ES2333844T3 - Procedimiento de clasificacion optica. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define un elemento genético como que comprende un ácido nucleico que codifica un producto génico que presenta una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede resultar, directa o indirectamente, en la modificación de una propiedad óptica del elemento genético, que comprende las etapas siguientes: (a) compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas; (b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas; (c) modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas mediante (i) la unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o (ii) la conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que permanece como parte del elemento genético; o (iii) la utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento; (d) opcionalmente modificar además los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y (e) clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto/s génico/s que presentan la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.
Description
Procedimiento de clasificación óptica.
La presente invención se refiere a
procedimientos para su utilización en la evolución in vitro
de bancos moleculares. En particular, la presente invención se
refiere a procedimientos de clasificación de ácidos nucleicos que
codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la
actividad del producto génico codificado están relacionados por
compartimentación.
La evolución requiere la generación de
diversidad genética (diversidad en ácidos nucleicos) seguida de la
clasificación de los ácidos nucleicos que produzcan características
beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la actividad del
producto génico codificado de un organismo están relacionados
físicamente (estando alojados los ácidos nucleicos dentro de las
células que codifican) múltiples rondas de mutación y clasificación
pueden dar como resultado la supervivencia progresiva de organismos
con buen estado físico en aumento. Los sistemas para la rápida
evolución de los ácidos nucleicos o las proteínas simulan in
vitro ventajosamente este proceso a nivel molecular en el que
el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado
están relacionados y la actividad del producto génico es
seleccionable.
Los avances recientes en biología molecular han
permitido seleccionar conjuntamente algunas moléculas según sus
propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los
ácidos nucleicos seleccionados pueden ser clonados posteriormente
para análisis o utilización posterior, o ser sometidos a rondas
adicionales de mutación y clasificación.
Es frecuente en estos procedimientos la creación
de grandes bancos de ácidos nucleicos. Las moléculas con las
características (actividad) deseadas pueden aislarse mediante
regímenes de clasificación que seleccionan la actividad deseada del
producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o
biológica deseada, por ejemplo la actividad de unión.
La tecnología de exposición en fagos ha tenido
mucho éxito proporcionando un vehículo que permite la clasificación
de una proteína expuesta proporcionando el enlace esencial entre el
ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado
(Smith, 1985; Bass et al., 1990; McCafferty et al.,
1990; para estudio véase Clackson y Wells, 1994). Las partículas de
fago filamentoso actúan como concentrados genéticos para exposición
con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que les
codifican en el interior. El enlace fuerte entre el ácido nucleico
y la actividad del producto génico codificado es un resultado del
montaje del fago dentro de las bacterias. Ya que las bacterias
individuales se infectan raramente al multiplicarse, en la mayoría
de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria
individual serán portadores del mismo elemento genético y expondrán
la misma proteína.
Sin embargo, la exposición en fagos se basa en
la creación de bancos de ácido nucleico in vivo en las
bacterias. Por lo tanto, la limitación práctica sobre el tamaño del
banco permitido por la tecnología de exposición en fagos es del
orden de 10^{7} a 10^{11}, aún aprovechándose de los vectores
del fago \lambda con replicones de fago filamentoso escindibles.
La técnica ha sido aplicada principalmente a la clasificación de
moléculas con actividad de unión. Se ha aislado un pequeño número
de proteínas con actividad catalítica utilizando también ésta
técnica, sin embargo, la clasificación no fue directamente para la
actividad catalítica deseada, sino para la unión a un análogo del
estado de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o la reacción con
un inhibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et
al., 1997). Más recientemente ha habido algunos ejemplos en
enzimas seleccionadas utilizando la exposición en fagos mediante la
formación del producto (Atwell & Wells, 1999; Demartis et
al., 1999; Jestin et al., 1999; Pederson et al.,
1998), pero en todos estos casos la clasificación no fue para
recambio múltiple.
Se han seleccionado ligandos de péptido
específicos para la unión a receptores por clasificación de afinidad
utilizando grandes bancos de péptidos unidos al terminal C del
represor Lacl de lac (Cull et al., 1992).
Cuando se expresa en E. coli la proteína represora une
físicamente el ligando al plásmido codificador uniendo a una
secuencia del operador lac en el plásmido.
Se ha descrito también un sistema de exposición
polisómico enteramente in vitro (Mattheakis et al.,
1994; Hanes y Pluckthun, 1997) en el que los péptidos nacientes se
acoplan físicamente a través del ribosoma al ARN que les codifica.
Se ha descrito también un sistema alternativo, enteramente in
vitro para enlazar el genotipo al fenotipo realizando fisiones
ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997; Nemoto et
al., 1997).
Sin embargo, el alcance de los sistemas
anteriores está limitado a la clasificación de proteínas y además
no permite la clasificación directa para otras actividades que la
unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.
La clasificación y evolución del ARN in
vitro (Ellington y Szostak, 1990), algunas veces se denomina
SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento
exponencial) (Tuerk y Gold, 1990) permite la clasificación tanto
para la unión como para la actividad química, pero solamente para
ácidos nucleicos. Cuando la clasificación es para la unión, se
incuba una mezcla de ácidos nucleicos con el sustrato inmovilizado.
Los que no son aglutinantes se lavan, a continuación se liberan los
aglutinantes, se amplían y se repite el proceso completo en etapas
iterativas para enriquecer las secuencias que se unen mejor. Este
procedimiento puede también adaptarse para permitir el aislamiento
del ARN y ADN catalíticos (Green y Szostak, 1992; para estudios
véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al.,
1995; Moore, 1995).
Sin embargo, la clasificación para la actividad
"catalítica" o de unión que utiliza SELEX solamente es posible
porque la misma molécula lleva a cabo la doble función de
transportar la información genética y ser el catalizador o molécula
de unión (aptámero). Cuando la clasificación es para
"autocatálisis" la misma molécula también debe realizar la
tercera función de ser un sustrato. Como el elemento genético debe
desempeñar la función tanto de sustrato como de catalizador, la
clasificación es solamente posible para episodios de un solo
recambio. Debido a que el "catalizador" en este proceso se
modifica, no es por definición un verdadero catalizador. Además,
las proteínas no pueden seleccionarse utilizando el procedimiento
SELEX. La gama de catalizadores, sustratos y reacciones que puede
seleccionarse por consiguiente está muy limitada.
Los procedimientos anteriores que permiten
rondas iterativas de mutación y clasificación son los mecanismos de
simulación in vitro normalmente atribuidos al proceso de
evolución: variación iterativa, clasificación progresiva para una
actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los
procedimientos desarrollados hasta ahora han proporcionado
moléculas de diversidad comparable y de eficacia funcional a las que
se encuentran en la naturaleza. Además, no existe ningún sistema de
"evolución" artificial que pueda desarrollar tanto ácidos
nucleicos como proteínas para efectuar las actividades bioquímicas y
biológicas completas (por ejemplo, las actividades de unión,
catalítica y reguladora) y que pueda combinar varios procedimientos
que conducen a un producto o actividad deseada.
Existe por lo tanto una gran necesidad de un
sistema in vitro que supere las limitaciones expuestas
anteriormente.
En Tawfik y Griffiths (1998), y en la solicitud
de patente internacional PCT/GB98/01889, los inventores describen
un sistema para la evolución in vitro que supera muchas de
las limitaciones descritas anteriormente utilizando la
compartimentación en microcápsulas para unir el genotipo y el
fenotipo a nivel molecular.
En Tawfik y Griffiths (1998), y en varias formas
de realización de la solicitud de patente internacional
PCT/GB98/
01889, la actividad deseada de un producto génico produce una modificación del elemento genético que le codifica (y está presente en la misma microcápsula). El elemento genético codificado puede seleccionarse a continuación en una etapa posterior.
01889, la actividad deseada de un producto génico produce una modificación del elemento genético que le codifica (y está presente en la misma microcápsula). El elemento genético codificado puede seleccionarse a continuación en una etapa posterior.
En la presente memoria se describe una invención
adicional en la que la modificación del elemento genético produce
un cambio en las propiedades ópticas del propio elemento, y que
presenta muchas ventajas sobre los procedimientos descritos
anteriormente.
Según la presente invención, se proporciona un
procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un
cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define
un elemento genético comprendiendo un ácido nucleico que comprende
un producto génico que codifica un ácido nucleico con una actividad
deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico
puede producir, directa o indirectamente, la modificación de una
propiedad óptica del elemento genético, que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas;
- (b)
- expresar los elementos genéticos para producir sus respectivos productos génicos dentro de las microcápsulas;
- (c)
- modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas por
- (i)
- unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o
- (ii)
- conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que continúa siendo parte del elemento genético; o
- (iii)
- utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento;
- (d)
- opcionalmente modificar más los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y
- (e)
- clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto(s) génico(s) con la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.
Las microcápsulas utilizadas en el procedimiento
según la presente invención compartimentan elementos genéticos y
productos génicos tales como los que permanecen físicamente
unidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
elemento genético es una molécula o montaje molecular que comprende
un ácido nucleico. Los elementos genéticos utilizados en el
procedimiento de la presente invención pueden comprender cualquier
ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o cualquier análogo, natural o
artificial, de los mismos). El componente ácido nucleico del
elemento genético está unido, por enlace covalente o no covalente,
a perlas (incluyendo perlas no magnéticas, magnéticas y
paramagnéticas). En el procedimiento de la invención, estas
estructuras o moléculas pueden diseñarse para ayudar en la
clasificación y/o al aislamiento del elemento genético según un
producto génico con actividad deseada.
Expresión, tal como se utiliza en la presente
memoria, se utiliza en su sentido más amplio, para hacer referencia
a la conversión de un ácido nucleico contenido en el elemento
genético en su producto génico. Por lo tanto, cuando el ácido
nucleico es ADN, la expresión se refiere a la transcripción del ADN
en ARN; cuando este ARN codifica una proteína, la expresión puede
también referirse a la traducción del ARN en proteínas. Cuando el
ácido nucleico es el ARN, la expresión puede referirse a la
replicación de este ARN en más copias de ARN, la transcripción
inversa del ARN en ADN y opcionalmente a la transcripción de este
ADN en más moléculas de ARN, así como opcionalmente a la traducción
de alguna de las especies de ARN producidas en la proteína.
Preferentemente, por consiguiente, la expresión se lleva a cabo
mediante uno o más procesos seleccionados de entre el grupo
constituido por transcripción, transcripción inversa, replicación y
traducción.
La expresión del elemento genético puede estar
así dirigida al ADN, al ARN o a las proteínas, o a un ácido
nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales
(producto génico) dentro de la microcápsula utilizada en el
procedimiento de la invención, de modo que el producto génico está
contenido dentro de la misma microcápsula como elemento
genético.
El elemento genético y el producto génico
codificado por éste están unidos confinando cada elemento genético
y el respectivo producto génico codificado por el elemento genético
dentro de la misma microcápsula. De esta manera el producto génico
en una microcápsula no puede producir un cambio en ninguna otra
microcápsula. Además, pueden utilizarse unos medios de enlace
adicionales para unir productos génicos a elementos genéticos que
les codifican, como se indica a continuación.
El término "microcápsula" se utiliza en la
presente memoria según el significado normalmente asignado a ésta
en la técnica y descrito con mayor detalle a continuación en la
presente memoria. En esencia, sin embargo, una microcápsula es un
compartimento artificial cuyos bordes delimitantes restringen el
intercambio de los componentes de los mecanismos moleculares
descritos en la presente memoria que permiten la clasificación de
los elementos genéticos según la función de los productos génicos
que codifican.
Preferentemente, las microcápsulas utilizadas en
el procedimiento de la presente invención podrán producirse en
cantidades muy grandes, y de este modo compartimentar un banco de
elementos genéticos que codifica un repertorio de productos
génicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos se
refiere a cualquier cambio en la absorción o emisión de radiación
electromagnética, incluyendo cambios de absorbancia, luminiscencia,
fosforescencia o fluorescencia. Todas estas propiedades se incluyen
en el término "óptica". Los elementos genéticos pueden
clasificarse, por ejemplo, por clasificación activada por
luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una forma de
realización preferida, se emplea citometría de flujo para
clasificar elementos genéticos, por ejemplo, puede utilizarse la
dispersión de la luz (Kerker, 1983) y polarización por
fluorescencia (Rolland et al., 1985) para activar la
clasificación por flujo. En una forma de realización muy preferida
se clasifican elementos genéticos utilizando un clasificador de
células activadas por fluorescencia (FACS) (Norman, 1980; Mackenzie
y Pinder, 1986).
Los cambios en las propiedades ópticas pueden
ser directos o indirectos. Por lo tanto, el cambio puede producir
la alteración de una propiedad óptica en el propio elemento
genético, o puede conducir indirectamente a dicho cambio. Por
ejemplo, la modificación de un elemento genético puede alterar su
capacidad para unir un ligando ópticamente activo, alterando
indirectamente de este modo sus propiedades ópticas.
Alternativamente, pueden utilizarse técnicas de
diagnóstico por la imagen para identificar películas finas de
elementos genéticos que permitan el enriquecimiento en un elemento
genético con propiedades deseables, por ejemplo por aislamiento
físico de la zona en la que está situado un elemento genético con
propiedades deseables, o la extirpación de elementos genéticos no
deseados. Los elementos genéticos pueden detectarse por
luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia.
Según una forma de realización preferida de la
presente invención, la clasificación de los elementos genéticos
puede realizarse en una de esencialmente dos técnicas.
- (I)
- En una primera forma de realización, los elementos genéticos se clasifican siguiendo la mezcla de las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un producto génico con la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica (y que reside en la misma microcápsula) a fin de hacerlo seleccionable como resultado de sus propiedades ópticas modificadas en una etapa posterior. Las reacciones se interrumpen y las microcápsulas se rompen a continuación de modo que todo el contenido de cada una de las microcápsulas se mezcla. La modificación del elemento genético en la microcápsula puede producir directamente la modificación de las propiedades ópticas del elemento genético. Alternativamente, la modificación puede permitir que los elementos genéticos se modifiquen más fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas. La clasificación de los elementos genéticos con propiedades ópticas modificadas permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el/los producto(s) génico(s) con la actividad deseada. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) el producto génico con actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica para permitir el aislamiento del elemento genético como resultado en un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético. Debe sobreentenderse, desde luego, que la modificación puede ser directa, porque está producida por la acción directa del producto génico sobre el elemento genético, o indirecta, porque una serie de reacciones, una o más de las que implican el producto génico con actividad deseada, conduce a la modificación del elemento genético.
- (II)
- En una segunda forma de realización, los elementos genéticos pueden clasificarse por un procedimiento multietapa, que implica por lo menos dos etapas, por ejemplo, para permitir la exposición de los elementos genéticos a condiciones que permitan que sucedan por lo menos dos reacciones independientes. Como apreciarán los expertos en la materia, la primera etapa de microencapsulación de la invención da como resultado de manera ventajosa condiciones que permiten a la expresión de los elementos genéticos ser la transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o similares. En estas condiciones, puede no ser posible seleccionar una actividad de producto génico específica, por ejemplo porque el producto génico puede no ser activo en estas condiciones o porque el sistema de expresión contiene una actividad que interfiere. La invención por consiguiente proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la presente invención, en el que la etapa (b) comprende expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas, uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que les codifica y aislando los complejos formados de este modo. Esto permite aislar los elementos genéticos y sus productos génicos asociados de las cápsulas antes de la clasificación según la actividad del producto génico que tenga lugar. En una forma de realización preferida, los complejos se someten a una etapa de compartimentación adicional antes de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico con la actividad deseada. Esta etapa de compartimentación adicional, que tiene lugar ventajosamente en microcápsulas, permite el funcionamiento de reacciones adicionales, en diferentes condiciones, en un medio donde los elementos genéticos y sus productos génicos respectivos están unidos físicamente. La clasificación opcional de los elementos genéticos puede realizarse según la forma de realización (I) anterior.
La "encapsulación secundaria" puede
realizarse también con los elementos genéticos unidos a los
productos génicos por otros medios, tales como por exposición en
fagos, exposición en polisomas, fusión ARN-péptido
o fusión del péptido represor lac.
El/los elementos/s genético/s seleccionado/s
puede/n someterse también a rondas posteriores, opcionalmente más
severas de clasificación en etapas iterativamente repetidas,
volviendo a aplicar el procedimiento de la invención en su
totalidad o solamente en etapas seleccionadas. Adaptando las
condiciones apropiadamente, pueden aislarse productos génicos que
codifican elementos genéticos con una actividad mejor optimizada
después de cada ronda de clasificación.
Además, los elementos genéticos aislados después
de una primera ronda de clasificación pueden someterse a
mutagénesis antes de repetir la clasificación o repetición iterativa
de las etapas del procedimiento de la invención tal como se indicó
anteriormente. Después de cada ronda de mutagénesis, algunos
elementos genéticos habrán sido modificados de tal manera que
aumenta la actividad de los productos génicos.
Además, los elementos genéticos seleccionados
pueden clonarse en un vector de expresión para permitir más
caracterización de los elementos genéticos en sus productos.
Este sistema de clasificación puede configurarse
para seleccionar moléculas de ARN, ADN o de proteína con actividad
catalítica, reguladora o de unión.
Figura 1. La
dihidrofolato-reductasa puede expresarse en genes
traducida in vitro en solución y genes acoplados a perlas
paramagnéticas con idéntica eficacia. La actividad de DHFR
resultante de la traducción in vitro de genes folA en
solución o los genes folA acoplados a microperlas
paramagnéticas se determina controlando la oxidación de NADPH a
NADP espectrofotométricamente a 340 nm y la actividad se calcula
por velocidades iniciales en condiciones de So>>K_{M}
(vmax). (\blacklozenge), traducida a partir de genes en solución;
(\sqbullet), traducida a partir de genes acoplados a
microperlas.2.
Figura 2. Microscopía de epifluorescencia de
emulsiones de agua en aceite que demuestra que GFP puede
traducirse in vitro desde genes acoplados a microperlas
individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las
emulsiones y unida al producto génico traducido volverse a unir a
las microperlas haciéndolas fluorescentes.
Figura 3. Análisis citométrico de flujo de la
expresión de GFP en microcápsulas e unión in situ al elemento
genético (microperlas). A: Características de dispersión de la
luz de las perlas antes de la reacción. El 75% de las perlas actúan
como perlas individuales. B: Características de dispersión de la luz
de las perlas después de la traducción in vitro.
Aproximadamente el 50% de las perlas caen a la entrada en las perlas
individuales. C: Fluorescencia de microperlas (prohibida para
perlas individuales solamente) recubiertas con el gen
T7-GFP y el anticuerpo antiGFP policlonal es
significativamente mayor que la señal procedente de las perlas en
las que se omitieron el gen GFP o el anticuerpo antiGFP.
Figura 4. Síntesis de
biotina-GS-DNP por la reacción de
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB; Sigma) con glutatión biotinilado reducido
(biotina-GSH). catalizada por glutatión
S-transferasa M2-2 (GST
M2-2) humana.
Figura 5. Detección de perlas paramagnéticas
recubiertas con el producto de una reacción catalizada por enzimas
por citometría de flujo. Micropartículas magnéticas recubiertas
con estreptavidina Sera-Mag^{TM} incubadas con
biotina-GS-DNP preparadas por la
reacción catalizada por GST M2-2 de
biotina-GSH y CDNB. La
biotina-GS-DNP capturada se detectó
por incubación de las macropartículas con un anticuerpo
antidinitrofenol de ratón seguido de IgG antiratón de cabra con el
fragmento F(ab')_{2} conjugado con FITC, fragmento
F(ab')_{2}. Después del lavado, se analizaron 2x10^{5}
micropartículas por citometría de flujo. Todos los reactivos, los
no reactivos omitidos procedentes de la síntesis enzimática con
biotina-GS-DNP; menos GST, enzima
GST M2-2 se omitió en la síntesis; menos
biotina-GSH, la biotina-GSH fue
omitida de la síntesis; menos CDNB, se omitió CDNB de la
síntesis.
Figura 6. Síntesis de
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH
(biotina-\beta-Ala-GSH
bloqueada). Se añadió cloruro de acetilo (5 ml) a metanol
anhidro (80 ml). La solución agitada se dejó enfriar y se añadió
d-biotina (4 g). Después de agitar durante la noche
los disolventes se evaporaron al vacío para proporcionar un sólido
blanco. El sólido se disgregó con éter, se filtró y se secó al vacío
(en presencia de pentóxido de fósforo) y se almacenó a -20ºC.
Figura 7. Reacción de
biotina-\beta-Ala-GSH
bloqueada con
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB) y desbloqueo fotoquímico del grupo biotina.
Figura 8. Reacción de
biotina-\beta-Ala-GSH
bloqueada con
4-cloro-3-dinitrobenzoato
(CNB) y desbloqueo fotoquímico del grupo biotina.
Figura 9. GST M2-2 humana
cataliza la reacción de
biotina-\beta-Ala-GSH
bloqueada con CDNB y CNB en solución y los productos de la reacción
pueden desbloquearse por irradiación de UV, capturarse en las perlas
y detectarse utilizando anticuerpos antiproducto marcados por
fluorescencia y citometría de flujo.
Panel A: Características de la dispersión de la
luz de perlas y entrada de perlas individuales (R1). Panel B:
Fluorescencia procedente de microperlas (empezando por R1) de las
reacciones con CNB. Panel C: fluorescencia procedente de
microperlas (empezando por R1) de las reacciones con CNB. Señales
procedentes de microperlas de las reacciones con y sin GST
M2-2 se anotan +enz y -enz respectivamente. Las
señales de microperlas procedentes de las reacciones que se
irradiaron con UV y las que no, se anotan +UV y -UV
respectivamente.
Figura 10. La citometría de flujo puede
utilizarse para distinguir perlas de compartimentos acuosos de una
emulsión que contiene GST M2-2 de perlas procedentes
de compartimentos sin GST M2-2 utilizando
\beta-Ala-GSH biotinilada
bloqueada y CNB como sustratos.
Panel A: Características de la dispersión de la
luz de una mezcla de microesferas no fluorescentes marcadas con
neutravidina de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes,
F-8777), o perlas de poliestireno recubiertas con
estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) y
entradas indicadas para perlas Bangs individuales (R1) y perlas de
sondas moleculares individuales (R2). Panel B: Fluorescencia de
microperlas tomadas de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas
de Bangs (sin GST) y 2% de perlas de molecular Probes (con GST).
Panel C: Fluorescencia de microperlas recibida de una mezcla de dos
emulsiones en una proporción de 98% de emulsión que contiene perlas
Bangs (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas de
molecular Probes (con GST). Panel D: Fluorescencia de microperlas
recibida de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de molecular
Probes (sin GST) y 2% de perlas Bangs (sin GST). Panel E:
Fluorescencia de microperlas recibida de una mezcla dos emulsiones
en una proporción de 98% de emulsión que contiene perlas de
molecular Probes (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas
Bangs (sin GST). Las fluorescencias de perlas incontroladas (sin
control), de perlas controladas por R1 (R1) y perlas controladas por
R2 (R2) se superponen.
Figura 11. GST M2-2 humana
transcrita y traducida in vitro en los compartimentos acuosos
de una emulsión de agua en aceite cataliza una reacción que da
lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de las
microesferas co-compartimentadas.
Panel A: Características de dispersión de la luz
de las perlas y control de las perlas individuales (R1). Panel B:
Fluorescencia de microperlas (controlada por R1) procedente de
reacciones no emulsionadas. Panel C: Fluorescencia de microperlas
(controlada por R1) procedente de reacciones emulsionadas. Señales
procedentes de microperlas de reacciones con y sin
GSTM2-2.LMB2-3 ADN se anotan +ADN y
-ADN respectivamente. Las señales procedentes de microperlas de
reacciones con y sin GST M2-2 recombinantes se
anotan +GST y -GST respectivamente.
Figura 12. Síntesis del sustrato
EtNP-BzGlu-biotina bloqueada
biotinilado y bloqueado (17).
Figura 13. Hidrólisis del sustrato biotina
bloqueada con EtNP-Bz-Glu de PET
(17) para dar el producto
Et-Bz-Glu-biotina
bloqueada, y sin bloquear, tanto del sustrato como del producto para
proporcionar el sustrato biotinilado correspondiente
(EtNP-Bz-Glu-biotina)
y producto
(EtNP-Bz-Glu-biotina).
Figura 14. Preparación de conjugados de
proteína de un sustrato de PTE y el producto para la inmunización y
ELISA.
Figura 15. PTE cataliza la reacción de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada en presencia de perlas recubiertas de estreptavidina y
los productos de reacción desbloqueados por irradiación UV, se
capturan en las perlas y se detectan anticuerpos antiproducto
marcados por fluorescencia y citometría de flujo.
Panel A: Características de dispersión de la luz
de las perlas y control seleccionado para perlas individuales (R2).
Panel B: Fluorescencia de las perlas (controlada por R2) de las
reacciones con 10 \muM de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada en presencia de fragmentos de ADN
OPD.LMB3-2biotina (OPD) traducidos o fragmentos de
ADN N.HaeIII.LMB3-2biotina
(M.HaeIII). Panel C: Como B pero con 20 \muM de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada. Panel D: Como B pero con 50 \muM de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada.
Figura 16. Reacción de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada en presencia de perlas a las que se acoplaron elementos
genéticos que codifican la fosfotriesterasa activada con el péptido
Flag
(N-Flag-OPD.LMB3-2biotina)
u otra enzima
(N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina)
una al lado de la otra con un anticuerpo que une el péptido Flag.
Las perlas se hicieron reaccionar y posteriormente se analizaron
por citometría de flujo tal como se describe en el texto.
Panel A: Características de la dispersión de la
luz de las perlas y control de las perlas individuales (R1). Panel
B: Fluorescencia de las microperlas (controlada por R1) a las que se
acoplaron fragmentos de
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
(OPD) o fragmentos de M.HaeIII.LMB3-2biotina
(M.HaeIII) de las reacciones con 12,5 \muM de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada. Panel C: Como B pero con 25 \muM de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada.
Figura 17. BirA de E. coli transcrito
y traducido cataliza in vitro una reacción que da lugar a un
cambio en las propiedades de fluorescencia de las microesferas
marcadas con sustrato en los compartimentos acuosos de una emulsión
de agua y aceite y en la solución en grandes cantidades.
Figura 18. Análisis citométrico de flujo de
las muestras preparadas para el experimento de
clasificación.
Figura 19. Clasificación citométrica de flujo
activada por fluorescencia de los elementos genéticos.
Panel A: Muestras nº 1 a nº 4 antes de la
clasificación y después de la clasificación. Panel B: Genes
recuperados de perlas individuales clasificadas procedentes de la
muestra nº 3 clasificadas en una placa de 96 pocillos. Panel C:
Genes recuperados de las perlas individuales clasificadas
procedentes de la muestra nº 4 clasificada en una placa de 96
pocillos. Los marcadores de ADN (M) son el digesto de
\PhiX174-HaeIII.
Las microcápsulas utilizadas en el procedimiento
de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas
que permitan la explotación de la invención.
En primer lugar, para asegurar que los elementos
genéticos y los productos génicos pueden no difundirse entre las
microcápsulas, los contenidos de cada microcápsula se aíslan
preferentemente de los contenidos de las microcápsulas
circundantes, de modo que no existe o hay poco intercambio de los
elementos genéticos y de los productos génicos entre las
microcápsulas en toda la escala de tiempo del experimento.
En segundo lugar, el procedimiento de la
presente invención requiere que exista solamente un número limitado
de elementos genéticos por microcápsula. Esto asegura que el
producto génico de un elemento genético individual se aísle de
otros elementos genéticos. De este modo, el acoplamiento entre el
elemento genético y el producto génico será muy específico. El
factor de enriquecimiento es mayor por término medio con un elemento
o pocos elementos genéticos por microcápsula, siendo el enlace
entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico
codificado tan ajustado como sea posible, ya que el producto génico
de un elemento genético individual se aislará de los productos de
los demás elementos genéticos. Sin embargo, aún si no se utiliza la
situación teóricamente óptima, por término medio, de un solo
elemento genético o menos por microcápsula, una relación de 5, 10,
50, 100 ó 1.000 o más elementos genéticos por microcápsula puede
demostrar ser útil en la clasificación de un banco grande.
Posteriores rondas de clasificación, incluyendo la encapsulación
renovada con diferente distribución de elementos genéticos,
permitirán la clasificación más severa de los elementos genéticos.
Preferentemente, existe un solo elemento genético, o menos, por
microcápsula.
En tercer lugar, la formación y la composición
de las microcápsulas no suprime favorablemente la función del
sistema de expresión de los elementos genéticos y la actividad de
los productos génicos.
El/los sistema/s apropiados/s puede/n variar
dependiendo de la naturaleza exacta de los requisitos en cada
aplicación de la invención, como es evidente para el experto en la
materia.
Una amplia variedad de procedimientos de
microencapsulación están disponibles (véase Benita, 1996) y pueden
utilizarse para crear las microcápsulas utilizadas según la presente
invención. De hecho, más de 200 procedimientos de
microencapsulación se han identificado en la bibliografía (Finch,
1993).
Estos incluyen vesículas acuosas envueltas en la
membrana tales como las vesículas de lípidos (liposomas) (New,
1990) y vesículas de tensioactivo no iónico (van Hal et al.,
1996). Éstas son cápsulas membranosas cerradas de bicapas
individuales o múltiples de moléculas unidas por enlace no
covalente, con cada bicapa separada de la contigua por un
compartimento acuoso. En el caso de los liposomas, la membrana está
compuesta por moléculas de lípido; normalmente hay fosfolípidos
pero pueden incorporarse también en las membranas esteroles tales
como el colesterol (New, 1990). Una variedad de reacciones
bioquímicas catalizadas por enzimas, incluyendo la polimerización
del ARN y ADN, puede realizarse con liposomas (Chakrabarti et
al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et
al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick & Luisi,
1996).
Con un sistema de vesícula envuelta en la
membrana gran parte de la fase acuosa está fuera de las vesículas y
por lo tanto no está compartimentada. Esta fase acuosa continua se
clasifica o los sistemas biológicos en ella se inhiben o se
destruyen (por ejemplo, por digestión de ácidos nucleicos con ADNasa
o ARNasa) para que las reacciones se limiten a las microcápsulas
(Luisi et al., 1987).
Las reacciones bioquímicas catalizadas por
enzimas se han demostrado en las microcápsulas generadas por una
variedad de otros procedimientos. Muchas enzimas son activas en
soluciones micelares inversas (Bru & Walde, 1991; Bru &
Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993;
Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987, Mao & Walde,
1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde
et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et
al., 1988) tal como el sistema
AOT-isooctano-agua (Menger y Yamada,
1979).
Las microcápsulas pueden generarse también por
polimerización interfacial y acomplejamiento interfacial (Whateley,
1996). Las microcápsulas de esta especie pueden tener membranas
rígidas y no permeables, o membranas semipermeables. Las
microcápsulas semipermeables bordeadas por membranas de nitrato de
celulosa, membranas de poliamida y membranas de
lípido-poliamida todas pueden soportar reacciones
bioquímicas, incluyendo los sistemas multienzimáticos (Chang, 1987;
Chang, 1992; Lim, 1984). Se ha demostrado también que las
microcápsulas de alginato/polilisina (Lim y Sun, 1980), que pueden
formarse en condiciones muy suaves, son muy compatibles,
proporcionando, por ejemplo, un procedimiento muy eficaz de
encapsulación de células y tejidos vivos (Chang, 1992; Sun et
al., 1992).
Pueden utilizarse también sistemas de
microencapsulación no membranosos basados en el reparto de fases de
un medio acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.
Preferentemente, las microcápsulas utilizadas en
el procedimiento de la presente invención están formadas por
emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles
con una de las fases dispersada en la otra en forma de gotitas de
tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968;
Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Pueden producirse emulsiones de cualquier
combinación adecuada de líquidos inmiscibles. Preferentemente la
emulsión utilizada en el procedimiento de la presente invención
tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase
presente en forma de gotitas finamente divididas (la fase dispersa,
interna o discontinua) de un líquido hidrófobo, inmiscible (un
aceite) como la matriz en la que estas gotitas están en suspensión
(fase no dispersa, continua o externa). Dichas emulsiones se
denominan "agua en aceite" (W/O). Éstas tiene la ventaja de
que la fase acuosa completa que contiene los componentes bioquímicos
está compartimentada en gotitas discretas (fase interna). La fase
externa, que es un aceite hidrófobo, generalmente no contiene
ninguno de los componentes y por consiguiente es inerte.
La emulsión puede estabilizarse mediante la
adición de uno o más agentes tensioactivos. Estos tensioactivos se
denominan agentes emulsionantes y actúan en la interfase agua/aceite
para evitar (o por lo menos retardar) la separación de las fases.
Muchos aceites y muchos emulsionantes pueden utilizarse para la
generación de emulsiones aceite en agua; una compilación reciente
listada de más de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se
utilizan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites
adecuados incluyen aceites minerales blancos ligeros y
tensioactivos no iónicos (Schick, 1996) tal como el monooleato de
sorbitán (Span^{TM}80; ICI) y el monooleato de
polioxietilensorbitán (Tween^{TM}80; ICI).
La utilización de tensioactivos aniónicos puede
ser también útil. Los tensioactivos adecuados incluyen el colato
sódico y el taurocolato sódico. Es particularmente preferido el
desoxicolato sódico, preferiblemente a una concentración de 0,5%
p/v, o inferior. La inclusión de dichos tensioactivos puede aumentar
en muchos casos la expresión de los elementos genéticos y/o la
actividad de los productos génicos. La adición de algunos
tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada
suprime completamente la traducción. Durante la emulsión, sin
embargo, el tensioactivo se transfiere desde la fase acuosa a la
interfase y se restablece la actividad. La adición de un
tensioactivo aniónico a las mezclas que han de emulsionarse
garantiza que las reacciones procedían solamente después de la
compartimentación.
\newpage
La creación de una emulsión generalmente
requiere la aplicación de energía mecánica para forzar a las fases
juntas. Hay varias maneras de hacer esto que utilizan una variedad
de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como barras
agitadoras magnéticas, agitadores con impulsores y de turbina,
dispositivos con paletas y batidoras), homogeneizadores (incluyendo
homogeneizadores con rotor-estator, homogeneizadores
con válvula de alta presión y homogeneizadores a chorro), molinos
coloidales, ultrasonidos y dispositivos de "emulsionamiento con
membrana" (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Las microcápsulas acuosas formadas en las
emulsiones de agua en aceite son generalmente estables con poco si
es que algún intercambio de elementos genéticos o de productos
génicos entre las microcápsulas. Además, los inventores han
demostrado que varias reacciones bioquímicas procedieron en
microcápsulas de emulsión. Además, complicados procesos
bioquímicos, principalmente transcripción y traducción génica son
también activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la
tecnología para crear emulsiones con volúmenes de todas las maneras
hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957;
Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
El tamaño de microcápsulas preferido variará
dependiendo de los requisitos precisos de cualquier procedimiento
de clasificación individual que ha de realizarse según la presente
invención. En todos los casos, existirá un equilibrio óptimo entre
el tamaño del banco de genes, el enriquecimiento requerido y la
concentración requerida de componentes en las microcápsulas
individuales para conseguir la extrusión eficaz y la reactividad de
los productos génicos.
Los procesos de expresión se producen dentro de
cada microcápsula para su utilización en el procedimiento de la
presente invención. Tanto en la transcripción in vitro como
en la transcripción-traducción acoplada llega a ser
menos eficaz a concentraciones de ADN
sub-nanomolares. Debido al requisito para sólo un
número limitado de moléculas de ADN que ha de estar presente en
cada microcápsula, éste por lo tanto fija un límite superior
práctico en el posible tamaño de la microcápsula. Preferentemente,
el volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x
10^{-16} m^{3} (correspondiente a una microcápsula esférica de
diámetro inferior a 10 \mum, más preferentemente inferior a 6,5 x
10^{-17} m^{3} (5 \mum de diámetro), más preferentemente de
aproximadamente 4,2 x 10^{-18} m^{3} (2 \mum de diámetro), y
teóricamente de aproximadamente 9 x 10^{-18} m^{3} (2,6 \mum
de diámetro).
La concentración eficaz de ADN o ARN en las
microcápsulas puede aumentarse artificialmente por varios
procedimientos que serán bien conocidos por los expertos en la
materia. Éstos incluyen, por ejemplo, la adición de volumen
excluyendo productos químicos tales como los polietilenglicoles
(PEG) y una variedad de técnicas de ampliación génica, incluyendo
la transcripción que utiliza ARN-polimerasas
incluyendo las de bacterias tales como E. coli (Roberts,
1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975;
Rosenberg et al., 1975), eucariotas por ejemplo (Weil et
al., 1979; Manley et al., 1983) y bacteriófagos tales
como T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984); la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988); la
ampliación con Qb-replicasa (Miele et al.,
1983; Cahill et al., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev
et al., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (RCL)
(Landegren et al., 1988; Barany, 1991); y el sistema de
replicación de secuencia automantenido (Fahy et al., 1991) y
la ampliación con desplazamiento de cadena (Walker et al.,
1992). Las técnicas de ampliación génica que requieren ciclación
térmica tales como PCR y LCR pueden utilizarse si las emulsiones y
la transcripción in vitro o los sistemas de
transcripción-traducción acoplados son
termoestables (por ejemplo, los sistemas de
transcripción-traducción acoplados pueden realizarse
en un organismo termoestable tal como Thermus
aquaticus).
El aumento de la concentración local eficaz de
ácido nucleico permite utilizar microcápsulas mayores de manera más
eficaz. Éste permite un límite superior práctico preferido al
volumen de la microcápsula de aproximadamente 5,2 x 10^{-16}
m^{3} (correspondiente a una esfera de 10 \mum de diámetro).
El tamaño de las microcápsulas preferentemente
es suficientemente grande para alojar todos los componentes
requeridos de las reacciones bioquímicas que se necesita que se
produzcan dentro de la microcápsula. Por ejemplo, tanto las
reacciones de transcripción como las reacciones de
transcripción-traducción acopladas, in vitro,
requieren una concentración total de trifosfato de nucleósido de
aproximadamente 2 mM.
Por ejemplo, para transcribir un gen a una sola
molécula de ARN corta de 500 bases de longitud, éste requeriría por
lo menos 500 moléculas de trifosfato de nucleósido por microcápsula
(8,33x10^{-22} moles). Para constituir una solución 2 mM, este
número de moléculas está contenido dentro de una microcápsula de
4,17x10^{-19} litros de volumen (4,17x10^{-22} m^{3}) que si
es esférico tendría un diámetro de 93 nm.
Además, particularmente en el caso de reacciones
que implican traducción, debe señalarse que los ribosomas
necesarios para que ocurra la traducción son ellos mismos
aproximadamente de 20 nm de diámetro. Por consiguiente, el límite
inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de
aproximadamente 0,1 \mum (100 nm).
Por consiguiente, el volumen de microcápsulas
preferentemente es del orden de entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y
5,2 x 10^{-16} m^{3} que corresponde a una esfera de diámetro
entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de entre
aproximadamente 5,2 x 10^{-19} m^{3} y6,5 x 10^{-17} m^{3}
(1 \mum y 5 \mum). Los diámetros esféricos de aproximadamente
2,6 \mum son los más ventajosos.
No es casualidad que las dimensiones preferidas
de los compartimentos (gotitas de 2,6 \mum de diámetro medio)
recuerdan mucho las de las bacterias, por ejemplo,
Escherichia son varillas de 1,1-1,5 x
2,0-6,0 \mum y las de Azotobacter son
células ovoides de 1,5-2,0 \mum de diámetro. En su
forma más sencilla, la evolución darwiniana se basa en un mecanismo
de "un genotipo un fenotipo". La concentración de un sólo gel
compartimentado o genoma disminuye desde 0,4 nM en un compartimento
de 2 \mum de diámetro, hasta 25 pM en un compartimento de 5
\mum, de diámetro. El sistema procariótico de
transcripción-traducción ha evolucionado para operar
en compartimentos de \sim1-2 \mum de diámetro,
donde los genes individuales están en concentraciones
aproximadamente nanomolares. Un solo gen, en un compartimento de
2,6 \mum de diámetro está a una concentración de 0,2 nM. Ésta
concentración génica es lo suficiente elevada para una traducción
eficaz. La compartimentación en tal volumen garantiza también que
incluso si solamente se forma una sola molécula del producto génico
está presente a aproximadamente 0,2 nM, lo que es importante si el
producto génico ha de tener una actividad de modificación del
propio elemento genético. El volumen de la microcápsula se
selecciona de este modo teniendo en mente no solamente los
requisitos para la transcripción y traducción del elemento genético,
sino también la actividad de modificación requerida del producto
génico en el procedimiento de la invención.
El tamaño de las microcápsulas de emulsión puede
variarse simplemente adaptando las condiciones de la emulsión
utilizada para formar la emulsión según los requisitos del sistema
de clasificación. Cuanto mayor es el tamaño de la microcápsula,
mayor es el volumen que se requerirá para encapsular un banco de
elementos genéticos dados, ya que el factor limitante por último
será el tamaño de la microcápsula y de este modo el número de
microcápsulas posibles por unidad de volumen.
El tamaño de las microcápsulas se selecciona no
solamente teniendo en cuenta los requisitos del sistema de
transcripción/traducción, sino también los del sistema de
clasificación empleado para el elemento genético. De este modo, los
componentes del sistema de clasificación, tal como un sistema de
modificación químico, pueden requerir volúmenes de reacción y/o
concentraciones de reactivo que no son óptimas para la
transcripción/traducción. Como se indica en la presente memoria,
dichos requisitos pueden acomodarse mediante una etapa de
reencapsulación secundaria; además, puede acomodarse seleccionando
el tamaño de la microcápsula con objeto de maximizar la
transcripción/traducción y la clasificación en conjunto. Se prefiere
la determinación empírica del volumen de microcápsula óptimo y de
la concentración del reactivo, por ejemplo como se indica en la
presente memoria.
Un "elemento genético" en el contexto de la
presente invención es como se describió anteriormente.
Preferentemente, un elemento genético es una molécula o montaje
seleccionado de entre el grupo constituido por una molécula de ADN,
una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o
totalmente artificial constituida por bases exclusivamente
sintéticas o una mezcla de bases sintéticas y naturales, cualquiera
de las anteriores unidas a una perla, por ejemplo perlas de
poliestireno y perlas magnéticas o paramagnéticas.
La fracción de ácido nucleico del elemento
genético puede comprender secuencias reguladoras adecuadas, tales
como las requeridas para la expresión eficaz del producto génico,
por ejemplo secuencias activadoras, potenciadoras, de iniciación de
la traducción, secuencias de poliadenilación, secuencias de corte y
empalme y similares.
Como se deducirá a partir de lo expuesto a
continuación, en muchos casos el elemento genético puede estar
compuesto por un ligando o un sustrato que se une directa o
indirectamente al producto génico o reacciona con éste para alterar
las propiedades ópticas del elemento genético. Esto permite la
clasificación del elemento genético basándose en la actividad del
producto génico. El ligando o sustrato puede estar conectado al
ácido nucleico mediante una variedad de medios que resultarán
evidentes para los expertos en la materia (véase, por ejemplo,
Hermanson, 1996).
Una manera en la que la molécula de ácido
nucleico puede estar unida a la microperla es por biotinilación.
Esto puede realizarse por ampliación por PCR con un cebador de
5'-biotinilación de modo que la biotina y el ácido
nucleico están unidos por enlace covalente.
El ligado o sustrato puede estar acoplado al
elemento genético mediante una variedad de medios que son evidentes
para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson,
1996). Un ácido nucleico biotinilado puede estar acoplado a una
microperla de poliestireno o paramagnética (0,02 a aproximadamente
5,0 \mum de diámetro) que está recubierta con avidina o
estreptavidina, que por consiguiente se unirá al ácido nucleico con
muy alta afinidad. Esta perla puede modificarse con sustrato o
ligando por cualquier procedimiento adecuado tal como añadiendo
sustrato biotinilado o por enlace covalente.
Aunque no forma parte de la invención, un ácido
nucleico biotinilado puede acoplarse a la avidina o a la
estreptavidina acomplejado con una molécula de proteína mayor tal
como la tiroglobulina (669 Kd) o ferritina (440 Kd). Este complejo
puede modificarse con sustrato o ligando, por ejemplo por enlace
covalente al grupo \varepsilon-amino de lisinas o
mediante una interacción no covalente tal como
biotina-avidina.
El sustrato puede estar presente en una forma
sin enlace al elemento genético pero que contiene una
"etiqueta" inactiva que requiere una etapa adicional para
activarlo tal como la fotoactivación (por ejemplo de un análogo de
biotina "bloqueado", (Sundberg et al., 1995; Pirrung y
Huang, 1996)). El catalizador que debe seleccionarse a continuación
convierte el sustrato en producto. La "etiqueta" se activa a
continuación y el sustrato "etiquetado" y/o el producto unido
por una molécula que se une a la etiqueta (por ejemplo avidina o
estreptavidina) acomplejada con el ácido nucleico. La relación de
sustrato a producto acoplado al ácido nucleico mediante la
"etiqueta" reflejará por consiguiente la relación del sustrato
y producto en solución.
Una alternativa consiste en acoplar el elemento
genético a un anticuerpo específico para el producto (u otra
molécula específica para el producto). En este escenario, el
sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada
microcápsula sin enlace con el elemento genético, pero tiene una
"etiqueta" molecular (por ejemplo biotina DIG, o DNP o un
grupo fluorescente). Cuando el catalizador que debe seleccionarse
convierte el sustrato en producto, el producto conserva la
"etiqueta" y es capturado a continuación en la microcápsula por
el anticuerpo específico para el producto. De esta manera el
elemento genético sólo llega a estar asociado con la "etiqueta"
cuando codifica o produce una enzima capaz de convertir el sustrato
en producto.
Los términos "aislamiento",
"clasificación" y "selección", así como variaciones de los
mismos, se utilizan en la presente memoria. Aislamiento, en el
contexto de la presente invención, se refiere al proceso de
separación de una entidad de una población heterogénea, por ejemplo
una mezcla, de modo que está exenta de por lo menos una sustancia a
la que se asoció antes del proceso de aislamiento. En una forma de
realización preferida, aislamiento se refiere a la purificación de
una entidad esencialmente para homogeneidad. Clasificación de una
entidad se refiere al proceso de aislar preferentemente entidades
deseadas sobre entidades no deseadas. En cuanto a esto se refiere
al aislamiento de las entidades deseadas, los términos
"aislamiento" y "clasificación" son equivalentes. El
procedimiento de la presente invención permite la clasificación de
elementos genéticos deseados a partir de mezclas (bancos o
repertorios) de elementos genéticos que contienen el elemento
genético deseado. Clasificación se utiliza para referirse al
proceso (incluyendo el proceso de clasificación) de aislar una
entidad según una propiedad particular del
mismo.
mismo.
En una aplicación muy preferida, el
procedimiento de la presente invención es útil para clasificar banco
de elementos genéticos. La invención por consiguiente proporciona
un procedimiento según aspectos anteriores de la invención, en la
que los elementos genéticos se aíslan en un banco de elementos
genéticos que codifica un repertorio de productos génicos. En la
presente invención, los términos "banco", "repertorio" y
"mezcla" se utilizan según su significado ordinario en la
materia, de modo que un banco de elementos genéticos codifica un
repertorio de productos génicos. En general, los bancos se
construyen a partir de mezclas de elementos genéticos y tienen
propiedades que facilitan la clasificación.
La selección inicial de un elemento genético a
partir de un banco de elementos genéticos que utilizando la
presente invención en la mayoría de los casos requerirá la
identificación de un gran número de elementos genéticos variables.
Los bancos de elementos genéticos pueden crearse en una variedad de
diferentes maneras, incluyendo las siguien-
tes.
tes.
Pueden clonarse mezclas de elementos genéticos
naturales a partir de ADN genómico o ADNc (Sambrook et al.,
1989); por ejemplo, bancos de anticuerpos de fago, preparados por
repertorios de ampliación por PCR de genes de anticuerpo de
donantes inmunizados o no inmunizados han demostrado fuentes muy
eficaces de fragmentos de anticuerpo funcional (Winter et
al., 1994; Hoogenboom, 1997). Pueden prepararse también bancos
de genes codificando la totalidad (véase por ejemplo Smith, 1985;
Parmley y Smith, 1988) o parte de los genes (véase por ejemplo
Lowman et al., 1991) o mezclas de genes (véase por ejemplo
Nissim et al., 1994) mediante un oligonucleótido sintético
al azar o aditivado. Pueden prepararse también bancos introduciendo
"al azar" mutaciones en un elemento genético o mezcla de
elementos genéticos mediante una variedad de técnicas in
vivo, que incluyen: utilización de cepas mutantes de bacterias
tales como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986;
Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); utilizando
el sistema de B-linfocitos con hipermutación de
anticuerpos (Yelamos et al., 1995). Mutágenos químicos, e
ionización o irradiación UV (véase Friedberg et al., 1995),
o incorporación de análogos de base mutagénica (Freese, 1959;
Zaccolo et al., 1996) pueden introducir también mutaciones
aleatorias tanto in vivo como in vitro. Pueden
introducirse también mutaciones al azar en genes in vitro
durante la polimerización utilizando, por ejemplo, polimerasas
propensas a error (Leung et al., 1989).
Puede introducirse diversificación adicional
utilizando recombinación homóloga ya sea in vivo (véase
Kowalczykowski et al., 1994) o in vitro (Stemmer,
1994a; Stemmer, 1994b).
Según otro aspecto de la presente invención, por
consiguiente, se proporciona un procedimiento de evolución in
vitro que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- seleccionar uno o más elementos genéticos de un banco de elementos genéticos según el procedimiento de la presente invención;
- (b)
- mutar el/los elemento/s genético/s seleccionado/s con objeto de generar un banco adicional de elementos genéticos que codifica un repertorio para productos génicos; y
- (c)
- repetir de manera iterativa las etapas (a) y (b) con objeto de obtener un producto génico con actividad potenciada.
Pueden introducirse mutaciones en el/los
elemento/s genético/s como se indicó anteriormente.
Los elementos genéticos utilizados en el
procedimiento según la invención codifican ventajosamente enzimas,
preferentemente de interés farmacológico o industrial activadores o
inhibidores, especialmente de sistemas biológicos, tales como
mecanismos de transducción de señal celular, anticuerpos y
fragmentos de los mismos, y otros agentes aglutinantes (por ejemplo
factores de transcripción) adecuados para aplicaciones en
diagnóstico y terapéuticas. En un aspecto preferido, por
consiguiente, la invención permite la identificación y el
aislamiento de productos clínica o industrialmente útiles. En un
aspecto adicional, se describe un producto aislado por el
procedimiento de la
invención.
invención.
Es deseable la selección de condiciones de
encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y del tamaño
del banco que ha de cribarse, puede ser útil organizar el
procedimiento de encapsulación de modo que 1 o menos de 1 elemento
genético es encapsulado por la microcápsula. Esto proporcionará el
mayor poder de resolución. Cuando el banco es mayor y/o más
complejo, sin embargo, esto puede ser impracticable; puede ser
preferible encapsular varios elementos genéticos juntos y basarse
en la aplicación repetida del procedimiento de la invención para
conseguir la clasificación de la actividad deseada. Puede utilizarse
una combinación de procedimientos de encapsulación para obtener el
enriquecimiento deseado.
Los estudios teóricos indican que cuanto mayor
es el número de variantes de elementos genéticos creados mayor
probablemente es una molécula que se creará con las propiedades
deseadas (véase Perelson y Oster, 1979 para una descripción de cómo
se aplica esto a los repertorios de anticuerpos). Recientemente se
ha confirmado también en la práctica que los mayores repertorios de
fago-anticuerpo de hecho dan lugar a más anticuerpos
con mejores afinidades de unión que los repertorios más pequeños
(Griffiths et al., 1994). Para garantizar que se generan
variantes raras y de este modo son capaces de seleccionarse, es
deseable un tamaño de banco mayor. Por lo tanto, es beneficiosa la
utilización de microcápsulas óptimamente pequeñas.
El mayor repertorio creado hasta la fecha
utilizando procedimientos que requieren una etapa in vivo
(sistemas de exposición en fagos y LacI) ha sido un banco de
fago-péptido de 1,6 x 10^{11} clones que requería
la fermentación de 15 litros de bacterias (Fisch et al.,
1996). Experimentos SELEX se llevan a cabo con frecuencia sobre un
número muy grande de variantes (hasta 10^{15}).
Utilizando la presente invención, a un diámetro
de microcápsula preferido de 2,6 \mum, puede seleccionarse un
tamaño de repertorio de por lo menos 10^{11} utilizando 1 ml de
fase acuosa en 20 ml de emulsión.
Además de los elementos genéticos descritos
anteriormente, las microcápsulas utilizadas en el procedimiento
según la invención comprenderán componentes adicionales requeridos
para que tenga lugar el proceso de clasificación. Otros componentes
del sistema comprenderán por ejemplo los necesarios para la
transcripción y/o traducción del elemento genético. Estos se
seleccionan para los requisitos de un sistema específico a partir de
lo siguiente; un tampón adecuado, un sistema de
transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de
traducción in vitro que contiene todos los ingredientes
necesarios, enzimas y cofactores, ARN-polimerasa,
nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), los ARN de
transferencia, ribosomas y aminoácidos y los sustratos de la
reacción de interés con objeto de permitir la clasificación del
producto génico modificado.
Un tampón adecuado será aquel en el que todos
los componentes deseados del sistema biológico son activos y por
consiguiente dependerán de los requisitos de cada sistema de
reacción específico. Los tampones adecuados para las reacciones
biológicas y/o químicas son conocidos en la técnica y las recetas se
proporcionan en varios textos de laboratorio, tales como Sambrook
et al., 1989.
El sistema de traducción in vitro
comprenderá normalmente un extracto celular, por lo general de
bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991;
Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976), o
germen de trigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas
adecuados están disponibles en el mercado (por ejemplo en Promega)
incluyendo algunos que permiten la transcripción/traducción acoplada
(todos los sistemas bacterianos y los sistemas de reticulocitos y
de extracto de germen de trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de
aminoácidos utilizados puede incluir aminoácidos sintéticos si se
desea, para aumentar el posible número o variedad de proteínas
producidas en el banco. Esto puede realizarse cargando los ARNt con
aminoácidos artificiales y utilizando estos ARNt para la traducción
in vitro de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman
et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).
Después de cada ronda de clasificación el
enriquecimiento de la mezcla de elementos genéticos para los que
codifican las moléculas de interés puede ensayarse mediante
transcripción/replicación in vitro no compartimentada o
reacciones acopladas de transcripción/traducción. La mezcla
seleccionada se clona en un vector plásmido adecuado y se produce
ARN o proteína recombinante a partir de los clones individuales para
purificación adicional y ensayo.
En un aspecto preferido, el medio interno de una
microcápsula puede alterarse mediante la adición de reactivos a la
fase aceitosa de la emulsión. Los reactivos se difunden por la fase
aceitosa hasta el medio acuoso de microcápsulas. Preferentemente,
los reactivos son por lo menos parcialmente solubles en agua, de
modo que una proporción de los mismos se distribuye desde la fase
aceitosa al medio acuoso de microcápsulas. Ventajosamente, los
reactivos son sustancialmente insolubles en la fase aceitosa. Los
reactivos se mezclan preferentemente en la fase aceitosa por
mezclado mecánico, por ejemplo agitando.
Los reactivos que pueden añadirse por la fase
aceitosa incluyen sustratos, componentes tamponantes, factores y
similares. En particular, el pH interno de las microcápsulas puede
alterarse in situ añadiendo componentes ácidos o básicos a
la fase aceitosa.
Una vez el elemento genético que codifica un
producto génico se ha clasificado por el procedimiento de la
invención, el propio elemento genético puede expresarse directamente
por medios convencionales para producir el producto génico. Sin
embargo, pueden emplearse técnicas alternativas, como es evidente
para los expertos en la materia. Por ejemplo, la información
genética incorporada en el producto génico puede incorporarse en un
vector de expresión adecuada, y expresarse en éste.
Pueden utilizarse técnicas de identificación
convencionales para identificar compuestos que son capaces de
interactuar con los productos génicos identificados por el primer
aspecto de la invención. Por ejemplo, el producto génico que
codifica un ácido nucleico se incorpora en un vector, y se introduce
en células hospedadoras adecuadas para producir estirpes celulares
transformadas que expresan el producto génico. Las estirpes
celulares resultantes pueden producirse a continuación por análisis
cualitativo y/o cuantitativo reproducibles del efecto o de los
efectos de fármacos potenciales que afectan la función del producto
génico. Por lo tanto las células que expresan el producto génico
pueden emplearse para la identificación de compuestos,
particularmente compuestos de pequeño peso molecular, que modulan
la función del producto génico. De este modo las células
hospedadoras que expresan el producto génico son útiles para la
identificación de fármacos y además se describe un procedimiento
para identificar compuestos que en la actividad del producto génico,
comprendiendo dicho procedimiento exponer las células que contienen
el producto génico que codifica el ADN heterólogo, en el que dichas
células producen el producto génico funcional, para por lo menos un
compuesto o mezcla de compuestos o señal cuya capacidad para
modular la actividad de dicho producto génico se busca para ser
determinada y a continuación el control de dichas células para
cambios producidos por dicha modulación. Dicho ensayo permite la
identificación de moduladores, tales como agonistas, antagonistas y
moduladores alostéricos, del producto génico. Tal como se utiliza
en la presente memoria, un compuesto o señal que modula la actividad
del producto génico se refiere a un compuesto que altera la
actividad del producto génico de tal manera que la actividad del
producto génico es diferente en la presencia del compuesto o señal
(en comparación con la ausencia de dicho compuesto o señal).
Pueden diseñarse ensayos de identificación
basados en células construyendo estirpes celulares en las que la
expresión de una proteína indicadora, es decir, una proteína
fácilmente analizable, tal como la
\beta-galactosildasa,
cloranfelicol-acetiltransferasa (CAT), la proteína
verde fluorescente (GFP) o luciferasa, depende del producto génico.
Dicho análisis permite la detección de compuestos que modulan
directamente la función del producto génico, tales como los
compuestos que antagonizan el producto génico, o los compuestos que
inhiben o potencian otras funciones celulares requeridas para la
actividad del producto génico.
Los procesos que se producen en las células que
dependen de un producto génico pueden ser afectados de manera
exógena. El producto génico recombinante que produce células
hospedadoras, por ejemplo células de mamífero, puede ponerse en
contacto con el compuesto de ensayo, y el/los efecto/s de modulación
de los mismos puede evaluarse a continuación comparando la
respuesta mediada por el producto génico en presencia y ausencia del
compuesto de ensayo, o relacionando la respuesta mediada por el
producto génico de las células de ensayo, o de las células de
referencia (es decir, células que no expresan el producto génico),
para la presencia del compuesto.
Mediante la invención, pueden optimizarse
enzimas implicadas en la preparación de un compuesto por
clasificación de la actividad óptima. Este procedimiento implica la
preparación de variantes del polipéptido que deben identificarse,
que se equiparan con un banco de polipéptidos citados en la presente
memoria. Las variantes deben prepararse de la misma manera que los
bancos expuestos en cualquier parte en la presente memoria.
El sistema puede configurarse para seleccionar
moléculas de ARN, ADN o del producto génico de proteínas con
actividad catalítica, reguladora o aglutinante.
En el caso de la selección de un producto génico
con afinidad para un ligando específico el elemento genético puede
estar unido al producto génico en la microcápsula mediante el
ligando. Solamente los productos génicos con afinidad para el
ligando se unirán por consiguiente al elemento genético y solamente
aquellos elementos genéticos con el producto génico unido mediante
el ligando adquirirán las propiedades ópticas alteradas que les
permiten mantenerse en la etapa de selección. En esta forma de
realización, el elemento genético comprenderá de este modo un ácido
nucleico que codifica el producto génico unido a un ligando para el
producto génico.
El cambio en las propiedades ópticas del
elemento genético después de la unión del producto génico al ligando
puede producirse de varias maneras, incluyendo:
- (1)
- el propio producto génico puede tener propiedades ópticas distintas, por ejemplo, es una proteína fluorescente (proteína verde fluorescente, (Lorenz et al., 1991)).
- (2)
- las propiedades ópticas del elemento génico pueden modificarse en la unión al ligando, por ejemplo, la fluorescencia del producto génico se extingue o aumenta en la unión (Guixe et al, 1998; Qi y Grabowski, 1998).
- (3)
- Las propiedades ópticas del ligando pueden modificarse en la unión del producto génico, por ejemplo, la fluorescencia del ligando se extingue o aumenta en la unión (Voss, 1993; Masui y Kuramitsu, 1998).
- (4)
- Las propiedades ópticas tanto del ligando como del producto génico pueden modificarse en la unión, por ejemplo, puede existir una transferencia de energía de resonancia con fluorescencia (FRET) desde el ligando al producto génico (o viceversa) dando como resultado la misión en la longitud de onda de emisión del "receptor" cuando la excitación está en la longitud de onda de absorción del "donante" (Heim & Tsien, 1996; Mahajan et al., 1998; Miyawaki et al., 1997).
En esta forma de realización, no es necesario
para la unión del producto génico al elemento genético mediante el
ligando para provocar directamente un cambio en las propiedades
ópticas. Todos los productos génicos que han de seleccionarse
pueden contener un supuesto dominio de unión, que tiene que ser
seleccionado para, y una característica común, una etiqueta. El
elemento genético en cada microcápsula está físicamente unido al
ligando. Si el producto génico producido a partir del elemento
genético tiene afinidad para el ligando, se unirá a él y llegará a
estar físicamente unido al mismos elemento genético que lo codifica,
dando como resultado el elemento genético que está
"etiquetado". Al final de la reacción, todas las microcápsulas
se combinan, y todos los elementos genéticos y los productos
génicos se mezclan en un medio. Los elementos genéticos que
codifican los productos génicos que presentan la unión deseada
pueden seleccionarse añadiendo reactivos que se unen
específicamente a la "etiqueta", o reaccionan específicamente
con ésta, y de este modo provocan un cambio en las propiedades
ópticas del elemento genético permitiendo esta clasificación. Por
ejemplo, puede utilizarse un anticuerpo anti"etiqueta" marcado
por fluorescencia, o un anticuerpo anti"etiqueta" seguido de
un segundo anticuerpo marcado con fluorescencia que se une al
primero.
primero.
En una forma de realización alternativa, pueden
clasificarse los elementos genéticos basándose en que el producto
génico, que se une al ligando, oculta meramente el ligando, por
ejemplo, de compañeros de unión adicionales que si no modificarían
las propiedades ópticas del elementos genético. En este caso se
seleccionarían los elementos genéticos con propiedades ópticas
inalteradas.
En una forma de realización alternativa, la
invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de
la invención, en el que los productos génicos se unen a elementos
genéticos que les codifican. Los productos génicos junto con los
elementos genéticos acoplados se clasifican entonces como resultado
de la unión de un ligando a los productos génicos con la actividad
de unión deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos pueden
contener una zona invariable que se une por enlace covalente o no
covalente al elemento genético, y una segunda zona que está
diversificada con el fin de generar la actividad de unión
deseada.
En una forma de realización alternativa, el
ligando para el producto génico es él mismo codificado por el
elemento genético y se une al elemento genético. Dicho de otra
manera, el elemento genético codifica dos (o de hecho más)
productos génicos, por lo menos uno de los cuales se une al elemento
genético, y que pueden unirse potencialmente entre sí. Solamente
cuando los productos génicos interactúan en una microcápsula es el
elemento genético modificado de una manera que produce por último un
cambio en sus propiedades ópticas que permite que se clasifique.
Esta forma de realización, por ejemplo, se publicó para buscar
bancos génicos para pares de genes que codifican pares de proteínas
que se unen entre sí.
La fluorescencia puede aumentarse mediante la
utilización de la ampliación Tyramide Signal Amplification
(TSA^{TM}) para hacer fluorescentes los elementos genéticos. Esto implica la unión de la peroxidasa (unida a otra proteína) a los elementos genéticos y catalizar la conversión de fluoresceína-tiramina en una forma de radical libre que reacciona a continuación (localmente) con los elementos genéticos. Los procedimientos para llevar a cabo la TSA son conocidos en la técnica, y están comercializados kits de NEN.
(TSA^{TM}) para hacer fluorescentes los elementos genéticos. Esto implica la unión de la peroxidasa (unida a otra proteína) a los elementos genéticos y catalizar la conversión de fluoresceína-tiramina en una forma de radical libre que reacciona a continuación (localmente) con los elementos genéticos. Los procedimientos para llevar a cabo la TSA son conocidos en la técnica, y están comercializados kits de NEN.
La TSA puede configurarse de modo que de como
resultado un aumento directo en la fluorescencia del elemento
genético, o de modo que un ligando está acoplado al elemento
genético que está unido por una segunda molécula fluorescente, o
una secuencia de moléculas, una o más de las cuales es
fluorescente.
Cuando la clasificación es para la catálisis, el
elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato
de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico
capaz de actuar como catalizador, el producto génico catalizará la
conversión del sustrato en el producto. Por consiguiente, al final
de la reacción el elemento genético está físicamente unido al
producto de la reacción catalizada.
Puede ser deseable también, en algunos casos,
que el sustrato no sea un componente del elemento genético. En este
caso el sustrato contendría una "etiqueta" inactiva que
requiere una etapa adicional para activarlo tal como la
fotoactivación (por ejemplo de un análogo de biotina
"bloqueado" (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang,
1996)). El catalizador que debe seleccionarse a continuación
convierte el sustrato en producto. La "etiqueta" se activa a
continuación y el sustrato "etiquetado" y/o el producto unido
mediante una molécula que se une a la etiqueta (por ejemplo avidina
o estreptavidina) acomplejada con el ácido nucleico. La relación de
sustrato a producto acoplado al ácido nucleico mediante la
"etiqueta" reflejará por consiguiente la relación del sustrato
y producto en solución.
Las propiedades ópticas de los elementos
genéticos con el producto acoplado y que codifica productos génicos
con la actividad catalítica deseada pueden ser modificadas por:
- (1)
- el complejo producto-elemento genético con propiedades ópticas características no encontradas en el complejo sustrato-elemento genético, debido a, por ejemplo;
- (a)
- el sustrato y el producto con diferentes propiedades ópticas (muchos sustratos de enzima fluorógenos están disponibles en el mercado (véase por ejemplo Haugland, 1996) incluyendo sustratos para glucosidasas, fosfatasas, peptidasas y proteasas (Craig et al., 1995; Huang et al., 1992; Brynes et al., 1982, Jones et al., 1997; Matayoshi et al. 1990; Wang et al., 1990)), o
- (b)
- el sustrato y el producto con propiedades ópticas similares, pero sólo el producto, y no el sustrato se une al elemento genético o reacciona con éste;
- (2)
- añadir reactivos que se unen específicamente al producto, o reaccionan con éste y que por esto provocan un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos que permiten sus clasificación (estos reactivos pueden añadirse antes o después de romper las microcápsulas y mezclar los elementos genéticos). Los reactivos:
- (a)
- se unen específicamente al producto, o reaccionan específicamente con éste, y no al sustrato, si tanto el sustrato como el producto están unidos al elemento genético, o
- (b)
- opcionalmente se unen tanto al sustrato como al producto si solamente el producto, y no el sustrato se une al elemento genético, o reacciona con éste;
Los elementos genéticos mezclados que codifican
moléculas catalíticas pueden enriquecerse entonces seleccionando
los elementos genéticos con propiedades ópticas modificadas.
Una alternativa consiste en acoplar el ácido
nucleico a un anticuerpo específico para el producto (u otra
molécula específica para el producto). En este escenario, el
sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada
microcápsula no unida al elemento genético, pero tiene una
"etiqueta" molecular (por ejemplo, biotina, DIG, o DNP o un
grupo fluorescente). Cuando el catalizador que debe seleccionarse
convierte el sustrato en producto, el producto conserva la
"etiqueta" y es capturado a continuación en la microcápsula por
el anticuerpo específico para el producto. De esta manera el
elemento genético solamente llega a estar asociado con la
"etiqueta" cuando codifica o produce una enzima capaz de
convertir el sustrato en producto. Cuando se interrumpen todas las
reacciones y se combinan las microcápsulas, los elementos genéticos
que codifican enzimas activas estarán "etiquetados" y pueden
ya presentar propiedades ópticas alteradas, por ejemplo, si la
"etiqueta" era un grupo fluorescente. Alternativamente, un
cambio en las propiedades ópticas de genes "etiquetados" puede
provocarse añadiendo un ligando marcado con fluorescencia que se
une a la "etiqueta" (por ejemplo,
avidina-estreptavidina marcada con fluorescencia,
un anticuerpo antietiqueta que es fluorescente o un anticuerpo
anti"etiqueta" no fluorescente que puede ser detectado por un
segundo anticuerpo marcado con fluorescencia.
Alternativamente, la selección puede realizarse
directamente acoplando una primera reacción a las reacciones
posteriores que tienen lugar en la misma microcápsula. Existen dos
maneras generales en las que esto puede realizarse. En una primera
forma de realización, el producto de la primera reacción se hace
reaccionar con, o se une mediante, una molécula que no reacciona
con el sustrato de la primera reacción. Una segunda, reacción
acoplada solamente continuará en presencia del producto de la
primera reacción. Un elemento genético que codifica un producto
génico con una actividad deseada puede purificarse a continuación
utilizando los procedimientos del producto de la segunda reacción
para provocar un cambio en las condiciones ópticas del elemento
genético como anterior-
mente.
mente.
Alternativamente, el producto de la reacción que
se selecciona puede ser el sustrato o un cofactor para una segunda
reacción catalizada por enzimas. La enzima para catalizar la segunda
reacción puede ser trasladada in situ a las microcápsulas o
incorporada en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación.
Solamente cuando procede la primera reacción la enzima acoplada
generará un producto que puede utilizarse para provocar un cambio
en las propiedades ópticas del elemento genético como
anteriormente.
Este concepto de acoplamiento puede elaborarse
para incorporar múltiples enzimas, utilizando cada una como
sustrato el producto de la reacción anterior. Esto permite la
selección de enzimas que no reaccionarán con un sustrato
inmovilizado. Puede diseñarse también para proporcionar aumento de
sensibilidad mediante la ampliación de señal si un producto de una
reacción es un catalizador o un cofactor para una segunda reacción o
una serie de reacciones que conduce a un producto seleccionable
(por ejemplo, véase Johannsson y Bates, 1988; Johannsson, 1991).
Además un sistema enzimático en cascada puede basarse en la
producción de un activador para una enzima o en la destrucción de
un inhibidor enzimático (véase Mize et al., 1989). El
acoplamiento también tiene la ventaja de que puede utilizarse un
sistema de clasificación común como grupo completo de enzimas que
generan el mismo producto y que permite la selección de
transformaciones químicas complicadas que no puede realizarse en
una sola
etapa.
etapa.
Dicho procedimiento de acoplamiento permite de
este modo la evolución de nuevas "series de reacciones
metabólicas" in vitro paso a paso, seleccionando y
mejorando en primer lugar una etapa y a continuación la siguiente.
La estrategia de selección está basada en el producto final de la
serie de reacciones, de modo que todas las etapas preliminares
pueden evolucionar independientemente o sucesivamente sin organizar
un nuevo sistema de selección para cada etapa de la reacción.
Expresado de manera alternativa, se proporciona
un procedimiento de aislamiento de uno o más elementos genéticos
que codifican un producto génico con una actividad catalítica
deseada, que comprende las etapas siguientes:
- (1)
- expresar los elementos genéticos para proporcionar sus respectivos productos génicos;
- (2)
- permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato en un producto, que puede o no ser directamente seleccionable, según la actividad deseada;
- (3)
- acoplar opcionalmente la primera reacción a una o más reacciones ulteriores, siendo modulada cada reacción por el producto de las reacciones anteriores, y conduciendo a la creación de un producto seleccionable final;
- (4)
- unir el producto seleccionable de la catálisis a los elementos genéticos por:
- (a)
- acoplar un sustrato a los elementos genéticos de tal manera que el producto permanezca asociado a los elementos genéticos, o
- (b)
- hacer reaccionar o unir el producto seleccionable a los elementos genéticos mediante una "etiqueta" molecular adecuada acoplada al sustrato que permanece en el producto, o
- (c)
- acoplar el producto seleccionable (pero no el sustrato) a los elementos genéticos mediante una reacción específica para el producto o interacción con el producto; y
- (5)
- seleccionar el producto de la catálisis, junto con el elemento genético al que está unido, por medio de sus propiedades ópticas características, o añadiendo los reactivos que se unen específicamente al producto, o reaccionan específicamente con éste, y que por esto provocan un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos en donde las etapas (1) a (4) cada elemento genético y el producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.
\vskip1.000000\baselineskip
Los elementos genéticos que codifican enzimas
con especificidad o selectividad para el sustrato pueden
enriquecerse específicamente llevando a cabo una selección positiva
para la reacción con un sustrato y una clasificación negativa para
la reacción con otro sustrato. Dicha presión de selección positiva y
negativa combinada sería de gran importancia en el aislamiento de
enzimas regio-selectivas y
estéreo-selectivas (por ejemplo, las enzimas que
pueden distinguir entre dos enantiómeros del mismo sustrato). Por
ejemplo, dos sustratos (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) se
marcan cada una con diferentes etiquetas (por ejemplo dos
fluoróforos diferentes) de modo que las etiquetas llegarán a unirse
al elemento genético mediante la reacción catalizada por enzimas.
Si las dos etiquetas comunican propiedades ópticas diferentes al
elemento genético la especificidad del sustrato de la enzima puede
determinarse a partir de las propiedades ópticas del elemento
genético y se rechazan los elementos genéticos que codifican
productos génicos con especificidad equivocada (o no). Las etiquetas
que no proporcionan ningún cambio de actividad óptica pueden
utilizarse también si se añaden los ligandos específicos para la
etiqueta con diferentes propiedades ópticas (por ejemplo anticuerpos
específicos para la etiqueta marcados con fluoróforos
diferentes).
\vskip1.000000\baselineskip
Un sistema similar puede utilizarse para
seleccionar propiedades reguladoras de enzimas.
En el caso de la selección de una molécula
reguladora que actúa como activador o inhibidor de un proceso
bioquímico, los componentes del proceso bioquímico pueden
trasladarse in situ en cada microcápsula o pueden
incorporarse en la mezcla de reacción antes de la
microencapsulación. Si el elemento genético que se está
seleccionando es para codificar un activador, puede realizarse la
selección del producto de la reacción regulada, como se describió
anteriormente en relación con la catálisis. Si se desea un
inhibidor, la selección puede ser de una propiedad química
específica para el sustrato de la reacción regulada.
Se proporciona por consiguiente un procedimiento
de clasificación de uno o más elementos genéticos que codifican un
producto génico que presenta una actividad reguladora deseada, que
comprende las etapas siguientes:
- (1)
- expresar los elementos genéticos para proporcionar sus productos génicos respectivos;
- (2)
- dejar que los productos génicos activen o inhiban una reacción bioquímica, o una secuencia de reacciones acopladas, según la actividad deseada, de tal manera que permitan la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;
- (3)
- unir la molécula seleccionable a los elementos genéticos
- (a)
- teniendo la molécula seleccionable o el sustrato del que derivan, acoplado a los elementos genéticos, o
- (b)
- haciendo reaccionar o uniendo el producto seleccionable a los elementos genéticos, por medio de una "etiqueta" molecular adecuada acoplada al sustrato que permanece sobre el producto, o
- (c)
- acoplar el producto de catálisis (pero no el sustrato) a los elementos genéticos, mediante una reacción específica para el producto o la interacción con el producto;
- (4)
- seleccionar el producto seleccionable, junto con el elemento genético al que está unido, ya sea mediante sus propiedades ópticas características, o mediante la adición de reactivos que se unen específicamente al producto, o reaccionan específicamente con el mismo, y que provocan de este modo un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos en donde las etapas (1) a (3) cada elemento genético y cada producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.
\vskip1.000000\baselineskip
Es posible seleccionar las propiedades ópticas
inherentes de los producto génicos si, en las microcápsulas, el
producto génico se vuelve a unir al elemento genético, por ejemplo
mediante un elemento común del producto génico que se une a un
ligando que forma parte del elemento genético. Después de la mezcla
los elementos genéticos pueden clasificarse utilizando las
propiedades ópticas de los productos génicos unidos. Esta forma de
realización puede utilizarse, por ejemplo, para seleccionar
variantes de proteína verde fluorescente (GFP) (Cormack et
al., 1996; Delagrave et al., 1995; Ehrig et al.,
1995), con fluorescencia mejorada y/o nuevos espectros de absorción
y emisión.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización preferida de la
invención los elementos genéticos se clasificarán por citometría de
flujo. Una variedad de propiedades ópticas puede utilizarse para
activar la clasificación, incluyendo la dispersión de la luz
(Kerker, 1983) y la polarización de fluorescencia (Rolland et
al., 1985). En una forma de realización muy preferida la
diferencia en las propiedades ópticas de los elementos genéticos
será una diferencia en fluorescencia y los elementos genéticos se
clasificarán utilizando un clasificador de células activadas por
fluorescencia (Norman, 1980; Mackenzie y Pinder, 1986), o un
dispositivo similar. En una forma de realización especialmente
preferida el elemento genético comprende una microperla no magnética
ni fluorescente (por ejemplo poliestireno) o paramagnética (véase
Fornusek y Vetvicka, 1986), de manera óptima 0,6 a 1,0 \mum de
diámetro, al que se acoplan tanto el gen como los grupos implicados
en generar una señal fluorescente:
- (1)
- equipo de clasificación de células activadas por fluorescencia disponibles en el mercado en los fabricantes establecidos (por ejemplo Becton-Dickinson, Coulter) permite la clasificación de hasta 10^{8} elementos genéticos (episodios) por hora;
- (2)
- la señal de fluorescencia de cada perla corresponde estrechamente con el número de moléculas fluorescentes unidas a la perla. En el presente tan pocas como unos pocos centenares de moléculas fluorescentes por partícula pueden detectarse cuantitativamente;
- (3)
- el amplio intervalo dinámico de los detectores por fluorescencia (por lo general 4 unidades logarítmicas) permite el fácil escenario de la severidad del procedimiento de clasificación, permitiendo de este modo la recuperación del número óptimo de elementos genéticos de la mezcla de partida (pueden fijarse controles para separar perlas con pequeñas diferencias de fluorescencia o para separar solamente perlas con grandes diferencias de fluorescencia, dependiendo de la clasificación que se lleve a cabo);
- (4)
- el equipo de clasificación de células activadas por fluorescencia disponible en el mercado puede llevar a cabo la excitación simultánea en más de dos longitudes de onda diferentes y detectar la fluorescencia hasta en cuatro longitudes de onda diferentes (Shapiro, 1983) permitiendo que se lleven a cabo selecciones positivas y negativas simultáneamente controlando el etiquetado del elemento genético con dos (o más) marcadores fluorescentes diferentes, por ejemplo, si dos sustratos alternativos para una enzima (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) se marcan con diferentes etiquetas fluorescentes el elemento genético puede marcarse con diferentes fluoróforos dependientes del sustrato utilizado y solamente los genes que codifican enzimas con enantioselectividad seleccionada.
- (5)
- micropartículas (perlas) no magnéticas y paramagnéticas modificadas y sin modificar muy uniformes están disponibles en el mercado de muchos proveedores (por ejemplo Sigma y molecular Probes) (Fornusek y Vetvicka, 1986).
\vskip1.000000\baselineskip
Se valorará también que para todos los procesos
de transcripción/replicación y/o traducción, y clasificación no sea
necesario continuar en una sola etapa, con todas las reacciones que
tienen lugar en una microcápsula. El procedimiento de clasificación
puede comprender dos o más etapas. En primer lugar, la
transcripción/replicación y/o la traducción de cada elemento
genético de un banco de elementos genéticos puede tener lugar en una
primera microcápsula. Cada producto génico se une a continuación al
elemento genético que lo codifica (que reside en la misma
microcápsula), por ejemplo mediante un ligando específico para el
producto génico tal como un anticuerpo. Las microcápsulas se rompen
a continuación, y los elementos genéticos se acoplan a sus productos
génicos respectivos opcionalmente purificados. Alternativamente,
los elementos genéticos pueden acoplarse a sus productos génicos
respectivos utilizando procedimientos que no se basan en la
encapsulación. Por ejemplo la exposición en fagos (Smith, G.P.,
1985), exposición en polisomas (Mattheakkis et al., 1994),
ARN-péptido de fusión (Roberts y Szostak, 1997) o
la fusión del péptido represor (Cull, et al., 1992).
En la segunda etapa del procedimiento, cada
elemento genético purificado acoplado a su producto génico se
coloca en una segunda microcápsula que contiene componentes de la
reacción que deben seleccionarse. Esta reacción se inicia a
continuación. Una vez completadas las reacciones, las microcápsulas
se rompen de nuevo y los elementos genéticos modificados se
seleccionan. En el caso de reacciones multietapa complicadas en las
que están implicados muchos componentes individuales y etapas de
reacción, pueden realizarse una o más etapas intervinientes entre
la etapa inicial de creación y la unión del producto génico al
elemento genético, y la etapa final de generación del cambio
seleccionable en el elemento genético.
Si fuera necesario, puede conseguirse la
liberación del producto génico del elemento genético en una segunda
microcápsula secundaria de varias maneras, incluyendo por
competencia específica por un producto de bajo peso molecular para
el punto de unión o la escisión de una zona enlazadora que une el
dominio de unión del producto génico del dominio catalítico ya sea
enzimáticamente (utilizando proteasas específicas) o
autocatalíticamente (utilizando un dominio de integrina).
\vskip1.000000\baselineskip
El sistema puede configurarse de modo que la
actividad de unión, catalítica o reguladora deseada codificada por
un elemento genético conduzca, directa o indirectamente, a la
activación de la expresión de un "gen indicador" que está
presente en todas las microcápsulas. Solamente los productos génicos
con la actividad deseada activan la expresión del gen indicador. La
actividad resultante de la expresión del gen indicador permite la
selección del elemento genético (o del compartimento que lo
contiene) por cualquiera de los procedimientos descritos en la
presente
memoria.
memoria.
Por ejemplo, la activación del gen indicador
puede ser el resultado de una actividad de unión del producto
génico de manera análoga al "sistema de dos híbridos" (Fields y
Song, 1989). La activación puede también ser el resultado del
producto de una reacción catalizada por un producto génico deseable.
Por ejemplo, el producto de reacción puede ser un inductor de
transcripción del gen indicador. Por ejemplo la arabinosa puede
utilizarse para provocar la transcripción del activador araBAD. La
actividad del producto génico deseable puede también dar como
resultado la modificación de un factor de transcripción, dando como
resultado la expresión del gen indicador. Por ejemplo, si el
producto génico deseado es una cinasa o una fosfatasa la
fosforilación o la desfosforilación de un factor de transcripción
puede conducir a la activación de la expresión del gen
indicador.
\vskip1.000000\baselineskip
Los elementos genéticos pueden ampliarse. La
ampliación selectiva puede utilizarse como medio para enriquecer
los elementos genéticos que codifican el producto génico
deseado.
En todas las configuraciones anteriores, el
material genético comprendido en los elementos genéticos puede
ampliarse y repetirse el proceso en etapas iterativas. La ampliación
puede ser por reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et
al., 1988) o utilizando una de varias otras técnicas de
ampliación génica incluyendo; la ampliación de la
Qb-replicasa (Cahill, Foster y Mahan, 1991;
Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kumasov y Spirin, 1995); la
reacción en cadena de la ligasa (RCL) (Landegren et al.,
1988; Barany, 1991); el sistema de replicación de secuencias
automantenido (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991) y la ampliación por
desplazamiento de cadena (Walker et al.,
1992).
1992).
En los ejemplos siguientes se ilustran varios
aspectos y formas de realización de la presente invención. Se
valorará que la modificación de detalle pueda realizarse sin
apartarse del alcance de la invención.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Ejemplo
1
(A título ilustrativo
solamente)
Un formato para la selección de elementos
genéticos utilizando un cambio en sus propiedades ópticas es aquel
en el que el elemento genético comprende una microperla a la que se
une el gen. Se muestra entonces cómo un gen para una enzima
(dihidrofolato-reductasa de E. coli) puede
unirse a una perla paramagnética y se traduce in vitro tan
eficazmente como en solución.
El gen folA de E. coli que
codifica la dihidrofolato-reductasa (DHFR) se amplía
por PCR utilizando EDHFRFo y EDHFRBa. Este ADN se clona a
continuación en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido
con HindIII y KpnI corriente abajo del activador lac y del
activador de T7 ARN-polimerasa del. El
oligonucleótido EDHFRBa se añade al punto de partida de la
traducción del gen 10 del fago T7 eficaz corriente arriba del codón
de iniciación de DHFR.
El secuenciado del ADN identifica un clon que
tiene la secuencia nucleotídica correcta. Las bacterias
transformadas con este clon (pGEM-foIA) se observa
que sobreexpresan el DHFR activo (conducido desde el activador lac)
cuando se inducen con IPTG.
El gen folA en el plásmido
pGEM-folA se amplía por PCR a continuación
utilizando los cebadores folA-FW y
folA-BW, el fragmento de ADN resultante en HindIII y
XhoI se digiere y se subclona en el vector de expresión pET23a
digerido con HindIII/XhoI (Novagen) para dar el montaje pET23a/folA.
La secuencia del gen folA ampliado por PCR fue verificada por
secuenciado.
Se amplió más el pET23a/folA con los cebadores
pETfor.b y pETrev.b biotinilados en 5' y radiomarcados incluyendo
10 \muCi \alpha^{35}S-dATP (Amersham Pharmacia
Biotech, U.K.) en la mezcla de PCR. El fragmento
T7-folA biotinilado dos veces de 1.765 pb
resultante se purificó en gel utilizando el kit con Qiagen y se
analizó cuantitativamente por espectrometría. La actividad
específica del producto fue 210.000 CPM/pmol T7-folA
ADN, medida en el contador de centelleo Beckman LS6000SC. Se
prepararon diluciones 10 nM y 1 nM en 1 mg/ml de ADN lambda
digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al
plástico). Este fragmento de la PCR se utilizó después para
programar un sistema procariótico de transcripción/traducción
acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley,
Brow y Burgess, 1991). Se utiliza una preparación comercial de este
sistema (Sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas
lineales; Promega) enriquecido con T7 ARN polimerasa (10^{3}
unidades).
El fragmento de ADN está unido a perlas
paramagnéticos con estreptavidina (perlas Sera-Mag,
de 0,74 \mum de diámetro, capacidad de unión a la biotina 46
nmol/mg, Seradyn, US), recubiertas parcialmente con proteína A
biotinilada (Sigma). Se añaden 2 \mul de proteína A biotinilada 80
\mum a 100 \mul (1 mg) de perlas, se deja unir a temperatura
ambiente durante 1 hora, se lavan una vez y se cubren durante una
hora a temperatura ambiente con IgG de conejo (1 mg/ml de
anticuerpo 10 \mul por 1 mg de perlas en
TBS/Tween-20 al 0,1% (TBST)). Las perlas se lavaron
dos veces a continuación con TBS/T antes de que se añadiera ADN
T7-folA radiomarcado y biotinilado y se dejó unir
durante 1 hora a temperatura ambiente. Se calculó la cantidad de
T7-folA ADN unido haciendo un recuento de la
radioactividad unida a una alícuota de perlas. Se unió \sim50% del
ADN total.
Los fragmentos de ADN unidos en perlas o el
fragmento de ADN no unido se añaden directamente al sistema de
extracto de S30. Las reacciones se incuban durante 2 horas a
37ºC.
Se analizó la actividad de
dihidrofolato-reductasa por espectrofotometría
controlando la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante 10
minutos tal como se describe (Williams et al., 1979; Ma et
al., 1993). 2 \mul de cada reacción de traducción enfriada
in vitro se añaden a 150 \mul de tampón A (Imidazol 100
mM, pH 7,0, \beta-mercaptoetanol 10 mM) y 20
\mul de NADPH 1 mM. Se añaden 20 \mul de dihidrofolato (1 mM)
(H_{2}F) después de 1 minuto y la reacción se controla a 340 nm
utilizando un lector de microplacas ThermoMax (Molecular Devices).
Se calcula la actividad por velocidades iniciales en condiciones
So>>K_{M} (\numax).
No existe diferencia significativa en la
cantidad de DHFR activa producida si el ADN está libre, o acoplado
mediante biotinas terminales a una perla recubierta con
estreptavidina (véase la figura 1).
Ejemplo
2
Un formato para la clasificación de elementos
genéticos es aquel en el que el elemento genético comprende un gen
unido a una microperla y el producto se vuelve a acoplar sobre la
microperla en la microcápsula resultando, directa o indirectamente,
un cambio en las propiedades ópticas de la microperla que permite
que se clasifique.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se demuestra que una proteína fluorescente
(proteína verde fluorescente o GFP) puede transcribirse y traducirse
in vitro en genes acoplados a microperlas individuales
encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua
en aceite y el producto génico traducido volver a unirse a las
microperlas que les hacen fluorescen-
tes.
tes.
La GFP en el plásmido pBS/GFP6 (Siemering et
al., 1996) se amplió por PCR utilizando los cebadores
GFP-FW y GFP-BW, el fragmento de
ADN resultante en HindIII y XhoI se digirió y subclonó en el vector
de expresión pET23a digerido con HindIII/XhoI (Novagen) para
proporcionar el montaje pET23a/GFP. La secuencia del gen GFP
ampliado por PCR se verificó por secuenciado. Se continuó ampliando
el pET23a/GFP con los cebadores pETfor.b y pETrev.b biotinilados en
5'. El fragmento T7-GFP de 2.038 pb resultante
biotinilado dos veces se purificó en gel utilizando un kit Qiagen y
se analizó cuantitativamente por espectrofotometría. Se prepararon
diluciones 10 nM y 1 nM de este ADN en 1 mg/ml de ADN lambda
digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al
plástico). Este fragmento de la PCR se utilizó después para
programar un sistema procariótico de transcripción/traducción
acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley,
Brow y Burgess, 1991). Se utiliza una preparación comercial de este
sistema (Sistema de extracto S30 de E. coli para plantillas
lineales; Promega) enriquecido con T7 ARN polimerasa
(10^{3}
unidades).
unidades).
Como referencia, se utilizó un fragmento
T7-folA de ADN de 1.765 bp biotinilado (sintetizado
por PCR como en el ejemplo 1) para programar la síntesis de la
proteína DHFR no fluorescente.
Se suspendieron 150 \mul de perlas
paramagnéticas recubiertas con estreptavidina ProActive (Bangs
Laboratories, 2x10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl 1
M/Tween 20 al 0,1% y se cortaron y empalmaron en tres alícuotas de
50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \muM
(T7-folA o T7-GFP) a cada alícuota
de perlas, se incubó a 43ºC durante 15 min, se lavó tres veces en
NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0
(PBS/Tween20 al 0,1%), se volvió a poner en suspensión en 40 \mul
de TBST y 10 \mul de proteína A biotinilada 80 \mum (Sigma) se
añadieron (para dar una concentración final de 15 \muM). Tras la
incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron
las perlas tres veces in PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a
poner en suspensión en 20 \mul de dilución 1:10 de anticuerpo
policlonal antiGFP de conejo (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo
no inmunizado (Sigma). Tras la incubación durante 30 minutos a
temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween
20 al 0,1% y se volvieron a poner en suspensión en 15 \mul de S30
premezclado procedente de un sistema de extracto S30 de E.
coli para Linear Templates (Promega), se sometieron a
ultrasonidos durante un minuto en un baño con ultrasonidos, a
continuación se añadió (en hielo) el resto de la mezcla S30 de
traducción in vitro y se enriqueció con T7
ARN-polimerasa (10^{3} unidades).
Los 50 \mul de las reacciones de traducción
in vitro enfriados en hielo se añadieron gradualmente (en 5
alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de la fase
aceitosa enfriada en hielo recién preparada disolviendo Span 80
(Fluka) al 4,5% (v/v) en aceite mineral (Sigma, nº
M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v)
(SigmaUltra; nº P-8074) en un vial de 5 ml Costar
Biofreeze (nº 2051)) en agitación con una barra magnética (8x3 mm
con un anillo en el eje; Scientific Industries International,
Loughborough, UK). Se continuó agitando (a 1.150 rpm) durante 3
minutos adicionales en hielo. Las reacciones se incubaron a
continuación 3 h a 32ºC.
Se extendieron 2 \mul de emulsión en un
portaobjetos de microscopio bajo un cubreobjetos circular de 13 mm
y se observaron utilizando un objetivo 20xNeofluar en un microscopio
Axioplan (Zeiss) equipado con una cámara RTEA
CCD-1300-Y CCD (Princeton
Instruments). Se utilizaron filtros normales de excitación de
emisión para fluoresceína y se procesaron las imágenes con el
programa informático IPLab.
Como puede observarse en la Figura 2 la GFP
traducida de los genes acoplados a microperlas individuales
encapsuladas en los compartimentos acuosos de las emulsiones está
unida a las microperlas in situ cuando las microperlas están
recubiertas con un anticuerpo antiGFP. Esta unión se observa como
concentración de fluorescencia de las perlas por microscopía de
epifluorescencia. No se observa fluorescencia en las perlas cuando
desaparecen el gen GFP o el anticuerpo antiGFP.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se suspendieron 150 \mul de perlas de
poliestireno recubiertas con estreptavidina (1 \muM de diámetro;
Bangs Laboratories, 2x10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl
1 M/Tween 20 al 0,1% y se cortaron y empalmaron en 3 alícuotas de
50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \mum
(T7-folA o T7-GFP) a cada alícuota
de perlas, se incubó a 43ºC durante 15 min, se lavó tres veces en
NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0
(PBS/Tween20 al 0,1%), se volvió a poner en suspensión en 40 \mul
de TBST y 10 \mul de proteína A biotinilada 80 \muM (Sigma) se
añadieron (para dar una concentración final de 15 \muM). Tras la
incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron las
perlas tres veces in PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a poner en
suspensión en 20 \mul de dilución 1:10 de anticuerpo policlonal
antiGFP de conejo (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no
inmunizado (Sigma). Tras la incubación durante 30 minutos a
temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween
20 al 1% y se volvieron a poner en suspensión en 15 \mul de S30
premezclado procedente de un sistema de extracto S30 de E.
coli para Plantillas Lineales (Promega), se sometieron a
ultrasonidos durante un minuto en un baño con ultrasonidos, a
continuación se añadió (en hielo) el resto de la mezcla S30 de
traducción in vitro y se enriqueció con T7
ARN-polimerasa (10^{3} unidades). Los 50 \mul
de las reacciones de traducción in vitro enfriados en hielo
se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante
\sim2 minutos) a 0,95 ml de la fase aceitosa enfriada en hielo
recién preparada disolviendo Span 80 (Fluka) al 4,5% (v/v) en
aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de Tween
80 al 0,5% (v/v) (SigmaUltra; nº P-8074) en un vial
de 5 ml Costar Biofreeze (nº 2051)) en agitación con una barra
magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific Industries
International, Loughborough, UK). Se continuó agitando (a 1.150
rpm) durante 3 minutos adicionales en hielo. Las reacciones se
incubaron a continuación 3 h a 32ºC. Para recuperar las mezclas de
reacción, se centrifugaron las emulsiones a 3.000 g durante 5
minutos y la fase aceitosa se clasificó dejando la emulsión
concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del vial. Se
añadieron PBS y 2 ml de éter saturado con agua y se agitó la
mezcla, se centrifugó brevemente, y se clasificó la fase etérea. Se
lavaron dos veces las perlas con PBS y por último se volvieron a
poner en suspensión a razón de 10^{8} perlas/ml en PBS. Se
analizaron 10^{4} perlas utilizando un citómetro de flujo
FACScalibur (Becton Dickinson) utilizando excitación a 488 nm y el
filtro de emisión de fluoresceína. La GFP traducida de los genes
acoplados a microperlas individuales encapsulada en los
compartimentos acuosos de las emulsiones se une a las microperlas
in situ cuando las microperlas están recubiertas con un
anticuerpo antiGFP. La unión de GFP a las microperlas las hace
fluorescentes (Fig. 2) y estas perlas con GFP unida pueden
distinguirse claramente de las que no lo están por citometría de
flujo (Figura 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se llevó a cabo una reacción catalizada por la
enzima glutatión S-transferasa M2-2
(GST M2-2) humana para generar un producto
biotinilado (Figura 4). Los dos sustratos utilizados fueron
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB; Sigma) y glutatión biotinilado reducido
(biotina-GSH). El producto generado
(biotina-GS-DNP) tiene biotina en
un extremo para permitir el acoplamiento a micropartículas
paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y un grupo
2,4-dinitrofenol (DNP) que puede unirse por un
anticuerpo antiDNP.
Se sintetizó biotina-GSH
añadiendo 100 mg de éster de biotinamidocaproato de
N-hidroxisuccinimida (biotina-NHS;
Sigma) en 1 ml de DMF a una solución de glutatión oxidado (Fluka) en
1 ml de agua, 30 \mul de NaOH 12,5 N más 1 ml de DMF. Se añadió
la biotina-NHS, en hielo, en 100 \mul de alícuotas
durante 20 minutos. El pH se ajustó a continuación a 7,0 con NaOH 1
N. El precipitado parecido a jarabe que se formó durante la reacción
se disolvió por calentamiento a temperatura ambiente, agitando y
añadiendo 300 \mul de agua. Se continuó agitando durante 2 horas
a temperatura ambiente, el pH se volvió a llevar a 7,0 añadiendo
NaOH 1 N y se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se
utilizó a continuación NaOH para volver a llevar el pH a 7,5, se
agitó la reacción 30 minutos más a temperatura ambiente y a
continuación se incubó 30 minutos más después de añadir 500 \mul
de DTT 1 M. Los disolventes se evaporaron al vacío y el producto se
purificó por HPLC en fase inversa utilizando una columna C8 y un
gradiente del 10 al 40% de acetonitrilo, 0,1% de TFA. Se sintetizó
enzimáticamente biotina-GS-DNP en
100 \mul de reacción que contenía 1 \mug de GST
M2-2 recombinante purificado, CDNB 500 \mum y
biotina-GSH 200 \mum en KH_{2}PO_{4} 0,1 M,
EDTA 1 mM, pH 6,5. La incubación se realizó durante 1 hora a 25ºC.
La reacción fue esencialmente hasta la terminación interpretada
siguiendo el aumento de absorbancia a 340 nm. Se llevaron a cabo
también reacciones de control 1) sin nada de GST, 2) sin nada de
CDNB y 3) sin nada de biotina-GSH. Se diluyeron las
reacciones 200 veces (dando una concentración final de 1 \muM de
biotina) en Tris-HCl 5 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 1,0 M,
pH 7,4 (tampón B/W). Se mezclaron 50 \mul de las reacciones
diluidas con 50 \mul de tampón B/W que contenía 29,3 \mug
(10^{8} micropartículas) micropartículas magnéticas recubiertas
con estreptavidina Sera-Mag^{TM} de 0,737 \mum
de diámetro (MG-SA; Seradyn) y se incubaron 1 hora
a temperatura ambiente. Se separaron las micropartículas en una
placa de microvaloración (Falcon 3911) utilizando un imán (Dynal
MPC-96) y se lavaron 3 veces con
Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,4
(2xtampón B/W), a continuación dos veces con PBS, 0,1% de Tween 20.
Se volvieron a poner en suspensión las micropartículas en una
dilución 1:2.500 del anticuerpo SPE 21-11 (cortesía
del Prof. Zelig Eshhar) monoclonal antidinitrofenol de ratón en
PBS/0,1% de Tween 20 y se incubó 45 minutos a temperatura ambiente.
Se lavaron las micropartículas tres veces en PBS/0,1% de Tween 20,
se volvieron a poner en suspensión en PBS/0,1% de Tween 20 que
contenía 15 \mug/ml de fluoresceína (FITC) IgG antiratón de cabra
fragmento F(ab')_{2} conjugado), fragmento
F(ab')_{2} (Jackson;
115-096-006) y se incubó 30 minutos
a temperatura ambiente. Se lavaron las micropartículas cuatro veces
en PS/0,1% de Tween 20, se volvieron a poner en suspensión en 1 ml
de PBS/0,1% de Tween 20 y 2x10^{5} micropartículas analizadas
utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Como
se puede apreciar en la Figura 5, no existe ninguna diferencia en la
distribución de la intensidad de fluorescencia de las perlas de las
tres reacciones de control (sin GST, sin CDNB, y sin
biotina-GSH), donde la fluorescencia media es
\sim3. En cambio las perlas de la reacción catalizada por enzimas
tienen una fluorescencia media de 34, más de 10 veces mayores. De
hecho, utilizando el control representado (Fig. 5), 81,1% de las
perlas de la reacción catalizada por enzimas (y recubiertas con el
producto biotinilado) están en el control mientras que en las
reacciones de referencia no más del 0,06% de las perlas están en
control. Por consiguiente, las perlas recubiertas con el producto
de la reacción catalizada por GST pueden clasificarse fácilmente de
las que no lo están.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
La síntesis de biotina bloqueada (5) y sus
derivados (7) estaba basada en los protocolos publicados (Pirrung y
Huang, 1996; Sundberg et al. (1995). Sin embargo, se hicieron
modificaciones significativas de estos protocolos en varias etapas
de la síntesis como se describe a continuación.
Se preparó éster metílico de biotina (3,
biotina-OMe) esencialmente como se describe en
Sundberg et al. (1995) (véase la Fig. 6):
Alcohol metilnitropepironílico (1,
MeNPOH). Se disolvió
3',4'-(metilendioxi)-6'-nitroacetofenona
(Lancaster; 6,2 g., 29,6 mmoles) en una mezcla de THF (100 ml) y
etanol (100 ml). Se añadió borohidruro sódico (1,12 g., 29,6
mmoles) y la solución se agitó durante 3 horas a temperatura
ambiente. La TLC (sobre placas recubiertas con sílice;
disolvente-metanol al 3% en DCM) indicó la
conversión total del material de partida (Rf= 0,8) en el alcohol
(Rf= 0,6). Se añadió lentamente ácido clorhídrico (1N) hasta que la
evolución de hidrógeno se interrumpió y los disolventes se
evaporaron al vacío. El sólido residual se disolvió en DCM (500 ml)
y se lavó con salmuera (40 ml). La fase orgánica se secó (sobre
mgSO_{4}) y el disolvente se clasificó al vacío. La
recristalización en DCM caliente y hexano dio 6,1 g de 1 (un sólido
cristalino amarillo).
Se añadió alcohol metilnitropiperonílico (1,69
g, 8 mmoles) (en varias porciones durante 20 minutos) a una
solución de carbonilimidazol (CDI, 2,6 g, 16 mmoles) en DCM (50 ml).
Se agitó al solución durante 3 h tras lo cual la TLC indicó la
completa conversión del alcohol (Rf=0,6-3% de
metanol en DCM) en el producto (Rf= 0,45). Se añadieron DCM (100
ml) y agua (30 ml) y la mezcla de reacción se transfirió a un embudo
de clasificación. Se preparó la mezcla y se añadió (en alícuotas de
1 ml) HCl 1 N hasta que el pH de la fase acuosa fue inferior a 6.
Se eliminó la fase acuosa, se añadió más agua (30 ml) y se acidificó
a pH 6 mientras se mezclaba. Por último, se lavó la fase de DCM con
salmuera, se secó (sobre MgSO4) y se eliminó el disolvente al vacío.
El sólido restante se recristalizó en DCM caliente y hexano para
dar 2,2 g de 2 (un sólido cristalino amarillo).
Éster metílico de
N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina
(4,
MeNPO-CO-biotina-OMe).
Se añadió hidruro sódico (suspensión al 60% en aceite; 100 mg, 2,5
mmoles) a una suspensión agitada de biotina-OMe (517
mg, 2 mmoles) y MeNPO-CO-Im (305
mg, 1 mmol) en DCM anhidro (10 ml) en hielo. Se agitó la solución
durante 30 minutos en hielo y 30 minutos a temperatura ambiente. La
TLC indicó la completa desaparición del
MeNPO-CO-Im
(Rf=0,6-5% de metanol en DCM) y el aspecto del
producto (Rf=0,45). Vestigios de alcohol 1 (Rf=0,7), y un producto
lateral con Rf=0,95 (probablemente el carbonato de
di-MeNPO) se observaron también (la relación del
producto frente al producto lateral anterior variaba de una
preparación a otra; el secado minucioso de los materiales de
partida y la realización de la reacción en hielo dio rendimientos
generalmente mayores de producto).
Una vez terminada la reacción, se añadió DCM
(100 ml) y se extrajo la solución tres veces con NaH_{2}PO_{4}
1 M. Se secó (MgSO_{4}) la fase orgánica y se eliminó el
disolvente al vacío. El jarabe restante se disolvió en DCM caliente
(aproximadamente 5 ml), hexano (aproximadamente 5 ml) se añadió en
el punto de enturbiamiento y se dejó reposar la solución a 4ºC toda
la noche. Esto produjo la precipitación del exceso de la
biotina-OMe en forma de un sólido blanco cristalino
(que se lavó con éter, se secó y se utilizó en reacciones
posteriores). Se filtró el concentrado al vacío y se purificó por
cromatografía sobre sílice (1,5 a 3% de metanol en DCM) para dar 4
en forma de una espuma amarilla (con rendimientos hasta de 385 mg, u
80% referidos a equivalentes molares de 2 como material de
partida).
partida).
Se disolvió
MeNPO-CO-biotina-OMe
(940 mg; 1,73 mmoles) en 25 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6;
enjuagado con argón). La solución se agitó a 44ºC durante 24 horas
en argón. Se redujeron los disolventes al vacío hasta
aproximadamente 1 ml, se añadió agua (10 ml) y se liofilizó la
mezcla resultante. Se disolvió el sólido resultante en DCM con
metanol al 2% (20 ml) y se añadió carbón activo. Se hirvió la mezcla
durante pocos minutos y se filtró. La TLC (10% de metanol en DCM)
indicó la aparición del producto de la hidrólisis (Rf=0,2) y
aproximadamente 5% del material de partida
(MeNPO-CO-biotina-OMe;
Rf=0,9). Se eliminaron los disolventes al vacío para dar un sólido
blanco que se secó al vacío (860 mg de aproximadamente 95% de 5 más
5% de 4). Se produjeron concentraciones mayores de HCl (por ejemplo
1 N) y temperaturas mayores (por ejemplo de reflujo con THF como
codisolvente) en hidrólisis completa del éster metílico. Sin
embargo, se observaron también cantidades significativas de alcohol
1 y biotina, indicando la hidrólisis del carbamato en estas
condiciones. Obsérvese que el éster metílico 4, y en particular el
producto de su hidrólisis (5) se descubrió que era sensible a la
oxidación. El calentamiento o incluso el almacenamiento de
soluciones de 5 en presencia de aire produjo oscurecimiento.
Asimismo, los intentos para purificar 5 (o derivados de, por
ejemplo, 7) por cromatografía sobre sílice condujeron a pérdidas
muy grandes debido a la oxidación.
Éster terc-butílico del ácido
N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropiónico
(6,
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OBu^{t}).
Se disolvió
MeNPO-CO-biotina-OH
(860 mg conteniendo \sim5% de
MeNPO-CO-biotina-OMe;
\sim1,6 mmoles) en 20 ml de DCM anhidro. Se añadieron sal
hidrocloruro del éster terc-butílico de
\beta-alanina
(H-\beta-Ala-OBut)
(Bachem; 362 mg; 2 mmoles), N-hidroxisuccinimida
(172 mg; 1,5 mmoles) y trietilamina (280 \mul; 2 mmoles). La
solución agitada se enfrió en hielo y se añadió EDCI (420 mg; 2,2
mmoles). Se agitó la reacción durante 24 horas a 4ºC y 2 horas a
temperatura ambiente. La TLC (5% de metanol en DCM) indicó la
aparición del producto (Rf=0,3) y el resto,
MeNPO-CO-biotina-OMe
sin reaccionar (Rf=0,45). Se diluyó la reacción con DCM (30 ml) y
se extrajo tres veces con NaH_{2}PO_{4} 1M y una vez con
NaHCO_{3} saturado. Se secó la fase orgánica (Na_{2}SO_{4}) y
se clasificó el disolvente al vacío. Se purificó el jarabe restante
por cromatografía sobre sílice (3,0-4,5% de metanol
en DCM) para proporcionar 640 mg de 6 (espuma amarilla).
Ácido
N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropiónico
(7,
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH).
Se disolvió éster terc-butílico 6 (510 mg; 0,84
mmoles) en 15 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; enjuagado con argón).
Se agitó la solución a 52ºC durante 24 horas bajo argón. Se añadió
agua (10 ml) y la solución resultante se liofilizó para dar un
sólido que contenía (evaluado por TLC) el producto de la hidrólisis
(7) y el material de partida (6; \sim10%). Se purificó esta
mezcla por cromatografía sobre sílice (10% de metanol en acetona más
0,1% de ácido acético) para dar 60 mg de 7 (los bajos rendimientos
eran principalmente el resultado de la oxidación de 7 en
sílice).
N-(N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropionil)-glutatión
(8,
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-
GSH). Se añadió carbonildiimidazol (20 mg, 120 \mumoles) a
una solución de
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH
(7, 49 mg, 89 \mumoles) en DMF (1,5 ml). Se agitó la solución
durante 30 minutos a temperatura ambiente y a continuación se
añadió, en varias alícuotas, a una solución de glutatión oxidado (62
mg, 100 \mumoles) y trietilamina (55 \mul, 0,4 mmoles), en DMF
(2 ml) más agua (0,15 ml), se agitó en hielo. Se agitó la solución
en hielo durante 30 minutos y a continuación a temperatura ambiente.
Se añadió trietilamina, hasta que la solución se volvió
transparente (25 \mul) y a continuación se agitó la reacción
durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió a
continuación DTT (0,25 ml de una solución 1M; 0,25 mmoles) y se
agitó la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos.
El producto de la reacción anterior se purificó
por HPLC en fase inversa, en una columna RP-8 de
preparación, utilizando un gradiente de
agua-acetonitrilo en presencia de 0,1% de ácido
trifluoroacético. Se recogió el pico correspondiente a 8 (tiempo de
retención = 28,6 minutos). Se aisló a continuación el producto por
liofilización y se purificó otra vez en HPLC en fase inversa
(utilizando la misma columna y el sistema de disolvente). El
análisis del producto después de la segunda purificación por HPLC,
utilizando HPLC en fase inversa analítica, indicó un producto
(>95%) cuyo espectro UV corresponde a 8 (específicamente,
\lambda^{max} a 355 nm indicó la presencia del grupo
O-metilnitropiperonil-carbonilo de
la biotina bloqueada). La concentración de 8 se determinó valorando
los grupos tiol libres (utilizando DTNB,
5,5'-ditiobis (ácido
2-nitrobenzoico), según Hermanson, 1996) procedente
del glutatión, y también por absorbancia a 355 nm (correspondiente a
la biotina bloqueada). Ambas mediciones independientes dieron el
mismo resultado dentro del error experimental.
El producto 8 purificado se observó también que
era un sustrato para M2-2 GST humana en la
sustitución electrófila de CDNB (controlado por el cambio de
absorbancia a 340 nm; Habig & Jakoby, 1981) con velocidades que
son aproximadamente 10 veces más lentas que las observadas con
glutatión en condiciones similares.
La
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH
reducida (biotina-\betaala-GSH
bloqueada) se hizo reaccionar con
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB; Sigma) o
4-cloro-3-nitrobenzoato
(CNB, Acros). El producto bloqueado generado no está unido a avidina
o estreptavidina. Sin embargo, después del desbloqueo fotoquímico
por radiación ultravioleta el producto presenta una biotina en un
extremo que se unirá a micropartículas recubiertas con avidina o
estreptavidina y un 2,4-dinitrofenol (DNP) o un
grupo 3-nitrobenzoato que puede unirse por
anticuerpos antiDNP o
anti-3-nitrobenzoato apropiados
(véanse las Figs. 7 y 8).
Se centrifugaron 5 \mul (10^{8} perlas)
microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0
\mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) en una
microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. y se eliminó el
sobrenadante. Se volvieron a poner en suspensión las perlas en 5
\mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6.5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2
mM, biotina-\betaala-GSH 10 \mum
y CDNB 500 \mum o CNB 500 \mum. Los 5 \mul de mezclas de
reacción contenían 0,75 \mug de GST M2-2 humana
recombinante unificada o sin enzima.
Se incubaron las reacciones durante 30 min
(reacciones de CDNB) o 4 horas (reacciones de CNB) a 25ºC, después
de cuyo periodo se interrumpieron mediante la adición de 35 \mul
de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfirieron a hielo. Cada
reacción se dividió a continuación en dos alícuotas de 20 \mul
cada una, una de las cuales se colocó en un punto en una capa de
parafilm en la superficie de un bloque de aluminio enfriado con
hilo. Este punto se irradió a continuación durante 2 min con una
lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim6 cm.
La otra alícuota se dejó sin irradiar. Todas las muestras se
incubaron a continuación 30 min, a temperatura ambiente y a
continuación se lavaron con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en
una placa filtrante de 0,45 \mum MultiScreen-HV
(Millipore, MAHVN4510) volviendo a poner en suspensión intensamente
entre cada lavado.
Se volvieron a poner en suspensión a
continuación las perlas en 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 que
contenía 20 ng/\mul de anticuerpo antiDNP de conejo marcado con
Alexa-488 (Dako, nº V0401) 20 ng/\mul de antisuero
antiCNB marcado con Alexa-488 y se incubó durante 1
hora a temperatura ambiente. El antisuero antiCNB se obtuvo en
conejos por inmunización con conjugados de
CNB-CH_{2}-KLH preparados
añadiendo alícuotas de una solución 200 mM de ácido
4-(bromometil)-3-nitrobenzoico
(CNB-CH_{2}Br) en DMF para 5 mg/ml de soluciones
de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa
californiana (KLH) en borato 50 mM pH 8,8 (para dar 1,5 a 6
\mumoles de CNB-CH_{2}Br por mg de proteína).
Las mezclas de reacción se agitaron durante 6 horas a temperatura
ambiente y los conjugados de proteínas resultantes se dializaron
exhaustivamente frente a solución salina tamponada con fosfato
(PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación (densidad de hapteno o Hd) se
determinó midiendo las densidades ópticas de los conjugados a 355
nm. Estos se observaron que eran: 7 a 11 grupos
CNB-CH_{2} por molécula de BSA y 9,4 a 24,3 por
molécula de KLH dependiendo de la cantidad de
CNB-CH_{2}Br añadida a las muestras de proteína.
El conjugado CNB-CH_{2}KLH con Hd de 14,2 se
utilizó para inmunizar conejos utilizando los protocolos publicados
(Tawfik et al., 1993; Tawfik et al., 1997) (por el
Prof. Z Eshhar, Weizmann Institute of Science, Rehovot). Se analizó
la unión del conjugado CNB-CH_{2}BSA (Hd=11) y a
BSA en los sueros por ELISA. La primera extracción de sangre de
ambos conejos inmunizados (cuando se diluye 50 veces o más)
presentó señal alta de rendimiento de selectividad deseable cuando
se incubaba con el conjugado CNB-CH_{2}BSA y muy
bajo fondo (<5%) con BSA. Se purificó el suero antiCNB utilizando
una columna con proteína A HiTrap (Pharmacia). Tanto los
anticuerpos antiCDNB como los antiCNB se marcaron con un kit de
marcado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) según las
instrucciones del fabricante.
Se lavaron las perlas tres veces con 200 \mul
de PBS, 0,1% de Tween 20 como anteriormente, a continuación se
volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS, 0,1% de Tween 20 y
10.000 episodios analizados utilizando un citómetro de flujo
FACScan (Becton Dickinson).
Como puede apreciarse en la Fig. 9, el resto de
biotina bloqueado se desbloquea en la irradiación por UV y se une a
las perlas. Se observó un aumento de 19 veces en la fluorescencia
media de la perla después de la reacción catalizada por GST
M2-2 de
biotina-\betaala-GSH bloqueada con
CDNB incluso en ausencia de irradiación de UV. Esto se correlaciona
con la presencia aparente de \sim4% de
biotina-\betaala-GSH en la
preparación de
biotina-\betaala-GSH bloqueada
como se determina utilizando fluorimetría para medir el
desplazamiento del ácido
2-anilonaftalen-6-sulfónico
(2,6-ANS) de la avidina (Mock et al., 1985).
Estos resultados son coherentes con la inmovilización de fondo
observada anteriormente de la biotina bloqueada a avidina "en la
oscuridad" (es decir, sin iluminación de UV) que era tan alta
como 15% de la señal observada después de la iluminación (Sundberg
et al. 1995). La señal "oscura" observada anteriormente
se asignó a contaminantes en vestigios de biotina en la preparación
de biotina bloqueada, o a interacciones débiles entre la avidina y
los componentes de la biotina bloqueada incluyendo el enlazador
(Sundberg et al. 1995). Después de la irradiación de UV se
observó una gran diferencia en la fluorescencia media de estas
perlas incubadas en presencia y ausencia de GST. La fluorescencia
de la perla media con GST fue 84 veces y 56 veces la observada sin
GST con CDNB y CNB como sustratos respectivamente (Fig. 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se centrifugaron 20 \mul de alícuotas (4 x
10^{8} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no
fluorescentes de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes,
F-8777) o bolitas de poliestireno recubiertas con
estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) cada
una en una microcentrifugadora a 2.600 g (6.500 rpm) durante 3 min.
Se eliminó el sobrenadante y las bolitas se volvieron a poner en
suspensión, en hielo, en 20 \mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH
6,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM,
biotina-\betaala-GSH bloqueada 50
\mum, que contiene 3 \mug de GST M2-2 humana
recombinante purificada o sin enzima.
Se emulsionaron a continuación seis mezclas de
reacción esencialmente según Tawfik y Griffiths (1998):
- a)
- Perlas de Bangs, sin GST
- b)
- Perlas de Bangs, más GST
- c)
- Perlas de molecular Probes, sin GST
- d)
- Perlas de molecular Probes, más GST
- e)
- Perlas de Bangs, sin GST
- f)
- Perlas de molecular Probes, sin GST.
La fase aceitosa se preparó reciente disolviendo
4,5% (v/v) de Span 80 (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº
M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v) de
(SigmaUltra; nº P-8074). Las mezclas de reacción
enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 4
\mul durante \sim 2 minutos) a 0,4 ml de fase aceitosa enfriada
en hielo en 5 ml de Biofreeze Vial (Costar, nº 2051) agitando con
una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific
Industries International, Loughborough, UK). La agitación (a 1.150
rpm) se continuó durante 1 minuto adicional en hielo.
Se añadieron 8 \mul de emulsión d) a 0,4 ml de
emulsión e), y 8 \mul de emulsión b) se añadieron a 0,4 ml de
emulsión f) (para proporcionar diluciones 1:50) y las mezclas de
emulsión se agitaron durante 5 segundos para mezclar.
Seis mezclas de reacción se dejaron sin
emulsionar:
- a)
- Perlas de Bangs, sin GST
- b)
- Perlas de Bangs, más GST
- c)
- Perlas de molecular Probes, sin GST
- d)
- Perlas de molecular probes, más GST
- e)
- Perlas de Bangs, sin GST
- f)
- Perlas de molecular Probes, sin GST.
Se añadieron 0,4 \mul de d) a 20 \mul de e),
y se añadieron 0,4 \mul de b) a 20 \mul de f) (para dar
diluciones 1:50).
Tanto las emulsiones como las reacciones no
emulsionadas se incubaron durante 15 min a 25ºC. A continuación se
añadieron 0,8 \mul de CNB 500 mM (en alcohol absoluto) a cada 0,4
ml de emulsión y se agitó la emulsión durante 5 segundos (la CNB se
transfiere mediante el aceite mineral a los compartimentos acuosos).
Se añadieron 5 \mul de CNB 5mM (en KH_{2}PO_{4} 0,1 M, EDTA 1
mM, pH 6,5) a las reacciones no emulsionadas.
Todas las reacciones se incubaron durante 4
horas a 25ºC.
El pH de las gotitas acuosas se redujo para
enfriar la reacción catalizada por GST agitando las emulsiones con
200 \mul de aceite mineral Sigma para Biología molecular
(M-5904) conteniendo 4,5% de Span 80 (Fluka), 0,5%
de Tween 80 (Sigma Ultra) en aceite mineral Sigma para Biología
molecular) y ácido acético 25 mM. Las reacciones no emulsionadas se
enfriaron añadiendo 25 \mul de ácido acético 0,5 M. Todas las
reacciones se transfirieron a una placa de fondo plano de 24
pocillos (Corning, nº 25820) flotando en agua con hielo y se
irradió durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a
una distancia de \sim 6 cm. Todas las muestras se incubaron a
continuación 30 min. a temperatura ambiente.
Se transfirieron las soluciones a tubos de
microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min. 13,5k rpm en
una microcentrifugadora y la fase aceitosa se eliminó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Se añadieron 200 \mul de acetato Na 0,1 M pH 5,0 y se rompió la
emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada
adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando
durante 10 min a temperatura ambiente al vacío en un Speedvac
(Farmingdale, NY).
Todas las muestras se lavaron a continuación
tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en una placa
filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada
lavado. Las perlas se volvieron a poner en suspensión a continuación
en 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20. Se añadieron a continuación
25 \mul (\sim5 x 10^{7} perlas) a 200 \mul de PBS, 0,1% de
Tween 20 que contenía 20 ng/\mul de anticuerpo antiDNP marcado
con Alexa-488 o anticuerpo antiCNB marcado con
Alexa-488 (véase el Ejemplo 5) y se incubó durante 1
hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con
200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como anteriormente, a
continuación se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS,
0,1% de Tween 20 y 300.000 casos analizados utilizando un citómetro
de flujo FACScan (Becton Dickinson).
En las mezclas no emulsionadas, en las que ni
GST ni el producto de la reacción catalizada por GST,
(biotina-\betaAla-NB bloqueada)
estaban compartimentados, todas las perlas tienen una fluorescencia
igualmente baja (Fig. 10, paneles B y D). En cambio, en las mezclas
de la emulsión, donde tanto GST como el producto de la reacción
catalizada por GST,
(biotina-\betaAla-NB bloqueada)
estaban compartimentados, dos poblaciones de perlas, una de baja
fluorescencia y otra de mayor son obviamente visibles (Fig. 10,
paneles C y E). El control mediante R1 y R2 permite a las perlas de
Bangs y de molecular Probes estar muy separadas basándose en sus
características de difusión de la luz ligeramente diferentes (Fig.
10, panel A). La proporción de perlas Bangs a molecular Probes que
pasan a través de R1 es del 68%:0,1% y la proporción que pasan a
través de R2 es de 0,08%:87%. Utilizando estos controles es
evidente que las perlas con alta fluorescencia son las que estaban
compartimentadas con la enzima GST. Por consiguiente la
compartimentación de las perlas, de la enzima y del producto de
reacción se obtuvo por emulsificación y las perlas presentes en los
compartimentos que contenían enzimas pueden distinguirse de las que
no por sus características de fluorescencia.
\newpage
Ejemplo
7
La glutatión S-transferasa
M2-2 (GST M2-2) humana que codifica
el gen se amplía por PCR utilizando los oligonucleótidos
GSTM2-2Fo y GSTM2-2Bc de un clon de
ADNc de GST M2-2 humano en el
pGEM-3Z (Baez et al., 1997). El fragmento de
la PCR se clona en el vector pGEM-4Z (Promega)
digerido con HindIII y KpnI corriente abajo del
activador lac y del activador de T7 ARN-polimerasa.
El oligonucleótido GSTM2-2Bc se añade a la
secuencia de partida de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz
del codón de iniciación del gen de metiltransferasa. El secuenciado
del ADN identifica un clon con la secuencia nucleotídica correcta,
denominado pGEM-hGSTM2-2. El
plásmido pGEM-hGSTM2-2 descrito
anteriormente se amplía por PCR utilizando los cebadores LMB2 y
LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de 826 pares
de bases (GSTM2-2.LMB2-3) que lleva
el activador de T7 ARN-polimerasa, la secuencia de
partida de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen GST. El
fragmento de la PCR se purifica directamente utilizando Wizard PCR
Preps (Promega).
Se centrifugaron 60 \mul de alícuotas (1,2 x
10^{9} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no
fluorescentes de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes,
F-8777) en una microcentrifugadora a 10.000 g
durante 3 min. Se eliminó el sobrenadante y las perlas se volvieron
a poner a suspensión, en hielo, en 60 \mul de un sistema de
transcripción/traducción procariótico acoplado in vitro
diseñado para plantillas lineales (Lesley et al., 1991). Una
preparación comercial de este sistema se utiliza (E. coli S30
Extract System for Linear Templates; Promega) enriquecido con ácido
acético 12,5 mM (para reducir el pH hasta \sim7,0), T7
ARN-polimerasa (2.000 unidades), 12,5 \mug/ml de
digesto \lambda ADN-HindIII (New England Biolabs),
biotina-\betaala-GSH bloqueada 50
\mum, y, opcionalmente,
GSTM2-2.LMB2-3 ADN 5 nM o 5,0 \mug
de GST M2-2 humano recombinante purificado por 50
\mul (o ninguno de los dos).
Se eliminó una alícuota de 5 \mul de cada
mezcla de reacción y se dejó sin emulsionar. 50 \mul de la mezcla
de reacción restante se emulsionaron esencialmente según Tawfik y
Griffiths (1998).
La fase aceitosa se preparó reciente disolviendo
4,5% (v/v) de Span 80 (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº
M-5904) seguido de Tween 80 al 0,5% (v/v)
(SigmaUltra; nº P-8074). Las mezclas de reacción
enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10
\mul durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada
en hielo en un vial de 5 ml Biofreeze (Costar, nº 2051) mientras se
agita con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje;
Scientific Industries International, Loughborough, UK). La agitación
(a 1.150 rpm) se continuó durante 1 minuto adicional en hielo.
Tanto las emulsiones como las reacciones no
emulsionadas se incubaron durante 45 min a 25ºC para dejar que
continúe la traducción. A continuación se añadieron 5 \mul de
1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
(CDNB) 100 mM (en etanol absoluto) a cada 1,0 ml de emulsión y la
emulsión se agitó durante 5 segundos (el CDNB se transfiere a
través del aceite mineral a los compartimentos acuosos). Se añadió
1,0 \mul de CDNB 2,5 mM (en agua) a las reacciones no
emulsionadas. CDNB inhibe la traducción in vitro y
añadiéndolo de esta manera, una vez terminada la traducción,
maximiza el rendimiento de GST.
Todas las reacciones se incubaron durante 30
mins. a 25ºC. El pH de las gotitas acuosas se redujo a continuación
para enfriar la reacción agitando las emulsiones con 500 \mul de
aceite mineral Sigma para Biología molecular
(M-5904) que contenía 4,5% de Span 80 (Fluka), 0,5%
de Tween 80 (Sigma Ultra) en aceite mineral Sigma para Biología
molecular) y ácido acético 25 mM. Se enfriaron las reacciones no
emulsionadas añadiendo 5 \mul de ácido acético 0,5 M y 20 \mul
de acetato Na 0,1M, pH 5,0.
Todas las reacciones se transfirieron a una
placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) flotando en
agua con hielo y se irradió durante 2 min. con una lámpara UV B 100
AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Toda las
muestras se incubaron a continuación 30 mins. a temperatura
ambiente.
Se transfirieron las emulsiones a tubos de
microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min. a 13,5k rpm
en una microcentrifugadora y la fase aceitosa se eliminó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Se añadieron 200 \mul de acetato Na 0,1 M pH 5,0 y se rompió la
emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada
adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando
durante 10 min a temperatura ambiente al vacío en una Speedvac
(Farmingdale, NY).
Aproximadamente 5 x 10^{7} perlas de las
emulsiones rotas y de las reacciones no emulsionadas se lavaron a
continuación tres veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 en
una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum
(Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión a fondo
entre cada lavado. Las perlas se volvieron a poner en suspensión a
continuación en 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 que contenía 10
ng/\mul de anticuerpo antiDNP marcado con
Alexa-488 (véase el Ejemplo 5) y se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres
veces con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como antes, a
continuación se volvieron a poner en suspensión en 1 ml de PBS,
0,1% de Tween 20 y 10.000 casos analizados que utilizan un
citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).
Dickinson).
Como puede apreciarse en la Fig. 11, tanto en
las reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la
reacción catalizada por GST M2-2 traducida in
vitro produce unas perlas con mayor fluorescencia que cuando no
había ninguna enzima presente. Esta diferencia en la fluorescencia
no sería suficiente, sin embargo, para la clasificación eficaz
activada por fluorescencia (FACS). Sin embargo, las perlas tanto de
las reacciones emulsionadas como no emulsionadas que contienen 5,0
\mug de GST M2-2 recombinante purificado por 50
\mul eran aún más fluorescentes que las que contenían GST
M2-2 traducida in vitro que permite el
enriquecimiento eficaz de estas perlas por FACS a partir de las
incubadas en ausencia de GST. Esto simula la situación cuando un
GST mutante de mayor actividad que el natural se traduce in
vitro.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Un formato para la selección de elementos
genéticos es aquel que el elemento genético comprende un gen ligado
a una microperla, que se traslada en una microcápsula, y el producto
génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la
microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos (por ejemplo, proteínas
o enzimas) acoplados al gen que les codifica. Estos complejos
podrían seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el
Ejemplo 12) o para actividad enzimática mediante una segunda
reacción compartimentada.
En la presente memoria se demuestra, que una
enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y traducirse
in vitro en los genes unidos a microperlas y la enzima
traducida se vuelve a unir a las microperlas. Los inventores
también demuestran que la enzima traducida puede modificarse,
montarse o complementarse con un único factor mientras que está
unida en las perlas, en este ejemplo, los iones metálicos se añaden
a la apo-enzima para dar una metaloenzima activa.
Además, se demuestra en la presente memoria que la actividad
catalítica de la enzima se conserva mientras está unida a la
microperla junto con el gen que la codifica.
El gen opd que codifica una
fosfotriesterasa (PTE; conocida también como paraoxón hidroxilasa;
Mulbry & Karns, 1989) se amplía a partir de la cepa ATCC 27551
de Flavobacterium sp. por PCR utilizando un cebador
delantero que se añade a los codones de terminación y una secuencia
EcoRI (OPD-Fo; véase la Tabla 1) y un
cebador trasero que se añade a la secuencia de transición (RBS) del
gen 10 del fago T7 y una secuencia de clonación HindIII
(OPD-Bc). Este ADN se clona en el
pGEM-4Z utilizando las secuencias HindIII y
la EcoRI corriente abajo del activador de la T7
ARN-polimerasa. El secuenciado del ADN identifica un
clon que tiene la secuencia nucleotídica correcta. Se descubrió que
las bacterias (E. coli, TG1) transformadas con este clon
(Gem-OPD) sobreexpresan la PTE activa cuando crecen
en presencia de cloruro de cobalto y se inducen con IPTG (Omburo
et al., 1992).
El gen OPD se clona también con un péptido
Flag^{TM}
(Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys;
Sigma-Aldrich) añadido a su terminal N. El gen OPD
es la cepa ATCC 27551 de Flavobacterium sp. ampliada por PCR
utilizando un cebador delantero
(N-Flag-OPD-Fo) que
añade los codones de terminación y una secuencia KpnI, y un
cebador trasero
(N-Flag-OPD-Bc) que
añade una secuencia NcoI, un péptido Flag y un enlazador
corto entre el péptido Flag y el marco de lectura OPD. El fragmento
de ADN resultante se clona en el plásmido
pGEM-4Z^{Ncol} (utilizando las secuencias
KpnI y Nco). El pGEM-4Z^{Ncol} es
una modificación de p-GEM-4Z en la
que, la secuencia de transición (RBS) del gen 10 del fago T7 y el
codón de iniciación de ATG se añaden corriente abajo al activador
de T7 ARN de polimerasa, para crear una secuencia NcoI que
permite la clonación de marcos de lectura en el contexto de la RBS
y el codón ATG. La secuencia de la sección incorporada en el
pGEM-4Z (entre las secuencias HindIII y la
KpnI corriente abajo del T7 ARN polimerizan el activador),
para dar pGEM-4Z^{Ncol}, según se indica en el
esquema I.
El resto del pGEM-4Z, incluyendo
las secuencias de clonación KpnI y EcoRI, permaneció
intacto.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema
I
El secuenciado de ADN identifica un clon que
tiene la secuencia nucleotídica correcta. Se observa que las
bacterias transformadas con este clon
(Gem-N-Flag-OPD)
sobreexpresan una PTE activa cuando crece en presencia de cloruro
de cobalto y se induce con IPTG.
Los plástidos gem-OPD y
gem-N-Flag-OPD
descritos anteriormente se amplían por PCR, utilizando los cebadores
LMB2-biotina y LMB3, para crear fragmentos de ADN
(OPD.LMB3-2biotina y
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina,
respectivamente) que llevan el T7 ARN polimerizan el promotor, el
punto de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y el
OPD o los genes de N-Flag-OPD y se
marcan con biotina en el terminal 3'. Los fragmentos por PCR se
purifican directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).
Las alícuotas de una suspensión de microesferas
marcadas con estreptavidina no fluorescente de 0,95 \mum (Bangs,
\sim2x10^{7} perlas por \mul de suspensión) se centrifugan en
una microcentrifugadora a 10.000 g (13.500 rpm) durante 3 min. Se
elimina el sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en
suspensión en tampón TNT (Tris 0,1 M, NaCl 0,15 M,
Tween-20 al 0,05%). Un anticuerpo que es capaz de
unir los péptidos Flag amino-terminales y está
marcado por biotinilación (BioM5, un anticuerpo antiFlag marcado con
biotina; Sigma) se añade a las suspensiones de las perlas a una
media de 4x10^{4} moléculas de anticuerpo por perla. La mezcla
resultante se incuba durante varias horas con mezclado ocasional.
Las perlas se enjuagan dos veces por centrifugación y se vuelven a
poner en suspensión en tampón TNT. Los fragmentos de ADN
biotinilados (fragmentos OPD.LMB3-2biotina,
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina,
o fragmentos que llevan el T7 ARN polimerizan el promotor, la
secuencia de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 y
un gen que codifica una enzima diferente que está también activado
con el péptido N-Flag, por ejemplo metiltransferasa
HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina)
se añaden a una suspensión de perlas recubiertas de anticuerpo y la
mezcla se incuba durante la noche a 4ºC. Las perlas se enjuagan
tres veces por centrifugación y se vuelven a poner en suspensión en
tampón TNT.
Las alícuotas de 50 \mul de la suspensión
anterior de perlas (\sim10^{9} perlas) se centrifugan en una
microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. Se retira el
sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en suspensión
suavemente, en hielo, en 50 \mul de un sistema procariótico de
transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para
plantillas lineales (Lesley et al., 1991). Se utiliza una
preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de
E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7
RNA polimerasa (2.000 unidades). Se incuban las reacciones a 25ºC
durante 1,5 horas y se centrifuga en una microcentrifugadora a
10.000 g durante 3 minutos. El sobrenadante se retira y las perlas
se vuelven a poner en suspensión en 100 \mul de Tris 50 mM, 10 mM
de carbonato potásico, pH 8,0. Una solución acuosa de cloruro de
cobalto se añade a una concentración de 1 mM y las reacciones se
incuban durante varias horas a temperatura ambiente (o durante la
noche a 4ºC). Las perlas se enjuagan 4 veces por centrifugación y se
vuelven a poner en suspensión en tampón TNT.
Las alícuotas de las perlas anteriores se añaden
a una solución de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM pH 8,3. Las perlas
se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante periodos
ocasionales. Las perlas se centrifugan en una microcentrifugadora a
10.000 g durante 3 min, se clasifica el sobrenadante y se mide su
densidad óptica a 405 nm. No se observa un cambio significativo en
la densidad óptica, en comparación con la densidad óptica observada
en las mismas condiciones en ausencia de perlas o de
fosfotriesterasa, cuando se unen las perlas a las que se acoplan
fragmentos de ADN biotinilado OPD.LMB3-2biotina o
N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina
(y se hacen reaccionar posteriormente como se describió
anteriormente) se incuban con Paraoxon. Sin embargo, se observa un
cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las
perlas a las que están acoplados fragmentos de ADN biotinilados
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
(y se hacen reaccionar posteriormente como se describió
anteriormente) se incuban con Paraoxon. Por ejemplo, cuando se
añaden fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
a una concentración de 1 nM (a una suspensión de perlas de 50
\mul (\sim10^{9} perlas) que se vuelve a poner en suspensión
a continuación en 50 \mul de transcripción/traducción in
vitro) y se hace reaccionar como se describió anteriormente, el
cambio en la densidad óptica observado después de 3 horas
corresponde a más del 50% de hidrólisis de Paraoxon (a 0,25 mM en
un volumen de reacción de 50 \mul). De este modo, las microperlas
que transportan un gen que codifica una proteína con la actividad
catalítica deseada (fosfotriesterasa en el ejemplo anterior) pueden
distinguirse claramente de las microperlas que llevan genes que no
codifican una proteína con la actividad catalítica deseada
(metiltransferasa HaeIII en el ejemplo anterior). Además, no
se observa casi ningún cambio en la densidad óptica a 405 nm cuando
fragmentos de ADN biotinilados
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
se unen a las perlas y se hacen reaccionar como se describió
anteriormente, excepto que no se añade cloruro de cobalto a las
perlas de nuevo en suspensión después de la
transcripción/traducción.
Estos resultados demuestran que una enzima
(fosfotriesterasa) puede transcribirse y traducirse in vitro
en genes que codifican esta enzima y están unidos a las microperlas.
Cuando los genes que codifican una etiqueta (un péptido Flag con
terminal N en el ejemplo anterior) la enzima traducida se vuelve a
unir a las microperlas a las que están acoplados los genes. Si
fuera necesario, la enzima traducida puede modificarse entonces
mientras que permanece acoplada a las microperlas (junto con el gen
que la codifica) en este ejemplo. Se añaden iones cobalto para dar
una metal-enzima reactiva. Estos resultados también
indican que la enzima está catalíticamente activa mientras que está
unida a las microperlas junto con el gen que la codifica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Un formato para la selección de elementos
genéticos es aquel que el elemento genético comprende un gen unido
a una microperla, que es trasladada en una microcápsula, y el
producto génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla
dentro de la microcápsula. De este modo, la compartimentación
conduce a la formación de complejos de productos génicos (por
ejemplo, proteínas o enzimas) acoplados al gen que les codifica.
Estos complejos podrían seleccionarse posteriormente para unir un
ligando (véase el Ejemplo 12), o para la actividad enzimática
mediante una segunda reacción compartimentada.
Sin embargo, para dichos complejos que van a
seleccionarse para la actividad catalítica, un sustrato soluble
estaría disponible para la enzima inmovilizada, y, una vez se ha
terminado la reacción catalítica, el producto de la actividad
enzimática que se está seleccionando llegaría a acoplarse con el gen
que codifica esta enzima. Los complejos resultantes se pudieron
clasificar o seleccionar a continuación en virtud del producto que
está uniéndoles, por ejemplo utilizando un anticuerpo marcado con
fluorescencia que reconoce el producto. En otros compartimentos,
que contienen complejos de genes y productos génicos que no
codifican proteínas con la actividad enzimática deseada, el
sustrato sin reaccionar llegaría a unirse al gen. Estos complejos no
estarán marcados con el producto y por consiguiente se descargarán.
En la presente memoria se demuestra que una enzima (fosfotriesterasa
o PTE) puede reaccionar con un sustrato biotinilado bloqueado en
presencia de perlas recubiertas con estreptavidina. El producto
biotinilado bloqueado generado puede ser desbloqueado a continuación
por irradiación UV y ser capturado en perlas recubiertas con
avidina. Posteriormente, estas perlas se detectan por citometría de
flujo y se distinguen claramente de las perlas incubadas con un
sustrato
\hbox{biotinilado bloqueado en presencia de otras enzimas o proteínas que no presentan actividad de fosfotriesterasa.}
Un sustrato biotinilado bloqueado para PTE
(EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada; Fig. 12) se sintetiza de la manera siguiente:
Boc-5-aminopentanol:
Se añade dicarbonato de
di-terc-butilo (20,8 g; 0,095 moles)
a una solución agitada de 5-aminopentanol (10,37 g;
0,1 moles) en diclorometano (DCM) (200 ml) sobre hielo. Después de
la adición, la solución se vuelve turbia y se separa un jarabe. Se
añade trietilamina (13,8 ml; 0,1 moles) en perlas, y la solución
resultante se agita durante 10 minutos en hielo y a continuación
durante la noche a temperatura ambiente. Se retiran los disolventes
al vacío, el jarabe resultante se disuelve en acetato de etilo (500
ml), se extrae 3 veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez
con NaHCO_{3} saturado, y por último con salmuera, y a
continuación se seca sobre MgSO_{4}. Se retiran los disolventes al
vacío y el jarabe resultante (después de secado exhaustivo al vacío
en presencia de hidróxido potásico), comprendía principalmente
Boc-5-aminopentanol, se utiliza sin
purificación adicional.
(11) Se añade perla a perla trietilamina (3 ml;
22 mmoles) a una solución agitada de fosfodicloridato de
p-nitrofenilo (5,15 g; 20 mmoles) y etanol (1,15
ml, 20 mmoles) enfriado en hielo en acetona, en 30 minutos. La
solución se deja calentar lentamente hasta la temperatura ambiente
y se agita durante 90 minutos adicionales. Se añade a continuación
perla a perla una solución de
Boc-5-aminopentanol (4,3 g;
aproximadamente 20 mmoles) y trietilamina (3 ml; 22 mmoles) en DCM
(20 ml). La reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante
10 minutos, se añade 1H-tetrazol (0,35 g; 5 mmoles) y la
reacción se agita durante otras 2 horas. Se añade DCM (100 ml) y se
extrae 3 veces la solución con Na_{2}HPO_{4} 1M (pH 4),
NaHCO_{3} saturado, y por último con salmuera, y a continuación
se seca sobre mgSO_{4}. Se retiran los disolventes al vacío para
dar un jarabe que se purifica por cromatografía en columna sobre
sílice (disolvente: 1% a 2% de metanol en DCM) para dar 3,52 g de 11
(un jarabe).
Éster de
N-hidroxi-succinimida del ácido
4-N-Boc-aminometilbenzoico:
Se añade diciclohexildicarbodiimida
(DCC; 5,15 g; 25 mmoles) a una suspensión agitada de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (Tiger, Monmouth NJ; 5,2 g; 25 mmoles) y N-hidroxi-succinimida (2,88 g; 25 mmoles) en DCM (200 ml) más acetonitrilo (20 ml). Se agita la reacción durante la noche a 4ºC y a continuación 3 horas a temperatura ambiente. El precipitado de diciclohexil-urea se elimina por filtración, y el filtrado se concentra al vacío para dar un jarabe. El jarabe se disuelve en cloroformo y DCM y se trata con carbón activo. La adición de éter da un sólido blanco cristalino. La recristalización en DCM y éter de petróleo da 6,2 g del éster de N-hidroxi succinimida de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico.
(DCC; 5,15 g; 25 mmoles) a una suspensión agitada de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (Tiger, Monmouth NJ; 5,2 g; 25 mmoles) y N-hidroxi-succinimida (2,88 g; 25 mmoles) en DCM (200 ml) más acetonitrilo (20 ml). Se agita la reacción durante la noche a 4ºC y a continuación 3 horas a temperatura ambiente. El precipitado de diciclohexil-urea se elimina por filtración, y el filtrado se concentra al vacío para dar un jarabe. El jarabe se disuelve en cloroformo y DCM y se trata con carbón activo. La adición de éter da un sólido blanco cristalino. La recristalización en DCM y éter de petróleo da 6,2 g del éster de N-hidroxi succinimida de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico.
(12) Se añade a ácido trifluoroacético (TFA; 4
ml) a una solución de 11 (900 mg; 2,07 mmoles) en DCM (5 ml). La
solución se deja a temperatura ambiente durante 45 minutos y los
disolventes se eliminan al vacío. El jarabe residual se disgrega
disolviéndolo en DCM y metanol y añadiendo éter. El 12 resultante
(como sal de TFA; jarabe) se seca al vacío en presencia de
hidróxido potásico, y a continuación se hace reaccionar
inmediatamente sin purificación adicional (véase a
continuación).
(13) Se añaden éster de
N-hidroxi succinimida del ácido
4-N-Boc-aminometilbenzoico
(670 mg; 2,2 mmoles) y trietilamina (0,345 ml; 2,5 mmoles) a 12
(véase anteriormente) en DCM (15 ml). Se agita la solución durante
30 minutos, se añade trietilamina (0,1 ml; 0,72 mmoles) y se agita
la solución durante 3 horas más. Se añade DCM (20 ml), y se extrae
dos veces la solución con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con
NaHCO_{3}, saturado, y por último con salmuera, y a continuación
se seca sobre mgSO_{4}. Se eliminan los disolventes al vacío para
dar un jarabe que se purifica por cromatografía en columna sobre
sílice (disolvente: metanol al 5% en DCM) para dar 0,86 g de 13 (un
jarabe).
(14) Se tratan 0,84 g de 13 (1,6 mmoles) con TFA
como se describió anteriormente para proporcionar 14 (como sal de
TFA; jarabe) que se hace reaccionar inmediatamente tal como se
describe a continuación.
(15) Se añaden a 14 (véase anteriormente)
Boc-Glu(OSu)-OBu^{t}
(Bachem; 641 mg; 1,6 mmoles) y trietilamina (0,235 ml; 1,7 mmoles)
en DCM (15 ml). Se agita la solución durante 1 hora, se añade
trietilamina (60 \mul; 0,43 mmoles) y la solución se agita
durante 1 hora. Se añade DCM (20 ml), y se extrae dos veces la
solución con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3},
saturado, y por último con salmuera, y a continuación se seca sobre
mgSO_{4}. Se eliminan los disolventes al vacío para dar un jarabe
que se purifica por cromatografía en columna sobre sílice
(disolvente: 7% de metanol en DCM) para dar 0,8 g de 15 (sólido
blanco cristalino).
EtNP-Bz-Glu
(16): Se disuelven 0,4 g de 15 (0,56 mmoles) en DCM (5 ml) y TFA
(5 ml). La solución se agita durante 1 hora a temperatura ambiente,
y los disolventes se eliminan al vacío. El jarabe residual se
cristaliza disolviéndolo en metanol y añadiendo éter. La
recristalización (en metanol y éter) da 200 mg de 16 (como sal de
TFA; sólido blanco).
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada (17): Se añade carbonildiimidazol (6 mg, 37,5
\mumoles) a una solución de
MeNPO-CO-biotina-OH
(5, 17 mg, 35 \mumoles) en DMF (1 ml). Se agita la solución
durante 60 minutos a temperatura ambiente y se añade a 16 (20 mg,
30 \mumoles). Se añaden trietilamina (5,5 \mul, 40 \mumoles),
DMF (1 ml) y agua (0,5 ml) a una mezcla de reacción agitada hasta
que se vuelve transparente. Se agita la solución durante 2 horas a
temperatura y se almacena a -20ºC.
El producto de la reacción anterior se purifica
por HPLC en fase inversa en una columna de preparación C8
utilizando un gradiente de agua-acetonitrilo en
presencia de 0,1% de ácido trifluoroacético. Se recoge el pico
correspondiente a 17 (tiempo de retención = 23,1 minutos). Se aísla
el producto por liofilización como un sólido amarillo. El análisis
del producto después de la purificación por HPLC utilizando HPLC en
fase inversa analítica indicó un producto mayoritario (>80%),
cuyo espectro UV corresponde a 17. Específicamente,
\lambda^{max} a 355 nm indica la presencia del grupo
O-metilnitropiperonil-carbonilo de
la biotina bloqueada (Pirrung & Huang, 1996), y un
"hombro" a 277 nm, ausente en biotina bloqueada, indica la
presencia del éster de fosfato de p-nitrofenilo de
17. La concentración de 17 se verifica hidrolizando el éster de
fosfato de p-nitrofenilo en hidróxido potásico 0,1
M y determinando la cantidad de p-nitrofenol
liberado (densidad óptica a 405 nm).
Se observa también que el 17 purificado es un
sustrato para llevar PTE a la liberación de
p-nitrofenol (Fig. 13; controlado por el cambio en
la densidad cambia a 405 nm) con velocidades que son sólo
aproximadamente 6 veces más lentas que las observadas con Paraoxon.
Principalmente, a diferencia de la hidrólisis catalizada por bases
de 17 que continúa hasta la terminación (y la hidrólisis catalizada
por PTE de Paraoxon), la hidrólisis catalizada por PTE de 17
procede a velocidades significativas solamente hasta que la mitad
del sustrato se ha hidrolizado. La segunda mitad del sustrato pudo
hidrolizarse también, pero solamente en presencia de cantidades
mucho más mayores de PTE y después de largas incubaciones (varias
horas hasta toda la noche). Esto se debe probablemente al hecho de
que 17 está compuesto de dos diastereómeros (correspondiente a dos
enantiómeros con respecto al fosfotriéster quiral), sólo uno de los
cuales es un sustrato eficaz para la enzima. De hecho, se observó
estereoselectividad anteriormente con PTE y otros fosfotriésteres
quirales (Hong y Raushel, 1999).
Se generan anticuerpos que reconocerían
etil-fosfodiésteres que son los productos de
hidrólisis de los correspondientes fosfotriésteres de
p-nitrofenilo. Con este fin, se sintetiza un
derivado adecuado de etilfosfodiéster y se conjuga con proteínas
portadoras como se describe a continuación (Fig. 14).
EtNPBG (18). Se añaden anhídrido
glutárico (180 mg; 1,6 mmoles) y trietilamina (0,22 ml; 1,6 mmoles)
a 12 (preparado por desprotección de 1,6 mmoles de 11, como se
describió anteriormente) en DCM (15 ml). Se agita la solución
durante 20 minutos, se añade trietilamina (0,12 ml; 0,85 mmoles), y
se agita la solución durante 1 hora más. Se añade DCM 820 ml), y se
extrae la solución dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M y a
continuación se seca sobre mgSO_{4}. Se eliminan los disolventes
al vacío para dar un jarabe que se purifica por cromatografía en
columna sobre sílice (disolvente: 12,5% de metanol en DCM más 0,1%
de ácido acético) para dar 445 mg de 18 (un jarabe).
El sustrato conjuga
EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH. Se
añade carbonildiimidazol (CDI; 32 mg, 200 \mumoles) a una
solución de 18 (60 mg, 134 \mumoles) en DMF (1 ml). Se agita la
solución durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se añaden a
continuación alícuotas del 18 activado hasta 5 mg/ml de soluciones
de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa
californiana (KLH) en fosfato 0,1 M pH 8,0 (a razón de 0,5 hasta 4
\mumoles de 18 por mg de proteína). Se agitan las reacciones
durante 1 hora a temperatura ambiente, y los conjugados de proteína
resultantes se dializan exhaustivamente frente a la solución salina
tamponada con fosfato (PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación
(densidad de hapteno o Hd) se determina hidrolizando una muestra de
los conjugados dializados en hidróxido potásico en 0,1 M y
controlando la cantidad de p-nitrofenol liberado (a
405 nm). Se ha observado que es: 8,5 a 24 moléculas de EtNPBG por
molécula de BSA y 14 a 63 por molécula de KLH dependiendo de la
cantidad de 18 activado añadida a las muestras de proteína.
El producto conjuga EtBG-KLH
y EtBG-KLH. Los conjugados de
EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH descritos
anteriormente se dializan frente a carbonato 0,1 M pH 11,8 durante
44 horas a temperatura ambiente, y a continuación exhaustivamente
frente a PBS (a 4ºC).
Se obtuvieron anticuerpos antiEtBG en
conejos por inmunización con EtBG-KLH (Hd=14)
utilizando los protocolos publicados (Tawfik et al., 1993;
Tawfik et al., 1997) (donación del Prof. Z Eshhar, Weizmann
Institute of Science, Rehovot). Se analiza la unión en los sueros
por ELISA tanto en el conjugado de sustrato
EtNPBG-BSA (Hd=8,5) como en el conjugado de
producto correspondiente (EtBG-BSA; Hd=8,5). La
primera extracción de sangre de uno de los conejos inmunizados
(cuando se diluye 500 veces o más) presenta la selectividad
deseable, dando alta señal cuando se incuba con el conjugado del
producto y un fondo bajo (<20%) con el conjugado del sustrato.
Diluyendo los sueros en tampón COVAp (NaCl 2 M, 1
mgSO_{4}\cdot7H_{2}O, Tween-20 al 0,04%,
fosfato 10 mM, p-nitrofenol 0,1 mM, pH 6,5) aumenta
más la selectividad, con niveles de fondo que inferiores al 5%. El
suero antiEtBG se purifica utilizando una columna con proteína A
HiTrap (Pharmacia). Los anticuerpos de conejo purificados se marcan
con un kit de marcado con la proteína Alexa Fluor 488 (Molecular
Probes) según las instrucciones del fabricante.
Se centrifugan 10 \mul (\sim2 x 10^{8}
perlas) de microperlas de 0,95 \mum recubiertas con estreptavidina
(Bangs, \sim2x10^{7} perlas por \mul de suspensión) en una
microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 minutos y se elimina el
sobrenadante. Las perlas se vuelven a poner en suspensión en 10
\mul de Tris 50 mM pH 8,3 que contiene
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada (17) para dar una concentración final de 10 \muM, 20
\muM o 30 \muM. Se expresa PTE in vitro por
transcripción/traducción de fragmentos de ADN de
OPD.LMB3-2biotina (a 5 nM). Se utiliza una
preparación comercial (Sistema de extracto S30 de E. coli
para plantillas lineales; Promega) enriquecida con T7 ARN
polimerasa (2.000 unidades) y se incuban las reacciones a 25ºC
durante 1,5 horas. La PTE se monta a continuación mediante adición
de carbonato potásico (10 mM) y cloruro de cobalto (1 mM) en tampón
Tris (10 mM, pH 8,0) y se incuba durante la noche a 4ºC. Otra
enzima, que no presenta actividad de fosfotriesterasa, la
metiltransferasa HaeIII, es expresada también in vitro
por transcripción/traducción de los fragmentos de
M.HaeIII.LMB3-2biotina (a 5 nM), y a
continuación se trata con carbonato y cobalto como con la PTE. Se
añaden 5 \mul de alícuotas de las mezclas de reacción anteriores a
las suspensiones de perlas y se incuban las reacciones durante 1
hora a 25ºC en la oscuridad. Se interrumpe la reacción mediante la
adición de 15 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfiere
a hielo. Cada reacción se divide a continuación en dos alícuotas de
15 \mul cada una, una de las cuales se coloca como un punto en una
capa de parafina sobre la superficie de un bloque de aluminio
enfriado con hielo. Esta alícuota se irradia a continuación durante
2 min con una lámpara UV de B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia
de \sim6 cm. La otra alícuota se deja en la oscuridad. Todas las
muestras de perlas se incuban a continuación durante 30 minutos a
temperatura ambiente y se lavan tres veces con 200 \mul de PBS,
0,1% de Tween 20 en una placa filtrante
MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada
lavado. Se vuelven a poner en suspensión a continuación las perlas
(\sim2 x 10^{7}) en 200 \mul de COVAp que contiene 100
ng/\mul de anticuerpos antiEtBG de conejo marcados con
Alexa-488 y se incuban durante 1 hora a temperatura
ambiente y a continuación 1 hora a 4ºC. Se lavan tres veces las
perlas con 200 \mul de PBS, 0,1% de Tween 20 como anteriormente,
a continuación se vuelven a poner en suspensión en 1 ml de PBS, 0,1%
de Tween 20 y 10.000 casos analizados utilizando un citómetro de
flujo FACScan (Becton Dickinson).
Como puede apreciarse en la Fig. 15, se observa
hasta un aumento de 20 veces en la fluorescencia media de las
perlas después de la hidrólisis catalizada por PTE de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina y
después de irradiación con UV. Este aumento se observa en
comparación con las perlas tratadas esencialmente las mismas pero
en presencia de otra enzima (M.HaeIII), sin actividad de
fosfotriesterasa. Principalmente, las diferencias en la señal de
fluorescencia se observan cuando tanto PTE como M.HaeIII, se
expresan in vitro en los genes correspondientes y se añaden
juntos con el contenido completo de la mezcla de reacción de
transcripción/traducción in vitro.
A altas concentraciones de sustrato la
fluorescencia media observada es inferior a la observada a 20
\muM. Además a concentraciones del sustrato superiores a 20
\muM, no existe esencialmente diferencia en la señal de
fluorescencia entre las reacciones mantenidas en la oscuridad y las
irradiadas con UV (datos no mostrados). Ya que las perlas, en las
condiciones de reacción descritas anteriormente, comienzan a
presentar saturación de la señal de unión a concentraciones
superiores a 10 \muM (de productos detectados por la adición
ulterior de anticuerpos antiEtBG marcados con fluorescencia), estos
resultados pueden explicarse por la presencia de una contaminación
de
ETNP-Bz-Glu-biotina
en la preparación de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada. Estos resultados son también coherentes con la
inmovilización del fondo observada anteriormente de biotina
bloqueada a avidina "en la oscuridad" (es decir, sin
iluminación UV) que era tan alta como el 15% de la señal observada
después de la iluminación (Sundberg et al. 1995). La señal
"oscura" observada anteriormente se atribuyó a vestigios de
contaminantes de biotina en la preparación de biotina bloqueada, o a
las interacciones semanales entre avidina y los componentes de la
biotina bloqueada incluyendo el enlazador (Sundberg et al.
1995). Ambos mecanismos pueden explicarse por el hecho de que a
altas concentraciones de sustrato bloqueado biotinilado (y por
encima de la capacidad de fijación de las perlas), la señal
"oscura" se vuelve significativa. No obstante, a
concentraciones de sustrato de 20 \muM, o inferiores, la señal
"oscura" constituye solamente el 25%, o incluso menos del 10%
(por ejemplo, a 10 \muM de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada) de la señal iluminada. Esto indica que la mayor parte de
la hidrólisis catalizada por PTE de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada se produce mientras la sustancia está en la solución y no
unida a las perlas, y que el producto resultante
(Et-Bz-Glu-Biotina
bloqueada), después de la iluminación con luz UV, está desbloqueado
y llega a inmovilizarse en las microperlas.
Ejemplo
10
Un formato para la clasificación de elementos
genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen unido a
una microperla, que se traslada en una microcápsula, y el producto
génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la
microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos (por ejemplo, proteínas
o enzimas) acopladas al gen que los codifica. Estos complejos
podría seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase
Ejemplo 12), o para actividad enzimática o mediante una segunda
reacción compartimentada.
Para que dichos complejos se seleccionen para la
actividad catalítica, debería estar disponible un sustrato soluble
para la enzima inmovilizada, y, una vez terminada la reacción
catalítica, el producto de la actividad enzimática que se está
seleccionando llegará a unirse al gen que codifica esta enzima. Los
complejos resultantes podrían clasificarse o seleccionarse a
continuación en virtud del producto que está uniéndose a ellos, por
ejemplo utilizando un anticuerpo marcado con fluorescencia que
reconoce el producto. En otros compartimentos, que contienen
complejos de genes y productos génicos que no presentan la actividad
enzimática deseada, el sustrato no reactivo llegará a unirse al
gen. Estos complejos no estarán marcados con el producto y por
consiguiente se descartarán.
En la presente memoria se demuestra que una
enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y trasladarse
in vitro desde los genes acoplados a microperlas y la enzima
trasladada se vuelve a unir a las microperlas. La enzima trasladada
puede modificarse a continuación para incorporar el cobalto de la
zona activa, y su actividad catalítica se conserva a la vez que se
une a la microperla junto con el gen que le codifica. El PTE
inmovilizado reacciona posteriormente con un sustrato bloqueado
biotinilado, y el producto bloqueado biotinilado generado se
desbloquea por irradiación con UV y se captura en las mismas perlas
recubiertas con avidina a las que se acopla el gen que codifica la
PTE. Posteriormente estas perlas se detectan por citometría de flujo
y se distinguen claramente de las perlas que llevan un gen que
codifica una proteína que no presenta actividad de
fosfotriesterasa.
Las alícuotas de una suspensión de microesferas
de 0,95 \mum recubiertas con estreptavidina (Bangs,
\sim2x10^{7} perlas por \mul de suspensión) se centrifugan en
una microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante
se retira y las perlas se vuelven a poner en suspensión en tampón de
TNT (Tris 7,5 0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween-20 al
0,05%). Un anticuerpo, capaz de unir el péptido Flag y biotinilado
(BioM5, un anticuerpo antiFlag marcado con biotina, Sigma) se añade
a la suspensión de perlas para dar una media de 10^{4} moléculas
de anticuerpos por perla y la mezcla se incuba durante varias
horas. Las perlas se enjuagan por centrifugación y se vuelven a
poner en suspensión en tampón TNT hasta el volumen original. Los
fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina,
o los fragmentos que transportan el activador de T7 ARN polimerasa,
la secuencia de partida de la transición del gen 10 de la fase T7 y
un gen que codifica una enzima diferente (activada también con el
péptido N-Flag), por ejemplo, metiltransferasa
HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina)
se añaden a la suspensión de perlas recubiertas de anticuerpo a una
concentración de 1,6 nM y la mezcla se incuba durante la noche a
4ºC. Las perlas se enjuagan 3 veces centrifugándolas y volviéndolas
a poner en suspensión en tampón TNT.
Se centrifugan 50 \mul de alícuotas de la
suspensión de perlas anterior (\sim10^{9} perlas) en una
microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. Se elimina el
sobrenadante y las perlas se vuelven a poner en suspensión
suavemente, sobre hielo, en 50 \mul de un sistema procariótico de
transcripción/traducción acoplado in vitro diseñado para
plantillas lineales (Lesley et al., 1991). Se utiliza una
preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de
E. coli para plantillas lineales; Promega) enriquecido con T7
RNA polimerasa (2.000 unidades). Las reacciones se incuban a 25ºC
durante 1,5 horas y se centrifugan en una microcentrifugadora a
10.000 g durante 3 min. Se elimina el sobrenadante y las perlas se
vuelven a poner en suspensión en 100 \mul de Tris 50 mM, 10 mM de
carbonato potásico, pH 8,0. Una solución acuosa de cloruro de
cobalto se añade a una concentración de 1 mM y se incuban las
reacciones durante 2 horas a temperatura ambiente. Las perlas se
enjuagan 4 veces girándolas y volviéndolas a poner en suspensión en
tampón TNT. Por último, las perlas se vuelven a poner en suspensión
en tampón TNT hasta el volumen original.
Las alícuotas de las perlas anteriores se añaden
a soluciones de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM pH 8,3. Las perlas
se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante diferentes
periodos de tiempo. Se centrifugan las perlas en una
microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min, se elimina el
sobrenadante y se mide su densidad óptica a 405 nm. Se observa un
cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las
perlas a las que están unidos fragmentos
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
de ADN biotinilados (y posteriormente se hacen reaccionar tal como
se describió anteriormente) en contraste con las reacciones llevadas
a cabo en las mismas condiciones pero en ausencia de perlas o de
fosfotriesterasa, o con perlas a las que se acoplan fragmentos de
ADN y
N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina
y se hacen reaccionar posteriormente como se describió
anteriormente.
A continuación, 10 \mul (\sim2 x 10^{8}
perlas) de las perlas anteriores se centrifugan en una
microcentrifugadora a 10.000 g durante 3 min. y se clasifica el
sobrenadante. Las perlas se vuelven a poner en suspensión en 10
\mul de
EtNP-Bz-Glu-biotina
bloqueada 12,5 ó 25 \muM en Tris 50 mM pH 8,3. Las suspensiones de
perlas se incuban durante 1,5 horas a 25ºC en la oscuridad. Se
interrumpe la reacción mediante la adición de 10 \mul de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfieren a hielo y se irradian durante
2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia
de \sim6 cm. Todas las muestras de perlas se incuban a
continuación durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se
lavan tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una
placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum
(Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión
intensamente entre cada lavado. Las perlas (\sim7 x 10^{7}) se
vuelven a poner en suspensión a continuación en 125 \mul de un
suero antiEtBG de conejo diluido 1:125 en COVAp y se incuba durante
toda la noche a 4ºC. Se lavan las perlas una vez con 200 \mul de
COVAp y a continuación 3 veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al
0,1% como anteriormente y se vuelven a poner en suspensión en 200
\mul de PBS, Tween 20 al 0,1%. 70 \mul de la suspensión de
perlas anterior (\sim2 x 10^{7}) se añaden a 50 \mul de 40
ng/\mul de Fab anticonejo de cabra marcado con FITC (Jackson
115-095-006) en PBS, Tween 20 al
0,1% y se incuban 1 hora a temperatura ambiente. Se lavan 3 veces
las perlas con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como
anteriormente, después se vuelven a poner en suspensión en 1 ml de
PBS, Tween
\hbox{20 al 0,1% y 10.000 casos analizados utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).}
En consecuencia, como se aprecia en la Fig. 16,
las perlas a las que se acoplaron genes que codifican la
fosfotriesterasa activada con el péptido Flag (junto con un
anticuerpo que une el péptido Flag) se pudo distinguir claramente
de los genes a los que se acoplaron otros genes, que codifican
enzimas sin actividad de fosfotriesterasa (por ejemplo,
N-Flag-M.HaeIII).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
El gen que codifica un péptido procedente de
Propionibacterium shermanii que está biotinilado in
vivo en E. coli se amplía utilizando los
oligonucleótidos BCCP5 y BCCP3 del vector Pinpoint
Xa-1 (Promega). El fragmento de la PCR se clona en
el vector pET-23d(FLAG) digerido con
BamHI y HindIII, corriente debajo de un activador de
T7 ARN polimerasa y la secuencia de partida de la traducción del gen
10 del fago T7, y en el marco con una zona de codificación del
péptido FLAG N-terminal; este vector se denomina
pET-23d(FLAG-BCCP). El
vector pET-23d(FLAG) es idéntico al vector
pET-23d (Novagen) excepto para la zona entre las
secuencias únicas NcoI y BamHI, que ha sido
modificada para incluir una zona de codificación del péptido FLAG
N-terminal como se muestra a continuación en el
Esquema 2. Con objeto de añadir una etiqueta de hexahistidina al
terminal C de la proteína, se hibridaron los dos oligonucleótidos
BCCPHis+ y BCCPHis- y a continuación se ligaron en el vector
pET-23d(FLAG-BCCP) digerido
con SacI y NotI, proporcionando el vector
pET-(FLAG-BCCP-His). La proteína
FLAG-BCCP-His (denominada FBH) se
sobreexpresa en la cepa C41(DE3) (Miroux y Walker, 1996), se
recoge y se purifica con Ni-NTA agarosa (Qiagen) en
condiciones naturales, siguiendo el protocolo del fabricante. La
proteína biotinilada se elimina por incubación con un volumen igual
de avidina-agarosa (Sigma), se preequilibra con un
tampón de lavado (NaH_{2}PO_{4}, 50 mM, pH 8,0; NaCl 300 mM;
imidazol 20 mM) durante 1 hora a 4ºC. La suspensión se centrifuga a
continuación a 10.000 g durante 2 minutos y se conserva el
sobrenadante, se toman alícuotas y se almacena en nitrógeno líquido
(a largo plazo) o a 4ºC.
Esquema
2
Se amplió por PCR el gen que codifica a BirA de
E. coli utilizando los oligonucleótidos BirA5 y BirA3
procedentes de un vector pBluescript 2SK+ que contiene el gen BirA
de E. coli (donación de P. Wang, no publicada). El fragmento
de la PCR se clona en el vector pGEM-4Z(K2)
digerido con KpnI y XhoI corriente abajo del
activador lac, el activador de T7 ARN polimerasa y la
secuencia de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7
eficaz. El vector pGEM-4Z(K2) es idéntico al
vector pGEM-4Z^{Ncol} (véase el Ejemplo 8,
Esquema 1), excepto para la zona entre las secuencias únicas
NcoI y KpnI, que se ha modificado según el Esquema 3
mostrado a continuación que contiene una secuencia única XhoI
corriente abajo de la secuencia NcoI.
Esquema
3
El secuenciado de ADN identifica un clon con la
secuencia de nucleótidos correcta, denominado
pGEM-BirA. El plásmido pGEM-BirA
descrito anteriormente se amplía por PCR utilizando los cebadores
LMB2 y LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de
1.139 pares de bases (BirA_LMB2-3) que transporta el
activador de T7 ARN polimerasa, la secuencia de iniciación de la
traducción del gen 10 del fago T7 y el gen BirA. El fragmento de la
PCR se purifica directamente utilizando Wizard PCR Preps
(Promega).
Se centrifugaron 60 \mul de alícuotas (1,2 x
10^{9} perlas) de microesferas marcadas con IgG antiratón de
cabra no fluorescentes de 1,0 \mum de diámetro (Bangs
Laboratories, CP03N) en una microcentrifugadora a aproximadamente
2.600 g (6.000 rpm) durante 3 minutos. Se clasificó el sobrenadante
y se volvieron a poner en suspensión las perlas en 60 \mul de
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M,
Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5%. Se centrifugaron
otra vez las perlas, se volvieron a poner en suspensión en 60 \mul
de anticuerpo antiFLAG de M5 (Sigma F4042) y se incubaron toda la
noche a 4ºC. Las perlas se volvieron a centrifugar (2.600 g) durante
3 minutos, se retiró el sobrenadante y las perlas se volvieron a
poner en suspensión en una mezcla de 30 \mul de
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M,
Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% y 30 \mul de
proteína FBH obtenida como anteriormente (concentración en proteína
final aproximadamente 4 mg/ml) y se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente.
Mientras tanto, se prepararon 60 \mul de
alícuotas de un sistema procariótico de transcripción/traducción
acoplado in vitro diseñado para plantillas lineales (Lesley
et al., 1991), utilizando un kit comercial (sistema de
extracto S30 de E. coli para plantillas lineales; Promega)
enriquecido con T7 RNA polimerasa (2.000 unidades), de
BirA-LMB2-3 ADN 10 nM (o sin DNA en
absoluto). Se incubaron éstas alícuotas a 25ºC durante 1 hora para
permitir la traducción.
Se centrifugaron 60 \mul de alícuotas de
perlas a 2.600 g (6.000 rpm) en una microcentrifugadora durante 3
minutos y se eliminó el sobrenadante. Se volvieron a poner en
suspensión en 60 \mul de Tris HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,1 5M,
Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5%, se volvió a
centrifugar y se clasificó el sobrenadante. Finalmente se volvieron
a poner en suspensión en hielo en una alícuota de 54 \mul de las
reacciones procarióticas de transcripción/traducción acopladas
in vitro descritas anteriormente, enriquecidas con 3 \mul
de d-biotina 2 mM y 3 \mul de ATP 0,2 M.
Se extrajo una alícuota de 5 \mul de cada
mezcla de reacción y se dejó sin emulsionar. Se emulsionaron 50
\mul de la mezcla de reacción restante esencialmente como Tawfik y
Griffiths (1998).
La fase aceitosa se preparó reciente disolviendo
Span 80 (Fluka) al 4,5% (v/v) en aceite mineral (Sigma, nº
M-5904) seguido de Tween 80 (SigmaUltra; nº
P-8074) al 0,5% (v/v). Se añadieron gradualmente
mezclas de reacción enfriadas en hielo (en 5 alícuotas de 10 \mul
durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en
hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se
agita con una barra magnética (8x3 mm con un anillo en el eje;
Scientific Industries International, Loughborough, UK). Se continuó
la agitación (a 1.150 rpm) durante 1 minuto adicional en hielo.
Todas las reacciones se incubaron durante 4
horas a 37ºC para permitir que continúe la reacción de
biotinilación.
Se transfirieron las emulsiones a tubos de
microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugó 1 min. a 13,5k rpm en
una microcentrifugadora y la fase aceitosa se eliminó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) al fondo del tubo. Se
añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl
0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% y se rompió
la emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre
cada adición de hexano. Se eliminó el hexano residual centrifugando
durante 10 min a temperatura ambiente al vacío en un Speedvac
(Farmingdale,
NY).
NY).
Se lavaron a continuación dos veces
aproximadamente 1 x 10^{8} perlas procedentes de las emulsiones
rotas y las reacciones no emulsionadas con 100 \mul de TNT/BSA en
una placa filtrante MultiScreen-HV de 0,45 \mum
(Millipore, MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente
entre cada lavado. Se volvieron a poner en suspensión a
continuación las perlas en 50 \mul de Tris-HCl 0,1
M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween-20 al 0,05%, BSA al
0,5% que contenía 1 \mul de solución de HRP con estreptavidina
(proporcionada con el kit NEN TSA^{TM} Direct) y se incubó
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavaron las perlas dos
veces con 100 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, como
anteriormente, a continuación se volvieron a poner en suspensión en
50 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 Mm, pH 8,8, H_{2}O_{2} al
0,01%. Se añadió 1 \mul de una solución madre de fluoresceína
tiramida (preparada según las instrucciones del fabricante (kit NEN
TSA^{TM} Direct)) y se dejó continuar la reacción durante diez
minutos. Se lavaron dos veces las perlas con PBS, como
anteriormente, y por último se volvieron a poner en suspensión en un
total de 500 \mul de PBS, se transfirieron a un tubo de fondo
redondeado de poliestireno de 5 ml (Falcon) y 10.000 casos
analizados utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).
Como puede apreciarse en la figura 17, tanto en
las reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la
reacción catalizada por BirA traducida in vitro produce
perlas con mayor fluorescencia que cuando no estaba presente
ninguna enzima. Parece que las perlas que se han incubado en una
emulsión con BirA traducida in vitro son más fluorescentes
que las perlas que no han sido incubadas en emulsiones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Un formato para la selección de elementos
genéticos existe cuando el elemento genético comprende un gen unido
a una microperla, que se traslada en una microcápsula, y el producto
génico trasladado se vuelve a acoplar en la microperla dentro de la
microcápsula. De este modo, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos acoplados al gen que
les codifica. Estos complejos pueden posteriormente seleccionarse
para la unión a un ligando por clasificación citométrica de flujo si
la interacción de la unión produce un cambio en la fluorescencia de
la microperla.
El vector pET-23d(FLAG)
codifica el péptido FLAG N-terminal fusionado a la
zona polienlazadora del pET23d (Novagen). Se digirió el pET23d con
Nco I/BamH I, se purificó en gel y se volvió a disolver en agua. Se
mezclaron dos oligonucleótidos fosforilados sintéticos (Vh Bio Ltd,
Newcastle upon Tyne, U.K.), FLAG y FLAGas, a la concentración de 1
\muM cada uno en agua, se calentó durante 3 min. a 94ºC y se dejó
enfriar a temperatura ambiente antes de añadirse al vector digerido
en la mezcla de ligadura. La reacción de ligadura se utilizó
impurificada para transformar TG-1 de E.coli.
Los clones que contienen la inserción donde fueron identificados
por Kpn I se digieren y verifican por secuenciado (Oswel Research
Product Ltd., Southampton, U.K.). La zona polienlazadora de
pET-23d(FLAG) es la siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó el montaje de la expresión
FLAG-HA biotinilado del vector
pET-23d(FLAG) por PCR. La secuencia peptídica
YPYDVPDYA de la hemoaglutinina de la gripe fue añadida a la
etiqueta FLAG en el pET-23d(FLAG) utilizando
el cebador FLAGHA y el cebador pETrev.b biotinilado en 5'. El
producto de la ampliación tiene 903 bases de longitud y la zona de
codificación del montaje es:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El montaje competitivo en el proceso de
clasificación es el gen folA de E. coli que codifica
la dihidrofolato-reductasa ampliada procedente del
pET23a/folA utilizando los cebadores pETfor y pETrev.b.
Los fragmentos de la PCR se purificaron en gel
utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). Se midió
la concentración del ADN por espectrofotometría UV. Se hicieron
diluciones de los montajes de expresión preparados por PCR en 0,5
mg/ml de ADN portador preparado a partir de ADN del fago lambda
digerido con Hind III (40 min a 80ºC, seguido de precipitación en
etanol y disolución en agua).
Se centrifugaron 2x10^{9} perlas de
poliestireno de 0,95 \mul recubiertas con estreptavidina en 100
\mul de alícuotas de suspensión al 1% (Bangs Laboratories, Inc.
CP01N) en una microcentrifugadora a aproximadamente 2.600 g (6.000
rpm) durante 3 minutos. Se clasificó el sobrenadante y las perlas se
volvieron a poner en suspensión en 100 \mul de
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M,
Tween-20 al 0,05%, BSA al 0,5% (TNTB). Se añadieron
7 \mul de 2 mg/ml de anticuerpo monoclonal M5 antiFLAG biotinilado
(Sigma) a las perlas puestas de nuevo en suspensión y se incubó la
mezcla a temperatura ambiente durante dos horas. Después del
recubrimiento con el anticuerpo, se lavaron las perlas tres veces
con 200 \mul de TNTB, se volvieron a poner en suspensión en 100
\mul de TNTB y se dividieron en alícuotas 1 y 2 de 10 \mul y
alícuotas 3 y 4 de 40 \mul. Solución madre 0,7 nM de ADN de
FLAG-HA puro (nº 1), ADN de folA puro (nº 2) o ADN
de FLAG-HA puro (nº 3 y nº 4) diluida en un exceso
de 1.000 veces de ADN de folA se prepararon en ADN lambda digerida
con Hind III y se aplicaron a las alícuotas de las perlas. La
reacción de unión se dejó continuar durante la noche a 4ºC. El
número máximo de genes por perla fue de 2 en las alícuotas 1 a 3 y
0,2 en la alícuota 4. Las perlas recubiertas con montaje
FLAG-HA sirvió como referencia positiva y las perlas
recubiertas con folA como referencia negativa.
Después de incubación toda la noche a 4ºC, se
lavaron dos veces las perlas en TNTB y se volvieron a poner en
suspensión en mezcla de traducción in vitro S30 (Sistema de
extracto S30 para plantillas lineales, Promega) enriquecida con T7
ARN-polimerasa (20 unidades/\mul).
Las reacciones de traducción in vitro
enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10
\mul durante \sim2 minutos) a 0,5 ml de fase aceitosa enfriada
con hielo (recién preparada disolviendo 4,5% (v/v) Span 80 (Fluka)
en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido de
Tween 80 al 0,5% (v/v) (SigmaUltra; nº P-8074) en
un vial Biofreeze de Costar de 5 ml (nº 2051) agitando a la vez con
una varilla magnética (8x3 mm con un anillo en el eje; Scientific
Industries International, Loughborough, UK). Se continuó la
agitación (a 1.150 rpm) durante 3 minutos más en hielo. Se
incubaron a continuación las reacciones 90 min a 30ºC.
Se transfirieron las emulsiones a tubos de
microcentrifugadora de 1,5 ml, se centrifugaron 8 min a 6,5k rpm en
una microcentrifugadora y la fase aceitosa se clasificó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Se añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5,
NaCl 0,15 M, Tween-20 (TNT) al 0,05% y se rompió la
emulsión extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, agitando entre cada
adición de hexano. Se clasificó el hexano residual barboteando aire
en toda la suspensión de perlas durante 1 a 2 min a temperatura
ambiente.
Las perlas de las emulsiones rotas se lavaron a
continuación dos veces con 100 \mul de TNT en una placa filtrante
MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviendo a poner en suspensión intensamente entre cada
lavado. Las perlas se volvieron a poner en suspensión a continuación
en TNTB a razón de 10^{6} perlas/\mul y conteniendo 100 mU/ml
de antiHA-peroxidasa de rata, conjugado de alta
afinidad (3F10) (Boehringer Mannheim).
Las perlas se incubaron con el anticuerpo
durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces
con 200 \mul de TNT antes de ser puestas en suspensión otra vez en
2 ml de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. Las perlas en
suspensión se sometieron a ultrasonidos durante 1 min en hielo
utilizando un emisor de ultrasonidos de Heat Systems a la potencia
1, 95% del ciclo, boquilla de 3,4 mm. Las perlas sometidas a
ultrasonidos se volvieron a poner en suspensión a razón de 10^{8}
perlas/ml en Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. A esta suspensión
de perlas se añadió un volumen igual de tampón de ampliación de la
señal de tiramina (TSA), Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8,
H_{2}O_{2} al 0,004% y 5 \mug/ml de fluoresceína tiramina.
Se sintetizó fluoresceína tiramina como describe
Hopman et al. (Anthon H.N. Hopman, Frans C.S. Ramaekers,
Ernst J.M. Speel, The Journal of Histochemistry and
Cytochemistry vol 46(6), 771-777,
1998).
La reacción se deja que continúe durante 5
minutos a temperatura ambiente y se interrumpe mediante adición de
1/10^{a} del volumen de albúmina de suero bovino al 10% en PBS
(BSA, Sigma). Se centrifugaron las perlas en alícuotas de 2 ml de
la reacción de etiquetado y se lavaron 2 veces en TNTB y 1 vez en
PBS. Por último las perlas se volvieron a poner en suspensión en 2
ml de PBS y se sometieron a ultrasonidos como anteriormente.
Las perlas recubiertas con genes que codifican
folA, FLAG-HA o una dilución de 1.000 veces de
FLAG-HA en folA se analizaron en un citómetro de
flujo FACScan de Becton Dickinson.
En la Figura 18, el histograma A de baja
resolución demuestra que las perlas que llevan ADN de
FLAG-HA (muestra nº 1) están significativamente más
marcadas por fluorescencia que la referencia negativa folA (muestra
nº 2). Las mezclas con puntas nº 3 y nº 4 funcionaron
predominantemente de manera idéntica a la muestra de referencia
negativa excepto para un pequeño número de perlas muy fluorescentes
(panel B). 0,04% de las perlas en la muestra nº 3 y 0,02% de las
perlas en la muestra nº 4 caen en la zona M1 que comprende el 95% de
los casos positivos.
Las perlas en las muestras nº 3 y nº 4 que caen
en la zona M1 se clasificaron utilizando un clasificador de células
activadas por fluorescencia MoFlo. Dos series de perlas clasificadas
se obtuvieron para ambas muestras nº 3 y nº 4. En la serie uno se
recogieron 500 perlas en un solo tubo. En la serie dos se recogieron
96 perlas en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos.
Ambas series de perlas se sometieron a una PCR de 35 ciclos
utilizando los cebadores pETrev.b y FLAGrev1.
Los productos de la ampliación se analizaron por
electroforesis en gel (Figura 19). Los tamaños del producto son de
903 bases para FLAG-HA y de 1.390 pb para folA.
El análisis electroforético en gel de los
productos de la reacción de ampliación sugiere enriquecimiento
significativo durante el curso de la clasificación. En el panel A
no hay ninguna banda de FLAG-HA visible en las
bandas de los productos ampliados en las reacciones nº 3 y nº 4 no
seleccionadas mientras que la banda FLAG-HA en las
muestras de las perlas seleccionadas es muy visible. Los datos
definitivos en relación con la naturaleza del ADN ampliado se
obtuvieron del análisis del ADN ampliado de perlas individuales. En
total 22 perlas de 96 dieron un producto de ADN para la reacción nº
3 y 50% de éstas eran de FLAG-HA puro. Para la
reacción nº 4 9 perlas dieron productos y 8 era
FLAG-HA.
Los datos de cada perla para la reacción nº 3
sugieren que a la concentración aplicada, nominalmente 2 moléculas
de ADN/perla, la mayoría de las perlas de hecho tienen solamente un
gen unido que permite un enlace inequívoco entre el gen y su
producto. Un número relativamente alto de perlas marcadas
positivamente significa sin embargo que aproximadamente el 50% de
las perlas recuperadas crean falsos positivos. En la muestra nº 4
donde existían solamente \approx0,1 genes/perla, la pureza del
ADN recuperado se aproximó al 90%, indicando casi el enriquecimiento
de 1.000 veces en una etapa.
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Claims (32)
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1. Procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos según un cambio en las propiedades ópticas de los mismos, en el que se define un elemento genético como que comprende un ácido nucleico que codifica un producto génico que presenta una actividad deseada unido a una microperla y la expresión del ácido nucleico puede resultar, directa o indirectamente, en la modificación\hbox{de una propiedad óptica del elemento genético, que comprende las etapas siguientes:}
- (a)
- compartimentar los elementos genéticos en microcápsulas;
- (b)
- expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
- (c)
- modificar los elementos genéticos dentro de las microcápsulas mediante
- (i)
- la unión del producto génico deseado directa o indirectamente a un ligando que es parte del elemento genético, dentro de la microcápsula; o
- (ii)
- la conversión de un sustrato que es parte del elemento genético mediante la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula, directa o indirectamente, en un producto que permanece como parte del elemento genético; o
- (iii)
- la utilización de la actividad del producto génico deseado directa o indirectamente para generar un producto dentro de la microcápsula que se acompleja posteriormente con el elemento genético y permite su aislamiento;
- (d)
- opcionalmente modificar además los elementos genéticos fuera de las microcápsulas para provocar un cambio en sus propiedades ópticas; y
- (e)
- clasificar los elementos genéticos que producen el/los producto/s génico/s que presentan la actividad deseada según dicho cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos.
- 2. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que el ligando está asimismo codificado por el elemento genético.
- 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que la actividad del producto génico deseado dentro de la microcápsula resulta, directa o indirectamente, en la alteración de la expresión de un segundo gen dentro del compartimento y la actividad del producto de dicho segundo gen permite el aislamiento del elemento genético utilizando un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético.
- 4. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se clasifican directamente sobre la base de sus propiedades ópticas cambiadas para aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.
- 5. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se hacen además reaccionar para provocar un cambio condicional en las propiedades ópticas del elemento genético dependiendo de la presencia de los productos génicos con la actividad deseada en el complejo.
- 6. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(i), en el que los complejos formados uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican se someten a una etapa de compartimentación adicional con el fin de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.
- 7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un producto génico con propiedades ópticas características del elemento genético.
- 8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a la unión de un ligando con propiedades ópticas características por el producto génico.
- 9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas del producto génico cuando está unido al ligando.
- 10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas de un ligando cuando está unido al producto génico.
- 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a un cambio en las propiedades ópticas tanto del ligando como del producto génico en la unión.
- 12. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(ii) o (iii), en el que el cambio en las propiedades ópticas del elemento genético es debido a las propiedades ópticas diferentes del sustrato y del producto de la reacción que es seleccionado.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
- 13. Procedimiento según la reivindicación 1(c)(iii), en el que tanto el sustrato como el producto presentan propiedades ópticas similares, pero únicamente el producto, y no el sustrato de la reacción que se selecciona se une o reacciona con el elemento genético, cambiando así las propiedades ópticas del elemento genético.
- 14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que los reactivos adicionales se unen específicamente a, o reaccionan específicamente con, el producto (y no el sustrato) acoplado al elemento general, alterando así las propiedades ópticas del elemento genético.
- 15. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la actividad no deseada de un producto génico resulta en un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético que es distinto del resultante de la actividad deseada.
- 16. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que el cambio óptico resultante de la actividad no deseada se utiliza para seleccionar negativamente los elementos genéticos.
- 17. Procedimiento según la reivindicación 15, en el que la selección negativa se combina con la selección positiva para mejorar la especificidad de la reacción.
- 18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la especificidad de la reacción mejorada es una mejora en la especificidad de unión.
- 19. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la especificidad de la reacción mejorada es una mejora en la regio- y/o estereoselectividad para el sustrato y/o el producto.
- 20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se aíslan en un banco de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos.
- 21. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cada elemento genético codifica dos o más genes y cada producto génico debe presentar una actividad deseada para que las propiedades ópticas del elemento genético se modifiquen para que les permitan clasificarse.
- 22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cada elemento genético codifica dos o más genes y los productos génicos deben unirse entre sí en la microcápsula para que las propiedades ópticas del elemento genético se modifiquen y los elementos genéticos se clasifiquen.
- 23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional siguiente:
- (f)
- Introducir una o más mutaciones en el/los elemento/s genético/s aislado/s en la etapa (e).
- 24. Procedimiento según la reivindicación 23, que comprende además repetir de manera iterativa una o más de las etapas (a) a (f).
- 25. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la ampliación de los elementos genéticos.
- 26. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la microencapsulación se consigue formando una emulsión de agua en aceite de la solución acuosa en un medio a base de aceite.
- 27. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la microperla es amagnética, magnética o paramagnética.
- 28. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los elementos genéticos se clasifican mediante la detección de un cambio en su fluorescencia.
- 29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la clasificación de los elementos genéticos se realiza utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS).
- 30. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que las propiedades de fluorescencia diferentes del sustrato y del producto se deben a la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET).
- 31. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el medio interno de las microcápsulas está modificado por la adición de uno o más reactivos a la fase aceitosa.
- 32. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos modificados directa o indirectamente por la actividad del producto génico deseado se modifican además mediante la Ampliación de la Señal de la Tiramida, resultando directa o indirectamente en un cambio en las propiedades ópticas de dichos elementos genéticos permitiendo así su separación.
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