ES2354480T3 - Procedimiento de clasificación in vitro. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo, que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes: (a) compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas; (b) expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas; (c) clasificar los elementos genéticos que producen los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que poseen la actividad deseada.

Description

La presente invención se refiere a la utilización de procedimientos en la evolución in vitro de genotecas moleculares. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para seleccionar ácidos nucleicos que codifican productos génicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están relacionados mediante compartimentación.

La evolución necesita la generación de diversidad genética (diversidad en los ácidos nucleicos), seguida de la selección de aquéllos ácidos nucleicos que dan lugar a características beneficiosas. A causa de que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado de un organismo están físicamente relacionados (estando confinados los ácidos nucleicos en el interior de las células que codifican), series múltiples de mutación y selección pueden llevar a la supervivencia progresiva de organismos con aptitudes crecientes. Los sistemas para la evolución rápida de los ácidos nucleicos o de las proteínas in vitro deben imitar este proceso a nivel molecular, ya que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado deban estar relacionados y esta actividad del producto génico debe poder seleccionarse.

Avances recientes en biología molecular han permitido que algunas moléculas sean coseleccionadas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que las codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden ser clonados subsiguientemente para un análisis o utilización posterior, o someterse a series adicionales de mutación y selección.

Común a estos procedimientos es el establecimiento de voluminosas genotecas de ácidos nucleicos. Moléculas que poseen las características deseadas (actividad), pueden aislarse a través de regímenes de selección que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad biológica o bioquímica deseada, por ejemplo, la actividad de unión.

La tecnología de presentación de los fagos ha tenido mucho éxito, proporcionando un vehículo que permite la selección de una proteína que se exhibe, proporcionando el enlace esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass et al., 1990); McCafferty et al.,1990; para una revisión, véase Clackson y Wells, 1994). Partículas fágicas filamentosas actúan como conjuntos de exposición genética con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que las codifican en el interior. La estrecha relación entre el ácido nucleico y la actividad del producto codificado es el resultado del ensamblaje del fago en el interior de las bacterias. Como las bacterias individuales se infectan raramente de forma múltiple, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria individual, llevarán el mismo elemento genético y exhibirán la misma proteína.

Sin embargo, la presentación de los fagos depende de la creación de genotecas de ácidos nucleicos in vivo en las bacterias. De este modo, la limitación práctica que permite la tecnología de la presentación fágica respecto al tamaño de la genoteca es del orden de 107 a 1011, aventajando incluso a los efectores fágicos  con replicones fágicos filamentosos extirpables. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección de moléculas con actividad de unión. También, utilizando esta técnica, se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica, pero en ningún caso, sin embargo, se llevó a cabo directamente la selección para la actividad catalítica deseada, sino para la unión a un estado de transición análogo (Widersten y Mannervik, 1995), o para la reacción con un inhibidor suicida (Soumillion et al., 1994; Janda et al., 1997).

Se han seleccionado ligandos peptídicos específicos para la unión a receptores mediante selección por afinidad, utilizando voluminosas genotecas de péptidos unidos al extremo C del represor lac Lacl (Cull et al., 1992). Cuando se expresa en E. coli, la proteína represora une físicamente el ligando al plásmido codificante mediante la unión a una secuencia del operador lac en el plásmido.

Se ha informado, asimismo, de un sistema enteramente in vitro de presentación polirribosómica (Mattheakis et al., 1994), en el que los péptidos nacientes se unen físicamente mediante el ribosoma al ARN que los codifica.

Sin embargo, el alcance de los sistemas mencionados se limita a la selección de proteínas y no permite posteriormente la selección directa de actividades distintas a la unión, por ejemplo la actividad catalítica o reguladora.

La selección de ARN in vitro y la evolución (Ellington y Szostak, 1990), a la que a veces se ha referencia como SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990), permite la selección de actividad tanto de unión como química, pero sólo para los ácidos nucleicos. Cuando la selección es para la unión, un conjunto de ácidos nucleicos se incuba con sustrato inmovilizado. Los que no se unen se descartan, y entonces los que se unen se liberan entonces, se amplifican y el procedimiento se repite en su totalidad en etapas reiterativas para enriquecer las secuencias que mejor se unan. Este procedimiento puede también adaptarse para permitir el aislamiento de ARN catalítico y de ADN (Green y Szostak, 1992; para revisiones, véase Chapman y Szostak, 1994: Joyce, 1994; Gold et al.,1995; Moore, 1995).

Sin embargo, la selección para la actividad "catalítica" o de unión utilizando SELEX es sólo posible porque la misma molécula realiza la función dual de transportar la información genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Cuando la selección es para "auto-catálisis", la misma molécula debe también llevar a cabo la tercera función de ser un sustrato. Ya que el elemento genético debe jugar el papel tanto de sustrato como de catalizador, la selección es sólo posible para los eventos de recambio único. A causa de que el "catalizador" se modifica él mismo en este proceso, no constituye por definición un verdadero catalizador. Además, las proteínas no pueden seleccionarse utilizando el procedimiento SELEX. El abanico de catalizadores, sustratos y reacciones que pueden seleccionarse está, por tanto, severamente limitado.

Aquellos de los procedimientos mencionados que permiten series reiterativas de mutación y selección imitan in vitro mecanismos que se atribuyen habitualmente al proceso de la evolución: variación reiterativa, selección progresiva para una actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los procedimientos que se han desarrollado hasta ahora han proporcionado moléculas de diversidad y eficacia funcional comparables a las que se encuentran de modo natural. Además, no existen sistemas "evolutivos" propiciados por el hombre que puedan desarrollar tanto ácidos nucleicos como proteínas para llevar a cabo el abanico completo de actividades bioquímicas y biológicas

(por ejemplo, las actividades de unión, catalítica y reguladora) y que puedan combinar

varias procesos que conduzcan a un producto o actividad deseados.

El documento WO 93/03151 describe un procedimiento para el tratamiento de un población heterogénea de células para unir entre sí las copias de dos o más secuencias de ácido nucleico a partir de por lo menos algunas de las células, siendo la disposición de tal manera que las copias de las secuencias de ADN a partir de una célula individual están unidas preferentemente en la proximidad del ácido nucleico del que proceden las copias.

Hans y Plückthun P.N.A.S. 94 (1997) págs. 4.937-4.942 describen un procedimiento de evolución y selección in vivo de las proteínas funcionales utilizando presentación de ribosomas.

El documento DE 46 372 C describe un compuesto que comprende una unidad estructural A (genotipo) y una unidad estructural B (fenotipo) en el que el genotipo y el fenotipo están unidos de manera permanente entre sí.

Existe, por tanto, una gran necesidad de un sistema in vitro que supere las limitaciones que anteriormente se han expuesto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:

(a)

compartimentalización de elementos genéticos en microcápsulas;

(b)

expresión de los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas;

(c)

clasificación de los elementos genéticos que producen los anticuerpos o fragmentos de los mismos que poseen la actividad deseada.

Las microcápsulas según la presente invención compartimentalizan los elementos genéticos y los productos génicos de forma tal que permanecen unidos juntos físicamente. Sorprendentemente, la expresión del ácido nucleico sigue siendo posible en el interior de las microcápsulas artificiales, permitiendo el aislamiento del ácido nucleico basándose en la actividad del producto génico que codifica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un elemento genético es una molécula

o constructo molecular que comprende un ácido nucleico. Los elementos genéticos de la presente invención pueden incluir cualquier ácido nucleico (por ejemplo, ADN, ARN o cualquier análogo suyo, natural o artificial). El componente ácido nucleico del elemento genético puede además unirse, covalentemente o no, a una o más moléculas o estructuras, incluyendo proteínas, entidades químicas y grupos, soportes de fase sólida tales como perlas magnéticas, y similares. En el procedimiento de la invención, estas estructuras o moléculas pueden diseñarse para cooperar en la clasificación y/o en el

aislamiento del elemento genético que codifica un producto génico con la actividad

deseada.

Expresión, tal como se utiliza en la presente memoria, se emplea en su más amplio significado, para significar que un ácido nucleico contenido en el elemento genético, se convierte en su producto génico. Así, si el ácido nucleico es ADN, la expresión se refiere a la transcripción del ADN en ARN; y la traducción del ARN en proteína. Si el ácido nucleico es ARN, la expresión puede referirse a la replicación de este ARN en más copias de ARN, a la transcripción inversa del ARN en ADN, y opcionalmente, a la transcripción de este ADN en otra molécula o moléculas de ARN, así como también a la traducción de cualquiera de los tipos de ARN producidos, en proteínas. Preferentemente, por tanto, la expresión se lleva a cabo mediante uno o más procesos seleccionados a partir del grupo formado por la transcripción, transcripción inversa, replicación y traducción.

La expresión del elemento genético puede dirigirse a la proteína, o proteína que contenga aminoácidos no naturales (el producto génico) y que se encuentren en el interior de la microcápsula de la invención, de forma que el producto génico quede confinado en el interior de la misma microcápsula que el elemento genético.

El elemento genético y el producto génico por ello codificado, están unidos mediante confinamiento de cada elemento genético y del producto génico respectivo codificado por aquél en el interior de la misma microcápsula. De esta forma, el producto génico en una microcápsula no puede provocar un cambio en ninguna de las otras microcápsulas.

El término "microcápsula" tal como se utiliza en la presente memoria, según el significado que se le asigna normalmente en la técnica y que se describe a continuación en la presente memoria. Esencialmente, sin embargo, una microcápsula es un compartimento artificial cuyos márgenes delimitantes restringen el intercambio de los componentes de los mecanismos moleculares descritos en la presente memoria, que permiten la clasificación de los elementos genéticos según la función de los productos génicos que codifican.

Preferentemente, las microcápsulas que se utilizan en el procedimiento de la presente invención, podrán producirse en grandes cantidades, y por tanto compartimentalizar una genoteca de elementos genéticos que codifique un repertorio de productos génicos.

Según una forma de realización preferida del primer aspecto de la presente invención, la clasificación de elementos genéticos puede realizarse según una de entre esencialmente cuatro técnicas.

(I)

En una primera forma de realización, las microcápsulas se clasifican según una actividad del producto génico o de su derivado, que hace que la microcápsula sea detectable como un todo. De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que un producto génico con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula, o una modificación de una o más moléculas en su interior, lo que permite que la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento genético que lo codifica, sea clasificada. En esta forma de realización, por tanto, las microcápsulas se clasifican físicamente entre ellas, según la

actividad del producto génico o productos génicos expresados a partir de los elementos genéticos que en ellas se contienen, lo que hace posible enriquecer selectivamente las microcápsulas que contienen los productos génicos de la actividad deseada.

(II)

En una segunda forma de realización, los elementos genéticos se clasifican después de reunir las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un producto génico que presenta la actividad deseada modifica al elemento genético que lo codificó (y que reside en la misma microcápsula), de tal forma que sea capaz de ser seleccionado en una etapa siguiente. Las reacciones se detienen y las microcápsulas se fragmentan entonces de forma que todos los contenidos de las microcápsulas individuales se fusionan. La selección para los elementos genéticos modificados permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada. De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) el p producto génico que posee la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica, para permitir el aislamiento del elemento genético. Debe tenerse en cuenta, por supuesto, que la modificación puede ser directa, porque sea causada por la acción directa del producto génico, o indirecta, en la cual una serie de reacciones, una o más de las cuales están implicadas en el producto génico que posee la actividad deseada, conduce a la modificación del elemento genético.

(III) En una tercera forma de realización, los elementos genéticos se clasifican después de la reunión de las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta forma de realización, un gen con una actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento genético que lo codifica. Este cambio, cuando se detecta, induce la modificación del gen en el interior del compartimento. Las reacciones se detienen y las microcápsulas se fragmentan entonces, de forma que la totalidad de los contenidos de las microcápsulas individuales se fusionan. La selección de los elementos genéticos modificados, permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el producto o productos génicos que poseen la actividad deseada. De acuerdo con esto, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) el producto génico que posee la actividad deseada, induce un cambio en el compartimento que es detectado, e induce la modificación del elementos genético en el interior del compartimento, de forma que se permite su aislamiento. Debe tenerse en cuenta que el cambio detectado en el compartimento puede estar causado por la acción directa del producto génico, o acción indirecta, en la cual una serie de reacciones, un o más de las cuales están implicadas en el producto génico que posee la actividad deseada, conduce al cambio detectado.

(IV) En una cuarta forma de realización, los elementos genéticos pueden clasificarse mediante un procedimiento de pasos múltiples que implica por lo menos dos etapas, por ejemplo, con objeto de permitir la exposición de los elementos genéticos a condiciones que permitan, como mínimo, que tengan lugar dos reacciones separadas. Como será evidente para los expertos en la materia, la primera etapa de microencapsulación de la invención debe tener como resultado condiciones que permitan la expresión de los elementos genéticos, sea mediante transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o similar. Bajo estas condiciones, no puede ser posible seleccionar una actividad particular del producto génico, por ejemplo, a causa de que éste puede no ser activo bajo estas condiciones, o debido a que el sistema de expresión contiene una actividad interferente. La invención proporciona así un procedimiento según el primer aspecto de la presente invención, en el que la etapa (b) comprende la expresión de los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas, uniendo los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican y aislando por ello los complejos formados. Esto permite que los elementos genéticos y sus productos génicos asociados se aíslen a partir de las cápsulas antes de la clasificación, según tenga lugar la actividad del producto génico. En una forma de realización, los complejos se exponen a otra etapa de compartimentalización, previa al aislamiento de los elementos genéticos que codifican el producto génico que posea la actividad deseada. Esta etapa de compartimentalización, que tiene lugar ventajosamente en las microcápsulas, permite la ejecución de reacciones ulteriores, bajo distintas condiciones, en un medioambiente en el que los elementos genéticos y sus respectivos productos génicos están unidos físicamente. Según las formas de realización (I), (II) o (III) anteriores, puede llevarse a cabo la clasificación eventual de elementos genéticos.

La "encapsulación secundaria" puede también llevarse a cabo con elementos genéticos unidos a productos génicos mediante otros medios, tales como mediante presentación de fagos, presentación polirribosómica, fusión ARN-péptido o fusión del péptido represor lac.

El o los elementos genéticos seleccionados pueden también someterse a series consecutivas, posiblemente más estrictas, de clasificación en etapas repetidas reiteradamente, volviendo a aplicar el procedimiento de la invención, bien completo o sólo en etapas seleccionadas. Adaptando apropiadamente las condiciones, pueden aislarse, después de cada serie de selecciones, los elementos genéticos que codifican productos génicos que poseen la actividad mejor optimizada.

Además, los elementos genéticos aislados después de una primera serie de clasificaciones, pueden ser sometidos a mutagénesis antes de repetir la clasificación repitiendo reiteradamente las etapas del procedimiento de la invención, tal como se explicó anteriormente. Después de cada serie de mutagénesis, algunos elementos genéticos se habrán modificado de tal forma que la actividad de los productos génicos se potencia.

Además, los elementos genéticos seleccionados pueden clonarse en un vector de expresión para permitir una ulterior caracterización de los elementos genéticos y de sus productos.

La presente invención proporciona asimismo un procedimiento para la compartimentalización de un elemento genético que codifica un anticuerpo o fragmento y expresar el elemento genético para formar su anticuerpo o fragmento del mismo en el interior de compartimento, que comprende las etapas que consisten en:

(a)

formar una solución acuosa que comprende el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo para formar su producto génico;

(b)

microencapsular la solución para formar una microcápsula discreta que comprende el elemento genético; y

(c)

exponer la microcápsula a las condiciones apropiadas para proceder a la expresión del elemento genético para formar su anticuerpo o fragmento del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1

Selección génica mediante compartimentalización.

a Representación esquemática del procedimiento de selección. En la Etapa 1, una mezcla reactiva in vitro de transcripción/traducción que contiene una genoteca de elementos genéticos unidos a un sustrato para la reacción que va a seleccionarse, se dispersa para formar una emulsión de agua en aceite con típicamente un elemento genético por compartimento acuoso. Los elementos genéticos se transcriben y traducen en el interior de sus compartimentos (Etapa 2). A continuación, (Etapa 3), proteínas (o ARN) con actividades enzimáticas, convierten al sustrato en un producto que permanece unido al elemento genético. La compartimentalización evita la modificación de los elementos genéticos en otros compartimentos. A continuación (Etapa 4), la emulsión se fragmenta, todas las reacciones se detienen y los compartimentos acuosos se combinan. Los elementos genéticos que están unidos al producto se enriquecen selectivamente, se amplifican entonces, y se caracterizan (Etapa 5) o se unen al sustrato y se compartimentalizan para series posteriores de selección (Etapa 6).

b Selección para la metilación del ADN diana-específico mediante la HaeIII metilasa. El sustrato es un segmento de ADN que contiene sitios HaeIII de restricción/modificación (R/M). Los elementos genéticos se aíslan uniéndolos a perlas magnéticas revestidas con estreptavidina y tratados con la enzima de restricción similar HaeIII. Sólo los ácidos nucleicos con sitios metilados R/M son resistentes a la fragmentación y son amplificados subsiguientemente mediante PCR.

Figura 2a

Distribución del tamaño de las gotas y actividades de DHFR y de la metilasa HaeIII en emulsiones: distribución del tamaño de los compartimentos acuosos en una emulsión, determinada por difracción laser. Las mezclas reactivas in vitro de transcripción/traducción que contienen ADN y desoxicolato sódico se emulsifican mediante agitación, o mediante agitación seguido de homogeneización a 8k, 9,5 k ó 13,5 k r.p.m. La distribución del tamaño de las partículas acuosas se muestra en porcentaje del volumen acuoso total.

Figura 2b

La actividad de DHFR formado in situ mediante transcripción y traducción de su gen (Fig 1b) en compartimentos acuosos de una emulsión. La concentración del gen folA utilizado (2,5 nM) da lugar a un promedio de un gen por gota en las emulsiones más finas (homogeneizadas a 13,5 k r.p.m.). El diámetro medio calculado a partir de los datos de distribución del tamaño (en la Figura 2) se presenta como función de la velocidad de homogeneización (0k r.p.m. se refiere a la emulsión preparada mediante agitación sin homogeneización ulterior). La actividad se presenta como porcentaje de la actividad observada en la mezcla reactiva in vitro no emulsificada bajo las mismas condiciones.

Actividad de la metilasa HaeIII formada in situ mediante transcripción y traducción

de su gen (Fig. 1b) en compartimentos acuosos de una emulsión. La concentración del gen M. HaeIII utilizado (2,5 nM) da lugar a un promedio de un gen por gotita en las emulsiones más finas (homogeneizadas a 13,5 k r.p.m.). El diámetro principal calculado a partir de los datos de distribución (en la Figura 2a) se presenta como una función de la velocidad de homogeneización (0k r.p.m. se refiere a la emulsión preparada agitando sin homogeneización ulterior). La actividad se presenta como porcentaje de la actividad observada en la mezcla reactiva in vitro no emulsificada bajo las mismas condiciones.

Figura 3

Selecciones para la HaeIII ADN metilasa

a Selección de genes M.HaeIII a partir de un exceso de 1000 veces de los genes folA. Las reacciones se establecieron con 0,2 n nM de DIG-folA-3s-Biotin ADN (que corresponde a un promedio de un gen por compartimento), y se terminaron con 0,2 pM de IG-M.HaeIII-3s-Biotin. Las mezclas reactivas se emulsificaron mediante agitación o se dejaron en solución. El ADN de estas reacciones se capturó, se digirió con HaeIII (o con HhaI) y se amplificó mediante PCR. Este ADN se amplificó posteriormente mediante PCR unida a los iniciadores LMB2-Nest y LMB3-Nest y cinco microlitros de cada PCR unida se sometieron a electroforesis sobre un gel de agarosa al 1,5% que contenía bromuro de etidio. Marcadores,  X174-HaeIII digerido; menos T7, sin T7 ARN polimerasa; menos NadCh, sin desoxicolato sódico.

b Selecciones biseriadas. Las reacciones que contenían una relación molar de

1:104

a 1:107 de DIG-M.HaeIII-3s-Biotin:DIG-folA-3s-Biotin (a 500 pM) se emulsificaron mediante agitación. El ADN de estas reacciones se digirió con HaeIII y se amplificó mediante PCR con los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) El ADN amplificado procedente de la primera selección seriada, de proporciones

1:104

y 1:105 (a 20 pM) y proporciones 1:106 y 1:107 (a 500 pM), se dispuso en una segunda serie de selección. Este ADN se amplificó ulteriormente mediante PCR unida a los iniciadores LMB2-Nest y LMB3-Nest y cinco microlitros de la PCR unida de cada serie de selección se analizaron mediante electroforesis en gel como antes (cuadro superior). El mismo ADN se tradujo in vitro y se midió la actividad metilasa resultante. Los resultados se presentan como porcentaje del ADN sustrato metilado (cuadro inferior).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

(A) DESCRIPCIÓN GENERAL

Las microcápsulas de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas para permitir que la invención se ejecute.

En primer lugar, para asegurar que los elementos genéticos y los productos génicos no puedan difundirse entre las cápsulas, el contenido de cada microcápsula debe aislarse del contenido de las microcápsulas que la rodean, de forma que no exista o exista poco intercambio de los elementos genéticos y de los productos génicos entre las microcápsulas a lo largo del tiempo que dure el experimento.

En segundo lugar, el procedimiento de la presente invención necesita que exista sólo un número limitado de elementos genéticos por microcápsula. Esto asegura que el producto génico de un elemento genético individual quedará aislado de los otros elementos genéticos. De este modo, el acoplamiento entre el elemento genético y el producto génico será altamente específico. El factor de enriquecimiento es el mayor con un término medio de uno o algunos elementos genéticos por microcápsula, siendo tan estrecha como sea posible la unión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado, ya que el producto génico de un elemento genético individual se aislará de los productos de todos los otros elementos genéticos. Sin embargo, incluso si no se utiliza la situación teóricamente óptima de, por término medio, un único elemento genético

o menos por microcápsula, una proporción de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más elementos genéticos por microcápsula, puede resultar beneficiosa para clasificar una genoteca voluminosa. Series subsiguientes de clasificación, incluyendo una encapsulación renovada con una distribución diferente de los elementos genéticos, permitirá una clasificación más estricta de los elementos genéticos. Preferentemente, existe un único elemento genético, o menos, por microcápsula.

En tercer lugar, la formación y la composición de las microcápsulas no debe abolir la función de la maquinaria de expresión de los elementos genéticos y la actividad de los productos génicos.

En consecuencia, cualquier sistema de microencapsulación utilizado debe cumplir estos tres requerimientos. El sistema o sistemas apropiados puede variar, dependiendo de la naturaleza precisa de las necesidades en cada aplicación de la invención, como será evidente para el experto en la materia.

Se dispone de una amplia variedad de procedimientos de microencapsulación (véase Benita, 1996) y pueden utilizarse para crear las microcápsulas utilizadas según la presente invención. En verdad, se han identificado en la literatura más de 200 procedimientos de encapsulación (Finch, 1993).

Estos incluyen vesículas acuosas envueltas por membranas tales como vesículas lipídicas (liposomas) (New, 1990), y vesículas surfactantes no iónicas (van Hal et al., 1996). Estas consisten en cápsulas cerradas membranosas de bicapas únicas o múltiples de moléculas ensambladas no covalentemente, con cada bicapa separada de su vecina mediante un compartimento acuoso. En el caso de liposomas, la membrana está compuesta de moléculas lipídicas; estas son habitualmente fosfolípidos, pero también pueden incorporarse a las membranas esteroles, tales como colesterol (New, 1990). En el interior de los liposomas pueden realizarse diversas reacciones bioquímicas catalizadas enzimáticamente, incluyendo la polimerización del ARN y del ADN (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick y Luisi, 1996).

Con un sistema vesicular envuelto por una membrana, una gran parte de la fase acuosa se encuentra por fuera de las vesículas y por tanto, no está compartimentalizada. Esta fase acuosa continua deberá eliminarse o los sistemas biológicos en ella se inhibirán o se destruirán (por ejemplo, mediante digestión de los ácidos nucleicos con DNasa o RNasa), con objeto de que las reacciones se limiten a las microcápsulas (Luisi et al., 1987).

También se han demostrado en microcápsulas generadas por otros diversos procedimientos, las reacciones bioquímicas catalizadas enzimáticamente. Muchas enzimas son activas en soluciones micelares inversas (Bru y Walde, 1991; Bru y Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi y B, 1987; Mao y Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988) tales como el sistema AOT-isooctano-agua (Menger y Yamada, 1979).

Las microcápsulas pueden también generarse mediante polimerización y complejización interfacial (Whateley, 1996). Las microcápsulas de este tipo pueden tener membranas rígidas y no permeables, o semipermeables. Las microcápsulas semipermeables bordeadas por membranas de nitrato de celulosa, membranas poliamídicas y por membranas lípido-poliamídicas, pueden todas sustentar reacciones bioquímicas, incluyendo sistemas multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Las microcápsulas de alginato/polilisina (Lim y Sun, 1980), que pueden formarse bajo condiciones poco rigurosas, han mostrado también que son muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un procedimiento efectivo para la encapsulación de las células y tejidos vivientes (Chang, 1992; Sun et al., 1992).

También pueden utilizarse sistemas no membranosos de microencapsulación basados en la repartición fásica de un medioambiente acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.

Preferentemente, las microcápsulas de la presente invención se forman a partir de las emulsiones: sistemas heterogéneos de dos fases líquidas no miscibles, estando una de las fases dispersa en la otra como gotitas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984)

Las emulsiones pueden producirse a partir de cualquier combinación apropiada de líquidos no miscibles. Preferentemente la emulsión de la presente invención tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como fase presente en forma de gotitas finamente divididas (fase dispersa, interna o discontinua) y un líquido no miscible, hidrofóbico ("aceite") como matriz en la que estas gotitas están suspendidas (fase no dispersa, continua o externa). Dichas emulsiones se denominan "agua en aceite" (W/O). Esto tiene la ventaja de que la fase acuosa entera que contiene los componentes bioquímicos se compartimentaliza en gotitas discretas (la fase interna). La fase externa, siendo un aceite hidrofóbico, no contiene generalmente ninguno de los componentes bioquímicos y por tanto, es inerte.

La emulsión puede estabilizarse añadiendo uno o más agentes activos superficiales (surfactantes). Estos surfactantes se denominan agentes de emulsificación y actúan en la interfase agua/aceite para evitar (o por lo menos retrasar) la separación de las fases. Para generar las emulsiones agua-aceite pueden utilizarse muchos aceites y emulsificantes; una compilación reciente listó más de 16.000 surfactantes, muchos de los cuales se utilizan como agentes emulsificantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites apropiados incluyen aceite mineral blanco ligero y surfactantes no iónicos (Schik, 1966) tales como monooleato de sorbitano (SpanTM 80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitano (TweenTM 80; ICI).

La utilización de surfactantes aniónicos puede también ser beneficiosa. Surfactantes apropiados incluyen colato sódico y taurocolato sódico. Particularmente preferido es el desoxicolato sódico, preferentemente a una concentración de 0,5% peso/volumen, o inferior. La inclusión de dichos surfactantes puede en algunos casos aumentar la expresión de los elementos genéticos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos surfactantes aniónicos a una mezcla reactiva no emulsificada completamente, abolió la traducción. Durante la emulsificación, sin embargo, el surfactante se transfiere desde la fase acuosa a la interfase y la actividad se restaura. La adición de un surfactante aniónico a las mezclas que van a emulsificarse, asegura que las reacciones tendrán lugar sólo después de la compartimentalización.

La creación de una emulsión requiere generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar que las fases se junten. Existen muchas maneras de hacer esto, que utilizan diversos dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como varillas agitadoras magnéticas, agitadores de turbina y de propulsión, dispositivos con paleta y batidores), homogeneizadores (que incluyen homogeneizadores de estator-rotor, homogeneizador con válvula de alta presión y homogeneizadores de chorro), trituradores de coloides, dispositivos de "emulsificación de membranas" y de ultrasonidos (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones de agua en aceite son generalmente estables con un escaso intercambio, si es que alguno tiene lugar, de elementos genéticos o de productos génicos entre las microcápsulas. Además, se ha demostrado que diversas reacciones bioquímicas tuvieron lugar en microcápsulas de emulsión. Además, procesos bioquímicos complicados, especialmente la transcripción génica y la traducción, son también activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la tecnología para crear emulsiones con volúmenes a escala industrial, hasta el final, de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

El tamaño preferido de la microcápsula variará dependiendo de las necesidades precisas de cualquier proceso de selección individual que tenga que llevarse a cabo según la presente invención. En todos los casos, existirá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la genoteca, el enriquecimiento que se requiera y la concentración que se necesite de componentes en las microcápsulas individuales para alcanzar una expresión y reactividad eficiente de los productos génicos.

Los procedimientos de expresión pueden tener lugar en el interior de cada microcápsula individual proporcionada por la presente invención. Tanto la transcripción in vitro como la transcripción-traducción acopladas se convertirán en menos eficientes a concentraciones sub-nanomolares de ADN. Debido al requerimiento de que sólo un número limitado de moléculas de ADN se encuentre en cada microcápsula, queda fijado, por tanto, un límite superior práctico respecto al posible tamaño de la microcápsula. Preferentemente, el volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x 10-16 m3, (que corresponde a una microcápsula esférica con un diámetro inferior a 10 μm, más preferentemente menor que 6,5 x 10-17 m3 (5 μm), más preferentemente de alrededor de 4,2 x 10-18 m3 (2 μm), e idealmente de 9 x 10-18 m3 aproximadamente (2,6 μm).

La concentración efectiva de ADN o de ARN en las microcápsulas puede aumentarse artificialmente mediante varios procedimientos, que serán bien conocidos por los expertos en la materia. Estos incluyen, por ejemplo, la adición de sustancias químicas que excluyan volumen, tales como polietilenglicoles (PEG) y diversas técnicas de amplificación génica, incluyendo la transcripción utilizando ARN polimerasas, incluyendo las de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al.,1975), eucariotas por ejemplo (Weil et al., Manley et al.,1983) y bacteriófagos tal como T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al.,1988); la amplificación por la replicasa Qβ (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); y el sistema de replicación secuencial auto-mantenido (Fahy et al.,1991) y la amplificación por desplazamiento de las cadenas (Walker et al., 1992). Pueden utilizarse incluso las técnicas de amplificación génica que requieran la ciclación térmica, tales como PCR y LCR, si las emulsiones y la transcripción in vitro o los sistemas acoplados de transcripción-traducción pudieran llevarse a cabo a partir de un organismo termoestable, tal como Thermus aquaticus).

El aumento de la concentración local efectiva de ácido nucleico permite que puedan utilizarse efectivamente microcápsulas más voluminosas. Esto permite un límite superior práctico preferido para el volumen microcapsular de 5,2 x 1016 m3 aproximadamente (que corresponde a una esfera de diámetro 10 μm).

El tamaño de la microcápsula debe ser lo suficientemente voluminoso para acomodar a todos los componentes requeridos de las reacciones bioquímicas que es necesario se lleven a cabo en su interior. Por ejemplo, in vitro, tanto las reacciones de transcripción como las de acoplamiento de transcripción-traducción requieren una concentración total de nucleósido trifosfatos de 2 mM aproximadamente.

Por ejemplo, con objeto de transcribir un gen a una molécula corta única de ARN de 500 bases de longitud, se requerirían un mínimo de 500 moléculas de nucleósido trifosfato por microcápsula (8,33 x 10-22 moles). Con objeto de constituir una solución de 2 mM, este número de moléculas debe estar contenido en el interior de una microcápsula de un volumen de 4,17 x 10-19 litros (4,17 x 10-22 m3) que si fuera esférica tendría un diámetro de 93 nm.

Además, en el caso, particularmente, de reacciones relacionadas con la traducción, debe tenerse en cuenta que los ribosomas necesarios para que ésta tenga lugar, tienen ellos mismos 20 nm de diámetro, aproximadamente. Por tanto, el límite inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de 0,1 μm (100 nm) aproximadamente.

Por tanto, el volumen microcapsular es preferentemente del orden de entre 5,2 x 10-22 m3 y 5,2 x 10-16 m3, que corresponde a una esfera con un diámetro de entre 0,1 μm y 10 μm, más preferentemente de entre 5,2 x 10-19 m3 y 6,5 x 10-17 m3 (1 μm y 5 μm). Los diámetros esféricos de alrededor de 2,6 μm, son más ventajosos.

No es coincidencia que las dimensiones preferidas de los compartimentos (gotitas de un diámetro medio de 2,6 μm) se parezcan estrechamente a las de las bacterias, por ejemplo, Escherichia, que constituyen bastones de 1,1 a 1,5 x 2,0 a 6,0 μm, y Azotobacter, que son células ovoides de 1,5 a 2,0 μm de diámetro. En su forma más sencilla, la evolución darviniana se basa en un mecanismo "un genotipo, un fenotipo". La concentración de un único gen compartimentalizado, o genoma, disminuye desde 0,4 nM en un compartimento de 2 μm de diámetro, a 25 pM en un compartimento de 5 μm de diámetro. La maquinaria procariótica de transcripción/traducción ha evolucionado para operar en compartimentos de aproximadamente 1 a 2 μm de diámetro, donde los genes únicos se encuentran a concentraciones aproximadamente nanomolares. Un gen único, en un compartimento de 2,6 μm de diámetro, se encuentra a una concentración de 0,2 nM. Esta concentración génica es lo bastante alta para una traducción eficiente. La compartimentalización en tal volumen asegura también que, incluso si sólo se forma una molécula sencilla del producto génico, se encuentre presente a 0,2 nM aproximadamente, lo que es importante, si el producto génico tiene que modificar la actividad del elemento genético en sí mismo. El volumen de la microcápsula deberá seleccionarse, pues, teniendo en cuenta no sólo las necesidades para la transcripción y traducción del elemento genético, sino también la actividad modificadora que se requiera del producto génico en el procedimiento de la invención.

El tamaño de las microcápsulas de emulsión puede variarse simplemente adaptando las condiciones de la emulsión que se utilizaron para formarla, a los requerimientos del sistema de selección. Cuanto más voluminoso sea el tamaño microcapsular, mayor es el volumen que será necesario para encapsular una genoteca de elementos genéticos dada, ya que el factor limitante, en última instancia, será el tamaño de la microcápsula, y por tanto, el número de microcápsulas posible por volumen unitario.

El tamaño de las microcápsulas se selecciona no sólo teniendo en cuenta los requerimientos del sistema de transcripción/traducción, sino también los del sistema de selección utilizado para los elementos genéticos. De este modo, los componentes del sistema de selección, tales como un sistema de modificación químico, pueden requerir volúmenes de reacción y/o concentraciones de reactivos que no sean óptimos para la transcripción/traducción. Tal como se expone en la presente memoria, tales requerimientos pueden acomodarse mediante una etapa secundaria de re-encapsulación; además, pueden acomodarse seleccionando el tamaño de la microcápsula con objeto de maximizar la transcripción/traducción y la selección como un todo. La determinación empírica del volumen microcapsular óptimo y de la concentración de los reactivos, se prefiere, por ejemplo, tal como se expone en la presente memoria.

Un "elemento genético" según la presente invención, es tal como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, un elemento genético es una molécula o constructo seleccionado a partir del grupo formado por una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o enteramente artificial formada por bases exclusivamente de síntesis o por una mezcla de éstas y de las que se presentan de modo natural, cualquiera de las anteriormente mencionadas unidas a un polipéptido, y cualquiera de las anteriormente mencionadas unidas a cualquier otro grupo o constructo molecular. Ventajosamente, el otro grupo o constructo molecular puede ser seleccionado a partir del grupo formado por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo, perlas de poliestireno, sustancias magnéticas tales como perlas magnéticas, marcadores tales como fluoróforos o marcadores isotópicos, reactivos químicos, agentes de unión tales como macrociclos y similares.

La parte ácido nucleica del elemento genético puede incluir secuencias reguladores apropiadas tales como las que son necesarias para la expresión eficiente del producto génico, por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias de iniciación traduccional, secuencias de poliadenilación, sitios de corte y empalme y similares.

Tal como se pondrá en evidencia a continuación, en muchos casos, el polipéptido u otro grupo o constructo molecular es un ligando que directa o indirectamente se une a o reacciona con el producto génico, con objeto de marcar al elemento genético. Esto permite la clasificación del elemento genético basándose en la actividad del producto génico.

El ligando puede conectarse al ácido nucleico mediante diversos medios que serán evidentes para los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996). Bastará cualquier marcador para permitir la subsiguiente selección del elemento genético. La clasificación puede llevarse a cabo mediante cualquier procedimiento que permita la separación preferente, la amplificación o la supervivencia del elemento genético marcado. Ejemplos incluyen la selección mediante unión ((incluyendo técnicas basadas en la separación magnética, por ejemplo, utilizando DynabeadsTM), y mediante la resistencia a la degradación (por ejemplo, mediante nucleasas, incluyendo endonucleasas de restricción).

Una forma en la que la molécula de ácido nucleico puede estar unida a un ligando es mediante la biotinilación. Esto puede realizarse mediante amplificación PCR con un iniciador de biotinilación en el extremo 5', de forma que la biotina y el ácido nucleico están unidos covalentemente.

El ligando que va a seleccionarse puede estar unido al ácido nucleico modificado mediante diversos medios que serán evidentes para los expertos en la materia. Un ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a una microperla de poliestireno (de 0,035 a 0,2 μm de diámetro) que está revestida con avidina o estreptavidina, que se unirá por tanto al ácido nucleico con una afinidad muy intensa. Esta perla puede derivatizarse con un ligando mediante cualquier procedimiento apropiado, tal como la adición de un ligando biotinilado o mediante enlace covalente.

Alternativamente, un ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a la avidina o a la estreptavidina formando complejo con una gran molécula proteica tal como la tiroglobulina (669 Kd) o la ferritina (440 Kd). Este complejo puede derivatizarse con un ligando, por ejemplo, mediante enlace covalente con el grupo -amino de lisinas, o mediante una interacción no covalente tal como biotina-avidina. El sustrato puede estar presente en forma no unida al elemento genético, pero que contenga un "marcador" inactivo que requiera una etapa posterior para activarlo, tal como la fotoactivación (por ejemplo, de un análogo "enjaulado" de biotina, (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang, 1996)).

Los términos "aislamiento", "clasificación" y "selección", así como sus variaciones, se utilizan en la presente memoria. Aislamiento, según la presente invención, se refiere al procedimiento de separar una entidad a partir de una población h heterogénea, por ejemplo una mezcla, de forma que se libere por lo menos de una sustancia con la que se asoció antes del proceso de aislamiento. En una forma de realización preferida, el aislamiento se refiere a la purificación de una entidad, esencialmente hasta la homogeneidad. La clasificación de una entidad se refiere al procedimiento de aislar preferentemente las entidades deseadas respecto a las entidades no deseadas. En la medida en que esto se refiere al aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislamiento" y "clasificación", son equivalentes. El procedimiento de la presente invención permite la clasificación de los elementos genéticos deseados a partir de conjuntos (genotecas o repertorios) de elementos genéticos que contienen el elemento genético deseado. La selección se utiliza para referirse al procedimiento (que incluye el procedimiento de clasificación) de aislar una entidad según una propiedad particular suya.

En una forma de realización muy preferida, el procedimiento de la presente invención es útil para la clasificación de genotecas de elementos genéticos. La invención proporciona, de acuerdo con esto, un procedimiento según aspectos anteriores de la invención, en el que los elementos genéticos se aíslan a partir de una genoteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos. En la presente memoria, los términos "genoteca", "repertorio" y "conjunto" se utilizan según su significación habitual en la técnica, de forma que una genoteca de elementos genéticos codifica un repertorio de productos génicos. En general, las genotecas se construyen a partir de conjuntos de elementos genéticos que tienen propiedades que facilitan la clasificación.

La selección inicial de un elemento genético a partir de una genoteca de elementos genéticos utilizando la presente invención, requerirá en la mayoría de los casos, el rastreo de un gran número de elementos genéticos variantes. Pueden crearse, de distintas maneras, genotecas de elementos genéticos, que incluyen las siguientes.

Conjuntos de elementos genéticos que se presentan de modo natural pueden clonarse a partir del ADN genómico o del cADN (Sambrook et al., 1989); por ejemplo, las genotecas de anticuerpos fágicos, obtenidas mediante amplificación PCR de repertorios de genes de anticuerpos, de donadores inmunizados o no, han probado ser fuentes muy efectivas de fragmentos de anticuerpos funcionales (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Las genotecas de genes pueden también obtenerse codificando la totalidad (véase por ejemplo Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de los genes (véase por ejemplo Lowman et al., 1991), o conjuntos de genes (véase por ejemplo Nissim et al., 1994) mediante un oligonucleótido sintético dopado o escogido al azar. Las genotecas pueden también obtenerse introduciendo mutaciones en un elemento genético o en un conjunto de elementos genéticos "al azar" mediante diversas técnicas in vivo, que incluyen: la utilización de "cepas mutantes", de bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); la utilización del sistema de hipermutación de anticuerpos de los B-linfocitos (Yelamos et al., 1995). Las mutaciones al azar pueden también introducirse tanto in vivo como in vitro mediante mutágenos químicos, y radiación UV o ionizante (véase Friedberg et al., 1995), o la incorporación de análogos mutagénicos de bases (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Las mutaciones " al azar" pueden asimismo introducirse en los genes in vitro durante la polimerización, utilizando por ejemplo polimerasas que sean propensas al error (Leung et al., 1989).

Puede introducirse una ulterior diversificación utilizando la recombinación homóloga

in vivo (véase Kowalczykowski et al., 1994 o in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b)).

Los elementos genéticos según la invención codifican anticuerpos o fragmentos de los mismos. En un aspecto preferido, la invención permite la identificación y el aislamiento de los productos industrialmente o clínicamente útiles.

La selección de condiciones apropiadas de encapsulación es deseable. Dependiendo de la complejidad y tamaño de la genoteca que vaya a rastrearse, puede ser beneficioso fijar el procedimiento de encapsulación de forma que un elemento genético o menos de 1 sea encapsulado por microcápsula. Esto proporcionará el mayor poder de resolución. Cuando la genoteca es más grande y/o más compleja, sin embargo, esto puede ser impracticable; puede preferirse encapsular varios elementos genéticos juntos y depender de la aplicación repetida del procedimiento de la invención para alcanzar la clasificación de la actividad deseada, Pudiendo utilizarse una combinación de procedimientos de encapsulación para obtener el enriquecimiento deseado.

Los estudios teóricos indican que cuanto más abundante es el número de variantes creadas de elementos genéticos, lo más probable es que una molécula sea creada con las propiedades deseadas (véase Perelson y Oster, 1979, para una descripción de cómo se aplica esto a repertorios de anticuerpos). Recientemente, también se ha confirmado prácticamente que repertorios más numerosos de anticuerpos-fago dan lugar verdaderamente a más anticuerpos con mejores afinidades de unión que los repertorios más pequeños (Griffiths et al., 1994). Para asegurar que se generan variantes raras y por tanto son capaces de ser seleccionadas, es deseable una genoteca de gran tamaño. Así, la utilización de microcápsulas óptimamente pequeñas es beneficiosa.

El repertorio más grande creado hasta la fecha utilizando los procedimientos que necesitan una etapa in vivo (presentación fágica y sistemas LacI), ha sido una genoteca péptido-fágica de 1,6 x 1011 clones, que requirió la fermentación de 15 litros de bacterias (Fish et al., 1996). Los experimentos SELEX se llevan a cabo a menudo sobre grandes cantidades de variantes (hasta 1015).

Utilizando la presente invención, en una microcápsula preferida de 2,6 μm de diámetro, puede seleccionarse, utilizando 1 ml de fase acuosa en 20 ml de emulsión, un tamaño de repertorio de por lo menos 1011 .

Además de los elementos genéticos descritos anteriormente, las microcápsulas según la invención incluirán otros componentes que se requieren para que el procedimiento de clasificación tenga lugar. Otros componentes del sistema comprenderán por ejemplo los necesarios para la transcripción y/o traducción del elemento genético. Éstos son seleccionados para las necesidades de un sistema específico a partir de los siguientes: un tampón apropiado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los ingredientes necesarios, enzimas y cofactores, ARN polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés, con objeto de permitir la selección del producto génico modificado.

Un tampón apropiado será uno en el que todos los componentes deseados del sistema biológico son activos y dependerá por tanto de las necesidades de cada sistema reactivo específico. Los tampones apropiados para las reacciones biológicas y/o químicas son conocidos en la técnica y las recetas se proporcionan en varios textos de laboratorio, tal el de Sambrook et al., 1989.

El sistema de traducción in vitro comprenderá habitualmente un extracto celular, típicamente de bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976), o germen de trigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas apropiados están disponibles comercialmente (por ejemplo, de Promega), incluyendo algunos que permitirán la transcripción/traducción conjugadas (todas los sistemas bacterianos y los sistemas de reticulocitos y de germen de trigo TNTTM son sistemas de extractos de Promega). La mezcla de aminoácidos que se utilizan puede incluir aminoácidos sintéticos si se desea, para aumentar el posible número o variedad de proteínas producidas en la genoteca. Esto puede llevarse a cabo cargando ARNt con aminoácidos artificiales y utilizando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).

Después de cada serie de selección, el enriquecimiento del conjunto de elementos genéticos para los que codifican las moléculas de interés, puede ensayarse mediante la transcripción/replicación in vitro no compartimentalizada, o mediante reacciones acopladas de transcripción-traducción. El conjunto seleccionado se clona en un vector plasmídico apropiado y se produce el ARN o la proteína recombinante a partir de clones individuales para ulterior purificación y ensayo.

Una vez que un elemento genético que codifique el producto génico se haya clasificado mediante el procedimiento de la invención el producto génico puede ser producido. Claramente, el elemento genético en sí mismo puede expresarse directamente mediante medios convencionales para producir el producto génico. Sin embargo, pueden utilizarse técnicas alternativas, como será evidente para los expertos en la materia. Por ejemplo, la información genética incorporada en el producto génico puede incorporarse a un vector de expresión apropiado, y expresada a partir de él.

Las técnicas de rastreo convencional pueden ser utilizadas para identificar compuestos que sean capaces de interactuar con los productos génicos identificados mediante el primer aspecto de la invención. Puede incorporarse el ácido nucleico que codifica el producto génico a un vector, y se introduce en células huéspedes apropiadas para producir progenies celulares transformadas que expresen el producto génico. Las progenies celulares resultantes pueden entonces producirse para llevar a cabo un análisis cuantitativo y/o cualitativo reproducible del efecto o efectos de los medicamentos potenciales que afecten la función del producto génico. De este modo, las células que expresan el producto génico pueden utilizarse para la identificación de compuestos, particularmente de compuestos de peso molecular bajo, que modulan la función del producto génico. Así, las células huéspedes que expresan el producto génico son útiles para el rastreo medicamentoso y pueden ser utilizadas en un procedimiento para identificar compuestos que modulen la actividad del producto génico, que comprende la exposición de las células que contienen ADN heterólogo que codifica el producto génico, en el cual procedimiento dichas células producen productos génicos funcionales, hasta por lo menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal, cuya capacidad para modular la actividad de dicho producto génico se busca determinar, controlando a continuación dichas células respecto a los cambios causados por dicha modulación. Dicho ensayo permite la identificación de moduladores, tales como moduladores agonistas, antagonistas y alostéricos, del producto génico. Tal como se utiliza en la presente memoria, un compuesto o señal que module la actividad del producto génico hace referencia a un producto que altera la actividad del producto génico, de tal manera, que la actividad del producto génico es distinta en presencia del compuesto o señal (comparada con la ausencia de dicho compuesto o señal).

Los ensayos de rastreo basados en células pueden diseñarse para construir progenies celulares en las que la expresión de una proteína informadora, es decir, una proteína fácilmente ensayable, tal como la b galactosidasa, la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) o la luciferasa, depende del producto génico. Dicho ensayo permite la detección de compuestos que modulan directamente la función del producto génico, tal como compuestos que antagonizan el producto génico, o compuestos que inhiben o potencial otras funciones celulares que se requieren para la actividad del producto génico.

Pueden asimismo ponerse en práctica procedimientos para influir exógenamente en los procesos dependientes del producto génico que tienen lugar en las células. Las células huésped que producen productos génicos recombinantes, por ejemplo, las células de mamíferos, pueden ponerse en contacto con un compuesto de prueba, y su efecto o efectos modulantes pueden entonces evaluarse comparando la respuesta mediada por el producto génico en presencia y ausencia del compuesto de prueba, o relacionando la respuesta mediada por el producto génico de las células de ensayo, o de las células control(es decir, de células que no expresan el producto génico), con la presencia del compuesto.

(B) PROCEDIMIENTOS DE SELECCIÓN

El sistema está concebido para seleccionar moléculas de productos génicos proteicos con actividad de unión.

(i) SELECCIÓN DE AFINIDAD

En el caso de selección para un producto génico que presente afinidad por un ligando específico, el elemento genético puede unirse al producto génico en la microcápsula a través del ligando. Sólo los productos génicos con afinidad por el ligando se unirán por lo tanto al elemento genético mismo, y por lo tanto, sólo elementos genéticos que produzcan producto activo quedarán retenidos en la etapa selectiva. En esta forma de realización, el elemento genético comprenderá, de esta forma, un ácido nucleico que codifique el producto génico unido a un ligando para éste.

En esta forma de realización, todos los productos génicos que van a ser seleccionados contienen un dominio putativo de unión, el cual va a seleccionarse, así como una característica común, un marcador. El elemento genético en cada microcápsula está unido físicamente al ligando. Si el producto génico producido a partir del elemento genético posee afinidad por el ligando, se unirá a éste y llegará a estar unido físicamente al mismo elemento genético que lo codificó, dando lugar a un elemento genético "marcado". Al final de la reacción, todas las microcápsulas se combinan, y todos los elementos genéticos y productos génicos se agrupan conjuntamente en un mismo medio ambiente. Los elementos genéticos que codifican los productos génicos que exhiben la unión deseada, pueden seleccionarse mediante purificación por afinidad, utilizando una molécula que se une específicamente a, o reacciona específicamente con "el marcador".

En una forma de realización alternativa, los elementos genéticos pueden clasificarse basándose en que el producto génico, que se une al ligando, oculta meramente a éste de, por ejemplo, otros socios de unión. En esta eventualidad, el elemento genético, más que quedar retenido durante una etapa de purificación por afinidad, puede eluirse selectivamente mientras otros elementos genéticos se unen.

En una forma de realización alternativa, la invención proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la invención, en el que en la etapa (b) los productos génicos se unen a los elementos genéticos que los codifican. Los productos génicos junto con los elementos genéticos unidos, se clasifican a continuación como resultado de la unión de un ligando a productos génicos que tienen la actividad deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos pueden contener una región constante que se une covalentemente o no al elemento genético, y una segunda región que está diversificada, de forma que genera la actividad de unión deseada.

La clasificación mediante afinidad depende de la presencia de dos elementos de un par de unión, en tales condiciones que la unión puede tener lugar, por ejemplo un antígeno y un anticuerpo o fragmento del mismo que puede unirse al antígeno.

(ii) CLASIFICACIÓN DE LAS MICROCÁPSULAS

La invención proporciona la clasificación de microcápsulas intactas, permitiendo llevarla a cabo las técnicas de clasificación que van a utilizarse. Las microcápsulas pueden clasificarse cuando tiene lugar el cambio inducido por el producto génico deseado o el mismo cambio se manifiesta en la superficie de la microcápsula o puede detectarse desde fuera de ésta. El cambio puede estar causado por la acción directa del producto génico, o indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las cuales implican al producto génico que posee la actividad deseada, conduce al cambio. Por ejemplo, la microcápsula puede estar configurada de forma que el producto génico se exponga en su superficie y sea accesible, de esta forma, a los reactivos. Cuando la microcápsula es membranosa, el producto génico puede ser dirigido o puede causar que una molécula se dirija a la membrana de la microcápsula. Esto puede alcanzarse, por ejemplo, utilizando una secuencia de localización de la membrana, tal como las derivadas de las proteínas de la membrana, que favorecerán la incorporación de una molécula fusionada o unida a la membrana de la microcápsula. Alternativamente, cuando la microcápsula se forma mediante la división de fases, tal como con las emulsiones agua-aceite, una molécula que posea partes que sean más solubles en la fase extra-capsular, se organizará ella misma de forma que estas partes se encuentren en el límite de la microcápsula.

En un aspecto preferido de la invención, sin embargo, la clasificación de las microcápsulas se aplica a los sistemas de clasificación que dependen de un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula, por ejemplo, sus características de absorción o de emisión, por ejemplo, la alteración en las propiedades ópticas de la microcápsula, que resulta de una reacción que conduce a cambios en la absorbencia, luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia asociadas con la microcápsula. La totalidad de dichas propiedades se incluyen en el término "óptico". En tal caso, las microcápsulas pueden clasificarse debido a que la clasificación puede activarse por luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una forma de realización muy preferida, la clasificación activada por la fluorescencia se utiliza para clasificar las microcápsulas en las que la producción de un producto génico que tenga una actividad deseada, se acompaña de la producción de una molécula fluorescente en la célula. Por ejemplo, el producto génico en si mismo puede ser fluorescente, por una proteína fluorescente tal como GFP. Alternativamente, el producto génico puede inducir o modificar la fluorescencia de otra molécula, uniéndose o reaccionando con ella.

(iii) IDENTIFICACIÓN DE LAS MICROCÁPSULAS

Las microcápsulas pueden identificarse mediante un cambio inducido por el producto génico deseado, que tiene lugar o él mismo se manifiesta en la superficie de la microcápsula o es detectable desde el exterior, tal como se describe en la sección ii (Clasificación de las Microcápsulas). Este cambio, cuando se identifica, se utiliza para desencadenar la modificación del gen en el interior del compartimento. En un aspecto preferido de la invención, la identificación de las microcápsulas depende de un cambio en sus propiedades ópticas, resultantes de una reacción que conduce a la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia en el interior de la microcápsula. La modificación del gen en el interior de las microcápsulas será desencadenada por la identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Por ejemplo, la identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia, puede desencadenar el bombardeo del compartimento con fotones (u otras partículas u ondas) que conduce a la modificación del elemento genético. Un procedimiento similar se ha descrito previamente para la clasificación de células (Keij et al., 1994). La modificación del elemento genético puede resultar, por ejemplo, del acoplamiento de un "marcador" molecular envuelto por un grupo protector fotolábil para los elementos genéticos: el bombardeo con fotones de una longitud de onda apropiada conduce a la eliminación de la envuelta. A continuación, las microcápsulas se combinan y los elementos genéticos se agrupan juntos en un ambiente determinado. Los elementos genéticos que codifican productos génicos que muestran la actividad deseada, pueden seleccionarse mediante purificación por afinidad utilizando una molécula que se une o reacciona específicamente con el "marcador".

(iv) PROCEDIMIENTO DE MÚLTIPLES ETAPAS.

Asimismo, se apreciará que, según la presente invención, no es necesario, para todos los procedimientos de transcripción/replicación y/o traducción y selección continuar en una única etapa, teniendo lugar en una microcápsula la totalidad de las reacciones. El procedimiento de selección puede comprender dos o más etapas. En primer lugar, la transcripción/replicación y/o la traducción de cada elemento genético de una genoteca de elementos genéticos puede llevarse a cabo en una primera microcápsula. Cada producto génico se une entonces al elemento genético que lo codificó (que se encuentra en la misma microcápsula). Las microcápsulas se fragmentan entonces, y los elementos genéticos unidos a sus productos génicos respectivos, se purifican opcionalmente. Alternativamente, los elementos genéticos pueden unirse a sus respectivos productos genéticos utilizando procedimientos que no dependen de la encapsulación. Por ejemplo, la presentación de fagos (Smith, G.P., 1985), la presentación polisómica (Mattheakkis et al., 1994), la fusión ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997), o la fusión del péptido represor lac (Cull, et al., 1992).

En la segunda etapa del procedimiento, cada elemento genético purificado que se une al producto génico, se dispone en una segunda microcápsula que contiene componentes de la reacción que va a seleccionarse. Esta reacción se inicia entonces. Después de finalización de las reacciones, las microcápsulas se fragmentan otra vez y se seleccionan los elementos genéticos modificados. En el caso de reacciones de múltiples etapas complicadas, en las que están implicados muchos componentes individuales y etapas de reacción, una o más de las etapas que intervienen pueden llevarse a cabo entre la etapa inicial de creación y la unión del producto génico al elemento genético, y la etapa final de generación del cambio seleccionable en el elemento genético.

(v) SELECCIÓN MEDIANTE ACTIVACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN INFORMADOR IN SITU

El sistema puede configurarse de tal forma que la deseada actividad de unión, catalítica o reguladora codificada por un elemento genético conduce, directa o indirectamente, a la activación de la expresión de un "gen informador" que se encuentra en todas las microcápsulas. Sólo los productos génicos con la actividad deseada activan la expresión del gen informador. La actividad resultante de la expresión del gen informador permite la selección del elemento genético (o del compartimento que lo contiene) mediante algunos de los procedimientos que se describen en la presente memoria.

Por ejemplo, la activación del gen informador puede ser el resultado de la actividad de unión del producto génico de una forma análoga a la del "sistema de dos híbridos" (Fields y Song, 1989).

(vi) AMPLIFICACIÓN

Según otro aspecto de la presente invención, el procedimiento comprende la etapa ulterior de amplificación de los elementos genéticos. La amplificación selectiva puede utilizarse como un medio para enriquecer los elementos genéticos que codifican el producto génico deseado.

En todas las configuraciones anteriores, el material genético incluido en los

elementos genéticos puede amplificarse y repetirse el proceso en etapas reiterativas. La amplificación puede realizarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al.,1988), o utilizando una de las diversas técnicas de amplificación génica, incluyendo: amplificación mediante la replicasa Qβ (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); el sistema de replicación secuencial auto-sostenido (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991), y la amplificación del desplazamiento de las cadenas (Walker et al., 1992).

(vii) COMPARTIMENTALIZACIÓN

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento para la compartimentalización y expresión de un elemento genético con objeto de formar su anticuerpo o fragmento del mismo en el interior del compartimento, que comprende las etapas siguientes:

(a)

formación de una solución acuosa que comprenda el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo, para formar su producto génico;

(b)

microencapsulación de la solución, de manera que se forme una microcápsula discreta que incluya el elemento genético; y

(c)

exposición de la microcápsula a condiciones apropiadas para que el elemento genético se exprese, y se forme su anticuerpo o fragmento del mismo.

Las técnicas apropiadas de microencapsulación se describen detalladamente en la descripción general que sigue a continuación.

Preferentemente, una genoteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos es encapsulada mediante el procedimiento expuesto anteriormente, y los elementos genéticos se expresan para producir sus respectivos productos génicos, según la invención. En una forma de realización muy preferida, la microencapsulación es obtenida formando una emulsión agua-aceite a partir de la solución acuosa que incluye los elementos genéticos.

Varios aspectos y formas de realización de la presente invención se ilustran en los ejemplos siguientes.

EJEMPLOS (únicamente como referencia)

Ejemplo 1

La producción de microcápsulas acuosas de aproximadamente 2 μm en un sistema de emulsión agua-aceite.

Las microcápsulas que pertenecen al abanico de tamaños preferidos de la presente invención, pueden generarse utilizando un sistema de emulsión agua-aceite.

Aceite mineral blanco ligero (Sigma; M-3516) se utiliza en la presente memoria como la fase continua y la emulsión se estabiliza mediante los emulsificantes monooleato de sorbitán (Span 80, Fluka; 85548) y monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80, Sigma Ultra; P-8074) y en algunos casos, también con desoxicolato sódico al 0,5% peso/vol (Fluka; 30970).

La fase oleosa se preparó en el momento disolviendo Span 80 al 4,5% (vol/vol) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, #M-5904), seguido por Tween 80 al 0,5% (vol/vol) (SigmaUltra; #P-8074). Mezclas reactivas in vitro enfriadas con hielo (50 μl) se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 μl durante 2 minutos aproximadamente) a 0,95 ml de la fase oleosa enfriada con hielo en un Vial Costar Biofreeze de 5 ml (#2051), mientras se agitaba con una varilla magnética (8 x 3 mm con un anillo giratorio; Scientific Industries International, Loughborough, Gran Bretaña). Se continuó la agitación en hielo a 1150

r.p.m. durante otro minuto más. En algunas emulsiones la fase acuosa se suplementó con un surfactante aniónico, por ejemplo, desoxicolato sódico, colato sódico, glicolato sódico y taurocolato sódico, típicamente al 0,5% (peso/vol).

Cuando se indicó, la emulsión se homogeneizó posteriormente utilizando un dispersor Ultra-Turrax T23 (IKA), equipado con un dispositivo de dispersión de 8 mm de diámetro a 8 k, 9 k ó 13,5 k r.p.m. durante 1 minuto, o a 20 k r.p.m. durante 1 ó 5 minutos, en hielo. Esto redujo el tamaño de la microcápsula.

Las reacciones pudieron extinguirse y la emulsión fragmentarse, tal como se indica en los ejemplos individuales, provocando una rotación 3.000 g durante 5 minutos y eliminando la fase oleosa, dejando que la emulsión se concentrara en el fondo del vial. Se añadieron tampón de extinción (típicamente, 0,2 ml de 25 μg/ml de ARN de levadura en tampón W + B: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4) y 2 ml de éter dietílico saturado con agua, haciendo rotar la mezcla, centrifugándola brevemente, y eliminando la fase éter. La fase acuosa se lavó con éter y se secó (5 minutos en un Speedvac a temperatura ambiente).

La distribución del tamaño de las gotitas acuosas en las emulsiones se determinó mediante difracción laser utilizando un Analizador del Tamaño de Partícula Coulter LS230. Una alícuota de la emulsión, recién diluida (1:10) en aceite mineral, se añadió a la cámara de micro-volumen que contenía aceite mineral sometido a agitación. Los resultados se analizaron con el modelo óptico Mie basado en el instrumento, utilizando índices de refracción de 1.468 para el aceite mineral y de 1.350 para la fase acuosa. La distribución del tamaño de las gotitas de agua en la emulsión, se muestra en la Figura 2. La adición de desoxicolato sódico no alteró significativamente la distribución del tamaño.

Ejemplo 2

Reacciones eficientes de transcripción, in vitro, llevadas a cabo en las microcápsulas acuosas de una emulsión agua-aceite.

Con objeto de producir ARN a partir de ADN en el interior de cada microcápsula, la molécula única de ADN que se encuentra en el interior de cada microcápsula acuosa del sistema, debe ser transcrita eficientemente. En la presente memoria, la transcripción in vitro se demuestra en el interior de las microcápsulas.

El núcleo catalítico del intrón de Tetrahymena de auto corte y empalme, es un ribozima muy estudiado que puede catalizar diversas reacciones de transferencia de fosfoésteres (Sag et al., 1986; Sag y Czech 1986; Sag y Czech, 1986). Por ejemplo, un intrón modificado de Tetrahymena al que le falta el bucle troncal P1 del extremo 5' y los bucles troncales P9.1 y P9.2 del extremo 3', puede funcionar como una ARN ligasa, cortando y empalmando juntos eficientemente dos o más oligonucleótidos alineados en una cadena matricial (Green y Szostak, 1992).

El ADN que codifica el ribozima de Tetrahymena anteriormente descrito, se amplifica mediante PCR utilizando los iniciadores P2T7Ba (hibridizándose a la región del bucle P2 y añadiendo un promotor de la T7 ARN polimerasa) y P9Fo (hibridizándose a la región del bucle P9). Esto da lugar a un fragmento de ADN de 331 pares de bases que transporta el promotor de la T7 ARN polimerasa. Este fragmento se purifica directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega) y se emplea como matriz para una reacción de transcripción in vitro utilizando la T7 ARN polimerasa.

La transcripción in vitro se ensaya durante un período inicial de 10 minutos durante el cual la velocidad de la reacción es esencialmente lineal (Chamberlin y Ring, 1973). Las condiciones de la reacción para la transcripción son las descritas por Wyatt et al., 1991.

La incorporación de [-32 P] UTP se utiliza para ensayar la progresión de la reacción.

Una reacción de transcripción se limita a un volumen de 200 μl y se divide en 2 alícuotas, cada una de las cuales contiene 3 x 1011 moléculas de ADN (5 nM). Una alícuota de 100 μl se añade a 2 ml de aceite mineral ligero Sigma que contiene Span 80 al 4,5% y Tween 80 al 0,5%. homogeneizándose durante 5 minutos con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 20.000 r.p.m. como en el Ejemplo 1. Basándose en el volumen medio de la microcápsula en estas emulsiones (2,8 X 10-19 m3 para un diámetro de la microcápsula de 0,81 μm) los 100 μl de la reacción se dividirán en 3,6 x 1011 microcápsulas. Por tanto, deberá haber, por término medio, 1 molécula de ADN por microcápsula.

Las dos alícuotas se incubaron en un baño acuoso a 37ºC. Muestras de 0,5 ml de la emulsión se eliminaron antes del comienzo de la incubación y después de 10 minutos de transcurrida ésta, colocándolas en hielo. Al mismo tiempo, se eliminaron muestras similares de 25 μl de las reacciones de control no emulsificadas. Las emulsiones se fragmentaron y las reacciones se detuvieron con 0,5 ml EDTA (50 mM) y 2 ml de éter dietílico saturado con agua, tal como se describe en el Ejemplo 1. Se añadieron entonces 100 μl de ADN espermático de salmón (500 μg/ml) en 20 mM EDTA. Se quitaron entonces tres alícuotas de 100 μl de las dos emulsiones y de los controles, ensayándose el ARN marcado mediante precipitación de TCA y contaje de centelleo.

La tasa de transcripción se cuantifica como el aumento en el contaje de centelleo perceptible del ácido cpm durante los 10 minutos de incubación a 37ºC. En las reacciones del control no emulsificado se detecta un contaje de centelleo del material ácido, perceptible, de 442.000 cpm, comparado con los 147.000 cpm en la emulsión. Por tanto, la tasa de transcripción en la emulsión es 33% de la encontrada en las reacciones del control no emulsificado.

Este procedimiento por tanto, muestra que el ARN puede sintetizarse eficientemente mediante la T17 ARN polimerasa en las microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite.

Ejemplo 3

Reacciones acopladas de transcripción/traducción eficientes, in vitro, llevadas a cabo en las microcápsulas acuosas de una emulsión de agua en aceite.

Con objeto de sintetizar proteínas utilizando el procedimiento de la presente invención, la traducción debe ser activa en las microcápsulas acuosas de la emulsión de agua en aceite que se describen en la presente memoria.

Aquí se muestra cómo una proteína (la dihidrofolato reductasa de E. coli) puede sintetizarse eficientemente a partir del ADN en las microcápsulas acuosas de un sistema de emulsión de agua en aceite, utilizando un sistema acoplado de transcripción/traducción.

El gen folA de E. coli que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) se amplifica mediante la PCR utilizando los oligonucleótidos EDHFRFo y EDHFRBa. Este ADN es clonado entonces en el vector pGEM-4Z (Promega) que se digiere con HindIII y KpnI por debajo del promotor de la T7 ARN polimerasa y del promotor lac. El oligonucleótido EDHFRBa se añade al sitio de inicio traduccional 10 del gen del fago eficiente T7 por encima del codon de inicio de DHFR.

La secuenciación del ADN identificó un clon que posee la secuencia nucleótida correcta. Se encontró que las bacterias transformadas con este clon (pGEM-folA) sobreexpresan la DHFR activa (comandada a partir del promotor lac) cuando se indujo con IPTG.

El plásmido pGEM-folA se amplificó entonces mediante PCR utilizando los iniciadores LMB2 y LMB3 bajo las condiciones descritas anteriormente, para crear un fragmento de ADN de 649 pares de bases que transporta el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de inicio traduccional 10 del gen del fago T7 y el gen folA. Este fragmento PCR se purificó directamente, utilizando Wizard PCR Preps (Promega) y se utilizó para programar un sistema procariótico acoplado de transcripción/traducción, in vitro, diseñado para las matrices lineales (Lesley, Brow y Burgess, 1991).

Se utilizó una preparación comercial de este sistema (Sistema de extracto de E. coli S30 para Matrices Lineales; Promega), suplementado con la T7 ARN polimerasa.

300 μl de una reacción de traducción se fijaron en hielo, que contenían 3 x 1012 moléculas de ADN. Se añadieron 104 unidades de T7 ARN polimerasa para dirigir la transcripción y la proteína traducida se marcó añadiendo [35S]metionina. Una alícuota de 150 μl de esta reacción se añadió a 2,85 ml de aceite mineral ligero Sigma que contenía Span 80 al 4,5% y Tween 80 al 0,5%, homogeneizándose durante 1 minuto con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 20.000 r.p.m., como en el Ejemplo 1. La otra alícuota no se emulsificó.

Basándose en el volumen medio de la microcápsula en las emulsiones (1,1 x 10-18 m3 para una microcápsula de un diámetro de 1,29 μm), la reacción de 150 μl se dividiría en 1,3 x 1011, microcápsulas). Por tanto, deberá haber aproximadamente 11 moléculas de ADN por microcápsula.

Cuatro alícuotas de 0,5 ml se quitaron de la mezcla reactiva de la emulsión. Una alícuota se dispuso inmediatamente en hielo y las otras tres se incubaron en un baño acuoso a 25ºC durante 2 horas antes de depositarlas en hielo. Cuatro muestras de 25 μl se quitaron también de la mezcla reactiva no emulsificada; una se dispuso inmediatamente en hielo y las otras tres se incubaron en un baño acuoso a 25ºC durante 2 horas, situándolas entonces en hielo.

Las emulsiones se sometieron a rotación en una microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos a 4ºC, depositándose entonces el aceite mineral en el fondo del tubo que contenía a la emulsión concentrada (pero todavía intacta). Después de llevar a cabo otra vez, brevemente, la rotación, y eliminando cualquier otro aceite mineral que pudiera quedar, la emulsión se fragmentó, deteniéndose cualquier otra traducción posterior mediante la adición de 100 μl de agua que contenía 125 μg/ml de puromicina y 1 ml de éter dietílico saturado con agua. Esta mezcla se agitó vorticialmente, sometiéndola a rotación en una microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 1 minuto a 4ºC. El éter y el aceite mineral disuelto se eliminaron entonces mediante aspiración, repitiéndose la extracción con 1 ml adicional de éter. Cualquier éter que quedara se apartó repitiendo la rotación durante 5 minutos en una Speedvac a temperatura ambiente.

100 μl de agua que contenían 125 μg/ml de puromicina se añadieron también a las reacciones de control no emulsificadas de 25 μl. 25 μl de cada una de las muestras se precipitaron entonces con acetona y se procesaron en un gel SDS-PAGE al 20%, según las instrucciones dadas por los fabricantes del sistema de transcripción/traducción (Promega). El gel se secó y sometió a rastreo utilizando PhosphorImager (Molecular Dynamics). Se apreció una banda única e intensa con el peso molecular esperado de la DHFR (18 kd) tanto en las reacciones llevadas a cabo en las emulsiones como en los controles. Esta banda se cuantificó de forma precisa.

En las reacciones emulsificadas, el área media bajo el pico de 18 kd es de 15,073 unidades, mientras que el área media bajo el mismo pico en las reacciones de control no emulsificadas es de 18,990 unidades. Por tanto, en las reacciones emulsificadas, la cantidad de proteína DHFR se calcula que es el 79% de la encontrada en las reacciones de control no emulsificadas. Esto indica por tanto que el sistema de transcripción/traducción es funcional en el sistema de emulsión de agua-aceite de la presente invención.

Ejemplo 4

La Dihidrofolato reductasa producida utilizando las reacciones acopladas de transcripción/traducción in vitro, es activa.

Aquí se muestra que la proteína (dihidrofolato reductasa) de E. coli puede sintetizarse eficientemente en una forma catalíticamente activa mediante una transcripción/traducción acoplada del gen folA en las microcápsulas acuosas de un sistema de emulsión de agua en aceite. En este ensayo, se utiliza una emulsión que comprende microcápsulas que se encuentran por debajo del tamaño óptimo; se muestra que la actividad de DHFR es superior en los tamaños más grandes de las microcápsulas.

175 μl de reacciones de traducción (no marcadas) se fijaron en hielo, conteniendo 2 x 1011, 6 x 1012 ó 1,8 x 1012 moléculas del ADN matriz folA utilizado en el Ejemplo 3, o sin ADN. Se añadió T7 ARN polimerasa (6 x 103 unidades) a cada reacción para gobernar la transcripción.

Una alícuota de 100 μl de cada reacción se añadió a 1,9 ml de aceite mineral ligero Sigma que contenía Span 80 al 4,5% y Tween 80 al 0,5%, homogeneizándose durante 1 minuto ó 5 minutos mediante un Homogenizador UltraTurrax T25 equipado con un dispositivo dispersor con un diámetro de 8 mm, a 20.000 r.p.m. como en el Ejemplo 1. Después de homogeneización durante 1 minuto, el diámetro medio de las partículas (en volumen) es de 1,30 μm (media de 1,28 μm). El 98% en volumen de la fase (acuosa) interna se encuentra como partículas que varían entre 0,63 μm y 2,12 μm. Después de homogeneización durante 5 minutos, el diámetro medio de las microcápsulas (en volumen) es de 0,81 μm (media de 0,79 μm) y el 98% en volumen de la fase (acuosa) interna se encuentra en partículas que varían entre 0,41 μm y 1,38 μm.

Basándose en el volumen microcapsular medio en las emulsiones de 1 minuto (1,1 x 10-18 m3 para una microcápsula con un diámetro de 1,299 μm), los 100 μl reactivos deberán dividirse en 8,7 x 1010 microcápsulas). Por tanto, deberán existir aproximadamente 1,3, 3,9 ó 11,8 moléculas de ADN por microcápsula.

Basándose en el volumen microcapsular medio en las emulsiones de 5 minutos (2,8 x 10-19 m3 para una microcápsula con un diámetro de 0,81 μm), los 100 μl reactivos deberán dividirse en 3,6 x 1011 microcápsulas). Por tanto, deberán existir aproximadamente 0,3., 1,0 ó 2,9 moléculas de ADN por microcápsula.

Las emulsiones, y la mezcla reactiva no emulsificada, se incuban en un baño acuoso a 25ºC. Muestras de 0,5 ml de la emulsión, se eliminaron inmediatamente antes del inicio de la incubación y después de 2 horas, y se situaron en hielo. Muestras de 25 μl se eliminaron al mismo tiempo de las reacciones de control no emulsificadas.

Las emulsiones se hicieron rotar en una microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 5 minutos, a 4ºC, eliminándose el aceite mineral mediante aspiración, dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Después de llevar a cabo otra vez, brevemente, la rotación, y eliminando cualquier otro aceite mineral que pudiera quedar, la emulsión se fragmentó, deteniéndose cualquier otra traducción posterior mediante la adición de 100 μl de tampón A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM β-mercaptoetanol), que contenía 125 μg/ml de puromicina y 1 ml de éter dietílico saturado con agua. Esta mezcla se agitó vorticialmente, sometiéndola a rotación en una microcentrífuga a 13.000 r.p.m. durante 1 minuto a 4ºC. El éter y el aceite mineral disuelto se eliminaron entonces mediante aspiración, repitiéndose la extracción con otro ml de éter. Cualquier éter que quedara se apartó repitiendo la rotación durante 5 minutos en una Speedvac a temperatura ambiente. También se añadieron 100 μl de un tampón A que contenía (125 μg/ml) de puromicina a los 25 μl de las reacciones de control no emulsificadas.

La actividad de la dihidrofolato reductasa se ensayó mediante espectrofotometría, controlando la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm, durante un tiempo de 10 minutos, tal como se describe por Williams et al., 1979; Ma et al.,1993. 10 μl de cada reacción de traducción extinguida, in vitro, se añadieron a 150 μl de Tampón A (100 mM Imidazol, pH 7,0, 10 mM de β-mercaptoetanol) y 20 μl de 1mM NADPH. Se añadieron 20 μl de Dihidrofolato (1 mM) (H2F) después de 1 minuto y la reacción se controló a 340 nm, utilizando un lector de microplaca ThermoMax (Molecular Devices). La actividad se calculó por las velocidades iniciales bajo condiciones So >> KM (υmax). La actividad anterior en el extracto S30 se substrajo de todas las muestras.

La actividad de DHFR generada en las emulsiones se obtiene a partir de la diferencia entre la actividad medida a las 0 y a las 2 horas de incubación. No tuvo lugar un aumento en la oxidación del NADPH entre las muestras a las 0 y las 2 horas, cuando se añadió 0,1 μm de metotrexato (un inhibidor específico de DHFR), mostrando que la totalidad del aumento en la oxidación de NADPH que se observó, se debe a la DHFR producida en las reacciones de traducción in vitro.

Realizando una homogeneización de 1 minuto a 20.000 r.p.m., la actividad de DHFR que se generó en las emulsiones, es el 31% de la encontrada en las reacciones de control no emulsificadas, con 1,3 moléculas de ADN por microcápsula; el 45% con 3,9 moléculas de ADN por microcápsula; y el 84% con 11,8 moléculas de ADN por microcápsula.

Realizando una homogeneización de 5 minutos a 20.000 r.p.m., la actividad de DHFR que se generó en las emulsiones, es el 7% de la encontrada en las reacciones de control no emulsificadas, con 0,3 moléculas de ADN por microcápsula; el 15% con 1 molécula de ADN por microcápsula; y el 35% con 2,9 moléculas de ADN por microcápsula, como promedio.

Asumiendo que el recambio de la DHFR es tal como se describe por Posner et al., 1996, este corresponde, con la mayor concentración de ADN, a un rendimiento de 6,3 μg (340 pmoles) de DHFR por 100 μl reactivos (control no emulsificado), de 1,98 μg (104 pmoles) de DHFR por 100 μl reactivos (emulsificado durante 1 minuto), o de 0,46 μg (24,8 pmoles) por 100 μl reactivos (emulsificado durante 5 minutos). Esto se equipara con 74 moléculas de DHFR por microcápsula en las emulsiones de 1 minuto y con 44 moléculas por microcápsula en las emulsiones de 5 minutos (asumiendo que todas las microcápsulas sean del tamaño medio).

La actividad de la DHFR que resulta de las transcripciones/traducciones acopladas de los genes folA, se mide también en las cápsulas más voluminosas producidas mediante solo agitación, o mediante agitación seguida por la ulterior homogeneización con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 8.000 r.p.m., 9.000 r.p.m., o 13.500 r.p.m., durante 1 minuto, tal como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Figura 2b. La concentración de los genes folA utilizados (2,5 nM), proporciona un promedio de 1, 1,5 y 4,8 elementos genéticos por gotita en las emulsiones homogeneizadas a 13.500, 9500 y

8.000 r.p.m., respectivamente, y un promedio de 14 elementos genéticos por gotita en las emulsiones preparadas sólo mediante agitación. La adición de desoxicolato sódico (0,5%) a la mezcla reactiva de la traducción in vitro no afecta significativamente a la actividad DHFR observada en las emulsiones fragmentadas.

Ejemplo 5

Unión de un sustrato inmovilizado a un elemento genético mediante una proteína de alto peso molecular.

Con objeto de unir múltiples moléculas de sustrato inmovilizadas a un fragmento de ADN que comprende el gen folA, el fragmento de ADN se somete en primer lugar a biotinilación, uniéndose entonces a un complejo de avidina con apoferritina. La apoferritina del bazo del caballo constituye una molécula proteica casi esférica, voluminosa, de 12,5 nm de diámetro, que proporciona por tanto, múltiples sitios que pueden ser derivatizados con sustrato (por ejemplo, el grupo -amino de las lisinas superficiales). El plásmido pGEM-folA que codifica la DHFR de E. coli se amplificó mediante PCR utilizando los iniciadores LMB3 y LMB2 biotinilado en el extremo 5' (LMB2-Biotina), para crear un fragmento biotinilado de ADN de 649 pares de bases que transporta el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7 y el gen folA (véase Ejemplo 3). El ADN se marcó radioactivamente suplementando la mezcla reactiva PCR de 500 μl con 100 μCi [α-32P]dCTP (Amersham; 3000 Ci/mmoles). El fragmento PCR biotinilado se purificó directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega), determinándose espectrofotométricamente la concentración. El porcentaje de ADN biotinilado se ensayó mediante unión a las Streptavidin M-280 Dynabeads (Dynal) y el contaje de centelleo. Se determinó que el 83% del ADN estaba biotinilado, utilizando esta técnica.

El hierro secuestrado se eliminó de un conjugado comercial de avidina y ferritina (Avidina-Ferritina; 1,1 mol de ferritina por mol de avidina, aproximadamente; Sigma) mediante diálisis nocturna (4ºC) de una solución de avidina-ferritina en PBS (1 mg/ml) contra 0,12 M de ácido tioglicólico, pH 4,25, seguido por 24 horas de diálisis contra PBS (4ºC), tal como se describe por Kadir y Moore, 1990. La eliminación del hierro se comprueba mediante análisis del espectro de absorbencia (el Fe (III) secuestrado absorbe intensamente a 310 -360 nm).

0,3 pmoles de ADN biotinilado y marcado radioactivamente, se incubaron en PBS con distintas proporciones molares de avidina-apoferritina (volumen total de 9 μl) durante 30 minutos a temperatura ambiente. se eliminó una alícuota de 4,5 μl, y el porcentaje de ADN formando complejo con la avidina-apoferritina se ensayó utilizando una prueba de cambio en un gel de agarosa al 1,5%, tal como se describe por Berman et al., 1987. El gel se secó entonces y se rastreó utilizando un PhosphorImager (Molecular Dynamics). El porcentaje de ADN que no había cambiado (es decir, que no se acomplejaba con la avidina-apoferritina) era del 17% (proporción molar avidina-apoferritina:ADN de 1:1, del 15% (proporción molar avidina-apoferritina:ADN del 5:1) o del 14% (proporción molar avidina-apoferritina:ADN 25:1). Esto significa que incluso con una proporción 1:1 avidinaapoferrina:ADN, todo el ADN biotinilado está básicamente unido. No se observó cambio en

la bandas cuando el ADN biotinilado se mezcló con la apoferrina o cuando el ADN no

biotinilado se mezcló con la avidina-apoferritina.

El resto de 4,5 μl del ADN formando complejo con la avidina-apoferrina, se utiliza como matriz para una reacción de transcripción/traducción in vitro de 25 μl (Sistema de Extracto S30 de E. coli para las Matrices Lineales; Promega). Después de 2 horas a 25ºC, la reacción se detuvo añadiendo 100 μl de tampón A que contenía puromicina (125 μg/ml). La actividad de la dihidrofolato reductasa se ensayó como anteriormente, mediante espectrofotometría, controlando la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante un tiempo de 10 minutos.

10 μl de cada una de las reacciones de traducción in vitro se añadieron a 150 μl del tampón A y a 20 μl de NADPH (1mM). 20 l de dihidrofolato (ImM) (las emulsiones se fragmentaron y las reacciones se detuvieron con 0,5 ml de EDTA (50 mM) y 2 ml de éter dietílico saturado con agua, tal como se describió en el Ejemplo 1) se añadieron después de un minuto, controlándose la reacción a 340 nm utilizando un lector de microplaca ThermoMax (Molecular Devices). No se encontró diferencia en la actividad de la DHFR a incluso la proporción más alta de avidina-apoferritina:ADN, comparada con un control en el que no se había añadido la avidina-apoferritina. Esto indica que la mayor parte del ADN puede formar complejo sin comprometer la eficiencia de la traducción in vitro.

Ejemplo 6

Tanto la transcripción-traducción in vitro como la actividad de la DHFR son compatibles en el mismo sistema.

Con objeto de seleccionar la actividad de la DHFR producida in situ mediante la transcripción-traducción acopladas, tanto la reacción de transcripción-traducción como la DHFR deben ser activos en el mismo sistema tampón.

Un ensayo directo respecto a la actividad de DHFR en un sistema completo de traducción in vitro de E. coli basado en el control espectrométrico de la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm, no es práctico, debido a la turbidez de los extractos S30.

Sin embargo, es posible comprobar que la DHFR es activa en el mismo sistema tampón que en la traducción in vitro. La DHFR de E. coli se obtiene mediante inducción por IPTG de las bacterias que contienen el plásmido pGEM-folA y que es purificado por afinidad en una columna de Sepharose-metotrexato (Baccanari et al.,1977).

La actividad de la DHFR se compara en el tampón A como anteriormente o en una mezcla de traducción in vitro, completa, excepto por la sustitución del tampón de diálisis S30 (Lesley, 1995) (10 mM Tris-acetato pH 8,0, 14 mM acetato de magnesio, 60 mM acetato potásico, ImM DTT) por la fracción S30. En cada caso el volumen de reacción total es 200 μl y la concentración de NADPH y la fragmentación de las emulsiones, la detención de las reacciones con 0,5 ml de EDTA (50 mM) y 2 ml de éter dietílico saturado con agua, es como se describe en el Ejemplo 1 cada 0,1 mM. Las reacciones se controlaron espectrofotométricamente a 340 nm. La adición de 1,75 pmoles (1,3 m Unidades) de DHFR de E. coli da lugar a proporciones iniciales de -25,77 mOD/min (en el tampón A) y de -11,24 mOD/min (en el tampón de traducción) por lo que la reacción es un 44% tan eficiente en el tampón de traducción como en un tampón optimizado (tampón A).

Además, la presencia de los sustratos de DHFR (NADPH y H2F) con una concentración de 0,1 mM (solos o combinados) no provoca ninguna inhibición de la producción de DHFR activa a partir de una reacción acoplada de transcripción-traducción durante 2 horas.

Ejemplo 7

La actividad de DHFR sobre un elemento genético que contiene un sustrato del dihidrofolato inmovilizado conduce a la formación de un producto tetrahidrofolato unido al ácido nucleico que codifica DHFR.

Se sintetiza un péptido que comprende tres ácidos glutámicos que se unen mediante sus -carboxilatos (utilizando el éster α-bencílico del ácido N-fluorenilmetoxicarbonil-glutámico como material de partida) con una lisina en el extremo carboxilo y unidos por la biotina a su grupo -amino, modificando procedimientos publicados (Krumdiek et al., 1980). El ácido fólico se une al extremo amino y se eliminan los grupos protectores bencilo y trifluoroacetamídicos mediante hidrólisis alcalina como se ha descrito previamente. El péptido se purifica mediante HPLC de fase inversa y se caracteriza mediante espectroscopía de masas y UV. Este péptido de ácido fólico se reduce químicamente al correspondiente péptido de ácido dihidrofólico (utilizando ditionato y ácido ascórbico) y entonces, al correspondiente péptido de ácido tetrahidrofólico (utilizando borohidruro sódico) aplicando procedimientos publicados (Zakrzewski et al., 1980). Estas transformaciones se caracterizan mediante espectroscopía UV.

Se construye un elemento genético uniendo, por término medio, de dos a tres moléculas del péptido ácido fólico a la avidina (o estreptavidina), conjuntamente con una molécula del ADN amplificado mediante PCR del plásmido pGEM-folA, que codifica la DHFR utilizando los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y LMB3 (véase el Ejemplo 3). El ácido fólico inmovilizado se reduce químicamente a dihidrofolato utilizando ditionato y ácido ascórbico y purificándose mediante diálisis contra el tampón A. La DHFR de E. coli se obtiene mediante inducción IPTG de bacterias que contienen el plásmido pGEM-folA, purificándose por afinidad en una columna de Sepharose-metotrexato. Se muestra que la DHFR de E. coli reacciona con el ácido dihidrofólico inmovilizado en este elemento genético controlando la oxidación de NADPH a NADP espectrofotométricamente utilizando entre 0 y10 μm del péptido de ácido dihidrofólico unido a la avidina y entre 0 y50 μm de NADPH. Por tanto, al final de esta reacción, el producto tetrahidrofolato se une al gen folA que codifica la enzima (es decir, DHFR) que cataliza su formación.

Para el aislamiento de aquellos genes unidos al producto tetrahidrofolato existen dos métodos de abordaje. El primero implica la generación de anticuerpos presentados por fagos, que son específicos para el tetrahidrofolato (Hoogenboom, 1997). La segunda aproximación se basa en la utilización de un reactivo dirigido que reacciona específicamente con el producto inmovilizado, pero no con el sustrato. Se sintetizó una molécula formada por un marcador dinitrofenilo (DNP) unida a benzaldehído por un espacio de 14 átomos. El grupo aldehído reacciona específicamente con el tetrahidrofolato

para formar un aducto covalente (Kallen y Jencks, 1966), pudiéndose llevar a cabo la

purificación por afinidad utilizando un anticuerpo anti-DNP.

Ejemplo 8

Un procedimiento alternativo para seleccionar la actividad DHFR.

La reacción catalizada por DHFR puede seleccionarse mediante un acoplamiento in situ a una segunda reacción, catalizada por la aldehído deshidrogenasa de la levadura, con un sustrato "diana".

En vez de seleccionar los genes conectados a uno de los productos de la reacción DHFR(5,6,7,8-tetrahidrofolato o NADP+), la reacción DHFR se acopla a una segunda reacción. La selección es mediada en este caso por la formación del segundo producto de la reacción catalizada por DHFR, la nicotinamida adenín dinucleótido fosfato (NADP+).

La reacción que hemos escogido para el acoplamiento es catalizada por la aldehído deshidrogenasa de la levadura (YAD; EC 1.2.1.5). Esta enzima utiliza NAD+ ó NADP+ en la oxidación de una amplia gama de aldehídos alifáticos o aromáticos a sus ácidos carboxílicos correspondientes, generando NADH o NADHP en el proceso. La reacción tiene la gran ventaja de ser esencialmente irreversible -particularmente, las deshidrogenasas (incluyendo DHFR y YAD) no catalizan la reducción del ácido al aldehído. Ya que un gran número de enzimas que catalizan reacciones redox general NAD+ ó NADP+, la reacción YAD puede también utilizarse en la selección de estas enzimas, y no se limita solamente a la selección de la Dihidrofolato reductasa.

Un sustrato pentaldehído se sintetiza y une a un marcador DNP (dinitrofenilo), utilizando un engarce C20 (en lo sucesivo, DNP-PA). La oxidación de DNP-PA al ácido correspondiente (DNP-PC) es seguida mediante una HPLC inversa (columna C18 de fase inversa; gradiente de H2O/CH3CN + ácido trifluoroacético al 0,1%; tiempos de retención: DNP-PA, 5,0 minutos; DNP-PC, 4,26 minutos). La conversión de DNP-PA a DNP-PC se observa sólo en presencia de tanto YAD como NADP+. Las reacciones también se siguen espectrofotométricamente; el aumento de absorbencia a 340 nm indicó que el NADP+ se convierte simultáneamente a NADPH.

La reacción acoplada DHFR-YAD se sigue utilizando el mismo ensayo HPLC. La mezcla reactiva inicial contenía los sustratos para DHFR-NADPH (50 μm) y 7-8dihidrofolato (H2F; 50 μm), YAD (Sigma, 0,5 unidades) y DNP-PA (50 μm) en tampón pH 7,7 (100 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol y 25 mM KCl). La conversión de DNP-PA a DNP-PC se observa cuando se añade DHFR a la mezcla reactiva anterior (DHFR 5 nM, 83%, 1,25 nM, 14,5% después de 32 minutos).

La concentración de DHFR obtenida en la traducción in vitro compartimentalizada es, de hecho, mucho más alta que 5 nM (véase el Ejemplo 4). La conversión de DNP-PA a DNP-PC es despreciable en ausencia de DHFR, o cuando el metotrexato (MTX) -un potente inhibidor de la enzima- está presente (10 μm). Por tanto, la formación del producto secundario, DNP-PC, está por tanto unida a la presencia de DHFR.

Utilizando esta reacción acoplada, las proteínas que confieren actividad DHFR

pueden seleccionarse por: i) uniendo los genes a anticuerpos que específicamente se unen al producto carboxílico de DNP-PA, y ii), aislando estos genes mediante purificación por afinidad, utilizando un anticuerpo anti-DNP.

Este planteamiento se demuestra mediante un inmunoensayo rutinario basado en el catELISA (Tawfik et al., 1993). Placas de microtitulación se revistieron con inmunoglobulinas anti-conejo (Sigma, 10 μg/pocillo), seguido por suero policlonal de conejo que une específicamente a los derivados del ácido glutárico (Tawfik et al., 1993), diluído 1:500 en tampón de solución salina fosfato + 1 mg/ml BSA). Las placas se enjuagaron y se bloquearon con BSA. Las mezclas de la reacción acoplada descritas anteriormente se diluyeron en tampón Tris/BSA (50 mM Tris, 150 mM cloruro sódico, 10 mg/ml BSA, pH 7,4) y se incubaron durante 1 hora. La placa se enjuagó y un anticuerpo anti-DNP (SPE21.11 monoclonal de ratón) que se diluyó en el mismo tampón (1:10.000) se añadió e incubó durante una hora. La placa se enjuagó y se añadió un anticuerpo anti ratón (Jackson) marcado con peroxidasa, seguido por un sustrato peroxidásico (BM Blue; Boehringer Mannheim). Se observó sólo una señal específica en las muestras de las reacciones acopladas que contenían DHFR (además de H2F, NADPH, YAD y DNP-PA).

Para la selección en dos formatos, se utilizaron anticuerpos anti-ácido carboxílico altamente específicos (Tawfik et al., 1993).

En el primero, el anticuerpo anti-ácido carboxílico se acopló químicamente a una avidina de alto peso molecular (o estreptavidina) que contenía el complejo de la forma descrita en el Ejemplo 5. El ADN biotinilado que codifica DHFR se une a este complejo mediante la interacción avidina-biotina, tal como se describe en el Ejemplo 5. Este complejo se utilizó entonces en un sistema de transcripción/traducción acoplado compartimentalizado, que también contiene YAD y un sustrato YAD diana tal como DNPPA. Si existe actividad DHFR en el compartimento, el DNP-PA se convierte a DNP-PC. Los anticuerpos anti-ácido carboxílico, acoplados al ADN mediante el complejo de alto peso molecular, capturarán sólo las moléculas DNP-PC y no las moléculas de aldehído. El ADN de estos compartimentos que contiene DHFR activo (y por tanto que codifica DHFR activo si existe sólo una molécula de ADN por compartimento), se purifican entonces por afinidad utilizando anticuerpos anti-DNP.

En el segundo formato, múltiples moléculas de estreptavidina se conjugan conjuntamente en un complejo de peso molecular alto que puede fácilmente acoplarse al ADN biotinilado que codifica DHFR (véase el Ejemplo 5). Este complejo se utiliza en un sistema de transcripción/traducción acoplado compartimentalizado que contiene también YAD y un sustrato YAD tal como MeNPOC-biotin-benzaldehído. El grupo biotina en MeNPOC-biotin-benzaldhído se "enjaula" (Sundberg et al., 1995; Pirrung y Huang, 1996), es decir, no puede unirse mediante la avidina o la estreptavidina hasta que un grupo nitrobencilo fotoeliminable se haya separado mediante irradiación con luz. Si existe actividad DHFR en el compartimento, el MeNPOC-biotin-benzaldehído se convierte a MeNPOC-biotin-ácido benzoico. Después de que la reacción compartimentalizada haya tenido lugar durante un tiempo, la reacción es irradiada con luz, eliminándose el grupo nitrobencilo y uniéndose el compuesto al complejo estreptavidina-ADN. El ADN en estos compartimentos que contienen DHFR (y por tanto que codifica DHFR activo si sólo existe una molécula de ADN por compartimento), forma complejo con la biotina-ácido benzoico

(en vez de la biotina-benzaldehído) y puede ser purificado por afinidad utilizando

anticuerpos anti-ácido benzoico inmovilizados.

La presencia de otras enzimas que pueden catalizar la oxidación NAD+ o NADP+ a NADH o NADPH en el sistema de transcripción/traducción in vitro, puede, bajo ciertas circunstancias, dificultar la utilización de este sistema YAD para realizar la selección directamente en el sistema de transcripción/traducción in vitro compartimentalizado. En este caso, la selección se lleva a cabo utilizando el sistema de compartimentalización de dos etapas que se describió anteriormente. Es decir, DHFR se traslada primero a compartimentos y entonces se une al ADN en el mismo compartimento mediante un marcador de afinidad apropiado. La emulsión se fragmenta, el contenido de los compartimentos se une y el ADN se purifica por afinidad fuera de otros componentes del sistema de transcripción/traducción (que incluye óxido reductasas contaminantes), utilizando anticuerpos específicos para una digoxigenina "marcador" que se une a un extremo de la molécula del ADN. Las moléculas del ADN purificado, conjuntamente con la proteína DHFR unida, se disponen entonces en una mezcla reactiva que contiene los sustratos para DHFR-NADPH (50 μm) y 7-8-dihidrofolato (H2F; 50 μm), YAD (Sigma, 0,5 unidades) y DNP-PA (50 μm) en tampón de pH 7,7 (100 mM imidazol, 5 mM β-mercaptoetanol y 25 mM KCl), volviéndose a compartimentalizar la reacción mediante emulsificación para dar lugar sólo a una, y como mucho, a algunas, moléculas de ADN por compartimento. Loa anticuerpos anti-ácido carboxílico (Tawfik et al., 1993), se utilizan para la selección en cualquiera de los dos formatos descritos anteriormente.

Ejemplo 9

Metilación de elementos genéticos mediante productos génicos.

Las ADN metiltransferasas, producidas mediante transcripción/traducción in vitro en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite, metilan las moléculas de ADN que las codifican en los compartimentos.

La selección de proteínas con actividades de unión o catalíticas que utilizan el sistema de compartimentalización descrito en la presente memoria, presenta dos requerimientos básicos: i) una molécula única de ADN (o como mucho, algunas) que codifica las proteínas que van a seleccionarse, se expresa en una forma biológicamente activa mediante un sistema de transcripción/traducción acoplado en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite; y ii) la proteína que va a seleccionarse debe ser capaz de modificar el elemento genético que la codificó, de tal forma que lo convierta en seleccionable en una etapa subsiguiente. En este Ejemplo, se describen un grupo de proteínas -ADN metiltransferasas (tipo II)-, que son producidas eficientemente en los compartimentos acuosos de un sistema de emulsión acuosa en aceite, utilizando un sistema de transcripción/traducción acoplado. Además, las ADN metiltransferasas traducidas in vitro modifican eficientemente las moléculas de ADN que las codifican in situ en los compartimentos acuosos, de forma que pueden seleccionarse y amplificarse. Los sitios diana en las moléculas de ADN son modificados mediante metilación de una citosina en posición C5 que vuelve resistentes a los sitios a la fragmentación mediante la endonucleasa de restricción afín (es decir, HhaI para M.HhaI, y HaeIII para M.HaeIII). Por tanto, el ADN metilado es seleccionable respecto al ADN no metilado en virtud de su resistencia a la fragmentación mediante la endonucleasa de restricción.

El gen que codifica M.HhaI es amplificado mediante PCR utilizando los oligonucleótidos HhaI-Fo2S y HhaI-Bv directamente a partir de Haemophilus parahaemolyticus (ATCC 10014). El gen que codifica M.HaeIII es amplificado mediante PCR utilizando los oligonucleótidos HaeIII-Fo2s y HaeIII-Bc (SEC. ID. nº 4) directamente a partir de Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC 11116). Ambos grupos PCR se clonan en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y KpnI, por debajo del promotor lac y del promotor de la T7 ARN polimerasa. Los oligonucleótidos HhaI-Bc y HaeIII-Bc (SEC. ID. nº 4) añaden el sitio eficiente de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7 por encima del codon de iniciación del gen de la metiltransferasa. El oligonucleótido HhaI-Fo añade un sitio HhaI de metilación/restricción (M/R) y un sitio HaeIII (/NotI) para funcionar como sustratos para M.HhaI y M.HaeIII respectivamente. El oligonucleótido HaeIII-Fo añade un sitio M/R NotI/HaeIII que funciona como un sustrato para M.HaeIII (el gen M.HaeIII contiene ya dos sitios M/R internos HhaI. La secuenciación del ADN identifica clones con la secuencia nucleótida correcta.

Los plásmidos pGEM-M.HhaI y pGEM-M.HaeIII descritos anteriormente son amplificados mediante PCR utilizando los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) como anteriormente, para crear, bien DIG-M.HhaI-Biotina de 1167 pares de bases o un fragmento DIG-M.HaeIII-Biotina ADN de 1171 pares de bases, marcados en un extremo por la biotina y el otro extremo por la digoxigenina, y los cuales transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios M/R de HaeIII y HhaI. Cada fragmento PCR se purificó directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).

Los genes requeridos para la transcripción -traducción in vitro acoplada de M.EcoRI y M.EcoRV son amplificados mediante PCR utilizando los plásmidos pMB1 (Betlach et al., 1976) y pLB1 (Bougueleret et al., 1984) respectivamente, como matrices, un iniciador posterior que añade el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7 y LMB3 por encima del sitio de unión ribosómico del gen de la metiltransferasa (EcoRI-Bc ó EcoRV-Bc), y un iniciador posterior (EcoRI-Fo ó EcoRV-Fo) que añade LMB2. Estos fragmentos se amplificaron posteriormente mediante PCR utilizando los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) tal como se describieron anteriormente para crear los fragmentos DIG-M.Eco RI-Biotina y DIG-M.EcoRV-Biotin ADN, que transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios M/R de EcoRI y EcoRV.Cada fragmento PCR se purificó directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega).

Los genes de ADN-metilasas amplificados mediante PCR anteriormente descritos se expresan en un sistema de transcripción/traducción procariótico acoplado in vitro diseñado para matrices lineales (Lesley et al., 1991). Se utiliza una preparación comercial de este sistema (Sistema de extracto S30 de E. coli para Matrices Lineales; Promega), suplementado con T7 ARN polimerasa y S-adenosil metionina (SAM) a una concentración de 80 μm.

La metilación se ensayó midiendo la resistencia de los fragmentos de ADN marcados con DIG y biotina a la fragmentación mediante la enzima de restricción similar, utilizando DIG-Biotin ELISA de Boehringer-Mannheim o con fragmentos de ADN marcados radioactivamente y perlas magnéticas revestidas con streptavidina. Las mezclas reactivas in vitro que contenían fragmentos marcados con DIG-Biotin reaccionaron in situ mediante la transcripción-traducción in vitro acoplada, y tal como se describe seguidamente, se diluyeron en tampón 1xW&B (1 M NaCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4) + Tween-20 al 0,1% (la concentración del ADN marcado con DIG-Biotina en el ensayo es del orden de 0 a 250 pM), incubándose en placas de microtitulación revestidas con streptavidina (alta capacidad) durante 30 a 60 minutos. La placa se enjuagó (3 veces 2 x W&B) y finalmente con 50 mM Tris pH 7,4 + 5 mM MgCl2), añadiéndose las enzimas de restricción (NEB) (10 a 50 unidades enzimáticas en 0,2 ml del tampón correspondiente), incubándose a 37ºC durante 3 a 12 horas. La placa se enjuagó y se añadieron anticuerpos anti-DIG unidos a la peroxidasa (diluídos 1:1500 en PBS + Tween-20 al 0,1% + 2 mg/ml de BSA) durante 40 a 60 minutos, seguido por el sustrato de peroxidasa (Azul BM; 70 μl/pocillo). La absorbencia (a 450 menos 650 nm) se mide después de extinguir con 0,5 M H2SO4 (130 μl/pocillo).

Para el ensayo radioactivo, los plásmidos y los fragmentos PCR descritos anteriormente, se amplificaron mediante PCR utilizando los iniciadores LMB2-Biotin (SEC. ID. nº 9) y LMB3 y α-P32-CTP para dar lugar a fragmentos de ADN marcado con P32 marcados en un extremo por la biotina y que transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, el gen de la metiltransferasa y los sitios pertinentes M/R. Estos fragmentos PCR se purificaron directamente utilizando Wizard PCR Preps (Promega). Las mezclas reactivas que contenían el ADN marcado con P32 -Biotina reaccionaron in situ mediante transcripción-traducción acoplada in vitro, se diluyeron en tampón 1xW&B + Tween-20 al 0,1%, y se incubaron con perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal, M-280; 1 a 5 x 106 perlas) durante 30a a60 minutos. Las perlas se separaron y enjuagaron (3 veces 2xW&B + Tween-20 al 0,1% + BSA al 3% y finalmente con 50 mM de Tris pH 7,4 + 5 mM MgCl2). Se añadieron las enzimas de restricción (NEB) (10 a 50 unidades enzimáticas en 50 a 150 μl del tampón correspondiente), incubándose a 37ºC durante 5 a 20 horas. Se eliminó el sobrenadante y las perlas se enjuagaron y se volvieron a suspender en 100 μl de agua. La cantidad de ADN marcado radioactivamente en las perlas, y en los sobrenadantes se determina mediante centelleo.

La totalidad de las cuatro metilasas descritas en la presente memoria -M.HaeIII, M.HhaI, M.EcoRI y M.EcoRV-se expresan y activan en la transcripción/traducción acoplada in vitro. Además, la metilasa traducida in vitro puede metilar su propio gen, haciéndolo de esta forma resistente a la fragmentación por la metilasa similar (autometilación). Ambos procesos, la transcripción-traducción acoplada in vitro del gen de la metilasa, así como su metilación, se llevaron a cabo eficientemente en la misma mezcla reactiva. Más específicamente, fragmentos de ADN (con concentraciones de 0,5 a 10 nM) que transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, un gen de la metiltransferasa y los sitios M/R de las cuatro metilasas, se volvieron resistentes a la fragmentación por la endonucleasa de restricción similar. Por ejemplo, el fragmento de ADN que codifica la M.EcoRI metiltransferasa se vuelve resistente a la fragmentación por EcoRI (75 a 100% después de 20 a 90 minutos a 25ºC) cuando se incubó con el Sistema del Extracto S30 de E. coli para las Matrices Lineales (Promega), SAM (80 μm) y T7 ARN polimerasa. La resistencia a la fragmentación como resultado de la metilación es selectiva y específica: bajo las mismas condiciones, la resistencia a la fragmentación por HhaI ó M.EcoRV no se observa; además, la resistencia a la fragmentación por EcoRI no se observa cuando la traducción es inhibida (por ejemplo, en presencia de puromicina o en ausencia de la T7 ARN polimerasa). Resultados similares se obtuvieron cuando mediante DIG-Biotin ELISA se ensayó la supervivencia de los genes, o con fragmentos de ADN-P32 -Biotina, tal como se ha descrito anteriormente. La metilación in trans, es decir, de fragmentos de ADN (distintos a los que codifican la metilasa similar) que se añaden a los sitios M/R, se observa también en el sistema de transcripción-traducción acoplado in vitro S30 de E. coli en presencia de un gen que codifica una metilasa.

Ambos procesos, la transcripción-traducción acoplada in vitro de los genes de la metilasa, así como su auto-metilación, tuvieron lugar eficientemente en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite. Más específicamente, los fragmentos de ADN (a concentraciones de 0,1 a 10 nM), que transportan el promotor de la T7 ARN polimerasa, el sitio de iniciación traduccional 10 del gen del fago T7, el gen de la metiltransferasa (por ejemplo, M.HhaI) y los sitios M/R de HaeIII, HhaI y EcoRI se añaden al Sistema del Extracto S30 de E. coli para las Matrices Lineales (Promega), en presencia de SAM (80 μm) y T7 ARN polimerasa. Las mezclas reactivas enfriadas con hielo se emulsificaron homogeneizando durante 1 minuto con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 20000 r.p.m., tal como se describe en el Ejemplo 1, incubándose a 25º a 30ºC durante 0 a 180 minutos. La reacción se detiene y la fase acuosa se separa (véase, Ejemplo 1) y la metilación de los fragmentos de ADN marcados con P32 -Biotina o DIG-Biotina se ensaya tal como se describió anteriormente. La metilación de hasta el 20% de los genes compartimentalizados para llevar a cabo la fragmentación mediante HhaI, se observa después de 60 a 180 minutos de incubación. No se observa resistencia cuando la emulsión enfriada en hielo se fragmenta justamente después de haberla confeccionado, y la reacción se extingue mediante extracción con éter ("0 minutos"). La metilación es selectiva; bajo las mismas condiciones, la resistencia a la fragmentación por HaeIII o EcoRI no se observa. Además, el ensayo de los fragmentos del ADN marcado con P32, ha mostrado que la auto-metilación de tanto M.HaeIII como M.HhaI continuó a concentraciones de genes que corresponden a un promedio de menos de un gen por compartimento (0,1 a 0,5 nM; véase el Ejemplo 4). Así, la transcripción-traducción acoplada in vitro de los genes de las metilasas, así como de su auto-metilación, continuó eficientemente incluso cuando sólo un único elemento genético se encuentra en los compartimentos acuosos de la emulsión de agua en aceite.

La actividad metilasa de HaeIII procedente de la transcripción-traducción acoplada de los genes M.HAeIII también se mide en las microcápsulas más voluminosas producidas agitando solo, y mediante agitación seguida por ulterior homogeneización con un dispersor Ultra-Turrax T25 a 8.000 r.p.m., 9.000 r.p.m., ó 13.500 r.p.m., durante 1 minuto, tal como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se presentan en la Figura 2b. La concentración de los genes M.HaeIII utilizada (2,5 nM) da lugar a un promedio de 1, 1,5 y 4,8 elementos genéticos por gotita en las emulsiones homogeneizadas a 13.500 r.p.m.,

9.500 y 8.000 r.p.m., respectivamente, y un promedio de 14 elementos genéticos por gotita en la emulsión preparada mediante sólo agitación. La adición de un surfactante aniónicopor ejemplo, desoxicolato sódico, típicamente al 0,5% (peso/vol), a la mezcla de traducción in vitro, aumenta significativamente el porcentaje de elementos genéticos metilados en las emulsiones.

Ejemplo 10

Elementos genéticos que codifican ADN metiltransferasas pueden seleccionarse y amplificarse siguiendo su auto-metilación en los compartimentos acuosos de una emulsión de agua en aceite.

La metilación de genes que codifican las ADN metilasas les permite ser aislados y amplificados en una etapa subsiguiente. El ADN metilado es seleccionable respecto al ADN no metilado en virtud de su resistencia a la fragmentación mediante las endonucleasas de restricción. Así, los elementos genéticos que permanecen intactos después del tratamiento con la enzima similar de restricción, pueden ser amplificados mediante PCR. Sin embargo, dicha selección no puede alcanzarse obviamente si otros genes que contienen el mismo sitio R/M pero no codifican la metilasa, se encuentran en la misma mezcla reactiva. Esto es así debido a que la metilación cruzada de los genes no metilasa (que se encuentran en un exceso abundante) les hará resistentes a la fragmentación por la enzima similar de restricción y, por tanto, amplificables mediante PCR. Bajo estas condiciones, la selección de genes que codifican la metilasa se hará posible sólo si ellos están compartimentalizados - particularmente, si sólo uno, o algunos genes se encuentran en un único compartimento de forma que la auto metilación sea el proceso más importante en ese compartimento. La metilación cruzada se evita desde que los genes no metilasa que se encuentran en compartimentos que no contienen un gen metilasa, permanezcan no metilados.

Los genes utilizados en el experimento son un fragmento M. HaeIII de 1194 pares de bases (DIG-M.HaeIII-3s-Biotina) que codifica la HaeIII metilasa y un fragmento folA de 681 pares de bases (DIG-folA-3s-Biotina) que codifica la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) que contiene sitios de restricción/modificación adicionales HaeIII y HhaI (véase la Fig 1b). Ambos fragmentos de ADN están marcados en un extremo con digoxigenina (DIG) y en el otro con biotina, y contienen un promotor de la T7 ARN polimerasa (Promotor T7) y un sitio de iniciación traduccional 10 del gen T7 (rbs) para la expresión in vitro.

pGEM-4Z-3s se crea hibridizando los oligonucleótidos HaeHha-Pl y HaeHha-Mi (SEC.ID. nº2) (Tabla 1) y uniéndolos a HindIII y a pGEM-4Z cortado por EcoRI (Promega). El gen M.HaeIII se amplifica mediante PCR a partir de Haemophilus influenzae (biogrupo aegyptius) (ATCC 11116) utilizando los oligonucleótidos HaeIII-FoNC (SEC. ID. nº 3) y HaeIII-Bc (SEC. ID. nº 4) (Tabla 1). El gen folA es amplificado a partir de Escherichia coli utilizando los iniciadores EDHFR-Fo (SEC. ID. nº 5) y EDHFR-Ba (SEC. ID. nº 6) (Tabla 1). Ambos genes amplificados son digeridos con HindIII y KpnI y son clonados en pGEM-4Z3s, creando los vectores de expresión pGEM-HaeIII-3s y pGEM-folA-3s. DIG-M.HaeIII-3sBiotina y DIG-folA-3s-Biotina (véase la Fig 1b) se amplificaron a partir de estos vectores mediante PCR con la polimerasa Pfu, utilizando los iniciadores LMB2-Biotina (SEC. ID. nº 9) y LMB3-DIG (SEC. ID. nº 10) (20 ciclos) y purificándose utilizando Wizard PCR Preps (Promega). DIG-D1.3-Biotina, un fragmento de ADN de 942 pares de bases que contiene cuatro sitios R/M HaeIII, utilizado como un sustrato para ensayar la actividad de la HaeIII metilasa, se amplificó a partir de un derivado pUC19 que contenía un gen Fv de cadena única D1.3 (McCafferty et al., 1990) como anteriormente. Un ADN transportador de 558 pares de bases (ADN transportador g3; un fragmento interno del gen III del fago fd que no tiene promotor T7, sitios R/M HaeIII o HhaI) se amplificó mediante PCR con Taq polimerasa de pHEN1 ADN (Hoogenboom et al., 1991) utilizando los iniciadores G3FRAGFo (SEC. ID. nº 11) y G3FRAG-Ba (SEC. ID. nº 12) (Tabla 1) y se purificó mediante extracción fenol-clorofórmica y precipitación etanólica. Este ADN (a  10 nM) se utilizó como un transportador en dilución de todo el ADN utilizado para las reacciones en este ejemplo.

La figura 3 demuestra la selección de los genes M.HaeIII que codifican la ADN metilasa HaeIII a partir de un exceso de los genes folA (que codifican DHFR que no metila al ADN). Ambos genes tienen las mismas secuencias HaeIII R/M añadidas para actuar como un sustrato (Fig 1b). Después de traducción en los compartimentos acuosos de una emulsión, las secuencias HaeIII R/M unidas a los genes de la metilasa, son metiladas. Estos genes se convierten en resistentes a la fragmentación por la endonucleasa HaeIII y son amplificados subsiguientemente mediante PCR. Los genes folA, que se encuentran en otros compartimentos, permanecen sin metilar, son fragmentados y no se amplifican. Los productos PCR son analizados mediante electroforesis en gel de agarosa en la que el enriquecimiento para los genes M.HaeIII puede visualizarse por la aparición de una banda de 1194 pares de bases (Fig 3).

Se utiliza el sistema de extracto S30 de E. coli para el ADN lineal (Promega), se suplementa con el ADN transportador g3 (10 nM), fragmentos de ADN (DIG-M.HaeIII-3sBiotina y DIG-M.folA-3s- Biotina) con proporciones y concentraciones que se indican más adelante), T7 ARN polimerasa (104 unidades), desoxicolato sódico (Fluka, 0,5% peso/vol; sólo en reacciones emulsificadas) y S-adenosil metionina (NEB, 80 μm). Las reacciones se fijaron utilizando fragmentos de ADN DIG-M.HaeIII-3s-Biotina y DIG-M.folA-3s-Biotina con una proporción de 1:103 y una concentración total de 200 pM (Fig 3a) y proporciones de

1:104 a 1:107 y una concentración total de 500 pM (Fig 3b). Se prepararon reacciones de 50 microlitros sobre hielo y se emulsificaron mediante agitación sólo tal como se describe en el Ejemplo 1. Las reacciones se incubaron durante 2 horas a 25ºC. Para recuperar las mezclas reactivas, las emulsiones se hicieron rotar a 3.000 g durante 5 minutos y se eliminó la fase oleosa, abandonando la emulsión concentrada en el fondo del vial. Se añadieron tampón de extinción (0,2 ml de 25 μg/ml de ARN de levadura en tampón W +B: 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,4) y 2 ml de éter saturado con agua, y la mezcla se agitó vorticialmente, se centrifugó brevemente y se eliminó la fase etérea. La fase acuosa se lavó con éter y se secó (5 minutos en un Speedvac a temperatura ambiente). Se capturó el ADN sobre Dynabeads M-280 de 100 μg de streptavidina (2 horas a temperatura ambiente). Las Dynabeads se lavaron secuencialmente con: tampón W + B; 2,25 M Guanidina-HCl, 25 mM de Tris-HCl, pH 7,4; tampón W +B; y dos veces con tampón de restricción. Las perlas se volvieron a suspender en 100 μl de tampón de restricción que contenía 10 unidades HaeIII (o HhaI) y se incubaron a 37ºC durante 5 horas. Las perlas se lavaron tres veces con tampón W + B, dos veces con 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, Triton X-100 al 0,1%, pH 9,0, y entonces se volvieron a suspender en 100 μl del mismo tampón suplementado con 1,5 mM MgCl2 (tampón PCR). Se amplificaron mediante PCR alícuotas de las perlas (2 a 20 μl) utilizando Taq polimerasa añadida a 94ºC con los iniciadores LMB2-Biotina y LMB3-DIG(reacciones de 50 μl, 32 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC, 2 minutos a 72ºC). Este ADN se purificó utilizando Wizard PCR Preps y se utilizó para la segunda serie de selección (20 pM en las selecciones 1:104 y

1:105 y 500 pM en las selecciones 1:106 y 1:107). Para la electroforesis en gel y los ensayos de actividad, este ADN (diluído a 1 pM aproximadamente) se amplificó ulteriormente con los iniciadores LMB2-Nest y LMB3-Nest, los cuales se hibridizan inmediatamente en el interior de LMB2 y LMB3 respectivamente (25 ciclos de 1 minuto a 94º, 1 minuto a 50º, 1,5 minutos a 72º), purificándose como anteriormente. Este ADN (con 10 nM), el cual no se añade a DIG ni a la Biotina, también se traduce in vitro en presencia de 10 nM de DIG-D1.3-Biotina, un ADN de 942 pares de bases que contiene cuatro sitios R/M HaeIII. La metilación del sustrato DIG-D1.3-Biotina se determina mediante el DIG-Biotin ELISA como en el Ejemplo 9.

Una única serie de selección de una proporción 1:1000 de los genes M.HaeIII:folA en la emulsión, da lugar a una proporción génica final aproximada de 1:1 (Fig 3a). Varios experimentos de control indican que la selección obra según el mecanismo descrito anteriormente: una banda que corresponde al gen M.HaeIII no se observa cuando la mezcla inicial de genes es amplificada mediante PCR; ni después de la reacción en solución (no emulsificada); ni cuando se produce la emulsificación en ausencia de la transcripción/traducción (cuando la T7 ARN polimerasa se omite); ni cuando los genes reaccionantes son fragmentados en sitios R/M que son distintos a los de HaeIII -por ejemplo, después de la digestión con HhaI. El rendimiento de M.HaeIII ADN después de la selección es menor que el 100%, debido principalmente a la digestión incompleta por HaeIII, mas que a la metilación cruzada, tal como se indica por la gran banda folA observada en ausencia de actividad metilásica (cuando la T7 polimerasa no se añade. Durante la digestión, la concentración del ADN disminuye por debajo de la KM de HaeIII (6 nM) y la digestión se vuelve extremadamente ineficaz.

Una banda que corresponde a los genes M. HaeIII se vuelve también visible después de una única serie de selección que empieza a partir de proporciones M.HaeIII: folA de 1:104 a 1:105 (Fig 3b), pero no a proporciones inferiores, indicando un factor de enriquecimiento de por lo menos 5000 veces. La selección de un pequeño número de genes a partir de un amplio conjunto (por ejemplo, una genoteca), requiere por tanto ulteriores series de selección. Cuando el ADN digerido por HaeIII y amplificado a partir de la primera serie de selección, se somete a una segunda serie de selección, una banda que corresponde a los genes M.HaeIII también se vuelve visible a partir de proporciones iniciales 1:106 y 1:107 de M.HaeIII:folA. Una segunda serie de selección también se lleva a cabo sobre el ADN derivado de las proporciones iniciales 1:104 a 1:105 de M.HaeII:folA. Esto da lugar a un enriquecimiento posterior, hasta una proporción de aproximadamente

3:1 a favor de los genes M. HaeIII. Antes y después de cada serie de selección, los genes se amplifican, se traducen in vitro y reaccionan con un sustrato separado de ADN, para ensayar la actividad HaeIII metilasa. Estos ensayos indican que el enriquecimiento para los genes M.HaeIII, tal como se observa mediante electroforesis en gel, da lugar a un aumento paralelo en la actividad metilásica de HaeIII (Fig 3b).

imagen1

imagen1

imagen1

LISTA DE REFERENCIAS

Anderson, C.W., Straus, J.W. y Dudock, B. S. (1983) Methods Enzymol, 101, 635-44. Anderson, J.E. (1993) Curr. Op. Struct. Biol., 3, 24-30. Ash, M. y Ash, I. (1993) Handbook of industrial surfactants. Gower, Aldershot. Baccanari, D.P., Averett, D., Briggs, C. y Burchall, J. (1977) Biochemistry, 16, 3566-72. Barany, F. (1991) PCR Methods Applic., 1 , 5-16. Bass, S., Greene, R. y Wells, J.A. (1990) Proteins, 8, 309-14. Becher, P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York. Benita, S., Ed. (1996). Microencapsulation: methods and industrial applications. Drugs and

pharmaceutical sciences. Edited by Swarbrick, J. New York: Marcel Dekker. Benner, S.A. (1994) Trends Biotechnol, 12, 158-63. Berman, J., Eisenberg, S. y Tye, B.K. (1987) Methods Enzymol, 155, 528-37 Betlach, L., Hershfield, V., Chow, L., Brown, W., Goodman, H. M. y Boyer, H. W. (1976). A

restriction endonuclease analysis of the bacterial plasmid controlling the EcoRl restriction and modification of DNA. Federation Proceedings 35, 2037-2043.

Blattner, F.R. y Dahlberg, J.E. (1972) Nature New Biol, 237, 227-32. Bougueleret, L., Schwarzstein, M, Tsugita, A. y Zabeau, M. (1984). Characterization of the genes coding for the Eco RV restriction and modification system of Escherichia coli.

Nucleic Acids Res 12(8), 3659-76.

Bru, R. y Walde, P. (1991). Product inhibition of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. Eur J Biochem 199(1), 95-103. Bru, R. y Walde, P. (1993). Catalytic activity of elastase in reverse micelles. Biochem Mol

Biol Int 31(4), 685-92. Cahill, P, Foster, K. y Mahan, D. E. (1991) Clin Chem, 37, 1482-5. Chakrabarti, A. C., Breaker, R. R., Joyce, G. F. y Deamer, D. W. (1994). Production of RNA

by a polymerase protein encapsulated within phospholipid vesicles. J Mol Evol 39(6), 555

9. Chamberlin, M. y Ring, J. (1973) J Biol Chem. 248, 2235-2244 Chang, T. M. (1987). Recycling of NAD(P) by multienzyme systems immobilized by

microencapsulation in artificial cells. Methods Enzymol 136(67), 67-82.

Chang, T. M. S. (1992). Recent advances in artificial cells based on microencapsulation. En Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharmacy (Donbrow, M, ed.), pp. 323-339. CRC Press, Boca Raton, Florida.

Chapman, K.B. y Szostak, J.W. (1994) Curr. op. Struct. Biol., 4, 618-622. Chetverin, A.B. y Spirin, A.S. (1995) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 51, 225-70. Clackson, T. y Wells, J.A. (1994) Trends Biotechnol, 12, 173-84. Creagh, A. L., Prausnitz, J. M. y Blanch, H. W. (1993). Structural and catalytic properties of

enzymes in reverse micelles. Enzyme Microb Technol 15(5), 383-92. Cull, M.G., Miller, J.F. y Schatz, P.J. (1992) Proc Natl Acad Sci USA, 89, 1865-9. Dickinson, E. (1994) In Wedlock, D.J. (ed.), Emulsions and droplet size control.

Butterworth-Heine-mann, Oxford, Vol. pp. 191-257. Ellington, A.D. y Szostak, J.W. (1990) Nature, 346, 81822. Ellman, J., Mendel, D., Anthony, C.S., Noren, C.J. y Schultz, P.G. (1991) Methods

Enzymol, 202, 301-36. Fahy, E., Kwoh, D.Y. y Gingeras, T.R. (1991) PCR Methods Appl, 1 , 25-33. Fields, S. y Song, O. (1989) A novel genetic system to detect protein-protein interactions.

Nature 340, 245-6. Finch, C. A. (1993). Encapsulation and controlled release. Spec. Publ.-R. Soc. Chem. 138, 35

Fisch, I., Kontermann, R.E., Finnern, R., Hartley, O., Soler, G.A., Griffiths, A.D. y Winter, G. (1996) Proc Natl Acad Sci USA, 93, 7761-6.

Freese, E. (1959) J. Mol. Biol., 1, 87. Friedberg, E.C., Walker, G.C. y Siede, W. (1995) DNA repair and mutagenesis. ASM Press, Washington D.C.

Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. y Yarus, M. (1995) Annu Rev Biochem, 64, 763-97. Green, R. y Szostak, J.W. (1992) Science, 258, 1910-5. Gregoriadis, G. (1976) Methods Enzymol, 44, 21 8-27. Griffiths, A.D., Williams, S.C., Hartley, O., Tomlinson, I. M., Waterhouse, P., Crosby, W. L.,

Kontermann, R. E., Jones, P.T., Low, N.M., Allison, T.J. and et al.,(1994) Embo J, 13, 3245-60.

Haber, J., Maslakiewicz, P, Rodakiewicz, N. J. y Walde, P. (1993). Activity and spectroscopic properties of bovine liver catalase in sodium bis(2ethylhexyl)sulfosuccinate/isooctane reverse micelles. Eur J Biochem 217(2), 567-73.

Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate techniques. Academic Press, San Diego

Hochuli, E., Dobeli, H. y Schacher, A. (1987) J Chromatogr, 411, 177-84.

Hoogenboom, H.R., et al., (1991) Nucl. Acids Res., 91, 4133-4137.

Hoogenboom, H. R. (1997). Designing and optimizing library selection strategies for

generating high-affinity antibodies. Trends Biotechnol. 15, 62-70. Hoogenboom, H.R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62-70. Janda, K.D., Lo, L.-C., Lo, C.-H.L., Sim, M, -M, Wang, R., Wong, C.-H. y Lerner, R.A.

(1997) Science, 275, 945-948.

Johannsson, A. (1991) In Price, C.P. y Newman, D.J. (ed.), Heterogeneous enzyme immunoassays. Stockton Press, New York, Vol. pp. 295-325. Johannsson, A. y Bates, D.L. (1988) In Kemeny, D.M. y Challacombe, S.i. (ed.) ,

Amplification by second enzymes. John Wiley, Chichester, Vol. pp. 85-106. Joyce, G. F. (1994) Curr. op. Structural Biol., 4, 331-336. Kadir, F.H. y Moore, G.R. (1990) Febs Lett, 276, 81-4. Kallen, R. G. y Jencks, W. P. (1966). The mechanism of the condensation of formaldehyde

with tetrahydrofolic acid. J. Biol. Chem. 241, 5851-5863. Katanaev, V.L., Kurnasov, O.V. y Spirin, A.S. (1995) Febs Lett, 359, 89-92. Keij, J.F., Groenewegen, A.C. y Visser, J.W.M. (1994) High-speed photodamage cell

sorting: An evaluation of the ZAPPER prototype. Methods in cell biology 42, 371-358. Klug, A. (1995) Ann N Y Acad Sci, 758, 143-60 Klug, A. y Schwabe, J.W. (1995) Faseb T, 9, 597-604. Kolb, V.A., Makeyev, E.V., Kommer, A. y Spirin, A.S.(1995) Biochem Cell Biol, 73, 1217

20.

Kowalczykowski, S.C., Dixon, D.A., Eggleston, A.K. Lauder,S.D. y Rehrauer, W.M. (1994) Microbiol Rev, 58, 401-65. Krumdiek, C.L. y Baugh, C.M. (1980) Solid-phase synthesis of pteroylpolyglutamates.

Methods Enzymol. pp. 524-529 Kumar, A., Kumar, A. y Katiyar, S. S. (1989). Activity and kinetic characteristics of

glutathione reductase in vitro in reverse micellar waterpool. Biochim Biophys Acta 996(1-2), 1-6.

Landegren, U, Kaiser, R., Sanders, J. y Hood, L. (1988) Science, 241, 1077-80. Lesley, S. A., Brow, M. A. y Burgess, R. R. (1991). Use of in vitro protein synthesis from polymerase chain reaction-generated templates to study interaction of Escherichia coli transcription factors with core RNA polymerase and for epitope mapping of monoclonal antibodies. J Biol Chem 266(4), 2632-8.

Lesley, S.A. (1995) Methods Mol Biol, 37, 265-78. Lesley, S.A., Brow, M.A. y Burgess, R.R. (1991) J Biol Chem, 266, 2632-8. Leung, D.W., Chen, E. y Goeddel, D.V. (1989) Technique, 1, 11-15. Liao, H., McKenzie, T. y Hageman, R. (1986) Proc Natl Acad Sci USA, 83, 576-80 Lim, F. y Sun, A. M. (1980). Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.

Science 210(4472), 908-10.

Lim, F., Ed. (1984). Biomedical applications of microencapsulation. Boca Raton, Florida: CRC Press. Lissant, K.J., ed Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York:

Marcel Dekker, 1974.

Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York: Marcel Dekker, 1974. Lissant, K.J., ed. Emulsions and emulsion technology. Surfactant Science New York:

Marcel Dekker, 1984. Low, N.M., Holliger, P.H. y Winter, G. (1996) J Mol Biol, 260, 359-68. Lowman, H.B., Bass, S.H., Simpson, N. y Wells, J.A. (1991) Biochemistry, 30, 10832-8. Luisi, P. L. y B., S.-H. (1987). Activity and conformation of enzymes in reverse micellar

solutions. Methods Enzymol 136(188), 188-216.

Ma, C., Kudlicki, W., Odom, O.W., Kramer, G. y Hardesty, B. (1993) Biochemistry, 32, 7939-45. Magdassi, S., Frenkel, M, Carti, N. y Cazan, R. (1984) 97, 377-379. Manley, J.L., Fire, A., Samuels, M. y Sharp, P.A. (1983) Methods Enzymol, 101, 568-82. Mao, Q. y Walde, P. (1991). Substrate effects on the enzymatic activity of alpha

chymotrypsin in reverse micelles. Biochem Biophys Res Commun 178(3), 1105-12.

Mao, Q., Walde, P. y Luisi, P. L. (1992). Kinetic behaviour of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. A stopped-flow study. Eur J Biochem 208(1), 165-70. Mattheakis, L.C., Bhatt, R.R. y Dower, W.J. (1994) Proc Natl Acad Sci USA, 91, 9022-6.

McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. y Chiswell, D.J. (1990) Nature, 348, 552-4. Melton, D.A., Krieg, P.A., Rebagliati, M.R., Maniatis, T., Zinn, K. y Green, M.R. (1984) Nucleic Acids Res, 12, 703556.

Mendel, D., Cornish, V.W. y Schultz, P.G. (1995) Annu Rev Biophys Biomol Struct, 24, 435-62. Menger, F. M. y Yamada, K. (1979). J. Am. Chem. Soc. 101, 6731-6734.

Miele, E.A., Mills, D.R. y Kramer, F.R. (1983) J Mol Biol, 171, 281-95. Mize, P.D., Hoke, R.A., Linn, C.P., Reardon, J.E. y Schulte, T.H. (1989) Anal Biochem, 179, 229-35.

Montigiani, S., Neri, G., Neri, P. y Neri, D. (1996) J Mol Biol, 258, 6-13. Moore, M.J. (1995) Nature, 374, 766-7. New, R. R. C., Ed. (1990). Liposomes: a practical approach. The practical approach series.

Edited by Rickwood, D. y Hames, B. D. Oxford: Oxford University Press. Nissim, A., Hoogenboom, H.R. I Tomlinson, I.M., Flynn, G., Midgley, C., Lane, D. y Winter,

G. (1994) Embo J, 13, 692-8.

Oberholzer, T., Albrizio, M. y Luisi, P. L. (1995a). Polymerase chain reaction in liposomes. Chemistry and Biology 2, 677-682. Oberholzer, T., Wick, R., Luisi, P. L. y Biebricher, C. K. (1995b). Enzymatic RNA replication

in self-reproducing vesicles: an approach to a minimal cell. Biochem Biophys Res Commun 207(1), 250-7. Parmley, S.F. y Smith, G.P. (1988) Gene, 73, 305-18. Pelham, H.R. y Jackson, R.J. (1976) Eur J Biochem, 67, 247-56.

Perelson, A.S. y Oster, G.F. (1979) J Theor Biol, 81, 64570. Perez, G. M, Sanchez, F. A. y Garcia, C. F. (1992). Application of active-phase plot to the kinetic analysis of lipoxygenase in reverse micelles. Biochem J.

Pirrung, M.C. y Huang, C.Y. (1996) Bioconjug Chem, 7, 31721 Posner, B.A., Li, L., Bethell, R., Tsuji, T. y Benkovic, S.J. (1996) Biochemistry, 35, 1653-63.

Roberts, B.E., Gorecki, M, Mulligan, R.C., Danna, K.J., Rozenblatt, S. y Rich, A. (1975) Proc Natl Acad Sci USA, 72, 1922-6.

Roberts, J.W. (1969) Nature, 224, 1168-74. Roberts, R. y Szostak, J. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12297-12302.

Rosenberg, M, Weissman, S. y Decrombrugghe, B. (1975) J Biol Chem, 250, 4755-64.

Saki, R.K., Gelfand, D.H., Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. y Erlich, H.A. (1988) Science, 239, 487-91. Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratoy manual.

Cold Spring Harbor Laboratoy Press, New York.

Savage, M.D., Mattson, G., Desai, S., Nielander, G.W., Morgensen, S. y Conklin, E.J. (1994) Avidin-biotin chemistry: a handbook. Pierce Chemical Company, Rockford. Schick, M.J. (1966) Nonionic surfactants. Marcel Dekker, New York. Sherman, P. (1968) Emulsion science. Academic Press, London. Smith, G.P. (1985) Science, 228, 1315-7 Soumillion, P, Jaspers, L., Bouchet, M, Marchand, B.J., Winter, G. y Fastrez, J. (1994) J

Mol Biol, 237, 415-22. Stemmer, W.P. (1994a) Nature, 370, 389-91 Stemmer, W.P. (1994b) Proc Natl Acad Sci USA, 91, 10747-51 Stofko, H.R., Carr, D.W. y Scott, J.D. (1992) Febs Lett, 302, 274-8. Sun, A. M, Vasek, I. y Tai, I. (1992). Microencapsulation of living cells and tissues. En

Microencapsulation and nanoparticles in medicine andpharmacy (Donbrow, M, ed.), pp. 315-322. CRC Press, Boca Raton, Florida. Sundberg, S.A., Barrett, R.W., Pirrung, M, Lu, A.L., Kiangsoontra, B. y Holmes, C.P. (1995)

J. Am. CheM. Soc., 117, 12050-12057.

Tawfik, D. S., Green, B. S., Chap, R., Sela, M. y Eshhar, Z. (1993). catELISA: a facile general route to catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci USA 90(2), 373-7.

Tokatlidis, K., Friguet, B., Deville, B.D., Baleux, F., Fedorov, A.N., Navon, A., Djavadi, O.L. y Goldberg, M.E. (1995) Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 348, 89-95.

Tripet, B., Yu, L., Bautista, D.L., Wong, W.Y., Irvin, R.T. y Hodges, R.S. (1996) Protein Engng., 9, 1029-1042.

Tuerk, C. y Gold, L. (1990) Science, 249, 505-10. van Hal, D. A., Bouwstra, J. A. y Junginger, H. E. (1996). Nonionic surfactant vesicles

containing estradiol for topical application. En Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 329-347. Marcel Dekker, New York. Walde, P, Goto, A., Monnard, P,-A., Wessicken. M. y Luisi, P. L. (1994). Oparin's reactions

revisited: enzymatic synthesis of poly(adenylic acid) in micelles and self-reproducing

vesicles. J. Am. Chem. Soc. 116, 7541-7547. Walde, P, Han, D. y Luisi, P. L. (1993). Spectroscopic and kinetic studies of lipases solubilized in reverse micelles. Biochemistry 32(15), 4029-34.

Walde, P, Peng, Q., Fadnavis, N. W., Battistel, E. y Luisi, P. L. (1988). Structure and

activity of trypsin in reverse micelles. Eur J Biochem 173(2), 401-9. Walker, G.T. Fraiser, M.S., Schram, J.L., Little, M.C., Nadeau, J.G. y Malinowski, D.P. (1992) Nucleic Acids Res, 20, 1691-6.

Weil, P.A., Luse, D.S., Segall, J. y Roeder, R.G. (1979) Cell, 18, 469-84. Whateley, T. L. (1996). Microcapsules: preparation by interfacial polymerisation and

interfacial complexation and their applications. En Microencapsulation: methods and industrial applications (Benita, S., ed.), pp. 349-375. Marcel Dekker, New York. Wick, R. y Luisi, P. L. (1996). Enzyme-containing liposomes can endogenously produce

membrane-constituting lipids. Chem Biol 3(4), 277-85. Widersten, M. y Mannervik,. B. (1995) J Mol Biol, 250, 115-22 Williams, J.W., Morrison, J.F. y Duggleby, R.G. (1979) Biochemistry, 18, 2567-73. Winter, G., Griffiths, A.D., Hawkins, R.E. y Hoogenboom, H.R. (1994) Annu Rev Immunol,

12, 433-55. Wyatt, J.R.l Chastain, M. y Puglisi, J.D. (1991) Biotechniques, 11, 764-9. Yamagishi, J., Kawashima, H., Matsuo, N., Ohue, M, Yamayoshi, M, Fukui, T., Kotani, H.,

Furuta, R., Nakano, K. y Yamada, M. (1990) Protein Eng, 3, 713-9.

Yelamos, J., Klix, N., Goyenechea, B., Lozano, F., Chui, Y.L., Gonzalez, F.A., Pannell, R., Neuberger, M.S. y Milstein, C. (1995) Nature, 376, 225-9. Zaccolo, M, Williams, D.M., Brown, D.M. y Gherardi, E. (1996) J Mol Biol, 255, 589-603. Zakrzewski, S.F. (1980) Preparation of tritiated dihydrofolic acid of high specific activity.

Methods Enzymol. pp.539. Zaug, A.J. y Cech, T.R. (1986) Biochemistry, 25, 4478-82.

Zaug, A.J. y Cech, T.R. (1986) Science, 231, 470-5. Zaug, A.J., Been, M.D. y Cech, T.R. (1986) Nature, 324, 429-33. Zubay, G. (1973) Annu Rev Genet, 7, 267-87. Zubay, G. (1980) Methods Enzymol, 65, 856-77

LISTADO DE SECUENCIAS

(1)

INFORMACIÓN GENERAL:

(i)

SOLICITANTE:

(A)

NOMBRE: MEDICAL RESEARCH COUNCIL

(B)

CALLE: 20 PARK CRESCENT

(C)

CIUDAD: LONDON

(E)

PAÍS: UK

(F)

CODIGO POSTAL: W1N 4AL

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN:

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

(v) MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

(B)

ORDENADOR: PC compatible IBM

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 1:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 1:

AGCTTGCATG CCTGCGGTAC CGGCCATGCG CATGGCCTAG CGCATGCGGC CGCTAGCGCG 60

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 2:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 60 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 2: AATTCGCGCT AGCGGCCGCA TGCGCTAGGC CATGCGCATG GCCGGTACCG CAGGCATGCA 60

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 3:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 54 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 3: CGAGCTAGAG CTACCTTATT AATTACCTTT ACAAATTTCC AATGCAGATT TTAT 54

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 4:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 84 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 4:

GCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGAATTTA 60 ATTAGTCTTT TTTCAGGTGC AGGG 84

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 5:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 49 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 5: CGAGCTAGAG GTACCTTATT ACCGCCGCTC CAGAATCTCA AAGCAATAG 49

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 6:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 82 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 9:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 9: GTAAAACGAC GGCCAGT 17

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 10:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 10: CAGGAAACAG CTATGAC 17

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 11:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 11: GTCTCTGAAT TTACCGTTCC AG 22

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 12:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 12: GAAACTGTTG AAAGTTGTTT AG 22

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 13:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 13: ATTATAATAC GACTCACTAT AGGGAGAGTT ATCAGGCATG CACC 44

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 14:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 14: CTAGCTCCCA TTAAGGAG 18

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 15:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 15: GTAAAACGAC GGCCAGT 17

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 16:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 16: CAGGAAACAG CTATGAC 18

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 17:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 6:

GCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGATCAGT CTGATTGCGG CGTTAGCGGT AG

60 82

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 7:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B) (C) (D)

LONGITUD: 18 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 7:

GAATTGGATT TAGGTGAC

18

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 8:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B) (C) (D)

LONGITUD: 18 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 8:

CATGATTACG CCAAGCTC

18

(A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) HIPOTÉTICO: NO

(iv)

ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 17:

CGAGCTAGAG GTACCGCGGC CGCTGCGCTT ATTAATATGG TTTGAAATTT AATGATGAAC 60 CAATG 65

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A)

LONGITUD: 83 pares de bases

(B)

TIPO: ácido nucleico

(C)

Nº DE HEBRAS: única

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 18:

GCATCTGACA AGCTTAATAA TTTTGTTAA CTTTAAGAAG GAGATATACA TATGATTGAA ATAAAAGATA AACAGCTCAC AGG

60 83

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 19:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B) (C) (D)

LONGITUD: 67 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 19:

CGAGCTAGAG GTACCGCGGC CGCTGCGCTT ATTAATTACC TTTACAAATT TCCAATGCAG ATTTTAT

60 67

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 20:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B) (C) (D)

LONGITUD: 78 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 20:

CAGGAAACAG CTATGACAAG CTTAATACGA CTCACTATAG GGAGATATTT TTTATTTTAA TAAGGTTTTA ATTAATGG

60 84

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 21:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B) (C) (D)

LONGITUD: 54 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 21:

GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCTTATTAC TTTTGTAATC GTTTGTTTTT TATC

54

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 22:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) (B) (C) (D)

LONGITUD: 77 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

(A)

DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

(iii) (iv)

HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 22:

CAGGAAACAG CTATGACAAG CTTAATACGA CTCACTATAG GGAGAAATGG GTTTCTTTGG CATATTTTTT ACAAATG

60 77

(2)

INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº : 23:

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

5

(A) (B) (C) (D) LONGITUD: 59 pares de bases TIPO: ácido nucleico Nº DE HEBRAS: única TOPOLOGÍA: lineal

10

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: "OLIGONUCLEÓTIDO SINTÉTICO"

15

(iii) (iv) (xi) HIPOTÉTICO: NO ANTISENTIDO: NO DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 23:

GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCGATATCT TATTACTCTT CAATTACCAA AATATCCCC

59

20

Claims (23)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para el aislamiento de uno o más elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo, que posee una actividad deseada, que comprende las etapas siguientes:

   (a)

   compartimentalización de los elementos genéticos en microcápsulas;

   (b)

   expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos en el interior de las microcápsulas;

   (c)

   clasificar los elementos genéticos que producen los anticuerpos o fragmentos de los mismos, que poseen la actividad deseada.

2. 2.

   Procedimiento según la reivindicación 1, en el que un anticuerpo o fragmento del mismo con la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que permite que la microcápsula que contiene el producto génico y el elementos génico que lo codifica, sean clasificados.

3. 3.

   Procedimiento según la reivindicación 2, en el que un anticuerpo o fragmento del mismo que presenta la actividad deseada modifica una o más moléculas en el interior de la microcápsula que permite que la microcápsula que contiene el producto génico y el elemento génico que lo codifica, sean clasificados.

4. 4.

   Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo que posee la actividad deseada induce un cambio en las propiedades ópticas de la microcápsula y de este modo las microcápsulas son clasificadas.

5. 5.

   Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en la etapa (b) la actividad del anticuerpo deseado o fragmento del mismo en el interior de la microcápsula da lugar, directa o indirectamente, a la modificación del elemento genético que codifica el producto génico, para permitir el aislamiento del elemento genético.

6. 6.

   Procedimiento según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo que posee la actividad deseada induce un cambio en la microcápsula que, cuando es detectado, provoca la modificación del elemento genético en el interior del compartimento, para permitir el aislamiento del elemento genético.

7. 7.

   Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el cambio en la microcápsula es un cambio en sus propiedades ópticas.

8. 8.

   Procedimiento según la reivindicación 5, en el que una parte del elemento genético es un ligando y el anticuerpo deseado o fragmento del mismo en el interior de la microcápsula se une, directa o indirectamente, a dicho ligando para permitir el aislamiento del elemento genético.

9. 9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende:

   expresar los elementos genéticos para producir sus anticuerpos respectivos o fragmentos de los mismos en el interior de las microcápsulas, unir los anticuerpos o fragmentos de los mismos a los elementos genéticos que los codifican y aislar los complejos así formados.

10. 10.

    Procedimiento según la reivindicación 9, en el que en la etapa (c) los complejos son clasificados directamente para aislar los elementos genéticos que codifican un anticuerpo o fragmento del mismo que presenta la actividad deseada.

11. 11.

    Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los complejos son sometidos a una etapa de compartimentalización adicional con el fin de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que presenta la actividad deseada.

12. 12.

    Procedimiento según la reivindicación 11, en el que las microcápsulas son clasificadas según las reivindicaciones 2 a 4.

13. 13.

    Procedimiento según la reivindicación 10, en el que los elementos genéticos son clasificados según las reivindicaciones 5 a 10.

14. 14.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los elementos genéticos se aíslan a partir de una genoteca de elementos genéticos que codifica un repertorio de anticuerpos o fragmentos de los mismos.

15. 15.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la etapa adicional de:

    (d) introducción de una o más mutaciones en el o los elementos genéticos aislados en la etapa (c).

16. 16.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además la repetición reiterativa de una o más de las etapas (a) a (d).

17. 17.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además la amplificación de los elementos genéticos.

18. 18.

    Procedimiento para la compartimentalización de un elemento genético que codifica un anticuerpo o fragmento y expresar el elemento genético para formar su anticuerpo o fragmento del mismo en el interior del compartimento, que comprende las etapas que consisten en:

    (a)

    formar una solución acuosa que comprende el elemento genético y los componentes necesarios para expresarlo para formar su producto génico;

    (b)

    microencapsular la solución para formar una microcápsula discreta que comprende el elemento genético; y

    (c)

    exponer la microcápsula a las condiciones apropiadas para proceder a la expresión del elemento genético para formar su anticuerpo o fragmento del mismo.

19. 19.

    Procedimiento según la reivindicación 18, en el que una genoteca de elementos genéticos que codifica un repertorio de anticuerpos o fragmentos de los mismos es encapsulada y cada elemento genético expresado para formar su producto génico en el interior de una microcápsula.

20. 20.

    Procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que la microencapsulación se lleva a cabo formando una emulsión de agua en aceite de la solución acuosa en un medio basado en aceite.

21. 21.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, en el que los elementos genéticos se clasifican mediante purificación por afinidad.

22. 22.

    Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 17, en el que los elementos genéticos son clasificados mediante ablación selectiva de los elementos genéticos que no codifican el anticuerpo deseado o un fragmento del mismo.

23. 23.

    Procedimiento para la preparación de un anticuerpo o fragmento del mismo, que comprende las etapas que consisten en:

    (a)

    aislar un elemento genético que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1; y

    (b)

    expresar el producto génico que presenta la actividad deseada.