomics GmbH）、DyLight Fluor（Dyomics GmbH）、Alexa Fluor（Thermo Fisher Scientific）、BD Horizon Brilliant（Sirigen, BD Biosciences）、Cy（GE Healthcare）、HyLyte Fluor、CyLyte Fluor（Anaspec, Inc）、ADS（American Dye Source, Inc.）、ATTO（ATTO-TEC GmbH）、IRDye（Li-COR Biosciences）、Pacific Blue、Pacific Green、Pacific Orange（Thermo Fisher Scientific）、Texas Red（Thermo Fisher Scientific）、eFluor（Thermo Fisher Scientific）、FireTM（BioLegend）、NorthernLights（NorthernLights）、MFP（MoBiTec）、Tide Fluor（AAT Bioquest, Inc.）、CAL Fluor（LGC Biosearch Technologies）、Abberior STAR（Abberior）、Fluoid（アイエスティー）、FAM、FITC、TRITC、Rhodamine Green、Rhodamine Green-X、Lucifer Yellow、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、ABY、JUN、ROX、LIZ、NED、PET、HEX、Quasar、Dragonfly orange，TAMRA，FAR-Fuschia、LC Red、PULSAR、WellRed、FAR-Blue、FAR-Green、IRIS-Green One、Spectrum Green、Spectrum Red、ECD、EDANS、aminomethylcoumarin (AMCA)、AMCA-X（AdipoGen）、BODIPY、BODIPY FL、BODIPY FL-X、Royal Blue、Marina blue、Oyster（Luminartis）、Oregon Green、Cascade Blue（Thermo Fisher Scientific）又はこれらのタンデム構造や混合物等が挙げられる。
また、前記色素は、蛍光タンパク質であってもよく、具体的には、例えば、GFP、mCherry、Phycoerythrin（PE）、Phycocyanin（PC）、Allophycocyanin（APC）、Peridinin-Chlorophyll Protein Complex（PerCP）等とすることができる。更に、前記色素は、前記ビオチン結合タンパク質で表面を覆われた半導体量子ドットとすることができ、具体的には、例えば、Ag2S、AgInS2、CuInS2、又はこれらをコアとし、ZnSを外殻とするコアシェル構造を有する量子ドット等とすることができる。
また、前記色素は、後述する粒子分取工程を行う場合、フローサイトメータで通常使用している光源の波長で励起可能な色素を用いることができる。これにより、高速に粒子の回収を行うことができる。
本技術において、前記ビオチン結合タンパク質や前記色素は、酵素が結合したものであってもよく、酵素の発光基質であってもよい。
本技術では、一次標識工程と二次標識工程とを繰り返し行い、図２に示すように、異なる二次標識工程におけるビオチン結合タンパク質は、異なる色素で標識されたものとすることができる。これにより、例えば、任意の異なる領域に存在する目的粒子同士を異なる色素で染め分けることができ、複数色での識別を実現することができる。また、後述する粒子分取工程を行う場合、光学的に粒子を選別することも可能となる。
（３）その他の工程
本技術に係る粒子染色方法は、必要に応じてその他の工程を行ってもよい。具体的には、例えば、粒子捕捉工程、解析工程、粒子分取工程等である。これらの工程は、それぞれ、後述する顕微鏡システム１００の、粒子捕捉部１、解析部３、粒子分取部５にて行われる方法と同様であるため、ここでは説明を割愛する。更に、後述する実施例に示すように、洗浄工程等も適宜行うことができる。
３．顕微鏡システム１００
図３は、本技術に係る顕微鏡システム１００のブロック図である。本技術に係る顕微鏡システム１００は、粒子捕捉部１と、画像取得部２と、解析部３と、を有し、解析部３により解析された目的粒子は、上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色されたものである。また、本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて照射部４、粒子分取部５、観察部６、制御部７、記憶部８、表示部９等を有していてもよい。前記粒子標識用試薬については、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
（１）粒子捕捉部１
粒子捕捉部１は、粒子捕捉領域中のウェルに目的粒子を捕捉する。粒子捕捉部１は、例えば、ウェルの粒子の入り口側の面と、該面と対向する面とから構成される板状部材で構成することができる。前記板状部材の厚みは、ウェルの深さや板状部材の材料の強度などにより適宜設定することができる。
粒子捕捉部１を形成する材料としては、例えば、紫外線硬化性樹脂、特に、３Ｄ光造形法に適用可能な樹脂等が挙げられる。前記樹脂としては、例えば、シリコーンエラストマー、アクリル系オリゴマー、アクリル系モノマー、エポキシ系オリゴマー、エポキシ系モノマー等から選ばれる１種又は２種以上を含む樹脂組成物を紫外線硬化することにより得ることができる。また、マイクロ流路の技術分野において、一般に用いられる材料が用いられていてもよく、前記材料としては、例えば、ガラス（硼珪酸ガラス、石英ガラス等）、プラスチック樹脂（アクリル系樹脂、シクロオレフィンポリマー、ポリスチレン等）、ゴム素材（ＰＤＭＳ等）等が挙げられる。粒子捕捉部１が、複数の部材から構成される場合、当該複数の部材は同じ材料から形成されてもよく、異なる材料を組み合わせて形成されてもよい。
本技術に係る顕微鏡システム１００において、粒子捕捉部１は取り替え可能とすることができる。
粒子捕捉領域中のウェルは、一つの粒子（好ましくは、細胞）を捕捉可能であるような形状とすることができる。例えば、ウェルにおける粒子の入り口の形状は、円形、楕円形、多角形（三角形、四角形等）、五角形、六角形等に形成することができる。
ウェルの配置は特に限定されず、粒子捕捉部１の形態や粒子捕捉後の目的に応じて、自由に設計することができる。例えば、所定の間隔で一列に又は複数列に配置したり、所定の間隔で格子状に配置することができる。この場合の間隔としては、施与される粒子の数及び捕捉されるべき粒子の数等によって、適宜選択することができる。例えば、２０μｍ〜３００μｍ、好ましくは３０μｍ〜２５０μｍ、より好ましくは４０μｍ〜２００μｍ、更に好ましくは５０μｍ〜１５０μｍの間隔に設計することができる。また、ウェルの数も特に限定されず、目的に応じて自由に設定することができる。
ウェル内に捕捉された粒子は、目的に応じて観察、各種反応や各種測定等が行われる。
（２）画像取得部２
画像取得部２は、前記捕捉された目的粒子の画像を取得する。画像取得部２は、具体的には、対物レンズ等を介して粒子捕捉面を撮像できるように構成される。画像取得部２は、例えば、ＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）等のイメージセンサを含む。また、画像取得部２は、後述する解析部３に画像を送信できるように構成されている。
（３）解析部３
解析部３は、画像取得部２より取得された目的粒子の画像を解析する。また、解析部３は、上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色された目的粒子を解析する。解析部３は、具体的には、画像取得部２から送信された画像に基づいて、粒子の特徴量を算出し、この特徴量に基づいて、粒子の形態、構造、性質等を解析することができる。
解析部３は、パーソナルコンピュータや、ＣＰＵにて実施してもよく、記録媒体（不揮発性メモリ（ＵＳＢメモリ）、ＨＤＤ、ＣＤ等）を備えるハードウェア資源にプログラムとして格納し、パーソナルコンピュータやＣＰＵによって機能させることも可能である。また、解析部３は顕微鏡システム１００の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（４）光照射部４
本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて光照射部４を有していてもよい。光照射部４は、光を照射し、これにより、前記染色された目的粒子は一次標識され、前記一次標識された目的粒子は色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合可能となる。染色された目的粒子に照射される光としては、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
（５）粒子分取部５
本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて粒子分取部５を有していてもよい。粒子分取部５は、粒子を分取し、前記色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合した前記目的粒子を分取する。また、目的粒子の中から更に選別を行うこともできる。
粒子分取部５は、例えば、関連付け部、粒子排出部、識別情報取得部、及び確認部から構成することができる。以下、各部について詳細に説明する。
（５−１）関連付け部
関連付け部は、粒子捕捉領域中のウェルに捕捉された粒子が有する識別情報とウェルの位置情報とを関連付ける。すなわち、当該関連付け部において、識別情報を有する粒子と当該粒子が捕捉されているウェルの位置とが紐付けられる。関連付けられた前記識別情報及び前記位置情報は、後述する確認部において用いられる。
前記関連付けは、機械的に行われてよく、又は、前記粒子捕捉領域を利用して粒子分取操作を行うユーザーにより行われてもよい。機械的に前記関連付けが行われる場合、例えば、関連付けを行うシステムにより行われてよい。当該システムは、本技術に係る顕微鏡システム１００に含まれる解析部３及び／又は制御部７に含まれ得る。
ここでいう「識別情報」とは、或る粒子を他の粒子から識別するために用いられる情報であってよく、又は、粒子を同定するために用いられる情報であってもよい。当該識別又は当該同定は、例えば、粒子の種類又は特徴に基づき行われ得る。識別情報は、より具体的には、ウェル内に捕捉された粒子の蛍光、色、電荷、磁荷、若しくはラジカルに基づく情報、又は、ウェル内に捕捉された粒子の形態若しくはサイズに関する情報であってよい。識別情報として、これらの情報の２以上の組み合わせが用いられてもよい。
また、ここでいう「位置情報」とは、粒子が捕捉されているウェルの位置に関する情報であり得る。位置情報は、例えば、顕微鏡観察下での１視野内における粒子が捕捉されているウェルの位置に関する情報であってよく、又は、顕微鏡観察下での１視野内における粒子の位置に関する情報であってもよい。位置情報は、例えば、粒子捕捉領域内における粒子が捕捉されているウェルの位置に関する情報であってよく、又は、粒子捕捉領域内における粒子の位置に関する情報であってもよい。位置情報は、座標系の位置情報であってよく、又は、非座標系の位置情報であってもよい。
関連付け部は、画像取得部２において取得された画像を用いて関連付けを行ってもよい。当該画像から、ウェル内に捕捉された粒子の識別情報及び当該ウェルの位置情報が取得され、そして、当該識別情報及び当該位置情報が関連付けられ得る。当該画像から取得される識別情報は、例えば、粒子の蛍光、色、又は、粒子の大きさ若しくは形であり得る。
（５−２）粒子排出部
粒子排出部は、目的粒子が捕捉されているウェルに対してレーザー光又は超音波を照射し、当該レーザー光又は超音波の照射によりウェル内に気泡が発生することで、目的粒子をウェルから排出する。具体的には、例えば、水の光吸収波長近傍の発振波長を有するレーザー（例えば、ホルミウムヤグ（Ho:YAG）レーザー）を利用し、短時間で大きなエネルギーを水に与えることで、気泡を発生させる。代替的には、マイクロマニュピレータ又はマイクロピペット等の粒子操作装置等を用いることもできる。
また、粒子排出部として、粒子捕捉領域のウェルを封止するシートが用いられてもよい。具体的には、粒子捕捉後に、当該シートによって、粒子捕捉領域内のウェルが封止される。次に、目的粒子を捕捉しているウェルを覆うシート部分だけに穴が開けられ、当該ウェルから目的粒子が排出される流れが形成される。これにより、他の粒子をウェル内に捕捉したまま、目的粒子をウェルから排出することができる。当該穴を開けることを可能とするために、当該シートは、例えば、光線（例えば、赤外線等）吸収性材料から形成されていてよい。当該シート部分に、光線を照射することで、前記穴が開けられる。
粒子排出部により目的粒子がウェルから排出される際に、識別情報を有する複数の粒子が連続して排出され得る。例えば、識別情報を有する２〜１００個の粒子、特には２〜５０個、より特には２〜３０個の粒子が連続して排出され得る。これにより、連続して排出された当該複数の粒子の識別情報の順序を、後述する確認部で確認することができる。
この場合、本技術では、同じ識別情報を有する粒子が連続して排出されないように行われてよい。すなわち、連続して排出される２つの粒子が互いに異なる識別情報を有するように、前記排出が行われ得る。例えば、赤色の蛍光を有する粒子、青色の蛍光を有する粒子、そして次に、赤色の蛍光を有する粒子がこの順に排出され得る。このような排出される粒子の識別情報の順序が、以下の確認において、例えば、識別情報取得部において取得された識別情報の順序と比較され得る。本技術では、このように、前記排出において連続して排出される２以上の粒子が異なる識別情報を有してよい。代替的には、前記排出は、同じ識別情報を有する粒子が連続して排出されるように行われてよい。例えば、赤色の蛍光を有する粒子が連続して３つ排出され得る。同じ識別情報を有する粒子が連続して排出されていることも、以下の確認において、解析部３にて取得された識別情報の順序と比較され得る。
また、ウェルから排出された粒子は、粒子捕捉領域周辺に形成された流体の流れによって、当該粒子捕捉領域が配置されている空間と流体的に接続された流路へと導かれ、当該流路を通って粒子回収用の容器内又はプレートに回収されてもよい。代替的には、ウェルから排出された粒子は、マイクロピペットに接続された流路内を移動させて当該流路と接続された粒子回収用の容器内又はプレート上に回収されてよく、又は、マイクロマニュピレータによって粒子回収用の容器内又はプレート上へと移動されてもよい。更に、当該容器内において又は当該プレート上で、更なる粒子の分析が行われてもよい。例えば、粒子が細胞である場合、当該容器又は当該プレートにおいて細胞の分析又は培養が行われてもよい。
（５−３）識別情報取得部
識別情報取得部は、粒子の識別情報を取得する。識別情報取得部での情報の取得は、前記排出後に行われる。すなわち、本技術において、粒子の識別情報は、関連付け部及び識別情報取得部の異なる２つの部においてそれぞれ取得される。前者においては、粒子はウェル内に捕捉され、後者においては、粒子はウェルの外にある。このように、ウェル内に捕捉された粒子の識別情報とウェルから排出された後の粒子の識別情報とを取得することで、目的粒子が分取されたかを確認できる。
識別情報取得部は、例えば、顕微鏡等により、１つのウェルに回収された粒子の識別情報が取得され得る。代替的には、流路を通過している粒子から識別情報が取得されてもよい。例えば、流路を通過している粒子に対する光照射により生じた蛍光及び／又は散乱光が、識別情報として取得され得る。このように識別情報を取得するためには、例えば、フローサイトメータ又はセルソータにおいて利用されている光検出技術を適用することができる。
（５−４）確認部
確認部は、取得された前記識別情報に基づいて、前記粒子が、前記位置情報を有するウェルに捕捉されていたかを確認する。例えば、当該確認部において、識別情報取得部において取得された前記識別情報に基づいて前記粒子が捕捉されたウェルの位置が確認され得る。
前記確認は、機械的に行われてよく、又は、前記粒子捕捉領域を利用して粒子分取操作を行うユーザーにより行われてもよい。機械的に前記確認が行われる場合、本技術に係る顕微鏡システム１００に含まれる解析部３及び／又は制御部７により行われてよい。
前記確認において、識別情報を有する複数の粒子の排出の順序が参照され得る。例えば、連続した所定数の粒子群に関して、前記排出で排出された粒子の識別情報の順序と、前記識別情報取得部で取得された粒子の識別情報の順序が異なる時、当該粒子群が廃棄され得る。例えば、前記排出において赤色の蛍光を有する粒子、青色の蛍光を有する粒子、赤色の蛍光を有する粒子がこの順番で排出され、そして、識別情報取得部において赤色、赤色、及び青色という識別情報が取得された場合を想定する。この場合、確認部において、前記排出における排出の順序と識別情報取得部において取得された蛍光の順序とが比較され、両者が異なることが確認され得る。これにより、確認部において、目的粒子が取得されていないことが確認され得る。また、前記排出において赤色の蛍光を有する粒子が連続して３つ排出され、そして、識別情報取得部において赤色、青色、及び赤色という識別情報が取得された場合も想定される。この場合、確認部において、前記排出における排出の順序と、識別情報取得部において取得された蛍光の順序とが比較され、両者が異なることが確認される。これにより、確認部において、目的粒子が取得されていないことが確認され得る。取得された粒子群が目的粒子でないと確認された場合、当該取得された粒子は廃棄され得る。
また、確認部において、識別情報取得部において取得された識別情報と関連付け部において取得された識別情報とが比較され得る。当該比較の結果、これらの識別情報が一致する場合は、識別情報取得部において識別情報が取得された粒子が、関連付け部における関連付けの対象となった粒子と同じであることが確認され得る。関連付け部における関連付けの対象となった粒子に関して識別情報と位置情報とが関連付けられているので、識別情報取得部において識別情報が取得された粒子が、関連付け部において関連付けられた位置情報を有するウェルに捕捉されていたことが確認され得る。当該比較の結果、これらの識別情報が一致しない場合は、識別情報取得部において識別情報が取得された粒子が、関連付け部における関連付けの対象となった粒子と同じでないことが確認され、更には、関連付け部において関連付けられた位置情報を有するウェルに捕捉されていなかったことが確認され得る。
確認部において、分取されるべき粒子が分取されなかったことが確認された場合は、ウェルに回収された粒子は廃棄されてもよい。代替的には、粒子がウェルに回収されずに、当該粒子は廃棄されてもよい。
（５−５）その他
また、粒子分取部５は、従来公知のフローサイトメータ等から構成することもできる。具体的には、目的粒子を含むサンプル液をフローセル中に流し、レーザー光を照射して、粒子から発生する測定対象光を検出する。測定対象光としては、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光等とすることができる。検出された測定対象光は電気信号に変換され、この電気信号に基づいて粒子の分取操作が行われる。
従来、二次元表面上の細胞アレイから全細胞を回収すると、元の位置情報が失われてしまうという問題が生じていたが、本技術では、前記色素を用いて目的粒子を標識しており、粒子分取部５による分取が行われたとしても、前記色素に基づき粒子捕捉部１における元の位置情報を確認することができる。また、前記粒子標識用試薬にて染色する一次標識と、この一次標識を得た目的粒子を色素標識されたビオチン結合タンパク質にて染色する二次標識と、繰り返しを行い、異なる色素で複数の目的粒子を標識することで、目的粒子毎の位置情報も把握することができる。
（６）観察部６
本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて観察部６を有していてもよい。観察部６では、ウェル内に捕捉された粒子の観察が行われる。ウェル内に捕捉された粒子を観察することで、粒子の形状、構造、色等や、粒子から生じる蛍光等の光の波長、強度等の情報を得ることができる。観察部６は、具体的には、顕微鏡や光検出器等により構成することができる。前記顕微鏡としては、倒立顕微鏡であることが好ましい。また、前記顕微鏡は、光学顕微鏡であることが好ましい。すなわち、本技術に係る顕微鏡システム１００において、観察部６としては、倒立型の光学顕微鏡を用いることが好ましい。
また、観察部６には、各種光源、各種レンズ、各種フィルター、各種ミラー等を備えることもできる。
（７）制御部７
本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて制御部７を有していてもよい。制御部７では、粒子捕捉部１への粒子及び流体の供給制御、粒子捕捉部１からの粒子及び流体の排出制御、画像取得部２における画像取得条件の制御、光照射部４における照射条件の制御、粒子分取部５における粒子分取条件の制御、観察部６における観察条件の制御、解析部３における解析条件の制御等、顕微鏡システム１００に備えられた各部の制御を行うことができる。
なお、本技術に係る顕微鏡システム１００では、制御部７は必須ではなく、外部の制御装置等を用いて、各部の制御を行うことも可能である。また、制御部７は、顕微鏡システム１００の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（８）記憶部８
本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて各種情報を記憶する記憶部８を有していてもよい。記憶部８には、粒子捕捉部１における粒子の捕捉状態に関わる情報データ、画像取得部２で取得された画像データ、粒子分取部５で分取された粒子のデータ、観察部６で取得された観察データ、解析部３で解析された解析データ、制御部７における制御データ等、顕微鏡システム１００の各部で得られる様々なデータや条件等を記憶することが可能である。
なお、本技術に係る顕微鏡システム１００では、記憶部８は必須ではなく、外部の記憶装置等を用いて、各種情報の記憶を行うことも可能である。記憶部８としては、例えば、ハードディスク等を用いることができる。また、記憶部８は、顕微鏡システム１００の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
（９）表示部９
本技術に係る顕微鏡システム１００は、必要に応じて各種情報を表示する表示部９を有していてもよい。表示部９には、粒子捕捉部１における粒子の捕捉状態に関わる情報データ、観察部６で取得された観察データ、解析部３で解析された解析データ、制御部７における制御データ等、顕微鏡システム１００の各部で得られる様々なデータや条件等を表示することができる。
なお、本技術に係る顕微鏡システム１００では、表示部９は必須ではなく、外部の表示装置等を用いて、各種情報の表示を行うことも可能である。表示部９としては、例えば、ディスプレイやプリンタ等を用いることができる。また、表示部９は、顕微鏡システム１００の各部とネットワークを介して接続されていてもよい。
以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。
なお、以下に説明する実施例は、本発明の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
＜＜実施例１＞＞
本実施例１では、MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester soduim saltの合成を行った。本合成スキームを、図４に示す。
［biotin-OMe (2) の合成］
二口ナスフラスコ50 mL内を窒素置換した後、MeOH（脱水）13.3 mLを注入し、氷冷した。次にacetyl chloride 533 μL（7.5 mmol）をナスフラスコへ1滴ずつ滴下した。氷水を除いて室温下で5分撹拌した後、MeOH（脱水）13.3 mLに懸濁させたD-biotin (1) 979 mg（4.0 mmol）をガラスパスツールを用いてナスフラスコへ添加した。室温、窒素ガス注入下で1時間30分撹拌し、100 mLナスフラスコへ移し替えて溶媒を40℃で減圧留去した。続いて、分液操作を行った。残渣を200 mL分液漏斗に移し、5% (v/v) MeOH/CH2Cl2 50 mLと飽和NaHCO3/H2O（>9.6 g/100 mL H2O at 20℃） 50 mLを加えて撹拌し、二層に分かれるまで静置した（約10分）。下層（CH2Cl2層）を100 mLコニカルビーカーに回収した。残った水層に5% (v/v) MeOH/CH2Cl2 50 mLを加えて再び撹拌・静置し、下層（CH2Cl2層）を回収した。回収液にNa2SO4を加えて30分撹拌し、濾過して残留水分を除いた。溶媒を40℃で減圧留去し、デシケーター内で1時間真空乾燥させ白色の乾燥固体を得た。生成物を1H-NMR測定及びTOF MSにて確認した（図５及び６参照）。収量は988 mg、収率は95.7%であった。
［MeNPOC-ONP (4) の合成］
二口ナスフラスコ50 mLにα-methyl-6-nitropiperonyl alcohol (3) 211 mg（1.0 mmol）及び4-nitrophenyl chloroformate 403 mg（2.0 mmol）を加え、氷上で窒素置換した。CH2Cl2（脱水）10 mLを加え、氷上で15分撹拌した。TEA 550 μL（4.0 mmol）を加え、氷上で更に15分撹拌した。続いて、室温で一晩（14時間）撹拌した。反応溶液を液体クロマトグラフィー（溶出溶媒：ヘキサン：CH2Cl2＝ 20：80 (w/w)）にて精製した。分取したサンプルを100 mLナス型フラスコ回収し、減圧留去した。デシケーター内で一晩真空乾燥して白色固体を得た。生成物を1H-NMR測定にて確認した（図７参照）。収量は340 mg、収率は90.4%であった。
［MeNPOC-biotin-OMe (5) の合成］
二口ナスフラスコ50 mLにbiotin-OMe (2) 258.1 mg（1.0 mmol）及びMeNPOC-ONP (4) 188 mg（0.5 mmol）を入れ、氷上で窒素置換した。脱水THF 10 mLを加え、氷上で15分間撹拌した。次にNaH 42 mg（1.05 mmol）を加え、氷上で30分間撹拌した後、室温で更に6時間撹拌した。15分氷冷した後、残留NaHを酢酸120 μL（2.1 mmol）でクエンチした。反応液を濾過し、濾液を100 mLナスフラスコに回収した。溶媒を30℃で減圧留去し、デシケーター内で1時間30分真空乾燥して黄色の粘稠固体を得た。2% (v/v) MeOH/CH2Cl2 5 mLに再溶解させ、液体クロマトグラフィー（溶出溶媒：MeOH：CH2Cl2＝ 1：99 (w/w)）にて精製した。以下に溶出条件を示した。分取したサンプルを100 mLナス型フラスコに回収し、減圧留去した。デシケーター内で一晩真空乾燥した。生成物を1H-NMR測定及びTOF MSにて確認した（図８及び９参照）。収量は120 mgであった。
［MeNPOC-biotin-OH (6) の合成］
MeNPOC-biotin-OMeを含む回収サンプル約118 mgを0.5 M HCl/H2O/50% (v/v) THF 10 mLに溶解させ、三ツ口フラスコ50 mLに移した。オイルバス中45℃で窒素ガスを送気しながら23時間撹拌した。THFを減圧留去した後、超純水を10 mL加え、一晩（16時間）凍結乾燥した。続いて、サンプルを50% (v/v) CH3CN/H2O 2.5 mLに再溶解させ、液体クロマトグラフィーにて精製した。分取したサンプルを100 mLナス型フラスコに回収し、減圧留去した。凍結乾燥により黄白色固体を得た。生成物を1H-NMR測定及びMALDI-TOF MSにて確認した（図１０及び１１参照）。収量は65 mgであった。加水分解前のサンプルが混合物のため、収率は算出しなかったが、MeNPOC-ONP (4) から換算すると27%であった。
［MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester sodium salt (7) の合成］
MeNPOC-biotin-OH (30 mg, 0.05 mmol)を脱水アセトニトリル（AcCN） 10 mL中で撹拌し、DIC 23.3 μL (0.15 mmol)とN-hydroxysulfosuccinimide-Na（sulfo-NHS） 32.6 mg (0.15 mmol)を加え、室温で24時間撹拌した。余剰のsulfo-NHSをろ過により取り除いた後、溶媒を減圧留去した。CH2Cl2を10 mL加えて静置し、沈殿物をろ過して回収した。サンプルを真空乾燥した後、1H-NMR測定及びMALDI-TOF MSにて生成物を確認した（図１２及び１３参照）。収量は9.3 mg、収率は27%であった。
＜＜実施例２＞＞
本実施例２では、1H-NMRによるMeNPOC biotin-OHの光分解特性評価を行った。
＜評価方法＞
MeNPOC-biotin-OHをDMSO-d6に溶解し、0.566 mMに調整した。NMR試料管2本に700 μLずつ分注し、それぞれUV照射用とUV非照射用とした。UV照射距離は5 cmとした（LEDヘッド先端から5 cmにおける光強度は約17 mW/cm2）。同一サンプルに対してUV照射と1H-NMR測定を繰り返し行った。合成したMeNPOC-biotin-OHの光分解特性を1H-NMRにより評価した。MeNPOC-biotin-OHをDMSO-d6に溶解後、UV（λp＝365 nm）を一定時間照射した。
＜評価結果＞
UV照射前後の1H-NMRスペクトルを図１４に示した。ピークa, b, c及びdが減少し、新たにピークa’及びd’が出現した。a’はD-biotinのチオフェン環上9位のプロトン、d’はウレイド環上3’位のアミンプロトンのケミカルシフトとそれぞれ一致しており、光分解によってD-biotinが生成したものと考えられる。
＜＜実施例３＞＞
本実施例３では、HABA法による光分解に伴うD-biotin生成量の定量的評価を行った。
＜評価方法＞
D-biotinの比色定量法であるHABA法（Green, NM., Methods Enzymol, 18-A, 418 （1970））により、MeNPOC-biotin-OH へのUV照射前後におけるD-biotinの生成量を評価した。はじめに、D-biotinを用いて検量線を作成した。D-biotin 4.4 mgをDMSO 2.2 mLに溶解し、溶液0.5 mLを0.01 M PBS（K不含） 4.5 mLと混合して0.82 mM D-biotin/10% (v/v) DMSO/PBS（K不含）を調製した。更に10% (v/v) DMSO/PBS（K不含）で100 μM, 75 μM, 50 μM, 25 μM及び10 μMに調整した。HABA 14.5 mg（6.0×10-2mmol）をDMSO 518 μLに溶解させた。Avidin 4.8 mg（72.7 mmol）、PBS（K不含） 9.504 mL及びHABA/10% (v/v) DMSO 96 μLを混合した（[avidin (monomer)]＝ 30.3 μM, [HABA]＝ 1.16 mM）。HABA/avidin/DMSO/PBS（K不含） 630 μLとD-biotin/10% (v/v) DMSO/PBS（K不含） 70 μLを混合後、5分以上静置した。Pst製96ウェルプレート（cat.#2-8085-02, Asone）へ200 μL/well、一濃度につき3 wells分滴下し、吸光度（500 nm）を測定した。UV照射条件としては、COCフィルムボトム96ウェルプレート（cat.#4680, Corning）に100 μL滴下し、底面から5 cmの距離からUV光を照射した。照射時間は10分及び20分とした。ウェルプレートよりサンプルを回収し、D-biotinと同様にしてHABA/avidinと混合後、吸光度を測定した。MeNPOC-biotin-OHの光分解により、D-biotinが生成し、avidinと結合する過程をHABA法（図１５参照）により間接的に評価した。HABA法とは、avidinに対するHABAとD-biotinの親和性（解離定数）の差（下記表１参照）を利用したbiotin定量法である。HABAは、avidinと複合体を形成している際には500 nmに吸収を持つが、遊離するとモル吸光係数が低下することが知られている。D-biotin存在下ではHABAはD-biotinに置換されることから、500 nmの吸光度の変化からD-biotin量を見積もることができる。
＜評価結果＞
今回、HABA法を用いて、MeNPOC-biotin-OHから光分解によって生成するD-biotin量を推定したところ、D-biotinを用いた検量線では、D-biotinに換算すると光照射前は5.1±1.6 μMと、光照射10分後は75.7±1.8 μMであった（図１６参照）。分解濃度は初期濃度（81 μM, TFA塩として換算）と凡そ一致しており、ほぼすべて分解したことが示唆された。
＜＜実施例４＞＞
本実施例４では、MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester soduim saltを用いたJurkat細胞の染色、及びUV照射による蛍光標識ストレプトアビジンの吸着量変化について検討した。
＜試験方法＞
ヒト白血病T細胞株であるJurkat細胞3.0×106 cells/PBS (-) 1 mLを1.5 mLエッペンドルフチューブに調製し、200×gで5分遠心した。上澄みを除去し、50 μM MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester・Na/PBS溶液 1 mLを添加した。アルミホイルで遮光し、室温で20分間静置した。200×gで5分遠心して上澄みを除去した。PBS (-) 1 mLに再懸濁し、再度200×gで5分遠心して上澄みを除去した。PBS (-) を加えて細胞計数盤にて細胞濃度を計測後、1.5×105 cells/mLに調整した。細胞を1%BSAで一晩浸らせていたCOCフィルムボトム96ウェルプレートに0.1 mL/well滴下し、120×gで1分遠心して細胞をウェル底面に沈降させた。続いて、UV-LED（LED365-SPT, オプトコード, λp ＝ 365 nm, 約17 mW/cm2）を用いてUV光をウェル底面側から10分間照射した。比較として、UV光を照射しないサンプルについては10分間静置した。細胞懸濁液をウェルから回収し、PBSを加えて0.8 mLに調整した後、50 μg/mL streptavidin conjugated with AlexaFluor488/PBSを200 μL添加した。室温で10分間静置した後、200×gで5分遠心して上澄みを除去した。PBS (-) 1 mLに再懸濁し、再度200×gで5分遠心して再び上澄みを除去した。細胞をPBS 0.5 mLに再懸濁し、COCフィルムボトム96ウェルプレートに0.1 mL/well滴下した。120×gで1分遠心した後、蛍光顕微鏡（IX-71, Olympus）にて細胞を観察した（ミラーユニット：WIB, Ex：460〜490 nm/Em：510 nm〜, 対物レンズ40倍）。
＜試験結果＞
UV照射の有無により、蛍光強度が変化している様子が観察された（図１７参照）。これは光分解によりbiotinが露出し、そこに蛍光標識ストレプトアビジンが吸着しやすくなったためと考えられる。
＜＜実施例５＞＞
実施例５では、本技術に係る顕微鏡システム１００を用いて行われる、本技術に係る粒子染色方法の一例について説明する。
図１８は、本技術に係る粒子染色方法の一例を示すフローチャートである。まず、粒子捕捉部１により、細胞等の粒子が一つずつ捕捉される（S101）。その後、観察部６により、ウェル内に捕捉された粒子の観察を行う（S102）。次いで、MeNPOC-biotin-sulfo-NHS ester soduim salt（ケージドビオチンsulfo-NHS ester）により一次染色を行う（S103）。その後、洗浄を行う（S104）。次いで、光照射部４により、任意のウェルに対してケージ解除のための光を照射する（S105）。その後、洗浄し（S106）、蛍光標識ストレプトアビジンにより染色を行う（S107）。次いで、洗浄する（S108）。
更に、異なる他の色素を用いて染色を行う場合（S109）、S105に戻り、前回照射したウェルとは異なるウェルに対してケージ解除の光を照射し、S105〜S109の工程を繰り返す。
色素での染色が完了した場合（S109）、この色素で標識された細胞について解析部３により、解析を行う（S110）。なお、解析部３による解析は、S110のみならず、S102でも行うことができる。その後、粒子分取部５により、粒子の分取や選別が行われる（S111）。
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬。
（上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
（２）
前記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中のＬ２及び／又はＬ３は、２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基である、（１）に記載の粒子標識用試薬。
（３）
前記２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基は、上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかで表された１価の基である、（２）に記載の粒子標識用試薬。
（上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ１及びＲ６は、水素原子又は１価の基である。Ｒ１及びＲ６は、同一でも異なっていてもよい。
上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は１価の基であるか、又は、互いに結合して形成される環構造である。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同一でも異なっていてもよい。
上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、＊は結合手である。）
（４）
前記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中のＲ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群のいずれか一以上は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基である、（３）に記載の粒子標識用試薬。
（５）
前記一般式（Ｉ−１）中のＬ１は、スクシンイミド環を含む（ｐ＋１）価の基である、（１）から（４）のいずれかに記載の粒子標識用試薬。
（６）
前記一般式（Ｉ−１）中のＬ１は、ポチエチレングリコール鎖を含む（ｐ＋１）価の基である、（１）から（５）のいずれかに記載の粒子標識用試薬。
（７）
前記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の脂溶性官能基である、（１）から（４）のいずれかに記載の粒子識別標識用試薬。
（８）
前記一般式（Ｉ−２）中のＬ４は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基である、（１）から（４）、及び（７）のいずれかに記載の粒子識別標識用試薬。
（９）
前記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価のカチオン性官能基ある、（１）から（４）のいずれかに記載の粒子識別標識用試薬。
（１０）
目的粒子を上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色し、染色された目的粒子に光を照射する一次標識工程と、
前記一次標識工程を経た目的粒子に色素標識されたビオチン結合タンパク質にて染色する二次標識工程と、
を行う、粒子染色方法。
（上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
（１１）
前記一次標識工程は、光の照射により前記光分解性保護基が分解し、ビオチンがビオチン結合タンパク質と結合可能な状態となる結合可能化工程を更に含む、（１０）に記載の粒子染色方法。
（１２）
前記一次標識工程と前記二次標識工程とを繰り返し行い、異なる前記二次標識工程におけるビオチン結合タンパク質は、異なる色素で標識された、（１０）又は（１１）に記載の粒子染色方法。
（１３）
粒子捕捉領域中のウェルに目的粒子を捕捉する粒子捕捉部と、
前記捕捉された目的粒子の画像を取得する画像取得部と、
前記画像取得部より取得された目的粒子の画像を解析する解析部と、
を有し、
前記解析部により解析された目的粒子は、上記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色されたものである、顕微鏡システム。
（上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
（１４）
光を照射する光照射部、を更に有し、
前記染色された目的粒子は、前記光照射部により光を照射されることで一次標識され、前記一次標識された目的粒子は色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合可能となる、（１３）に記載の顕微鏡システム。
（１５）
目的粒子を分取する粒子分取部、を更に有し、
前記粒子分取部は、前記色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合した前記目的粒子を分取する、（１３）又は（１４）に記載の顕微鏡システム。
１００：顕微鏡システム
１：粒子捕捉部
２：画像取得部
３：解析部
４：光照射部
５：粒子分取部
６：観察部
７：制御部
８：記憶部
９：表示部

Claims (15)

  1. 下記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬。
    （上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
    上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
    上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
    上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
    上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
  2. 前記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中のＬ２及び／又はＬ３は、２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基である、請求項１に記載の粒子標識用試薬。
  3. 前記２−ニトロベンジル誘導体を含む１価の基は、下記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）のいずれかで表された１価の基である、請求項２に記載の粒子標識用試薬。
    （上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ１及びＲ６は、水素原子又は１価の基である。Ｒ１及びＲ６は、同一でも異なっていてもよい。
    上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、それぞれ独立に、水素原子又は１価の基であるか、又は、互いに結合して形成される環構造である。Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５は、同一でも異なっていてもよい。
    上記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中、＊は結合手である。）
  4. 前記一般式（ＩＩ−１）〜（ＩＩ−３）中のＲ２、Ｒ３、Ｒ４、及びＲ５からなる群のいずれか一以上は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基である、請求項３に記載の粒子標識用試薬。
  5. 前記一般式（Ｉ−１）中のＬ１は、スクシンイミド環を含む（ｐ＋１）価の基である、請求項１に記載の粒子標識用試薬。
  6. 前記一般式（Ｉ−１）中のＬ１は、ポチエチレングリコール鎖を含む（ｐ＋１）価の基である、請求項１に記載の粒子標識用試薬。
  7. 前記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の脂溶性官能基である、請求項１に記載の粒子識別標識用試薬。
  8. 前記一般式（Ｉ−２）中のＬ４は、ポチエチレングリコール鎖を含む１価の基である、請求項１に記載の粒子識別標識用試薬。
  9. 前記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価のカチオン性官能基ある、請求項１に記載の粒子識別標識用試薬。
  10. 目的粒子を下記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色し、染色された目的粒子に光を照射する一次標識工程と、
    前記一次標識工程を経た目的粒子に色素標識されたビオチン結合タンパク質にて染色する二次標識工程と、
    を行う、粒子染色方法。
    （上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
    上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
    上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
    上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
    上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
  11. 前記一次標識工程は、光の照射により前記光分解性保護基が分解し、ビオチンがビオチン結合タンパク質と結合可能な状態となる結合可能化工程を更に含む、請求項１０に記載の粒子染色方法。
  12. 前記一次標識工程と前記二次標識工程とを繰り返し行い、異なる前記二次標識工程におけるビオチン結合タンパク質は、異なる色素で標識された、請求項１０に記載の粒子染色方法。
  13. 粒子捕捉領域中のウェルに目的粒子を捕捉する粒子捕捉部と、
    前記捕捉された目的粒子の画像を取得する画像取得部と、
    前記画像取得部より取得された目的粒子の画像を解析する解析部と、
    を有し、
    前記解析部により解析された目的粒子は、下記一般式（Ｉ−１）又は（Ｉ−２）で表される化合物を含有する、粒子標識用試薬で染色されたものである、顕微鏡システム。
    （上記一般式（Ｉ−１）中、ｐは、１〜３の整数である。
    上記一般式（Ｉ−１）中、Ｍは、水素原子又は１〜３価の金属原子である。
    上記一般式（Ｉ−１）中、Ｌ１は、単結合又は（ｐ＋１）価の基である。
    上記一般式（Ｉ−１）及び（Ｉ−２）中、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立に、水素原子又は光分解性保護基であり、Ｌ２及びＬ３は、同一でも異なっていてもよい。ただし、Ｌ２及びＬ３の少なくとも一方は、光分解性保護基である。
    上記一般式（Ｉ−２）中、Ｌ４は、１価の基である。）
  14. 光を照射する光照射部、を更に有し、
    前記染色された目的粒子は、前記光照射部により光を照射されることで一次標識され、前記一次標識された目的粒子は色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合可能となる、請求項１３に記載の顕微鏡システム。
  15. 目的粒子を分取する粒子分取部、を更に有し、
    前記粒子分取部は、前記色素標識されたビオチン結合タンパク質と結合した前記目的粒子を分取する、請求項１３に記載の顕微鏡システム。
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