DE60035442T2

DE60035442T2 - Optisches Sortierungsverfahren

Info

Publication number: DE60035442T2
Application number: DE60035442T
Authority: DE
Inventors: Andrew MRC Lab. of Griffiths; Dan Tawfik; Armin c/o Domantis Sepp
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2020-01-07
Also published as: JP4851008B2; US20090325236A1; EP1522581A3; EP1141272B1; CA2357037C; US6808882B2; JP2011092218A; US20090053700A1; US20140187762A1; EP1522582B1; AU1884400A; US20050164239A1; CA2479551A1; ATE448300T1; EP1522582A3; DE60035442D1; EP1905828A2; AU781217B2; EP1905828A3; ATE548452T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verwendungen in der in vitro Evolution von molekularen Bibliotheken. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Erhöhen der Konzentration von Nukleinsäuren, die Genprodukte kodieren, in die Nukleinsäure und die Aktivität des kodierten Genprodukts durch Aufteilung bzw. Kompartimentalisierung verknüpft sind. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung von Genprodukten aus einem oder mehreren genetischen Elementen.
Die Evolution benötigt die Bildung von genetischer Diversität (Diversität in Nukleinsäure), gefolgt von der Selektion jener Nukleinsäuren, die zu vorteilhaften Eigenschaften führen. Weil die Nukleinsäure und die Aktivität des kodierten Genprodukts eines Organismus physikalisch verknüpft sind (die Nukleinsäuren sind innerhalb der Zellen abgegrenzt, die sie kodieren) können mehrere Runden der Mutation und Selektion zu dem fortschreitenden Überleben von Organismen mit verbesserter Fitness führen. Systeme für schnelle Evolution von Nukleinsäuren oder Proteinen in vitro ahmen vorteilhafterweise diesen Vorgang auf der molekularen Ebene dahingehend nach, dass die Nukleinsäure und die Aktivität des kodierten Genprodukts verknüpft sind und die Aktivität des Genprodukts selektierbar ist.
Kürzliche Fortschritte in der Molekularbiologie haben es ermöglicht, dass einige Moleküle nach ihren Eigenschaften zusammen mit den Nukleinsäuren, die sie kodieren, gleichzeitig selektiert werden können. Die selektierten Nukleinsäuren können anschließend für die weitere Analyse oder Verwendung kloniert werden, oder sie können zusätzlichen Runden der Mutation und Selektion unterworfen werden.
Gemeinsam ist diesen Verfahren die Etablierung von großen Nukleinsäure Bibliotheken. Moleküle, welche die gewünschten Eigenschaften (Aktivität) aufweisen, können durch Selektionspläne isoliert werden, die hinsichtlich der gewünschten Aktivität des kodierten Genprodukts selektieren, wie einer gewünschten biochemischen oder biologischen Aktivität, zum Beispiel Bindungsaktivität.
Die Phagen Displaytechnologie war sehr erfolgreich, weil sie ein Vehikel bereitstellt, das die Selektion eines gezeigten Proteins (engl.: displayed Protein) erlaubt, indem die essenzielle Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und Aktivität des kodierten Genprodukts bereitgestellt wird (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; für einen Übersichtsartikel siehe Clackson und Wells, 1994). Filamentöse Phagen Partikel wirken als genetische Displaypakete mit Proteinen auf der Außenseite und den genetischen Elementen, die sie kodieren auf der Innenseite. Die enge Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und der Aktivität des kodierten Genprodukts ist ein Ergebnis des Zusammenbaus des Phagen innerhalb von Bakterien. Weil einzelne Bakterien selten mehrfach infiziert werden, werden in den meisten Fällen all die Phagen, die von einem einzelnen Bakterium gebildet werden, dasselbe genetische Element tragen und dasselbe Protein zeigen.
Jedoch beruht Phagen Display auf der Bildung von Nukleinsäure Bibliotheken in vivo in Bakterien. Somit liegt die praktische Begrenzung der Bibliotheksgröße, die durch Phagen Displaytechnologie erlaubt wird, in der Größenordnung von 10⁷ bis 10¹¹, selbst wenn der Vorteil von λ Phagen Vektoren mit ausschneidbaren filamentösen Phagen Replikons verwendet wird. Die Technik wurde hauptsächlich auf die Selektion von Molekülen mit Bindungsaktivität angewendet. Eine kleine Anzahl von Proteinen mit katalytischer Aktivität sind ebenfalls unter Verwendung dieser Technik isoliert worden, jedoch fand die Selektion nicht direkt hinsichtlich der gewünschten katalytischen Aktivität statt, sondern entweder nach der Bindung an ein Analog im Übergangszustand (Widersten und Mannervik, 1995) oder Reaktion mit einem Suizid Inhibitor (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997). Vor kurzem hat es einige Beispiele von Enzymen gegeben, die unter Verwendung von Phagen Display durch Produktbildung selektiert wurden (Atwell & Wells, 1999; Demartis et al., 1999; Jestin et al., 1999; Pederson, et al., 1998), aber in all diesen Fällen fand die Selektion nicht hinsichtlich mehrfachen Durchsatzes statt.
Spezifische Peptid Liganden sind hinsichtlich der Bindung an Rezeptoren durch Affinitätsselektion unter Verwendung großer Peptid Bibliotheken, die mit dem C Terminus des lac Repressors LacI verknüpft sind, selektiert worden (Cull et al., 1992). Wenn es in E. coli exprimiert wird, verknüpft das Repressor Protein den Liganden an das kodierende Plasmid physikalisch durch Binden an eine lac Operatorsequenz auf dem Plasmid.
Es ist auch über ein vollständiges in vitro Polysomen Displaysystem berichtet worden (Mattheakis et al., 1994; Hanes und Pluckthun, 1997), in dem wachsende Peptide physikalisch über das Ribosom an die RNA, die sie kodiert, angeheftet sind. Ein alternatives vollständiges in vitro System für das Verknüpfen des Genotyps mit dem Phänotyp durch das Herstellen von RNA-Peptid Fusionen (Roberts und Szostak, 1997; Nemoto et al., 1997) ist ebenfalls beschrieben worden.
Jedoch ist der Schutzbereich der obigen Systeme auf die Selektion von Proteinen beschränkt und erlaubt darüber hinaus keine direkte Selektion hinsichtlich anderer Aktivitäten als Bindung, zum Beispiel katalytische oder regulatorische Aktivität.
Die in vitro RNA Selektion und Evolution (Ellington und Szostak, 1990), auf die manchmal als SELEX (engl.: systematic evolution of ligands by exponential enrichment = systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Bezug genommen wird (Tuerk und Gold, 1990) erlaubt die Selektion hinsichtlich sowohl Bindung als auch chemischer Aktivität, aber nur hinsichtlich Nukleinsäuren. Wenn eine Selektion hinsichtlich der Bindung stattfindet, wird ein Pool von Nukleinsäuren mit immobilisiertem Substrat inkubiert. Nicht gebundenes Material wird weggewaschen, anschließend wird das gebundene Material freigesetzt, amplifiziert, und der gesamte Vorgang wird in wiederkehrenden Schritten wiederholt, um hinsichtlich besserer Bindungssequenzen anzureichern. Dieses Verfahren kann auch adaptiert werden, um die Isolierung von katalytischer RNA und DNA zu erlauben (Grenn und Szostak, 1992; für Übersichtsartikel siehe Chapman und Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995).
Jedoch ist die Selektion hinsichtlich "katalytischer" oder Bindungsaktivität unter Verwendung von SELEX nur möglich, weil dasselbe Molekül die duale Rolle des Tragens der genetischen Information und der Funktion des Katalysators oder Bindungsmoleküls (Aptamer) erfüllt. Wenn die Selektion hinsichtlich "Autokatalyse" stattfindet, muss dasselbe Molekül auch die dritte Rolle als ein Substrat erfüllen. Weil das genetische Element sowohl die Rolle des Substrats als auch des Katalysators spielen muss, ist Selektion nur für einzelne Umsatzereignisse möglich. Weil der "Katalysator" in diesem Vorgang selbst modifiziert wird, ist er per Definition kein echter Katalysator. Zusätzlich können Proteine unter Verwendung des SELEX Verfahrens nicht selektiert werden. Der Bereich von Katalysatoren, Substraten und Reaktionen, die selektiert werden können, ist deshalb stark begrenzt.
Jene der obigen Verfahren, die wiederkehrende Runden der Mutation und Selektion erlauben, ahmen in vitro Mechanismen nach, die für gewöhnlich dem Vorgang der Evolution zugeschrieben werden: wiederkehrende Variation, fortschreitende Selektion, hinsichtlich einer gewünschten Aktivität und Replikation. Jedoch hat keines der bislang entwickelten Verfahren Moleküle mit vergleichbarer Diversität und funktioneller Wirksamkeit zu jenen bereitgestellt, die natürlich gefunden werden. Zusätzlich gibt es keine durch den Menschen hergestellten "Evolutions"-Systeme, die sowohl Nukleinsäuren als auch Proteine evolvieren können, um den vollständigen Bereich von biochemischen und biologischen Aktivitäten (zum Beispiel Bindung, katalytische und regulatorische Aktivitäten) zu bewirken, und die verschiedene Vorgänge miteinander kombinieren können, um zu einem gewünschten Produkt oder einer gewünschten Aktivität zu gelangen.
Somit besteht ein großer Bedarf hinsichtlich eines in vitro Systems, das die oben diskutierten Beschränkungen überwindet.
In Tawfik et al. (1998), Nature Biotechnology, US, Nature Publishing Vol. 7(16), Seiten 652–656 werden durch den Menschen hergestellte zellähnliche Abschnitte für molekulare Evolution offenbart.
In Anarbaev et al. (1998), Biochimica et Biophysica Acta. Protein Structure and Molecular Enzymology, Elsevier, Amsterdam, NL, Vol. 1384(2): 315–324 wurde die Aktivität von DNA Polymerase α-Primasekomplex aus Kalbsthymus und Klenow Fragment der E. coli DNA Polymerase in reversen Mikroemulsionen untersucht.
In Oberholzer et al., (1995) Chemistry and Biology, Current Biology, London GB, Vol. 2 (10): 677–682 ist offenbart, dass PCR in Liposomen durchgeführt werden kann.
In Tawfik und Griffiths (1998) und in der internationalen Patentanmeldung WO 99/02671 beschreiben wir ein System für in vitro Evolution, das viele der Beschränkungen, die oben beschrieben sind unter Verwendung von Aufteilung in Mikrokapseln löst, um den Genotyp und den Phänotyp auf der molekularen Ebene miteinander zu verknüpfen.
In Tawfik und Griffiths (1998) und in einigen Ausführungsformen der internationalen Patentanmeldung WO 99/02671 führt die gewünschte Aktivität eines Genprodukts zu einer Modifikation des genetischen Elements, das es kodiert (und liegt in derselben Mikrokapsel vor). Das modifizierte genetische Element kann anschließend in einem nachfolgenden Schritt selektiert werden.
Hier beschreiben wir ein Verfahren, in dem die Modifikation des genetischen Elements eine Veränderung in den optischen Eigenschaften des Elements selbst bewirkt, und das viele Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen Verfahren aufweist.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird ein Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, die ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität kodieren, bereitgestellt, dessen Expression direkt oder indirekt zu der Modifikation einer optischen Eigenschaft eines genetischen Elements, welches das Genprodukt kodiert, führen kann, umfassend die Schritte:

(a) Aufteilen genetischer Elemente in Mikrokapseln;
(b) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln zu bilden;
(c) Sortieren der genetischen Elemente, welche das/die Genprodukt/e mit der gewünschten Aktivität bilden nach den veränderten optischen Eigenschaften der genetischen Elemente.

Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln teilen genetische Elemente und Genprodukte auf, sodass sie physikalisch miteinander verknüpft verbleiben.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Erhöhen der Konzentration eines Nukleinsäure Moleküls bereitgestellt, das die Schritte umfasst:

(a) Bilden wässriger Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl Emulsion, wobei die Mikrokapseln eine wässrige innere Phase, die als einzelne Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase suspendiert wird, umfassen und wobei eine Vielzahl der Mikrokapseln ein Nukleinsäure-Molekül, einen Festphasen Träger, der fähig ist, mit dem Nukleinsäure-Molekül verbunden zu werden, und eine wässrige Lösung, die Bestandteile umfasst, die nötig sind, um Nukleinsäure Amplifikation in der wässrigen inneren Phase durchzuführen, umfassen;
(b) Amplifizieren des Nukleinsäure Moleküls in den Mikrokapseln, um amplifizierte Produktkopien des Nukleinsäure Moleküls zu bilden;
(c) Fangen der amplifizierten Produktkopien an den Festphasen Träger in den Mikrokapseln;

Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen eines Genprodukts aus einem oder mehreren genetischen Elementen, die Nukleinsäuren umfassen, bereitgestellt, das Verfahren umfasst:

(a) Bereitstellen von Kügelchen und einem oder mehreren genetischen Elementen, die Nukleinsäuren umfassen, wobei die Kügelchen zum Koppeln an das eine oder mehrere genetische Elemente und Genprodukte, die von den genetischen Elementen hergestellt werden, angepasst werden, und das eine oder mehrere genetische Elemente zum Koppeln an die Kügelchen angepasst werden, und Kombinieren der Kügelchen und genetischen Elemente, so dass die genetischen Elemente an die Kügelchen binden;
(b) Aufteilen des einen oder mehrerer an Kügelchen gebundener genetischer Elemente in wässrige Mikrokapseln mit Bestandteilen, die benötigt werden, um ein Genprodukt aus dem einem oder mehreren genetischen Elementen herzustellen, die Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl Emulsion gebildet werden und wobei die Mikrokapseln eine wässrige innere Phase, die als einzelne Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase suspendiert wird, umfassen;
(c) Exprimieren des einen oder mehrerer genetischer Elemente innerhalb der Mikrokapseln, um entsprechende Genprodukte herzustellen, so dass die Genprodukte an die Kügelchen rückgekoppelt werden;

Wie hier verwendet, ist ein genetisches Element ein Molekül oder molekulares Konstrukt, das eine Nukleinsäure umfasst. Die erfindungsgemäßen genetischen Elemente können irgendeine Nukleinsäure (zum Beispiel DNA, RNA, oder irgendein Analog davon, natürlich oder künstlich) umfassen. Der Nukleinsäure Bestandteil des genetischen Elements kann darüber hinaus kovalent oder nicht kovalent mit einem/r oder mehreren Molekülen oder Strukturen, einschließlich Proteinen, chemischen Resten und Gruppen und Festphasen Träger wie Kügelchen (einschließlich nicht magnetischen, magnetischen und paramagnetischen Kügelchen) und ähnlichem verknüpft werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren können diese Strukturen oder Moleküle ausgestaltet sein, um beim Sortieren und/oder der Isolierung des genetischen Elements, das ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität kodiert, zu helfen.
Expression, wie hier verwendet, wird in ihrer breitesten Bedeutung verwendet, um anzugeben, dass eine Nukleinsäure, die in dem genetischen Element enthalten ist, in ihr Genprodukt umgewandelt wird. Wo somit die Nukleinsäure DNA ist, betrifft Expression die Transkription der DNA in RNA; wo diese RNA für Protein kodiert, kann Expression auch die Translation der RNA in Protein betreffen. Wo die Nukleinsäure RNA ist, kann Expression die Replikation dieser RNA in weitere RNA Kopien, die reverse Transkription der RNA in DNA und wahlweise die Transkription dieser DNA in (ein) weitere/s RNA Molekül/e, ebenso wie wahlweise die Translation irgendeiner der RNA Spezies, die als Protein hergestellt wird, betreffen. Vorzugsweise wird Expression deshalb durch einen oder mehrere Vorgänge durchgeführt, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Transkription, reverser Transkription, Replikation und Translation.
Die Expression des genetischen Elements kann somit entweder auf DNA, RNA oder Protein, oder eine Nukleinsäure oder ein Protein mit nicht natürlichen Basen oder Aminosäuren (das Genprodukt) innerhalb der erfindungsgemäßen Mikrokapsel gerichtet sein, sodass das Genprodukt innerhalb derselben Mikrokapsel als das genetische Element abgegrenzt ist.
Da genetische Element und das dadurch kodierte Genprodukt sind miteinander durch Abgrenzen jedes genetischen Elements und des jeweiligen Genprodukts, das durch das genetische Element innerhalb derselben Mikrokapsel kodiert wird, verknüpft. Auf diese Weise kann das Genprodukt in einer Mikrokapsel nicht eine Veränderung in irgendeiner der anderen Mikrokapseln hervorrufen. Zusätzlich können weitere Verknüpfungsmittel eingesetzt werden, um die Genprodukte mit den genetischen Elementen, die sie kodieren, zu verknüpfen, wie im Folgenden angegeben ist.
Der Begriff "Mikrokapsel" wird hier in Übereinstimmung mit der Bedeutung verwendet, die ihm im Stand der Technik zugewiesen wird und wird hier im Folgenden näher beschrieben. Im Wesentlichen ist eine Mikrokapsel jedoch ein künstliches Kompartiment bzw. ein künstlicher Abschnitt, dessen abgegrenzte Grenze den Austausch der Bestandteile der hier beschriebenen molekularen Mechanismen beschränkt, die das Sortieren der genetischen Elemente nach der Funktion der Genprodukte, die sie kodieren, erlauben.
Vorzugsweise sind die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Mikrokapseln in der Lage, in großen Anzahlen hergestellt zu werden, und dadurch eine Bibliothek von genetischen Elementen, die ein Repertoire von Genprodukten kodiert, aufzuteilen.
Wie hier verwendet, betrifft eine Änderung in optischen Eigenschaften der genetischen Elemente irgendeine Änderung in der Absorption oder Emission von elektromagnetischer Strahlung, einschließlich Änderungen im Absorptionsvermögen, der Lumineszenz, der Phosphoreszenz oder Fluoreszenz. Alle solche Eigenschaften sind in dem Begriff "optisch" eingeschlossen. Genetische Elemente können zum Beispiel durch Lumineszenz, Fluoreszenz oder Phosphoreszenz aktiviertes Sortieren sortiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird Flusszytometrie eingesetzt, um genetische Elemente zu sortieren, zum Beispiel können Lichtstreuung (Kerker, 1983) und Fluoreszenzpolarisation (Rolland et al., 1985) verwendet werden, um das Flusssortieren auszulösen. In einer stark bevorzugten Ausführungsform werden die genetischen Elemente unter Verwendung eines Fluoreszenz aktivierten Zellsortiergeräts (FACS für engl.: fluorescence activated cell sorter) sortiert (Norman, 1980; Mackenzie und Pinder, 1986).
Änderungen in den optischen Eigenschaften können direkt oder indirekt sein. Somit kann die Änderung zu der Veränderung einer optischen Eigenschaft in dem genetischen Element selbst führen, oder sie kann indirekt zu einer solchen Änderung führen. Zum Beispiel kann die Modifikation eines genetischen Elements seine Fähigkeit, an einen optisch aktiven Liganden zu binden, verändern wodurch indirekt seine optischen Eigenschaften geändert werden.
Alternativ dazu können Bild gebende Techniken verwendet werden, um dünne Filme aus genetischen Elementen zu screenen, um eine Anreicherung hinsichtlich eines genetischen Elements mit gewünschten Eigenschaften zu erlauben, zum Beispiel durch physikalische Isolierung des Bereichs, wo ein genetisches Element mit gewünschten Eigenschaften lokalisiert ist, oder Ablösung von nicht gewünschten genetischen Elementen. Die genetischen Elemente können durch Lumineszenz, Phosphoreszenz oder Fluoreszenz nachgewiesen werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des ersten Aspekts der vorliegenden Offenbarung kann das Sortieren von genetischen Elementen durch eine von im Wesentlichen zwei Techniken durchgeführt werden.

(I) In einer ersten Ausführungsform werden die genetischen Elemente nach dem Vereinigen der Mikrokapseln in einen oder mehrere gemeinsame Abschnitte sortiert. In dieser Ausführungsform modifiziert ein genetisches Produkt mit der gewünschten Aktivität das genetische Element, das es kodiert (und das sich in derselben Mikrokapsel befindet), sodass es als ein Ergebnis seiner modifizierten optischen Eigenschaften in einem nachfolgenden Schritt selektierbar wird. Die Reaktionen werden gestoppt, und die Mikrokapseln werden anschließend aufgebrochen, sodass all die Inhalte der einzelnen Mikrokapseln vereinigt werden. Die Modifikation des genetischen Elements in der Mikrokapsel kann direkt zu der Modifikation der optischen Eigenschaften des genetischen Elements führen. Alternativ dazu kann die Modifikation den genetischen Elementen erlauben, außerhalb der Mikrokapseln weiter modifiziert zu werden, um eine Änderung in ihren optischen Eigenschaften zu induzieren. Die Selektion hinsichtlich genetischer Elemente mit modifizierten optischen Eigenschaften erlaubt die Anreicherung der genetischen Elemente, die das/die Genprodukte mit der gewünschten Aktivität kodieren. Folglich stellt die Offenbarung ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Offenbarung bereit, wobei in Schritt (b) das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität das genetische Element modifiziert, das es kodiert, um die Isolierung des genetischen Elements als ein Ergebnis einer Veränderung in den optischen Eigenschaften des genetischen Elements zu erlauben. Es wird selbstverständlich verstanden, dass die Modifikation direkt sein kann, dahingehend, dass sie durch die direkte Wirkung des Genprodukts auf das genetische Element verursacht wird, oder indirekt, wobei eine Reihe von Reaktionen, von denen eine oder mehrere das Genprodukt mit der gewünschten Aktivität einschließen, zu der Modifikation des genetischen Elements führen.
(II) In einer zweiten Ausführungsform können die genetischen Elemente durch ein Verfahren mit mehreren Schritten bzw. Multistepverfahren sortiert werden, das zum Beispiel mindestens zwei Schritte einschließt, um die Exposition der genetischen Elemente gegenüber Bedingungen zu erlauben, die gestatten, dass mindestens zwei getrennte Reaktionen stattfinden. Wie dem Fachmann offensichtlich sein wird, führt der erste Mikroverkapselungsschritt der Offenbarung vorteilhafterweise zu Bedingungen, welche die Expression der genetischen Elemente gestatten – sei es Transkription, Transkription und/oder Translation, Replikation oder ähnliches. Unter diesen Umständen kann es möglich sein, hinsichtlich einer bestimmten Genprodukt Aktivität zu selektieren, zum Beispiel weil das Genprodukt unter diesen Bedingungen nicht aktiv ist, oder weil das Expressionssystem eine interferierende Aktivität enthält. Die Offenbarung stellt deshalb gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Offenbarung ein Verfahren bereit, worin Schritt (b) das Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte innerhalb von Mikrokapseln herzustellen, das Verknüpfen der Genprodukte mit den genetischen Elementen, die sie kodieren und das Isolieren der dadurch gebildeten Komplexe umfasst. Dies erlaubt es den genetischen Elementen und ihren assoziierten Genprodukten, dass sie aus den Kapseln isoliert werden, bevor das Sortieren nach der Genprodukt Aktivität stattfindet. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Komplexe einem weiteren Aufteilungsschritt vor dem Isolieren der genetischen Elemente, die ein Genprodukt mit der gewünschten Aktivität kodieren, unterworfen. Dieser weitere Aufteilungsschritt, der vorteilhafterweise in den Mikrokapseln stattfindet, erlaubt die Durchführung weiterer Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen in einer Umgebung, in der die genetischen Elemente und ihre jeweiligen Genprodukte physikalisch verknüpft werden. Abschließendes Sortieren der genetischen Elemente kann gemäß der Ausführungsform (I) oben durchgeführt werden.

Die "zweite Verkapselung" kann auch mit genetischen Elementen durchgeführt werden, die durch andere Mittel mit Genprodukten verknüpft sind, wie durch Phagen Display, Polysomen Display, RNA-Peptid Fusion oder lac Repressor Peptid Fusion.
Das/die selektierte/n genetische/n Elemente kann auch anschließenden, wahlweise stringenteren Runden des Sortierens in wiederkehrenden wiederholten Schritten unterworfen werden, wobei das Verfahren der Offenbarung entweder in seiner Gesamtheit oder nur in ausgewählten Schritten erneut angewendet wird. Dadurch dass die Bedingungen entsprechend maßgeschneidert werden, können genetische Elemente, die Genprodukte mit einer weiter optimierten Aktivität kodieren, nach jeder Selektionsrunde isoliert werden.
Zusätzlich können die genetischen Elemente, die nach einer ersten Runde des Sortierens isoliert wurden, einer Mutagenese unterworfen werden, bevor das Sortieren durch wiederkehrende Wiederholung der Schritte des Verfahrens der Offenbarung, wie oben angegeben, wiederholt wird. Nach jeder Mutagenese Runde werden einige genetische Elemente derart modifiziert sein, dass die Aktivität der Genprodukte verstärkt ist.
Darüber hinaus können die selektierten genetischen Elemente in einen Expressionsvektor kloniert werden, um die weitere Charakterisierung der genetischen Elemente und ihrer Produkte zu erlauben.
In einem zweiten Aspekt stellt die Offenbarung ein Produkt bereit, wenn es gemäß dem ersten Aspekt der Offenbarung selektiert wird. Wie in diesem Zusammenhang verwendet, kann ein "Produkt" ein Genprodukt, das gemäß der Offenbarung selektierbar ist, oder ein genetisches Element (oder genetische Information, die darin umfasst ist) betreffen.
In einem dritten Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Erzeugen eines Genprodukts bereit, dessen Expression direkt oder indirekt zu der Modifikation der optischen Eigenschaften eines genetischen Elements, das es kodiert, führen kann, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugen eines genetischen Elements, welches das Genprodukt kodiert;
(b) Aufteilen der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
(c) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln herzustellen;
(d) Sortieren der genetischen Elemente, die (ein) Genprodukt/e mit der gewünschten Aktivität unter Verwendung der veränderten optischen Eigenschaften der genetischen Elemente bilden; und
(e) Exprimieren des Genprodukts mit der gewünschten Aktivität.

In Übereinstimmung mit dem dritten Aspekt umfasst Schritt (a) vorzugsweise das Herstellen eines Repertoires von genetischen Elementen, wobei jedes genetische Element ein potenziell unterschiedliches Genprodukt kodiert. Die Repertoires können durch herkömmliche Techniken, wie jene, die für die Erzeugung von Bibliotheken, die für die Selektion beabsichtigt sind, eingesetzt werden, durch Verfahren, wie Phagen Display, erzeugt werden. Genprodukte mit der gewünschten Aktivität können aus dem Repertoire gemäß der vorliegenden Offenbarung gemäß ihrer Fähigkeit, die optischen Eigenschaften der genetischen Elemente in einer Weise zu modifizieren, dass sie sich von jenen von anderen Genprodukten unterscheiden, ausgewählt werden. Zum Beispiel können gewünschte Genprodukte die optischen Eigenschaften in einem größeren Ausmaß als andere Genprodukte oder zu einem geringeren Ausmaß, nicht alle eingeschlossen, modifizieren.
In einem vierten Aspekt stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Screenen einer Verbindung oder von Verbindungen bereit, die in der Lage ist/sind, die Aktivität eines Genprodukts zu modulieren, dessen/deren Expression direkt oder indirekt zur Modifikation der optischen Eigenschaften eines genetischen Elements, das sie kodierten führt, umfassend die Schritte:

(a) Erzeugen eines Repertoires von genetischen Elementen, welche ein Genprodukt kodieren;
(b) Aufteilen der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
(c) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln herzustellen;
(d) Sortieren der genetischen Elemente, die (ein) Genprodukt/e mit der gewünschten Aktivität unter Verwendung der veränderten optischen Eigenschaften der genetischen Elemente bilden; und
(e) Inkontaktbringen eines Genprodukts mit der gewünschten Aktivität mit der Verbindung oder den Verbindungen und Überwachen der Modulation einer Aktivität des Genprodukts durch die Verbindung oder die Verbindungen.

Vorteilhafterweise umfasst das Verfahren weiterhin den Schritt:

(g) Identifizieren der Verbindung oder der Verbindungen, die in der Lage ist/sind, die Aktivität des Genprodukts zu modulieren und Synthetisieren der Verbindung oder der Verbindungen.

Dieses Selektionssystem kann konfiguriert werden, um hinsichtlich RNA, DNA oder Protein Molekülen mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität zu selektieren.
Kurzbeschreibung der Figuren
1. Dihydrofolat Reduktase kann mit identischer Wirksamkeit von Genen exprimiert werden, die in vitro in Lösung translatiert wurden und Genen, die an paramagnetische Kügelchen angeheftet sind. Die DHFR Aktivität, die von der in vitro Translation von folA Genen in Lösung oder folA Genen, die an paramagnetische Mikrokügelchen angeheftet sind, stammen, wird durch Überwachen der Oxidation von NADPH zu NADP spektrofotometrisch bei 340 nm bestimmt, und die Aktivität wird durch Anfangsgeschwindigkeiten unter So >> K_M Bedingungen (υmax) berechnet. (♦), translatiert aus Genen in Lösung; (∎), translatiert aus Genen, die an Mikrokügelchen angeheftet sind.
2. Epifluoreszenz Mikroskopie von Wasser-in-Öl Emulsionen zeigen, dass GFP in vitro von Genen translatiert werden kann, die an einzelne Mikrokügelchen angeheftet sind, die in den wässrigen Abschnitten der Emulsionen verkapselt sind, und das translatierte Genprodukt, das an die Mikrokügelchen zurückgebunden ist, lässt sie fluoreszieren.
3. Flusszytometrische Analyse von GFP Expression in Mikrokapseln und in situ Binden an das genetische Element (Mikrokügelchen). A: Lichtstreuungseigenschaften der Kügelchen vor der Reaktion. 75% der Kügelchen werden als einzelne Kügelchen gefahren. B: Lichtstreuungseigenschaften der Kügelchen nach in vitro Translationsreaktion. Ungefähr 50% der Kügelchen fallen in das Gatter bzw. die Schranke für einzelne Kügelchen. C: Die Fluoreszenz von Mikrokügelchen (nur bzgl. der Schranke für einzelne Kügelchen), die mit T7-GFP Gen und Anti-GFP polyklonalem Antikörper beschichtet sind, ist signifikant höher als das Signal von den Kügelchen, bei denen entweder das GFP Gen oder der Anti-GFP Antikörper weggelassen wurden.
4. Synthese von Biotin-GS-DNP durch die humane Glutathion S-Transferase M2-2 (GST M2-2) katalysierte Reaktion von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB; Sigma) mit reduziertem biotinyliertem Glutathion (Biotin-GSH).
5. Nachweisen von paramagnetischen Kügelchen, die mit dem Produkt einer Enzym katalysierten Reaktion beschichtet wurden durch Flusszytometrie. Sera-Mag^TM Streptavidin beschichtete magnetische Mikropartikel, inkubiert mit Biotin-GS-DNP, wurden durch die GST M2-2 katalysierte Reaktion von Biotin-GSH und CDNB hergestellt. Das gefangene Biotin-GS-DNP wurde durch Inkubation der Mikropartikel mit einem Maus Anti-Dinitrophenol Antikörper, gefolgt von einem (FITC)-konjugierten F(ab')₂ Fragment Ziege Anti-Maus IgG, F(ab')₂ Fragment nachgewiesen. Nach dem Waschen wurden 2 × 10⁵ Mikropartikel durch Flusszytometrie analysiert. Alle Reagenzien, keine Reagenzien aus der enzymatischen Synthese mit Biotin-GS-DNP weggelassen; minus GST, das Enzym GST M2-2 wurde aus der Synthese weggelassen; minus Biotin-GSH, Biotin-GSH wurde aus der Synthese weggelassen; minus CDNB, CDNB wurde aus der Synthese weggelassen.
6. Synthese von MeNPO-CO-Biotin-β-Ala-GSH (eingeschlossenes-Biotinβala-GSH).
Acetylchlorid (5 ml) wurde zu wasserfreiem Methanol (80 ml) zugegeben. Die gerührte Lösung wurde abgekühlt, und d-Biotin (4 g) wurde zugegeben. Nach Rühren über Nacht wurden die Lösungsmittel in Vakuum verdampft, um einen weißen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde mit Ether titriert, filtriert und unter Vakuum (in der Anwesenheit von Phosphorpentoxid) getrocknet und bei –20°C gelagert.
7. Reaktion von eingeschlossenem-Biotin-βala-GSH mit 1-Chlor-2,4-Dinitrobenzol (CDNB) und fotochemisches Freisetzen der Biotin Gruppe.
8. Reaktion von eingeschlossenem-Biotin-βala-GSH mit 4-Chlor-3-Nitrobenzoat (CNB) und fotochemisches Freisetzen der Biotin Gruppe.
9. Humanes GST M2-2 katalysiert die Reaktion von eingeschlossenem-Biotin-βala-GSH mit CDNB und CNB in Lösung, und die Reaktionsprodukte können durch UV Bestrahlung freigesetzt, durch Kügelchen gefangen und unter Verwendung von Fluoreszenz markierten Anti-Produkt Antikörpern und Flusszytometrie nachgewiesen werden.
Ansicht A: Lichtstreuungseigenschaften der Kügelchen und Schranke für einzelne Kügelchen (R1). Ansicht B: Fluoreszenz von Mikrokügelchen (Schranke durch R1) aus Reaktionen mit CDNB. Ansicht C: Fluoreszenz von Mikrokügelchen (Schranke durch R1) aus Reaktionen mit CNB. Die Signale von den Mikrokügelchen aus den Reaktionen mit und ohne GST M2-2 sind jeweils als +enz und –enz angegeben. Die Signale von den Mikrokügelchen aus Reaktionen, die UV bestrahlt waren, und jene die es nicht waren, sind jeweils als +UV und –UV angegeben.
10. Flusszytometrie kann verwendet werden, um Kügelchen aus den wässrigen Abschnitten einer Emulsion mit GST M2-2 von den Kügelchen aus Abschnitten ohne GST M2-2 unter Verwendung von eingeschlossenem-biotinyliertem-βala-GSH und CNB als Substrate zu unterscheiden.
Ansicht A: Lichtstreuungseigenschaften einer Mischung aus 1,0 μm Durchmesser nicht fluoreszierender Neutravidin markierter Mikrokugel (Molecular Probes, F- 8777) oder 0,93 μm Durchmesser Streptavidin beschichteten Polystyrol Kügelchen (Bangs Laborstories) und den gesetzten Schranken für einzelne Kügelchen von Gangs (R1) und einzelne Kügelchen von Molecular Probes (R2). Ansicht B: Fluoreszenz von Mikrokügelchen, die aus einer nicht emulgierten Mischung aus 98% Kügelchen von Bangs (ohne GST) und 2% Kügelchen von Molecular Probes (mit GST) entnommen wurden. Ansicht C: Fluoreszenz aus Mikrokügelchen, die aus einem Gemisch aus zwei Emulsionen in einem Verhältnis von 98% Emulsion enthaltend Kügelchen von Bangs (ohne GST) und einer Emulsion enthaltend 2% Kügelchen von Molecular Probes (mit GST) entnommen wurden. Ansicht D: Fluoreszenz von Mikrokügelchen, die aus einer nicht emulgierten Mischung aus 98% Kügelchen von Molecular Probes (ohne GST) und 2% Kügelchen von Bangs (mit GST) entnommen wurden. Ansicht E: Fluoreszenz von Mikrokügelchen, die aus einer Mischung aus zwei Emulsionen in einem Verhältnis von 98% Emulsion enthaltend Kügelchen von Molecular Probes (ohne GST) und einer Emulsion enthaltend 2% Kügelchen von Bangs (mit GST) entnommen wurden. Fluoreszenz von nicht mit Schranken versehenen Kügelchen (keine Schranke), Kügelchen nach Schranke R1 (R1) und Kügelchen nach Schranke R2 (R2) sind übereinander geschichtet.
11. Humanes GST M2-2, transkribiert und translatiert in vitro, in den wässrigen Abschnitten einer Wasser-in-Öl Emulsion katalysiert eine Reaktion, die eine Änderung in den Fluoreszenzeigenschaften von Mikrokugeln in denselben Abschnitten (ko-kompartimentalisierte Mikrokugeln) hervorruft.
Ansicht A: Lichtstreuungseigenschaften von Kügelchen und Schranke für einzelne Kügelchen (R1). Ansicht B: Fluoreszenz von Mikrokügelchen (durch Schranke R1) aus nicht emulgierten Reaktionen. Ansicht C: Fluoreszenz von Mikrokügelchen (durch Schranke R1) aus emulgierten Reaktionen. Signale von Mikrokügelchen aus Reaktionen mit und ohne GST M2-2. LMB2-3 DNA sind jeweils als +DNA und –DNA angegeben. Signale von Mikrokügelchen aus Reaktionen mit und ohne rekombinantem GST M2-2 sind jeweils als +GST und –GST angegeben.
12. Synthese des eingeschlossenen biotinylierten Substrats EtNP-BzGlu-eingeschlossenes-Biotin (17).
13. Hydrolyse des PTE Substrats EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenen-Biotins (17), um das Produkt Et-Bz-Glu-eingeschlossenes-Biotin zu erhalten, und Freisetzen sowohl des Substrats als auch des Produkts, um das korrespondierende biotinylierte Substrat (EtNP-Bz-Glu-Biotin) und das Produkt (EtNP-Bz-Glu-Biotin) zu erhalten.
14. Herstellung von Protein Konjugaten eines PTE Substrats und Produkt für die Immunisierung und ELISA.
15. PTE katalysiert die Reaktion von EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin in der Anwesenheit von Streptavidin beschichteten Kügelchen, und die Reaktionsprodukte, die durch UV Bestrahlung freigesetzt werden, werden auf Kügelchen gefangen und unter Verwendung von Fluoreszenz markierten Anti-Produkt Antikörpern und Flusszytometrie nachgewiesen.
Ansicht A: Lichtstreuungseigenschaften der Kügelchen und durch eine Schranke selektiert hinsichtlich einzelnes Kügelchen (R2). Ansicht B: Fluoreszenz von Kügelchen (durch Schranke R2) aus Reaktionen mit 10 μM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin in der Anwesenheit von in vitro translatiertem OPD. LMB3-2biotin DNA Fragmente (OPD) oder M.HaeIII.LMB3-2biotin DNA Fragmente (M.HaeIII.) Ansicht C: Wie B, aber mit 20 mM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin. Ansicht D: Wie B, aber mit 50 μM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin.
16. Reaktion von EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin in der Anwesenheit von Kügelchen, an die genetische Elemente, welche die Phosphotriesterase, markiert mit dem Flag Peptid (N-Flag-OPD.LMB3-2biotin) oder einem anderen Enzym (N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotin) kodieren, wurden zusammen mit einem Antikörper angeheftet, der an das Flag Peptid bindet. Die Kügelchen wurden umgesetzt und anschließend durch Flusszytometrie wie im Text beschrieben analysiert.
Ansicht A: Lichtstreuungseigenschaften der Kügelchen und Schranke für einzelne Kügelchen (R1). Ansicht B: Fluoreszenz von Mikrokügelchen (durch Schranke R1), an die N-Flag-OPD.LMB3-2biotin DNA Fragmente (OPD) oder M.HaeIII.LMB3-2biotin DNA Fragmente (M.HaeIII) aus Reaktionen mit 12,5 μM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin angeheftet wurden. Ansicht C: Wie B, aber mit 25 μM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin.
17. In vitro transkribiertes und translatiertes E. coli BirA katalysiert eine Reaktion, die eine Änderung in den Fluoreszenzeigenschaften von Substrat markierten Mikrokugeln in den wässrigen Abschnitten einer Wasser-in-Öl Emulsion und in Masselösung hervorruft.
18. Flusszytometrische Analyse von Proben, die für das Sortierexperiment hergestellt wurden.
19. Fluoreszenz aktiviertes Flusszytometrie Sortieren der genetischen Elemente.
Ansicht A: Proben #1 bis #4 vor dem Sortieren und nach dem Sortieren. Ansicht B: Gene, die aus einzelnen Kügelchen aus Probe #3, sortiert in eine 96-Vertiefungsplatte, gewonnen wurden. Ansicht C: Gene, die aus einzelnen Kügelchen aus Probe #4, sortiert in eine 96-Vertiefungsplatte, gewonnen wurden. DNA Markierung (M) sind ϕX174-HaeIII Spaltungen.
(A) ALLGEMEINE BESCHREIBUNG
Die erfindungsgemäßen Mikrokapseln benötigen geeignete physikalische Eigenschaften, um die Durchführung der Erfindung zu erlauben.
Erstens, um sicherzustellen, dass die genetischen Elemente und Genprodukte nicht zwischen den Mikrokapseln diffundieren, werden die Inhalte jeder Mikrokapsel vorzugsweise aus den Inhalten der umgebenden Mikrokapseln isoliert, sodass es keinen oder wenig Austausch der genetischen Elemente und der Genprodukte zwischen den Mikrokapseln über die Zeitskala des Experiments gibt.
Zweitens macht es das Verfahren der vorliegenden Offenbarung notwendig, dass es nur eine begrenzte Anzahl von genetischen Elementen pro Mikrokapsel gibt. Dies stellt sicher, dass das Genprodukt eines einzelnen genetischen Elements aus anderen genetischen Elementen isoliert wird. Somit wird die Kopplung zwischen dem genetischen Element und dem Genprodukt hochspezifisch sein. Der Anreicherungsfaktor ist am größten mit durchschnittlich einem oder weniger genetischen Element/en pro Mikrokapsel, die Verknüpfung zwischen der Nukleinsäure und der Aktivität des kodierten Genprodukts ist so stark wie möglich, weil das Genprodukt eines einzelnen genetischen Elements aus den Produkten all der genetischen Elemente isoliert werden wird. Selbst wenn jedoch die theoretisch optimale Situation von durchschnittlich einem einzelnen genetischen Element oder weniger pro Mikrokapsel nicht verwendet wird, kann sich ein Verhältnis von 5, 10, 50, 100 oder 1000 oder mehr genetischen Elementen pro Mikrokapsel als vorteilhaft beim Sortieren einer großen Bibliothek erweisen. Anschließende Sortierrunden, einschließlich erneuerter Verkapselung mit unterschiedlicher Verteilung der genetischen Elemente werden ein stringenteres Sortieren der genetischen Elemente erlauben. Vorzugsweise gibt es ein einzelnes genetisches Element, oder weniger, pro Mikrokapsel.
Drittens hebt die Bildung und die Zusammensetzung der Mikrokapseln vorteilhafterweise nicht die Funktion der Maschinerie der Expression der genetischen Elemente und die Aktivität der Genprodukte auf.
Das/die geeignete/n System/e kann/können in Abhängigkeit von der präzisen Natur der Bedürfnisse in jeder Anwendung der Offenbarung variieren, wie für den Fachmann offensichtlich sein wird.
Eine große Vielzahl von Mikroverkapselungsverfahren stehen zur Verfügung (siehe Benita, 1996) und können verwendet werden, um die Mikrokapseln zu erzeugen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Tatsächlich wurden mehr als 200 Mikroverkapselungsverfahren in der Literatur identifiziert (Finch, 1993).
Diese schließen Membran umhüllte wässrige Vesikel, wie Lipid Vesikel (Liposomen) (New, 1990) und nicht ionische oberflächenaktive Vesikel (van Hal et al., 1996) ein. Dies sind geschlossene Membran umhüllte Kapseln aus einer oder mehreren Doppelschichten von nicht kovalent zusammen gelagerten Molekülen, wobei jede Doppelschicht von ihrem Nachbarn durch einen wässrigen Abschnitt getrennt ist. Im Fall von Liposomen ist die Membran aus Lipid Molekülen zusammengesetzt; dies sind für gewöhnlich Phospholipide, aber Sterole, wie Cholesterol, können auch in die Membrane eingebaut werden (New, 1990). Eine Vielzahl von Enzym katalysierten biochemischen Reaktionen, einschließlich RNA und DNA Polymerisation, können innerhalb der Liposomen durchgeführt werden (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
In einem Membran umhüllten Vesikelsystem befindet sich viel der wässrigen Phase außerhalb des Vesikels und ist deshalb nicht abgeteilt. Diese kontinuierliche wässrige Phase wird entfernt oder die biologischen Systeme in ihr inhibiert oder zerstört (zum Beispiel durch Spaltung der Nukleinsäuren mit DNase oder RNase), sodass die Reaktionen auf die Mikrokapseln beschränkt sind (Luisi et al., 1987).
Enzym katalysierte biochemische Reaktionen wurden auch in Mikrokapseln gezeigt, die durch eine Vielzahl von anderen Verfahren erzeugt wurden. Viele Enzyme sind in reversen mizellaren Lösungen aktiv (Bru & Walde, 1991; Bru & Walde 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988) wie das AOT-Isooctan Wassersystem (Menger & Yamada, 1979).
Mikrokapseln können auch durch Polymerisation zwischen zwei Flächen und Komplexation zwischen zwei Flächen (Whateley, 1996) erzeugt werden. Mikrokapseln dieser Art weisen steife nicht permeable Membrane oder semipermeable Membrane auf. Semipermeable Mikrokapseln, die durch Zellulosenitrat Membrane, Polyamid Membrane und Lipid-Polyamid Membrane begrenzt werden, können alle biochemische Reaktionen, einschließlich Multienzymsysteme unterstützen (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Alginat/Polylysin Mikrokapseln (Lim & Sun, 1980), die unter sehr milden Bedingungen gebildet werden können, haben sich auch als sehr bioverträglich erwiesen, und stellen zum Beispiel ein wirksames Verfahren zum Verkapseln lebender Zellen und Gewebe bereit (Chang, 1992; Sun et al., 1992).
Nicht membranöse Mikroverkapselungssysteme, die auf einer Phasenaufteilung einer wässrigen Umgebung in einem kolloidalen System, wie einer Emulsion, beruhen, können ebenfalls verwendet werden.
Vorteilhafterweise werden die erfindungsgemäßen Mikrokapseln aus Emulsionen gebildet; heterogenen Systemen von zwei nicht mischbaren flüssigen Phasen, wobei eine der Phasen in der anderen als Tröpfchen oder mikroskopisch oder von kolloidaler Größe verteilt ist (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Die Emulsionen können aus irgendeiner geeigneten Kombination von nicht mischbaren Flüssigkeiten hergestellt werden. Vorzugsweise weist die erfindungemäße Emulsion Wasser (enthaltend die biochemischen Bestandteile) als die Phase auf, die in der Form von fein verteilten Tröpfchen vorliegt (die verteilte, innere oder diskontinuierliche Phase) und eine hydrophobe, nicht mischbare Flüssigkeit (ein "Öl") als die Matrix, in der diese Tröpfchen suspendiert werden (die nicht verteilte, kontinuierliche oder äußere Phase). Solche Emulsionen werden als "Wasser-in-Öl" (W/O) bezeichnet. Dies weist den Vorteil auf, dass die gesamte wässrige Phase, welche die biochemischen Bestandteile enthält, in einzelne Tröpfchen (die innere Phase) aufgeteilt ist. Die äußere Phase, die ein hydrophobes Öl ist, enthält im Allgemeinen keine der biochemischen Bestandteile, und ist damit inert.
Die Emulsion kann durch die Zugabe von einem oder mehreren oberflächenaktiven Mitteln (oberflächenaktiven Mitteln) stabilisiert werden. Diese oberflächenaktiven Mittel werden als emulgierende Mittel bezeichnet und wirken an der Wasser/Öl Grenzfläche, um die Trennung der Phasen zu verhindern (oder zumindest zu verzögern). Viele Öle und viele Emulgatoren können für die Erzeugung von Wasser-in-Öl Emulsionen verwendet werden; eine kürzliche Zusammenstellung führte über 16.000 oberflächenaktive Mittel auf, von denen viele als emulgierende Mittel verwendet werden (Ash und Ash, 1993). Geeignete Öle schließen leichtes weißes Mineralöl und nicht ionische oberflächenaktiven Mittel (Schick, 1966), wie Sorbitan Monooleat (Span^TM80; ICI) und Polyoxyethylensorbitan Monooleat (Tween^TM80; ICI) ein.
Die Verwendung von anionischen oberflächenaktiven Mitteln kann ebenfalls vorteilhaft sein. Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen Natriumcholat und Natriumtaurocholat ein. Besonders bevorzugt ist Natriumdesoxycholat, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,5% w/v oder geringer. Der Einschluss von solchen oberflächenaktiven Mitteln kann in einigen Fällen die Expression der genetischen Elemente und/oder die Aktivität der Genprodukte erhöhen. Die Zugabe von einigen anionischen oberflächenaktiven Mitteln zu einer nicht emulgierten Reaktionsmischung verhindert vollständig die Translation. Während der Emulgation wird das oberflächenaktive Mittel jedoch von der wässrigen Phase in die Interphase transferiert, und die Aktivität wird wiederhergestellt. Die Zugabe eines anonischen oberflächenaktiven Mittels zu den Mischungen, die emulgiert werden sollen, stellt sicher, dass die Reaktionen nur nach der Aufteilung fortschreiten.
Die Bildung einer Emulsion benötigt im Allgemeinen die Anwendung von mechanischer Energie, um die Phasen unter Zwang zusammenzubringen. Es gibt eine Vielzahl von Wegen, dies durchzuführen, die eine Vielzahl von mechanischen Vorrichtungen verwenden, einschließlich Rührgeräten (wie magnetischen Rührfischen, Propeller und Turbinenrührern, Vorrichtungen mit Paddeln bzw. Armen und Schneebesen, Homogenisatoren (einschließlich Rotor-Stator Homogenisatoren, Hochdruck Schneebesen Ventil Homogenisatoren und Jet Homogenisatoren), Kolloidmühlen, Ultraschall und "Membranemulsions"-Vorrichtungen (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Wässrige Mikrokapseln, die in Wasser-in-Öl Emulsionen gebildet werden, sind im Allgemeinen stabil mit wenig, wenn überhaupt, Austausch von genetischen Elementen oder genetischen Produkten zwischen den Mikrokapseln. Zusätzlich haben wir gezeigt, dass einige biochemische Reaktionen in Emulsionsmikrokapseln fortschreiten. Darüber hinaus sind komplizierte biochemische Vorgänge, bemerkenswerterweise Gentranskription und -translation ebenfalls in Emulsionsmikro kapseln aktiv. Die Technologie existiert, um Emulsionen mit Volumina den ganzen Weg hinauf bis zu industriellen Maßstäben von Tausenden von Litern herzustellen (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Die bevorzugte Größe der Mikrokapsel wird in Abhängigkeit von den präzisen Erfordernissen irgendeines einzelnen Selektionsvorgangs, der erfindungsgemäß durchgeführt werden soll, variieren. In allen Fällen wird es eine optimale Balance zwischen der Größe der Genbibliothek, der benötigten Anreicherung und der benötigten Konzentration der Bestandteile in den einzelnen Mikrokapseln geben, um eine wirksame Expression und Relativität der Genprodukte zu erreichen.
Die Vorgänge der Expression finden innerhalb jeder einzelnen Mikrokapsel statt, die durch die vorliegende Offenbarung bereitgestellt wird. Sowohl in vitro Transkription als auch gekoppelte Transkription-Translation werden weniger wirksam bei subnanomolaren DNA Konzentrationen. Aufgrund des Erfordernisses, dass nur eine begrenzte Anzahl von DNA Molekülen in jeder Mikrokapsel anwesend ist, setzt dies deshalb eine praktische obere Grenze für die mögliche Größe der Mikrokapsel. Vorzugsweise beträgt das durchschnittliche Volumen der Mikrokapsel weniger als 5,2 × 10^–16 m³ (entspricht einer sphärischen Mikrokapsel mit einem Durchmesser von weniger als 10 ×m, weiter bevorzugt weniger als 6,5 × 10^–17 m³ (5 μm Durchmesser), weiter bevorzugt ungefähr 4,2 × 10^–18 m³ (2 μm Durchmesser) und idealerweise ungefähr 9 × 10^–18 m³ (2,6 μm Durchmesser).
Die wirksame DNA oder RNA Konzentration in den Mikrokapseln kann künstlich durch verschiedene Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sein werden, erhöht werden. Diese schließen zum Beispiel die Zugabe von Volumen ausschließenden Chemikalien, wie Polyethylenglykolen (PEG) und eine Vielzahl von Genamplifikationstechniken, einschließlich Transkription unter Verwendung von RNA Polymerasen einschließlich jenen aus Bakterien, wie E. coli (Roberts, 1969; Blattner und Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), Eukaryonten z.B. (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) und Bakteriophagen, wie T7, T3 und SP6 (Melton et al., 1984); die Polymerase Kettenreaktion (PCR) (Saiki et al., 1988); Qβ Replikase Amplifikation (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); die Ligase Kettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); und self-sustained Sequenz Replikationssystem (Fahy et al., 1991) und Strang Displacement Amplifikation (Walker et al., 1992), ein. Genamplifikationstechniken, die Temperaturzyklen benötigen, wie PCR und LCR, können verwendet werden, wenn die Emulsionen und die in vitro Transkription oder gekoppelten Transkriptions/Translationssysteme thermostabil sind (zum Beispiel können die gekoppelten Transkriptions-Translationssysteme aus einem thermostabilen Organismus, wie Thermus aquaticus, hergestellt werden).
Das Erhöhen der wirksamen lokalen Nukleinsäure Konzentration erlaubt es, dass größere Mikrokapseln wirksam verwendet werden können. Dies erlaubt eine bevorzugte obere Grenze für das Volumen der Mikrokapsel von ungefähr 5,2 × 10^–16 m³ (entspricht einer Kugel mit dem Durchmesser 10 μm).
Die Größe der Mikrokapsel ist vorzugsweise ausreichend groß, um all die benötigten Bestandteile der biochemischen Reaktionen, die innerhalb der Mikrokapsel vorkommen müssen, aufzunehmen. Zum Beispiel benötigen in vitro sowohl Transkriptionsreaktionen als auch gekoppelte Transkriptions-Translationsreaktionen eine Gesamt Nukleosidtriphosphat Konzentration von ungefähr 2 mM.
Um zum Beispiel ein Gen in ein einzelnes kurzes RNA Molekül von 500 Basen Länge zu transkribieren, würde dies ein Minimum von 500 Molekülen Nukleosidtrisphosphat pro Mikrokapsel (8,33 × 10^–22 mol) benötigen. Um eine 2 mM Lösung zu bilden, ist diese Zahl von Molekülen innerhalb einer Mikrokapsel mit einem Volumen von 4,17 × 10^–19 Liter (4,17 × 10^–22 m³), das, wenn es kugelförmig wäre, einen Durchmesser von 93 nm aufweisen würde.
Darüber hinaus, insbesondere für den Fall dass die Reaktionen Translation einschließen, wird angemerkt, dass die Ribosomen, die notwendig sind, damit die Translation stattfindet, selbst ungefähr 20 nm im Durchmesser groß sind. Somit ist die bevorzugte untere Grenze für Mikrokapseln ein Durchmesser von ungefähr 0,1 mm (100 nm).
Deshalb liegt das Volumen der Mikrokapsel vorzugsweise in der Größenordnung von zwischen 5,2 × 10²² m³ und 5,2 × 10¹⁶ m³, was einer Kugel im Durchmesser zwischen 0,1 μm und 10 μm, weiter bevorzugt von zwischen ungefähr 5,2 × 10^–19 m³ und 6,5 × 10^–17 m³ (1 mm und 5 μm) entspricht. Kugeldurchmesser von ungefähr 2,6 μm sind am vorteilhaftesten.
Es ist kein Zufall, dass die bevorzugten Dimensionen der Abschnitte (Tröpfchen von 2,6 μm mittlerem Durchmesser) stark jenen von Bakterien ähneln, zum Beispiel sind Escherichia 1,1–1,5 × 2,0–2,6 μm Stäbchen und Azotobacter sind 1,5–2,0 μm Durchmesser eiförmige Zellen. In ihrer einfachsten Form beruht die Darwinsche Evolution auf einem "ein Genotyp ein Phänotyp" Mechanismus. Die Konzentration eines einzelnen aufgeteilten Gens, oder Genoms, fällt von 0,4 nM in einem Abschnitt von 2 μm Durchmesser auf 25 pM in einem Abschnitt von 5 μm Durchmesser. Die prokaryotische Transkriptions/Translationsmaschinerie hat sich entwickelt, um in Abschnitten von ~1–2 μm Durchmesser zu arbeiten, wo einzelne Gene in ungefähr nanomolaren Konzentrationen vorliegen. Ein einzelnes Gen liegt in einem Abschnitt von 2,6 μm Durchmesser in einer Konzentration von 0,2 nM vor. Diese Genkonzentration ist für eine wirksame Translation hoch genug. Die Aufteilung in ein solches Volumen stellt auch sicher, dass selbst wenn nur ein einzelnes Molekül des Genprodukts gebildet wird, es in ungefähr 0,2 nM vorliegt, was wichtig ist, wenn das Genprodukt eine modifizierende Aktivität auf das genetische Element selbst haben wird. Das Volumen der Mikrokapsel wird somit derart ausgewählt, dass nicht nur die Bedürfnisse für Transkription und Translation des genetischen Elements berücksichtigt werden, sondern auch die modifizierende Aktivität, die von dem Genprodukt in dem erfindungsgemäßen Verfahren benötigt wird.
Die Größe der Emulsionsmikrokapseln kann einfach variiert werden durch Anpassen der Emulsionsbedingungen, die verwendet werden, um die Emulsion nach den Bedürfnissen des Selektionssystems zu bilden. Je größer die Größe der Mik rokapsel ist, desto größer ist das Volumen, das benötigt wird, um eine gegebene Bibliothek von genetischen Elementen einzukapseln, weil der letztendlich limitierende Faktor die Größe der Mikrokapsel und damit die Zahl der Mikrokapseln, die pro Einheit Volumen möglich ist, sein wird.
Die Größe der Mikrokapseln wird nicht nur bezüglich der Bedürfnisse des Transkriptions/Translationssystems ausgewählt, sondern auch bezüglich jener des Selektionssystems, das für das genetische Element eingesetzt wird. Somit können die Bestandteile des Selektionssystems, wie ein chemisches Modifikationssystem, Reaktionsvolumina und/oder Reagenskonzentrationen benötigen, die für die Transkription/Translation nicht optimal sind. Wie hier angegeben ist, können solche Bedürfnisse durch einen zweiten erneuten Verkapselungsschritt erfüllt werden; darüber hinaus können sie durch Auswählen der Größe der Mikrokapsel erfül lt werden, um die Transkription/Translation und die Selektion als Ganzes zu maximieren. Eine empirische Bestimmung des optimalen Volumens der Mikrokapsel und der Reagenskonzentration, wie zum Beispiel hier angegeben ist, ist bevorzugt.
Ein erfindungsgemäßes "genetisches Element" wird oben beschrieben. Vorzugsweise ist ein genetisches Element ein Molekül oder Konstrukt, das aus der Gruppe bestehend aus einem DNA Molekül, einem RNA Molekül, einem teilweise oder vollständig künstlichen Nukleinsäure Molekül, das vollständig oder aus einer Mischung von natürlich vorkommenden und synthetischen Basen besteht, irgendeinem der genannten, verknüpft mit einem Polypeptid, und irgendeinem der genannten, verknüpft mit einer anderen molekularen Gruppe oder einem anderen Konstrukt, ausgewählt ist. Vorteilhafterweise kann die andere molekulare Gruppe oder das andere Konstrukt aus der Gruppe, die aus Nukleinsäuren, polymeren Substanzen, insbesondere Kügelchen, zum Beispiel Polystyrol Kügelchen und magnetischen oder paramagnetischen Substanzen, wie magnetischen oder paramagnetischen Kügelchen, ausgewählt werden.
Der Nukleinsäure Abschnitt des genetischen Elements kann geeignete regulatorische Sequenzen umfassen, wie jene, die für eine wirksame Expression des Gen- Produkts benötigt werden, zum Beispiel Promotoren, Enhancer, Translationsinitiationssequenzen, Polyadenylierungssequenzen, Spleißstellen und ähnliches.
Wie durch das Folgende offensichtlich wird, ist in vielen Fällen das Polypeptid oder die andere molekulare Gruppe oder das andere Konstrukt ein Ligand oder ein Substrat, das/der direkt oder indirekt an das Genprodukt bindet oder mit ihm reagiert, um die optischen Eigenschaften des genetischen Elements zu verändern. Dies erlaubt das Sortieren des genetischen Elements auf der Basis der Aktivität des Genprodukts. Der Ligand oder das Substrat können mit der Nukleinsäure durch eine Vielzahl von Mitteln verbunden werden, die für den Fachmann offensichtlich sind (siehe zum Beispiel Hermanson, 1996).
Eine Art, wie das Nukleinsäure Molekül mit einem Liganden oder einem Substrat verknüpft werden kann, ist durch Biotinylierung. Dies kann durch PCR Amplifikation mit einem 5'-Biotinylierungsprimer durchgeführt werden, sodass das Biotin und die Nukleinsäure kovalent verknüpft sind.
Der Ligand oder das Substrat können an die modifizierte Nukleinsäure durch eine Vielzahl von Mittel angeheftet werden, die für den Fachmann offensichtlich sind (siehe zum Beispiel Hermanson, 1996). Eine biotinylierte Nukleinsäure kann an ein Polystyrol oder paramagnetisches Mikrokügelchen (0,02 bis ungefähr 5,0 μm im Durchmesser) angekoppelt werden, das mit Avidin oder Streptavidin beschichtet ist, sodass es an die Nukleinsäure mit sehr hoher Affinität binden wird. Dieses Kügelchen kann mit einem Substrat oder einem Liganden durch irgendein geeignetes Verfahren derivatisiert werden, wie durch Zugeben von biotinyliertem Substrat oder durch kovalentes Koppeln.
Alternativ kann eine biotinylierte Nukleinsäure an Avidin oder Streptavidin gekoppelt werden, das an ein großes Protein Molekül, wie Thyroglobulin (669 Kd) oder Ferritin (440 Kd) komplexiert ist. Dieser Komplex kann mit Substrat oder Ligand dervatisiert werden, zum Beispiel durch das Koppeln an die ε-Aminogruppe von Lysinen oder durch eine nicht kovalente Interaktion, wie Biotin-Avidin.
Das Substrat kann in einer mit dem genetischen Element unverknüpften Form vorliegen, aber ein inaktives "Tag" enthalten, das einen weiteren Schritt benötigt, um es zu aktivieren, wie Fotoaktivierung (z.B. eines "eingeschlossenen" Biotin Analogs, (Sundberg et al., 1995; Pirrung und Huang, 1996)). Der zu wählende Katalysator wandelt anschließend das Substrat in das Produkt um. Das "Tag" wird anschließend aktiviert, und das "markierte" Substrat und/oder Produkt wird durch ein Tag-bindendes Molekül (z.B. Avidin oder Streptavidin) mit der Nukleinsäure komplexiert. Das Verhältnis von Substrat zu Produkt, das über das "Tag" an die Nukleinsäure angeheftet ist, wird deshalb das Verhältnis des Substrats zu dem Produkt in Lösung reflektieren.
Eine Alternative ist es, die Nukleinsäure an einen Produkt spezifischen Antikörper (oder ein anderes Produkt spezifisches Molekül) zu koppeln. In diesem Szenario ist das Substrat (oder eines der Substrate) in jeder Mikrokapsel und nicht verknüpft mit dem genetischen Element anwesend, aber weist ein molekulares "Tag" (zum Beispiel Biotin, DIG oder DNP oder eine fluoreszierende Gruppe) auf. Wenn der zu wählende Katalysator das Substrat in das Produkt umwandelt, behält das Produkt das "Tag" und wird anschließend in der Mikrokapsel durch den Produkt spezifischen Antikörper gefangen. Auf diese Weise wird nur das genetische Element mit dem "Tag" assoziiert, wenn es ein Enzym kodiert oder bildet, das in der Lage ist, das Substrat in das Produkt umzuwandeln.
Die Begriffe "Isolieren", "Sortieren" und "Auswählen", ebenso wie Variationen davon, werden hier verwendet. Isolierung betrifft das Verfahren des Trennens eines Rests bzw. einer Einheit aus einer heterogenen Population, zum Beispiel einer Mischung, sodass es frei ist von mindestens einer Substanz, mit der er/sie vor dem Isolierungsverfahren assoziiert war. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft Isolierung die Reinigung einer Einheit bis im Wesentlichen zur Homogenität. Sortieren einer Einheit betrifft ein Verfahren zum vorzugsweise Isolieren gewünschter Einheiten gegenüber nicht gewünschten Einheiten. Soweit dies die Isolierung der gewünschten Einheiten betrifft, sind die Begriffe "Isolieren" und "Sortieren" äquivalent. Das Verfahren erlaubt das Sortieren von gewünschten genetischen Elementen aus Pools (Bibliotheken oder Repertoires) aus genetischen E lementen, die das gewünschte genetische Element enthalten. Selektieren wird verwendet, um auf das Verfahren (einschließlich des Sortierverfahrens) zum Isolieren einer Einheit nach einer bestimmten Eigenschaft davon Bezug zu nehmen.
In einer sehr bevorzugten Verwendung ist das Verfahren der vorliegenden Offenbarung nützlich zum Sortieren von Bibliotheken von genetischen Elementen. Demzufolge stellt die Offenbarung ein Verfahren gemäß vorangegangener Aspekte der Offenbarung bereit, wobei die genetischen Elemente aus einer Bibliothek von genetischen Elementen isoliert werden, die ein Repertoire von Genprodukten kodieren. Hier werden die Begriffe "Bibliothek", "Repertoire" und "Pool" gemäß ihrer ursprünglichen Bedeutung im Stand der Technik verwendet, sodass eine Bibliothek aus genetischen Elementen ein Repertoire von Genprodukten kodiert. Im Allgemeinen werden Bibliotheken aus Pools von genetischen Elementen konstruiert und weisen Eigenschaften auf, die das Sortieren erleichtern.
Die anfängliche Selektion eines genetischen Elements aus einer Bibliothek von genetischen Elementen unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung wird in den meisten Fällen das Screenen einer großen Anzahl von Varianten genetischer Elemente notwendig machen. Bibliotheken aus genetischen Elementen können in einer Vielzahl von verschiedenen Weisen einschließlich dem Folgenden hergestellt werden.
Pools von natürlich vorkommenden genetischen Elementen können aus genomischer DNA oder cDNA kloniert werden (Sambrook et al., 1989); zum Beispiel haben sich Bibliotheken aus Phagen Antikörpern, hergestellt durch PCR Amplifikationsrepertoires von Antikörper Genen aus immunisierten und nicht immunisierten Spendern als wirksame Quellen von funktionellen Antikörper Fragmenten erwiesen (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Genbibliotheken können auch durch das Kodieren aller (siehe zum Beispiel Smith, 1985; Parmley und Smith, 1988) oder eines Teils von Genen (siehe zum Beispiel Lowman et al., 1991) oder Pools von Genen (siehe zum Beispiel Nissim et al., 1994) durch ein randomisiertes oder dotiertes synthetisches Oligonukleotid hergestellt werden. Bibliotheken können auch durch das Einführen von Mutationen in ein genetisches Element oder einen Pool von genetischen Elementen "zufällig" durch eine Vielzahl von Techniken in vivo hergestellt werden, einschließlich der Verwendung von Mutatorstämmen von Bakterien, wie E. coli mutD5 (Liao et al., 1996; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); der Verwendung des Antikörper Hypermutationssystems von B-Lymphozyten (Yelamos et al., 1995). Zufällige Mutationen können auch sowohl in vivo als auch in vitro durch chemische Mutagene und Ionisierung oder UV Bestrahlung (siehe Friedberg et al., 1995) eingeführt werden, oder durch die Einführung von mutagenen Basen Analoga (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Zufällige Mutationen können auch in Gene in vitro während der Polymerisation zum Beispiel unter Verwendung von fehleranfälligen Polymerasen (Leung et al., 1989) eingeführt werden.
Eine weitere Diversifikation kann unter Verwendung von homologer Rekombination entweder in vivo (siehe Kowalczykowski et al., 1994) oder in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b) eingeführt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung wird deshalb ein Verfahren zur in vitro Evolution bereit gestellt, umfassend die Schritte:

(a) Auswählen eines oder mehrerer genetischer Elemente aus einer Bibliothek genetischer Elemente gemäß der vorliegenden Offenbarung;
(b) Mutieren des/der ausgewählten genetischen Elements/e, um eine weitere Bibliothek aus genetischen Elementen zu erzeugen, die ein Repertoire an Genprodukten kodiert; und
(c) erneutes Wiederholen der Schritte (a) und (b), um ein Genprodukt mit gesteigerter Aktivität zu erhalten.

Mutationen können in das/die genetischen Elemente eingeführt werden, wie oben angegeben ist.
Die genetischen Elemente gemäß der Offenbarung kodieren vorteilhafterweise Enzyme, vorzugsweise von pharmakologischem oder industriellem Interesse, Aktivatoren oder Inhibitoren, insbesondere biologischer Systeme, wie zellulärer Signaltransduktionsmechanismen, Antikörper und Fragmente davon, und andere Bindemittel (z.B. Transkriptionsfaktoren), die für diagnostische und therapeutische Anwendungen geeignet sind. In einem bevorzugten Aspekt erlaubt die Offenbarung deshalb die Identifizierung und Isolierung von klinisch oder industriell nützlichen Produkten. In einem weiteren Aspekt der Offenbarung wird ein Produkt bereitgestellt, wenn es durch das Verfahren der Offenbarung isoliert wurde.
Die Auswahl von geeigneten Verkapselungsbedingungen ist wünschenswert. In Abhängigkeit von der Komplexität und Größe der Bibliothek, die gescreent werden soll, kann es vorteilhaft sein, ein Verkapselungsverfahren auszuwählen, sodass 1 oder weniger als 1 genetisches Element pro Mikrokapsel verkapselt wird. Dies liefert die größte Auflösung. Wo die Bibliothek größer und/oder komplexer ist, kann dies jedoch unpraktikabel sein; es kann vorteilhaft sein, einige genetische Elemente zusammen zu verkapseln und sich auf die wiederholte Anwendung des Verfahrens der Offenbarung zu verlassen, um ein Sortieren der gewünschten Aktivität zu erreichen. Eine Kombination von Verkapselungsverfahren kann verwendet werden, um die gewünschte Anreicherung zu erhalten.
Theoretische Studien zeigen, dass, je größer die Anzahl von Varianten des genetischen Elements ist, die gebildet werden, desto wahrscheinlicher ist es, dass ein Molekül mit den gewünschten Eigenschaften gebildet wird (siehe Perelson und Oster, 1979 für eine Beschreibung wie dies auf Repertoires von Antikörpern zutrifft). Kürzlich ist ebenfalls praktisch bestätigt worden, dass große Phagen-Antikörper Repertoires tatsächlich mehr Antikörper mit besseren Bindungsaffinitäten als kleinere Repertoires hervorrufen (Griffiths et al., 1994). Um sicherzustellen, dass seltene Varianten erzeugt werden und damit in der Lage sind, ausgewählt zu werden, ist eine große Bibliotheksgröße wünschenswert. Somit ist die Verwendung von wahlweise kleinen Mikrokapseln vorteilhaft.
Das größte Repertoire, das bis heute unter Verwendung von Verfahren, die einen in vivo Schritt (Phagen Display und LacI Systeme) benötigen, gebildet wurde, war eine 1,6 × 10¹¹ Klon Phagen-Peptid Bibliothek, welche die Fermentation von 15 Liter Bakterien benötigt (Fisch et al., 1996). SELEX Experimente werden häufig mit sehr großen Zahlen von Varianten (bis zu 10¹⁵) durchgeführt.
Unter Verwendung der vorliegenden Offenbarung, bei einem bevorzugten Durchmesser der Mikrokapsel von 2,6 μm kann eine Repertoiregröße von mindestens 10¹¹ unter Verwendung von 1 ml wässriger Phase in einer 20 ml Emulsion ausgewählt werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen genetischen Elementen werden die Mikrokapseln gemäß der Offenbarung weitere Bestandteile umfassen, die notwendig sind, damit das Sortierverfahren stattfindet. Andere Bestandteile des Systems werden zum Beispiel jene umfassen, die für die Transkription und/oder Translation des genetischen Elements notwendig sind. Diese werden hinsichtlich der Bedürfnisse eines spezifischen Systems aus den Folgenden ausgewählt; ein geeigneter Puffer, ein in vitro Transkriptions/Translationssystem und/oder ein in vitro Translationssystem, das all die notwendigen Bestandteile, Enzyme und Kofaktoren, RNA Polymerase, Nukleotide, Nukleinsäuren (natürlich und synthetisch), Transfer RNAs, Ribosomen und Aminosäuren, und die Substrate der interessierenden Reaktion enthält, um die Auswahl des modifizierten Genprodukts zu erlauben.
Ein geeigneter Puffer ist einer, in dem all die gewünschten Bestandteile des biologischen Systems aktiv sind, und er wird deshalb von den Bedürfnissen jedes spezifischen Reaktionssystems abhängen. Puffer, die für biologische und/oder chemische Reaktionen geeignet sind, sind im Stand der Technik bekannt, und Herstellungsprotokolle werden in verschiedenen Laborhandbüchern, wie Sambrook et al., 1989 bereitgestellt.
Das in vitro Translationssystem wird für gewöhnlich einen Zellextrakt, typischerweise aus Bakterien (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), Kaninchen Retikulozyten (Pelham und Jackson, 1976) oder Weizenkeim (Anderson et al., 1983) umfassen. Viele geeignete Systeme sind kommerziell erhältlich (zum Beispiel von Promega), einschließlich einiger, die eine gekoppelte Transkription/Translation (all die bakteriellen Systeme und die Retikulozyten und Weizenkeim TNT^TM Extraktsysteme von Promega) erlauben. Die Mischung von Aminosäuren, die verwendet wird, kann synthetische Aminosäuren, wenn ge wünscht, einschließen, um die mögliche Anzahl von Varietät der Proteine zu erhöhen, die in der Bibliothek gebildet werden. Dies kann erreicht werden, indem tRNAs mit künstlichen Aminosäuren beladen werden und diese tRNAs in der in vitro Translation der Proteine, die ausgewählt werden sollen, verwendet werden (Ellman et al., 1991; Renner, 1994; Mendel et al., 1995).
Nach jeder Selektionsrunde kann die Anreicherung des Pools der genetischen Elemente hinsichtlich jener, die interessierende Moleküle kodieren, durch nicht aufgeteilte in vitro Transkription/Replikation oder gekoppelte Transkriptions-Translationsreaktionen untersucht werden. Der ausgewählte Pool wird in einen geeigneten Plasmid Vektor kloniert, und RNA oder rekombinantes Protein wird aus den einzelnen Klonen für die weitere Reinigung und den Assay hergestellt.
In einem bevorzugten Aspekt kann die äußere Umgebung einer Mikrokapsel durch Zugabe von Reagenzien zu der Ölphase der Emulsion verändert werden. Die Reagenzien diffundieren durch die Ölphase zu der wässrigen Umgebung der Mikrokapsel. Vorzugsweise sind die Reagenzien mindestens teilweise wasserlöslich, sodass ein Teil davon von der Ölphase in die wässrige Umgebung der Mikrokapsel verteilt wird. Vorteilhafterweise sind die Reagenzien im Wesentlichen in der Ölphase unlöslich. Die Reagenzien werden vorzugsweise in die Ölphase durch mechanisches Mischen, zum Beispiel Vortexen, gemischt.
Die Reagenzien, die über die Ölphase zugegeben werden können, schließen Substrate, Pufferbestandteile, Faktoren und ähnliches ein. Insbesondere kann der innere pH-Wert der Mikrokapseln in situ durch Zugeben von sauren oder basischen Bestandteilen zu der Ölphase verändert werden.
Die Offenbarung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts, sobald ein genetisches Element, welches das Genprodukt kodiert, durch das Verfahren der Offenbarung sortiert wurde. Eindeutig kann das genetische Element selbst direkt durch herkömmliche Mittel, um das Genprodukt herzustellen, exprimiert werden. Jedoch können alternative Techniken eingesetzt werden, wie für den Fachmann offensichtlich ist. Zum Beispiel kann die genetische Information, die in das Genprodukt eingeschlossen ist, in einen geeigneten Expressionsvektor eingebaut werden und von dort exprimiert werden.
Die Offenbarung beschreibt auch die Verwendung von herkömmlichen Screening Techniken, um Verbindungen zu identifizieren, die in der Lage sind, mit den Genprodukten zu interagieren, die in dem ersten Aspekt der Offenbarung identifiziert wurden. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Nukleinsäure, die das Genprodukt kodiert, in einen Vektor eingebaut und in geeignete Wirtszellen eingeführt, um transformierte Zelllinien herzustellen, die das Genprodukt exprimieren. Die resultierenden Zelllinien können anschließend für reproduzierbare qualitative und/oder quantitative Analyse der Wirkung/en von potenziellen Arzneimitteln, welche die Funktion des Genprodukts beeinflussen, hergestellt werden. Somit können Zellen, die das Genprodukt exprimieren, für die Identifizierung von Verbindungen, insbesondere Verbindungen mit geringem Molekulargewicht, welche die Funktion des Genprodukts modulieren, eingesetzt werden. Somit sind Wirtszellen, die das Genprodukt exprimieren, für das Screenen von Arzneimitteln nützlich, und es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereitzustellen, welche die Aktivität des Genprodukts modulieren, das Verfahren umfasst das Exponieren von Zellen, die heterologe DNA enthalten, die das Genprodukt kodiert, wobei die Zellen das funktionelle Genprodukt herstellen, gegenüber mindestens einer Verbindung oder Mischung von Verbindungen oder einem Signal, dessen Fähigkeit, die Aktivität des Genprodukts zu modulieren, bestimmt werden soll, und danach das Überwachen der Zellen hinsichtlich Änderungen, die durch die Modulation verursacht wurden. Ein solcher Assay erlaubt die Identifizierung von Modulatoren, wie Agonisten, Antagonisten und allosterischen Modulatoren des Genprodukts. So wie hier verwendet, betrifft eine Verbindung oder ein Signal, welche/s die Aktivität des Genprodukts moduliert, eine Verbindung, welche die Aktivität des Genprodukts in einer solchen Weise verändert, dass die Aktivität des Genprodukts in der Anwesenheit der Verbindung oder des Signals unterschiedlich ist (im Vergleich zu der Abwesenheit der Verbindung oder des Signals).
Zell basierte Screening Assays können ausgestaltet werden, indem Zelllinien konstruiert werden, in denen die Expression eines Reporter Proteins, d.h. eines einfach erreichbaren Proteins, wie β-Galactosidase, Chloramphenicol Acetyltransferase (CAT), grün fluoreszierendes Protein (GFP) oder Luziferase von dem Genprodukt abhängig ist. Ein solcher Assay erlaubt den Nachweis von Verbindungen, die direkt die Funktion des Genprodukts modulieren, wie Verbindungen, die das Genprodukt antagonisieren, oder Verbindungen, die andere zelluläre Funktionen inhibieren oder verstärken, die für die Aktivität des Genprodukts benötigt werden.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch ein Verfahren bereit, um exogen wirkende Genprodukt abhängige Vorgänge, die in Zellen stattfinden, zu beeinflussen. Wirtszellen, die das rekombinante Genprodukt herstellen, z.B. Säugetierzellen, können mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht werden, und die modulierende/n Wirkung/en davon können anschließend durch Vergleichen der Genprodukt vermittelten Antwort in der Anwesenheit und Abwesenheit der Testverbindung oder die Genprodukt vermittelte Antwort von Testzellen oder Kontrollzellen (d.h. Zellen, die das Genprodukt nicht exprimieren) gegenüber der Anwesenheit der Verbindung bewertet werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Offenbarung ein Verfahren zum Optimieren eines Herstellungsverfahrens, das mindestens einen Schritt einschließt, der durch ein Polypeptid erleichtert wird. Zum Beispiel kann der Schritt ein katalytischer Schritt sein, der durch ein Enzym erleichtert wird. Somit stellt die Offenbarung ein Verfahren zum Herstellen einer Verbindung oder Verbindungen bereit, umfassend die Schritte:

(a) Bereitstellen eines Syntheseprotokolls, indem mindestens ein Schritt durch ein Polypeptid erleichtert wird;
(b) Herstellen genetischer Elemente, die Varianten des Polypeptids kodieren, das diesen Schritt erleichtert, dessen Expression direkt oder indirekt zu der Modifikation der optischen Eigenschaften der genetischen Elemente führen kann;
(c) Aufteilen der genetischen Elemente in Mikrokapseln;
(d) Exprimieren der genetischen Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte innerhalb der Mikrokapseln herzustellen;
(e) Sortieren der genetischen Elemente, die (ein) Polypeptid Genprodukt/e mit der gewünschten Aktivität unter Verwendung der veränderten optischen Eigenschaften des genetischen Elements herstellen; und
(f) Herstellen der Verbindung oder der Verbindungen unter Verwendung des Polypeptid Genprodukts, das in (g) identifiziert wurde, um den relevanten Schritt in der Synthese zu erleichtern.

Mittels der Offenbarung können Enzyme, die in die Herstellung einer Verbindung eingeschlossen sind, durch Selektion hinsichtlich optimaler Aktivität optimiert werden. Das Verfahren schließt die Herstellung von Varianten des zu screenenden Polypeptids ein, die einer Polypeptid Bibliothek, auf die hier Bezug genommen wird, gleichzustellen sind. Die Varianten können auf dieselbe Weise hergestellt werden wie die Bibliotheken, die hier an anderer Stelle diskutiert sind.
(B) SELEKTIONSVERFAHREN
Das System kann konfiguriert werden, um hinsichtlich RNA, DNA oder Protein Genprodukt Moleküle mit katalytischer, regulatorischer oder Bindungsaktivität zu selektieren.
(i) SELEKTION HINSICHTLICH BINDUNG
Im Fall der Selektion eines Genprodukts mit Affinität für einen spezifischen Liganden kann das genetische Element mit dem Genprodukt in der Mikrokapsel über den Liganden verknüpft werden. Nur Genprodukte mit Affinität für den Liganden werden deshalb an das genetische Element binden, und nur jene genetischen Elemente mit dem über den Liganden gebundenen Genprodukt werden die veränderten optischen Eigenschaften annehmen, was es ihnen erlaubt, in einen Selektionsschritt eingeschlossen zu werden. In dieser Ausführungsform wird das genetische Element somit eine Nukleinsäure umfassen, die ein Genprodukt kodiert, das mit einem Liganden für das Genprodukt verknüpft ist.
Die Änderung in den optischen Eigenschaften des genetischen Elements nach Bindung des Genprodukts an den Liganden kann in einer Vielzahl von Wegen induziert werden, einschließlich:

(1) Das Genprodukt selbst kann unterscheidbare optische Eigenschaften aufweisen, zum Beispiel kann es fluoreszierend (z.B. grün fluoreszierendes Protein (Lorenz et al., 1991)) sein.
(2) Die optischen Eigenschaften des Genprodukts können bei der Bindung an den Liganden modifiziert werden, zum Beispiel wird die Fluoreszenz des Genprodukts bei der Bindung gequenscht oder erhöht (Guixe et al., 1998; Qi und Grabowski, 1998).
(3) Die optischen Eigenschaften des Liganden können bei der Bindung des Genprodukts modifiziert werden, zum Beispiel wird die Fluoreszenz des Liganden bei der Bindung gequenscht oder verstärkt (Voss, 1993; Masui und Kuramitsu, 1998).
(4) Die optischen Eigenschaften sowohl des Liganden als auch des Genprodukts werden bei der Bindung modifiziert, zum Beispiel kann es einen Fluoreszenz Resonanz Energietransfer (FREI) von dem Liganden zu dem Genprodukt (oder vice versa) geben, was zur Emission bei der "Akzeptor" Emissionswellenlänge führt, wenn die Anregung bei der "Donor" Absorptionswellenlänge stattfindet (Heim & Tsien, 1996; Mahajan et al., 1998; Miyawaki et al., 1997).

In dieser Ausführungsform ist es nicht notwendig für die Bindung des Genprodukts an das genetische Element über den Liganden, die Änderungen in den optischen Eigenschaften direkt zu induzieren. All die selektierbaren Genprodukte können eine putative Bindungsdomäne enthalten, die selektiert werden kann, und ein gemeinsam Merkmal – ein Tag. Das genetische Element in jeder Mikrokapsel ist physikalisch mit dem Liganden verknüpft. Wenn das Genprodukt, das von dem genetischen Element hergestellt wird, eine Affinität für den Liganden aufweist, wird es an ihn binden und es wird physikalisch mit demselben genetischen Element verknüpft, das es kodiert, was dazu führt, dass das genetische Element "markiert" ist. Am Ende der Reaktion werden alle Mikrokapseln vereinigt und alle genetischen Elemente und Genprodukte zusammen in einer Umgebung gepoolt. Die genetischen Elemente, die Genprodukte kodieren, welche die gewünschte Bindung zeigen, können durch Zugeben von Reagenzien ausgewählt werden, die spezifisch mit dem "Tag" binden oder spezifisch mit ihm interagieren und dadurch eine Änderung in den optischen Eigenschaften des genetischen Elements induzieren, was ihr Sortieren erlaubt. Zum Beispiel kann ein fluoreszent markierter Anti-"Tag" Antikörper oder ein Anti-"Tag" Antikörper gefolgt von einem zweiten fluoresezent markierten Antikörper, der an den ersten bindet, verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform können die genetischen Elemente auf der Basis sortiert werden, dass das Genprodukt, das den Liganden bindet, den Liganden nur zum Beispiel vor weiteren Bindungspartnern schützt, die ansonsten die optischen Eigenschaften des genetischen Elements modifizieren würden. In diesem Fall würden genetische Elemente mit nicht modifizierten optischen Eigenschaften ausgewählt werden.
In einer alternativen Ausführungsform stellt die Offenbarung ein Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Offenbarung bereit, in dem in Schritt (b) die Genprodukte an genetische Elemente binden, die sie kodieren. Die Genprodukte zusammen mit den angehefteten genetischen Elementen werden anschließend als ein Ergebnis der Bindung eines Liganden an Genprodukte mit der gewünschten Bindungsaktivität sortiert. Zum Beispiel können alle Genprodukte eine nicht variable Region enthalten, die kovalent oder nicht kovalent an das genetische Element bindet, und eine zweite Region, die verschiedenartig ist, um die gewünschte Bindungsaktivität zu erzeugen.
In einer alternativen Ausführungsform wird der Ligand für das Genprodukt selbst durch das genetische Element kodiert und bindet an das genetische Element. Anders gesagt, kodiert das genetische Element zwei (oder tatsächlich mehr) Genprodukte, von denen mindestens eines an das genetische Element bindet, und die potenziell aneinander binden können. Nur wenn die Genprodukte in der Mikrokapsel miteinander interagieren, wird das genetische Element in einer Weise modifiziert, die schließlich zu einer Änderung in ihren optischen Eigenschaften führt, die es erlaubt, dass sie sortiert werden. Diese Ausführungsform wird zum Beispiel verwendet, um Genbibliotheken nach Genpaaren zu durchsuchen, die Proteinpaare kodieren, die aneinander binden.
Die Fluoreszenz kann durch die Verwendung der Tyramide Signal Amplification (TSA^TM) Amplifikation erhöht werden, um die genetischen Elemente fluoreszieren zu lassen. Dies schließt die Bindung von Peroxidase (verknüpft mit einem anderen Protein) an die genetischen Elemente und das Katalysieren der Umsetzung von Fluoreszein-Tyramin in eine freie radikalische Form ein, die dann (lokal) mit den genetischen Elementen reagiert. Verfahren zum Durchführen von TSA sind im Stand der Technik bekannt, und Kits sind kommerziell von NEN erhältlich.
TSA kann derart konfiguriert sein, dass es zu einem direkten Anstieg in der Fluoreszenz des genetischen Elements führt, oder derart, dass ein Ligand an das genetische Element angeheftet ist, der an ein zweites fluoreszierendes Molekül oder eine Sequenz von Molekülen, von denen eines oder mehrere fluoreszierend ist/sind, gebunden ist.
(ii) SELEKTION HINSICHTLICH KATALYSE
Wenn die Selektion hinsichtlich einer Katalyse stattfindet, kann das genetische Element in jeder Mikrokapsel das Substrat der Reaktion umfassen. Wenn das genetische Element ein Genprodukt kodiert, das in der Lage ist als ein Katalysator zu wirken, wird das Genprodukt die Umsetzung des Substrats in das Produkt katalysieren. Deshalb ist am Ende der Reaktion das genetische Element physikalisch mit dem Produkt der katalysierten Reaktion verknüpft.
Es kann auch in einigen Fällen wünschenswert sein, dass das Substrat nicht ein Bestandteil des genetischen Elements ist. In diesem Fall würde das Substrat ein inaktives "Tag" enthalten, das einen weiteren Schritt benötigt, um es zu aktivieren, wie Fotoaktivierung (zum Beispiel eines "eingeschlossenen" Biotin Analogs, (Sundberg et al., 1995; Pirrung und Huang, 1996)). Der zu selektierende Katalysator setzt anschließend das Substrat in das Produkt um. Das "Tag" wird anschließend aktiviert, und das "markierte" Substrat und/oder das Produkt, das durch ein Tag-bindendes Molekül (z.B. Avidin oder Streptavidin) gebunden ist, wird mit der Nukleinsäure komplexiert. Das Verhältnis von Substrat zu Produkt, das an die Nukleinsäure über das "Tag" angeheftet ist, wird deshalb das Verhältnis des Substrats zu dem Produkt in Lösung widerspiegeln.
Die optischen Eigenschaften der genetischen Elemente mit angeheftetem Produkt und welche die Genprodukte mit der gewünschten katalytischen Aktivität kodieren, können weiter modifiziert werden durch entweder:

(1) der Komplex aus Produkt-genetischem Element weist charakteristische optische Eigenschaften auf, die in dem Komplex aus Substrat-genetischem Element nicht gefunden werden, aufgrund von entweder;
(a) das Substrat und das Produkt weisen verschiedene optische Eigenschaften auf (viele fluorogene Enzymsubstrate sind kommerziell erhältlich (siehe zum Beispiel Haugland, 1996), einschließlich Substraten für Glucosidase, Phosphatase, Peptidase und Protease (Craig et al., 1995; Huang et al., 1992; Brynes et al., 1982; Jones et al., 1997; Matayoshi et al. 1990; Wang et al., 1990)), oder
(b) das Substrat und das Produkt weisen gleiche optische Eigenschaften auf, aber nur das Produkt und nicht das Substrat bindet an oder reagiert mit dem genetischen Element;
(2) Zugeben von Reagenzien, die spezifisch an das Produkt binden oder mit ihm reagieren und die dadurch eine Änderung in den optischen Eigenschaften der genetischen Elemente induzieren, was ihr Sortieren erlaubt (diese Reagenzien können vor oder nach dem Aufbrechen der Mikrokapseln und dem Poolen der genetischen Elemente zugegeben werden). Die Reagenzien:
(a) binden spezifisch an oder reagieren spezifisch mit dem Produkt und nicht mit dem Substrat, wenn sowohl das Substrat als auch das Produkt an das genetische Element angeheftet sind, oder
(b) wahlweise binden sowohl das Substrat als auch das Produkt wenn nur das Produkt und nicht das Substrat an das genetische Element binden oder mit ihm reagieren.

Die gepoolten genetischen Elemente, die katalytische Moleküle kodieren, können anschließend durch Auswählen hinsichtlich der genetischen Elemente mit modifizierten optischen Eigenschaften angereichert werden.
Eine Alternative ist es, die Nukleinsäure an einen Produkt spezifischen Antikörper (oder andere Produkt spezifische Moleküle) zu koppeln. In diesem Szenario ist das Substrat (oder eines der Substrate) in jeder Mikrokapsel unverknüpft mit dem genetischen Element anwesend, aber weist ein molekulares "Tag" (zum Beispiel Biotin, DIG oder DNP oder eine fluoreszierende Gruppe) auf. Wenn der auszuwählende Katalysator das Substrat in das Produkt umsetzt, behält das Produkt das "Tag" und wird anschließend in der Mikrokapsel durch den Produkt spezifischen Antikörper eingefangen. Auf diese Weise wird das genetische Element nur mit dem "Tag" assoziiert, wenn es ein Enzym kodiert oder herstellt, das in der Lage ist, das Substrat in das Produkt umzusetzen. Wenn alle Reaktionen gestoppt sind und die Mikrokapseln vereinigt werden, sind die genetischen Elemente, die aktive Enzyme kodieren, "markiert" und können bereits die optischen Eigenschaften geändert haben, wenn zum Beispiel das "Tag" eine fluoreszierende Gruppe war. Alternativ dazu kann eine Änderung in den optischen Eigenschaften von "markierten" Genen" durch Hinzufügen eines fluoreszent markierten Liganden, der das "Tag" (zum Beispiel fluoreszent markiertes Avidin/Streptavidin, ein Anti-"Tag" Antikörper der fluoreszierend ist, oder ein nicht fluoreszenter Anti-"Tag" Antikörper, der durch einen zweiten fluoreszent markierten Antikörper nachgewiesen werden kann) induziert werden.
Alternativ dazu kann die Selektion indirekt durchgeführt werden durch Koppeln einer ersten Reaktion an nachfolgende Reaktionen, die in derselben Mikrokapsel stattfinden. Es gibt zwei allgemeine Wege, wie dies durchgeführt werden kann. In einer ersten Ausführungsform wird das Produkt der ersten Reaktion mit einem Molekül umgesetzt oder von einem Molekül gebunden, das nicht mit dem Substrat der ersten Reaktion reagiert. Eine zweite, gekoppelte Reaktion wird nur in der Anwesenheit des Produkts der ersten Reaktion ablaufen. Ein genetisches Element, das ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität kodiert, kann anschließend unter Verwendung der Eigenschaften des Produkts der zweiten Reaktion gereinigt werden, um eine Änderung in den optischen Eigenschaften des genetischen Elements, wie oben, zu induzieren.
Alternativ dazu kann das selektierte Produkt der Reaktion das Substrat oder der Kofaktor für eine zweite Enzym katalysierte Reaktion sein. Das Enzym, das die zweite Reaktion katalysiert, kann entweder in situ in den Mikrokapseln translatiert oder in die Reaktionsmischung vor der Mikroverkapselung eingebaut werden. Nur wenn die erste Reaktion abläuft wird das gekoppelte Enzym ein Produkt erzeugen, das verwendet werden kann, um eine Änderung in den optischen Eigenschaften des genetischen Elements, wie oben, zu induzieren.
Dieses Konzept des Koppelns kann erweitert werden, um mehrere Enzyme einzubauen, wobei jedes als ein Substrat das Produkt der vorherigen Reaktion verwendet. Dies erlaubt die Auswahl von Enzymen, die nicht mit einem immobilisierten Substrat reagieren. Es kann auch derart ausgestaltet werden, um eine gesteigerte Sensitivität durch Signalamplifikation zu verleihen, falls ein Produkt einer Reaktion ein Katalysator oder ein Kofaktor für eine zweite Reaktion oder eine Reihe von Reaktionen ist, die zu einem selektierbaren Produkt führen (zum Beispiel siehe Johannsson und Bates, 1988; Johannsson, 1991). Darüber hinaus kann ein System mit einer Enzym Kaskade auf der Herstellung eines Aktivators für ein Enzym oder die Zerstörung eines Enzym Inhibitors (siehe Mize et al., 1989) beruhen. Das Koppeln weist auch den Vorteil auf, dass ein gemeinsames Selektionssystem für eine ganze Gruppe von Enzymen verwendet werden kann, die dasselbe Produkt erzeugen und die Selektion von komplizierten chemischen Transformationen erlauben, die nicht in einem einzelnen Schritt durchgeführt werden können.
Ein solches Verfahren zum Koppeln erlaubt somit die Evolution von neuen "metabolischen Wegen" in vitro in einer schrittweisen Art, wobei zuerst ein Schritt selektiert und verbessert wird und dann der nächste. Die Selektionsstrategie beruht auf dem Endprodukt des Weges, sodass alle früheren Schritte unabhängig oder nacheinander ohne ein neues Selektionssystem für jeden Schritt der Reaktion aufsetzen zu müssen, evolviert werden können.
Anders ausgedrückt wird ein Verfahren zum Isolieren eines oder mehrerer genetischer Elemente, das/die ein Genprodukt mit einer gewünschten katalytischen Aktivität kodiert/en bereitgestellt, umfassend die Schritte:

(1) Exprimieren genetischer Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu ergeben;
(2) Zulassen, dass die Genprodukte die Umsetzung des Substrats in ein Produkt katalysieren, das direkt selektierbar sein kann oder nicht, in Übereinstimmung mit der gewünschten Aktivität;
(3) wahlweise Koppeln der ersten Reaktion an eine oder mehrere nachfolgende Reaktionen, wobei jede Reaktion durch das Produkt der vorherigen Reaktionen moduliert wird, und was zu der Bildung des selektierbaren Endprodukts führt;
(4) Verknüpfen des selektierbaren Produkts der Katalyse an die genetischen Elemente durch entweder:
(a) Koppeln eines Substrats an die genetischen Elemente in einer solchen Weise, dass das Produkt mit den genetischen Elementen assoziiert bleibt, oder
(b) Umsetzen oder Binden des selektierbaren Produkts an die genetischen Elemente mittels eines geeigneten molekularen "Tags", das an das Substrat angeheftet ist, das an dem Produkt verbleibt, oder
(c) Koppeln des selektierbaren Produkts (aber nicht des Substrats) an die genetischen Elemente mittels einer Produkt spezifischen Reaktion oder Interaktion mit dem Produkt; und
(5) Selektieren des Produkts der Katalyse, zusammen mit dem genetischen Element, an das es gebunden ist, entweder mittels seiner charakteristischen optischen Eigenschaften oder durch Zugeben eines Reagens, das spezifisch an das Produkt bindet oder mit ihm reagiert und das dadurch eine Änderung in den optischen Eigenschaften der genetischen Elemente induziert, wobei die Schritte (1) bis (4) jedes genetischen Elements und des jeweiligen Genprodukts in einer Mikrokapsel enthalten ist.

(iii) SELEKTION HINSICHTLICH ENZYM SUBSTRATSPEZIFITÄT/SELEKTIVITÄT
Genetische Elemente, die Enzyme mit Substratspezifität oder Selektivität kodieren, können spezifisch angereichert werden, indem eine positive Selektion hinsichtlich der Reaktion mit einem Substrat und eine negativen Selektion für die Reaktion mit einem anderen Substrat durchgeführt wird. Ein solcher kombinierter positiver und negativer Selektionsdruck sollte von großer Wichtigkeit beim Isolieren regioselektiver und stereoselektiver Enzyme sein (zum Beispiel Enzyme, die zwischen zwei Enantiomeren desselben Substrats unterscheiden können). Zum Beispiel werden zwei Substrate (z.B. zwei verschiedene Enantiomere) jeweils mit verschiedenen Tags markiert (z.B. zwei verschiedene Fluorophore), sodass die Tags an das genetische Element durch die Enzym katalysierte Reaktion angeheftet werden. Wenn die zwei Tags verschiedene optische Eigenschaften an das genetische Element verleihen, kann die Substratspezifität des Enzyms aus den optischen Eigenschaften des genetischen Elements bestimmt werden, und jene genetischen Elemente, die Genprodukte mit der falschen (oder keiner) Spezifität kodieren, werden verworfen. Tags, die keine Änderung in der optischen Aktivität verleihen, können ebenfalls verwendet werden, wenn Tag spezifische Liganden mit verschiedenen optischen Eigenschaften zugegeben werden (z.B. Tag spezifische Antikörper, die mit verschiedenen Fluorophoren markiert sind).
(iv) SELEKTION HINSICHTLICH REGULATION
Ein ähnliches System kann verwendet werden, um hinsichtlich regulatorischen Eigenschaften von Enzymen zu selektieren.
Im Fall der Selektion hinsichtlich eines Regulator Moleküls, das als ein Aktivator oder Inhibitor eines biochemischen Verfahrens wirkt, können die Bestandteile des biochemischen Verfahrens entweder in situ in jeder Mikrokapsel translatiert werden, oder sie können in die Reaktionsmischung vor der Mikroverkapselung eingeschlossen werden. Wenn das selektierte genetische Element einen Aktivator kodieren soll, kann die Selektion hinsichtlich des Produkts der regulierten Reaktion, wie oben im Zusammenhang mit Katalyse beschrieben, durchgeführt werden. Wenn ein Inhibitor gewünscht ist, kann die Selektion hinsichtlich einer chemischen Eigenschaft, die spezifisch für das Substrat der regulierten Reaktion ist, durchgeführt werden.
Es wird deshalb ein Verfahren zum Sortieren eines oder mehrerer genetischer Elemente bereitgestellt, die für ein Genprodukt kodieren, das eine gewünschte regulatorische Aktivität zeigt, umfassend die Schritte:

(1) Exprimieren genetischer Elemente, um ihre jeweiligen Genprodukte zu ergeben;
(2) Aktivieren oder Inhibieren einer biochemischen Reaktion durch die Genprodukte oder der Sequenz der gekoppelten Reaktionen in Übereinstimmung mit der gewünschten Aktivität in einer solchen Weise, um die Bildung oder das Überleben eines selektierbaren Moleküls zu erlauben;
(3) Verknüpfen des selektierbaren Moleküls an die genetischen Elemente entweder durch
(a) das Vorhandensein des selektierbaren Moleküls oder des Substrats, von dem es stammt, angeheftet an die genetischen Elemente, oder
(b) Reagieren oder Binden des selektierbaren Produkts an die genetischen Elemente durch ein geeignetes molekulares "Tag", das an das Substrat angeheftet ist, das an dem Produkt verbleibt, oder
(c) Koppeln des Produkts der Katalyse (aber nicht des Substrats) an die genetischen Elemente mittels einer Produkt spezifischen Reaktion oder Interaktion mit dem Produkt;
(4) Selektieren des selektierbaren Produkts, zusammen mit dem genetischen Element, an das es gebunden ist, entweder mittels seiner charakteristischen optischen Eigenschaften oder durch Zugeben von Reagenzien, die spezifisch an das Produkt oder mit ihm reagieren, die dadurch eine Änderung in den optischen Eigenschaften des genetischen Elements induzieren, wobei die Schritte (1) bis (3) jedes genetischen Elements und des jeweiligen Genprodukts innerhalb einer Mikrokapsel enthalten sind.

(v) SELEKTION HINSICHTLICH OPTISCHER EIGENSCHAFTEN DES GENPRODUKTS
Es ist möglich, nach inhärenten optischen Eigenschaften von Genprodukten in Mikrokapseln zu selektieren, das Genprodukt bindet zurück an das genetische Element, zum Beispiel durch ein gemeinsames Element des Genprodukts, das an einen Liganden bindet, der Teil des genetischen Elements ist. Nach dem Poolen der genetischen Elemente können sie anschließend unter Verwendung der optischen Eigenschaften der zurückgebundenen Genprodukte sortiert werden. Diese Ausführungsform kann zum Beispiel verwendet werden, um Varianten des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP) zu selektieren (Cormack et al., 1996; Delagrave et al., 1995; Ehrig et al., 1995), mit verbesserter Fluoreszenz und/oder neuen Absorptions- und Emissionsspektren.
(vi) FLUSSSORTIEREN VON GENETISCHEN ELEMENTEN
In einer bevorzugten Ausführungsform der Offenbarung werden die genetischen Elemente durch Flusszytometrie sortiert. Eine Vielzahl von optischen Eigenschaften kann verwendet werden, um das Sortieren auszulösen, einschließlich Lichtstreuung (Kerker, 1983) und Fluoreszenzpolymerisation (Rolland et al., 1985). In einer stark bevorzugten Ausführungsform wird der Unterschied in optischen Eigenschaften der genetischen Elemente ein Unterschied in der Fluoreszenz sein, und die genetischen Elemente werden unter Verwendung eines Fluoreszenz aktivierten Sortiergeräts (Norman, 1980; Mackenzie und Pinder, 1986) oder einer ähnlichen Vorrichtung sortiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das genetische Element ein nicht fluoreszierendes, nicht magnetisches (z.B. Polystyrol) oder paramagnetisches Mikrokügelchen (siehe Formusek und Vetvicka, 1986), optimalerweise 0,6 bis 1,0 μm Durchmesser, an das sowohl das Gen als auch die Gruppen angeheftet sind, die in das Erzeugen eines fluoreszierenden Signals eingeschlossen sind:

(1) die kommerziell erhältliche Fluoreszenz aktivierte Zellsortierausstattung von etablierten Herstellern (z.B. Becton-Dickinson, Coulter) erlaubt das Sortieren von bis zu 10⁸ genetischen Elementen (Ereignissen) pro Stunde;
(2) das Fluoreszenzsignal aus jedem Kügelchen entspricht eng der Zahl der fluoreszierenden Moleküle, die an das Kügelchen angeheftet sind. Gegenwärtig können so wenige wie einige hundert fluoreszierende Moleküle pro Partikel quantitativ nachgewiesen werden;
(3) der weite dynamische Bereich der Fluoreszenzdetektoren (typischerweise 4 Log Einheiten) erlaubt eine leichte Anpassung der Stringenz des Sortierverfahrens, wodurch die Rückgewinnung der optimalen Zahl von genetischen Elementen aus dem Ausgangspool erlaubt wird (die Schranken können derart gesetzt werden, um die Kügelchen mit kleinen Unterschieden in der Fluoreszenz zu trennen, oder nur Kügelchen mit großen Unterschieden in der Fluoreszenz zu trennen, in Abhängigkeit von der durchzuführenden Selektion;
(4) kommerziell erhältliche Fluoreszenz aktivierte Zellsortierausstattung kann die gleichzeitige Anregung bei bis zu zwei verschiedenen Wellenlängen durchführen und Fluoreszenz bei bis zu vier verschiedenen Wellenlängen (Shapiro, 1983) nachweisen, was es erlaubt, positive und negative Selektionen gleichzeitig durch Überwachen der Markierung des genetischen Elements mit zwei (oder mehr) verschiedenen fluoreszierenden Markern durchzuführen, zum Beispiel, wenn zwei alternative Substrate für ein Enzym (z.B. zwei verschiedene Enantiomere) mit verschiedenen fluoreszierenden Tags markiert sind, kann das genetische Element mit verschiedenen Fluorophoren in Abhängigkeit von dem verwendeten Substrat markiert werden, und nur Gene, die Enzyme mit Enantioselektivität werden selektiert.
(5) hoch einheitliche derivatisierte und nicht derivatisierte, nicht magnetische und paramagnetische Mikropartikel (Kügelchen) sind kommerziell aus vielen Quellen verfügbar (z.B. Sigma und Molecular Probes) (Formusek und Vetvicka, 1986).

(vii) MEHRSTUFIGES VERFAHREN
Es wird ebenfalls begrüßt, dass es gemäß der vorliegenden Offenbarung nicht notwendig ist für all die Verfahren der Transkription/Replikation und/oder Translation und der Selektion, dass sie in einem Schritt ablaufen, wobei all die Reaktionen in einer Mikrokapsel stattfinden. Das Selektionsverfahren kann zwei oder mehr Schritte umfassen. Zuerst kann die Transkription/Replikation und/oder Translation des genetischen Elements aus einer Bibliothek von genetischen Elementen in einer ersten Mikrokapsel stattfinden. Jedes Genprodukt wir anschließend mit dem genetischen Element verknüpft, das es kodiert (das in derselben Mikrokapsel vorliegt), zum Beispiel über einen Genprodukt spezifischen Liganden, wie einen Antikörper. Die Mikrokapsel wird anschließend aufgebrochen, und die genetischen Elemente, die an ihre jeweiligen Genprodukte angeheftet sind, werden wahlweise gereinigt. Alternativ dazu können die genetischen Elemente an ihre jeweiligen Genprodukte unter Verwendung von Verfahren, die nicht auf Verkapselung beruhen, angeheftet werden. Zum Beispiel Phagen Display (Smith, G. P., 1985), Polysemen Display (Mattheakkis et al., 1994), RNA-Peptid Fusion (Roberts und Szostak, 1997) oder lac Repressor Peptid Fusion (Cull et al., 1992).
In einem zweiten Schritt des Verfahrens wird jedes genetische Element, das an sein Genprodukt angeheftet ist, in eine zweite Mikrokapsel gegeben, die Bestandteile der Reaktion, die selektiert werden soll, enthält. Diese Reaktion wird anschließend initiiert. Nach Abschluss der Reaktionen werden die Mikrokapseln wiederum aufgebrochen, und die modifizierten genetischen Elemente werden selektriert. Im Fall von komplizierten mehrstufigen Reaktionen, in die viele einzelne Bestandteile und Reaktionsschritte eingeschlossen sind, können einer oder mehrere zwischengelagerte Schritte zwischen dem Anfangsschritt der Bildung und dem Verknüpfen des Genprodukts mit dem genetischen Element, und dem Endschritt des Erzeugens einer selektierbaren Änderung in dem genetischen Element durchgeführt werden.
Falls notwendig kann die Freisetzung des Genprodukts von dem genetischen Element innerhalb der zweiten Mikrokapsel auf eine Vielzahl von Weisen erreicht werden, einschließlich spezifischer Kompetition durch ein Produkt mit niedrigem Molekulargewicht hinsichtlich der Bindungsstelle oder Spaltung einer Linkerregion. welche die Bindungsdomäne des Genprodukts begleitet, von der katalytischen Domäne, entweder enzymatisch (unter Verwendung spezifischer Proteasen) oder autokatalytisch (unter Verwendung einer Integrin Domäne).
(viii) SELEKTION DURCH AKTIVIERUNG VON REPORTER GENEXPRESSION IN SITU
Das System kann derart konfiguriert werden, dass die gewünschte Bindung, katalytische oder regulatorische Aktivität, die durch ein genetisches Element kodiert wird, direkt oder indirekt zu der Aktivierung der Expression eines "Reportergens" führt, das in allen Mikrokapseln anwesend ist. Nur Genprodukte mit der gewünschten Aktivität aktivieren die Expression des Reportergens. Die Aktivität, die aus der Reporter Genexpression resultiert, erlaubt die Selektion des genetischen Elements (oder des Abschnitts, der es enthält), durch irgendeines der hier beschriebenen Verfahren.
Zum Beispiel kann die Aktivierung des Reportergens das Ergebnis einer Bindungsaktivität des Genprodukts in einer Weise analog zu dem "Two Hybrid System" (Fields und Song, 1989) sein. Die Aktivierung kann auch von dem Produkt einer Reaktion resultieren, die durch ein gewünschtes Genprodukt katalysiert ist. Zum Beispiel kann das Reaktionsprodukt ein transkriptioneller Induktor des Reportergens sein. Zum Beispiel kann Arabinose verwendet werden, um die Transkription von dem araBAD Promotor zu induzieren. Die Aktivität des gewünschten Genprodukts kann auch zu der Modifikation eines Transkriptionsfaktors führen, was zu der Expression des Reportergens führt. Wenn das gewünschte Genprodukt zum Beispiel eine Kinase oder Phosphatase ist, kann die Phosphorylierung oder Dephosphorylierung eines Transkriptionsfaktors zur Aktivierung der Reporter Genexpression führen.
(ix) AMPLIFIKATION
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Offenbarung umfasst das Verfahren den weiteren Schritt des Amplifizierens der genetischen Elemente. Die selektive Amplifikation kann als ein Mittel verwendet werden, um hinsichtlich genetischer Elemente, die ein gewünschtes Genprodukt kodieren, anzureichern.
In all den obigen Konfigurationen kann das genetische Material, das in den genetischen Elementen umfasst ist, amplifiziert werden, und das Verfahren kann in wiederkehrenden Schritten wiederholt werden. Die Amplifikation kann durch die Polymerase Kettenreaktion (Saiki et al., 1988) oder durch die Verwendung einer Vielzahl von anderen Gen Amplifikationstechniken einschließlich; Qβ Replikase Amplifikation (Cahill, Foster und Mahan, 1991; Chetverin und Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov und Spirin, 1995); die Ligase Kettenreaktion (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); das self-sustained Sequenz Replikationssystem (Fahy, Kwoh und Gingeras, 1991) und Strang Verlagerungsamplifikation (engl.: strand displacement amplification) (Walker et al., 1992) durchgeführt werden.
Verschiedene Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und der vorliegenden Offenbarung sind in den folgenden Beispielen dargestellt.
Alle im Text genannten Dokumente sind durch Bezugnahme eingeschlossen.
BEISPIELE
Beispiel 1.
Enzyme können von Genen in Lösung und Genen, die an paramagnetische Kügelchen angeheftet sind, mit identischer Wirksamkeit exprimiert werden.
Ein Formt für die Selektion von genetischen Elementen unter Verwendung einer Änderung in ihren optischen Eigenschaften ist eines, bei dem das genetische Element ein Mikrokügelchen umfasst, an welches das Gen angeheftet ist. Hier wird gezeigt, wie ein Gen für ein Enzym (E. coli Dihydrofolat Reduktase) mit einem paramagnetischen Kügelchen verknüpft werden kann und in vitro genauso wirksam wie in Lösung translatiert wird.
Das E. coli folA Gen, das Dihydrofolat Reduktase (DHFR) kodiert, wird unter Verwendung der Oligonukleotide EDHFRFo und EDHFRBa PCR amplifiziert. Diese DNA wird anschließend in den pGEM-4Z Vektor (Promega) kloniert, der mit HindIII und KpnI unterhalb des lac Promotors und des T7 RNA Polymerase Promotors gespalten wird. Das Oligonukleotid EDHFRBa hängt die wirksame Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle oberhalb des DHFR Startcodons an.
Die DNA Sequenzierung identifiziert einen Klon, der die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. In Bakterien, die mit diesem Klon (pGEM-folA) transformiert werden, wird gefunden, dass sie aktives DHFR (getrieben von dem lac Promotor) überexprimieren, wenn sie mit IPTG induziert werden.
Das folA Gen in dem pGEM-folA Plasmid wird anschließend PCR amplifiziert unter Verwendung der Primer folA-FW und folA-BW, das resultierende DNA Fragment wird mit HindIII und XhoI gespalten und in den HindIII/XhoI gespaltenen pET23a Expressionsvektor (Novagen) subkloniert, um das Konstrukt pET23a/folA zu ergeben. Die Sequenz des PCR amplifizierten folA Gens wurde durch Sequenzieren verifiziert.
pET23a/folA wurde weiter mit den 5'-biotinylierten Primern pETfor.b und pETrev.b amplifiziert und durch Einschließen von 10 μCi α³⁵S-dATP (Amersham Pharmacia Biotech, U. K.) in den PCR Mix radioaktiv markiert. Das resultierende 1765 bp doppelt biotinylierte Fragment T7-folA wurde unter Verwendung eines Qiagen Kits gelgereinigt und spektrofotometrisch quantifiziert. Die spezifische Aktivität des Produkts betrug 210000 CPM/pmol T7-folA DNA, wie durch den Beckman LS6000SC Szintillationszähler gemessen wurde. Es wurden 10 nM und 1 nM Verdünnungen dieser DNA in 1 mg/ml HindIII gespaltener Lambda DNA hergestellt, um eine nicht spezifische Bindung an das Plastik zu eliminieren. Dieses PCR Fragment wurde daran anschließend verwendet, um ein prokaryotisches in vitro gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem zu programmieren, das für lineare Matrizen entwickelt wurde (Lesley, Brow und Burgess, 1991). Eine kommerzielle Präparation dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega), das mit T7 RNA Polymerase (10³ Einheiten) ergänzt wurde.
Das DNA Fragment ist an Streptavidin-paramagnetische Kügelchen (0,74 μm Durchmesser Sera-Mag Kügelchen, Biotin Bindungskapazität 46 nmol/mg, Sera dyn, USA), die teilweise mit biotinyliertem Protein A (Sigma) vorbeschichtet wurden, gebunden 2 μl 80 μM biotinyliertes Protein A wird zu 100 μl (1 mg) Kügelchen zugegeben, bei Raumtemperatur für 1 Stunde gebunden, einmal gewaschen und für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Kaninchen IgG (10 μl 1 mg/ml Antikörper pro 1 mg Kügelchen in TBS/0,1% Tween 20 (TEST)) beschichtet. Die Kügelchen wurden anschließend zweimal mit TBS/T gewaschen, bevor radioaktiv markierte biotinylierte T7-folA DNA zugegeben wurde und für 1 Stunde bei Raumtemperatur gebunden wurde. Die Menge an gebundener T7-folA DNA wurde durch Zählen der Radioaktivität, die an ein Aliquot der Kügelchen gebunden war, berechnet. ~50% der Gesamt DNA war gebunden.
DNA Fragmente, die an Kügelchen gebunden waren oder ungebundenes DNA Fragment wurde direkt zu dem S30 Extrakt System zugegeben. Die Reaktionen wurden für 2 Stunden bei 37°C inkubiert.
Die Dihydrofolat Reduktaseaktivität wird durch spektrofotometrisches Überwachen der Oxidation von NADPH zu NADP bei 340 nm über 10 Minuten Zeitverlauf, wie von Williams et al., 1979; Ma et al., 1993 beschrieben, untersucht. 2 μl jeder gequenschten in vitro Translationsreaktion wird zu 150 μl Puffer A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM β-Mercaptoethanol) und 20 μl 1 mM NADPH zugegeben. 20 μl Dihydrofolat (1 mM) (H₂F) wird nach 1 Minute zugegeben, und die Reaktion wird bei 340 nm unter Verwendung eines ThermoMax Mikroplatten Lesegeräts (Molecular Devices) überwacht. Die Aktivität wird durch Anfangsgeschwindigkeiten unter So >> K_M Bedingungen (υmax) berechnet.
Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der Menge von aktiver gebildeter DHFR wenn die DNA frei ist oder über terminale Biotine an ein Streptavidin beschichtetes Kügelchen angeheftet ist (siehe 1).
Beispiel 2.
Ein fluoreszierendes Protein (GFP) kann in vitro von Genen translatiert werden, die an einzelne Mikrokügelchen angeheftet sind, die in dem wässrigen Abschnitt einer Wasser-in-Öl Emulsion verkapselt sind, und das translatierte Genprodukt wird an die Mikrokügelchen zurückgebunden, was sie fluoreszieren lässt.
Ein Format für die Selektion von genetischen Elementen ist, wo das genetische Element ein Gen umfasst, das an ein Mikrokügelchen angeheftet ist, und das Produkt wird an das Mirokügelchen innerhalb der Mikrokapsel zurückgebunden, was direkt oder indirekt zu einer Veränderung in den optischen Eigenschaften des Mikrokügelchens führt, was es ihm erlaubt, sortiert zu werden.
Hier wird gezeigt, dass ein fluroeszierendes Protein (grün fluoreszierendes Protein oder GFP) in vitro von Genen transkribiert und translatiert werden kann, die an einzelne Mikrokügelchen angeheftet sind, die in den wässrigen Abschnitten einer Wasser-in-Öl Emulsion verkapselt sind, und das translatierte Genprodukt wird an die Mikrokügelchen zurückgebunden, was sie fluoreszieren lässt.
Das GFP in dem pBS/GFP6 Plasmid (Siemering et al, 1996) wurde PCR amplifiziert unter Verwendung der Primer GFP-FW und GFP-BW, das resultierende DNA Fragment wurde mit HindIII und XhoI gespalten und in den HindIII/XhoI gespaltenen pET23a Expressionsvektor (Novagen) subkloniert, um das Konstrukt pET23a/GFP zu ergeben. Die Sequenz des PCR amplifizierten GFP Gens wurde durch Sequenzieren verifiziert. pET23a/GFP wurde weiter mit den 5'-biotinylierten Primern pETfor.b und pETrev.b amplifiziert. Das resultierende 2038 bp doppelt biotinylierte Fragment T7-GFP wurde gelgereinigt unter Verwendung eines Qiagen Kits und spektrofotometrisch quantifiziert. Es wurden 10 nM und 1 nM Verdünnungen dieser DNA in 1 mg/ml HindIII gespaltener Lambda DNA hergestellt, um unspezifische Bindung an das Plastik zu eliminieren. Dieses PCR Fragment wurde anschließend verwendet, um ein prokaryontes in vitro gekoppeltes Transkriptions/Translationssystem zu programmieren, das für lineare Matrizen ausgestaltet war (Lesley, Brow und Burgess, 1991). Eine kommerzielle Präparation dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega), das mit T7 RNA Polymerase (10³ Einheiten) ergänzt wurde.
Als eine Kontrolle wurde ein biotinyliertes 1765 bp DNA Fragment T7-folA (synthetisiert durch PCR wie in Beispiel 1) verwendet, um die Synthese des nicht fluoreszierenden Proteins DHFR zu programmieren.
150 μl ProActive Streptavidin beschichtete paramagnetische Kügelchen (Bangs Laborstories, 2 × 10⁷ Kügelchen/μl) wurden in 5 mM Tris 7,4/1 M NaCl/0,1% Tween 20 suspendiert und in drei Aliquots von 50 μl aufgeteilt. 0,5 μl 0,2 μM DNA (T7-folA oder T7-GFP) wurde zu jedem Aliquot der Kügelchen zugegeben, bei 43°C für 15 min inkubiert, dreimal in 25 mM NaH₂PO₄, 125 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,0 (PBS/0,1% Tween 20) gewaschen, in 40 μl TBST resuspendiert, und 10 μl 80 μM biotinyliertes Protein A (Sigma) wurde zugegeben (um eine Endkonzentration von 15 μM zu ergeben). Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Kügelchen dreimal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen und in 20 μl 1:10 Verdünnung Kaninchen Anti-GFP polyklonalem Antikörper (Clontech) oder 1 mg/ml nicht immunisiertem Kaninchen IgG (Sigma) resuspendiert. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Kügelchen dreimal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen und in 15 μl des S30 Prämix aus einem E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen (Promega) resuspendiert, für eine Minute in einem Beschallungsbad sonifiziert, anschließend wurde der Rest der S30 in vitro Translationsmischung zugegeben (auf Eis) und mit T7 RNA Polymerase (10³ Einheiten) ergänzt.
Die 50 μl eiskalten in vitro Translationsreaktionen wurden schrittweise (in 5 Aliquots 10 μl über ~2 Minuten) zu 0,95 ml eiskalter Ölphase (frisch hergestellt durch Lösen von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904), gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074) in ein 5 ml Costar Biofreeze Gefäß (#2051)) zugegeben, während mit einem magnetischen Rührtisch gerührt wurde (8 × 3 mm mit einem Drehring; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Das Rühren (bei 1150 rpm) wurde für weitere 3 Minuten auf Eis fortgesetzt. Die Reaktionen wurden anschließend 3 h bei 32°C inkubiert.
2 μl der Emulsion wurden auf einem Mikroskop Objektträger unter einem 13 mm runden Deckgläschen verteilt und unter Verwendung eines 20 × Neofluar Objektivs auf einem Axioplan Mikroskop (Zeiss) sichtbar gemacht, das mit einer RTEA CCD-1300-Y CCD Kamera (Princeton Instruments) ausgestattet war. Es wurden Standard Anregungs- und Emissionsfilter für Fluoreszein verwendet, und die Bilder wurden mit IPLab Software verarbeitet.
Wie in 2 gesehen werden kann, ist das GFP, das von Genen translatiert wurde, die an einzelne Mikrokügelchen angeheftet waren, die in dem wässrigen Abschitt der Emulsionen verkapselt sind, an die Mikrokügelchen in situ gebunden, wenn die Mikrokügelchen mit einem Anti-GFP Antikörper beschichtet sind. Diese Bindung wird als Konzentration der Fluoreszenz auf den Kügelchen durch Epifluoreszenz Mikroskopie beobachtet. Es wird keine Fluoreszenz der Kügelchen beobachtet, wenn entweder das GFP Gen oder der Anti-GFP Antikörper fehlen.
Beispiel 3.
Ein fluoreszierendes Protein (GFP) kann in vitro von Genen translatiert werden, die an einzelne Mikrokügelchen angeheftet sind, die in wässrigen Abschnitten einer Wasser-in-Öl Emulsion verkapselt sind, das translatierte Genprodukt wird an die Mikrokügelchen zurückgebunden, und die erhöhte Fluoreszenz der Mikrokügelchen wird durch Flusszytometrie nachgewiesen.
150 μl Streptavidin beschichtete Polystyrol Kügelchen (Durchmesser 1 μM; Bangs Laborstories, 2 × 10⁷ Kügelchen/μl) wurden in 5 mM Tris 7,4/1 M NaCl/0,1% Tween 20 suspendiert und in drei Aliquots à 50 μl aufgeteilt. 0,5 μl 0,2 μM DNA (T7-folA oder T7-GFP) wurden zu jedem Aliquot der Kügelchen zugegeben, bei 43°C für 15 min inkubiert, dreimal in 25 mM NaH₂PO₄, 125 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,0 (PBS/0,1% Tween 20) gewaschen, in 40 μl TBST resuspendiert, und 10 μl 80 μM biotinyliertes Protein A (Sigma) wurden zugegeben (um eine Endkonzentration von 15 μM zu ergeben). Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Kügelchen dreimal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen und in 20 μl 1:10 Verdünnung Kaninchen Anti-GFP polyklonalem Antikörper (Clontech) oder 1 mg/ml nicht immunisiertem Kaninchen IgG (Sigma) resuspendiert. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Kügelchen dreimal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen und in 15 μl S30 Prämix aus einem E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen (Promega) resuspendiert, für eine Minute in einem Beschallungsbad sonifiziert, anschließend wurde der Rest der S30 in vitro Translationsmischung zugegeben (auf Eis) und mit T7 RNA Polymerase (10³ Einheiten) ergänzt. Die 50 μl eiskalten in vitro Translationsreaktionen wurden schrittweise (in 5 Aliquots à 10 μl über ~2 Minuten) zu 0,95 ml eiskalter Ölphase (frisch hergestellt durch Lösen von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904), gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074) in einem 5 ml Costar Biofreeze Gefäß (#2051)) zugegeben, während mit einem magnetischen Rührfisch gerührt wurde (8 × 3 mm mit einem Drehring; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Das Rühren (bei 1150 rpm) wurde für weitere 3 Minuten auf Eis fortgesetzt. Die Reaktionen wurden anschließend 3 h bei 32°C inkubiert. Um die Reaktionsmischungen zurückzugewinnen wurden die Emulsionen bei 3000 g für 5 Minuten zentrifugiert, und die Ölphase wurde entfernt, was die konzentrierte (aber immer noch intakte) Emulsion am Boden des Gefäßes zurückließ. PBS und 2 ml Wasser gesättigter Ether wurden zugegeben, und die Mischung wurde gevortext, kurz zentrifugiert, und die Etherphase wurde entfernt. Die Kügelchen wurden zweimal mit PBS gewaschen und schließlich zu 10⁸ Kügelchen/ml in PBS resuspendiert. 10⁴ Kügelchen wurden unter Verwendung eines FACScalibur Flusszytometers (Becton Dickinson) unter Verwendung einer Anregung bei 488 nm und eines Fluoreszein Emissionsfilters analysiert. Das GFP, das von Genen translatiert wurde, die an einzelne Mikrokügelchen angeheftet waren, die in den wässrigen Abschnitten der Emulsionen verkapselt waren, ist an die Mikrokügelchen in situ gebunden, wenn die Mikrokügelchen mit einem Anti-GFP Antikörper beschichtet werden. Die Bindung von GFP an die Mikrokügelchen lässt diese fluoreszieren (2), und jene Kügelchen mit gebundenem GFP können eindeutig von jenen, die dies nicht tun, durch Flusszytometrie unterschieden werden (3).
Beispiel 4
Das Produkt einer Enzym katalysierten Reaktion kann auf paramagnetischen Kügelchen gefangen werden, und Kügelchen, die mit Produkt derivatisiert sind, können durch Flusszytometrie identifiziert werden.
Es wurde eine Reaktion, die durch das Enzym humane Glutathion S-Transferase M2-2 (GST M2-2) kataysiert wird, durchgeführt, um ein biotinyliertes Produkt zu erzeugen (4). Die beiden verwendeten Substrate waren 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB; Sigma) und reduziertes biotinyliertes Glutathion (Biotin-GSH). Das erzeugte Produkt (Biotin-GS-DNP) weist Biotin an dem einen Ende auf, um ein Koppeln an Streptavidin beschichtete paramagnetische Mikropartikel zu erlauben, und eine 2,4-Dinitrophenol (DNP) Gruppe, die von einem Anti-DNP Antikörper gebunden werden kann.
Biotin-GSH wurde synthetisiert durch Zugeben von 100 mg Biotinamidocaproat N-Hydroxysuccinimidester (Biotin-NHS; Sigma) in 1 ml DMF zu einer Lösung aus oxidiertem Glutathion (Fluka) in 1 ml Wasser, 30 μl 12,5 N NaOH plus 1 ml DMF. Das Biotin-NHS wurde auf Eis in 100 μl Aliquots über 20 Minuten zugegeben. Der pH-Wert wurde anschließend auf 7,0 mit 1 N NaOH eingestellt. Das Sirup ähnliche Präzipitat, das sich während der Reaktion bildete, wurde durch Erwärmen bei Raumtemperatur, Vortexen und Zugeben von 300 μl Wasser gelöst. Das Rühren wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur fortgesetzt, der pH-Wert wurde auf 7,0 durch Zugeben von 1 N NaOH und Rühren über Nacht bei Raumtemperatur zurückgebracht. NaOH wurde anschließend verwendet, um den pH-Wert auf 7,5 zurückzubringen, die Reaktion wurde für weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und anschließend weitere 30 Minuten nach dem Zugeben von 500 μl 1 M DTT inkubiert. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum verdampft, und das Produkt wurde durch reverse Phase HPLC unter Verwendung einer C8 Säule und eines Gradienten aus 10–40% Acetonitril, 0,1% TFA gereinigt. Biotin-GS-DNP wurde enzymatisch in einer 100 μl Reaktion mit 1 μg gereinigtem rekombinanten GST M2-2, 500 μM CDNB und 200 μM Biotin-GSH in 0,1 M KH₂PO₄, 1 mM EDTA, pH 6,5 synthetisiert. Die Inkubation erfolgte für 1 Stunde bei 25°C. Die Reaktion fand im Wesentlichen bis zur Vollständigkeit statt, wie durch das Überwachen des Anstiegs in der Absorption bei 340 nm bewertet wurde. Kontrollreaktionen wurden ebenfalls durchgeführt 1) ohne GST, 2) ohne CDNB, und 3) ohne Biotin-GSH. Die Reaktionen wurden 200-fach in 5 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, 1,0 NaCl, pH 7,4 (B/W Puffer) verdünnt (was eine Endkonzentration von 1 μM Biotin ergab). 50 ml der verdünnten Reaktionen wurden mit 50 μl B/W Puffer mit 29,3 μg (10⁸ Mikropartikeln) 0,737 μm Durchmesser Sera-Mag^TM Streptavidin beschichteten magnetischen Mikropartikeln (MG-SA; Seradyn) gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikropartikel wurden in einer Mikrotiterplatte (Falcon 3911) unter Verwendung eines Magneten (Dynal MPC-96) getrennt und dreimal mit 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 2,0 M NaCl, pH 7,4 (2 × B/W Puffer), anschließend zweimal mit PBS, 0,1% Tween 20 gewaschen. Die Mikropartikel wurden in einer 1:2500 Verdünnung des Maus Anti-Dinitrophenol monoklonalen Antikörpers SPE 21-11 (eine Gabe von Prof. Zelig Eshhar) in PBS/0,1% Tween 20 resuspendiert und 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikropartikel wurden anschließend dreimal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen, in PBS/0,1% Tween 20 enthaltend 15 μg/ml Fluoreszein (FITC)-konjugiertes F(ab')₂ Fragment Ziege Anti-Maus IgG, F(ab')₂ Fragment (Jackson; 115-096-006) resuspendiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikropartikel wurden viermal in PBS/0,1% Tween 20 gewaschen, in 1 ml PBS/0,1% Tween 20 resuspendiert, und 2 × 10⁵ Mikropartikel wurden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert. Wie aus 5 gesehen werden kann, gibt es keinen Unterschied in der Verteilung der Fluoreszenzintensität der Kügelchen aus allen drei Kontrollreaktionen (ohne GST, ohne CDNB und ohne Biotin-GSH), wobei die Hauptfluoreszenz ~3 beträgt. Im Gegensatz dazu weisen die Kügelchen aus der Enzym katalysierten Reaktion eine Hauptfluoreszenz von 34, mehr als 10-fach höher auf. Tatsächlich liegen unter Verwendung der gezeigten Schranke (5) 81,1% der Kügelchen aus der Enzym katalysierten Reaktion (und die mit dem biotinylierten Produkt beschichtet sind) in der Schranke, wohingegen in den Kontrollreaktionen nicht mehr als 0,06% der Kügelchen in der Schranke liegen. Somit können Kügelchen, die mit dem Produkt der GST katalysierten Reaktion beschichtet sind, einfach von jenen, die es nicht sind, aussortiert werden.
Beispiel 5.
Glutathion S-Transferase M2-2 (GST M2-2) wird als ein Substrat eingeschlossenes biotinyliertes Glutathion verwendet, und das erzeugte eingeschlossene biotinylierte Produkt kann anschließend durch UV Bestrahlung freigesetzt, auf Avidin-beschichteten Kügelchen gefangen und durch Flusszytometrie nachgewiesen werden.
Die Synthese von eingeschlossenem Biotin (5) und seinen Derivaten (7) beruhte auf den veröffentlichten Protokollen (Pirrung & Huang, 1996; Sundberg et al. 1995). Jedoch wurden signifikante Modifikationen an diesen Protokollen in mehreren Schritten der Synthese durchgeführt, wie im Folgenden beschrieben.
Biotinmethylester (3, Biotin-OMe) wurde im Wesentlichen hergestellt wie in Sundberg et al. (1995) (siehe 6) beschrieben:
Methylnitropiperonylalkohol (1, MeNPOH). 3',4-(Methylendioxy)-6'-nitroacetophenon (Lancaster; 6,2 g, 29,6 mmol) wurde in einer Mischung aus THF (100 ml) und Ethanol (100 ml) gelöst. Natriumborhydrid (1,12 g, 29,6 mmol) wurde zugegeben, und die Lösung wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. TLC (auf Silikat beschichteten Platten; Lösungsmittel – 3% Methanol in DCM) zeigte die vollständige Umsetzung des Ausgangsmaterials (Rf = 0,8) in den Alkohol (Rf = 0,6) an. Salzsäure (1 N) wurde langsam zugegeben, bis die Entwicklung von Wasserstoff stoppte und die Lösungsmittel unter Vakuum verdampften. Der zurückbleibende Feststoff wurde in DCM (500 ml) gelöst und mit Salzlösung (40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet (über MgSO₄) und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Die Rekristallisation aus heißem DCM und Hexan ergab 6,1 g von 1 (ein gelber kristalliner Feststoff).
O-Methylnitropiperonyl-carbonylimidazol (2, MeNPO-CO-Im)
Methylnitropiperonylalkohol (1,69 g, 8 mmol) wurde (in mehreren Portionen während 20 Minuten) zu einer Lösung aus Carbonyldiimidazol (CDI, 2,6 g, 16 mmol) in DCM (50 ml) zugegeben. Die Lösung wurde für 3 hr gerührt, wonach TLC die vollständige Umsetzung des Alkohols (Rf = 0,6–3% Methanol in DCM) in das Pro dukt (Rf = 0,45) anzeigte. DCM (100 ml) und Wasser (30 ml) wurden zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde in einen Scheidetrichter transferiert. Die Mischung wurde gemischt, und 1 N HCl wurde zugegeben (in 1 ml Aliquots) bis der pH-Wert der wässrigen Phase unter 6 fiel. Die wässrige Phase wurde entfernt, mehr Wasser (30 ml) wurde zugegeben, und es wurde auf pH 6 angesäuert während gemischt wurde. Schließlich wurde die DCM Phase mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (über MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. Der verbleibende Feststoff wurde aus heißem DCM und Hexan rekristallisiert, um 2,2 g von 2 (einem gelben kristallinen Feststoff) zu ergeben.
N-(O-Methylnitropiperonyl-carbonyl)-Biotinmethylester (4, MeNPO-CO-Biotin-OMe). Natriumhydrid (60% Suspension in Öl; 100 mg, 2,5 mmol) wurde zu einer gerührten Suspension aus Biotin-OMe (517 mg, 2 mmol) und MeNPO-CO-Im (305 mg, 1 mmol) in wasserfreiem DCM (10 ml) auf Eis zugegeben. Die Lösung wurde für 30 Minuten auf Eis und für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. TLC zeigte das vollständige Verschwinden des MeNPO-CO-Im (Rf = 0,6–5% Methanol in DCM) und das Auftreten des Produkts (Rf = 0,45) an. Spuren von Alkohol 1 (Rf = 0,7) und eines Nebenproduktes mit Rf = 0,95 (wahrscheinlich di-MeNPO-Carbonat) wurde ebenfalls beobachtet (Das Verhältnis des Produkts gegenüber dem oben genannten Nebenprodukt variierte von einer Präparation zur anderen; vorsichtiges Trocknen der Ausgangsmaterialien und das Durchführen der Reaktion auf Eis ergab im Allgemeinen höhere Ausbeuten des Produkts).
Sobald die Reaktion vollständig abgeschlossen war, wurde DCM (100 ml) zugegeben und die Lösung dreimal mit 1 M NaH₂PO₄ extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der verbleibende Sirup wurde in heißem DCM (ca. 5 ml) gelöst, Hexan (ca. 5 ml) wurde bis zum Wolkenpunkt zugegeben, und die Lösung wurde bei 4°C über Nacht stehen gelassen. Dies führte zu der Präzipitation des Überschusses des Biotin-OMe als einem weißen kristallinen Feststoff (der mit Ether gewaschen, getrocknet und in den anschließenden Reaktionen verwendet wurde). Das Filtrat wurde in Vakuum konzentriert und durch Chromatographie auf Silica (1,5 bis 3% Methanol in DCM) gereinigt, um 4 als einen gelben Schaum (mit Ausbeuten bis zu 385 mg oder 80% basierend auf den molaren Äquivalenten von 2 als Ausgangsmaterial) zu ergeben.
N-(O-Methylnitropiperonyl-carbonyl)-Biotin (5, MeNPO-CO-Biotin-OH). MeNPO-CO-Biotin-OMe (940 mg; 1,73 mmol) wurde in 25 ml 0,5 N HCl und Dioxan (4:6; beaufschlagt mit Argon) gelöst. Die Lösung wurde bei 44°C für 24 Stunden unter Argon gerührt. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum auf ca. 1 ml reduziert, Wasser wurde zugegeben (10 ml), und die resultierende Mischung wurde lyophilisiert. Der resultierende Feststoff wurde in DCM mit 2% Methanol (20 ml) gelöst, und Aktivkohle wurde zugegeben. Die Mischung wurde für einige Minuten aufgekocht und filtriert. TLC (10% Methanol in DCM) zeigte das Auftreten des Produkts der Hydrolyse (Rf = 0,2) und ungefähr 5% des Ausgangsmaterials (MeNPO-CO-Biotin-OMe; Rf = 0,9) an. Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum entfernt, um einen gelben Feststoff zu ergeben, der unter Vakuum getrocknet wurde (860 mg von ca. 95% von 5 plus 5% von 4). Höhere Konzentrationen an HCl (z.B. 1 N) und höhere Temperaturen (z.B. Rückfluss mit THF als ein Kolbsungsmittel) führten zu der vollständigen Hydrolyse des Methylesters. Jedoch wurde eine signifikante Menge des Alkohols 1 und von Biotin ebenfalls beobachtet, was die Hydrolyse des Carbamats unter diesen Bedingungen anzeigt. Es sollte auch angemerkt werden, dass Methylester 4, und insbesondere das Produkt seiner Hydrolyse (5) als empfindlich gegenüber Oxidation erkannt wurden. Erwärmung oder selbst Lagerungslösungen von 5 in der Anwesenheit von Luft führten zu Braunfärbung. Genauso führten Versuche, 5 (oder Derivate davon, z.B. 7) durch Chromatographie auf Silica zu reinigen, zu sehr großen Verlusten aufgrund von Oxidation.
N-(N-(O-Methynitropiperonyl-carbonyl)-Biotin)-3-aminopropionsäure tert-Butylester (6, MeNPO-CO-Biotin-β-Ala-OBu^t). MeNPO-CO-Biotin-OH (860 mg enthaltend ~5% MeNPO-CO-Biotin-OMe; ~1,6 mmol) wurde in 20 ml wasserfreiem DCM gelöst. β-Alanin tert-Butylester (H-β-Ala-OBu^t) Hydrochloridsalz (Bachem; 362 mg; 2 mmol), N-Hydroxysuccinimid (172 mg, 1,5 mmol) und Triethylamin (280 μl; 2 mmol) wurden zugegeben. Die gerührte Lösung wurde auf Eis abgekühlt, und EDCI wurde zugegeben (420 mg; 2,2 mmol). Die Reaktion wurde für 24 Stunden bei 4°C und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. TLC (5% Methanol in DCM) zeigte das Auftreten des Produkts (Rf = 0,3) und des verbleibenden, nicht umgesetzten MeNPO-CO-Biotin-OMe (Rf = 0,45) an. Die Reaktion wurde mit DCM (30 ml) verdünnt und dreimal mit 1 M NaH₂PO₄ und einmal mit gesättigter NaHCO₃ extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet (Na₂SO₄) und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der verbleibende Sirup wurde durch Chromatographie auf Silica (3,0–4,5% Methanol in DCM) gereinigt, um 640 mg von 6 (ein gelber Schaum) zu ergeben.
N-(N-(O-Methylnitropiperonyl-carbonyl)-Biotin-3-aminopropionsäure (7, MeNPO-CO-Biotin-β-Ala-OH). Tert-Butylester 6 (510 mg; 0,84 mmol) wurde in 15 ml 0,5 N HCl und Dioxan (4:6; mit Argon beaufschlagt) gelöst. Die Lösung wurde bei 52°C für 24 Stunden unter Argon gerührt. Wasser wurde zugegeben (10 ml), und die resultierende Lösung wurde gefriergetrocknet, um einen Feststoff zu ergeben, der (wie durch TLC bewertet) das Produkt der Hydrolyse (7) und des Ausgangsmaterials (6; ~10%) enthielt. Diese Mischung durch Säulenchromatographie auf Silica (10% Methanol in Aceton plus 0,1% Essigsäure) gereinigt, um 60 mg von 7 (die geringen Ausbeuten waren primär das Ergebnis von Oxidation von 7 auf der Silica) zu ergeben.
N-(N-(N-(O-Methylnitropiperonyl-carbonyl)-Biotin)-3-aminopropionyl)glutathion (8, MeNPO-CO-Biotin-β-Ala-GSH). Carbonyldiimidazol (20 mg, 120 μmol) wurde zu einer Lösung aus MeNPO-CO-Bioin-β-Ala-OH (7, 49 mg, 89 μmol) in DMF (1,5 ml) zugegeben. Die Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und wurde anschließend, in mehreren Aliquots, zu einer Lösung aus oxidiertem Glutathion (62 mg, 100 μmol) und Triethylamin (55 μl, 0,4 mmol) in DMF (2 ml) plus Wasser (0,15 ml), gerührt auf Eis, zugegeben. Die Lösung wurde auf Eis für 30 Minuten und anschließend bei Raumtemperatur gerührt. Triethylamin wurde zugegeben, bis die Lösung klar wurde (25 μl), und die Reaktion wurde anschließend für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. DTT wurde anschließend zugegeben (0,25 ml einer 1 M Lösung; 0,25 mmol), und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt.
Das Produkt der obigen Reaktion wurde durch reverse Phasen HPLC, auf einer RP-8 präparativen Säule, unter Verwendung eines Wasser-Acetonitril Gradienten in der Anwesenheit von 0,1% Trifluoressigsäure gereinigt. Die Spitze, die 8 (Retentionszeit = 28,6 Minuten) entspricht, wurde gesammelt. Das Produkt wurde anschließend durch Gefriertrocknen isoliert und erneut auf reverser Phasen HPLC (unter Verwendung derselben Säule und desselben Lösungsmittelsystems) gereinigt. Die Analyse des Produkts nach der zweiten HPLC Reinigung, unter Verwendung von analytischer reverser Phasen HPLC, zeigte ein Produkt (> 95%) an, dessen UV Spektrum 8 entsprach (insbesondere λ^max bei 355 nm zeigte die Anwesenheit der O-Methylnitropiperonyl-carbonyl Gruppe des eingeschlossenen Biotins). Die Konzentration von 8 wurde durch Titrieren der freien Thiol Gruppen (unter Verwendung von DTNB, 5,5'-Dithiobis 2-Nitrobenzoesäure, nach Hermanson, 1996), die von dem Glutathion stammen, und auch durch Absorption bei 355 nm (entspricht dem eingeschlossenen Biotin) bestimmt. Diese beiden unabhängigen Messungen ergaben dasselbe Ergebnis innerhalb des experimentellen Fehlers.
Das gereinigte 8 wurde als ein Substrat für humanes M2-2 GST in der elektrophilen Substitution von CDNB erkannt (überwacht durch die Änderung der Absorption bei 340 nm; Habig & Jakoby, 1981) mit Geschwindigkeiten, die ungefähr 10-fach langsamer waren, als jene, die mit Glutathion unter ähnlichen Bedingungen beobachtet wurden.
Das reduzierte MeNPO-COBiotin-β-Ala-GSH (eingeschlossenes-Biotin-βala-GSH) wurde mit entweder 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB; Sigma) oder 4-Chlor-3-nitrobenzoat (CNB, Acros) umgesetzt. Das eingeschlossene gebildete Produkt bindet nicht an Avidin oder Streptavidin. Jedoch weist nach der fotochemischen Freisetzung durch ultraviolette Bestrahlung das Produkt ein Biotin an einem Ende auf, das an Avidin oder Streptavidin beschichtete Mikropartikel binden wird, und entweder eine 2,4-Dinitrophenol (DNP) oder eine 3-Nitrobenzoat Gruppe auf, die durch geeignete Anti-DNP oder Anti-3-nitrobenzoat Antikörper (siehe 7 & 8) gebunden werden können.
5 μl (10⁸ Kügelchen) 1,0 μm Durchmesser nicht fluoreszierende Neutravidin markierte Mikrokugeln (Molecular Probes, F-8777) wurden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden in 5 μl 0,1 M KH₂PO₄, pH 6,5, 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol, 10 μM eingeschlossenes-Biotin-βala-GSH und entweder 500 μM CDNB oder 500 μM CNB resuspendiert. Die 5 μl Reaktionsmischungen enthielten entweder 0,75 μg gereinigtes rekombinantes humanes GST M2-2 oder kein Enzym.
Die Reaktionen wurden für 30 min (CDNB Reaktionen) oder 4 Stunden (CNB Reaktionen) bei 25°C inkubiert, nach dieser Zeit wurden sie durch die Zugabe von 35 μl 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 abgestoppt und auf Eis transferiert. Jede Reaktion wurde anschließend in zwei Aliquots von jeweils 20 μl aufgeteilt, wovon eines als ein Tropfen auf eine Schicht aus Parafilm auf die Oberfläche eines eisgekühlten Aluminiumblocks gegeben wurde. Dieser Tropfen wurde anschließend für 2 min mit einer B 100 AP UV Lampe (UVP), die in einem Abstand von ~6 cm gehalten wurde, bestrahlt. Das andere Aliquot wurde ungestrahlt belassen. Alle Proben wurden anschließend 30 min bei Umgebungstemperatur inkubiert und anschließend dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen, wobei sie zwischen jedem Waschschritt kräftig resuspendiert wurden.
Die Kügelchen wurden anschließend in 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 enthaltend 20 ng/μl Alexa-488 markierten Kaninchen Anti-DNP Antikörper (Dako, #V0401), 20 ng/μl Alexa-488 markiertes Anti-CNB Antiserum resuspendiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Anti-CNB Antiserum wurde in Kaninchen durch Immunisierung mit CNB-CH₂-KLH Konjugaten erzeugt, die durch Zugeben von Aliquots einer 200 mM Lösung aus 4-(Brommethyl)-3-nitrobenzoesäure (CNB-CH₂Br) in DMF zu 5 mg/ml Lösungen aus bovinem Serumalbumin (BSA) oder Schlüssellochnapfschnecken Hämocyanin (KLH für engl.: keyhole limpet hemocyanin) in 50 mM Borat pH 8,8 (um 1,5 bis 6 μmol CNB-CH₂Br pro mg Protein zu ergeben) hergestellt wurden. Die Reaktionsmischungen wurden für 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und die resultierenden Proteinkonjugate wurden kräftig gegen Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) bei 4°C dialysiert. Der Konjugati onsspiegel (Haptendichte oder Hd) wurde durch Messen der optischen Dichten der Konjugate bei 355 nm bestimmt. Diese wurden wie folgt bestimmt: 7 bis 11 CNB-CH₂ Gruppen pro BSA Molekül und 9,4 bis 24,3 pro KLH Molekül, abhängig von der Menge von CNB-CH₂Br, das zu den Proteinproben zugegeben wurde. Das CNB-CH₂-KLH Konjugat mit Hd 14,2 wurde verwendet, um Kaninchen unter Verwendung von publizierten Protokollen zu immunisieren (Tawfik et al., 1993; Tawfik et al., 1997) (von Prof. Z. Eshhar, Weizmann Institute of Science, Rehovot). Die Seren wurden durch ELISA hinsichtlich der Bindung des Konjugats CNB-CH₂-BSA (Hd = 11) und an BSA getestet. Die erste Blutentnahme von beiden immunisierten Kaninchen (wenn 50-fach oder mehr verdünnt) zeigte die gewünschte Selektivität, was ein hohes Signal lieferte, wenn sie mit dem CNB-CH₂-BSA Konjugat inkubiert wurde, und einen sehr niedrigen Hintergrund (< 5%) mit BSA. Das Anti-CNB Serum wurde unter Verwendung einer HiTrap Protein A Säule (Pharmacia) gereinigt. Sowohl der Anti-CDNB als auch der Anti-CNB Antikörper wurden mit einem Alexa Fluor 488 Protein Markierungskit (Molecular Probes) gemäß den Angaben des Herstellers markiert.
Die Kügelchen wurden dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20, wie oben, gewaschen, anschließend in 1 ml PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert, und 10.000 Ereignisse wurden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert.
Wie aus 9 gesehen werden kann, wird der eingeschlossene Biotin Rest bei UV Bestrahlung freigesetzt und bindet an die Kügelchen. Ein 19-facher Anstieg in der mittleren Kügelchenfluoreszenz wurde nach GST M2-2 katalysierter Reaktion von eingeschlossenem-Biotin-βala-GSH mit CDNB selbst in der Abwesenheit von UV Bestrahlung beobachtet. Dies korreliert mit der offensichtlichen Anwesenheit von ~4% Biotin-βala-GSH in der Präparation von eingeschlossenem-Biotin-βala-GSH, wie unter Verwendung von Fluorimetrie bestimmt wurde, um die Ablösung von 2-Anilonaphthalen-6-sulfonsäure (2,6-ANS) von Avidin (Mock et al., 1985) zu messen. Diese Ergebnisse stimmen mit der zuvor beobachteten Hintergrundimmobilisierung von eingeschlossenem Biotin an Avidin "im Dunkeln" (d.h. ohne UV Beleuchtung) überein, die eine Höhe von 15% des beobachteten Signals nach Beleuchtung (Sundberg et al., 1995) erreichte. Das "Dunkel" Signal, das zuvor beobachtet wurde, wurde entweder Spuren von Verunreinigungen von Biotin in der eingeschlossenen Biotin Präparation oder den schwachen Interaktionen zwischen Avidin und Bestandteilen des eingeschlossenen Biotins einschließlich der Linker (Sundberg et al., 1995) zugeschrieben. Nach UV Bestrahlung wurde ein großer Unterschied in der mittleren Fluoreszenz jener Kügelchen beobachtet, die in der Anwesenheit und Abwesenheit von GST inkubiert wurden. Die mittlere Fluoreszenz der Kügelchen mit GST war jeweils 84-mal bzw. 56-mal so hoch wie jene, die ohne GST mit CDNB bzw. CNB als Substrate beobachtet wurde (9).
Beispiel 6.
Glutathion S-Transferase M2-2 (GST M2-2), die in wässrige Tröpfchen einer Wasser-in-Öl Emulsion aufgeteilt ist, katalysiert die Reaktion von eingeschlossenem biotinyliertem Glutathion mit 4-Chlor-3-nitrobenzoat (CNB). Das erzeugte eingeschlossene biotinylierte Produkt Verbleibt aufgeteilt und kann anschließend durch UV Bestrahlung in den Abschnitten freigesetzt werden, auf einem Avidin beschichteten Kügelchen in demselben Abschnitt gefangen, und das Produkt beschichtete Kügelchen kann durch Flusszytometrie nachgewiesen werden.
20 μl Aliquots (4 × 10⁸ Kügelchen) 1,0 μm Durchmesser nicht fluoreszierender Neutravidin markierter Mikrokugeln (Molecular Probes, F-8777) oder 0,93 μm Durchmesser Streptavidin beschichtete Polystyrol Kügelchen (Bangs Laboratodes) wurden jeweils in einer Mikrofuge bei 2.600 g (6.500 rpm) für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Kügelchen wurden auf Eis in 20 μl 0,1 M KH₂PO₄, pH 6,5, 1 mM EDTA, 2 mM Dithiothreitol, 50 μM eingeschlossenes-Biotin-βala-GSH, enthaltend entweder 3 μg gereinigtes rekombinantes humanes GST M2-2 oder kein Enzym, resuspendiert.
Sechs Reaktionsmischungen wurden anschließend im Wesentlichen wie nach Tawfik & Griffiths (1998) emulgiert:

a) Bangs Kügelchen, ohne GST
b) Bangs Kügelchen, plus GST
c) Molecular Probes Kügelchen, ohne GST
d) Molecular Probes Kügelchen, plus GST
e) Bangs Kügelchen, ohne GST
f) Molecular Probes Kügelchen, ohne GST

Die Ölphase wurde frisch hergestellt durch Lösen von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904), gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074). Die eisgekühlten Reaktionsmischungen wurden schrittweise (in 5 Aliquots à 4 μl über ~2 Minuten) zu 0,4 ml eisgekühlter Ölphase in einem 5 ml Biofreeze Gefäß (Costar, #2051) zugegeben, während mit einem magnetischen Rührfisch (8 × 3 mm mit einem Drehring; Scientific Industries International, Loughborough, UK) gerührt wurde. Das Rühren (bei 1150 rpm) wurde für 1 zusätzliche Minute auf Eis fortgesetzt.
8 μl Emulsion d) wurde zu 0,4 ml Emulsion e) zugegeben, und 8 μl Emulsion b) wurde zu 0,4 ml Emulsion f) (um 1:50 Verdünnungen zu ergeben) zugegeben, und die Emulsionsmischungen wurden für 5 Sekunden zum Mischen gevortext.
Sechs Reaktionsmischungen wurden nicht emulgiert belassen:

Sowohl die Emulsionen als auch die nicht emulgierten Reaktionen wurden für 15 min bei 25°C inkubiert. Anschließend wurden 0,8 μl 500 mM CNB (in reinem Ethanol) zu jeder der 0,4 ml Emulsionen zugegeben, und die Emulsionen wurden für 5 Sekunden gevortext (das CNB wurde durch das Mineralöl in die wässrigen Abschnitte transferiert). 5 μl 5 mM CNB (in 0,1 M KH₂PO₄, 1 mM EDTA, pH 6,5) wurde zu den nicht emulgierten Reaktionen zugegeben.
Alle Reaktionen wurden für 4 Stunden bei 25°C inkubiert.
Der pH-Wert der wässrigen Tröpfchen wurde erniedrigt, um die GST katalysierte Reaktion durch Vortexen der Emulsionen mit 200 μl Sigma Mineralöl für Molekularbiologie (M-5904) enthaltend 4,5% Span 80 (Fluka), 0,5% Tween 80 (Sigma Ultra) in Sigma Mineralöl für Molekularbiologie und 25 mM Essigsäure zu quenschen. Die nicht emulgierten Reaktionen wurden durch Zugeben von 25 μl 0,5 M Essigsäure gequenscht.
Alle Reaktionen wurden in eine 24-Vertiefungsflachbodenplatte (Corning, #25820), die auf Eiswasser schwamm, transferiert und 2 min mit einer B 100 AP UV Lampe (UVP), die mit einem Abstand von ~6 cm gehalten wurde, bestrahlt. Alle Proben wurden anschließend 30 min bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Die Emulsionen wurden in 1,5 ml Mikrofugengefäße transferiert, 1 min bei 13,5 k rpm in einer Mikrofuge zentrifugiert, und die Ölphase wurde entfernt, was die konzentrierte (aber noch intakte) Emulsion am Boden des Gefäßes zurückließ. 200 μl 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 wurden zugegeben, und die Emulsion wurde durch Extrahieren 4-mal mit 1 ml Hexan und Vortexen zwischen jeder Hexan Zugabe, aufgebrochen. Restliches Hexan wurde durch Zentrifugieren bei 10 min bei Umgebungstemperatur unter Vakuum in einer Speedvac (Farmingdale, NY) entfernt.
Alle Proben wurden anschließend dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen, und sorgfältig zwischen jedem Waschschritt resuspendiert. Die Kügelchen wurden anschließend in 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert. 25 μl (~5 × 10⁷ Kügelchen) wurden anschließend zu 200 μl PBS, 01% Tween 20 enthaltend 20 ng/μl Alexa-488 markierten Anti-DNP Antikörper oder 20 ng/μl Alexa-488 markierten Anti-CNB Antikörper (siehe Beispiel 5) zugegeben und für 1 Stunde bei Umge bungstemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20, wie oben, gewaschen, anschließend in 1 ml PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert, und 300.000 Ereignisse wurden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert.
In den nicht emulgierten Mischungen, in denen weder GST noch das Produkt der GST katalysierten Reaktion (eingeschlossenes-Biotin-βAla-NB) aufgeteilt war, weisen alle Kügelchen eine ähnlich geringe Fluoreszenz (10, Ansichten B und D) auf. Im Gegensatz dazu waren in den Emulsionsmischungen, in denen sowohl GST als auch das Produkt der GST katalysierten Reaktion (eingeschlossenes-Biotin-βAla-NB) abgeteilt waren, zwei Populationen von Kügelchen, eine mit geringer und eine mit höherer Fluoreszenz eindeutig sichtbar (10, Abschnitte C und E). Die Schranke durch R1 und R2 erlaubt es den Kügelchen von Bangs und Molecular Probes auf der Basis ihrer geringfügig unterschiedlichen Lichtstreuungseigenschaften (10, Ansicht A) weitestgehend getrennt zu werden. Das Verhältnis der Kügelchen von Bangs zu Molecular Probes, die durch R1 hindurchtraten, beträgt 68%:0,1%, und das Verhältnis jener, die durch R2 hindurchtraten, beträgt 0,08%:87%. Unter Verwendung dieser Schranken ist es eindeutig, dass die Kügelchen mit hoher Fluoreszenz jene sind, die mit dem Enzym GST abgeteilt waren. Somit kann durch die Abteilung von Kügelchen, das Enzym und das Reaktionsprodukt werden durch Emulgation erhalten werden, und jene Kügelchen, die in den Abschnitten anwesend sind, die Enzyme enthalten, können von jenen, die keine Enzyme enthalten, durch ihre Fluoreszenzeigenschaften unterschieden werden.
Beispiel 7.
Humanes GST M2-2 kann in vitro in wässrigen Abschnitten einer Wasser-in-Öl Emulsion transkribiert und translatiert werden und katalysiert eine Reaktion, die eine Änderung in den Fluoreszenzeigenschaften von kokompartimentalisierten Mikrokugeln hervorruft.
Das Gen, das humane Glutathion S-Transferase M2-2 (GST M2-2) kodiert, wird durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide GSTM2-2Fo und GSTM2-2Bc aus einem humanen GST M2-2 cDNA Klon in pGEM-3Z (Baez et al., 1997) amplifiziert. Das PCR Fragment wird in den Vektor pGEM-4Z (Promega), der mit HindIII und KpnI gespalten wurde, unterhalb des lac Promotors und des T7 RNA Polymerase Promotors kloniert. Das Oligonukleotid GSTM2-2Bc fügt die wirksame Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle oberhalb des Methyltransferasegen Startcodons ein. Die DNA Sequenzierung identifiziert einen Klon mit der korrekten Nukleotidsequenz, als pGEM-hGSTM2-2 bezeichnet. Das pGEM-hGSTM2-2 Plasmid, das oben beschrieben ist, wird durch PCR unter Verwendung der Primer LMB2 und LMB3, wie oben, amplifiziert, um ein 826 Basenpaar PCR Fragment (GSTM2-2.LMB2-3) zu erzeugen, das den T7 RNA Polymerase Promotor, die Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle und das GST Gen trägt. Das PCR Fragment wird direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
60 ml Aliquots (1,2 × 10⁹ Kügelchen) 1,0 μm Durchmesser nicht fluoreszierende Neutravidin markierte Mikrokugeln (Molecular Probes, F-8777) wurden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Kügelchen wurden auf Eis in 60 μl eines prokaryotischen in vitro gekoppelten Transkriptions/Translationssystems, das für lineare Matrizen ausgestaltet ist (Lesley et al., 1991) resuspendiert. Eine kommerzielle Präparation dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega), das mit 12,5 mM Essigsäure (um den pH-Wert auf ~7,0 zu erniedrigen), T7 RNA Polymerase (2.000 Einheiten), 12,5 μg/ml λ DNA-HindIII Spaltung (New England Biolabs), 50 μM eingeschlossenes-Biotin-βala-GSH und wahlweise 5 nM GSTM2-2.LMB2-3 DNA oder 5,0 μg gereinigtem rekombinanten humanen GST M2-2 pro 50 μl (oder keines davon) ergänzt wurde.
Ein 5 μl Aliquot wurde aus jeder Reaktionsmischung entnommen und nicht emulgiert belassen. 50 μl der verbleibenden Reaktionsmischung wurde im Wesentlichen nach Tawfik & Griffiths (1998) emulgiert.
Die Ölphase wurde frisch hergestellt durch Lösen von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904), gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074). Die eiskalten Reaktionsmischungen wurden schrittweise (in 5 Aliquots von 10 μl über ~2 Minuten) zu 1,0 ml eiskalter Ölphase in einem 5 ml Biofreeze Gefäß (Costar, #2051) zugegeben, während mit einem magnetischen Rührtisch (8 × 3 mm mit einem Drehring; Scientific Industries International, Loughborough, UK) gerührt wurde. Das Rühren (bei 1150 rpm wurde für 1 weitere Minute auf Eis fortgesetzt.
Sowohl die Emulsionen als auch die nicht emulgierten Reaktionen wurden für 45 min bei 25°C inkubiert, um zu erlauben, dass die Translation fortschreitet. Anschließend wurden 5 μl 100 mM 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (CDNB) (in reinem Ethanol) zu jeder 1,0 ml Emulsion zugegeben, und die Emulsion wurde für 5 Sekunden gevortext (das CDNB wird durch das Mineralöl in die wässrigen Abschnitte transferiert). 1,0 μl 2,5 mM CDNB (in Wasser) wurde zu den nicht emulgierten Reaktionen zugegeben. CDNB inhibiert in vitro die Translation, und das Zugeben auf diese Weise, nachdem die Translation abgeschlossen ist, maximiert die Ausbeute an GST.
Alle Reaktionen wurden für 30 min bei 25°C inkubiert. Der pH-Wert der wässrigen Tropfen wurde anschließend verringert, um die Reaktion durch Vortexen der Emulsionen mit 500 μl Sigma Mineralöl für Molekularbiologie (M-5904), enthaltend 4,5% Span 80 (Fluka), 0,5% Tween 80 (Sigma Ultra) in Sigma Mineralöl für Molekularbiologie und 25 mM Essigsäure zu quenschen. Die nicht emulgierten Reaktionen wurden durch Zugeben von 5 μl 0,5 M Essigsäure und 20 μl 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 gequenscht.
Alle Reaktionen wurden in eine 24-Vertiefungsflachbodenplatte (Corning, #25820), die auf Eiswasser schwamm, transferiert und 2 min mit einer B 100 AP UV Lampe (UVP), die mit einem Abstand von ~6 cm gehalten wurde, bestrahlt. Alle Proben wurden anschließend 30 min bei Umgebungstemperatur inkubiert.
Die Emulsionen wurden in 1,5 ml Mikrofugengefäße transferiert, 1 min bei 13,5 k rpm in einer Mikrofuge zentrifugiert, und die Ölphase wurde entfernt, was die konzentrierte (aber noch intakte) Emulsion am Boden des Gefäßes zurückließ. 200 μl 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 wurden zugegeben, und die Emulsion wurde durch Extrahieren 4-mal mit 1 ml Hexan und Vortexen zwischen jeder Hexan Zugabe, aufgebrochen. Restliches Hexan wurde durch Zentrifugieren bei 10 min bei Umgebungstemperatur unter Vakuum in einer Speedvac (Farmingdale, NY) entfernt.
Ungefähr 5 × 10⁷ Kügelchen aus den aufgebrochenen Emulsionen und den nicht emulgierten Reaktionen wurden anschließend dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen, wobei zwischen jedem Waschschritt sorgfältig resuspendiert wurde. Die Kügelchen wurden anschließend in 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 enthaltend 10 ng/μl Alexa-488 markierten Anti-DNP Antikörper (siehe Beispiel 5) resuspendiert und 1 Stunde bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20, wie oben, gewaschen, anschließend in 1 ml PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert, und 10.000 Ereignisse wurden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert.
Wie aus 11 gesehen werden kann, führt die Reaktion, die durch in vitro translatiertes GST M2-2 katalysiert wird, sowohl in emulgierten als auch in nicht emulgierten Reaktionen zu Kügelchen mit höherer Fluoreszenz als wenn kein Enzym anwesend war. Dieser Unterschied in der Fluoreszenz wäre jedoch nicht ausreichend für wirksames Fluoreszenz aktiviertes Sortieren (FACS). Jedoch waren Kügelchen aus sowohl emulgierten als auch nicht emulgierten Reaktionen mit 5,0 μg gereinigtem rekombinanten GST M2-2 pro 50 μl sogar noch fluoreszierender als jene, die in vitro translatiertes GST M2-2 enthalten, was eine wirksamere Anreicherung dieser Kügelchen durch FACS aus jenen, die in der Abwesenheit von GST inkubiert wurden, erlaubt. Dies simuliert die Situation, wo ein mutantes GST mit höherer Aktivität als Wildtyp in vitro translatiert wird.
Beispiel 8.
Gene, die an Mikrokügelchen angeheftet sind, werden in vitro exprimiert, und das resultierende Genprodukt (ein Enzym) bindet an die Mikrokügelchen, während die katalytische Aktivität beibehalten wird.
Ein Format für die Selektion von genetischen Elementen ist, wo das genetische Element ein Gen umfasst, das mit einem Mikrokügelchen verknüpft ist, das in einer Mikrokapsel translatiert wird, und das translatierte Genprodukt wird auf das Mikrokügelchen innerhalb der Mikrokapsel zurückgekoppelt. Somit führt die Aufteilung zu der Bildung von Komplexen von Genprodukten (z.B. Proteine oder Enzyme), die an das Gen, das sie kodiert, angeheftet sind. Diese Komplexe könnten anschließend hinsichtlich der Bindung eines Liganden (siehe Beispiel 12) oder hinsichtlich enzymatischer Aktivität über eine zweite Aufteilungsreaktion selektiert werden.
Hier wird gezeigt, dass ein Enzym (Phosphotriesterase oder PTE) in vitro von Genen transkribiert und translatiert werden kann, die an Mikrokügelchen angeheftet sind, und das translatierte Enzym ist an die Mikrokügelchen zurückgebunden. Wir zeigen auch, dass das translatierte Enzym modifiziert, zusammengelagert oder mit einem Kofaktor komplementiert werden kann, während es an Kügelchen gebunden ist – in diesem Beispiel werden Metallionen zu dem Apoenzym zugegeben, um ein aktives Metalloenzym zu ergeben. Darüber hinaus zeigen wir hier, dass die katalytische Aktivität des Enzyms beibehalten wird, während es an das Mikrokügelchen zusammen mit dem Gen, das es kodiert, gebunden ist.
Das opd Gen, das eine Phosphotriesterase (PTE; auch als Paraoxonhydrolase bekannt; Mulbry & Karns, 1989) kodiert, wird aus Flavobacterium sp. Stamm ATCC 27551 durch PCR unter Verwendung eines Forward Primers, der Stoppcodons und eine EcoRI Stelle (OPD-Fo; siehe Tabelle 1) anhängt, und eines Back Primers, der die Phagen T7 Gen 10 Translationsstelle (RBS) und eine HindIII Klonierungsstelle (OPD-Bc) anhängt, amplifiziert. Diese DNA wird in pGEM-4Z unter Verwendung der HindIII und der EcoRI Stellen unterhalb des T7 RNA Polymerase Promotors kloniert. Die DNA Sequenzierung identifiziert einen Klon, der die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Bakterien (E. coli, TG1), die mit diesem Klon (Gem-OPD) transformiert wurden, überexprimieren aktives PTE, wenn sie in der Anwesenheit von Kobaltchlorid angezogen und mit IPTG induziert werden (Omburo et al., 1992).
Das OPD Gen wird auch mit einem Flag^TM Peptid (Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Ap-Asp-Asp-Lys; Sigma-Aldrich), das an seinen N-Terminus angehängt ist, kloniert. Das OPD Gen wird in Flavobacterium sp. Stamm ATCC 27551 durch PCR unter Verwendung eines Forward Primers (N-Flag-OPD-Fo), der Stoppcodons und eine KpnI Stelle anhängt, und eines Back Primers (N-Flag-OPD-Bc), der eine NcoI Stelle, ein Flag Peptid und einen kurzen Linker zwischen dem Flag Peptid und dem OPD Leserahmen anhängt, amplifiziert. Das resultierende DNA Fragment wird in das Plasmid pGEM-4Z^NcoI (unter Verwendung der KpnI und NcoI Stellen) kloniert. pGEM-4Z^NcoI ist eine Modifikation von pGEM-4Z, in dem die Phagen T7 Gen 10 Translationsstelle (RBS) und ein ATG Startcodon unterhalb des T7 RNA Polymerase Promotors angehängt sind, um eine NcoI Stelle zu erzeugen, die das Klonieren von Leserahmen im Kontext des RBS und ATG Codons erlaubt. Die Sequenz des Abschnitts, der in pGEM-4Z (zwischen die HindIII und KpnI Stellen unterhalb des T7 RNA Polymerase Promotors), um pGEM-4Z^NcoI zu ergeben, eingebaut ist, ist in Schema I (SEQ ID NO: 1) angegeben.
Der Rest von pGEM-4Z, einschließlich der KpnI und EcoRI Klonierungsstellen, verblieb intakt.
Schema I
Die DNA Sequenzierung identifiziert einen Klon, der die korrekte Nukleotidsequenz aufweist. Bakterien, die mit diesem Klon (Gem-N-Flag-OPD) transformiert wurden, überexprimieren eine aktive PTE, wenn sie in der Anwesenheit von Kobaltchlorid angezogen und mit IPTG induziert werden.
Die gem-OPD und gem-N-Flag-OPD Plastide, die oben beschrieben sind, werden durch PCR unter Verwendung der Primer LMB2-Biotin und LMB3 amplifiziert, um DNA Fragmente (jeweils OPD.LMB3-2biotin und N-Flag-OPD.LMB3-2biotin) zu erzeugen, die den T7 RNA Polymerase Promotor, die Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle und das OPD oder das N-Flag-OPD Gen tragen und mit Biotin an dem 3'-Ende markiert sind. Die PCR Fragmente werden direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
Aliquots einer Suspension aus 0,95 μm nicht fluoreszierenden Streptavidin markierten Mikrokugeln (Bangs, ~2 × 10⁷ Kügelchen pro μl Suspension) werden in einer Mikrofuge bei 10.000 g (13.500 rpm) für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen in TNT Puffer (0,1 M Tris 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20) resuspendiert. Ein Antikörper, der in der Lage ist, Amino-Termini Flag Peptide zu binden, und der durch Biotinylierung (BioM5, ein Biotin markierter Anti-Flag Antikörper; Sigma) markiert ist, wird zu den Kügelchensuspensionen mit durchschnittlich 4 × 10⁴ Antikörper Molekülen pro Kügelchen zugegeben. Die resultierende Mischung wird für mehrere Stunden mit gelegentlichem Mischen inkubiert. Die Kügelchen werden zweimal durch Herunterzentrifugieren und ihrem Resuspendieren in TNT Puffer gespült. Biotinylierte DNA Fragmente (die Fragmente OPD.LMB3-2biotin, N-Flag-OPD.LMB3-2biotin oder Fragmente, die den T7 RNA Polymerase Promotor, die Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle und ein Gen kodierend ein anderes Enzym, das auch mit dem N-Flag Peptid markiert ist, z.B. Methyltransferase HaeIII – N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotin) werden zu einer Suspension aus Antikörper beschichteten Kügelchen zugegeben, und die Mischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Kügelchen werden 3-mal durch Herunterzentrifugieren und ihrem Resuspendieren in TNT Puffer gespült.
50 μl Aliquots der obigen Suspension der Kügelchen (~10⁹ Kügelchen) werden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen vorsichtig auf Eis in 50 μl eines prokaryoten in vitro gekoppel ten Transkriptions/Translationssystems, das für lineare Matrizen ausgestaltet ist (Lesley et al., 1991) resuspendiert. Eine kommerzielle Präparation dieses Systems wird verwendet (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega), das mit T7 RNA Polymerase (2.000 Einheiten) ergänzt wurde. Die Reaktionen werden bei 25°C für 1,5 Stunden inkubiert und in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen in 100 μl 50 mM Tris, 10 mM Kaliumcarbonat, pH 8,0 resuspendiert. Eine wässrige Lösung aus Kobaltchlorid wird in einer Konzentration von 1 mM zugegeben, und die Reaktionen werden für einige Stunden bei Raumtemperatur (oder über Nacht bei 4°C inkubiert). Die Kügelchen werden 4-mal durch Herunterzentrifugieren und ihrem Resuspendieren in TNT Puffer gespült.
Aliquots der obigen Kügelchen werden zu einer Lösung aus 0,25 mM Paraoxon in 50 mM Tris pH 8,3 zugegeben. Die Kügelchen werden bei 25°C mit gelegentlichen Rühren für verschiedene Zeiträume inkubiert. Die Kügelchen werden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert, der Überstand wird entfernt, und ihre optische Dichte wird bei 405 nm gemessen. Eine signifikante Änderung in der optischen Dichte, relativ zu der optischen Dichte, die unter denselben Bedingungen in der Abwesenheit von Kügelchen oder Phosphotriesterase beobachtet wird, wird nicht beobachtet, wenn die Kügelchen, an welche die biotinylierten DNA Fragmente OPD.LMB3-2biotin oder N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotin angeheftet sind (und anschließend wie oben umgesetzt werden) mit Paraoxon inkubiert werden. Jedoch wird eine signifikante Änderung in der optischen Dichte bei 405 nm beobachtet, wenn die Kügelchen, an welche die biotinylierten DNA Fragmente N-Flag-OPD.LMB3-2biotin angeheftet sind (und die anschließend wie oben beschrieben umgesetzt werden) mit Paraoxon inkubiert werden. Wenn zum Beispiel die biotinylierten DNA Fragmente N-Flag-OPD.LMB3-2biotin in einer Konzentration von 1 nM (zu einer 50 μl Suspension der Kügelchen (~10⁹ Kügelchen), die anschließend in 50 μl in vitro Transkription/Translation resuspendiert wird) zugegeben werden und wie oben beschrieben umgesetzt werden, entspricht die Änderung in der optischen Dichte, die nach 3 Stunden beobachtet wird, mehr als 50% Hydrolyse von Paraoxon (bei 0,25 mM in einem 50 μl Reaktionsvolumen). Somit können Mikrokügelchen, die ein Gen tragen, das ein Protein mit der gewünschten katalytischen Aktivität (Phosphotriesterase im obigen Beispiel) kodieren, eindeutig von Mikrokügelchen unterschieden werden, die Gene tragen, die kein Protein mit der gewünschten katalytischen Aktivität (Methyltransferase HaeIII im obigen Beispiel) kodieren. Darüber hinaus wurde praktisch keine Änderung in der optischen Dichte bei 405 nm beobachtet, wenn die biotinylierten DNA Fragmente N-Flag-OPD-LMB3-2biotin an Kügelchen angeheftet und wie oben beschrieben umgesetzt wurden, mit der Ausnahme, dass Kobaltchlorid nicht zu den resuspendierten Kügelchen nach der Transkription/Translation zugegeben wird.
Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Enzym (Phosphotriesterase) in vitro von Genen transkribiert und translatiert werden kann, die dieses Enzym kodieren und an Mikrokügelchen angeheftet sind. Wenn die Gene ein Tag – ein N-Terminus Flag Peptid im obigen Beispiel – kodieren, bindet das translatierte Enzym zurück an die Mikrokügelchen, an welche die Gene angeheftet sind. Falls notwendig kann das translatierte Enzym anschließend modifiziert werden, während es angeheftet an die Mikrokügelchen verbleibt (zusammen mit dem Gen, das es kodiert) – in diesem Beispiel werden Kobaltionen zugegeben, um ein reaktives Metalloenzym zu ergeben. Dieses Ergebnis zeigt auch, dass das Enzym katalytisch aktiv ist, während es an Mikrokügelchen zusammen mit dem Gen, das es kodiert, gebunden ist.
Beispiel 9.
Ein Enzym katalysiert eine Reaktion mit einem eingeschlossenen biotinylierten Substrat, und das erzeugte eingeschlossene biotinylierte Produkt wird durch UV Bestrahlung freigesetzt und auf Streptavidin beschichteten Mikrokügelchen gefangen. Anschließend werden diese Kügelchen durch Flusszytometrie nachgewiesen.
Ein Format für die Selektion von genetischen Elementen ist, dass das genetische Element ein Gen, verknüpft mit einem Mikrokügelchen umfasst, das in einer Mikrokapsel translatiert wird, und das translatierte Genprodukt mit dem Mikrokügelchen innerhalb der Mikrokapsel zurückgekoppelt wird. Somit führt die Kompartimentalisierung zu der Bildung von Komplexen von Genprodukten (z.B. Proteine oder Enzyme), die an das Gen, das sie kodiert, angeheftet sind. Diese Komplexe können anschließend für die Bindung eines Liganden (siehe Beispiel 12) oder für enzymatische Aktivität über eine zweite Kompartimentalisierungsreaktion ausgewählt werden.
Dass jedoch solche Komplexe für katalytische Aktivität ausgewählt werden können, sollte ein lösliches Substrat für das immobilisierte Enzym bereitstehen, und sobald die katalytische Reaktion abgeschlossen wurde, sollte das Produkt der enzymatischen Aktivität, für die es ausgewählt ist, an das Gen angeheftet werden, das dieses Enzym kodiert. Die resultierenden Komplexe können anschließend durch das Produkt, das an sie angeheftet ist, sortiert oder selektiert werden, zum Beispiel unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers, der das Produkt erkennt. In anderen Abschnitten, die Komplexe von Genen und Genprodukten enthalten, die keine Proteine mit der gewünschten enzymatischen Aktivität kodieren, sollte das nicht umgesetzte Substrat mit dem Gen verknüpft werden. Diese Komplexe werden nicht mit dem Produkt markiert werden und werden deshalb verworfen.
Hier wird gezeigt, dass ein Enzym (Phosphotriesterase oder PTE) mit einem eingeschlossenen biotinylierten Substrat in der Anwesenheit von Streptavidin beschichteten Kügelchen umgesetzt werden kann. Das erzeugte eingeschlossene biotinylierte Produkt kann anschließend durch UV Bestrahlung freigesetzt werden und auf Avidin beschichteten Kügelchen gefangen werden. Anschließend werden diese Kügelchen durch Flusszytometrie nachgewiesen und werden eindeutig von Kügelchen unterschieden, die mit einem eingeschlossenen biotinylierten Substrat in der Anwesenheit von anderen Enzymen oder Proteinen, die keine Phosphotriesterase Aktivität zeigen, inkubiert wurden.
Ein eingeschlossenes biotinyliertes Substrat für PTE (EtNP-Bz-Glueingeschlossenes-Biotin; 12) wird wie folgt synthetisiert:
Boc-5-Aminopentanol: Di-tert-butyldicarbonat (20,8 g; 0,095 mol) wird zu einer gerührten Lösung aus 5-Aminopentanol (10,37 g; 0,1 mol) in Dichlormethan (DCM) (200 ml) auf Eis zugegeben. Nach der Zugabe wird die Lösung trüb, und ein Sirup trennt sich ab. Triethylamin (13,8 ml; 0,1 mol) wird tropfenweise zugegeben, und die resultierende Lösung wird für 10 Minuten auf Eis und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, der resultierende Sirup wird in Ethylacetat (500 ml) gelöst, dreimal mit 1 M Na₂HPO₄ (pH 4), einmal mit gesättigter NaHCO₃ und schließlich mit Salzlösung extrahiert und anschließend über MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, und der resultierende Sirup (nach ausreichendem Trocknen unter Vakuum in der Anwesenheit von Kaliumhydroxid), der primär aus Boc-5-Aminopentanol zusammengesetzt ist, wird ohne weitere Reinigung verwendet.
(11) Triethylamin (3 ml; 22 mmol) wird tropfenweise zu einer gerührten Lösung aus p-Nitrophenylphosphodichloridat (5,15 g; 20 mmol) und Ethanol (1,15 ml, 20 mmol), gekühlt auf Trockeneis in Aceton, innerhalb von 30 Minuten zugegeben. Die Lösung wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt und wird für weitere 90 Minuten gerührt. Eine Lösung aus Boc-5-Aminopentanol (4,3 g; ca. 20 mmol) und Triethylamin (3 ml; 22 mmol) in DCM (20 ml) wird anschließend tropfenweise zugegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt, 1 H-Tetrazol wird zugegeben (0,35 g; 5 mmol), und die Reaktion wird für weitere 2 Stunden gerührt. DCM wird zugegeben (100 ml), und die Lösung wird 3-mal mit 1 M Na₂HPO₄ (pH 4), gesättigter NaHCO₃ und schließlich mit Salzlösung extrahiert und anschließend über MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, um einen Sirup zu ergeben, der durch Säulenchromatographie auf Silica gereinigt wird (Lösungsmittel: 1% bis 2% Methanol in DCM) um 3,52 g von 11 (ein Sirup) zu ergeben.
4-N-Boc-aminomethylbenzoesäure N-Hydroxysuccinimidester: Dicyclohexyldcarbodiimid (DCC; 5,15 g; 25 mmol) wird zu einer gerührten Suspension aus 4-N-Boc-aminomethylbenzosäure (Tiger, Monmouth NJ; 5,2 g; 25 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (2,88 g; 25 mmol) in DCM (200 ml) plus Acetonitril (20 ml) zugegeben. Die Reaktion wird über Nacht bei 4°C und anschließend 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Dicyclohexylharnstoff Präzipitat wird durch Filtration entfernt, und das Filtrat wird unter Vakuum konzentriert, um einen Sirup zu erge ben. Der Sirup wird in Chloroform und DCM gelöst und mit Aktivkohle behandelt. Die Zugabe von Ether ergibt einen weißen kristallinen Feststoff. Die Rekristallisierung aus DCM und Petroleumether ergibt 6,2 g des N-Hydroxysuccinimidesters von 4-N-Boc-aminomethylbenzoesäure.
(12) Trifluoressigsäure (TFA; 4 ml) wird zu einer Lösung aus 11 (900 mg; 2,07 mmol) in DCM (5 ml) zugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur für 45 Minuten belassen, und die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt. Der zurückbleibende Sirup wird titriert, indem er in DCM und Methanol und zugegebenem Ether gelöst wird. Das resultierende 12 (als TFA Salz; Sirup) wird über Vakuum in der Anwesenheit von Kaliumhydroxid getrocknet und anschließend sofort ohne weitere Reinigung umgesetzt (siehe unten).
(13) 4-N-Boc-aminomethylbenzoesäure N-Hydroxysuccinimidester (670 mg; 2,2 mmol) und Triethylamin (0,345 ml; 2,5 mmol) werden zu 12 (siehe oben) in DCM (15 ml) zugegeben. Die Lösung wird für 30 Minuten gerührt, Triethylamin (0,1 ml; 0,72 mmol) wird zugegeben, und die Lösung wird für zusätzliche 3 Stunden gerührt. DCM wird zugegeben (20 ml), und die Lösung wird zweimal mit 1 M Na₂HPO₄ (pH 4), einmal mit gesättigter NaHCO₃ und schließlich mit Salzsäure extrahiert und anschließend über MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, um einen Sirup zu ergeben, der durch Säulenchromatographie auf Silica gereinigt wird (Lösungsmittel: 5% Methanol in DCM), um 0,86% von 13 (ein Sirup) zu ergeben.
(14) 0,84 g 13 von 14 (1,6 mmol) wird mit TFA wie oben beschrieben, behandelt, um 14 (als TFA Salz; Sirup) zu ergeben, das sofort wie unten beschrieben umgesetzt wird.
(15) Boc-Glu(OSu)-OBu^t (Bachem; 641 mg; 1,6 mmol) und Triethylamin (0,235 ml; 1,7 mmol) werden zu 14 (siehe oben) in DCM (15 ml) zugegeben. Die Lösung wird für 1 Stunde gerührt, Triethylamin (60 μl; 0,43 mmol) wird zugegeben, und die Lösung wird für 1 Stunde gerührt. DCM wird zugegeben (20 ml), und die Lösung wird zweimal mit 1 M Na₂HPO₄ (pH 4), einmal mit gesättigter NaHCO₃ und schließlich mit Salzlösung extrahiert und anschließend über MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, um einen Sirup zu ergeben, der durch Säulenchromatographie auf Silica gereinigt wird (Lösungsmittel: 7% Methanol in DCM), um 0,8 g von 15 (ein weißer kristalliner Feststoff) zu ergeben.
EtNP-Bz-Glu (16) 0,4 g von 15 (0,56 mmol) wird in DCM (5 ml) und TFA (5 ml) gelöst. Die Lösung wird für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt. Der zurückbleibende Sirup wird kristallisiert, indem er in Methanol und zugegebenem Ether gelöst wird. Die Rekristallisierung (in Methanol und Ether ergibt 200 mg von 16 (als TFA Salz; weißer Feststoff).
EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenes-Biotin (17) Carbonyldiimidazol (6 mg, 37,5 μmol) wird zu einer Lösung aus MeNPO-CO-Biotin-OH (5, 17 mg, 35 μmol) in DMF (1 ml) zugegeben. Die Lösung wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und zu 16 (20 mg, 30 μmol) zugegeben. Triethylamin (5,5 μl, 40 μmol), DMF (1 ml) und Wasser (0,5 ml) werden zu der gerührten Reaktionsmischung zugegeben, bis sie klar wird. Die Lösung wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und bei –20°C gelagert.
Das Produkt der obigen Reaktion wird durch reverse Phasen HPLC auf einer C8 präparativen Säule unter Verwendung eines Wasser-Acetonitril Gradienten in der Anwesenheit von 0,1% Trifluoressigsäure gereinigt. Die Spitze, die 17 entspricht (Retentionszeit = 23,1 Minuten), wird gesammelt. Das Produkt wird durch Gefriertrocknen als ein gelber Feststoff isoliert. Die Analyse des Produkts nach der HPLC Reinigung unter Verwendung von analytischer reverser Phasen HPLC zeigte ein Hauptprodukt (> 80%), dessen UV Spektrum 17 entspricht. Insbesondere zeigt λ^max bei 355 nm die Anwesenheit der O-Methylnitropiperonyl-carbonylgruppe des eingeschlossenen Biotins (Pirrung & Huang, 1996), und eine "Schulter" bei 277 nm, die bei eingeschlossenem Biotin fehlt, zeigt die Anwesenheit des p-Nitrophenylphosphatesters von 17. Die Konzentration von 17 wird durch Hydrolysieren des p-Nitrophenylphosphatesters in 0,1 M Kaliumhydroxid und dem Bestimmen der freigesetzten p-Nitrophenol Menge (optische Dichte bei 405 nm) verifiziert.
Von dem gereinigten 17 wird auch gefunden, dass es ein Substrat für PTE ist, was zu der Freisetzung von p-Nitrophenol (13; überwacht durch die Änderung der optischen Dichte bei 405 nm) mit Geschwindigkeiten, die nur ungefähr 6-fach langsamer sind als jene, die mit Paraoxon beobachtet werden, führt. Bemerkenswerterweise, nicht wie die Basen katalysierte Hydrolyse von 17, die vollständig abläuft (und die PTE katalysierte Hydrolyse von Paraoxon), läuft die PTE katalysierte Hydrolyse von 17 mit signifikanten Geschwindigkeiten nur bis die Hälfte des Substrats hydrolysiert wurde. Die zweite Hälfte des Substrats kann auch hydrolysiert werden, aber nur in der Anwesenheit von viel größeren Mengen von PTE und nach längeren Inkubationen (mehrere Stunden bis über Nacht). Dies liegt wahrscheinlich an der Tatsache, dass in diesem Fall 17 aus zwei Diastereomeren (die zwei Enantiomeren bezüglich des chiralen Phosphotriesters entsprechen) aufgebaut ist, von denen nur eines ein wirksames Substrat für das Enzym ist. Tatsächlich wurde die Stereoselektivität kürzlich bei PTE und anderen chiralen Phosphotriestern (Hong & Raushel, 1999) beobachtet.
Es werden Antikörper erzeugt, die Ethyl-Phosphodiester erkennen würden, welche die Produkte der Hydrolyse der entsprechenden p-Nitrophenylphosphotriester sind. Hierfür wird ein geeignetes Ethylphosphodiester Derivat synthetisiert und konjugiert, um Proteine wie unten beschrieben zu tragen (14).
EtNPBG (18) (Glutarsäureanhydrid (180 mg; 1,6 mmol) und Triethylamin (0,22 ml; 1,6 mmol) werden zu 12 (hergestellt durch Entschützen von 1,6 mmol von 11, wie oben beschrieben) in DCM (15 ml) zugegeben. Die Lösung wird für 20 Minuten gerührt, Triethylamin (0,12 ml; 0,85 mmol) wird zugegeben, und die Lösung wird für 1 weitere Stunde gerührt. DCM wird zugegeben (20 ml), und die Lösung wird zweimal mit 1 M Na₂HPO₄ (pH 4) extrahiert und anschließend über MgSO₄ getrocknet. Die Lösungsmittel werden unter Vakuum entfernt, um einen Sirup zu ergeben, der durch Säulenchromatographie auf Silica (Lösungsmittel: 12,5%; Me thanol in DCM plus 0,1% Essigsäure) gereinigt wird, um 445 mg von 18 (ein Sirup) zu ergeben.
Substrat Konjugate EtNPGB-KLH und EtNPBG-KLH. Carbonyldiimidazol (CDI; 32 mg, 200 mmol) wird zu einer Lösung von 18 (60 mg, 134 μmol) in DMF (1 ml) zugegeben. Die Lösung wird für 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Aliquots des aktivierten 18 werden anschließend zu 5 mg/ml Lösungen von bovinem Serumalbumin (BSA) oder Schlüssellochnapfschnecken Hämocyanin (KLH) in 0,1 M Phosphat pH 8,0 (bei 0,5 bis 4 μmol von 18 pro mg Protein), gegeben.
Die Reaktionen werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, und die resultierenden Protein Konjugate werden umfangreich gegen Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) bei 4°C dialysiert. Der Konjugationsspiegel (Haptendichte oder Hd) wird durch Hydrolysieren einer Probe der dialysierten Konjugate in 0,1 M Kaliumhydroxid und Überwachen der Menge des freigesetzten p-Nitrophenols (bei 405 nm) bestimmt. Diese wurden wie folgt gefunden: 8,5 bis 24 EtNPBG Moleküle pro BSA Molekül und 14 bis 63 pro KLH Molekül, in Abhängigkeit von der Menge des aktivierten 18, das zu den Proteinproben zugegeben wurde.
Produkt Konjugate EtBG-KLH und EtBG-KLH. Die EtNPBG-KLH und EtNPBG-KLH Konjugate, die oben beschrieben sind, werden gegen 0,1 M Carbonat pH 11,8 für 44 Stunden bei Raumtemperatur und anschließend umfangreich gegen PBS (bei 4°C) dialysiert.
Anti-EtBG Antikörper werden in Kaninchen durch Immunisierung mit EtBG-KLH (Hd = 14) unter Verwendung publizierter Protokolle (Tawfik et al., 1993; Tawfik et al., 1997) (eine Gabe von Prof. Z. Eshhar, Weizmann Institute of Science, Rehovot) hergestellt. Die Seren wurden durch ELISA hinsichtlich der Bindung an sowohl das Substrat Konjugat EtNPBG-BSA (Hd = 8,5) als auch korrespondierende Produkt Konjugat (EtBG-BSA; Hd = 8,5) getestet. Die erste Blutentnahme aus einem der immunisierten Kaninchen (wenn 500-fach oder mehr verdünnt) zeigt die gewünschte Selektivität, und führt zu einem starken Signal, wenn es mit dem Produkt Konjugat inkubiert wird und einen niedrigen Hintergrund (< 20%) mit dem Substrat Konjugat. Das Verdünnen der Seren in COVAp Puffer (2 M, NaCl, 10 g, 1 MgSO₄·7H₂O, 0,04% Tween 20, 10 mM Phosphat, 0,1 mM p-Nitrophenol, pH 6,5) erhöht weiter die Selektivität mit Hintergrundmengen, die unter 5% fallen. Das Anti-EtBG Serum wird unter Verwendung einer HiTrap Protein A Säule (Pharmacia) gereinigt. Die gereinigten Kaninchen Antikörper werden mit einem Alexa Fluor 488 Protein Markierungskit (Molecular Probes) nach den Angaben des Herstellers markiert.
10 μl (~2 × 10⁸ Kügelchen) 0,95 μm Streptavidin beschichteter Mikrokügelchen (Bangs, ~2 × 10⁷ Kügelchen pro ml Suspension) werden in einer Mikrofuge bei 10,000 g für 3 min zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt. Die Kügelchen werden in 10 μl 50 mM Tris pH 8,3 enthaltend EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenes-Biotin (17) resuspendiert, um eine Endkonzentration von 10 μM, 20 μM oder 30 μM zu ergeben. PTE wird in vitro durch Transkription/Translation der OPD.LMB3-2biotin DNA Fragmente (bei 5 nM) exprimiert. Es wird eine kommerzielle Präparation verwendet (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega), das mit T7 RNA Polymerase (2.000 Einheiten) ergänzt wurde, und die Reaktionen werden bei 25°C für 1,5 Stunden inkubiert. Die PTE wird anschließend durch die Zugabe von Kaliumcarbonat (10 mM) und Kobaltchlorid (1 mM) in Tris Puffer (10 mM pH 8,0) zusammengesetzt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Ein anderes Enzym, welches die Phosphotriesterase Aktivität nicht zeigt, Methyltransferase HaeIII, wird auch in vitro durch Transkription/Translation von M.HaeIII.LMB3-2biotin DNA Fragmenten (bei 5 nM) exprimiert und anschließend mit Carbonat und Kobalt wie die PTE behandelt. 5 μl Aliquots der obigen Reaktionsmischungen werden zu den Kügelchen Suspensionen zugegeben, und die Reaktionen werden für 1 Stunde bei 35°C im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 15 μl 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 abgestoppt und auf Eis transferiert. Jede Reaktion wird anschließend in zwei Aliquots von jeweils 15 μl aufgeteilt, von denen eines als ein Tropfen auf eine Schicht eines Parafilms auf die Oberfläche eines eisgekühlten Aluminiumblocks gegeben wird. Dieses Aliquots wird anschließend für 2 min mit einer B 100 AP UV Lampe (UVP), die in einem Abstand von ~6 cm gehalten wird, bestrahlt. Das andere Aliquot wird im Dunkeln belassen. Alle Proben mit Kügelchen werden anschließend für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert und dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen, wobei zwischen jedem Waschschritt kräftig resuspendiert wird. Die Kügelchen (~2 × 10⁷) werden anschließend in 200 μl COVAp enthaltend 100 ng/μl Alexa-488 markierte Kaninchen Anti-EtBG Antikörper resuspendiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur und anschließend 1 Stunde bei 4°C inkubiert. Die Kügelchen werden dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 wie oben gewaschen, anschließend in 1 ml PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert, und 10.000 Ereignisse werden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert.
Wie aus 15 gesehen werden kann, wird ein bis zu 20-facher Anstieg in der mittleren Fluoreszenz der Kügelchen nach der PTE katalysierten Hydrolyse von EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin in der Anwesenheit von Streptavidin beschichteten Kügelchen und nach UV Bestrahlung beobachtet. Dieser Anstieg wird relativ zu den Kügelchen beobachtet, die im Wesentlichen gleich behandelt wurden, aber in der Anwesenheit eines anderen Enzyms (M.HaeIII), ohne Phosphotriesterase Aktivität. Bemerkenswerterweise werden die Unterschiede im Fluoreszenzsignal beobachtet, wenn sowohl die PTE als auch die M.HaeIII in vitro von den entsprechenden Genen exprimiert und zusammen mit dem vollständigen Inhalt der in vitro Transkription/Translationsreaktionsmischung zugegeben werden.
Bei hohen Substratkonzentrationen ist die beobachtete mittlere Fluoreszenz geringer als sie bei 20 μM beobachtet wird. Zusätzlich gibt es bei Substratkonzentrationen über 20 μM im Wesentlichen keinen Unterschied in dem Fluoreszenzsignal zwischen den Reaktionen, die im Dunkeln gehalten wurden und jenen, die UV bestrahlt wurden (Daten nicht gezeigt). Weil die Kügelchen unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen beginnen, eine Sättigung des Bindungssignals bei Konzentrationen über 10 μM (des Produkts, wie es durch die anschließende Zugabe von fluoreszenzmarkierten Anti-EtBG Antikörpern nachgewiesen wird) zu zeigen, können diese Ergebnisse durch die Anwesenheit einer Kontamination von EtNP-Bz-Glu-Biotin in der Präparation von EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin erklärt werden. Diese Ergebnisse stimmen auch überein mit der zuvor beobachteten Hintergrundimmobilisierung von eingeschlossenem Biotin an Avidin (im Dun keln) (d.h. ohne UV Bestrahlung), die so hoch war wie 15% des Signals, das nach Bestrahlung beobachtet wurde (Sundberg et al., 1995). Das "Dunkel" Signal, das zuvor beobachtet wurde, wurde entweder Verunreinigungsspuren von Biotin in der eingeschlossenen Biotin Präparation oder den schwächeren Interaktionen zwischen Avidin und den Bestandteilen des eingeschlossenen Biotins einschließlich des Linkers zugeschrieben (Sundberg et al., 1995). Beide Mechanismen können zu der Tatsache beitragen, dass bei hohen Konzentrationen von eingeschlossenem biotinylierten Substrat (und überhalb der Bindungskapazität der Kügelchen), das "Dunkel" Signal signifikant wird. Nichts desto trotz macht bei Substratkonzentrationen von 20 μM oder niedriger das "Dunkel" Signal nur 25% oder sogar weniger als 10% (z.B. bei 10% μM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin) des Bestrahlungssignals aus. Dies zeigt, dass das meiste der PTE katalysierten Hydrolyse von EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenem-Biotin stattfindet, während sich das Substrat in Lösung befindet und nicht an die Kügelchen angeheftet ist, und dass das resultierende Produkt (Et-Bz-Glu-eingeschlossenes-Biotin) nach Bestrahlung mit UV Licht freigesetzt und auf den Mikrokügelchen immobilisiert wird.
Beispiel 10.
Gene, die an Kügelchen angeheftet sind, werden in vitro exprimiert, und die resultierenden Genprodukte (Enzyme) werden an die Mikrokügelchen immobilisiert, während sie die katalytische Aktivität behalten. Das immobilisierte Enzym katalysiert eine Reaktion mit einem eingeschlossenen biotinylierten Substrat, und das resultierende eingeschlossene biotinylierte Produkt wird anschließend durch UV Bestrahlung freigesetzt und wird an diese Kügelchen zusammen mit dem Gen, welches das Enzym kodiert, das zu seiner Bildung führte, angeheftet. Anschließend werden diese Kügelchen durch Flusszytometrie nachgewiesen.
Ein Format für die Selektion von genetischen Elementen ist, dass das genetische Element ein Gen, verknüpft mit einem Mikrokügelchen umfasst, das in einer Mikrokapsel translatiert wird, und das translatierte Genprodukt mit dem Mikrokügelchen innerhalb der Mikrokapsel zurückgekoppelt wird. Somit führt die Komparti mentalisierung zu der Bildung von Komplexen von Genprodukten (z.B. Proteine oder Enzyme), die an das Gen, das sie kodiert, angeheftet sind. Diese Komplexe können anschließend für die Bindung eines Liganden (siehe Beispiel 12) oder für enzymatische Aktivität über eine zweite Kompartimentalisierungsreaktion ausgewählt werden.
Für solche Komplexe, die hinsichtlich katalytischer Aktivität ausgewählt werden können, sollte ein lösliches Substrat für das immobilisierte Enzym bereitstehen, und sobald die katalytische Reaktion abgeschlossen wurde, sollte das Produkt der enzymatischen Aktivität, für die es ausgewählt ist, an das Gen angeheftet werden, das dieses Enzym kodiert. Die resultierenden Komplexe können anschließend durch das Produkt, das an sie angeheftet ist, sortiert oder selektiert werden, zum Beispiel unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers, der das Produkt erkennt. In anderen Abschnitten, die Komplexe von Genen und Genprodukten enthalten, die keine Proteine mit der gewünschten enzymatischen Aktivität kodieren, sollte das nicht umgesetzte Substrat mit dem Gen verknüpft werden. Diese Komplexe werden nicht mit dem Produkt markiert werden und werden deshalb verworfen.
Hier wird gezeigt, dass ein Enzym (Phosphotriesterase oder PTE) in vitro von Genen transkribiert oder translatiert werden kann, die an Mikrokügelchen angeheftet sind, und das translatierte Enzym wird an die Mikrokügelchen zurückgebunden. Das translatierte Enzym kann anschließend modifiziert werden, um die aktive Stelle Kobalt einzubauen, und seine katalytische Aktivität wird beibehalten, während es an das Mikrokügelchen zusammen mit dem Gen, das es kodiert, gebunden ist. Die immobilisierte PTE reagiert anschließend mit einem eingeschlossenen biotinylierten Substrat, und das erzeugte eingeschlossene biotinylierte Produkt wird durch UV Bestrahlung freigesetzt und auf denselben Avidin beschichteten Kügelchen gefangen, an welche das Gen, das die PTE kodiert, angeheftet ist. Anschließend werden diese Kügelchen durch Flusszytometrie nachgewiesen und sind eindeutig von Kügelchen zu unterscheiden, die ein Gen tragen, das ein Protein kodiert, das keine Phosphotriesterase Aktivität zeigt.
Aliquots einer Suspension von 0,95 μm Streptavidin beschichteten Mikrokugeln (Bangs, ~2 × 10⁷ Kügelchen pro μl Suspension) werden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen in TNT Puffer (0,1 M, Tris 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20) resuspendiert. Ein Antikörper, der zur Bindung des Flag Peptids in der Lage ist und biotinyliert ist (BioM5, ein Biotin markierter Anti-Flag Antikörper; Sigma) wird zu der Suspension der Kügelchen zugegeben, um durchschnittlich 10⁴ Antikörper Moleküle pro Kügelchen zu ergeben, und die Mischung wird für einige Stunden inkubiert. Die Kügelchen werden durch Herunterzentrifugieren und Resuspendieren in TNT Puffer auf das ursprüngliche Volumen gespült. Biotinylierte DNA Fragmente N-Flag-OPD.LMB3-2biotin oder Fragmente, die den T7 RNA Polymerase Promotor, die Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle und ein Gen kodierend ein anderes Enzym (auch mit N-Flag Peptid markiert), z.B. Methyltransferase HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotin) tragen, werden zu der Suspension aus Antikörper beschichteten Kügelchen in 1,6 nM Konzentration zugegeben, und die Mischung wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Kügelchen werden 3-mal durch Herunterzentrifugieren und Resuspendieren in TNT Puffer gespült.
50 μl Aliquots der obigen Suspension aus Kügelchen (~10⁹ Kügelchen) werden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen vorsichtig auf Eis in 50 μl eines prokaryonten in vitro gekoppelten Transkriptions/Translationssystems, das für lineare Matrizen ausgestaltet ist, resuspendiert (Lesley et al., 1991). Eine kommerzielle Präparation des Systems wird verwendet (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega), das mit T7 RNA Polymerase (2.000 Einheiten) ergänzt ist. Die Reaktionen werden bei 25°C für 1,5 Stunden inkubiert und in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Kügelchen in 100 μl 50 mM Tris, 10 mM Kaliumcarbonat, pH 8,0 resuspendiert. Eine wässrige Lösung aus Kobaltchlorid wird in einer Konzentration von 1 mM zugegeben, und die Reaktionen werden für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kügelchen werden 4-mal durch Herunterzentrifugieren und Resuspendieren in TNT Puffer gespült. Schließlich werden die Kügelchen in TNT Puffer in ihren ursprünglichen Volumen resuspendiert.
Aliquots der obigen Kügelchen werden zu Lösungen aus 0,25 mM Paraoxon in 50 mM Tris pH 8,3 zugegeben. Die Kügelchen werden bei 25°C mit gelegentlichem Rühren für verschiedene Zeiträume inkubiert. Die Kügelchen werden in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert, der Überstand wird entfernt, und ihre optische Dichte wird bei 405 nm gemessen. Eine signifikante Änderung in der optischen Dichte bei 405 nm wird beobachtet, wenn die Kügelchen an die biotinylierte DNA Fragmente N-Flag-OPD.LMB3-2biotin angeheftet sind (und die anschließend wie oben beschrieben umgesetzt werden), im Gegensatz zu Reaktionen, die unter denselben Bedingungen durchgeführt werden, aber in der Abwesenheit von Kügelchen oder Phosphotriesterase, oder mit Kügelchen, an die N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotin DNA Fragmente angeheftet sind, und die anschließend wie oben beschrieben umgesetzt werden.
Als Nächstes werden 10 μl (~2 × 10⁸ Kügelchen) der obigen Kügelchen in einer Mikrofuge bei 10.000 g für 3 min zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die Kügelchen werden in 10 μl 12,5 oder 25 μM EtNP-Bz-Glu-eingeschlossenes-Biotin in 50 mM Tris pH 8,3 resuspendiert. Die Suspensionen der Kügelchen werden für 1,5 Stunden bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 10 μl 0,1 M Natriumacetat, pH 5,0 abgestoppt und auf Eis transferiert und für 2 min mit einer B 100 AP UV Lampe (UVP), die in einem Abstand von ~6 cm gehalten wird, bestrahlt. Alle Proben mit Kügelchen werden anschließend für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert und anschließend dreimal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen und zwischen jedem Waschschritt sorgfältig resuspendiert. Die Kügelchen (~7 × 10⁷) werden anschließend in 125 μl eines Kaninchen Anti-EtBG Serums, das 1:125 in COVAp verdünnt wurde, resuspendiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Kügelchen werden einmal mit 200 μl COVAp und anschließend 3-mal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20, wie oben, gewaschen und in 200 μl PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert. 70 μl der obigen Suspensionen der Kügelchen (~2 × 10⁷) werden zu 50 μl 40 ng/μl FITC markiertem Ziege Anti Kaninchen Fab (Jackson 115-095-006) in PBS, 0,1% Tween 20 zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kügelchen werden 3-mal mit 200 μl PBS, 0,1% Tween 20, wie oben, gewaschen, anschließend in 1 ml PBS, 0,1% Tween 20 resuspendiert, und 10.000 Ereignisse werden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert.
Folglich, wie in 16 gesehen werden kann, können Kügelchen, an die jene angeheftet sind, die Phosphotriesterase markiert dem Flag Peptid kodieren (zusammen mit einem Antikörper, der an das Flag Peptid bindet) eindeutig von Genen unterschieden werden, an die andere Gene, die Enzyme ohne Phosphotriesterase Aktivität kodieren (z.B. N-Flag-M.HaeIII) angeheftet waren.
Beispiel 11.
E. coli BirA, das in vitro transkribiert und translatiert wurde, katalysiert eine Reaktion, die eine Änderung in den Fluoreszenzeigenschaften von Substrat markierten Mikrokugeln in wässrigen Abschnitten einer Wasser-in-Öl Emulsion hervorrufen.
Das Gen, das ein Peptid aus Propionibacterium shermanii kodiert, das in vivo in E. coli biotinyliert ist, wird unter Verwendung der Oligonukleotide BCCP5 und BCCP3 aus dem Vektor Pinpoint Xa-1 (Promega) amplifiziert. Das PCR Fragment wird in den Vektor pET-23d(FLAG), der mit BamHI und HindIII gespalten wurde, unterhalb eines T7 RNA Polymerase Promotors und der Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle und innerhalb des Leserahmens mit einer N-terminalen FLAG Peptid kodierenden Region kloniert; dieser Vektor wird als pET-23d(FLAG-BCCP) bezeichnet. Der Vektor pET-23d(FLAG) ist identisch zu dem Vektor pET-23d (Novagen), mit Ausnahme der Region zwischen den einmaligen NcoI und BamHI Stellen, der modifiziert wurde, um eine N-terminale FLAG Peptid kodierende Region, wie unten in Schema 2 (SEQ ID NOs: 2, 3) gezeigt ist, einzuschließen. Um ein Hexahistidin Tag an den C-Terminus des Proteins anzuhängen, wurden die zwei Oligonukleotide BCCPHis+ und BCCPHis– zusammen gelagert und anschließend in den Vektor pET-(23d(FLAG-BCCP) ligiert, der mit SacI und NotI gespalten wurde, was zu dem Vektor pET-(FLAG-BCCP-His) führte. Das Protein FLAG-BCCP-His (als FBH bezeichnet) wird in dem Stamm C41(DE3) (Miroux & Walker, 1996) überexprimiert, geerntet und mit Ni-NTA Agarose (Qiagen) unter nativen Bedingungen nach dem Protokoll des Herstellers gereinigt. Biotinyliertes Protein wird durch Inkubation mit einem gleichen Volumen an Avidin-Agarose (Sigma) abgereichert, mit einem Waschpuffer (50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0; 300 mM NaCl; 20 mM Imidazol) für 1 Stunde bei 4°C prääquilibriert. Die Suspension wird anschließend bei 10.000 g für 2 Minuten zentrifugiert, und der Überstand aufbewahrt, aliquotiert und in flüssigem Stickstoff (Langzeit) oder bei 4°C gelagert.
Schema 2
Das Gen, das E. coli BirA kodiert, wurde durch PCR unter Verwendung der Oligonukleotide BirA5 und BirA3 aus einem pBluescript 2SK+ Vektor, der das E. coli BirA Gen enthält (eine Gabe von P. Wang, nicht veröffentlicht) amplifiziert. Der PCR Vektor wird in den Vektor pGEM-4Z(K2), der mit KpnI und XhoI gespalten wurde, unterhalb des lac Promotors, T7 RNA Polymerase Promotors und der wirksamen Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle kloniert. Der Vektor pGEM-4Z(K2) ist identisch mit dem Vektor pGEM-4Z^NocI (siehe Beispiel 8, Schema 1), mit der Ausnahme der Region zwischen den singulären NcoI und KpnI Stellen, die gemäß Schema 3, das unten gezeigt ist, modifiziert wurde, um eine singuläre XhoI Stelle unterhalb der NcoI Stelle (SEQ ID NOs: 4, 5) zu enthalten.
Schema 3
Die DNA Sequenzierung identifiziert einen Klon mit der richtigen Nukleotidsequenz, der als pGEM-BirA bezeichnet wird. Das oben beschriebene pGEM-BirA Plasmid wird durch PCR unter Verwendung der Primer LMB2 und LMB3, wie oben, amplifiziert, um ein 1139 Basenpaar PCR Fragment (BirA_LMB2-3) zu erzeugen, das den T7 RNA Polymerase Promotor, die Phagen T7 Gen 10 Translationsstartstelle und das BirA Gen trägt. Das PCR Fragment wird direkt unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega) gereinigt.
60 μl Aliquots (1,2 × 10⁹ Kügelchen) mit 1,0 μm Durchmesser nicht fluoreszierenden Ziege Anti-Maus IgG markierten Mikrokugeln (Bangs Laborstories, CP03N) wurden in einer Mikrofuge bei ungefähr 2.600 g (6.000 rpm) für 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Kügelchen in 60 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA resuspendiert. Die Kügelchen wurden erneut zentrifugiert, in 60 μl M5 Anti-FLAG Antikörper (Sigma F4042) resuspendiert und über Nacht inkubiert. Die Kügelchen wurden erneut für 3 Minuten zentrifugiert (2.600 g), der Überstand wurde entfernt, und die Kügelchen wurden in einer Mischung aus 30 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA und 30 μl FBH Protein, das wie oben erhalten wurde (Endprotein Konzentration ungefähr 4 mg/ml) resuspendiert und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
In der Zwischenzeit wurden 60 μl Aliquots eines prokaryonten in vitro gekoppelten Transkriptions/Translationssystems, das für lineare Matrizen (Lesley et al., 1991) ausgestaltet wurde, unter Verwendung eines kommerziellen Kits (E. coli S30 Extrakt System für lineare Matrizen; Promega) hergestellt, das mit T7 RNA Polymerase (2.000 Einheiten), 10 nM BirA_LMB2-3 DNA (oder überhaupt keine DNA) ergänzt war. Diese Aliquots wurden bei 25°C für 1 Stunde inkubiert, um die Translation zu erlauben.
Die 60 μl Aliquots der Kügelchen wurden bei 2.600 g (6.000 rpm) in einer Mikrofuge für 3 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Sie wurden in 60 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA resuspendiert, erneut zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Schließlich wurden sie auf Eis in 54 μl Aliquots der prokaryotischen in vitro gekoppelten Transkriptions/Translationsreaktionen, wie oben beschrieben, resuspendiert, die mit 3 μl 2 mM d-Biotin und 3 μl 0,2 M ATP ergänzt wurden.
Ein 5 μl Aliquot wurde aus jeder Reaktionsmischung entfernt und nicht emulgiert belassen. 50 μl der verbleibenden Reaktionsmischung wurde im Wesentlichen wie bei Tawfik & Griffiths (1998) emulgiert.
Die Ölphase wurde frisch hergestellt durch Lösen von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904), gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074). Die eiskalten Reaktionsmischungen wurden schrittweise (in 5 Aliquots von 10 μl über ~2 Minuten) zu 1,0 ml eiskalter Ölphase in einem 5 ml Biofreeze Gefäß (Costar, #2051) zugegeben, während mit einem magnetischen Rührfisch (8 × 3 mm mit einem Drehring; Scientific Industries International, Loughborough, UK) gerührt wurde. Das Rühren (bei 1150 rpm wurde für 1 weitere Minute auf Eis fortgesetzt.
Alle Reaktionen wurden für 4 Stunden bei 37°C inkubiert, damit die Biotinylierungsreaktion stattfinden konnte.
Die Emulsionen wurden in 1,5 ml Mikrofugengefäße transferiert, 1 min bei 13,5 k rpm in einer Mikrofuge zentrifugiert, und die Ölphase wurde entfernt, was die konzentrierte (aber noch intakte) Emulsion am Boden des Gefäßes zurückließ. 200 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5,0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA wurden zugegeben, und die Emulsion wurde durch Extrahieren 4-mal mit 1 ml Hexan und Vortexen zwischen jeder Hexan Zugabe, aufgebrochen. Restliches Hexan wurde durch Zentrifugieren bei 10 min bei Umgebungstemperatur unter Vakuum in einer Speedvac (Farmingdale, NY) entfernt.
Ungefähr 1 × 10⁸ Kügelchen aus den aufgebrochenen Emulsionen und den nicht emulgierten Reaktionen wurden anschließend zweimal mit 100 μl TNT/BSA in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen, und sorgfältig zwischen jedem Waschschritt resuspendiert. Die Kügelchen wurden anschließend in 50 μl M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA enthaltend 1 μl einer Streptavidin-HRP Lösung (bereitgestellt mit dem NEN TSA^TM Direktkit) resuspendiert und für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden zweimal mit 100 μl 0,2 M Tris, 10 mM Imidazol, pH 8,8, wie oben, gewaschen, anschließend in 50 μl 0,2 M Tris, 10 mM Imidazol, pH 8,8, 0,01% H₂O₂ resuspendiert. 1 μl einer Fluoreszein Tyramid Stocklösung (hergestellt nach den Angaben des Herstellers (NEN TSA^TM Direktkit)) wurde zugegeben, und die Reaktion wurde für zehn Minuten fortgesetzt. Die Kügelchen wurden zweimal mit PBS, wie oben, gewaschen und schließlich in insgesamt 500 μl PBS resuspendiert, in eine 5 ml Polystyrol Rundbodenflasche (Falcon) transferiert, und 10.000 Ereignisse wurden unter Verwendung eines FACScan Flusszytometers (Becton Dickinson) analysiert.
Wie aus 17 gesehen werden kann, sowohl in emulgierten als auch in nicht emulgierten Reaktionen führt die Reaktion, die durch in vitro translatiertes BirA katalysiert wird, zu Kügelchen mit höherer Fluoreszenz als wenn kein Enzym anwesend ist. Es scheint, dass Kügelchen, die in einer Emulsion mit in vitro translatiertem BirA inkubiert wurden, fluoreszierender sind als Kügelchen, die nicht in Emulsionen inkubiert wurden.
Beispiel 12
Eine Änderung in der Fluoreszenz von genetischen Elementen kann verwendet werden, um selektiv genetische Elemente anzureichern, die Peptide mit einer Bindungsaktivität kodieren. Die fuoreszent markierten genetischen Elemente werden durch Sortieren mittels Flusszytometrie isoliert.
Ein Format für die Selektion von genetischen Elementen ist, dass das genetische Element ein Gen, verknüpft mit einem Mikrokügelchen umfasst, das in einer Mik rokapsel translatiert wird, und das translatierte Genprodukt mit dem Mikrokügelchen innerhalb der Mikrokapsel zurückgekoppelt wird. Somit führt die Kompartimentalisierung zu der Bildung von Komplexen von Genprodukten, die an das Gen, das sie kodiert, angeheftet sind. Diese Komplexe können anschließend für die Bindung eines Liganden durch Sortieren mittels Flusszytometrie ausgewählt werden, wenn die Bindungsinteraktion zu einer Änderung in der Fluoreszenz der Mikrokügelchen führt.
Der pET-23d(FLAG) Vektor kodiert das N-terminale FLAG Peptid, fusioniert an die Polylinker Region von pET23d (Novagen). pET23d wird mit NcoI/BamHI gespalten, gelgereinigt und in Wasser erneut gelöst. Zwei synthetische phosphorylierte Oligonukleotide (Vh Bio Ltd., Newcastle upon Tyne, U.K.), FLAG und FLAGas, wurden zu 1 μM Konzentration jeweils in Wasser gemischt, für 3 min auf 94°C erhitzt und auf Raumtemperatur abgekühlt, bevor sie zu dem gespaltenen Vektor in die Ligationsmischung zugegeben wurden. Die Ligationsreaktion wurde ungereinigt verwendet, um E. coli TG-1 zu transformieren. Klone, die das Insert enthalten, wurden durch KpnI Spaltung identifiziert und durch Sequenzieren verifiziert (Oswel Research Product Ltd., Southampton, U.K.). Die Polylinker Region von pET-23d(FLAG) ist wie folgt (SEQ ID NOs: 6, 7):
Biotinyliertes FLAG-HA Expressionskonstrukt wurde aus dem Vektor pET-23d(FLAG) durch PCR hergestellt. Die Peptidsequenz YPYDVPDYA aus dem In fluenza Hämagglutinin wurde an das FLAG-Tag in pET-23d(FLAG) unter Verwendung des Primers FLAGHA und des 5'-biotinylierten Primers pETrev.b angehängt. Das Amplifikationsprodukt ist 903 Basen lang, und die kodierende Region des Konstrukts (SEQ ID NOs: 8–10) lautet:
Das Kompetitor Konstrukt in dem Selektionsprozess ist das E. coli folA Gen, das Dihydrofolat Reduktase amplifiziert aus pET23a/folA unter Verwendung der Primer pETfor und pETrev.b kodiert.
Die PCR Fragmente wurden gelgereinigt unter Verwendung des QlAquick Gel Extraktionskits (Qiagen). Die DNA Konzentration wurde durch UV Spektrometrie gemessen. Es wurden Verdünnungen von PCR hergestellten Expressionskonstruktion in 0,5 mg/ml Träger DNA hergestellt, die aus HindIII gespaltener Lambda Phagen DNA (40 min bei 80°C, gefolgt von Ethanol Präzipitation und Lösung in Wasser) hergestellt wurde.

2 × 10⁹ Streptavidin beschichtete 0,95 μm Polystyrol Kügelchen in einem 100 μl Aliquot einer 1% Suspension (Bangs Laborstories, Inc. CP01 N) wurden in einer Mikrofuge bei ungefähr 2.600 g (6.000 rpm) für 3 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und die Kügelchen wurden in 100 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,5% BSA (TNTB) resuspendiert. 7 μl 2 mg/ml biotinylierter Anti-FLAG monoklonaler Antikörper M5 (Sigma) wurde zu den resuspendierten Kügelchen zugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden inkubiert. Nach Beschichtung mit dem Antikörper wurden die Kügelchen dreimal mit 200 μl TNTB gewaschen, in 100 μl TNTB resuspendiert und in 10 μl Aliquots 1 und 2 und 40 μl Aliquots 3 und 4 aufgeteilt. 0,7 nM Stocklösung von entweder (#1) reiner FLAG-HA DNA, (#2) reiner folA DNA oder (#3 und #4) reiner FLAG-HA DNA, verdünnt in einem 1000-fachen Überschuss an folA DNA wurden in HindIII gespaltener Lambda DNA hergestellt und auf die Aliquots der Kügelchen aufgetragen. Die Bindungsreaktion wurde über Nacht bei 4°C fortgesetzt. Die maximale Zahl der Gene pro Kügelchen betrug 2 in Aliquots 1–3 und 0,2 in Aliquot 4. Die Kügelchen, die mit FLAG-HA Konstrukt beschichtet waren, dienten als Positivkontrolle, und die Kügelchen, die mit folA beschichtet waren, als Negativkontrolle.

#	DNA	Verhältnis folA:FLAG-HA	Kügelchen	DNA (nM)	DNA (μl)	DNA Moleküle/Kügelchen	S30 (μl)	Emulsion (ml)
1	FLAG-HA	-	2 × 10⁸	0,7	1	2	25	0,5
2	folA	-	2 × 10⁸	0,7	1	2	25	0,5
3	folA:HA	1000:1	8 × 10⁸	0,7	4	2	50	2 × 0,5
4	folA:HA	1000:1	8 × 10⁸	0,7	0,4	0,2	50	2 × 0,5

Nach der Inkubation über Nacht bei 4°C wurden die Kügelchen zweimal in TNTB gewaschen und in S30 in vitro Translationsmischung (S30 Extrakt System für lineare Matrizen, Promega), die mit T7 RNA Polymerase (20 Einheiten/μl) ergänzt wurde, resuspendiert.
Die eisgekühlten in vitro Translationsreaktionen wurde schrittweise (in 5 Aliquots à 10 μl über ~2 Minuten) zu 0,5 ml eiskalter Ölphase (frisch hergestellt durch Lösen von 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) in Mineralöl (Sigma, #M-5904), gefolgt von 0,5% (v/v) Tween 80 (SigmaUltra; #P-8074) in einem 5 ml Costar Biofreeze Gefäß (#2051)) zugegeben, während mit einem magnetischen Rührfisch (8 × 3 mm mit einem Drehring; Scientific Industries International, Loughborough, UK) gerührt wurde. Das Rühren (bei 1150 rpm) wurde für weitere 3 Minuten auf Eis fortgesetzt. Die Reaktionen wurden anschließend 90 min bei 30°C inkubiert.
Die Emulsionen wurden in 1,5 ml Mikrofugengefäße transferiert, 8 min bei 6,5 k rpm in einer Mikrofuge zentrifugiert, und die Ölphase wurde entfernt, was die konzentrierte (aber noch intakte) Emulsion am Boden des Gefäßes zurückließ. 200 μl 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5,0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20 (TNT) wurden zugegeben, und die Emulsion wurde durch Extrahieren 4-mal mit 1 ml Hexan und Vortexen zwischen jeder Hexan Zugabe, aufgebrochen. Restliches Hexan wurde durch Einblasen von Luft durch die Suspension der Kügelchen für 1 bis 2 min bei Umgebungstemperatur entfernt.
Die Kügelchen aus den aufgebrochenen Emulsionen wurden anschließend zweimal mit 100 μl TNT in einer 0,45 μm MultiScreen-HV Filterplatte (Millipore, MAHVN4510) gewaschen, und zwischen jedem Waschschritt sorgfältig resuspendiert. Die Kügelchen wurden anschließend in TNTB zu 10⁶ Kügelchen/μl und enthaltend 100 mU/ml Ratten Anti-HA-Peroxidase, Hochaffinitäts-(3F10)-Konjugat (Boehringer Mannheim) resuspendiert.
Die Kügelchen wurden anschließend mit dem Antikörper für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur inkubiert und dreimal mit 200 μl TNT gewaschen, bevor sie in 2 ml 0,2 M Tris, 10 mM Imidazol, pH 8,8 resuspendiert wurden. Die resuspendierten Kügelchen wurden für 1 min auf Eis unter Verwendung des Heat Systems Beschallungsgeräts bei Stufe 1, 95% Zyklen, 3,4 mm Spitze beschallt. Die beschallten Kügelchen wurden zu 10⁸ Kügelchen/ml in 0,2 M Tris, 10 mM Imidazol, pH 8,8 resuspendiert. Zu dieser Suspension der Kügelchen wurde ein gleiches Volumen an Tyramin Signal Amplifikations-(TSA)-Puffer 0,2 M Tris, 10 mM Imidazol, pH 8,8, 0,004% H₂O₂, 5 μg/ml Fluoreszeintyramin zugegeben.
Fluoreszeintyramin wurde wie beschrieben bei Hopman et al. (Anthon H. N. Hopman, Frans C. S. Ramaekers, Ernst J. M. Speel, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry Vol. 46(6), 771–777, 1998) synthetisiert.
Die Reaktion wurde für fünf Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt und durch Zugabe von 1/10 des Volumens an 10% bovinem Serumalbumin in PBS (BSA, Sigma) abgestoppt. Die Kügelchen wurden in 2 ml Aliquots der Markierungsreaktion herunterzentrifugiert und 2-mal in TNTB und einmal in PBS gewaschen. Schließlich wurden die Kügelchen in 2 ml PBS resuspendiert und wie oben beschallt.
Die Kügelchen, die mit den Genen beschichtet waren, die folA, FLAG-HA oder die 1000-fache Verdünnung von FLAG-HA in folA kodieren, wurden auf einem Becton Dickinson FACScan Flusszytometer analysiert.
In 18 zeigt das Histogramm A mit geringer Auflösung, dass die Kügelchen, die FLAG-HA DNA (Probe #1) tragen, signifikant mehr fluoreszierend markiert sind, als die Negativkontrolle folA (Probe #2). Die gespikten Mischungen #3 und #4 laufen vorwiegend identisch zu der Negativkontrolle, mit der Ausnahme einer kleinen Anzahl von stark fluoreszierenden Kügelchen (Ansicht B). 0,04% der Kügelchen in Probe #3 und 0,02% der Kügelchen in Probe #4 fallen in die Region M1, die 95% der positiven Ereignisse abdeckt.
Die Kügelchen in den Proben #3 und #4, die in die Region M1 fallen, wurden unter Verwendung eines MoFlo Fluoreszenz aktivierten Zellsortiergeräts sortiert. Zwei Sätze von sortierten Kügelchen wurden für beide Proben #3 und #4 erhalten. In dem ersten Satz wurden 500 Kügelchen in ein einziges Gefäß gesammelt. In dem zweiten Satz wurden 96 Kügelchen einzeln in die Vertiefungen einer 96-Vertiefungsplatte gesammelt. Beide Sätze von Kügelchen wurden einer 35 Zyklus PCR unter Verwendung der Primer pETrev.b und FLAGrev1 unterworfen.
Die Amplifikationsprodukte wurden durch Gelelektrophorese (19) analysiert. Die Produktgrößen betrugen 903 Basen für FLAG-HA und 1390 bp für folA.
Die gelelektrophoretisch Analyse der Amplifikationsreaktionsprodukte schlägt eine signifikante Anreicherung während des Verlaufs des Sortierens vor. In Ansicht A sind keine FLAG-HA Banden in den Spuren der Produkte sichtbar, die aus unsortierten Reaktionen #3 und #4 amplifiziert wurden, wohingegen die FLAG-HA Bande in den Proben aus den sortierten Kügelchen stark sichtbar ist. Definitive Daten bezüglich der Natur der amplifizierten DNA wurden aus der Analyse der DNA erhalten, die aus einzelnen Kügelchen amplifiziert wurde. Insgesamt 22 Kügelchen von 96 lieferten ein DNA Produkt für Reaktion #3, und 50% davon war reine FLAG-HA. Für die Reaktion #4 lieferten 9 Kügelchen Produkte, und 8 waren FLAG-HA.
Die Daten von einzelnen Kügelchen für Reaktion #3 schlagen vor, dass die verwendete Konzentration, nominal 2 DNA Moleküle/Kügelchen, die meisten der Kügelchen weisen tatsächlich nur ein angeheftetes Gen auf, die unzweideutige Verknüpfung zwischen dem Gen und seinem Produkt erlaubt. Eine relativ hohe Zahl an positiv markierten Kügelchen bedeutet jedoch, dass ungefähr 50% der zurückgewonnenen Kügelchen falsch positive waren. In Probe #4, in der nur ≈0,1 Gene/Kügelchen vorkamen, erreichte die Reinheit der rückgewonnenen DNA 90%, was eine nahezu 1000-fache Anreicherung in einem Schritt anzeigt.
Oligonukleotide
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Claims

Verfahren zum Erhöhen der Konzentration eines Nukleinsäure Moleküls, das die Schritte umfasst: (a) Bilden wässriger Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl Emulsion, wobei die Mikrokapseln eine wässrige innere Phase, die als einzelne Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase suspendiert wird, umfassen und wobei eine Vielzahl der Mikrokapseln ein Nukleinsäure Molekül, einen Festphasen Träger, der fähig ist, mit dem Nukleinsäure Molekül verbunden zu werden, und eine wässrige Lösung, die Bestandteile umfasst, die nötig sind, um Nukleinsäure Amplifikation in der wässrigen inneren Phase durchzuführen, umfassen; (b) Amplifizieren des Nukleinsäure Moleküls in den Mikrokapseln, um amplifizierte Produktkopien des Nukleinsäure Moleküls zu bilden; (c) Fangen der amplifizierten Produktkopien an den Festphasen Träger in den Mikrokapseln; und (d) Sortieren gemäß einer Änderung in den optischen Eigenschaften der Nukleinsäure; wodurch die Konzentration des Nukleinsäure Moleküls erhöht wird.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure Amplifikation durch Verwenden von Qβ Replikase Amplifikation, Ligase Kettenreaktion, self-sustained Sequenz Replikation oder Strang Displacement Amplifikation durchgeführt wird.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure Amplifikation durch Verwenden von Polymerase Kettenreaktion durchgeführt wird.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 1, Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die Wasser-in-Öl Emulsion wenigstens einen Emulsionsstabilisator einschließt.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 4, wobei der Emulsionsstabilisator ein nicht ionisches grenzflächenaktives Mittel ist.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei der Emulsionsstabilisator aus Sorbitan Monooleat und Polyoxyethylensorbitan Monooleat ausgewählt wird.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 4, wobei der Emulsionsstabilisator ein anionisches grenzflächenaktives Mittel ist.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 4 oder Anspruch 7, wobei der Emulsionsstabilisator aus Natriumcholat, Natriumglycocholat, Natriumtaurocholat und Natriumdesoxycholat ausgewählt wird.
Verfahren wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Emulsion thermostabil ist.
Verfahren wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Nukleinsäure Molekül eine Biotin Markierung umfasst.
Verfahren wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Festphasen Träger ein Kügelchen ist.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 11, wobei das Kügelchen eine Beschichtung aus Avidin oder Streptavidin umfasst.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei das Kügelchen aus Polystyrol, paramagnetischen und magnetischen Kügelchen ausgewählt wird.
Verfahren wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Festphasen Träger ein Kügelchen ist, die Nukleinsäure Amplifikation durch Verwenden von Polymerase Kettenreaktion durchgeführt wird und die Emulsion thermostabil ist.
Verfahren wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Nukleinsäure Molekül genomische DNA oder cDNA ist.
Verfahren wie beansprucht in einem vorhergehenden Anspruch, wobei eine Vielzahl von Mikrokapseln, wenn sie gebildet werden, jede durchschnittlich ein oder weniger als ein Nukleinsäure Molekül enthält.
Verfahren wie beansprucht in einem der Ansprüche 1–15, wobei eine Vielzahl der Mikrokapseln, wenn sie gebildet werden, jede durchschnittlich zwischen 5 und 1000 Nukleinsäure Moleküle enthält.
Verfahren zum Herstellen eines Genprodukts aus einem oder mehreren genetischen Elementen, die Nukleinsäuren umfassen, das Verfahren umfasst: (a) Bereitstellen von Kügelchen und einem oder mehreren genetischen Elementen, die Nukleinsäuren umfassen, wobei die Kügelchen zum Koppeln an das eine oder mehrere genetische Elemente und Genprodukte, die von den genetischen Elementen hergestellt werden, angepasst werden, und das eine oder mehrere genetische Elemente zum Koppeln an die Kügelchen angepasst werden, und Kombinieren der Kügelchen und genetischen Elemente, so dass die genetischen Elemente an die Kügelchen binden; (b) Aufteilen des einen oder mehrerer an Kügelchen gebundener genetischer Elemente in wässrige Mikrokapseln mit Bestandteilen, die benötigt werden, um ein Genprodukt aus dem einem oder mehreren genetischen Elementen herzustellen, die Mikrokapseln in einer Wasser-in-Öl Emulsion gebildet werden und wobei die Mikrokapseln eine wässrige innere Phase, die als einzelne Tröpfchen in einer hydrophoben äußeren Phase suspendiert wird, umfassen; (c) Exprimieren des einen oder mehrerer genetischer Elemente innerhalb der Mikrokapseln, um entsprechende Genprodukte herzustellen, so dass die Genprodukte an die Kügelchen rückgekoppelt werden, wobei der Expressionsschritt Transkription oder Replikation umfasst, und das Genprodukt aus DNA, RNA oder Nukleinsäure ausgewählt wird; und (d) Sortieren gemäß einer Änderung in den optischen Eigenschaften des einen oder mehreren genetischen Elementen.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 18, wobei die Kügelchen Polystyrol, nicht magnetische, magnetische oder paramagnetische Kügelchen umfassen.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 18 oder 19, wobei das eine oder mehrere genetische Elemente eine Bibliothek von genetischen Elementen umfassen, die in die Mikrokapseln aufgeteilt wird.
Verfahren wie beansprucht in einem der Ansprüche 18–20, wobei die Kügelchen mit einer Substanz zum Binden der genetischen Elemente mit sehr hoher Affinität, z.B. Avidin oder Streptavidin, beschichtet werden.
Verfahren wie beansprucht in einem der Ansprüche 18–21, das Erhöhen der Konzentration der Nukleinsäure innerhalb der Mikrokapseln durch Amplifikation umfasst.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 22, wobei die Amplifikation Transkription durch Verwenden von RNA Polymerasen, die Polymerase Kettenreaktion, Qβ Replikase Amplifikation, die Ligase Kettenreaktion oder self-sustained Sequenz Replikationssystem und Strang Displacement Amplifikation umfasst.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 22 oder 23, wobei die Emulsion thermostabil ist und die Amplifikation das Durchlaufen thermaler Zyklen umfasst.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 21, wobei die Nukleinsäure zum Koppeln an die Kügelchen biotinyliert wird.
Verfahren wie beansprucht in Anspruch 25, wobei die Nukleinsäure durch PCR Amplifikation mit einem 5'-Biotinylierungsprimer biotinyliert wird.