ES2333844T3 - Procedimiento de clasificacion optica. - Google Patents

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Abstract

Procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define un elemento genético como que comprende un ácido nucleico que codifica un producto génico que presenta una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede resultar, directa o indirectamente, en la modificación de una propiedad óptica del elemento genético, que comprende las etapas siguientes: (a) compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas; (b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas; (c) modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas mediante (i) la unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o (ii) la conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que permanece como parte del elemento genético; o (iii) la utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento; (d) opcionalmente modificar además los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y (e) clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto/s génico/s que presentan la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.

Description

Procedimiento de clasificación óptica.
La presente invención se refiere a procedimientos para su utilización en la evolución in vitro de bancos moleculares. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos de clasificación de ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados por compartimentación.
La evolución requiere la generación de diversidad genética (diversidad en ácidos nucleicos) seguida de la clasificación de los ácidos nucleicos que produzcan características beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado de un organismo están relacionados físicamente (estando alojados los ácidos nucleicos dentro de las células que codifican) múltiples rondas de mutación y clasificación pueden dar como resultado la supervivencia progresiva de organismos con buen estado físico en aumento. Los sistemas para la rápida evolución de los ácidos nucleicos o las proteínas simulan in vitro ventajosamente este proceso a nivel molecular en el que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados y la actividad del producto génico es seleccionable.
Los avances recientes en biología molecular han permitido seleccionar conjuntamente algunas moléculas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden ser clonados posteriormente para análisis o utilización posterior, o ser sometidos a rondas adicionales de mutación y clasificación.
Es frecuente en estos procedimientos la creación de grandes bancos de ácidos nucleicos. Las moléculas con las características (actividad) deseadas pueden aislarse mediante regímenes de clasificación que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo la actividad de unión.
La tecnología de exposición en fagos ha tenido mucho éxito proporcionando un vehículo que permite la clasificación de una proteína expuesta proporcionando el enlace esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; para estudio véase Clackson y Wells, 1994). Las partículas de fago filamentoso actúan como concentrados genéticos para exposición con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que les codifican en el interior. El enlace fuerte entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado es un resultado del montaje del fago dentro de las bacterias. Ya que las bacterias individuales se infectan raramente al multiplicarse, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria individual serán portadores del mismo elemento genético y expondrán la misma proteína.
Sin embargo, la exposición en fagos se basa en la creación de bancos de ácido nucleico in vivo en las bacterias. Por lo tanto, la limitación práctica sobre el tamaño del banco permitido por la tecnología de exposición en fagos es del orden de 10^{7} a 10^{11}, aún aprovechándose de los vectores del fago \lambda con replicones de fago filamentoso escindibles. La técnica ha sido aplicada principalmente a la clasificación de moléculas con actividad de unión. Se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica utilizando también ésta técnica, sin embargo, la clasificación no fue directamente para la actividad catalítica deseada, sino para la unión a un análogo del estado de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o la reacción con un inhibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997). Más recientemente ha habido algunos ejemplos en enzimas seleccionadas utilizando la exposición en fagos mediante la formación del producto (Atwell & Wells, 1999; Demartis et al., 1999; Jestin et al., 1999; Pederson et al., 1998), pero en todos estos casos la clasificación no fue para recambio múltiple.
Se han seleccionado ligandos de péptido específicos para la unión a receptores por clasificación de afinidad utilizando grandes bancos de péptidos unidos al terminal C del represor Lacl de lac (Cull et al., 1992). Cuando se expresa en E. coli la proteína represora une físicamente el ligando al plásmido codificador uniendo a una secuencia del operador lac en el plásmido.
Se ha descrito también un sistema de exposición polisómico enteramente in vitro (Mattheakis et al., 1994; Hanes y Pluckthun, 1997) en el que los péptidos nacientes se acoplan físicamente a través del ribosoma al ARN que les codifica. Se ha descrito también un sistema alternativo, enteramente in vitro para enlazar el genotipo al fenotipo realizando fisiones ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997; Nemoto et al., 1997).
Sin embargo, el alcance de los sistemas anteriores está limitado a la clasificación de proteínas y además no permite la clasificación directa para otras actividades que la unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.
La clasificación y evolución del ARN in vitro (Ellington y Szostak, 1990), algunas veces se denomina SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990) permite la clasificación tanto para la unión como para la actividad química, pero solamente para ácidos nucleicos. Cuando la clasificación es para la unión, se incuba una mezcla de ácidos nucleicos con el sustrato inmovilizado. Los que no son aglutinantes se lavan, a continuación se liberan los aglutinantes, se amplían y se repite el proceso completo en etapas iterativas para enriquecer las secuencias que se unen mejor. Este procedimiento puede también adaptarse para permitir el aislamiento del ARN y ADN catalíticos (Green y Szostak, 1992; para estudios véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore, 1995).
Sin embargo, la clasificación para la actividad "catalítica" o de unión que utiliza SELEX solamente es posible porque la misma molécula lleva a cabo la doble función de transportar la información genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Cuando la clasificación es para "autocatálisis" la misma molécula también debe realizar la tercera función de ser un sustrato. Como el elemento genético debe desempeñar la función tanto de sustrato como de catalizador, la clasificación es solamente posible para episodios de un solo recambio. Debido a que el "catalizador" en este proceso se modifica, no es por definición un verdadero catalizador. Además, las proteínas no pueden seleccionarse utilizando el procedimiento SELEX. La gama de catalizadores, sustratos y reacciones que puede seleccionarse por consiguiente está muy limitada.
Los procedimientos anteriores que permiten rondas iterativas de mutación y clasificación son los mecanismos de simulación in vitro normalmente atribuidos al proceso de evolución: variación iterativa, clasificación progresiva para una actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los procedimientos desarrollados hasta ahora han proporcionado moléculas de diversidad comparable y de eficacia funcional a las que se encuentran en la naturaleza. Además, no existe ningún sistema de "evolución" artificial que pueda desarrollar tanto ácidos nucleicos como proteínas para efectuar las actividades bioquímicas y biológicas completas (por ejemplo, las actividades de unión, catalítica y reguladora) y que pueda combinar varios procedimientos que conducen a un producto o actividad deseada.
Existe por lo tanto una gran necesidad de un sistema in vitro que supere las limitaciones expuestas anteriormente.
En Tawfik y Griffiths (1998), y en la solicitud de patente internacional PCT/GB98/01889, los inventores describen un sistema para la evolución in vitro que supera muchas de las limitaciones descritas anteriormente utilizando la compartimentación en microcápsulas para unir el genotipo y el fenotipo a nivel molecular.
En Tawfik y Griffiths (1998), y en varias formas de realización de la solicitud de patente internacional PCT/GB98/
01889, la actividad deseada de un producto génico produce una modificación del elemento genético que le codifica (y está presente en la misma microcápsula). El elemento genético codificado puede seleccionarse a continuación en una etapa posterior.
En la presente memoria se describe una invención adicional en la que la modificación del elemento genético produce un cambio en las propiedades ópticas del propio elemento, y que presenta muchas ventajas sobre los procedimientos descritos anteriormente.
Breve descripción de la invención
Según la presente invención, se proporciona un procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define un elemento genético comprendiendo un ácido nucleico que comprende un producto génico que codifica un ácido nucleico con una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede producir, directa o indirectamente, la modificación de una propiedad óptica del elemento genético, que comprende las etapas siguientes:
(a)
compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas;
(b)
expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos dentro de las microcápsulas;
(c)
modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas por
(i)
unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o
(ii)
conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que continúa siendo parte del elemento genético; o
(iii)
utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento;
(d)
opcionalmente modificar más los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y
(e)
clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto(s) génico(s) con la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.
Las microcápsulas utilizadas en el procedimiento según la presente invención compartimentan elementos genéticos y productos génicos tales como los que permanecen físicamente unidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un elemento genético es una molécula o montaje molecular que comprende un ácido nucleico. Los elementos genéticos utilizados en el procedimiento de la presente invención pueden comprender cualquier ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o cualquier análogo, natural o artificial, de los mismos). El componente ácido nucleico del elemento genético está unido, por enlace covalente o no covalente, a perlas (incluyendo perlas no magnéticas, magnéticas y paramagnéticas). En el procedimiento de la invención, estas estructuras o moléculas pueden diseñarse para ayudar en la clasificación y/o al aislamiento del elemento genético según un producto génico con actividad deseada.
Expresión, tal como se utiliza en la presente memoria, se utiliza en su sentido más amplio, para hacer referencia a la conversión de un ácido nucleico contenido en el elemento genético en su producto génico. Por lo tanto, cuando el ácido nucleico es ADN, la expresión se refiere a la transcripción del ADN en ARN; cuando este ARN codifica una proteína, la expresión puede también referirse a la traducción del ARN en proteínas. Cuando el ácido nucleico es el ARN, la expresión puede referirse a la replicación de este ARN en más copias de ARN, la transcripción inversa del ARN en ADN y opcionalmente a la transcripción de este ADN en más moléculas de ARN, así como opcionalmente a la traducción de alguna de las especies de ARN producidas en la proteína. Preferentemente, por consiguiente, la expresión se lleva a cabo mediante uno o más procesos seleccionados de entre el grupo constituido por transcripción, transcripción inversa, replicación y traducción.
La expresión del elemento genético puede estar así dirigida al ADN, al ARN o a las proteínas, o a un ácido nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales (producto génico) dentro de la microcápsula utilizada en el procedimiento de la invención, de modo que el producto génico está contenido dentro de la misma microcápsula como elemento genético.
El elemento genético y el producto génico codificado por éste están unidos confinando cada elemento genético y el respectivo producto génico codificado por el elemento genético dentro de la misma microcápsula. De esta manera el producto génico en una microcápsula no puede producir un cambio en ninguna otra microcápsula. Además, pueden utilizarse unos medios de enlace adicionales para unir productos génicos a elementos genéticos que les codifican, como se indica a continuación.
El término "microcápsula" se utiliza en la presente memoria según el significado normalmente asignado a ésta en la técnica y descrito con mayor detalle a continuación en la presente memoria. En esencia, sin embargo, una microcápsula es un compartimento artificial cuyos bordes delimitantes restringen el intercambio de los componentes de los mecanismos moleculares descritos en la presente memoria que permiten la clasificación de los elementos genéticos según la función de los productos génicos que codifican.
Preferentemente, las microcápsulas utilizadas en el procedimiento de la presente invención podrán producirse en cantidades muy grandes, y de este modo compartimentar un banco de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos se refiere a cualquier cambio en la absorción o emisión de radiación electromagnética, incluyendo cambios de absorbancia, luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Todas estas propiedades se incluyen en el término "óptica". Los elementos genéticos pueden clasificarse, por ejemplo, por clasificación activada por luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una forma de realización preferida, se emplea citometría de flujo para clasificar elementos genéticos, por ejemplo, puede utilizarse la dispersión de la luz (Kerker, 1983) y polarización por fluorescencia (Rolland et al., 1985) para activar la clasificación por flujo. En una forma de realización muy preferida se clasifican elementos genéticos utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (Norman, 1980; Mackenzie y Pinder, 1986).
Los cambios en las propiedades ópticas pueden ser directos o indirectos. Por lo tanto, el cambio puede producir la alteración de una propiedad óptica en el propio elemento genético, o puede conducir indirectamente a dicho cambio. Por ejemplo, la modificación de un elemento genético puede alterar su capacidad para unir un ligando ópticamente activo, alterando indirectamente de este modo sus propiedades ópticas.
Alternativamente, pueden utilizarse técnicas de diagnóstico por la imagen para identificar películas finas de elementos genéticos que permitan el enriquecimiento en un elemento genético con propiedades deseables, por ejemplo por aislamiento físico de la zona en la que está situado un elemento genético con propiedades deseables, o la extirpación de elementos genéticos no deseados. Los elementos genéticos pueden detectarse por luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia.
Según una forma de realización preferida de la presente invención, la clasificación de los elementos genéticos puede realizarse en una de esencialmente dos técnicas.
(I)
En una primera forma de realización, los elementos genéticos se clasifican siguiendo la mezcla de las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un producto génico con la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica (y que reside en la misma microcápsula) a fin de hacerlo seleccionable como resultado de sus propiedades ópticas modificadas en una etapa posterior. Las reacciones se interrumpen y las microcápsulas se rompen a continuación de modo que todo el contenido de cada una de las microcápsulas se mezcla. La modificación del elemento genético en la microcápsula puede producir directamente la modificación de las propiedades ópticas del elemento genético. Alternativamente, la modificación puede permitir que los elementos genéticos se modifiquen más fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas. La clasificación de los elementos genéticos con propiedades ópticas modificadas permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el/los producto(s) génico(s) con la actividad deseada. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) el producto génico con actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica para permitir el aislamiento del elemento genético como resultado en un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético. Debe sobreentenderse, desde luego, que la modificación puede ser directa, porque está producida por la acción directa del producto génico sobre el elemento genético, o indirecta, porque una serie de reacciones, una o más de las que implican el producto génico con actividad deseada, conduce a la modificación del elemento genético.
(II)
En una segunda forma de realización, los elementos genéticos pueden clasificarse por un procedimiento multietapa, que implica por lo menos dos etapas, por ejemplo, para permitir la exposición de los elementos genéticos a condiciones que permitan que sucedan por lo menos dos reacciones independientes. Como apreciarán los expertos en la materia, la primera etapa de microencapsulación de la invención da como resultado de manera ventajosa condiciones que permiten a la expresión de los elementos genéticos ser la transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o similares. En estas condiciones, puede no ser posible seleccionar una actividad de producto génico específica, por ejemplo porque el producto génico puede no ser activo en estas condiciones o porque el sistema de expresión contiene una actividad que interfiere. La invención por consiguiente proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la presente invención, en el que la etapa (b) comprende expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas, uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que les codifica y aislando los complejos formados de este modo. Esto permite aislar los elementos genéticos y sus productos génicos asociados de las cápsulas antes de la clasificación según la actividad del producto génico que tenga lugar. En una forma de realización preferida, los complejos se someten a una etapa de compartimentación adicional antes de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico con la actividad deseada. Esta etapa de compartimentación adicional, que tiene lugar ventajosamente en microcápsulas, permite el funcionamiento de reacciones adicionales, en diferentes condiciones, en un medio donde los elementos genéticos y sus productos génicos respectivos están unidos físicamente. La clasificación opcional de los elementos genéticos puede realizarse según la forma de realización (I) anterior.
La "encapsulación secundaria" puede realizarse también con los elementos genéticos unidos a los productos génicos por otros medios, tales como por exposición en fagos, exposición en polisomas, fusión ARN-péptido o fusión del péptido represor lac.
El/los elementos/s genético/s seleccionado/s puede/n someterse también a rondas posteriores, opcionalmente más severas de clasificación en etapas iterativamente repetidas, volviendo a aplicar el procedimiento de la invención en su totalidad o solamente en etapas seleccionadas. Adaptando las condiciones apropiadamente, pueden aislarse productos génicos que codifican elementos genéticos con una actividad mejor optimizada después de cada ronda de clasificación.
Además, los elementos genéticos aislados después de una primera ronda de clasificación pueden someterse a mutagénesis antes de repetir la clasificación o repetición iterativa de las etapas del procedimiento de la invención tal como se indicó anteriormente. Después de cada ronda de mutagénesis, algunos elementos genéticos habrán sido modificados de tal manera que aumenta la actividad de los productos génicos.
Además, los elementos genéticos seleccionados pueden clonarse en un vector de expresión para permitir más caracterización de los elementos genéticos en sus productos.
Este sistema de clasificación puede configurarse para seleccionar moléculas de ARN, ADN o de proteína con actividad catalítica, reguladora o de unión.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. La dihidrofolato-reductasa puede expresarse en genes traducida in vitro en solución y genes acoplados a perlas paramagnéticas con idéntica eficacia. La actividad de DHFR resultante de la traducción in vitro de genes folA en solución o los genes folA acoplados a microperlas paramagnéticas se determina controlando la oxidación de NADPH a NADP espectrofotométricamente a 340 nm y la actividad se calcula por velocidades iniciales en condiciones de So>>K_{M} (vmax). (\blacklozenge), traducida a partir de genes en solución; (\sqbullet), traducida a partir de genes acoplados a microperlas.2.
Figura 2. Microscopía de epifluorescencia de emulsiones de agua en aceite que demuestra que GFP puede traducirse in vitro desde genes acoplados a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las emulsiones y unida al producto génico traducido volverse a unir a las microperlas haciéndolas fluorescentes.
Figura 3. Análisis citométrico de flujo de la expresión de GFP en microcápsulas e unión in situ al elemento genético (microperlas). A: Características de dispersión de la luz de las perlas antes de la reacción. El 75% de las perlas actúan como perlas individuales. B: Características de dispersión de la luz de las perlas después de la traducción in vitro. Aproximadamente el 50% de las perlas caen a la entrada en las perlas individuales. C: Fluorescencia de microperlas (prohibida para perlas individuales solamente) recubiertas con el gen T7-GFP y el anticuerpo antiGFP policlonal es significativamente mayor que la señal procedente de las perlas en las que se omitieron el gen GFP o el anticuerpo antiGFP.
Figura 4. Síntesis de biotina-GS-DNP por la reacción de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma) con glutatión biotinilado reducido (biotina-GSH). catalizada por glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) humana.
Figura 5. Detección de perlas paramagnéticas recubiertas con el producto de una reacción catalizada por enzimas por citometría de flujo. Micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina Sera-Mag^{TM} incubadas con biotina-GS-DNP preparadas por la reacción catalizada por GST M2-2 de biotina-GSH y CDNB. La biotina-GS-DNP capturada se detectó por incubación de las macropartículas con un anticuerpo antidinitrofenol de ratón seguido de IgG antiratón de cabra con el fragmento F(ab')_{2} conjugado con FITC, fragmento F(ab')_{2}. Después del lavado, se analizaron 2x10^{5} micropartículas por citometría de flujo. Todos los reactivos, los no reactivos omitidos procedentes de la síntesis enzimática con biotina-GS-DNP; menos GST, enzima GST M2-2 se omitió en la síntesis; menos biotina-GSH, la biotina-GSH fue omitida de la síntesis; menos CDNB, se omitió CDNB de la síntesis.
Figura 6. Síntesis de MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH (biotina-\beta-Ala-GSH bloqueada). Se añadió cloruro de acetilo (5 ml) a metanol anhidro (80 ml). La solución agitada se dejó enfriar y se añadió d-biotina (4 g). Después de agitar durante la noche los disolventes se evaporaron al vacío para proporcionar un sólido blanco. El sólido se disgregó con éter, se filtró y se secó al vacío (en presencia de pentóxido de fósforo) y se almacenó a -20ºC.
Figura 7. Reacción de biotina-\beta-Ala-GSH bloqueada con 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) y desbloqueo fotoquímico del grupo biotina.
Figura 8. Reacción de biotina-\beta-Ala-GSH bloqueada con 4-cloro-3-dinitrobenzoato (CNB) y desbloqueo fotoquímico del grupo biotina.
Figura 9. GST M2-2 humana cataliza la reacción de biotina-\beta-Ala-GSH bloqueada con CDNB y CNB en solución y los productos de la reacción pueden desbloquearse por irradiación de UV, capturarse en las perlas y detectarse utilizando anticuerpos antiproducto marcados por fluorescencia y citometría de flujo.
Panel A: Características de la dispersión de la luz de perlas y entrada de perlas individuales (R1). Panel B: Fluorescencia procedente de microperlas (empezando por R1) de las reacciones con CNB. Panel C: fluorescencia procedente de microperlas (empezando por R1) de las reacciones con CNB. Señales procedentes de microperlas de las reacciones con y sin GST M2-2 se anotan +enz y -enz respectivamente. Las señales de microperlas procedentes de las reacciones que se irradiaron con UV y las que no, se anotan +UV y -UV respectivamente.
Figura 10. La citometría de flujo puede utilizarse para distinguir perlas de compartimentos acuosos de una emulsión que contiene GST M2-2 de perlas procedentes de compartimentos sin GST M2-2 utilizando \beta-Ala-GSH biotinilada bloqueada y CNB como sustratos.
Panel A: Características de la dispersión de la luz de una mezcla de microesferas no fluorescentes marcadas con neutravidina de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777), o perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) y entradas indicadas para perlas Bangs individuales (R1) y perlas de sondas moleculares individuales (R2). Panel B: Fluorescencia de microperlas tomadas de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de Bangs (sin GST) y 2% de perlas de molecular Probes (con GST). Panel C: Fluorescencia de microperlas recibida de una mezcla de dos emulsiones en una proporción de 98% de emulsión que contiene perlas Bangs (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas de molecular Probes (con GST). Panel D: Fluorescencia de microperlas recibida de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de molecular Probes (sin GST) y 2% de perlas Bangs (sin GST). Panel E: Fluorescencia de microperlas recibida de una mezcla dos emulsiones en una proporción de 98% de emulsión que contiene perlas de molecular Probes (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas Bangs (sin GST). Las fluorescencias de perlas incontroladas (sin control), de perlas controladas por R1 (R1) y perlas controladas por R2 (R2) se superponen.
Figura 11. GST M2-2 humana transcrita y traducida in vitro en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de las microesferas co-compartimentadas.
Panel A: Características de dispersión de la luz de las perlas y control de las perlas individuales (R1). Panel B: Fluorescencia de microperlas (controlada por R1) procedente de reacciones no emulsionadas. Panel C: Fluorescencia de microperlas (controlada por R1) procedente de reacciones emulsionadas. Señales procedentes de microperlas de reacciones con y sin GSTM2-2.LMB2-3 ADN se anotan +ADN y -ADN respectivamente. Las señales procedentes de microperlas de reacciones con y sin GST M2-2 recombinantes se anotan +GST y -GST respectivamente.
Figura 12. Síntesis del sustrato EtNP-BzGlu-biotina bloqueada biotinilado y bloqueado (17).
Figura 13. Hidrólisis del sustrato biotina bloqueada con EtNP-Bz-Glu de PET (17) para dar el producto Et-Bz-Glu-biotina bloqueada, y sin bloquear, tanto del sustrato como del producto para proporcionar el sustrato biotinilado correspondiente (EtNP-Bz-Glu-biotina) y producto (EtNP-Bz-Glu-biotina).
Figura 14. Preparación de conjugados de proteína de un sustrato de PTE y el producto para la inmunización y ELISA.
Figura 15. PTE cataliza la reacción de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada en presencia de perlas recubiertas de estreptavidina y los productos de reacción desbloqueados por irradiación UV, se capturan en las perlas y se detectan anticuerpos antiproducto marcados por fluorescencia y citometría de flujo.
Panel A: Características de dispersión de la luz de las perlas y control seleccionado para perlas individuales (R2). Panel B: Fluorescencia de las perlas (controlada por R2) de las reacciones con 10 \muM de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada en presencia de fragmentos de ADN OPD.LMB3-2biotina (OPD) traducidos o fragmentos de ADN N.HaeIII.LMB3-2biotina (M.HaeIII). Panel C: Como B pero con 20 \muM de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada. Panel D: Como B pero con 50 \muM de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada.
Figura 16. Reacción de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada en presencia de perlas a las que se acoplaron elementos genéticos que codifican la fosfotriesterasa activada con el péptido Flag (N-Flag-OPD.LMB3-2biotina) u otra enzima (N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina) una al lado de la otra con un anticuerpo que une el péptido Flag. Las perlas se hicieron reaccionar y posteriormente se analizaron por citometría de flujo tal como se describe en el texto.
Panel A: Características de la dispersión de la luz de las perlas y control de las perlas individuales (R1). Panel B: Fluorescencia de las microperlas (controlada por R1) a las que se acoplaron fragmentos de N-Flag-OPD.LMB3-2biotina (OPD) o fragmentos de M.HaeIII.LMB3-2biotina (M.HaeIII) de las reacciones con 12,5 \muM de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada. Panel C: Como B pero con 25 \muM de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada.
Figura 17. BirA de E. coli transcrito y traducido cataliza in vitro una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de las microesferas marcadas con sustrato en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua y aceite y en la solución en grandes cantidades.
Figura 18. Análisis citométrico de flujo de las muestras preparadas para el experimento de clasificación.
Figura 19. Clasificación citométrica de flujo activada por fluorescencia de los elementos genéticos.
Panel A: Muestras nº 1 a nº 4 antes de la clasificación y después de la clasificación. Panel B: Genes recuperados de perlas individuales clasificadas procedentes de la muestra nº 3 clasificadas en una placa de 96 pocillos. Panel C: Genes recuperados de las perlas individuales clasificadas procedentes de la muestra nº 4 clasificada en una placa de 96 pocillos. Los marcadores de ADN (M) son el digesto de \PhiX174-HaeIII.
(A) Descripción general
Las microcápsulas utilizadas en el procedimiento de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas que permitan la explotación de la invención.
En primer lugar, para asegurar que los elementos genéticos y los productos génicos pueden no difundirse entre las microcápsulas, los contenidos de cada microcápsula se aíslan preferentemente de los contenidos de las microcápsulas circundantes, de modo que no existe o hay poco intercambio de los elementos genéticos y de los productos génicos entre las microcápsulas en toda la escala de tiempo del experimento.
En segundo lugar, el procedimiento de la presente invención requiere que exista solamente un número limitado de elementos genéticos por microcápsula. Esto asegura que el producto génico de un elemento genético individual se aísle de otros elementos genéticos. De este modo, el acoplamiento entre el elemento genético y el producto génico será muy específico. El factor de enriquecimiento es mayor por término medio con un elemento o pocos elementos genéticos por microcápsula, siendo el enlace entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado tan ajustado como sea posible, ya que el producto génico de un elemento genético individual se aislará de los productos de los demás elementos genéticos. Sin embargo, aún si no se utiliza la situación teóricamente óptima, por término medio, de un solo elemento genético o menos por microcápsula, una relación de 5, 10, 50, 100 ó 1.000 o más elementos genéticos por microcápsula puede demostrar ser útil en la clasificación de un banco grande. Posteriores rondas de clasificación, incluyendo la encapsulación renovada con diferente distribución de elementos genéticos, permitirán la clasificación más severa de los elementos genéticos. Preferentemente, existe un solo elemento genético, o menos, por microcápsula.
En tercer lugar, la formación y la composición de las microcápsulas no suprime favorablemente la función del sistema de expresión de los elementos genéticos y la actividad de los productos génicos.
El/los sistema/s apropiados/s puede/n variar dependiendo de la naturaleza exacta de los requisitos en cada aplicación de la invención, como es evidente para el experto en la materia.
Una amplia variedad de procedimientos de microencapsulación están disponibles (véase Benita, 1996) y pueden utilizarse para crear las microcápsulas utilizadas según la presente invención. De hecho, más de 200 procedimientos de microencapsulación se han identificado en la bibliografía (Finch, 1993).
Estos incluyen vesículas acuosas envueltas en la membrana tales como las vesículas de lípidos (liposomas) (New, 1990) y vesículas de tensioactivo no iónico (van Hal et al., 1996). Éstas son cápsulas membranosas cerradas de bicapas individuales o múltiples de moléculas unidas por enlace no covalente, con cada bicapa separada de la contigua por un compartimento acuoso. En el caso de los liposomas, la membrana está compuesta por moléculas de lípido; normalmente hay fosfolípidos pero pueden incorporarse también en las membranas esteroles tales como el colesterol (New, 1990). Una variedad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas, incluyendo la polimerización del ARN y ADN, puede realizarse con liposomas (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi, 1996).
Con un sistema de vesícula envuelta en la membrana gran parte de la fase acuosa está fuera de las vesículas y por lo tanto no está compartimentada. Esta fase acuosa continua se clasifica o los sistemas biológicos en ella se inhiben o se destruyen (por ejemplo, por digestión de ácidos nucleicos con ADNasa o ARNasa) para que las reacciones se limiten a las microcápsulas (Luisi et al., 1987).
Las reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas se han demostrado en las microcápsulas generadas por una variedad de otros procedimientos. Muchas enzimas son activas en soluciones micelares inversas (Bru & Walde, 1991; Bru & Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987, Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988) tal como el sistema AOT-isooctano-agua (Menger y Yamada, 1979).
Las microcápsulas pueden generarse también por polimerización interfacial y acomplejamiento interfacial (Whateley, 1996). Las microcápsulas de esta especie pueden tener membranas rígidas y no permeables, o membranas semipermeables. Las microcápsulas semipermeables bordeadas por membranas de nitrato de celulosa, membranas de poliamida y membranas de lípido-poliamida todas pueden soportar reacciones bioquímicas, incluyendo los sistemas multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Se ha demostrado también que las microcápsulas de alginato/polilisina (Lim y Sun, 1980), que pueden formarse en condiciones muy suaves, son muy compatibles, proporcionando, por ejemplo, un procedimiento muy eficaz de encapsulación de células y tejidos vivos (Chang, 1992; Sun et al., 1992).
Pueden utilizarse también sistemas de microencapsulación no membranosos basados en el reparto de fases de un medio acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.
Preferentemente, las microcápsulas utilizadas en el procedimiento de la presente invención están formadas por emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersada en la otra en forma de gotitas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Pueden producirse emulsiones de cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. Preferentemente la emulsión utilizada en el procedimiento de la presente invención tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotitas finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua) de un líquido hidrófobo, inmiscible (un aceite) como la matriz en la que estas gotitas están en suspensión (fase no dispersa, continua o externa). Dichas emulsiones se denominan "agua en aceite" (W/O). Éstas tiene la ventaja de que la fase acuosa completa que contiene los componentes bioquímicos está compartimentada en gotitas discretas (fase interna). La fase externa, que es un aceite hidrófobo, generalmente no contiene ninguno de los componentes y por consiguiente es inerte.
La emulsión puede estabilizarse mediante la adición de uno o más agentes tensioactivos. Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes y actúan en la interfase agua/aceite para evitar (o por lo menos retardar) la separación de las fases. Muchos aceites y muchos emulsionantes pueden utilizarse para la generación de emulsiones aceite en agua; una compilación reciente listada de más de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se utilizan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites adecuados incluyen aceites minerales blancos ligeros y tensioactivos no iónicos (Schick, 1996) tal como el monooleato de sorbitán (Span^{TM}80; ICI) y el monooleato de polioxietilensorbitán (Tween^{TM}80; ICI).
La utilización de tensioactivos aniónicos puede ser también útil. Los tensioactivos adecuados incluyen el colato sódico y el taurocolato sódico. Es particularmente preferido el desoxicolato sódico, preferiblemente a una concentración de 0,5% p/v, o inferior. La inclusión de dichos tensioactivos puede aumentar en muchos casos la expresión de los elementos genéticos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada suprime completamente la traducción. Durante la emulsión, sin embargo, el tensioactivo se transfiere desde la fase acuosa a la interfase y se restablece la actividad. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas que han de emulsionarse garantiza que las reacciones procedían solamente después de la compartimentación.
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La creación de una emulsión generalmente requiere la aplicación de energía mecánica para forzar a las fases juntas. Hay varias maneras de hacer esto que utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como barras agitadoras magnéticas, agitadores con impulsores y de turbina, dispositivos con paletas y batidoras), homogeneizadores (incluyendo homogeneizadores con rotor-estator, homogeneizadores con válvula de alta presión y homogeneizadores a chorro), molinos coloidales, ultrasonidos y dispositivos de "emulsionamiento con membrana" (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Las microcápsulas acuosas formadas en las emulsiones de agua en aceite son generalmente estables con poco si es que algún intercambio de elementos genéticos o de productos génicos entre las microcápsulas. Además, los inventores han demostrado que varias reacciones bioquímicas procedieron en microcápsulas de emulsión. Además, complicados procesos bioquímicos, principalmente transcripción y traducción génica son también activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la tecnología para crear emulsiones con volúmenes de todas las maneras hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
El tamaño de microcápsulas preferido variará dependiendo de los requisitos precisos de cualquier procedimiento de clasificación individual que ha de realizarse según la presente invención. En todos los casos, existirá un equilibrio óptimo entre el tamaño del banco de genes, el enriquecimiento requerido y la concentración requerida de componentes en las microcápsulas individuales para conseguir la extrusión eficaz y la reactividad de los productos génicos.
Los procesos de expresión se producen dentro de cada microcápsula para su utilización en el procedimiento de la presente invención. Tanto en la transcripción in vitro como en la transcripción-traducción acoplada llega a ser menos eficaz a concentraciones de ADN sub-nanomolares. Debido al requisito para sólo un número limitado de moléculas de ADN que ha de estar presente en cada microcápsula, éste por lo tanto fija un límite superior práctico en el posible tamaño de la microcápsula. Preferentemente, el volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondiente a una microcápsula esférica de diámetro inferior a 10 \mum, más preferentemente inferior a 6,5 x 10^{-17} m^{3} (5 \mum de diámetro), más preferentemente de aproximadamente 4,2 x 10^{-18} m^{3} (2 \mum de diámetro), y teóricamente de aproximadamente 9 x 10^{-18} m^{3} (2,6 \mum de diámetro).
La concentración eficaz de ADN o ARN en las microcápsulas puede aumentarse artificialmente por varios procedimientos que serán bien conocidos por los expertos en la materia. Éstos incluyen, por ejemplo, la adición de volumen excluyendo productos químicos tales como los polietilenglicoles (PEG) y una variedad de técnicas de ampliación génica, incluyendo la transcripción que utiliza ARN-polimerasas incluyendo las de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), eucariotas por ejemplo (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) y bacteriófagos tales como T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988); la ampliación con Qb-replicasa (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (RCL) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); y el sistema de replicación de secuencia automantenido (Fahy et al., 1991) y la ampliación con desplazamiento de cadena (Walker et al., 1992). Las técnicas de ampliación génica que requieren ciclación térmica tales como PCR y LCR pueden utilizarse si las emulsiones y la transcripción in vitro o los sistemas de transcripción-traducción acoplados son termoestables (por ejemplo, los sistemas de transcripción-traducción acoplados pueden realizarse en un organismo termoestable tal como Thermus aquaticus).
El aumento de la concentración local eficaz de ácido nucleico permite utilizar microcápsulas mayores de manera más eficaz. Éste permite un límite superior práctico preferido al volumen de la microcápsula de aproximadamente 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondiente a una esfera de 10 \mum de diámetro).
El tamaño de las microcápsulas preferentemente es suficientemente grande para alojar todos los componentes requeridos de las reacciones bioquímicas que se necesita que se produzcan dentro de la microcápsula. Por ejemplo, tanto las reacciones de transcripción como las reacciones de transcripción-traducción acopladas, in vitro, requieren una concentración total de trifosfato de nucleósido de aproximadamente 2 mM.
Por ejemplo, para transcribir un gen a una sola molécula de ARN corta de 500 bases de longitud, éste requeriría por lo menos 500 moléculas de trifosfato de nucleósido por microcápsula (8,33x10^{-22} moles). Para constituir una solución 2 mM, este número de moléculas está contenido dentro de una microcápsula de 4,17x10^{-19} litros de volumen (4,17x10^{-22} m^{3}) que si es esférico tendría un diámetro de 93 nm.
Además, particularmente en el caso de reacciones que implican traducción, debe señalarse que los ribosomas necesarios para que ocurra la traducción son ellos mismos aproximadamente de 20 nm de diámetro. Por consiguiente, el límite inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum (100 nm).
Por consiguiente, el volumen de microcápsulas preferentemente es del orden de entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y 5,2 x 10^{-16} m^{3} que corresponde a una esfera de diámetro entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de entre aproximadamente 5,2 x 10^{-19} m^{3} y6,5 x 10^{-17} m^{3} (1 \mum y 5 \mum). Los diámetros esféricos de aproximadamente 2,6 \mum son los más ventajosos.
No es casualidad que las dimensiones preferidas de los compartimentos (gotitas de 2,6 \mum de diámetro medio) recuerdan mucho las de las bacterias, por ejemplo, Escherichia son varillas de 1,1-1,5 x 2,0-6,0 \mum y las de Azotobacter son células ovoides de 1,5-2,0 \mum de diámetro. En su forma más sencilla, la evolución darwiniana se basa en un mecanismo de "un genotipo un fenotipo". La concentración de un sólo gel compartimentado o genoma disminuye desde 0,4 nM en un compartimento de 2 \mum de diámetro, hasta 25 pM en un compartimento de 5 \mum, de diámetro. El sistema procariótico de transcripción-traducción ha evolucionado para operar en compartimentos de \sim1-2 \mum de diámetro, donde los genes individuales están en concentraciones aproximadamente nanomolares. Un solo gen, en un compartimento de 2,6 \mum de diámetro está a una concentración de 0,2 nM. Ésta concentración génica es lo suficiente elevada para una traducción eficaz. La compartimentación en tal volumen garantiza también que incluso si solamente se forma una sola molécula del producto génico está presente a aproximadamente 0,2 nM, lo que es importante si el producto génico ha de tener una actividad de modificación del propio elemento genético. El volumen de la microcápsula se selecciona de este modo teniendo en mente no solamente los requisitos para la transcripción y traducción del elemento genético, sino también la actividad de modificación requerida del producto génico en el procedimiento de la invención.
El tamaño de las microcápsulas de emulsión puede variarse simplemente adaptando las condiciones de la emulsión utilizada para formar la emulsión según los requisitos del sistema de clasificación. Cuanto mayor es el tamaño de la microcápsula, mayor es el volumen que se requerirá para encapsular un banco de elementos genéticos dados, ya que el factor limitante por último será el tamaño de la microcápsula y de este modo el número de microcápsulas posibles por unidad de volumen.
El tamaño de las microcápsulas se selecciona no solamente teniendo en cuenta los requisitos del sistema de transcripción/traducción, sino también los del sistema de clasificación empleado para el elemento genético. De este modo, los componentes del sistema de clasificación, tal como un sistema de modificación químico, pueden requerir volúmenes de reacción y/o concentraciones de reactivo que no son óptimas para la transcripción/traducción. Como se indica en la presente memoria, dichos requisitos pueden acomodarse mediante una etapa de reencapsulación secundaria; además, puede acomodarse seleccionando el tamaño de la microcápsula con objeto de maximizar la transcripción/traducción y la clasificación en conjunto. Se prefiere la determinación empírica del volumen de microcápsula óptimo y de la concentración del reactivo, por ejemplo como se indica en la presente memoria.
Un "elemento genético" en el contexto de la presente invención es como se describió anteriormente. Preferentemente, un elemento genético es una molécula o montaje seleccionado de entre el grupo constituido por una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o totalmente artificial constituida por bases exclusivamente sintéticas o una mezcla de bases sintéticas y naturales, cualquiera de las anteriores unidas a una perla, por ejemplo perlas de poliestireno y perlas magnéticas o paramagnéticas.
La fracción de ácido nucleico del elemento genético puede comprender secuencias reguladoras adecuadas, tales como las requeridas para la expresión eficaz del producto génico, por ejemplo secuencias activadoras, potenciadoras, de iniciación de la traducción, secuencias de poliadenilación, secuencias de corte y empalme y similares.
Como se deducirá a partir de lo expuesto a continuación, en muchos casos el elemento genético puede estar compuesto por un ligando o un sustrato que se une directa o indirectamente al producto génico o reacciona con éste para alterar las propiedades ópticas del elemento genético. Esto permite la clasificación del elemento genético basándose en la actividad del producto génico. El ligando o sustrato puede estar conectado al ácido nucleico mediante una variedad de medios que resultarán evidentes para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996).
Una manera en la que la molécula de ácido nucleico puede estar unida a la microperla es por biotinilación. Esto puede realizarse por ampliación por PCR con un cebador de 5'-biotinilación de modo que la biotina y el ácido nucleico están unidos por enlace covalente.
El ligado o sustrato puede estar acoplado al elemento genético mediante una variedad de medios que son evidentes para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996). Un ácido nucleico biotinilado puede estar acoplado a una microperla de poliestireno o paramagnética (0,02 a aproximadamente 5,0 \mum de diámetro) que está recubierta con avidina o estreptavidina, que por consiguiente se unirá al ácido nucleico con muy alta afinidad. Esta perla puede modificarse con sustrato o ligando por cualquier procedimiento adecuado tal como añadiendo sustrato biotinilado o por enlace covalente.
Aunque no forma parte de la invención, un ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a la avidina o a la estreptavidina acomplejado con una molécula de proteína mayor tal como la tiroglobulina (669 Kd) o ferritina (440 Kd). Este complejo puede modificarse con sustrato o ligando, por ejemplo por enlace covalente al grupo \varepsilon-amino de lisinas o mediante una interacción no covalente tal como biotina-avidina.
El sustrato puede estar presente en una forma sin enlace al elemento genético pero que contiene una "etiqueta" inactiva que requiere una etapa adicional para activarlo tal como la fotoactivación (por ejemplo de un análogo de biotina "bloqueado", (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang, 1996)). El catalizador que debe seleccionarse a continuación convierte el sustrato en producto. La "etiqueta" se activa a continuación y el sustrato "etiquetado" y/o el producto unido por una molécula que se une a la etiqueta (por ejemplo avidina o estreptavidina) acomplejada con el ácido nucleico. La relación de sustrato a producto acoplado al ácido nucleico mediante la "etiqueta" reflejará por consiguiente la relación del sustrato y producto en solución.
Una alternativa consiste en acoplar el elemento genético a un anticuerpo específico para el producto (u otra molécula específica para el producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada microcápsula sin enlace con el elemento genético, pero tiene una "etiqueta" molecular (por ejemplo biotina DIG, o DNP o un grupo fluorescente). Cuando el catalizador que debe seleccionarse convierte el sustrato en producto, el producto conserva la "etiqueta" y es capturado a continuación en la microcápsula por el anticuerpo específico para el producto. De esta manera el elemento genético sólo llega a estar asociado con la "etiqueta" cuando codifica o produce una enzima capaz de convertir el sustrato en producto.
Los términos "aislamiento", "clasificación" y "selección", así como variaciones de los mismos, se utilizan en la presente memoria. Aislamiento, en el contexto de la presente invención, se refiere al proceso de separación de una entidad de una población heterogénea, por ejemplo una mezcla, de modo que está exenta de por lo menos una sustancia a la que se asoció antes del proceso de aislamiento. En una forma de realización preferida, aislamiento se refiere a la purificación de una entidad esencialmente para homogeneidad. Clasificación de una entidad se refiere al proceso de aislar preferentemente entidades deseadas sobre entidades no deseadas. En cuanto a esto se refiere al aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislamiento" y "clasificación" son equivalentes. El procedimiento de la presente invención permite la clasificación de elementos genéticos deseados a partir de mezclas (bancos o repertorios) de elementos genéticos que contienen el elemento genético deseado. Clasificación se utiliza para referirse al proceso (incluyendo el proceso de clasificación) de aislar una entidad según una propiedad particular del
mismo.
En una aplicación muy preferida, el procedimiento de la presente invención es útil para clasificar banco de elementos genéticos. La invención por consiguiente proporciona un procedimiento según aspectos anteriores de la invención, en la que los elementos genéticos se aíslan en un banco de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos. En la presente invención, los términos "banco", "repertorio" y "mezcla" se utilizan según su significado ordinario en la materia, de modo que un banco de elementos genéticos codifica un repertorio de productos génicos. En general, los bancos se construyen a partir de mezclas de elementos genéticos y tienen propiedades que facilitan la clasificación.
La selección inicial de un elemento genético a partir de un banco de elementos genéticos que utilizando la presente invención en la mayoría de los casos requerirá la identificación de un gran número de elementos genéticos variables. Los bancos de elementos genéticos pueden crearse en una variedad de diferentes maneras, incluyendo las siguien-
tes.
Pueden clonarse mezclas de elementos genéticos naturales a partir de ADN genómico o ADNc (Sambrook et al., 1989); por ejemplo, bancos de anticuerpos de fago, preparados por repertorios de ampliación por PCR de genes de anticuerpo de donantes inmunizados o no inmunizados han demostrado fuentes muy eficaces de fragmentos de anticuerpo funcional (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Pueden prepararse también bancos de genes codificando la totalidad (véase por ejemplo Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de los genes (véase por ejemplo Lowman et al., 1991) o mezclas de genes (véase por ejemplo Nissim et al., 1994) mediante un oligonucleótido sintético al azar o aditivado. Pueden prepararse también bancos introduciendo "al azar" mutaciones en un elemento genético o mezcla de elementos genéticos mediante una variedad de técnicas in vivo, que incluyen: utilización de cepas mutantes de bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); utilizando el sistema de B-linfocitos con hipermutación de anticuerpos (Yelamos et al., 1995). Mutágenos químicos, e ionización o irradiación UV (véase Friedberg et al., 1995), o incorporación de análogos de base mutagénica (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996) pueden introducir también mutaciones aleatorias tanto in vivo como in vitro. Pueden introducirse también mutaciones al azar en genes in vitro durante la polimerización utilizando, por ejemplo, polimerasas propensas a error (Leung et al., 1989).
Puede introducirse diversificación adicional utilizando recombinación homóloga ya sea in vivo (véase Kowalczykowski et al., 1994) o in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).
Según otro aspecto de la presente invención, por consiguiente, se proporciona un procedimiento de evolución in vitro que comprende las etapas siguientes:
(a)
seleccionar uno o más elementos genéticos de un banco de elementos genéticos según el procedimiento de la presente invención;
(b)
mutar el/los elemento/s genético/s seleccionado/s con objeto de generar un banco adicional de elementos genéticos que codifica un repertorio para productos génicos; y
(c)
repetir de manera iterativa las etapas (a) y (b) con objeto de obtener un producto génico con actividad potenciada.
Pueden introducirse mutaciones en el/los elemento/s genético/s como se indicó anteriormente.
Los elementos genéticos utilizados en el procedimiento según la invención codifican ventajosamente enzimas, preferentemente de interés farmacológico o industrial activadores o inhibidores, especialmente de sistemas biológicos, tales como mecanismos de transducción de señal celular, anticuerpos y fragmentos de los mismos, y otros agentes aglutinantes (por ejemplo factores de transcripción) adecuados para aplicaciones en diagnóstico y terapéuticas. En un aspecto preferido, por consiguiente, la invención permite la identificación y el aislamiento de productos clínica o industrialmente útiles. En un aspecto adicional, se describe un producto aislado por el procedimiento de la
invención.
Es deseable la selección de condiciones de encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y del tamaño del banco que ha de cribarse, puede ser útil organizar el procedimiento de encapsulación de modo que 1 o menos de 1 elemento genético es encapsulado por la microcápsula. Esto proporcionará el mayor poder de resolución. Cuando el banco es mayor y/o más complejo, sin embargo, esto puede ser impracticable; puede ser preferible encapsular varios elementos genéticos juntos y basarse en la aplicación repetida del procedimiento de la invención para conseguir la clasificación de la actividad deseada. Puede utilizarse una combinación de procedimientos de encapsulación para obtener el enriquecimiento deseado.
Los estudios teóricos indican que cuanto mayor es el número de variantes de elementos genéticos creados mayor probablemente es una molécula que se creará con las propiedades deseadas (véase Perelson y Oster, 1979 para una descripción de cómo se aplica esto a los repertorios de anticuerpos). Recientemente se ha confirmado también en la práctica que los mayores repertorios de fago-anticuerpo de hecho dan lugar a más anticuerpos con mejores afinidades de unión que los repertorios más pequeños (Griffiths et al., 1994). Para garantizar que se generan variantes raras y de este modo son capaces de seleccionarse, es deseable un tamaño de banco mayor. Por lo tanto, es beneficiosa la utilización de microcápsulas óptimamente pequeñas.
El mayor repertorio creado hasta la fecha utilizando procedimientos que requieren una etapa in vivo (sistemas de exposición en fagos y LacI) ha sido un banco de fago-péptido de 1,6 x 10^{11} clones que requería la fermentación de 15 litros de bacterias (Fisch et al., 1996). Experimentos SELEX se llevan a cabo con frecuencia sobre un número muy grande de variantes (hasta 10^{15}).
Utilizando la presente invención, a un diámetro de microcápsula preferido de 2,6 \mum, puede seleccionarse un tamaño de repertorio de por lo menos 10^{11} utilizando 1 ml de fase acuosa en 20 ml de emulsión.
Además de los elementos genéticos descritos anteriormente, las microcápsulas utilizadas en el procedimiento según la invención comprenderán componentes adicionales requeridos para que tenga lugar el proceso de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán por ejemplo los necesarios para la transcripción y/o traducción del elemento genético. Estos se seleccionan para los requisitos de un sistema específico a partir de lo siguiente; un tampón adecuado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los ingredientes necesarios, enzimas y cofactores, ARN-polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), los ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos y los sustratos de la reacción de interés con objeto de permitir la clasificación del producto génico modificado.
Un tampón adecuado será aquel en el que todos los componentes deseados del sistema biológico son activos y por consiguiente dependerán de los requisitos de cada sistema de reacción específico. Los tampones adecuados para las reacciones biológicas y/o químicas son conocidos en la técnica y las recetas se proporcionan en varios textos de laboratorio, tales como Sambrook et al., 1989.
El sistema de traducción in vitro comprenderá normalmente un extracto celular, por lo general de bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976), o germen de trigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas adecuados están disponibles en el mercado (por ejemplo en Promega) incluyendo algunos que permiten la transcripción/traducción acoplada (todos los sistemas bacterianos y los sistemas de reticulocitos y de extracto de germen de trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de aminoácidos utilizados puede incluir aminoácidos sintéticos si se desea, para aumentar el posible número o variedad de proteínas producidas en el banco. Esto puede realizarse cargando los ARNt con aminoácidos artificiales y utilizando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).
Después de cada ronda de clasificación el enriquecimiento de la mezcla de elementos genéticos para los que codifican las moléculas de interés puede ensayarse mediante transcripción/replicación in vitro no compartimentada o reacciones acopladas de transcripción/traducción. La mezcla seleccionada se clona en un vector plásmido adecuado y se produce ARN o proteína recombinante a partir de los clones individuales para purificación adicional y ensayo.
En un aspecto preferido, el medio interno de una microcápsula puede alterarse mediante la adición de reactivos a la fase aceitosa de la emulsión. Los reactivos se difunden por la fase aceitosa hasta el medio acuoso de microcápsulas. Preferentemente, los reactivos son por lo menos parcialmente solubles en agua, de modo que una proporción de los mismos se distribuye desde la fase aceitosa al medio acuoso de microcápsulas. Ventajosamente, los reactivos son sustancialmente insolubles en la fase aceitosa. Los reactivos se mezclan preferentemente en la fase aceitosa por mezclado mecánico, por ejemplo agitando.
Los reactivos que pueden añadirse por la fase aceitosa incluyen sustratos, componentes tamponantes, factores y similares. En particular, el pH interno de las microcápsulas puede alterarse in situ añadiendo componentes ácidos o básicos a la fase aceitosa.
Una vez el elemento genético que codifica un producto génico se ha clasificado por el procedimiento de la invención, el propio elemento genético puede expresarse directamente por medios convencionales para producir el producto génico. Sin embargo, pueden emplearse técnicas alternativas, como es evidente para los expertos en la materia. Por ejemplo, la información genética incorporada en el producto génico puede incorporarse en un vector de expresión adecuada, y expresarse en éste.
Pueden utilizarse técnicas de identificación convencionales para identificar compuestos que son capaces de interactuar con los productos génicos identificados por el primer aspecto de la invención. Por ejemplo, el producto génico que codifica un ácido nucleico se incorpora en un vector, y se introduce en células hospedadoras adecuadas para producir estirpes celulares transformadas que expresan el producto génico. Las estirpes celulares resultantes pueden producirse a continuación por análisis cualitativo y/o cuantitativo reproducibles del efecto o de los efectos de fármacos potenciales que afectan la función del producto génico. Por lo tanto las células que expresan el producto génico pueden emplearse para la identificación de compuestos, particularmente compuestos de pequeño peso molecular, que modulan la función del producto génico. De este modo las células hospedadoras que expresan el producto génico son útiles para la identificación de fármacos y además se describe un procedimiento para identificar compuestos que en la actividad del producto génico, comprendiendo dicho procedimiento exponer las células que contienen el producto génico que codifica el ADN heterólogo, en el que dichas células producen el producto génico funcional, para por lo menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal cuya capacidad para modular la actividad de dicho producto génico se busca para ser determinada y a continuación el control de dichas células para cambios producidos por dicha modulación. Dicho ensayo permite la identificación de moduladores, tales como agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos, del producto génico. Tal como se utiliza en la presente memoria, un compuesto o señal que modula la actividad del producto génico se refiere a un compuesto que altera la actividad del producto génico de tal manera que la actividad del producto génico es diferente en la presencia del compuesto o señal (en comparación con la ausencia de dicho compuesto o señal).
Pueden diseñarse ensayos de identificación basados en células construyendo estirpes celulares en las que la expresión de una proteína indicadora, es decir, una proteína fácilmente analizable, tal como la \beta-galactosildasa, cloranfelicol-acetiltransferasa (CAT), la proteína verde fluorescente (GFP) o luciferasa, depende del producto génico. Dicho análisis permite la detección de compuestos que modulan directamente la función del producto génico, tales como los compuestos que antagonizan el producto génico, o los compuestos que inhiben o potencian otras funciones celulares requeridas para la actividad del producto génico.
Los procesos que se producen en las células que dependen de un producto génico pueden ser afectados de manera exógena. El producto génico recombinante que produce células hospedadoras, por ejemplo células de mamífero, puede ponerse en contacto con el compuesto de ensayo, y el/los efecto/s de modulación de los mismos puede evaluarse a continuación comparando la respuesta mediada por el producto génico en presencia y ausencia del compuesto de ensayo, o relacionando la respuesta mediada por el producto génico de las células de ensayo, o de las células de referencia (es decir, células que no expresan el producto génico), para la presencia del compuesto.
Mediante la invención, pueden optimizarse enzimas implicadas en la preparación de un compuesto por clasificación de la actividad óptima. Este procedimiento implica la preparación de variantes del polipéptido que deben identificarse, que se equiparan con un banco de polipéptidos citados en la presente memoria. Las variantes deben prepararse de la misma manera que los bancos expuestos en cualquier parte en la presente memoria.
(B) Procedimientos de clasificación
El sistema puede configurarse para seleccionar moléculas de ARN, ADN o del producto génico de proteínas con actividad catalítica, reguladora o aglutinante.
(i) Selección para la unión
En el caso de la selección de un producto génico con afinidad para un ligando específico el elemento genético puede estar unido al producto génico en la microcápsula mediante el ligando. Solamente los productos génicos con afinidad para el ligando se unirán por consiguiente al elemento genético y solamente aquellos elementos genéticos con el producto génico unido mediante el ligando adquirirán las propiedades ópticas alteradas que les permiten mantenerse en la etapa de selección. En esta forma de realización, el elemento genético comprenderá de este modo un ácido nucleico que codifica el producto génico unido a un ligando para el producto génico.
El cambio en las propiedades ópticas del elemento genético después de la unión del producto génico al ligando puede producirse de varias maneras, incluyendo:
(1)
el propio producto génico puede tener propiedades ópticas distintas, por ejemplo, es una proteína fluorescente (proteína verde fluorescente, (Lorenz et al., 1991)).
(2)
las propiedades ópticas del elemento génico pueden modificarse en la unión al ligando, por ejemplo, la fluorescencia del producto génico se extingue o aumenta en la unión (Guixe et al, 1998; Qi y Grabowski, 1998).
(3)
Las propiedades ópticas del ligando pueden modificarse en la unión del producto génico, por ejemplo, la fluorescencia del ligando se extingue o aumenta en la unión (Voss, 1993; Masui y Kuramitsu, 1998).
(4)
Las propiedades ópticas tanto del ligando como del producto génico pueden modificarse en la unión, por ejemplo, puede existir una transferencia de energía de resonancia con fluorescencia (FRET) desde el ligando al producto génico (o viceversa) dando como resultado la misión en la longitud de onda de emisión del "receptor" cuando la excitación está en la longitud de onda de absorción del "donante" (Heim & Tsien, 1996; Mahajan et al., 1998; Miyawaki et al., 1997).
En esta forma de realización, no es necesario para la unión del producto génico al elemento genético mediante el ligando para provocar directamente un cambio en las propiedades ópticas. Todos los productos génicos que han de seleccionarse pueden contener un supuesto dominio de unión, que tiene que ser seleccionado para, y una característica común, una etiqueta. El elemento genético en cada microcápsula está físicamente unido al ligando. Si el producto génico producido a partir del elemento genético tiene afinidad para el ligando, se unirá a él y llegará a estar físicamente unido al mismos elemento genético que lo codifica, dando como resultado el elemento genético que está "etiquetado". Al final de la reacción, todas las microcápsulas se combinan, y todos los elementos genéticos y los productos génicos se mezclan en un medio. Los elementos genéticos que codifican los productos génicos que presentan la unión deseada pueden seleccionarse añadiendo reactivos que se unen específicamente a la "etiqueta", o reaccionan específicamente con ésta, y de este modo provocan un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético permitiendo esta clasificación. Por ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo anti"etiqueta" marcado por fluorescencia, o un anticuerpo anti"etiqueta" seguido de un segundo anticuerpo marcado con fluorescencia que se une al
primero.
En una forma de realización alternativa, pueden clasificarse los elementos genéticos basándose en que el producto génico, que se une al ligando, oculta meramente el ligando, por ejemplo, de compañeros de unión adicionales que si no modificarían las propiedades ópticas del elementos genético. En este caso se seleccionarían los elementos genéticos con propiedades ópticas inalteradas.
En una forma de realización alternativa, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que los productos génicos se unen a elementos genéticos que les codifican. Los productos génicos junto con los elementos genéticos acoplados se clasifican entonces como resultado de la unión de un ligando a los productos génicos con la actividad de unión deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos pueden contener una zona invariable que se une por enlace covalente o no covalente al elemento genético, y una segunda zona que está diversificada con el fin de generar la actividad de unión deseada.
En una forma de realización alternativa, el ligando para el producto génico es él mismo codificado por el elemento genético y se une al elemento genético. Dicho de otra manera, el elemento genético codifica dos (o de hecho más) productos génicos, por lo menos uno de los cuales se une al elemento genético, y que pueden unirse potencialmente entre sí. Solamente cuando los productos génicos interactúan en una microcápsula es el elemento genético modificado de una manera que produce por último un cambio en sus propiedades ópticas que permite que se clasifique. Esta forma de realización, por ejemplo, se publicó para buscar bancos génicos para pares de genes que codifican pares de proteínas que se unen entre sí.
La fluorescencia puede aumentarse mediante la utilización de la ampliación Tyramide Signal Amplification
(TSA^{TM}) para hacer fluorescentes los elementos genéticos. Esto implica la unión de la peroxidasa (unida a otra proteína) a los elementos genéticos y catalizar la conversión de fluoresceína-tiramina en una forma de radical libre que reacciona a continuación (localmente) con los elementos genéticos. Los procedimientos para llevar a cabo la TSA son conocidos en la técnica, y están comercializados kits de NEN.
La TSA puede configurarse de modo que de como resultado un aumento directo en la fluorescencia del elemento genético, o de modo que un ligando está acoplado al elemento genético que está unido por una segunda molécula fluorescente, o una secuencia de moléculas, una o más de las cuales es fluorescente.
(ii) Clasificación para la catálisis
Cuando la clasificación es para la catálisis, el elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico capaz de actuar como catalizador, el producto génico catalizará la conversión del sustrato en el producto. Por consiguiente, al final de la reacción el elemento genético está físicamente unido al producto de la reacción catalizada.
Puede ser deseable también, en algunos casos, que el sustrato no sea un componente del elemento genético. En este caso el sustrato contendría una "etiqueta" inactiva que requiere una etapa adicional para activarlo tal como la fotoactivación (por ejemplo de un análogo de biotina "bloqueado" (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang, 1996)). El catalizador que debe seleccionarse a continuación convierte el sustrato en producto. La "etiqueta" se activa a continuación y el sustrato "etiquetado" y/o el producto unido mediante una molécula que se une a la etiqueta (por ejemplo avidina o estreptavidina) acomplejada con el ácido nucleico. La relación de sustrato a producto acoplado al ácido nucleico mediante la "etiqueta" reflejará por consiguiente la relación del sustrato y producto en solución.
Las propiedades ópticas de los elementos genéticos con el producto acoplado y que codifica productos génicos con la actividad catalítica deseada pueden ser modificadas por:
(1)
el complejo producto-elemento genético con propiedades ópticas características no encontradas en el complejo sustrato-elemento genético, debido a, por ejemplo;
(a)
el sustrato y el producto con diferentes propiedades ópticas (muchos sustratos de enzima fluorógenos están disponibles en el mercado (véase por ejemplo Haugland, 1996) incluyendo sustratos para glucosidasas, fosfatasas, peptidasas y proteasas (Craig et al., 1995; Huang et al., 1992; Brynes et al., 1982, Jones et al., 1997; Matayoshi et al. 1990; Wang et al., 1990)), o
(b)
el sustrato y el producto con propiedades ópticas similares, pero sólo el producto, y no el sustrato se une al elemento genético o reacciona con éste;
(2)
añadir reactivos que se unen específicamente al producto, o reaccionan con éste y que por esto provocan un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos que permiten sus clasificación (estos reactivos pueden añadirse antes o después de romper las microcápsulas y mezclar los elementos genéticos). Los reactivos:
(a)
se unen específicamente al producto, o reaccionan específicamente con éste, y no al sustrato, si tanto el sustrato como el producto están unidos al elemento genético, o
(b)
opcionalmente se unen tanto al sustrato como al producto si solamente el producto, y no el sustrato se une al elemento genético, o reacciona con éste;
Los elementos genéticos mezclados que codifican moléculas catalíticas pueden enriquecerse entonces seleccionando los elementos genéticos con propiedades ópticas modificadas.
Una alternativa consiste en acoplar el ácido nucleico a un anticuerpo específico para el producto (u otra molécula específica para el producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada microcápsula no unida al elemento genético, pero tiene una "etiqueta" molecular (por ejemplo, biotina, DIG, o DNP o un grupo fluorescente). Cuando el catalizador que debe seleccionarse convierte el sustrato en producto, el producto conserva la "etiqueta" y es capturado a continuación en la microcápsula por el anticuerpo específico para el producto. De esta manera el elemento genético solamente llega a estar asociado con la "etiqueta" cuando codifica o produce una enzima capaz de convertir el sustrato en producto. Cuando se interrumpen todas las reacciones y se combinan las microcápsulas, los elementos genéticos que codifican enzimas activas estarán "etiquetados" y pueden ya presentar propiedades ópticas alteradas, por ejemplo, si la "etiqueta" era un grupo fluorescente. Alternativamente, un cambio en las propiedades ópticas de genes "etiquetados" puede provocarse añadiendo un ligando marcado con fluorescencia que se une a la "etiqueta" (por ejemplo, avidina-estreptavidina marcada con fluorescencia, un anticuerpo antietiqueta que es fluorescente o un anticuerpo anti"etiqueta" no fluorescente que puede ser detectado por un segundo anticuerpo marcado con fluorescencia.
Alternativamente, la selección puede realizarse directamente acoplando una primera reacción a las reacciones posteriores que tienen lugar en la misma microcápsula. Existen dos maneras generales en las que esto puede realizarse. En una primera forma de realización, el producto de la primera reacción se hace reaccionar con, o se une mediante, una molécula que no reacciona con el sustrato de la primera reacción. Una segunda, reacción acoplada solamente continuará en presencia del producto de la primera reacción. Un elemento genético que codifica un producto génico con una actividad deseada puede purificarse a continuación utilizando los procedimientos del producto de la segunda reacción para provocar un cambio en las condiciones ópticas del elemento genético como anterior-
mente.
Alternativamente, el producto de la reacción que se selecciona puede ser el sustrato o un cofactor para una segunda reacción catalizada por enzimas. La enzima para catalizar la segunda reacción puede ser trasladada in situ a las microcápsulas o incorporada en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. Solamente cuando procede la primera reacción la enzima acoplada generará un producto que puede utilizarse para provocar un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético como anteriormente.
Este concepto de acoplamiento puede elaborarse para incorporar múltiples enzimas, utilizando cada una como sustrato el producto de la reacción anterior. Esto permite la selección de enzimas que no reaccionarán con un sustrato inmovilizado. Puede diseñarse también para proporcionar aumento de sensibilidad mediante la ampliación de señal si un producto de una reacción es un catalizador o un cofactor para una segunda reacción o una serie de reacciones que conduce a un producto seleccionable (por ejemplo, véase Johannsson y Bates, 1988; Johannsson, 1991). Además un sistema enzimático en cascada puede basarse en la producción de un activador para una enzima o en la destrucción de un inhibidor enzimático (véase Mize et al., 1989). El acoplamiento también tiene la ventaja de que puede utilizarse un sistema de clasificación común como grupo completo de enzimas que generan el mismo producto y que permite la selección de transformaciones químicas complicadas que no puede realizarse en una sola
etapa.
Dicho procedimiento de acoplamiento permite de este modo la evolución de nuevas "series de reacciones metabólicas" in vitro paso a paso, seleccionando y mejorando en primer lugar una etapa y a continuación la siguiente. La estrategia de selección está basada en el producto final de la serie de reacciones, de modo que todas las etapas preliminares pueden evolucionar independientemente o sucesivamente sin organizar un nuevo sistema de selección para cada etapa de la reacción.
Expresado de manera alternativa, se proporciona un procedimiento de aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico con una actividad catalítica deseada, que comprende las etapas siguientes:
(1)
expresar los elementos genéticos para proporcionar sus respectivos productos génicos;
(2)
permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato en un producto, que puede o no ser directamente seleccionable, según la actividad deseada;
(3)
acoplar opcionalmente la primera reacción a una o más reacciones ulteriores, siendo modulada cada reacción por el producto de las reacciones anteriores, y conduciendo a la creación de un producto seleccionable final;
(4)
unir el producto seleccionable de la catálisis a los elementos genéticos por:
(a)
acoplar un sustrato a los elementos genéticos de tal manera que el producto permanezca asociado a los elementos genéticos, o
(b)
hacer reaccionar o unir el producto seleccionable a los elementos genéticos mediante una "etiqueta" molecular adecuada acoplada al sustrato que permanece en el producto, o
(c)
acoplar el producto seleccionable (pero no el sustrato) a los elementos genéticos mediante una reacción específica para el producto o interacción con el producto; y
(5)
seleccionar el producto de la catálisis, junto con el elemento genético al que está unido, por medio de sus propiedades ópticas características, o añadiendo los reactivos que se unen específicamente al producto, o reaccionan específicamente con éste, y que por esto provocan un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos en donde las etapas (1) a (4) cada elemento genético y el producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.
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(iii) Selección de especificidad/selectividad de enzima sustrato
Los elementos genéticos que codifican enzimas con especificidad o selectividad para el sustrato pueden enriquecerse específicamente llevando a cabo una selección positiva para la reacción con un sustrato y una clasificación negativa para la reacción con otro sustrato. Dicha presión de selección positiva y negativa combinada sería de gran importancia en el aislamiento de enzimas regio-selectivas y estéreo-selectivas (por ejemplo, las enzimas que pueden distinguir entre dos enantiómeros del mismo sustrato). Por ejemplo, dos sustratos (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) se marcan cada una con diferentes etiquetas (por ejemplo dos fluoróforos diferentes) de modo que las etiquetas llegarán a unirse al elemento genético mediante la reacción catalizada por enzimas. Si las dos etiquetas comunican propiedades ópticas diferentes al elemento genético la especificidad del sustrato de la enzima puede determinarse a partir de las propiedades ópticas del elemento genético y se rechazan los elementos genéticos que codifican productos génicos con especificidad equivocada (o no). Las etiquetas que no proporcionan ningún cambio de actividad óptica pueden utilizarse también si se añaden los ligandos específicos para la etiqueta con diferentes propiedades ópticas (por ejemplo anticuerpos específicos para la etiqueta marcados con fluoróforos diferentes).
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(iv) Selección para la regulación
Un sistema similar puede utilizarse para seleccionar propiedades reguladoras de enzimas.
En el caso de la selección de una molécula reguladora que actúa como activador o inhibidor de un proceso bioquímico, los componentes del proceso bioquímico pueden trasladarse in situ en cada microcápsula o pueden incorporarse en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. Si el elemento genético que se está seleccionando es para codificar un activador, puede realizarse la selección del producto de la reacción regulada, como se describió anteriormente en relación con la catálisis. Si se desea un inhibidor, la selección puede ser de una propiedad química específica para el sustrato de la reacción regulada.
Se proporciona por consiguiente un procedimiento de clasificación de uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta una actividad reguladora deseada, que comprende las etapas siguientes:
(1)
expresar los elementos genéticos para proporcionar sus productos génicos respectivos;
(2)
dejar que los productos génicos activen o inhiban una reacción bioquímica, o una secuencia de reacciones acopladas, según la actividad deseada, de tal manera que permitan la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;
(3)
unir la molécula seleccionable a los elementos genéticos
(a)
teniendo la molécula seleccionable o el sustrato del que derivan, acoplado a los elementos genéticos, o
(b)
haciendo reaccionar o uniendo el producto seleccionable a los elementos genéticos, por medio de una "etiqueta" molecular adecuada acoplada al sustrato que permanece sobre el producto, o
(c)
acoplar el producto de catálisis (pero no el sustrato) a los elementos genéticos, mediante una reacción específica para el producto o la interacción con el producto;
(4)
seleccionar el producto seleccionable, junto con el elemento genético al que está unido, ya sea mediante sus propiedades ópticas características, o mediante la adición de reactivos que se unen específicamente al producto, o reaccionan específicamente con el mismo, y que provocan de este modo un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos en donde las etapas (1) a (3) cada elemento genético y cada producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.
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(v) Selección de propiedades ópticas del producto génico
Es posible seleccionar las propiedades ópticas inherentes de los producto génicos si, en las microcápsulas, el producto génico se vuelve a unir al elemento genético, por ejemplo mediante un elemento común del producto génico que se une a un ligando que forma parte del elemento genético. Después de la mezcla los elementos genéticos pueden clasificarse utilizando las propiedades ópticas de los productos génicos unidos. Esta forma de realización puede utilizarse, por ejemplo, para seleccionar variantes de proteína verde fluorescente (GFP) (Cormack et al., 1996; Delagrave et al., 1995; Ehrig et al., 1995), con fluorescencia mejorada y/o nuevos espectros de absorción y emisión.
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(vi) Clasificación del flujo de los elementos genéticos
En una forma de realización preferida de la invención los elementos genéticos se clasificarán por citometría de flujo. Una variedad de propiedades ópticas puede utilizarse para activar la clasificación, incluyendo la dispersión de la luz (Kerker, 1983) y la polarización de fluorescencia (Rolland et al., 1985). En una forma de realización muy preferida la diferencia en las propiedades ópticas de los elementos genéticos será una diferencia en fluorescencia y los elementos genéticos se clasificarán utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia (Norman, 1980; Mackenzie y Pinder, 1986), o un dispositivo similar. En una forma de realización especialmente preferida el elemento genético comprende una microperla no magnética ni fluorescente (por ejemplo poliestireno) o paramagnética (véase Fornusek y Vetvicka, 1986), de manera óptima 0,6 a 1,0 \mum de diámetro, al que se acoplan tanto el gen como los grupos implicados en generar una señal fluorescente:
(1)
equipo de clasificación de células activadas por fluorescencia disponibles en el mercado en los fabricantes establecidos (por ejemplo Becton-Dickinson, Coulter) permite la clasificación de hasta 10^{8} elementos genéticos (episodios) por hora;
(2)
la señal de fluorescencia de cada perla corresponde estrechamente con el número de moléculas fluorescentes unidas a la perla. En el presente tan pocas como unos pocos centenares de moléculas fluorescentes por partícula pueden detectarse cuantitativamente;
(3)
el amplio intervalo dinámico de los detectores por fluorescencia (por lo general 4 unidades logarítmicas) permite el fácil escenario de la severidad del procedimiento de clasificación, permitiendo de este modo la recuperación del número óptimo de elementos genéticos de la mezcla de partida (pueden fijarse controles para separar perlas con pequeñas diferencias de fluorescencia o para separar solamente perlas con grandes diferencias de fluorescencia, dependiendo de la clasificación que se lleve a cabo);
(4)
el equipo de clasificación de células activadas por fluorescencia disponible en el mercado puede llevar a cabo la excitación simultánea en más de dos longitudes de onda diferentes y detectar la fluorescencia hasta en cuatro longitudes de onda diferentes (Shapiro, 1983) permitiendo que se lleven a cabo selecciones positivas y negativas simultáneamente controlando el etiquetado del elemento genético con dos (o más) marcadores fluorescentes diferentes, por ejemplo, si dos sustratos alternativos para una enzima (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) se marcan con diferentes etiquetas fluorescentes el elemento genético puede marcarse con diferentes fluoróforos dependientes del sustrato utilizado y solamente los genes que codifican enzimas con enantioselectividad seleccionada.
(5)
micropartículas (perlas) no magnéticas y paramagnéticas modificadas y sin modificar muy uniformes están disponibles en el mercado de muchos proveedores (por ejemplo Sigma y molecular Probes) (Fornusek y Vetvicka, 1986).
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(vii) Procedimiento multietapa
Se valorará también que para todos los procesos de transcripción/replicación y/o traducción, y clasificación no sea necesario continuar en una sola etapa, con todas las reacciones que tienen lugar en una microcápsula. El procedimiento de clasificación puede comprender dos o más etapas. En primer lugar, la transcripción/replicación y/o la traducción de cada elemento genético de un banco de elementos genéticos puede tener lugar en una primera microcápsula. Cada producto génico se une a continuación al elemento genético que lo codifica (que reside en la misma microcápsula), por ejemplo mediante un ligando específico para el producto génico tal como un anticuerpo. Las microcápsulas se rompen a continuación, y los elementos genéticos se acoplan a sus productos génicos respectivos opcionalmente purificados. Alternativamente, los elementos genéticos pueden acoplarse a sus productos génicos respectivos utilizando procedimientos que no se basan en la encapsulación. Por ejemplo la exposición en fagos (Smith, G.P., 1985), exposición en polisomas (Mattheakkis et al., 1994), ARN-péptido de fusión (Roberts y Szostak, 1997) o la fusión del péptido represor (Cull, et al., 1992).
En la segunda etapa del procedimiento, cada elemento genético purificado acoplado a su producto génico se coloca en una segunda microcápsula que contiene componentes de la reacción que deben seleccionarse. Esta reacción se inicia a continuación. Una vez completadas las reacciones, las microcápsulas se rompen de nuevo y los elementos genéticos modificados se seleccionan. En el caso de reacciones multietapa complicadas en las que están implicados muchos componentes individuales y etapas de reacción, pueden realizarse una o más etapas intervinientes entre la etapa inicial de creación y la unión del producto génico al elemento genético, y la etapa final de generación del cambio seleccionable en el elemento genético.
Si fuera necesario, puede conseguirse la liberación del producto génico del elemento genético en una segunda microcápsula secundaria de varias maneras, incluyendo por competencia específica por un producto de bajo peso molecular para el punto de unión o la escisión de una zona enlazadora que une el dominio de unión del producto génico del dominio catalítico ya sea enzimáticamente (utilizando proteasas específicas) o autocatalíticamente (utilizando un dominio de integrina).
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(viii) Clasificación por activación de la expresión del gen indicador in situ
El sistema puede configurarse de modo que la actividad de unión, catalítica o reguladora deseada codificada por un elemento genético conduzca, directa o indirectamente, a la activación de la expresión de un "gen indicador" que está presente en todas las microcápsulas. Solamente los productos génicos con la actividad deseada activan la expresión del gen indicador. La actividad resultante de la expresión del gen indicador permite la selección del elemento genético (o del compartimento que lo contiene) por cualquiera de los procedimientos descritos en la presente
memoria.
Por ejemplo, la activación del gen indicador puede ser el resultado de una actividad de unión del producto génico de manera análoga al "sistema de dos híbridos" (Fields y Song, 1989). La activación puede también ser el resultado del producto de una reacción catalizada por un producto génico deseable. Por ejemplo, el producto de reacción puede ser un inductor de transcripción del gen indicador. Por ejemplo la arabinosa puede utilizarse para provocar la transcripción del activador araBAD. La actividad del producto génico deseable puede también dar como resultado la modificación de un factor de transcripción, dando como resultado la expresión del gen indicador. Por ejemplo, si el producto génico deseado es una cinasa o una fosfatasa la fosforilación o la desfosforilación de un factor de transcripción puede conducir a la activación de la expresión del gen indicador.
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(ix) Ampliación
Los elementos genéticos pueden ampliarse. La ampliación selectiva puede utilizarse como medio para enriquecer los elementos genéticos que codifican el producto génico deseado.
En todas las configuraciones anteriores, el material genético comprendido en los elementos genéticos puede ampliarse y repetirse el proceso en etapas iterativas. La ampliación puede ser por reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al., 1988) o utilizando una de varias otras técnicas de ampliación génica incluyendo; la ampliación de la Qb-replicasa (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kumasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de la ligasa (RCL) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); el sistema de replicación de secuencias automantenido (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991) y la ampliación por desplazamiento de cadena (Walker et al.,
1992).
En los ejemplos siguientes se ilustran varios aspectos y formas de realización de la presente invención. Se valorará que la modificación de detalle pueda realizarse sin apartarse del alcance de la invención.
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Ejemplos
Ejemplo 1
(A título ilustrativo solamente)
Las enzimas pueden expresarse en genes en solución y genes acoplados a microperlas paramagnéticas con idéntica eficacia
Un formato para la selección de elementos genéticos utilizando un cambio en sus propiedades ópticas es aquel en el que el elemento genético comprende una microperla a la que se une el gen. Se muestra entonces cómo un gen para una enzima (dihidrofolato-reductasa de E. coli) puede unirse a una perla paramagnética y se traduce in vitro tan eficazmente como en solución.
El gen folA de E. coli que codifica la dihidrofolato-reductasa (DHFR) se amplía por PCR utilizando EDHFRFo y EDHFRBa. Este ADN se clona a continuación en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y KpnI corriente abajo del activador lac y del activador de T7 ARN-polimerasa del. El oligonucleótido EDHFRBa se añade al punto de partida de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz corriente arriba del codón de iniciación de DHFR.
El secuenciado del ADN identifica un clon que tiene la secuencia nucleotídica correcta. Las bacterias transformadas con este clon (pGEM-foIA) se observa que sobreexpresan el DHFR activo (conducido desde el activador lac) cuando se inducen con IPTG.
El gen folA en el plásmido pGEM-folA se amplía por PCR a continuación utilizando los cebadores folA-FW y folA-BW, el fragmento de ADN resultante en HindIII y XhoI se digiere y se subclona en el vector de expresión pET23a digerido con HindIII/XhoI (Novagen) para dar el montaje pET23a/folA. La secuencia del gen folA ampliado por PCR fue verificada por secuenciado.
Se amplió más el pET23a/folA con los cebadores pETfor.b y pETrev.b biotinilados en 5' y radiomarcados incluyendo 10 \muCi \alpha^{35}S-dATP (Amersham Pharmacia Biotech, U.K.) en la mezcla de PCR. El fragmento T7-folA biotinilado dos veces de 1.765 pb resultante se purificó en gel utilizando el kit con Qiagen y se analizó cuantitativamente por espectrometría. La actividad específica del producto fue 210.000 CPM/pmol T7-folA ADN, medida en el contador de centelleo Beckman LS6000SC. Se prepararon diluciones 10 nM y 1 nM en 1 mg/ml de ADN lambda digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al plástico). Este fragmento de la PCR se utilizó después para programar un sistema procariótico de transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley, Brow y Burgess, 1991). Se utiliza una preparación comercial de este sistema (Sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7 ARN polimerasa (10^{3} unidades).
El fragmento de ADN está unido a perlas paramagnéticos con estreptavidina (perlas Sera-Mag, de 0,74 \mum de diámetro, capacidad de unión a la biotina 46 nmol/mg, Seradyn, US), recubiertas parcialmente con proteína A biotinilada (Sigma). Se añaden 2 \mul de proteína A biotinilada 80 \mum a 100 \mul (1 mg) de perlas, se deja unir a temperatura ambiente durante 1 hora, se lavan una vez y se cubren durante una hora a temperatura ambiente con IgG de conejo (1 mg/ml de anticuerpo 10 \mul por 1 mg de perlas en TBS/Tween-20 al 0,1% (TBST)). Las perlas se lavaron dos veces a continuación con TBS/T antes de que se añadiera ADN T7-folA radiomarcado y biotinilado y se dejó unir durante 1 hora a temperatura ambiente. Se calculó la cantidad de T7-folA ADN unido haciendo un recuento de la radioactividad unida a una alícuota de perlas. Se unió \sim50% del ADN total.
Los fragmentos de ADN unidos en perlas o el fragmento de ADN no unido se añaden directamente al sistema de extracto de S30. Las reacciones se incuban durante 2 horas a 37ºC.
Se analizó la actividad de dihidrofolato-reductasa por espectrofotometría controlando la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante 10 minutos tal como se describe (Williams et al., 1979; Ma et al., 1993). 2 \mul de cada reacción de traducción enfriada in vitro se añaden a 150 \mul de tampón A (Imidazol 100 mM, pH 7,0, \beta-mercaptoetanol 10 mM) y 20 \mul de NADPH 1 mM. Se añaden 20 \mul de dihidrofolato (1 mM) (H_{2}F) después de 1 minuto y la reacción se controla a 340 nm utilizando un lector de microplacas ThermoMax (Molecular Devices). Se calcula la actividad por velocidades iniciales en condiciones So>>K_{M} (\numax).
No existe diferencia significativa en la cantidad de DHFR activa producida si el ADN está libre, o acoplado mediante biotinas terminales a una perla recubierta con estreptavidina (véase la figura 1).
Ejemplo 2
Una proteína fluorescente (GFP) puede traducirse in vitro en genes acoplados a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite y el producto génico traducido volver a unirse a las microperlas haciéndolas fluorescentes
Un formato para la clasificación de elementos genéticos es aquel en el que el elemento genético comprende un gen unido a una microperla y el producto se vuelve a acoplar sobre la microperla en la microcápsula resultando, directa o indirectamente, un cambio en las propiedades ópticas de la microperla que permite que se clasifique.
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Se demuestra que una proteína fluorescente (proteína verde fluorescente o GFP) puede transcribirse y traducirse in vitro en genes acoplados a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite y el producto génico traducido volver a unirse a las microperlas que les hacen fluorescen-
tes.
La GFP en el plásmido pBS/GFP6 (Siemering et al., 1996) se amplió por PCR utilizando los cebadores GFP-FW y GFP-BW, el fragmento de ADN resultante en HindIII y XhoI se digirió y subclonó en el vector de expresión pET23a digerido con HindIII/XhoI (Novagen) para proporcionar el montaje pET23a/GFP. La secuencia del gen GFP ampliado por PCR se verificó por secuenciado. Se continuó ampliando el pET23a/GFP con los cebadores pETfor.b y pETrev.b biotinilados en 5'. El fragmento T7-GFP de 2.038 pb resultante biotinilado dos veces se purificó en gel utilizando un kit Qiagen y se analizó cuantitativamente por espectrofotometría. Se prepararon diluciones 10 nM y 1 nM de este ADN en 1 mg/ml de ADN lambda digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al plástico). Este fragmento de la PCR se utilizó después para programar un sistema procariótico de transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley, Brow y Burgess, 1991). Se utiliza una preparación comercial de este sistema (Sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7 ARN polimerasa (10^{3}
unidades).
Como referencia, se utilizó un fragmento T7-folA de ADN de 1.765 bp biotinilado (sintetizado por PCR como en el ejemplo 1) para programar la síntesis de la proteína DHFR no fluorescente.
Se suspendieron 150 \mul de perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina ProActive (Bangs Laboratories, 2x10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl 1 M/Tween 20 al 0,1% y se cortaron y empalmaron en tres alícuotas de 50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \muM (T7-folA o T7-GFP) a cada alícuota de perlas, se incubó a 43ºC durante 15 min, se lavó tres veces en NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0 (PBS/Tween20 al 0,1%), se volvió a poner en suspensión en 40 \mul de TBST y 10 \mul de proteína A biotinilada 80 \mum (Sigma) se añadieron (para dar una concentración final de 15 \muM). Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron las perlas tres veces in PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a poner en suspensión en 20 \mul de dilución 1:10 de anticuerpo policlonal antiGFP de conejo (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no inmunizado (Sigma). Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a poner en suspensión en 15 \mul de S30 premezclado procedente de un sistema de extracto S30 de E. coli para Linear Templates (Promega), se sometieron a ultrasonidos durante un minuto en un baño con ultrasonidos, a continuación se añadió (en hielo) el resto de la mezcla S30 de traducción in vitro y se enriqueció con T7 ARN-polimerasa (10^{3} unidades).
Los 50 \mul de las reacciones de traducción in vitro enfriados en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de la fase aceitosa enfriada en hielo recién preparada disolviendo Span 80 (Fluka) al 4,5% (v/v) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) (SigmaUltra; nº P-8074) en un vial de 5 ml Costar Biofreeze (nº 2051)) en agitación con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Se continuó agitando (a 1.150 rpm) durante 3 minutos adicionales en hielo. Las reacciones se incubaron a continuación 3 h a 32ºC.
Se extendieron 2 \mul de emulsión en un portaobjetos de microscopio bajo un cubreobjetos circular de 13 mm y se observaron utilizando un objetivo 20xNeofluar en un microscopio Axioplan (Zeiss) equipado con una cámara RTEA CCD-1300-Y CCD (Princeton Instruments). Se utilizaron filtros normales de excitación de emisión para fluoresceína y se procesaron las imágenes con el programa informático IPLab.
Como puede observarse en la Figura 2 la GFP traducida de los genes acoplados a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las emulsiones está unida a las microperlas in situ cuando las microperlas están recubiertas con un anticuerpo antiGFP. Esta unión se observa como concentración de fluorescencia de las perlas por microscopía de epifluorescencia. No se observa fluorescencia en las perlas cuando desaparecen el gen GFP o el anticuerpo antiGFP.
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Ejemplo 3
Una proteína fluorescente (GFP) puede traducirse in vitro en los genes acoplados a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite, el producto génico traducido se vuelve a unir a las microperlas y el aumento de fluorescencia de las microperlas se detecta por citometría de flujo
Se suspendieron 150 \mul de perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina (1 \muM de diámetro; Bangs Laboratories, 2x10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl 1 M/Tween 20 al 0,1% y se cortaron y empalmaron en 3 alícuotas de 50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \mum (T7-folA o T7-GFP) a cada alícuota de perlas, se incubó a 43ºC durante 15 min, se lavó tres veces en NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0 (PBS/Tween20 al 0,1%), se volvió a poner en suspensión en 40 \mul de TBST y 10 \mul de proteína A biotinilada 80 \muM (Sigma) se añadieron (para dar una concentración final de 15 \muM). Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron las perlas tres veces in PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a poner en suspensión en 20 \mul de dilución 1:10 de anticuerpo policlonal antiGFP de conejo (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no inmunizado (Sigma). Tras la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 1% y se volvieron a poner en suspensión en 15 \mul de S30 premezclado procedente de un sistema de extracto S30 de E. coli para Plantillas Lineales (Promega), se sometieron a ultrasonidos durante un minuto en un baño con ultrasonidos, a continuación se añadió (en hielo) el resto de la mezcla S30 de traducción in vitro y se enriqueció con T7 ARN-polimerasa (10^{3} unidades). Los 50 \mul de las reacciones de traducción in vitro enfriados en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de la fase aceitosa enfriada en hielo recién preparada disolviendo Span 80 (Fluka) al 4,5% (v/v) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) (SigmaUltra; nº P-8074) en un vial de 5 ml Costar Biofreeze (nº 2051)) en agitación con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Se continuó agitando (a 1.150 rpm) durante 3 minutos adicionales en hielo. Las reacciones se incubaron a continuación 3 h a 32ºC. Para recuperar las mezclas de reacción, se centrifugaron las emulsiones a 3.000 g durante 5 minutos y la fase aceitosa se clasificó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del vial. Se añadieron PBS y 2 ml de éter saturado con agua y se agitó la mezcla, se centrifugó brevemente, y se clasificó la fase etérea. Se lavaron dos veces las perlas con PBS y por último se volvieron a poner en suspensión a razón de 10^{8} perlas/ml en PBS. Se analizaron 10^{4} perlas utilizando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson) utilizando excitación a 488 nm y el filtro de emisión de fluoresceína. La GFP traducida de los genes acoplados a microperlas individuales encapsulada en los compartimentos acuosos de las emulsiones se une a las microperlas in situ cuando las microperlas están recubiertas con un anticuerpo antiGFP. La unión de GFP a las microperlas las hace fluorescentes (Fig. 2) y estas perlas con GFP unida pueden distinguirse claramente de las que no lo están por citometría de flujo (Figura 3).
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Ejemplo 4
El producto de una reacción catalizada por enzimas puede capturarse en perlas paramagnéticas y perlas modificadas con producto identificado por citometría de flujo
Se llevó a cabo una reacción catalizada por la enzima glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) humana para generar un producto biotinilado (Figura 4). Los dos sustratos utilizados fueron 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma) y glutatión biotinilado reducido (biotina-GSH). El producto generado (biotina-GS-DNP) tiene biotina en un extremo para permitir el acoplamiento a micropartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y un grupo 2,4-dinitrofenol (DNP) que puede unirse por un anticuerpo antiDNP.
Se sintetizó biotina-GSH añadiendo 100 mg de éster de biotinamidocaproato de N-hidroxisuccinimida (biotina-NHS; Sigma) en 1 ml de DMF a una solución de glutatión oxidado (Fluka) en 1 ml de agua, 30 \mul de NaOH 12,5 N más 1 ml de DMF. Se añadió la biotina-NHS, en hielo, en 100 \mul de alícuotas durante 20 minutos. El pH se ajustó a continuación a 7,0 con NaOH 1 N. El precipitado parecido a jarabe que se formó durante la reacción se disolvió por calentamiento a temperatura ambiente, agitando y añadiendo 300 \mul de agua. Se continuó agitando durante 2 horas a temperatura ambiente, el pH se volvió a llevar a 7,0 añadiendo NaOH 1 N y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se utilizó a continuación NaOH para volver a llevar el pH a 7,5, se agitó la reacción 30 minutos más a temperatura ambiente y a continuación se incubó 30 minutos más después de añadir 500 \mul de DTT 1 M. Los disolventes se evaporaron al vacío y el producto se purificó por HPLC en fase inversa utilizando una columna C8 y un gradiente del 10 al 40% de acetonitrilo, 0,1% de TFA. Se sintetizó enzimáticamente biotina-GS-DNP en 100 \mul de reacción que contenía 1 \mug de GST M2-2 recombinante purificado, CDNB 500 \mum y biotina-GSH 200 \mum en KH_{2}PO_{4} 0,1 M, EDTA 1 mM, pH 6,5. La incubación se realizó durante 1 hora a 25ºC. La reacción fue esencialmente hasta la terminación interpretada siguiendo el aumento de absorbancia a 340 nm. Se llevaron a cabo también reacciones de control 1) sin nada de GST, 2) sin nada de CDNB y 3) sin nada de biotina-GSH. Se diluyeron las reacciones 200 veces (dando una concentración final de 1 \muM de biotina) en Tris-HCl 5 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,4 (tampón B/W). Se mezclaron 50 \mul de las reacciones diluidas con 50 \mul de tampón B/W que contenía 29,3 \mug (10^{8} micropartículas) micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina Sera-Mag^{TM} de 0,737 \mum de diámetro (MG-SA; Seradyn) y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Se separaron las micropartículas en una placa de microvaloración (Falcon 3911) utilizando un imán (Dynal MPC-96) y se lavaron 3 veces con Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,4 (2xtampón B/W), a continuación dos veces con PBS, 0,1% de Tween 20. Se volvieron a poner en suspensión las micropartículas en una dilución 1:2.500 del anticuerpo SPE 21-11 (cortesía del Prof. Zelig Eshhar) monoclonal antidinitrofenol de ratón en PBS/0,1% de Tween 20 y se incubó 45 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las micropartículas tres veces en PBS/0,1% de Tween 20, se volvieron a poner en suspensión en PBS/0,1% de Tween 20 que contenía 15 \mug/ml de fluoresceína (FITC) IgG antiratón de cabra fragmento F(ab')_{2} conjugado), fragmento F(ab')_{2} (Jackson; 115-096-006) y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las micropartículas cuatro veces en PS/0,1% de Tween 20, se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS/0,1% de Tween 20 y 2x10^{5} micropartículas analizadas utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Como se puede apreciar en la Figura 5, no existe ninguna diferencia en la distribución de la intensidad de fluorescencia de las perlas de las tres reacciones de control (sin GST, sin CDNB, y sin biotina-GSH), donde la fluorescencia media es \sim3. En cambio las perlas de la reacción catalizada por enzimas tienen una fluorescencia media de 34, más de 10 veces mayores. De hecho, utilizando el control representado (Fig. 5), 81,1% de las perlas de la reacción catalizada por enzimas (y recubiertas con el producto biotinilado) están en el control mientras que en las reacciones de referencia no más del 0,06% de las perlas están en control. Por consiguiente, las perlas recubiertas con el producto de la reacción catalizada por GST pueden clasificarse fácilmente de las que no lo están.
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Ejemplo 5
La glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) utilizará como sustrato glutatión biotinilado bloqueado y el producto biotinilado bloqueado generado puede posteriormente ser desbloqueado por irradiación UV, capturado sobre perlas recubiertas de avidina y detectado por citometría de flujo
La síntesis de biotina bloqueada (5) y sus derivados (7) estaba basada en los protocolos publicados (Pirrung y Huang, 1996; Sundberg et al. (1995). Sin embargo, se hicieron modificaciones significativas de estos protocolos en varias etapas de la síntesis como se describe a continuación.
Se preparó éster metílico de biotina (3, biotina-OMe) esencialmente como se describe en Sundberg et al. (1995) (véase la Fig. 6):
Alcohol metilnitropepironílico (1, MeNPOH). Se disolvió 3',4'-(metilendioxi)-6'-nitroacetofenona (Lancaster; 6,2 g., 29,6 mmoles) en una mezcla de THF (100 ml) y etanol (100 ml). Se añadió borohidruro sódico (1,12 g., 29,6 mmoles) y la solución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. La TLC (sobre placas recubiertas con sílice; disolvente-metanol al 3% en DCM) indicó la conversión total del material de partida (Rf= 0,8) en el alcohol (Rf= 0,6). Se añadió lentamente ácido clorhídrico (1N) hasta que la evolución de hidrógeno se interrumpió y los disolventes se evaporaron al vacío. El sólido residual se disolvió en DCM (500 ml) y se lavó con salmuera (40 ml). La fase orgánica se secó (sobre mgSO_{4}) y el disolvente se clasificó al vacío. La recristalización en DCM caliente y hexano dio 6,1 g de 1 (un sólido cristalino amarillo).
O-metilnitropepironil-carbonilimidazol (2, MeNPO-CO-Im)
Se añadió alcohol metilnitropiperonílico (1,69 g, 8 mmoles) (en varias porciones durante 20 minutos) a una solución de carbonilimidazol (CDI, 2,6 g, 16 mmoles) en DCM (50 ml). Se agitó al solución durante 3 h tras lo cual la TLC indicó la completa conversión del alcohol (Rf=0,6-3% de metanol en DCM) en el producto (Rf= 0,45). Se añadieron DCM (100 ml) y agua (30 ml) y la mezcla de reacción se transfirió a un embudo de clasificación. Se preparó la mezcla y se añadió (en alícuotas de 1 ml) HCl 1 N hasta que el pH de la fase acuosa fue inferior a 6. Se eliminó la fase acuosa, se añadió más agua (30 ml) y se acidificó a pH 6 mientras se mezclaba. Por último, se lavó la fase de DCM con salmuera, se secó (sobre MgSO4) y se eliminó el disolvente al vacío. El sólido restante se recristalizó en DCM caliente y hexano para dar 2,2 g de 2 (un sólido cristalino amarillo).
Éster metílico de N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina (4, MeNPO-CO-biotina-OMe). Se añadió hidruro sódico (suspensión al 60% en aceite; 100 mg, 2,5 mmoles) a una suspensión agitada de biotina-OMe (517 mg, 2 mmoles) y MeNPO-CO-Im (305 mg, 1 mmol) en DCM anhidro (10 ml) en hielo. Se agitó la solución durante 30 minutos en hielo y 30 minutos a temperatura ambiente. La TLC indicó la completa desaparición del MeNPO-CO-Im (Rf=0,6-5% de metanol en DCM) y el aspecto del producto (Rf=0,45). Vestigios de alcohol 1 (Rf=0,7), y un producto lateral con Rf=0,95 (probablemente el carbonato de di-MeNPO) se observaron también (la relación del producto frente al producto lateral anterior variaba de una preparación a otra; el secado minucioso de los materiales de partida y la realización de la reacción en hielo dio rendimientos generalmente mayores de producto).
Una vez terminada la reacción, se añadió DCM (100 ml) y se extrajo la solución tres veces con NaH_{2}PO_{4} 1 M. Se secó (MgSO_{4}) la fase orgánica y se eliminó el disolvente al vacío. El jarabe restante se disolvió en DCM caliente (aproximadamente 5 ml), hexano (aproximadamente 5 ml) se añadió en el punto de enturbiamiento y se dejó reposar la solución a 4ºC toda la noche. Esto produjo la precipitación del exceso de la biotina-OMe en forma de un sólido blanco cristalino (que se lavó con éter, se secó y se utilizó en reacciones posteriores). Se filtró el concentrado al vacío y se purificó por cromatografía sobre sílice (1,5 a 3% de metanol en DCM) para dar 4 en forma de una espuma amarilla (con rendimientos hasta de 385 mg, u 80% referidos a equivalentes molares de 2 como material de
partida).
N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina (5, MeNPO-CO-biotina-OH)
Se disolvió MeNPO-CO-biotina-OMe (940 mg; 1,73 mmoles) en 25 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; enjuagado con argón). La solución se agitó a 44ºC durante 24 horas en argón. Se redujeron los disolventes al vacío hasta aproximadamente 1 ml, se añadió agua (10 ml) y se liofilizó la mezcla resultante. Se disolvió el sólido resultante en DCM con metanol al 2% (20 ml) y se añadió carbón activo. Se hirvió la mezcla durante pocos minutos y se filtró. La TLC (10% de metanol en DCM) indicó la aparición del producto de la hidrólisis (Rf=0,2) y aproximadamente 5% del material de partida (MeNPO-CO-biotina-OMe; Rf=0,9). Se eliminaron los disolventes al vacío para dar un sólido blanco que se secó al vacío (860 mg de aproximadamente 95% de 5 más 5% de 4). Se produjeron concentraciones mayores de HCl (por ejemplo 1 N) y temperaturas mayores (por ejemplo de reflujo con THF como codisolvente) en hidrólisis completa del éster metílico. Sin embargo, se observaron también cantidades significativas de alcohol 1 y biotina, indicando la hidrólisis del carbamato en estas condiciones. Obsérvese que el éster metílico 4, y en particular el producto de su hidrólisis (5) se descubrió que era sensible a la oxidación. El calentamiento o incluso el almacenamiento de soluciones de 5 en presencia de aire produjo oscurecimiento. Asimismo, los intentos para purificar 5 (o derivados de, por ejemplo, 7) por cromatografía sobre sílice condujeron a pérdidas muy grandes debido a la oxidación.
Éster terc-butílico del ácido N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropiónico (6, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OBu^{t}). Se disolvió MeNPO-CO-biotina-OH (860 mg conteniendo \sim5% de MeNPO-CO-biotina-OMe; \sim1,6 mmoles) en 20 ml de DCM anhidro. Se añadieron sal hidrocloruro del éster terc-butílico de \beta-alanina (H-\beta-Ala-OBut) (Bachem; 362 mg; 2 mmoles), N-hidroxisuccinimida (172 mg; 1,5 mmoles) y trietilamina (280 \mul; 2 mmoles). La solución agitada se enfrió en hielo y se añadió EDCI (420 mg; 2,2 mmoles). Se agitó la reacción durante 24 horas a 4ºC y 2 horas a temperatura ambiente. La TLC (5% de metanol en DCM) indicó la aparición del producto (Rf=0,3) y el resto, MeNPO-CO-biotina-OMe sin reaccionar (Rf=0,45). Se diluyó la reacción con DCM (30 ml) y se extrajo tres veces con NaH_{2}PO_{4} 1M y una vez con NaHCO_{3} saturado. Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y se clasificó el disolvente al vacío. Se purificó el jarabe restante por cromatografía sobre sílice (3,0-4,5% de metanol en DCM) para proporcionar 640 mg de 6 (espuma amarilla).
Ácido N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropiónico (7, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH). Se disolvió éster terc-butílico 6 (510 mg; 0,84 mmoles) en 15 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; enjuagado con argón). Se agitó la solución a 52ºC durante 24 horas bajo argón. Se añadió agua (10 ml) y la solución resultante se liofilizó para dar un sólido que contenía (evaluado por TLC) el producto de la hidrólisis (7) y el material de partida (6; \sim10%). Se purificó esta mezcla por cromatografía sobre sílice (10% de metanol en acetona más 0,1% de ácido acético) para dar 60 mg de 7 (los bajos rendimientos eran principalmente el resultado de la oxidación de 7 en sílice).
N-(N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropionil)-glutatión (8, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala- GSH). Se añadió carbonildiimidazol (20 mg, 120 \mumoles) a una solución de MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH (7, 49 mg, 89 \mumoles) en DMF (1,5 ml). Se agitó la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se añadió, en varias alícuotas, a una solución de glutatión oxidado (62 mg, 100 \mumoles) y trietilamina (55 \mul, 0,4 mmoles), en DMF (2 ml) más agua (0,15 ml), se agitó en hielo. Se agitó la solución en hielo durante 30 minutos y a continuación a temperatura ambiente. Se añadió trietilamina, hasta que la solución se volvió transparente (25 \mul) y a continuación se agitó la reacción durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió a continuación DTT (0,25 ml de una solución 1M; 0,25 mmoles) y se agitó la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos.
El producto de la reacción anterior se purificó por HPLC en fase inversa, en una columna RP-8 de preparación, utilizando un gradiente de agua-acetonitrilo en presencia de 0,1% de ácido trifluoroacético. Se recogió el pico correspondiente a 8 (tiempo de retención = 28,6 minutos). Se aisló a continuación el producto por liofilización y se purificó otra vez en HPLC en fase inversa (utilizando la misma columna y el sistema de disolvente). El análisis del producto después de la segunda purificación por HPLC, utilizando HPLC en fase inversa analítica, indicó un producto (>95%) cuyo espectro UV corresponde a 8 (específicamente, \lambda^{max} a 355 nm indicó la presencia del grupo O-metilnitropiperonil-carbonilo de la biotina bloqueada). La concentración de 8 se determinó valorando los grupos tiol libres (utilizando DTNB, 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzoico), según Hermanson, 1996) procedente del glutatión, y también por absorbancia a 355 nm (correspondiente a la biotina bloqueada). Ambas mediciones independientes dieron el mismo resultado dentro del error experimental.
El producto 8 purificado se observó también que era un sustrato para M2-2 GST humana en la sustitución electrófila de CDNB (controlado por el cambio de absorbancia a 340 nm; Habig & Jakoby, 1981) con velocidades que son aproximadamente 10 veces más lentas que las observadas con glutatión en condiciones similares.
La MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH reducida (biotina-\betaala-GSH bloqueada) se hizo reaccionar con 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma) o 4-cloro-3-nitrobenzoato (CNB, Acros). El producto bloqueado generado no está unido a avidina o estreptavidina. Sin embargo, después del desbloqueo fotoquímico por radiación ultravioleta el producto presenta una biotina en un extremo que se unirá a micropartículas recubiertas con avidina o estreptavidina y un 2,4-dinitrofenol (DNP) o un grupo 3-nitrobenzoato que puede unirse por anticuerpos antiDNP o anti-3-nitrobenzoato apropiados (véanse las Figs. 7 y 8).
Se centrifugaron 5 \mul (10^{8} perlas) microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. y se eliminó el sobrenadante. Se volvieron a poner en suspensión las perlas en 5 \mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6.5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM, biotina-\betaala-GSH 10 \mum y CDNB 500 \mum o CNB 500 \mum. Los 5 \mul de mezclas de reacción contenían 0,75 \mug de GST M2-2 humana recombinante unificada o sin enzima.
Se incubaron las reacciones durante 30 min (reacciones de CDNB) o 4 horas (reacciones de CNB) a 25ºC, después de cuyo periodo se interrumpieron mediante la adición de 35 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfirieron a hielo. Cada reacción se dividió a continuación en dos alícuotas de 20 \mul cada una, una de las cuales se colocó en un punto en una capa de parafilm en la superficie de un bloque de aluminio enfriado con hilo. Este punto se irradió a continuación durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim6 cm. La otra alícuota se dejó sin irradiar. Todas las muestras se incubaron a continuación 30 min, a temperatura ambiente y a continuación se lavaron con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en una placa filtrante de 0,45 \mum MultiScreen-HV (Millipore, MAHVN4510) volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada lavado.
Se volvieron a poner en suspensión a continuación las perlas en 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 que contenía 20 ng/\mul de anticuerpo antiDNP de conejo marcado con Alexa-488 (Dako, nº V0401) 20 ng/\mul de antisuero antiCNB marcado con Alexa-488 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. El antisuero antiCNB se obtuvo en conejos por inmunización con conjugados de CNB-CH_{2}-KLH preparados añadiendo alícuotas de una solución 200 mM de ácido 4-(bromometil)-3-nitrobenzoico (CNB-CH_{2}Br) en DMF para 5 mg/ml de soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH) en borato 50 mM pH 8,8 (para dar 1,5 a 6 \mumoles de CNB-CH_{2}Br por mg de proteína). Las mezclas de reacción se agitaron durante 6 horas a temperatura ambiente y los conjugados de proteínas resultantes se dializaron exhaustivamente frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación (densidad de hapteno o Hd) se determinó midiendo las densidades ópticas de los conjugados a 355 nm. Estos se observaron que eran: 7 a 11 grupos CNB-CH_{2} por molécula de BSA y 9,4 a 24,3 por molécula de KLH dependiendo de la cantidad de CNB-CH_{2}Br añadida a las muestras de proteína. El conjugado CNB-CH_{2}KLH con Hd de 14,2 se utilizó para inmunizar conejos utilizando los protocolos publicados (Tawfik et al., 1993; Tawfik et al., 1997) (por el Prof. Z Eshhar, Weizmann Institute of Science, Rehovot). Se analizó la unión del conjugado CNB-CH_{2}BSA (Hd=11) y a BSA en los sueros por ELISA. La primera extracción de sangre de ambos conejos inmunizados (cuando se diluye 50 veces o más) presentó señal alta de rendimiento de selectividad deseable cuando se incubaba con el conjugado CNB-CH_{2}BSA y muy bajo fondo (<5%) con BSA. Se purificó el suero antiCNB utilizando una columna con proteína A HiTrap (Pharmacia). Tanto los anticuerpos antiCDNB como los antiCNB se marcaron con un kit de marcado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante.
Se lavaron las perlas tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como anteriormente, a continuación se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS, 0,1% de Tween 20 y 10.000 episodios analizados utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
Como puede apreciarse en la Fig. 9, el resto de biotina bloqueado se desbloquea en la irradiación por UV y se une a las perlas. Se observó un aumento de 19 veces en la fluorescencia media de la perla después de la reacción catalizada por GST M2-2 de biotina-\betaala-GSH bloqueada con CDNB incluso en ausencia de irradiación de UV. Esto se correlaciona con la presencia aparente de \sim4% de biotina-\betaala-GSH en la preparación de biotina-\betaala-GSH bloqueada como se determina utilizando fluorimetría para medir el desplazamiento del ácido 2-anilonaftalen-6-sulfónico (2,6-ANS) de la avidina (Mock et al., 1985). Estos resultados son coherentes con la inmovilización de fondo observada anteriormente de la biotina bloqueada a avidina "en la oscuridad" (es decir, sin iluminación de UV) que era tan alta como 15% de la señal observada después de la iluminación (Sundberg et al. 1995). La señal "oscura" observada anteriormente se asignó a contaminantes en vestigios de biotina en la preparación de biotina bloqueada, o a interacciones débiles entre la avidina y los componentes de la biotina bloqueada incluyendo el enlazador (Sundberg et al. 1995). Después de la irradiación de UV se observó una gran diferencia en la fluorescencia media de estas perlas incubadas en presencia y ausencia de GST. La fluorescencia de la perla media con GST fue 84 veces y 56 veces la observada sin GST con CDNB y CNB como sustratos respectivamente (Fig. 9).
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Ejemplo 6
Glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) compartimentada en las gotitas acuosas de una emulsión agua en aceite cataliza la reacción de glutatión biotinilado bloqueado con 4-cloro-3-nitrobenzoato (CNB). El producto biotinilado bloqueado generado permanece compartimentado y puede posteriormente ser desbloqueado por irradiación UV en los compartimentos, capturado en una perla recubierta con avidina en el mismo compartimento y las perlas recubiertas de producto detectarse por citometría de flujo
Se centrifugaron 20 \mul de alícuotas (4 x 10^{8} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no fluorescentes de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) o bolitas de poliestireno recubiertas con estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) cada una en una microcentrifugadora a 2.600 g (6.500 rpm) durante 3 min. Se eliminó el sobrenadante y las bolitas se volvieron a poner en suspensión, en hielo, en 20 \mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM, biotina-\betaala-GSH bloqueada 50 \mum, que contiene 3 \mug de GST M2-2 humana recombinante purificada o sin enzima.
Se emulsionaron a continuación seis mezclas de reacción esencialmente según Tawfik y Griffiths (1998):
a)
Perlas de Bangs, sin GST
b)
Perlas de Bangs, más GST
c)
Perlas de molecular Probes, sin GST
d)
Perlas de molecular Probes, más GST
e)
Perlas de Bangs, sin GST
f)
Perlas de molecular Probes, sin GST.
La fase aceitosa se preparó reciente disolviendo 4,5% (v/v) de Span 80 (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) de (SigmaUltra; nº P-8074). Las mezclas de reacción enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 4 \mul durante \sim 2 minutos) a 0,4 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en 5 ml de Biofreeze Vial (Costar, nº 2051) agitando con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries International, Loughborough, UK). La agitación (a 1.150 rpm) se continuó durante 1 minuto adicional en hielo.
Se añadieron 8 \mul de emulsión d) a 0,4 ml de emulsión e), y 8 \mul de emulsión b) se añadieron a 0,4 ml de emulsión f) (para proporcionar diluciones 1:50) y las mezclas de emulsión se agitaron durante 5 segundos para mezclar.
Seis mezclas de reacción se dejaron sin emulsionar:
a)
Perlas de Bangs, sin GST
b)
Perlas de Bangs, más GST
c)
Perlas de molecular Probes, sin GST
d)
Perlas de molecular probes, más GST
e)
Perlas de Bangs, sin GST
f)
Perlas de molecular Probes, sin GST.
Se añadieron 0,4 \mul de d) a 20 \mul de e), y se añadieron 0,4 \mul de b) a 20 \mul de f) (para dar diluciones 1:50).
Tanto las emulsiones como las reacciones no emulsionadas se incubaron durante 15 min a 25ºC. A continuación se añadieron 0,8 \mul de CNB 500 mM (en alcohol absoluto) a cada 0,4 ml de emulsión y se agitó la emulsión durante 5 segundos (la CNB se transfiere mediante el aceite mineral a los compartimentos acuosos). Se añadieron 5 \mul de CNB 5mM (en KH_{2}PO_{4} 0,1 M, EDTA 1 mM, pH 6,5) a las reacciones no emulsionadas.
Todas las reacciones se incubaron durante 4 horas a 25ºC.
El pH de las gotitas acuosas se redujo para enfriar la reacción catalizada por GST agitando las emulsiones con 200 \mul de aceite mineral Sigma para Biología molecular (M-5904) conteniendo 4,5% de Span 80 (Fluka), 0,5% de Tween 80 (Sigma Ultra) en aceite mineral Sigma para Biología molecular) y ácido acético 25 mM. Las reacciones no emulsionadas se enfriaron añadiendo 25 \mul de ácido acético 0,5 M. Todas las reacciones se transfirieron a una placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) flotando en agua con hielo y se irradió durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Todas las muestras se incubaron a continuación 30 min. a temperatura ambiente.
Se transfirieron las soluciones a tubos de microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min. 13,5k rpm en una microcentrifugadora y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de acetato Na 0,1 M pH 5,0 y se rompió la emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente al vacío en un Speedvac (Farmingdale, NY).
Todas las muestras se lavaron a continuación tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada lavado. Las perlas se volvieron a poner en suspensión a continuación en 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20. Se añadieron a continuación 25 \mul (\sim5 x 10^{7} perlas) a 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 que contenía 20 ng/\mul de anticuerpo antiDNP marcado con Alexa-488 o anticuerpo antiCNB marcado con Alexa-488 (véase el Ejemplo 5) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como anteriormente, a continuación se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS, 0,1% de Tween 20 y 300.000 casos analizados utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
En las mezclas no emulsionadas, en las que ni GST ni el producto de la reacción catalizada por GST, (biotina-\betaAla-NB bloqueada) estaban compartimentados, todas las perlas tienen una fluorescencia igualmente baja (Fig. 10, paneles B y D). En cambio, en las mezclas de la emulsión, donde tanto GST como el producto de la reacción catalizada por GST, (biotina-\betaAla-NB bloqueada) estaban compartimentados, dos poblaciones de perlas, una de baja fluorescencia y otra de mayor son obviamente visibles (Fig. 10, paneles C y E). El control mediante R1 y R2 permite a las perlas de Bangs y de molecular Probes estar muy separadas basándose en sus características de difusión de la luz ligeramente diferentes (Fig. 10, panel A). La proporción de perlas Bangs a molecular Probes que pasan a través de R1 es del 68%:0,1% y la proporción que pasan a través de R2 es de 0,08%:87%. Utilizando estos controles es evidente que las perlas con alta fluorescencia son las que estaban compartimentadas con la enzima GST. Por consiguiente la compartimentación de las perlas, de la enzima y del producto de reacción se obtuvo por emulsificación y las perlas presentes en los compartimentos que contenían enzimas pueden distinguirse de las que no por sus características de fluorescencia.
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Ejemplo 7
GST M2-2 humana puede transcribirse y traducirse in vitro en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite y cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas cocompartimentadas
La glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) humana que codifica el gen se amplía por PCR utilizando los oligonucleótidos GSTM2-2Fo y GSTM2-2Bc de un clon de ADNc de GST M2-2 humano en el pGEM-3Z (Baez et al., 1997). El fragmento de la PCR se clona en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y KpnI corriente abajo del activador lac y del activador de T7 ARN-polimerasa. El oligonucleótido GSTM2-2Bc se añade a la secuencia de partida de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz del codón de iniciación del gen de metiltransferasa. El secuenciado del ADN identifica un clon con la secuencia nucleotídica correcta, denominado pGEM-hGSTM2-2. El plásmido pGEM-hGSTM2-2 descrito anteriormente se amplía por PCR utilizando los cebadores LMB2 y LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de 826 pares de bases (GSTM2-2.LMB2-3) que lleva el activador de T7 ARN-polimerasa, la secuencia de partida de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen GST. El fragmento de la PCR se purifica directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).
Se centrifugaron 60 \mul de alícuotas (1,2 x 10^{9} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no fluorescentes de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. Se eliminó el sobrenadante y las perlas se volvieron a poner a suspensión, en hielo, en 60 \mul de un sistema de transcripción/traducción procariótico acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley et al., 1991). Una preparación comercial de este sistema se utiliza (E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega) enriquecido con ácido acético 12,5 mM (para reducir el pH hasta \sim7,0), T7 ARN-polimerasa (2.000 unidades), 12,5 \mug/ml de digesto \lambda ADN-HindIII (New England Biolabs), biotina-\betaala-GSH bloqueada 50 \mum, y, opcionalmente, GSTM2-2.LMB2-3 ADN 5 nM o 5,0 \mug de GST M2-2 humano recombinante purificado por 50 \mul (o ninguno de los dos).
Se eliminó una alícuota de 5 \mul de cada mezcla de reacción y se dejó sin emulsionar. 50 \mul de la mezcla de reacción restante se emulsionaron esencialmente según Tawfik y Griffiths (1998).
La fase aceitosa se preparó reciente disolviendo 4,5% (v/v) de Span 80 (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) (SigmaUltra; nº P-8074). Las mezclas de reacción enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en un vial de 5 ml Biofreeze (Costar, nº 2051) mientras se agita con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries International, Loughborough, UK). La agitación (a 1.150 rpm) se continuó durante 1 minuto adicional en hielo.
Tanto las emulsiones como las reacciones no emulsionadas se incubaron durante 45 min a 25ºC para dejar que continúe la traducción. A continuación se añadieron 5 \mul de 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) 100 mM (en etanol absoluto) a cada 1,0 ml de emulsión y la emulsión se agitó durante 5 segundos (el CDNB se transfiere a través del aceite mineral a los compartimentos acuosos). Se añadió 1,0 \mul de CDNB 2,5 mM (en agua) a las reacciones no emulsionadas. CDNB inhibe la traducción in vitro y añadiéndolo de esta manera, una vez terminada la traducción, maximiza el rendimiento de GST.
Todas las reacciones se incubaron durante 30 mins. a 25ºC. El pH de las gotitas acuosas se redujo a continuación para enfriar la reacción agitando las emulsiones con 500 \mul de aceite mineral Sigma para Biología molecular (M-5904) que contenía 4,5% de Span 80 (Fluka), 0,5% de Tween 80 (Sigma Ultra) en aceite mineral Sigma para Biología molecular) y ácido acético 25 mM. Se enfriaron las reacciones no emulsionadas añadiendo 5 \mul de ácido acético 0,5 M y 20 \mul de acetato Na 0,1M, pH 5,0.
Todas las reacciones se transfirieron a una placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) flotando en agua con hielo y se irradió durante 2 min. con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Toda las muestras se incubaron a continuación 30 mins. a temperatura ambiente.
Se transfirieron las emulsiones a tubos de microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min. a 13,5k rpm en una microcentrifugadora y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de acetato Na 0,1 M pH 5,0 y se rompió la emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente al vacío en una Speedvac (Farmingdale, NY).
Aproximadamente 5 x 10^{7} perlas de las emulsiones rotas y de las reacciones no emulsionadas se lavaron a continuación tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión a fondo entre cada lavado. Las perlas se volvieron a poner en suspensión a continuación en 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 que contenía 10 ng/\mul de anticuerpo antiDNP marcado con Alexa-488 (véase el Ejemplo 5) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como antes, a continuación se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS, 0,1% de Tween 20 y 10.000 casos analizados que utilizan un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).
Como puede apreciarse en la Fig. 11, tanto en las reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la reacción catalizada por GST M2-2 traducida in vitro produce unas perlas con mayor fluorescencia que cuando no había ninguna enzima presente. Esta diferencia en la fluorescencia no sería suficiente, sin embargo, para la clasificación eficaz activada por fluorescencia (FACS). Sin embargo, las perlas tanto de las reacciones emulsionadas como no emulsionadas que contienen 5,0 \mug de GST M2-2 recombinante purificado por 50 \mul eran aún más fluorescentes que las que contenían GST M2-2 traducida in vitro que permite el enriquecimiento eficaz de estas perlas por FACS a partir de las incubadas en ausencia de GST. Esto simula la situación cuando un GST mutante de mayor actividad que el natural se traduce in vitro.
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Ejemplo 8
Genes acoplados a microperlas se expresan in vitro y el producto génico resultante (una enzima) se une a las microperlas conservando la actividad catalítica
Un formato para la selección de elementos genéticos es aquel que el elemento genético comprende un gen ligado a una microperla, que se traslada en una microcápsula, y el producto génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos (por ejemplo, proteínas o enzimas) acoplados al gen que les codifica. Estos complejos podrían seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el Ejemplo 12) o para actividad enzimática mediante una segunda reacción compartimentada.
En la presente memoria se demuestra, que una enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y traducirse in vitro en los genes unidos a microperlas y la enzima traducida se vuelve a unir a las microperlas. Los inventores también demuestran que la enzima traducida puede modificarse, montarse o complementarse con un único factor mientras que está unida en las perlas, en este ejemplo, los iones metálicos se añaden a la apo-enzima para dar una metaloenzima activa. Además, se demuestra en la presente memoria que la actividad catalítica de la enzima se conserva mientras está unida a la microperla junto con el gen que la codifica.
El gen opd que codifica una fosfotriesterasa (PTE; conocida también como paraoxón hidroxilasa; Mulbry & Karns, 1989) se amplía a partir de la cepa ATCC 27551 de Flavobacterium sp. por PCR utilizando un cebador delantero que se añade a los codones de terminación y una secuencia EcoRI (OPD-Fo; véase la Tabla 1) y un cebador trasero que se añade a la secuencia de transición (RBS) del gen 10 del fago T7 y una secuencia de clonación HindIII (OPD-Bc). Este ADN se clona en el pGEM-4Z utilizando las secuencias HindIII y la EcoRI corriente abajo del activador de la T7 ARN-polimerasa. El secuenciado del ADN identifica un clon que tiene la secuencia nucleotídica correcta. Se descubrió que las bacterias (E. coli, TG1) transformadas con este clon (Gem-OPD) sobreexpresan la PTE activa cuando crecen en presencia de cloruro de cobalto y se inducen con IPTG (Omburo et al., 1992).
El gen OPD se clona también con un péptido Flag^{TM} (Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; Sigma-Aldrich) añadido a su terminal N. El gen OPD es la cepa ATCC 27551 de Flavobacterium sp. ampliada por PCR utilizando un cebador delantero (N-Flag-OPD-Fo) que añade los codones de terminación y una secuencia KpnI, y un cebador trasero (N-Flag-OPD-Bc) que añade una secuencia NcoI, un péptido Flag y un enlazador corto entre el péptido Flag y el marco de lectura OPD. El fragmento de ADN resultante se clona en el plásmido pGEM-4Z^{Ncol} (utilizando las secuencias KpnI y Nco). El pGEM-4Z^{Ncol} es una modificación de p-GEM-4Z en la que, la secuencia de transición (RBS) del gen 10 del fago T7 y el codón de iniciación de ATG se añaden corriente abajo al activador de T7 ARN de polimerasa, para crear una secuencia NcoI que permite la clonación de marcos de lectura en el contexto de la RBS y el codón ATG. La secuencia de la sección incorporada en el pGEM-4Z (entre las secuencias HindIII y la KpnI corriente abajo del T7 ARN polimerizan el activador), para dar pGEM-4Z^{Ncol}, según se indica en el esquema I.
El resto del pGEM-4Z, incluyendo las secuencias de clonación KpnI y EcoRI, permaneció intacto.
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Esquema I
1
El secuenciado de ADN identifica un clon que tiene la secuencia nucleotídica correcta. Se observa que las bacterias transformadas con este clon (Gem-N-Flag-OPD) sobreexpresan una PTE activa cuando crece en presencia de cloruro de cobalto y se induce con IPTG.
Los plástidos gem-OPD y gem-N-Flag-OPD descritos anteriormente se amplían por PCR, utilizando los cebadores LMB2-biotina y LMB3, para crear fragmentos de ADN (OPD.LMB3-2biotina y N-Flag-OPD.LMB3-2biotina, respectivamente) que llevan el T7 ARN polimerizan el promotor, el punto de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y el OPD o los genes de N-Flag-OPD y se marcan con biotina en el terminal 3'. Los fragmentos por PCR se purifican directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).
Las alícuotas de una suspensión de microesferas marcadas con estreptavidina no fluorescente de 0,95 \mum (Bangs, \sim2x10^{7} perlas por \mul de suspensión) se centrifugan en una microcentrifugadora a 10.000 g (13.500 rpm) durante 3 min. Se elimina el sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en suspensión en tampón TNT (Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%). Un anticuerpo que es capaz de unir los péptidos Flag amino-terminales y está marcado por biotinilación (BioM5, un anticuerpo antiFlag marcado con biotina; Sigma) se añade a las suspensiones de las perlas a una media de 4x10^{4} moléculas de anticuerpo por perla. La mezcla resultante se incuba durante varias horas con mezclado ocasional. Las perlas se enjuagan dos veces por centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en tampón TNT. Los fragmentos de ADN biotinilados (fragmentos OPD.LMB3-2biotina, N-Flag-OPD.LMB3-2biotina, o fragmentos que llevan el T7 ARN polimerizan el promotor, la secuencia de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 y un gen que codifica una enzima diferente que está también activado con el péptido N-Flag, por ejemplo metiltransferasa HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina) se añaden a una suspensión de perlas recubiertas de anticuerpo y la mezcla se incuba durante la noche a 4ºC. Las perlas se enjuagan tres veces por centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en tampón TNT.
Las alícuotas de 50 \mul de la suspensión anterior de perlas (\sim10^{9} perlas) se centrifugan en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. Se retira el sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en suspensión suavemente, en hielo, en 50 \mul de un sistema procariótico de transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley et al., 1991). Se utiliza una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7 RNA polimerasa (2.000 unidades). Se incuban las reacciones a 25ºC durante 1,5 horas y se centrifuga en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 minutos. El sobrenadante se retira y las perlas se vuelven a poner en suspensión en 100 \mul de Tris 50 mM, 10 mM de carbonato potásico, pH 8,0. Una solución acuosa de cloruro de cobalto se añade a una concentración de 1 mM y las reacciones se incuban durante varias horas a temperatura ambiente (o durante la noche a 4ºC). Las perlas se enjuagan 4 veces por centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en tampón TNT.
Las alícuotas de las perlas anteriores se añaden a una solución de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM pH 8,3. Las perlas se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante periodos ocasionales. Las perlas se centrifugan en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min, se clasifica el sobrenadante y se mide su densidad óptica a 405 nm. No se observa un cambio significativo en la densidad óptica, en comparación con la densidad óptica observada en las mismas condiciones en ausencia de perlas o de fosfotriesterasa, cuando se unen las perlas a las que se acoplan fragmentos de ADN biotinilado OPD.LMB3-2biotina o N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina (y se hacen reaccionar posteriormente como se describió anteriormente) se incuban con Paraoxon. Sin embargo, se observa un cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las perlas a las que están acoplados fragmentos de ADN biotinilados N-Flag-OPD.LMB3-2biotina (y se hacen reaccionar posteriormente como se describió anteriormente) se incuban con Paraoxon. Por ejemplo, cuando se añaden fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina a una concentración de 1 nM (a una suspensión de perlas de 50 \mul (\sim10^{9} perlas) que se vuelve a poner en suspensión a continuación en 50 \mul de transcripción/traducción in vitro) y se hace reaccionar como se describió anteriormente, el cambio en la densidad óptica observado después de 3 horas corresponde a más del 50% de hidrólisis de Paraoxon (a 0,25 mM en un volumen de reacción de 50 \mul). De este modo, las microperlas que transportan un gen que codifica una proteína con la actividad catalítica deseada (fosfotriesterasa en el ejemplo anterior) pueden distinguirse claramente de las microperlas que llevan genes que no codifican una proteína con la actividad catalítica deseada (metiltransferasa HaeIII en el ejemplo anterior). Además, no se observa casi ningún cambio en la densidad óptica a 405 nm cuando fragmentos de ADN biotinilados N-Flag-OPD.LMB3-2biotina se unen a las perlas y se hacen reaccionar como se describió anteriormente, excepto que no se añade cloruro de cobalto a las perlas de nuevo en suspensión después de la transcripción/traducción.
Estos resultados demuestran que una enzima (fosfotriesterasa) puede transcribirse y traducirse in vitro en genes que codifican esta enzima y están unidos a las microperlas. Cuando los genes que codifican una etiqueta (un péptido Flag con terminal N en el ejemplo anterior) la enzima traducida se vuelve a unir a las microperlas a las que están acoplados los genes. Si fuera necesario, la enzima traducida puede modificarse entonces mientras que permanece acoplada a las microperlas (junto con el gen que la codifica) en este ejemplo. Se añaden iones cobalto para dar una metal-enzima reactiva. Estos resultados también indican que la enzima está catalíticamente activa mientras que está unida a las microperlas junto con el gen que la codifica.
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Ejemplo 9
Una enzima cataliza una reacción con un sustrato biotinilado bloqueado, y el producto biotinilado bloqueado generado se desbloquea por irradiación UV y está capturado en microperlas recubiertas de estreptavidina. Posteriormente estas perlas son detectadas por citometría de flujo
Un formato para la selección de elementos genéticos es aquel que el elemento genético comprende un gen unido a una microperla, que es trasladada en una microcápsula, y el producto génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos (por ejemplo, proteínas o enzimas) acoplados al gen que les codifica. Estos complejos podrían seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el Ejemplo 12), o para la actividad enzimática mediante una segunda reacción compartimentada.
Sin embargo, para dichos complejos que van a seleccionarse para la actividad catalítica, un sustrato soluble estaría disponible para la enzima inmovilizada, y, una vez se ha terminado la reacción catalítica, el producto de la actividad enzimática que se está seleccionando llegaría a acoplarse con el gen que codifica esta enzima. Los complejos resultantes se pudieron clasificar o seleccionar a continuación en virtud del producto que está uniéndoles, por ejemplo utilizando un anticuerpo marcado con fluorescencia que reconoce el producto. En otros compartimentos, que contienen complejos de genes y productos génicos que no codifican proteínas con la actividad enzimática deseada, el sustrato sin reaccionar llegaría a unirse al gen. Estos complejos no estarán marcados con el producto y por consiguiente se descargarán. En la presente memoria se demuestra que una enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede reaccionar con un sustrato biotinilado bloqueado en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina. El producto biotinilado bloqueado generado puede ser desbloqueado a continuación por irradiación UV y ser capturado en perlas recubiertas con avidina. Posteriormente, estas perlas se detectan por citometría de flujo y se distinguen claramente de las perlas incubadas con un sustrato
\hbox{biotinilado bloqueado en presencia de otras 
enzimas o proteínas que no presentan actividad de
fosfotriesterasa.}
Un sustrato biotinilado bloqueado para PTE (EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada; Fig. 12) se sintetiza de la manera siguiente:
Boc-5-aminopentanol: Se añade dicarbonato de di-terc-butilo (20,8 g; 0,095 moles) a una solución agitada de 5-aminopentanol (10,37 g; 0,1 moles) en diclorometano (DCM) (200 ml) sobre hielo. Después de la adición, la solución se vuelve turbia y se separa un jarabe. Se añade trietilamina (13,8 ml; 0,1 moles) en perlas, y la solución resultante se agita durante 10 minutos en hielo y a continuación durante la noche a temperatura ambiente. Se retiran los disolventes al vacío, el jarabe resultante se disuelve en acetato de etilo (500 ml), se extrae 3 veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado, y por último con salmuera, y a continuación se seca sobre MgSO_{4}. Se retiran los disolventes al vacío y el jarabe resultante (después de secado exhaustivo al vacío en presencia de hidróxido potásico), comprendía principalmente Boc-5-aminopentanol, se utiliza sin purificación adicional.
(11) Se añade perla a perla trietilamina (3 ml; 22 mmoles) a una solución agitada de fosfodicloridato de p-nitrofenilo (5,15 g; 20 mmoles) y etanol (1,15 ml, 20 mmoles) enfriado en hielo en acetona, en 30 minutos. La solución se deja calentar lentamente hasta la temperatura ambiente y se agita durante 90 minutos adicionales. Se añade a continuación perla a perla una solución de Boc-5-aminopentanol (4,3 g; aproximadamente 20 mmoles) y trietilamina (3 ml; 22 mmoles) en DCM (20 ml). La reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añade 1H-tetrazol (0,35 g; 5 mmoles) y la reacción se agita durante otras 2 horas. Se añade DCM (100 ml) y se extrae 3 veces la solución con Na_{2}HPO_{4} 1M (pH 4), NaHCO_{3} saturado, y por último con salmuera, y a continuación se seca sobre mgSO_{4}. Se retiran los disolventes al vacío para dar un jarabe que se purifica por cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: 1% a 2% de metanol en DCM) para dar 3,52 g de 11 (un jarabe).
Éster de N-hidroxi-succinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico: Se añade diciclohexildicarbodiimida
(DCC; 5,15 g; 25 mmoles) a una suspensión agitada de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (Tiger, Monmouth NJ; 5,2 g; 25 mmoles) y N-hidroxi-succinimida (2,88 g; 25 mmoles) en DCM (200 ml) más acetonitrilo (20 ml). Se agita la reacción durante la noche a 4ºC y a continuación 3 horas a temperatura ambiente. El precipitado de diciclohexil-urea se elimina por filtración, y el filtrado se concentra al vacío para dar un jarabe. El jarabe se disuelve en cloroformo y DCM y se trata con carbón activo. La adición de éter da un sólido blanco cristalino. La recristalización en DCM y éter de petróleo da 6,2 g del éster de N-hidroxi succinimida de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico.
(12) Se añade a ácido trifluoroacético (TFA; 4 ml) a una solución de 11 (900 mg; 2,07 mmoles) en DCM (5 ml). La solución se deja a temperatura ambiente durante 45 minutos y los disolventes se eliminan al vacío. El jarabe residual se disgrega disolviéndolo en DCM y metanol y añadiendo éter. El 12 resultante (como sal de TFA; jarabe) se seca al vacío en presencia de hidróxido potásico, y a continuación se hace reaccionar inmediatamente sin purificación adicional (véase a continuación).
(13) Se añaden éster de N-hidroxi succinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (670 mg; 2,2 mmoles) y trietilamina (0,345 ml; 2,5 mmoles) a 12 (véase anteriormente) en DCM (15 ml). Se agita la solución durante 30 minutos, se añade trietilamina (0,1 ml; 0,72 mmoles) y se agita la solución durante 3 horas más. Se añade DCM (20 ml), y se extrae dos veces la solución con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3}, saturado, y por último con salmuera, y a continuación se seca sobre mgSO_{4}. Se eliminan los disolventes al vacío para dar un jarabe que se purifica por cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 5% en DCM) para dar 0,86 g de 13 (un jarabe).
(14) Se tratan 0,84 g de 13 (1,6 mmoles) con TFA como se describió anteriormente para proporcionar 14 (como sal de TFA; jarabe) que se hace reaccionar inmediatamente tal como se describe a continuación.
(15) Se añaden a 14 (véase anteriormente) Boc-Glu(OSu)-OBu^{t} (Bachem; 641 mg; 1,6 mmoles) y trietilamina (0,235 ml; 1,7 mmoles) en DCM (15 ml). Se agita la solución durante 1 hora, se añade trietilamina (60 \mul; 0,43 mmoles) y la solución se agita durante 1 hora. Se añade DCM (20 ml), y se extrae dos veces la solución con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3}, saturado, y por último con salmuera, y a continuación se seca sobre mgSO_{4}. Se eliminan los disolventes al vacío para dar un jarabe que se purifica por cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: 7% de metanol en DCM) para dar 0,8 g de 15 (sólido blanco cristalino).
EtNP-Bz-Glu (16): Se disuelven 0,4 g de 15 (0,56 mmoles) en DCM (5 ml) y TFA (5 ml). La solución se agita durante 1 hora a temperatura ambiente, y los disolventes se eliminan al vacío. El jarabe residual se cristaliza disolviéndolo en metanol y añadiendo éter. La recristalización (en metanol y éter) da 200 mg de 16 (como sal de TFA; sólido blanco).
EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada (17): Se añade carbonildiimidazol (6 mg, 37,5 \mumoles) a una solución de MeNPO-CO-biotina-OH (5, 17 mg, 35 \mumoles) en DMF (1 ml). Se agita la solución durante 60 minutos a temperatura ambiente y se añade a 16 (20 mg, 30 \mumoles). Se añaden trietilamina (5,5 \mul, 40 \mumoles), DMF (1 ml) y agua (0,5 ml) a una mezcla de reacción agitada hasta que se vuelve transparente. Se agita la solución durante 2 horas a temperatura y se almacena a -20ºC.
El producto de la reacción anterior se purifica por HPLC en fase inversa en una columna de preparación C8 utilizando un gradiente de agua-acetonitrilo en presencia de 0,1% de ácido trifluoroacético. Se recoge el pico correspondiente a 17 (tiempo de retención = 23,1 minutos). Se aísla el producto por liofilización como un sólido amarillo. El análisis del producto después de la purificación por HPLC utilizando HPLC en fase inversa analítica indicó un producto mayoritario (>80%), cuyo espectro UV corresponde a 17. Específicamente, \lambda^{max} a 355 nm indica la presencia del grupo O-metilnitropiperonil-carbonilo de la biotina bloqueada (Pirrung & Huang, 1996), y un "hombro" a 277 nm, ausente en biotina bloqueada, indica la presencia del éster de fosfato de p-nitrofenilo de 17. La concentración de 17 se verifica hidrolizando el éster de fosfato de p-nitrofenilo en hidróxido potásico 0,1 M y determinando la cantidad de p-nitrofenol liberado (densidad óptica a 405 nm).
Se observa también que el 17 purificado es un sustrato para llevar PTE a la liberación de p-nitrofenol (Fig. 13; controlado por el cambio en la densidad cambia a 405 nm) con velocidades que son sólo aproximadamente 6 veces más lentas que las observadas con Paraoxon. Principalmente, a diferencia de la hidrólisis catalizada por bases de 17 que continúa hasta la terminación (y la hidrólisis catalizada por PTE de Paraoxon), la hidrólisis catalizada por PTE de 17 procede a velocidades significativas solamente hasta que la mitad del sustrato se ha hidrolizado. La segunda mitad del sustrato pudo hidrolizarse también, pero solamente en presencia de cantidades mucho más mayores de PTE y después de largas incubaciones (varias horas hasta toda la noche). Esto se debe probablemente al hecho de que 17 está compuesto de dos diastereómeros (correspondiente a dos enantiómeros con respecto al fosfotriéster quiral), sólo uno de los cuales es un sustrato eficaz para la enzima. De hecho, se observó estereoselectividad anteriormente con PTE y otros fosfotriésteres quirales (Hong y Raushel, 1999).
Se generan anticuerpos que reconocerían etil-fosfodiésteres que son los productos de hidrólisis de los correspondientes fosfotriésteres de p-nitrofenilo. Con este fin, se sintetiza un derivado adecuado de etilfosfodiéster y se conjuga con proteínas portadoras como se describe a continuación (Fig. 14).
EtNPBG (18). Se añaden anhídrido glutárico (180 mg; 1,6 mmoles) y trietilamina (0,22 ml; 1,6 mmoles) a 12 (preparado por desprotección de 1,6 mmoles de 11, como se describió anteriormente) en DCM (15 ml). Se agita la solución durante 20 minutos, se añade trietilamina (0,12 ml; 0,85 mmoles), y se agita la solución durante 1 hora más. Se añade DCM 820 ml), y se extrae la solución dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M y a continuación se seca sobre mgSO_{4}. Se eliminan los disolventes al vacío para dar un jarabe que se purifica por cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: 12,5% de metanol en DCM más 0,1% de ácido acético) para dar 445 mg de 18 (un jarabe).
El sustrato conjuga EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH. Se añade carbonildiimidazol (CDI; 32 mg, 200 \mumoles) a una solución de 18 (60 mg, 134 \mumoles) en DMF (1 ml). Se agita la solución durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añaden a continuación alícuotas del 18 activado hasta 5 mg/ml de soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH) en fosfato 0,1 M pH 8,0 (a razón de 0,5 hasta 4 \mumoles de 18 por mg de proteína). Se agitan las reacciones durante 1 hora a temperatura ambiente, y los conjugados de proteína resultantes se dializan exhaustivamente frente a la solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación (densidad de hapteno o Hd) se determina hidrolizando una muestra de los conjugados dializados en hidróxido potásico en 0,1 M y controlando la cantidad de p-nitrofenol liberado (a 405 nm). Se ha observado que es: 8,5 a 24 moléculas de EtNPBG por molécula de BSA y 14 a 63 por molécula de KLH dependiendo de la cantidad de 18 activado añadida a las muestras de proteína.
El producto conjuga EtBG-KLH y EtBG-KLH. Los conjugados de EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH descritos anteriormente se dializan frente a carbonato 0,1 M pH 11,8 durante 44 horas a temperatura ambiente, y a continuación exhaustivamente frente a PBS (a 4ºC).
Se obtuvieron anticuerpos antiEtBG en conejos por inmunización con EtBG-KLH (Hd=14) utilizando los protocolos publicados (Tawfik et al., 1993; Tawfik et al., 1997) (donación del Prof. Z Eshhar, Weizmann Institute of Science, Rehovot). Se analiza la unión en los sueros por ELISA tanto en el conjugado de sustrato EtNPBG-BSA (Hd=8,5) como en el conjugado de producto correspondiente (EtBG-BSA; Hd=8,5). La primera extracción de sangre de uno de los conejos inmunizados (cuando se diluye 500 veces o más) presenta la selectividad deseable, dando alta señal cuando se incuba con el conjugado del producto y un fondo bajo (<20%) con el conjugado del sustrato. Diluyendo los sueros en tampón COVAp (NaCl 2 M, 1 mgSO_{4}\cdot7H_{2}O, Tween-20 al 0,04%, fosfato 10 mM, p-nitrofenol 0,1 mM, pH 6,5) aumenta más la selectividad, con niveles de fondo que inferiores al 5%. El suero antiEtBG se purifica utilizando una columna con proteína A HiTrap (Pharmacia). Los anticuerpos de conejo purificados se marcan con un kit de marcado con la proteína Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante.
Se centrifugan 10 \mul (\sim2 x 10^{8} perlas) de microperlas de 0,95 \mum recubiertas con estreptavidina (Bangs, \sim2x10^{7} perlas por \mul de suspensión) en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 minutos y se elimina el sobrenadante. Las perlas se vuelven a poner en suspensión en 10 \mul de Tris 50 mM pH 8,3 que contiene EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada (17) para dar una concentración final de 10 \muM, 20 \muM o 30 \muM. Se expresa PTE in vitro por transcripción/traducción de fragmentos de ADN de OPD.LMB3-2biotina (a 5 nM). Se utiliza una preparación comercial (Sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecida con T7 ARN polimerasa (2.000 unidades) y se incuban las reacciones a 25ºC durante 1,5 horas. La PTE se monta a continuación mediante adición de carbonato potásico (10 mM) y cloruro de cobalto (1 mM) en tampón Tris (10 mM, pH 8,0) y se incuba durante la noche a 4ºC. Otra enzima, que no presenta actividad de fosfotriesterasa, la metiltransferasa HaeIII, es expresada también in vitro por transcripción/traducción de los fragmentos de M.HaeIII.LMB3-2biotina (a 5 nM), y a continuación se trata con carbonato y cobalto como con la PTE. Se añaden 5 \mul de alícuotas de las mezclas de reacción anteriores a las suspensiones de perlas y se incuban las reacciones durante 1 hora a 25ºC en la oscuridad. Se interrumpe la reacción mediante la adición de 15 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfiere a hielo. Cada reacción se divide a continuación en dos alícuotas de 15 \mul cada una, una de las cuales se coloca como un punto en una capa de parafina sobre la superficie de un bloque de aluminio enfriado con hielo. Esta alícuota se irradia a continuación durante 2 min con una lámpara UV de B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim6 cm. La otra alícuota se deja en la oscuridad. Todas las muestras de perlas se incuban a continuación durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavan tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada lavado. Se vuelven a poner en suspensión a continuación las perlas (\sim2 x 10^{7}) en 200 \mul de COVAp que contiene 100 ng/\mul de anticuerpos antiEtBG de conejo marcados con Alexa-488 y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente y a continuación 1 hora a 4ºC. Se lavan tres veces las perlas con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como anteriormente, a continuación se vuelven a poner en suspensión en 1 ml de PBS, 0,1% de Tween 20 y 10.000 casos analizados utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
Como puede apreciarse en la Fig. 15, se observa hasta un aumento de 20 veces en la fluorescencia media de las perlas después de la hidrólisis catalizada por PTE de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina y después de irradiación con UV. Este aumento se observa en comparación con las perlas tratadas esencialmente las mismas pero en presencia de otra enzima (M.HaeIII), sin actividad de fosfotriesterasa. Principalmente, las diferencias en la señal de fluorescencia se observan cuando tanto PTE como M.HaeIII, se expresan in vitro en los genes correspondientes y se añaden juntos con el contenido completo de la mezcla de reacción de transcripción/traducción in vitro.
A altas concentraciones de sustrato la fluorescencia media observada es inferior a la observada a 20 \muM. Además a concentraciones del sustrato superiores a 20 \muM, no existe esencialmente diferencia en la señal de fluorescencia entre las reacciones mantenidas en la oscuridad y las irradiadas con UV (datos no mostrados). Ya que las perlas, en las condiciones de reacción descritas anteriormente, comienzan a presentar saturación de la señal de unión a concentraciones superiores a 10 \muM (de productos detectados por la adición ulterior de anticuerpos antiEtBG marcados con fluorescencia), estos resultados pueden explicarse por la presencia de una contaminación de ETNP-Bz-Glu-biotina en la preparación de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada. Estos resultados son también coherentes con la inmovilización del fondo observada anteriormente de biotina bloqueada a avidina "en la oscuridad" (es decir, sin iluminación UV) que era tan alta como el 15% de la señal observada después de la iluminación (Sundberg et al. 1995). La señal "oscura" observada anteriormente se atribuyó a vestigios de contaminantes de biotina en la preparación de biotina bloqueada, o a las interacciones semanales entre avidina y los componentes de la biotina bloqueada incluyendo el enlazador (Sundberg et al. 1995). Ambos mecanismos pueden explicarse por el hecho de que a altas concentraciones de sustrato bloqueado biotinilado (y por encima de la capacidad de fijación de las perlas), la señal "oscura" se vuelve significativa. No obstante, a concentraciones de sustrato de 20 \muM, o inferiores, la señal "oscura" constituye solamente el 25%, o incluso menos del 10% (por ejemplo, a 10 \muM de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada) de la señal iluminada. Esto indica que la mayor parte de la hidrólisis catalizada por PTE de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada se produce mientras la sustancia está en la solución y no unida a las perlas, y que el producto resultante (Et-Bz-Glu-Biotina bloqueada), después de la iluminación con luz UV, está desbloqueado y llega a inmovilizarse en las microperlas.
Ejemplo 10
Genes acoplados a perlas se expresan in vitro y los productos génicos (enzimas) resultantes llegarán a inmovilizarse en las microperlas mientras que se conserva la unidad catalítica. La enzima inmovilizada cataliza una reacción con un sustrato biotinilado bloqueado, y el producto biotinilado bloqueado resultante se desbloquea ulteriormente por irradiación UV y llegará a unirse a estas perlas junto con el gen que codifica la enzima que conduce a su formación. Posteriormente, estas perlas se detectan por citometría de flujo
Un formato para la clasificación de elementos genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen unido a una microperla, que se traslada en una microcápsula, y el producto génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos (por ejemplo, proteínas o enzimas) acopladas al gen que los codifica. Estos complejos podría seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase Ejemplo 12), o para actividad enzimática o mediante una segunda reacción compartimentada.
Para que dichos complejos se seleccionen para la actividad catalítica, debería estar disponible un sustrato soluble para la enzima inmovilizada, y, una vez terminada la reacción catalítica, el producto de la actividad enzimática que se está seleccionando llegará a unirse al gen que codifica esta enzima. Los complejos resultantes podrían clasificarse o seleccionarse a continuación en virtud del producto que está uniéndose a ellos, por ejemplo utilizando un anticuerpo marcado con fluorescencia que reconoce el producto. En otros compartimentos, que contienen complejos de genes y productos génicos que no presentan la actividad enzimática deseada, el sustrato no reactivo llegará a unirse al gen. Estos complejos no estarán marcados con el producto y por consiguiente se descartarán.
En la presente memoria se demuestra que una enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y trasladarse in vitro desde los genes acoplados a microperlas y la enzima trasladada se vuelve a unir a las microperlas. La enzima trasladada puede modificarse a continuación para incorporar el cobalto de la zona activa, y su actividad catalítica se conserva a la vez que se une a la microperla junto con el gen que le codifica. El PTE inmovilizado reacciona posteriormente con un sustrato bloqueado biotinilado, y el producto bloqueado biotinilado generado se desbloquea por irradiación con UV y se captura en las mismas perlas recubiertas con avidina a las que se acopla el gen que codifica la PTE. Posteriormente estas perlas se detectan por citometría de flujo y se distinguen claramente de las perlas que llevan un gen que codifica una proteína que no presenta actividad de fosfotriesterasa.
Las alícuotas de una suspensión de microesferas de 0,95 \mum recubiertas con estreptavidina (Bangs, \sim2x10^{7} perlas por \mul de suspensión) se centrifugan en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se retira y las perlas se vuelven a poner en suspensión en tampón de TNT (Tris 7,5 0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%). Un anticuerpo, capaz de unir el péptido Flag y biotinilado (BioM5, un anticuerpo antiFlag marcado con biotina, Sigma) se añade a la suspensión de perlas para dar una media de 10^{4} moléculas de anticuerpos por perla y la mezcla se incuba durante varias horas. Las perlas se enjuagan por centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en tampón TNT hasta el volumen original. Los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina, o los fragmentos que transportan el activador de T7 ARN polimerasa, la secuencia de partida de la transición del gen 10 de la fase T7 y un gen que codifica una enzima diferente (activada también con el péptido N-Flag), por ejemplo, metiltransferasa HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina) se añaden a la suspensión de perlas recubiertas de anticuerpo a una concentración de 1,6 nM y la mezcla se incuba durante la noche a 4ºC. Las perlas se enjuagan 3 veces centrifugándolas y volviéndolas a poner en suspensión en tampón TNT.
Se centrifugan 50 \mul de alícuotas de la suspensión de perlas anterior (\sim10^{9} perlas) en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. Se elimina el sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en suspensión suavemente, sobre hielo, en 50 \mul de un sistema procariótico de transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley et al., 1991). Se utiliza una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7 RNA polimerasa (2.000 unidades). Las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas y se centrifugan en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. Se elimina el sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en suspensión en 100 \mul de Tris 50 mM, 10 mM de carbonato potásico, pH 8,0. Una solución acuosa de cloruro de cobalto se añade a una concentración de 1 mM y se incuban las reacciones durante 2 horas a temperatura ambiente. Las perlas se enjuagan 4 veces girándolas y volviéndolas a poner en suspensión en tampón TNT. Por último, las perlas se vuelven a poner en suspensión en tampón TNT hasta el volumen original.
Las alícuotas de las perlas anteriores se añaden a soluciones de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM pH 8,3. Las perlas se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante diferentes periodos de tiempo. Se centrifugan las perlas en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min, se elimina el sobrenadante y se mide su densidad óptica a 405 nm. Se observa un cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las perlas a las que están unidos fragmentos N-Flag-OPD.LMB3-2biotina de ADN biotinilados (y posteriormente se hacen reaccionar tal como se describió anteriormente) en contraste con las reacciones llevadas a cabo en las mismas condiciones pero en ausencia de perlas o de fosfotriesterasa, o con perlas a las que se acoplan fragmentos de ADN y N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina y se hacen reaccionar posteriormente como se describió anteriormente.
A continuación, 10 \mul (\sim2 x 10^{8} perlas) de las perlas anteriores se centrifugan en una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. y se clasifica el sobrenadante. Las perlas se vuelven a poner en suspensión en 10 \mul de EtNP-Bz-Glu-biotina bloqueada 12,5 ó 25 \muM en Tris 50 mM pH 8,3. Las suspensiones de perlas se incuban durante 1,5 horas a 25ºC en la oscuridad. Se interrumpe la reacción mediante la adición de 10 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfieren a hielo y se irradian durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim6 cm. Todas las muestras de perlas se incuban a continuación durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavan tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada lavado. Las perlas (\sim7 x 10^{7}) se vuelven a poner en suspensión a continuación en 125 \mul de un suero antiEtBG de conejo diluido 1:125 en COVAp y se incuba durante toda la noche a 4ºC. Se lavan las perlas una vez con 200 \mul de COVAp y a continuación 3 veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente y se vuelven a poner en suspensión en 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1%. 70 \mul de la suspensión de perlas anterior (\sim2 x 10^{7}) se añaden a 50 \mul de 40 ng/\mul de Fab anticonejo de cabra marcado con FITC (Jackson 115-095-006) en PBS, Tween 20 al 0,1% y se incuban 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan 3 veces las perlas con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, después se vuelven a poner en suspensión en 1 ml de PBS, Tween
\hbox{20 al 0,1% y 10.000 casos analizados
utilizando un  citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).}
En consecuencia, como se aprecia en la Fig. 16, las perlas a las que se acoplaron genes que codifican la fosfotriesterasa activada con el péptido Flag (junto con un anticuerpo que une el péptido Flag) se pudo distinguir claramente de los genes a los que se acoplaron otros genes, que codifican enzimas sin actividad de fosfotriesterasa (por ejemplo, N-Flag-M.HaeIII).
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Ejemplo 11
BirA de E. coli transcrita y traducida in vitro cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas marcadas con sustrato en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite
El gen que codifica un péptido procedente de Propionibacterium shermanii que está biotinilado in vivo en E. coli se amplía utilizando los oligonucleótidos BCCP5 y BCCP3 del vector Pinpoint Xa-1 (Promega). El fragmento de la PCR se clona en el vector pET-23d(FLAG) digerido con BamHI y HindIII, corriente debajo de un activador de T7 ARN polimerasa y la secuencia de partida de la traducción del gen 10 del fago T7, y en el marco con una zona de codificación del péptido FLAG N-terminal; este vector se denomina pET-23d(FLAG-BCCP). El vector pET-23d(FLAG) es idéntico al vector pET-23d (Novagen) excepto para la zona entre las secuencias únicas NcoI y BamHI, que ha sido modificada para incluir una zona de codificación del péptido FLAG N-terminal como se muestra a continuación en el Esquema 2. Con objeto de añadir una etiqueta de hexahistidina al terminal C de la proteína, se hibridaron los dos oligonucleótidos BCCPHis+ y BCCPHis- y a continuación se ligaron en el vector pET-23d(FLAG-BCCP) digerido con SacI y NotI, proporcionando el vector pET-(FLAG-BCCP-His). La proteína FLAG-BCCP-His (denominada FBH) se sobreexpresa en la cepa C41(DE3) (Miroux y Walker, 1996), se recoge y se purifica con Ni-NTA agarosa (Qiagen) en condiciones naturales, siguiendo el protocolo del fabricante. La proteína biotinilada se elimina por incubación con un volumen igual de avidina-agarosa (Sigma), se preequilibra con un tampón de lavado (NaH_{2}PO_{4}, 50 mM, pH 8,0; NaCl 300 mM; imidazol 20 mM) durante 1 hora a 4ºC. La suspensión se centrifuga a continuación a 10.000 g durante 2 minutos y se conserva el sobrenadante, se toman alícuotas y se almacena en nitrógeno líquido (a largo plazo) o a 4ºC.
Esquema 2
2
Se amplió por PCR el gen que codifica a BirA de E. coli utilizando los oligonucleótidos BirA5 y BirA3 procedentes de un vector pBluescript 2SK+ que contiene el gen BirA de E. coli (donación de P. Wang, no publicada). El fragmento de la PCR se clona en el vector pGEM-4Z(K2) digerido con KpnI y XhoI corriente abajo del activador lac, el activador de T7 ARN polimerasa y la secuencia de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz. El vector pGEM-4Z(K2) es idéntico al vector pGEM-4Z^{Ncol} (véase el Ejemplo 8, Esquema 1), excepto para la zona entre las secuencias únicas NcoI y KpnI, que se ha modificado según el Esquema 3 mostrado a continuación que contiene una secuencia única XhoI corriente abajo de la secuencia NcoI.
Esquema 3
3
El secuenciado de ADN identifica un clon con la secuencia de nucleótidos correcta, denominado pGEM-BirA. El plásmido pGEM-BirA descrito anteriormente se amplía por PCR utilizando los cebadores LMB2 y LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de 1.139 pares de bases (BirA_LMB2-3) que transporta el activador de T7 ARN polimerasa, la secuencia de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen BirA. El fragmento de la PCR se purifica directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).
Se centrifugaron 60 \mul de alícuotas (1,2 x 10^{9} perlas) de microesferas marcadas con IgG antiratón de cabra no fluorescentes de 1,0 \mum de diámetro (Bangs Laboratories, CP03N) en una microcentrifugadora a aproximadamente 2.600 g (6.000 rpm) durante 3 minutos. Se clasificó el sobrenadante y se volvieron a poner en suspensión las perlas en 60 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5%. Se centrifugaron otra vez las perlas, se volvieron a poner en suspensión en 60 \mul de anticuerpo antiFLAG de M5 (Sigma F4042) y se incubaron toda la noche a 4ºC. Las perlas se volvieron a centrifugar (2.600 g) durante 3 minutos, se retiró el sobrenadante y las perlas se volvieron a poner en suspensión en una mezcla de 30 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% y 30 \mul de proteína FBH obtenida como anteriormente (concentración en proteína final aproximadamente 4 mg/ml) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente.
Mientras tanto, se prepararon 60 \mul de alícuotas de un sistema procariótico de transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley et al., 1991), utilizando un kit comercial (sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7 RNA polimerasa (2.000 unidades), de BirA-LMB2-3 ADN 10 nM (o sin DNA en absoluto). Se incubaron éstas alícuotas a 25ºC durante 1 hora para permitir la traducción.
Se centrifugaron 60 \mul de alícuotas de perlas a 2.600 g (6.000 rpm) en una microcentrifugadora durante 3 minutos y se eliminó el sobrenadante. Se volvieron a poner en suspensión en 60 \mul de Tris HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,1 5M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5%, se volvió a centrifugar y se clasificó el sobrenadante. Finalmente se volvieron a poner en suspensión en hielo en una alícuota de 54 \mul de las reacciones procarióticas de transcripción/traducción acopladas in vitro descritas anteriormente, enriquecidas con 3 \mul de d-biotina 2 mM y 3 \mul de ATP 0,2 M.
Se extrajo una alícuota de 5 \mul de cada mezcla de reacción y se dejó sin emulsionar. Se emulsionaron 50 \mul de la mezcla de reacción restante esencialmente como Tawfik y Griffiths (1998).
La fase aceitosa se preparó reciente disolviendo Span 80 (Fluka) al 4,5% (v/v) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween 80 (SigmaUltra; nº P-8074) al 0,5% (v/v). Se añadieron gradualmente mezclas de reacción enfriadas en hielo (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se agita con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Se continuó la agitación (a 1.150 rpm) durante 1 minuto adicional en hielo.
Todas las reacciones se incubaron durante 4 horas a 37ºC para permitir que continúe la reacción de biotinilación.
Se transfirieron las emulsiones a tubos de microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugó 1 min. a 13,5k rpm en una microcentrifugadora y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) al fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% y se rompió la emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada adición de hexano. Se eliminó el hexano residual centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente al vacío en un Speedvac (Farmingdale,
NY).
Se lavaron a continuación dos veces aproximadamente 1 x 10^{8} perlas procedentes de las emulsiones rotas y las reacciones no emulsionadas con 100 \mul de TNT/BSA en una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada lavado. Se volvieron a poner en suspensión a continuación las perlas en 50 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% que contenía 1 \mul de solución de HRP con estreptavidina (proporcionada con el kit NEN TSA^{TM} Direct) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las perlas dos veces con 100 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, como anteriormente, a continuación se volvieron a poner en suspensión en 50 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 Mm, pH 8,8, H_{2}O_{2} al 0,01%. Se añadió 1 \mul de una solución madre de fluoresceína tiramida (preparada según las instrucciones del fabricante (kit NEN TSA^{TM} Direct)) y se dejó continuar la reacción durante diez minutos. Se lavaron dos veces las perlas con PBS, como anteriormente, y por último se volvieron a poner en suspensión en un total de 500 \mul de PBS, se transfirieron a un tubo de fondo redondeado de poliestireno de 5 ml (Falcon) y 10.000 casos analizados utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
Como puede apreciarse en la figura 17, tanto en las reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la reacción catalizada por BirA traducida in vitro produce perlas con mayor fluorescencia que cuando no estaba presente ninguna enzima. Parece que las perlas que se han incubado en una emulsión con BirA traducida in vitro son más fluorescentes que las perlas que no han sido incubadas en emulsiones.
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Ejemplo 12
Un cambio en la fluorescencia de los elementos genéticos puede utilizarse para enriquecer selectivamente elementos genéticos que codifican péptidos con una actividad de unión. Los elementos genéticos marcados con fluorescencia se aíslan por clasificación citométrica de flujo
Un formato para la selección de elementos genéticos existe cuando el elemento genético comprende un gen unido a una microperla, que se traslada en una microcápsula, y el producto génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos acoplados al gen que les codifica. Estos complejos pueden posteriormente seleccionarse para la unión a un ligando por clasificación citométrica de flujo si la interacción de la unión produce un cambio en la fluorescencia de la microperla.
El vector pET-23d(FLAG) codifica el péptido FLAG N-terminal fusionado a la zona polienlazadora del pET23d (Novagen). Se digirió el pET23d con Nco I/BamH I, se purificó en gel y se volvió a disolver en agua. Se mezclaron dos oligonucleótidos fosforilados sintéticos (Vh Bio Ltd, Newcastle upon Tyne, U.K.), FLAG y FLAGas, a la concentración de 1 \muM cada uno en agua, se calentó durante 3 min. a 94ºC y se dejó enfriar a temperatura ambiente antes de añadirse al vector digerido en la mezcla de ligadura. La reacción de ligadura se utilizó impurificada para transformar TG-1 de E.coli. Los clones que contienen la inserción donde fueron identificados por Kpn I se digieren y verifican por secuenciado (Oswel Research Product Ltd., Southampton, U.K.). La zona polienlazadora de pET-23d(FLAG) es la siguiente:
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Se preparó el montaje de la expresión FLAG-HA biotinilado del vector pET-23d(FLAG) por PCR. La secuencia peptídica YPYDVPDYA de la hemoaglutinina de la gripe fue añadida a la etiqueta FLAG en el pET-23d(FLAG) utilizando el cebador FLAGHA y el cebador pETrev.b biotinilado en 5'. El producto de la ampliación tiene 903 bases de longitud y la zona de codificación del montaje es:
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El montaje competitivo en el proceso de clasificación es el gen folA de E. coli que codifica la dihidrofolato-reductasa ampliada procedente del pET23a/folA utilizando los cebadores pETfor y pETrev.b.
Los fragmentos de la PCR se purificaron en gel utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Se midió la concentración del ADN por espectrofotometría UV. Se hicieron diluciones de los montajes de expresión preparados por PCR en 0,5 mg/ml de ADN portador preparado a partir de ADN del fago lambda digerido con Hind III (40 min a 80ºC, seguido de precipitación en etanol y disolución en agua).
Se centrifugaron 2x10^{9} perlas de poliestireno de 0,95 \mul recubiertas con estreptavidina en 100 \mul de alícuotas de suspensión al 1% (Bangs Laboratories, Inc. CP01N) en una microcentrifugadora a aproximadamente 2.600 g (6.000 rpm) durante 3 minutos. Se clasificó el sobrenadante y las perlas se volvieron a poner en suspensión en 100 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% (TNTB). Se añadieron 7 \mul de 2 mg/ml de anticuerpo monoclonal M5 antiFLAG biotinilado (Sigma) a las perlas puestas de nuevo en suspensión y se incubó la mezcla a temperatura ambiente durante dos horas. Después del recubrimiento con el anticuerpo, se lavaron las perlas tres veces con 200 \mul de TNTB, se volvieron a poner en suspensión en 100 \mul de TNTB y se dividieron en alícuotas 1 y 2 de 10 \mul y alícuotas 3 y 4 de 40 \mul. Solución madre 0,7 nM de ADN de FLAG-HA puro (nº 1), ADN de folA puro (nº 2) o ADN de FLAG-HA puro (nº 3 y nº 4) diluida en un exceso de 1.000 veces de ADN de folA se prepararon en ADN lambda digerida con Hind III y se aplicaron a las alícuotas de las perlas. La reacción de unión se dejó continuar durante la noche a 4ºC. El número máximo de genes por perla fue de 2 en las alícuotas 1 a 3 y 0,2 en la alícuota 4. Las perlas recubiertas con montaje FLAG-HA sirvió como referencia positiva y las perlas recubiertas con folA como referencia negativa.
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Después de incubación toda la noche a 4ºC, se lavaron dos veces las perlas en TNTB y se volvieron a poner en suspensión en mezcla de traducción in vitro S30 (Sistema de extracto S30 para plantillas lineales, Promega) enriquecida con T7 ARN-polimerasa (20 unidades/\mul).
Las reacciones de traducción in vitro enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,5 ml de fase aceitosa enfriada con hielo (recién preparada disolviendo 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) (SigmaUltra; nº P-8074) en un vial Biofreeze de Costar de 5 ml (nº 2051) agitando a la vez con una varilla magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries International, Loughborough, UK). Se continuó la agitación (a 1.150 rpm) durante 3 minutos más en hielo. Se incubaron a continuación las reacciones 90 min a 30ºC.
Se transfirieron las emulsiones a tubos de microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugaron 8 min a 6,5k rpm en una microcentrifugadora y la fase aceitosa se clasificó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 (TNT) al 0,05% y se rompió la emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada adición de hexano. Se clasificó el hexano residual barboteando aire en toda la suspensión de perlas durante 1 a 2 min a temperatura ambiente.
Las perlas de las emulsiones rotas se lavaron a continuación dos veces con 100 \mul de TNT en una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada lavado. Las perlas se volvieron a poner en suspensión a continuación en TNTB a razón de 10^{6} perlas/\mul y conteniendo 100 mU/ml de antiHA-peroxidasa de rata, conjugado de alta afinidad (3F10) (Boehringer Mannheim).
Las perlas se incubaron con el anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con 200 \mul de TNT antes de ser puestas en suspensión otra vez en 2 ml de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. Las perlas en suspensión se sometieron a ultrasonidos durante 1 min en hielo utilizando un emisor de ultrasonidos de Heat Systems a la potencia 1, 95% del ciclo, boquilla de 3,4 mm. Las perlas sometidas a ultrasonidos se volvieron a poner en suspensión a razón de 10^{8} perlas/ml en Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. A esta suspensión de perlas se añadió un volumen igual de tampón de ampliación de la señal de tiramina (TSA), Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, H_{2}O_{2} al 0,004% y 5 \mug/ml de fluoresceína tiramina.
Se sintetizó fluoresceína tiramina como describe Hopman et al. (Anthon H.N. Hopman, Frans C.S. Ramaekers, Ernst J.M. Speel, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry vol 46(6), 771-777, 1998).
La reacción se deja que continúe durante 5 minutos a temperatura ambiente y se interrumpe mediante adición de 1/10^{a} del volumen de albúmina de suero bovino al 10% en PBS (BSA, Sigma). Se centrifugaron las perlas en alícuotas de 2 ml de la reacción de etiquetado y se lavaron 2 veces en TNTB y 1 vez en PBS. Por último las perlas se volvieron a poner en suspensión en 2 ml de PBS y se sometieron a ultrasonidos como anteriormente.
Las perlas recubiertas con genes que codifican folA, FLAG-HA o una dilución de 1.000 veces de FLAG-HA en folA se analizaron en un citómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson.
En la Figura 18, el histograma A de baja resolución demuestra que las perlas que llevan ADN de FLAG-HA (muestra nº 1) están significativamente más marcadas por fluorescencia que la referencia negativa folA (muestra nº 2). Las mezclas con puntas nº 3 y nº 4 funcionaron predominantemente de manera idéntica a la muestra de referencia negativa excepto para un pequeño número de perlas muy fluorescentes (panel B). 0,04% de las perlas en la muestra nº 3 y 0,02% de las perlas en la muestra nº 4 caen en la zona M1 que comprende el 95% de los casos positivos.
Las perlas en las muestras nº 3 y nº 4 que caen en la zona M1 se clasificaron utilizando un clasificador de células activadas por fluorescencia MoFlo. Dos series de perlas clasificadas se obtuvieron para ambas muestras nº 3 y nº 4. En la serie uno se recogieron 500 perlas en un solo tubo. En la serie dos se recogieron 96 perlas en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos. Ambas series de perlas se sometieron a una PCR de 35 ciclos utilizando los cebadores pETrev.b y FLAGrev1.
Los productos de la ampliación se analizaron por electroforesis en gel (Figura 19). Los tamaños del producto son de 903 bases para FLAG-HA y de 1.390 pb para folA.
El análisis electroforético en gel de los productos de la reacción de ampliación sugiere enriquecimiento significativo durante el curso de la clasificación. En el panel A no hay ninguna banda de FLAG-HA visible en las bandas de los productos ampliados en las reacciones nº 3 y nº 4 no seleccionadas mientras que la banda FLAG-HA en las muestras de las perlas seleccionadas es muy visible. Los datos definitivos en relación con la naturaleza del ADN ampliado se obtuvieron del análisis del ADN ampliado de perlas individuales. En total 22 perlas de 96 dieron un producto de ADN para la reacción nº 3 y 50% de éstas eran de FLAG-HA puro. Para la reacción nº 4 9 perlas dieron productos y 8 era FLAG-HA.
Los datos de cada perla para la reacción nº 3 sugieren que a la concentración aplicada, nominalmente 2 moléculas de ADN/perla, la mayoría de las perlas de hecho tienen solamente un gen unido que permite un enlace inequívoco entre el gen y su producto. Un número relativamente alto de perlas marcadas positivamente significa sin embargo que aproximadamente el 50% de las perlas recuperadas crean falsos positivos. En la muestra nº 4 donde existían solamente \approx0,1 genes/perla, la pureza del ADN recuperado se aproximó al 90%, indicando casi el enriquecimiento de 1.000 veces en una etapa.
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Claims (32)

  1. \global\parskip0.940000\baselineskip
    1. Procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define un elemento genético como que comprende un ácido nucleico que codifica un producto génico que presenta una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede resultar, directa o indirectamente, en la modificación
    \hbox{de una propiedad óptica del elemento genético, que
    comprende  las etapas siguientes:}
    (a)
    compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas;
    (b)
    expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
    (c)
    modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas mediante
    (i)
    la unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o
    (ii)
    la conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que permanece como parte del elemento genético; o
    (iii)
    la utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento;
    (d)
    opcionalmente modificar además los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y
    (e)
    clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto/s génico/s que presentan la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que el ligando está asimismo codificado por el elemento genético.
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula resulta, directa o indirectamente, en la alteración de la expresión de un segundo gen dentro del compartimento y la actividad del producto de dicho segundo gen permite el aislamiento del elemento genético utilizando un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético.
  4. 4. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se clasifican directamente sobre la base de sus propiedades ópticas cambiadas para aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.
  5. 5. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se hacen además reaccionar para provocar un cambio condicional en las propiedades ópticas del elemento genético dependiendo de la presencia de los productos génicos con la actividad deseada en el complejo.
  6. 6. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se someten a una etapa de compartimentación adicional con el fin de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.
  7. 7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un producto génico con propiedades ópticas características del elemento genético.
  8. 8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un ligando con propiedades ópticas características por el producto génico.
  9. 9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas del producto génico cuando está unido al ligando.
  10. 10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas de un ligando cuando está unido al producto génico.
  11. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas tanto del ligando como del producto génico en la unión.
  12. 12. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(ii) o (iii), en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a las propiedades ópticas diferentes del sustrato y del producto de la reacción que es seleccionado.
    \newpage
    \global\parskip1.000000\baselineskip
  13. 13. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(iii), en el que tanto el sustrato como el producto presentan propiedades ópticas similares, pero únicamente el producto, y no el sustrato de la reacción que se selecciona se une o reacciona con el elemento genético, cambiando así las propiedades ópticas del elemento genético.
  14. 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que los reactivos adicionales se unen específicamente a, o reaccionan específicamente con, el producto (y no el sustrato) acoplado al elemento general, alterando así las propiedades ópticas del elemento genético.
  15. 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad no deseada de un producto génico resulta en un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético que es distinto del resultante de la actividad deseada.
  16. 16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el cambio óptico resultante de la actividad no deseada se utiliza para seleccionar negativamente los elementos genéticos.
  17. 17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la selección negativa se combina con la selección positiva para mejorar la especificidad de la reacción.
  18. 18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la especificidad de la reacción mejorada es una mejora en la especificidad de unión.
  19. 19. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la especificidad de la reacción mejorada es una mejora en la regio- y/o estereoselectividad para el sustrato y/o el producto.
  20. 20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se aíslan en un banco de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos.
  21. 21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cada elemento genético codifica dos o más genes y cada producto génico debe presentar una actividad deseada para que las propiedades ópticas del elemento genético se modifiquen para que les permitan clasificarse.
  22. 22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cada elemento genético codifica dos o más genes y los productos génicos deben unirse entre sí en la microcápsula para que las propiedades ópticas del elemento genético se modifiquen y los elementos genéticos se clasifiquen.
  23. 23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional siguiente:
    (f)
    Introducir una o más mutaciones en el/los elemento/s genético/s aislado/s en la etapa (e).
  24. 24. Procedimiento según la reivindicación 23, que comprende además repetir de manera iterativa una o más de las etapas (a) a (f).
  25. 25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la ampliación de los elementos genéticos.
  26. 26. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la microencapsulación se consigue formando una emulsión de agua en aceite de la solución acuosa en un medio a base de aceite.
  27. 27. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la microperla es amagnética, magnética o paramagnética.
  28. 28. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los elementos genéticos se clasifican mediante la detección de un cambio en su fluorescencia.
  29. 29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la clasificación de los elementos genéticos se realiza utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
  30. 30. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que las propiedades de fluorescencia diferentes del sustrato y del producto se deben a la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET).
  31. 31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio interno de las microcápsulas está modificado por la adición de uno o más reactivos a la fase aceitosa.
  32. 32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos modificados directa o indirectamente por la actividad del producto génico deseado se modifican además mediante la Ampliación de la Señal de la Tiramida, resultando directa o indirectamente en un cambio en las propiedades ópticas de dichos elementos genéticos permitiendo así su separación.
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