ES2293161T3 - Procedimiento de clasificacion optica. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) formar microcápsulas acuosas en una emulsión agua en aceite, en la que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba y en la que una pluralidad de las microcápsulas incluyen una molécula de ácido nucleico, un soporte de fase sólida que puede ligarse a la molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende componentes necesarios para realizar la amplificación de ácidos nucleicos en la fase interna acuosa; (b) amplificar la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias de producto amplificado de la molécula de ácido nucleico; (c) capturar las copias de producto amplificado al soporte de fase sólida en las microcápsulas; y (d) clasificar según un cambio en las propiedades ópticas del ácido nucleico; aumentando así la concentración de la molécula de ácido nucleico.
Description
Procedimiento de clasificación óptica.
Un procedimiento para aumentar la concentración
de una molécula de ácido nucleico y un procedimiento para producir
producto génico.
La presente invención se refiere a
procedimientos para uso en evolución in vitro de bibliotecas
moleculares. En particular, la presente invención se refiere a
procedimientos para aumentar la concentración de productos génicos
que codifican ácidos nucleicos en los que el ácido nucleico y la
actividad del producto génico codificado están ligados por
compartimentación. La presente invención también se refiere a
procedimientos para producir productos génicos de uno o más
elementos genéticos.
La evolución requiere la generación de
diversidad genética (diversidad en ácido nucleico) seguida por la
selección de aquellos ácidos nucleicos que dan como resultado
características beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la
actividad del producto génico codificado de un organismo están
físicamente ligados (estando confinados los ácidos nucleicos dentro
de las células que codifican), múltiples rondas de mutación y
selección pueden dar como resultado la supervivencia progresiva de
organismos con idoneidad creciente. Los sistemas para la rápida
evolución de ácidos nucleicos o proteínas in vitro imitan
ventajosamente este procedimiento a nivel molecular en el que el
ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están
ligados y puede seleccionarse la actividad del producto génico.
Avances recientes en la biología molecular han
permitido coseleccionar algunas moléculas según sus propiedades
junto con los ácidos nucleicos que codifican. Los ácidos nucleicos
seleccionados pueden clonarse posteriormente para posterior
análisis o usarse o someterse a rondas adicionales de mutación y
selección.
Común a estos procedimientos es el
establecimiento de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos. Las
moléculas que tienen las características deseadas (actividad)
pueden aislarse mediante regímenes de selección que seleccionan la
actividad deseada del producto génico codificado, tal como una
actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo actividad de
unión.
La tecnología de expresión en fagos ha sido
sumamente satisfactoria en proporcionar un vehículo que permita la
selección de una proteína expresada mediante la proporción del
enlace esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto
génico codificado (Smith, 1985; Bass y col., 1990; McCafferty y
col., 1990; para revisión véase Clackson y Wells, 1994). Las
partículas de fagos filamentosos actúan como paquetes de expresión
genética con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que
las codifican en el interior. El estrecho enlace entre el ácido
nucleico y la actividad del producto génico codificado es un
resultado de la unidad del fago dentro de bacterias. Como las
bacterias individuales se multiplican rara vez infectadas, en la
mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una
bacteria individual llevarán el mismo elemento genético y expresarán
la misma proteína.
Sin embargo, la expresión en fagos se basa en la
creación de bibliotecas de ácidos nucleicos in vivo en
bacterias. Por tanto, la limitación práctica en el tamaño de la
biblioteca permitida por la tecnología de expresión en fagos es del
orden de 10^{7} a 10^{11}, incluso aprovechándose de los
vectores del fago \lambda con replicones suprimibles del fago
filamentoso. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección
de moléculas con actividad de unión. Usando esta técnica también se
ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica;
sin embargo, la selección no fue directamente para la actividad
catalítica deseada, pero tampoco para unirse a un análogo en estado
de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o reaccionar con un
inhibidor suicida (Soumillion y col., 1994; Janda y col., 1997). Más
recientemente ha habido algunos ejemplos de enzimas seleccionadas
usando expresión en fagos mediante la formación de productos (Atwell
y Wells, 1999; Demartis y col., 1999; Jestin y col., 1999; Pederson
y col., 1998), pero en todos estos casos la selección no era para
renovación múltiple.
Se han seleccionado ligandos de péptidos
específicos para unirse a receptores mediante selección de afinidad
usando grandes bibliotecas de péptidos ligadas al extremo de C del
represor lac LacI (Cull y col., 1992). Cuando se expresa en
E. coli, la proteína del represor liga físicamente el ligando
al plásmido codificante uniéndose a una secuencia del operador lac
en el plásmido.
También se ha informado de un sistema de
expresión en polisoma completamente in vitro (Mattheakis y
col., 1994; Hanes y Pluckthun, 1997) en el que los péptidos
nacientes están unidos físicamente mediante el ribosoma al ARN que
los codifica. También se ha descrito un sistema alternativo
completamente in vitro para ligar el genotipo al fenotipo
haciendo fusiones de ARN-péptidos (Roberts y
Szostak, 1997; Nemoto y col., 1997).
Sin embargo, el alcance de los sistemas
anteriores está limitado a la selección de proteínas y además
permite selección directa de actividades distintas de la actividad
de unión, por ejemplo actividad catalítica o reguladora.
La selección y evolución de ARN in vitro
(Ellington y Szostak, 1990), algunas veces denominada en lo sucesivo
SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento
exponencial) (Tuerk y Gold, 1990), permite la selección tanto para
la actividad de unión como la química, pero sólo para ácidos
nucleicos. Si la selección es para unir, una reunión de ácidos
nucleicos se incuba con sustrato inmovilizado. Los no aglutinantes
se lavan, entonces los aglutinantes se liberan, se amplifican y
todo el procedimiento se repite en etapas iterativas para
enriquecer mejores secuencias de unión. Este procedimiento también
puede adaptarse para permitir el aislamiento de ARN y ADN
catalítico (Green y Szostak, 1992; para revisiones véase Chapman y
Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold y col., 1995; Moore, 1995).
Sin embargo, la selección de actividad
"catalítica" o de unión usando SELEX sólo es posible porque la
misma molécula desempeña el doble papel de llevar la información
genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Si la
selección es para "autocatálisis", la misma molécula también
debe desempeñar el tercer papel de ser un sustrato. Debido a que el
elemento genético debe desempeñar el papel de tanto el sustrato como
el catalizador, la selección sólo es posible para acontecimientos
de una única renovación. Debido a que el "catalizador" está
modificado por sí mismo en este procedimiento, por definición no es
un catalizador real. Adicionalmente, las proteínas pueden no
seleccionarse usando el procedimiento SELEX. Por tanto, la variedad
de catalizadores, sustratos y reacciones que pueden seleccionarse
está rigurosamente limitada.
Aquellos de los procedimientos anteriores que
permiten rondas iterativas de mutación y selección están imitando
mecanismos in vitro normalmente atribuidos al procedimiento
de evolución: variación iterativa, selección progresiva para una
actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los
procedimientos desarrollados hasta tal punto ha proporcionado
moléculas de diversidad y eficacia funcional comparable a las de
aquellas que se encuentran naturalmente. Adicionalmente, hay
sistemas de "evolución" no hechos por el hombre que pueden
desarrollar tanto ácidos nucleicos como proteínas para efectuar el
intervalo completo de actividades bioquímicas y biológicas (por
ejemplo, actividades de unión, catalítica y reguladora) y que pueden
combinar varios procedimientos que conducen a un producto o
actividad deseada.
Por tanto, hay una gran necesidad de un sistema
in vitro que venza las limitaciones anteriormente
tratadas.
En Tawfik y col. (1998), Nature Biotechnology,
EE.UU., Nature Publishing volumen. 7(16), páginas
652-656, se describen compartimentos similares a
células hechas por el hombre para la invención molecular. En
Anarbaev y col. (1998), Biochemica et Biophysica Acta Protein
Structure and Molecular Enzymology, Elservier, Ámsterdam, NL,
volumen 1384(2): 315-324 se estudió la
actividad del complejo ADN polimerasa
\alpha-primasa de timo de ternera y fragmento de
Klenow de ADN polimerasa de E. coli en microemulsiones
inversas. En Oberholzer y col. (1995) Chemistry and Biology,
Current Biology, Londres, RU, volumen 2(10) :
677-682 se describe que puede llevarse a cabo PCR
en liposomas. En Tawfik y Griffiths (1998) y en la solicitud de
patente internacional WO99/62671 se describe un sistema para
evolución in vitro que vence muchas de las limitaciones
descritas anteriormente usando compartimentación en microcápsulas
para ligar a nivel molecular genotipo y fenotipo.
En Tawfik y Griffiths (1998) y en varias
realizaciones de la solicitud de patente internacional WO99/02671,
la actividad deseada de un producto génico da como resultado una
modificación del elemento genético que lo codifica (y está presente
en la misma microcápsula). Entonces, el elemento genético modificado
puede seleccionarse en una etapa posterior.
En este documento se describe un procedimiento
en el que la modificación del elemento genético produce un cambio
en las propiedades ópticas del propio elemento, y que tiene muchas
ventajas respecto a los procedimientos previamente descritos.
Según un primer aspecto de la presente
descripción se proporciona un procedimiento para aislar uno o más
elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene una
actividad deseada cuyaexpresión puede dar como resultando,
directamente o indirectamente, la modificación de una propiedad
óptica de un elemento genético que codifica el producto génico, que
comprende las etapas de:
- (a)
- compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;
- (b)
- expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
- (c)
- clasificar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada según las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos.
Las microcápsulas según la presente invención
compartimentan elementos genéticos y productos génicos de forma que
pueden permanecer juntos físicamente ligados. Según un primer
aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para
aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico que
comprende las etapas de:
- (a)
- formar microcápsulas acuosas en una emulsión agua en aceite, en la que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba y en la que una pluralidad de las microcápsulas incluyen una molécula de ácido nucleico, un soporte de fase sólida que puede ligarse a la molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende componentes necesarios para realizar la amplificación de ácidos nucleicos en la fase interna acuosa;
\newpage
- (b)
- amplificar la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias de producto amplificado de la molécula de ácido nucleico; y
- (c)
- capturar las copias de producto amplificado al soporte de fase sólida en las microcápsulas;
aumentando así la concentración de
la molécula de ácido
nucleico.
Según un segundo aspecto de la invención se
proporciona un procedimiento para producir producto génico de uno o
más elementos genéticos que comprenden ácido nucleico, comprendiendo
dicho procedimiento:
- (a)
- proporcionar perlas y uno o más elementos genéticos que comprenden ácido nucleico, en el que dichas perlas están adaptadas para acoplarse a dicho uno o más elementos genéticos y producto génico producido de dichos elementos genéticos, y dicho uno o más elementos genéticos están adaptados para acoplarse a dichas perlas, y combinar dichas perlas y elementos genéticos de forma que dichos elementos genéticos se unan a dichas perlas;
- (b)
- compartimentar dicho uno o más elementos genéticos unidos a perlas en microcápsulas acuosas con componentes requeridos para producir producto génico de dicho uno o más elementos genéticos, formándose dichas microcápsulas en una emulsión agua en aceite y en el que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba;
- (c)
- expresar dicho uno o más elementos genéticos dentro de dichas microcápsulas para producir productos génicos respectivos, de forma que dichos productos génicos se vuelven a acoplar a dichas perlas;
en el que dicha etapa de expresión
comprende transcripción, traducción inversa, replicación o
traducción, y dicho producto génico se selecciona de ADN, ARN o
proteína, o ácido nucleico o proteína que contiene bases o
aminoácidos no
naturales.
Como se usa en este documento, un elemento
genético es una molécula o constructo molecular que comprende un
ácido nucleico. Los elementos genéticos de la presente invención
puede comprender cualquier ácido nucleico (por ejemplo ADN, ARN o
cualquier análogo, natural o artificial, del mismo). Además, el
componente de ácido nucleico del elemento genético puede estar
ligado, covalente o no covalentemente, a una o más moléculas o
estructuras que incluyen proteínas, entidades y grupos químicos, y
soportes de fase sólida tales como perlas (que incluyen perlas no
magnéticas, magnéticas y paramagnéticas) y similares. En el
procedimiento de la invención, estas estructuras o moléculas pueden
diseñarse para ayudar en la clasificación y/o aislamiento del
elemento genético que codifica un producto génico con la actividad
deseada.
Expresión, como se usa en este documento, se usa
en su significado más amplio para significar que un ácido nucleico
contenido en el elemento genético se convierte en su producto
génico. Por tanto, cuando el ácido nucleico es ADN, la expresión se
refiere a la transcripción del ADN en ARN; donde este ARN codifica
para proteína, expresión también puede referirse a la traducción
del ARN en proteína. Cuando el ácido nucleico es ARN, la expresión
puede referirse a la replicación de este ARN en más copias de ARN,
la transcripción inversa del ARN en ADN y opcionalmente la
transcripción de este ADN en más molécula(s) de ARN, además
de opcionalmente la traducción de cualquiera de las especies de ARN
producidas en proteína. Por tanto, preferentemente, la expresión se
realiza por uno o más procedimientos seleccionados del grupo que
está constituido por transcripción, transcripción inversa,
replicación y traducción.
Por tanto, la expresión del elemento genético
puede dirigirse tanto a ADN, ARN o proteína, como a un ácido
nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales
(el producto génico) dentro de la microcápsula de la invención, de
manera que el producto génico está confinado dentro de la misma
microcápsula que el elemento genético.
El elemento genético y el producto génico así
codificados se ligan confinando cada elemento genético y el
producto génico respectivo codificado por el elemento genético
dentro de la misma microcápsula. De este modo, el producto génico
en una microcápsula no puede producir un cambio en cualquier otra
microcápsula. Además, pueden emplearse más medios de enlace para
ligar productos génicos a los elementos genéticos que los codifican,
como se expone más adelante.
El término "microcápsula" se usa en este
documento según el significado normalmente asignado al mismo en la
técnica y además se describe más adelante en este documento. Sin
embargo, en esencia, una microcápsula es un compartimento
artificial cuyos bordes delimitantes limitan el intercambio de los
componentes de los mecanismos moleculares descritos en este
documento que permiten la clasificación de los elementos genéticos
según la función de los productos génicos que codifican.
Preferentemente, las microcápsulas usadas en el
procedimiento de la presente invención podrán producirse en
cantidades muy grandes, y así compartimentan una biblioteca de
elementos genéticos que codifica un repertorio de productos
génicos.
Como se usa en este documento, un cambio en las
propiedades ópticas de los elementos genéticos se refiere a
cualquier cambio en la absorción o emisión de radiación
electromagnética, que incluye cambios en la absorbancia,
luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Todas estas
propiedades están incluidas en el término "ópticas". Los
elementos genéticos pueden clasificarse, por ejemplo, por
clasificación activada por luminiscencia, fluorescencia o
fosforescencia. En una realización preferida se emplea citometría de
flujo para clasificar elementos genéticos, por ejemplo, puede
usarse dispersión de la luz (Kerker, 1983) y polarización de
fluorescencia (Rolland y col., 1985) para provocar la clasificación
de flujo. En una realización sumamente preferida, los elementos
genéticos se clasifican usando un clasificador de células activado
por fluorescencia (FACS) (Norman, 1980; Mackenzie y Pinder,
1986).
Los cambios en propiedades ópticas pueden ser
directos o indirectos. Por tanto, el cambio puede dar como resultado
la alteración de una propiedad óptica en el propio elemento
genético o puede conducir indirectamente a un cambio tal. Por
ejemplo, la modificación de un elemento genético puede alterar su
capacidad para unir un ligando ópticamente activo, alterando así
indirectamente sus propiedades ópticas.
Alternativamente, las técnicas de obtención de
imágenes pueden usarse para seleccionar finas películas de
elementos genéticos para permitir el enriquecimiento de un elemento
genético con propiedades deseables, por ejemplo por aislamiento
físico de la región en la que está situado un elemento genético con
propiedades deseables o eliminación de elementos genéticos no
deseados. Los elementos genéticos pueden detectarse por
luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia.
Según una realización preferida del primer
aspecto de la presente descripción, la clasificación de elementos
genéticos puede realizarse en una de esencialmente dos técnicas.
(I) En una primera realización, los elementos
genéticos se clasifican tras la reunión de las microcápsulas en uno
o más compartimentos comunes. En esta realización, un producto
génico que tiene la actividad deseada modifica el elemento genético
que lo codifica (y que reside en la misma microcápsula) de manera
que hace que pueda seleccionarse en una etapa posterior como
resultado de sus propiedades ópticas modificadas. Las reacciones se
detienen y entonces se rompen las microcápsulas de manera que se
reúne el contenido de todas las microcápsulas individuales. La
modificación del elemento genético en la microcápsula puede dar
directamente como resultado la modificación de las propiedades
ópticas del elemento genético. Alternativamente, la modificación
puede permitir que los elementos genéticos se modifiquen
adicionalmente fuera de las microcápsulas de manera que se induzca
un cambio en sus propiedades ópticas. La selección de los elementos
genéticos con propiedades ópticas modificadas permite el
enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el (los)
producto(s) génico(s) que tienen la actividad
deseada. Por consiguiente, la descripción proporciona un
procedimiento según el primer aspecto de la descripción, en el que
en la etapa (b) el producto génico que tiene la actividad deseada
modifica el elemento genético que lo codifica para permitir el
aislamiento del elemento genético como resultado de un cambio en
las propiedades ópticas del elemento genético. Por supuesto, debe
entenderse que la modificación puede ser directa, porque se produce
por la acción directa del producto génico en el elemento genético, o
indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las que
implica el producto génico que tiene la actividad deseada, conduce a
la modificación del elemento genético.
(II) En una segunda realización, los elementos
genéticos pueden clasificarse mediante un procedimiento de
múltiples etapas que implica al menos dos etapas, por ejemplo, con
el fin de permitir la exposición de los elementos genéticos a
condiciones que permitan que se produzcan al menos dos reacciones
separadas. Como será evidente para expertos en la materia, la
primera etapa de microencapsulación de la descripción da
ventajosamente como resultado condiciones que permiten la expresión
de los elementos genéticos - sea transcripción, transcripción y/o
traducción, replicación o similares. En estas condiciones puede no
ser posible seleccionar una actividad del producto génico
particular, por ejemplo porque el producto génico pueda no ser
activo en estas condiciones, o porque el sistema de expresión
contiene una actividad interferente. Por tanto, la descripción
proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la presente
descripción en el que la etapa (b) comprende expresar los elementos
genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de
las microcápsulas, ligar los productos génicos a los elementos
genéticos que los codifican y aislar los complejos así formados.
Esto permite aislar los elementos genéticos y sus productos génicos
asociados de las cápsulas antes de que tenga lugar la clasificación
según la actividad del producto génico. En una realización
preferida, los complejos se someten a otra etapa de
compartimentación antes de aislar los elementos genéticos que
codifican un producto génico que tiene la actividad deseada. Esta
etapa de compartimentación, que ventajosamente tiene lugar en
microcápsulas, permite la realización de otras reacciones, a
diferentes condiciones, en un entorno en el que los elementos
genéticos y sus productos génicos respectivos están físicamente
ligados. La clasificación eventual de elementos genéticos puede
realizarse según la realización (I) anterior.
La "encapsulación secundaria" también puede
realizarse con elementos genéticos ligados a productos génicos por
otros medios tales como por expresión en fago, expresión en
polisoma, fusión de ARN-péptido o fusión de péptidos
del represor lac.
El (Los) elemento(s) genético(s)
seleccionado(s) también pueden someterse a rondas
posteriores, opcionalmente más estrictas, de clasificación en
etapas iterativamente repetidas, volviendo a aplicar el
procedimiento de la descripción bien en su totalidad o sólo en
etapas seleccionadas. Mediante la confección apropiada de las
condiciones pueden aislarse elementos genéticos que codifican
productos génicos que tienen una actividad mejor optimizada después
de cada ronda de selección.
Adicionalmente, los elementos genéticos aislados
después de una primera ronda de clasificación pueden someterse a
mutagénesis antes de repetir la clasificación mediante repetición
iterativa de las etapas del procedimiento de la descripción como se
explican anteriormente. Después de cada ronda de mutagénesis,
algunos elementos genéticos se habrán modificado de tal manera que
se mejora la actividad de los productos génicos.
Además, los elementos genéticos seleccionados
pueden clonarse en un vector de expresión para permitir la posterior
caracterización de los elementos genéticos y sus productos.
En un segundo aspecto, la descripción
proporciona un producto que se selecciona según el primer aspecto de
la descripción. Como se usa en este contexto, un "producto"
puede referirse a un producto génico que puede seleccionarse según
la descripción, o el elemento genético (o información genética
comprendida en él).
En un tercer aspecto, la descripción proporciona
un procedimiento para preparar un producto génico cuya expresión
puede dar como resultado, directamente o indirectamente, la
modificación de las propiedades ópticas de un elemento genético que
lo codifica, que comprende las etapas de:
- (a)
- preparar un elemento genético que codifica el producto génico;
- (b)
- compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;
- (c)
- expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
- (d)
- clasificar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada usando las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos; y
- (e)
- expresar el producto génico que tiene la actividad deseada.
Según el tercer aspecto, la etapa (a) comprende
preferentemente preparar un repertorio de elementos genéticos, en
el que cada elemento genético codifica un producto génico
potencialmente diferenciado. Los repertorios pueden generarse
mediante técnicas convencionales tales como aquellas empleadas para
la generación de bibliotecas previstas para la selección por
procedimientos tales como expresión en fago. Según la presente
descripción, los productos génicos que tienen la actividad deseada
pueden seleccionarse del repertorio según su capacidad para
modificar las propiedades ópticas de los elementos genéticos de un
modo que difiera de las de otros productos génicos. Por ejemplo,
los productos génicos deseados pueden modificar las propiedades
ópticas en mayor medida que otros productos génicos, o en menor
medida, incluyendo nada en absoluto.
En un cuarto aspecto, la descripción proporciona
un procedimiento para seleccionar un compuesto o compuestos que
puedan modular la actividad de un producto génico cuya expresión
pueda dar como resultado, directamente o indirectamente, la
modificación de las propiedades ópticas de un elemento genético que
lo codifica, que comprende las etapas de:
- (a)
- preparar un repertorio de elementos genéticos que codifican producto génico;
- (b)
- compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;
- (c)
- expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
- (d)
- clasificar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada usando las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos; y
- (e)
- poner en contacto un producto génico que tiene la actividad deseada con el compuesto o compuestos y monitorizar la modulación de una actividad del producto génico por el compuesto o compuestos.
Ventajosamente, el procedimiento comprende
además la etapa de:
- (g)
- identificar el compuesto o compuestos que pueden modular la actividad del producto génico y sintetizar dicho compuesto o compuestos.
Este sistema de selección puede configurarse
para seleccionar ARN, ADN o moléculas de proteínas con actividad
catalítica, reguladora o de unión.
Figura 1. La dihidrofolato reductasa puede
expresarse con idéntica eficiencia a partir de genes traducidos
in vitro en disolución y genes unidos a perlas
paramagnéticas. La actividad de DHFR resultante de la traducción
in vitro de genes folA en disolución o genes
folA unidos a microperlas paramagnéticas se determina
monitorizando la oxidación de NADPH a NADP por espectrofotometría a
340 nm y la actividad se calcula mediante velocidades iniciales en
condiciones de So>>K_{M} (\numáx). (\blacklozenge),
traducido de genes en disolución; (\blacksquare), traducido de
genes unidos a micro-
perlas. 2.
perlas. 2.
Figura 2. Microscopía de epifluorescencia de
emulsiones agua en aceite que demuestran que GFP puede
traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas
individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las
emulsiones y el producto génico traducido se une de nuevo a las
microperlas haciéndolas fluorescentes.
Figura 3. Análisis de citometría de flujo de
expresión de GFP en microcápsulas y unión in situ al elemento
genético (microperlas). A: las características de dispersión de
la luz de las perlas antes de la reacción. 75% de las perlas se
ejecutan como perlas individuales. B: las características de
dispersión de la luz de las perlas después de la reacción de
traducción in vitro. Aproximadamente el 50% de perlas se
clasifican en la puerta para perlas individuales. C: la
fluorescencia de microperlas (sólo graduada para perlas
individuales) recubiertas con gen T7-GFP y
anticuerpo policlonal anti-GFP es significativamente
superior a la señal de las perlas en las que se omitieron tanto el
gen de GFP como el anticuerpo anti-GFP.
Figura 4. Síntesis de
biotina-GS-DNP por la reacción
catalizada por glutatión S-transferasa
M2-2 humana (GST M2-2) de
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB; Sigma) con glutatión biotinilado reducido
(biotina-GSH).
Figura 5. Detección de perlas paramagnéticas
recubiertas con el producto de una reacción catalizada por enzima
por citometría de flujo. Las micropartículas magnéticas
recubiertas con estreptavidina Sera-Mag^{TM} se
incubaron con biotina-GS-DNP
preparada por la reacción catalizada por GST M2-2 de
biotina-GSH y CDNB. La
biotina-GS-DNP capturada se detectó
mediante incubación de las micropartículas con un anticuerpo
anti-dinitrofenol de ratón seguido por una IgG
antiratón de cabra del fragmento F(ab')_{2} conjugado con
(FITC), fragmento F(ab')2. Después del lavado se analizaron 2
x 10^{5} micropartículas por citometría de flujo. Todos los
reactivos, no se omiten reactivos de la síntesis enzimática de con
biotina-GS-DNP; menos GST, la enzima
GST M2-2 se omitió de la síntesis; menos
biotina-GSH, biotina-GSH se omitió
de la síntesis; menos CDNB, CDNB se omitió de la síntesis.
Figura 6. Síntesis de
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH
(biotina
enjaulada-\betaala-GSH).
Se añadió cloruro de acetilo (5 ml) a metanol
anhidro (80 ml). La disolución con agitación se dejó enfriar y se
añadió d-biotina (4 g). Después de agitación durante
toda la noche, los disolventes se evaporaron a vacío para
proporcionar un sólido blanco. El sólido se trituró con éter, se
filtró y se secó a vacío (en presencia de pentóxido de fósforo) y se
guardó a -20ºC.
Figura 7. Reacción de biotina
enjaulada-\betaala-GSH con
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB) y desenjaulamiento fotoquímico del grupo biotina.
Figura 8. Reacción de biotina
enjaulada-\betaala-GSH con
4-cloro-3-nitrobenzoato
(CNB) y desenjaulamiento fotoquímico del grupo biotina.
Figura 9. GST M2-2 humana
cataliza la reacción de biotina
enjaulada-\betaala-GSH con CDNB y
CNB en disolución y los productos de reacción pueden desenjaularse
por radiación UV, capturarse sobre perlas y detectarse usando
anticuerpos anti-producto marcados fluorescentemente
y citometría de flujo.
Panel A: características de dispersión de la luz
de perlas y la puerta para perlas individuales (R1). Panel B:
fluorescencia de microperlas (graduada por R1) de reacciones con
CDNB. Panel C: fluorescencia de microperlas (graduada por R1) de
reacciones con CNB. Las señales de microperlas de reacciones con y
sin GST M2-2 se anotan +enz y -enz, respectivamente.
Las señales de microperlas de reacciones que fueron irradiadas con
UV y aquellas que no se anotaron +UV y -UV, respectivamente.
Figura 10. La citometría de flujo puede
usarse para distinguir perlas de compartimentos acuosos de una
emulsión que contiene GST M2-2 de perlas de
compartimentos sin GST M2-2 usando biotina
enjaulada-\betaAla-GSH y CNB como
sustratos.
Panel A: características de dispersión de la luz
de una mezcla de una mezcla de microesferas marcadas con
neutravidina no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular
Probes, F-8777) o perlas de poliestireno recubiertas
con estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) y
puertas establecidas para perlas individuales de Bangs (R1) y perlas
individuales de Molecular Probes (R2). Panel B: fluorescencia de
microperlas tomada de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de
Bangs (sin GST) y 2% de perlas de Molecular Probes (con GST). Panel
C: fluorescencia de microperlas tomada de una mezcla de dos
emulsiones en una relación de perlas de Bangs que contiene 98% de
emulsión (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas de
Molecular Probes (con GST). Panel D: fluorescencia de microperlas
tomada de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de Molecular
Probes (sin GST) y 2% de perlas de Bangs (con GST). Panel E:
fluorescencia de microperlas tomada de una mezcla de dos emulsiones
en una relación de perlas de Molecular Probes que contienen 98% de
emulsión (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas de Bangs
(con GST). Se solapa la fluorescencia de perlas no graduadas (sin
puerta), perlas graduadas a través de R1 (R1) y perlas graduadas a
través de R2 (R2).
Figura 11. La GST M2-2 humana
transcrita y traducida in vitro en los compartimentos acuosos
de una emulsión agua en aceite cataliza una reacción que da lugar a
un cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas
co-compartimentadas.
Panel A: características de dispersión de la luz
de perlas y puertas para perlas individuales (R1). Panel B:
fluorescencia de microperlas (graduadas a través de R1) de
reacciones no emulsionadas. Panel C: fluorescencia de microperlas
(graduadas a través de R1) de reacciones emulsionadas. Las señales
de microperlas de reacciones con y sin ADN de
GSTM2-2.LMB2-3 se anotan +ADN y
-ADN, respectivamente. Las señales de microperlas de reacciones con
y sin GST M2-2 recombinante se anotan +GST y -GST,
respectivamente.
Figura 12. Síntesis del sustrato biotinilado
enjaulado EtNP-BzGlu-biotina
enjaulada (17).
Figura 13. Hidrólisis del sustrato de PTE
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada (17) para dar el producto
Et-Bz-Glu-biotina
enjaulada y desenjaulamiento de tanto el sustrato como el producto
para dar el sustrato biotinilado correspondiente
(EtNP-Bz- Glu-biotina) y producto
(EtNP-Bz-Glu-biotina).
Figura 14. Preparación de conjugados de
proteínas de un sustrato de PTE y producto para inmunización y
ELISA.
Figura 15. PTE cataliza la reacción de
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina, y
los productos de reacción se desenjaulan por radiación UV, se
capturan sobre perlas y se detectan usando anticuerpos
anti-producto marcados fluorescentemente y
citometría de flujo.
Panel A: características de dispersión de la luz
de las perlas y puerta seleccionada para perlas individuales (R2).
Panel B: fluorescencia de perlas (graduadas a través de R2) de
reacciones con
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 10 \muM en presencia de fragmentos de ADN
OPD.LMB3-2biotina (OPD) traducidos in vitro o
fragmentos de ADN M.HaeIII.LMB3-2biotina
(M.HaeIII). Panel C: como B pero con
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 20 \muM. Panel D: como B pero con
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 50 \muM.
Figura 16. Reacción de
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada en presencia de perlas a las que se unieron elementos
genéticos que codifican la fosfotriesterasa marcada con el péptido
Flag
(N-Flag-OPD.LMB3-2biotina)
u otra enzima
(N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina)
junto con un anticuerpo que une el péptido Flag. Las perlas se
hicieron reaccionar y posteriormente se analizaron mediante
citometría de flujo como se describe en el texto.
Panel A: características de dispersión de la luz
de perlas y puerta para perlas individuales (R1). Panel B:
fluorescencia de microperlas (graduadas a través de R1) a las que se
unieron fragmentos de ADN
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
(OPD) o fragmentos de ADN M.HaeIII.
LMB3-2biotina (M.HaeIII) de reacciones con
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 12,5 \muM. Panel C: como B pero con
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 25 \muM.
Figura 17. BirA de E. coli transcrito
y traducido in vitro cataliza una reacción que da lugar a un
cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas marcadas
en el sustrato en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en
aceite y en disolución en gran cantidad.
Figura 18. Análisis de citometría de flujo de
muestras preparadas para el experimento de clasificación.
Figura 19. Clasificación por citometría de
flujo activada por fluorescencia de los elementos genéticos.
Panel A: muestras nº 1 a nº 4 antes de la
clasificación y después de la clasificación. Panel B: genes
recuperados de perlas individuales clasificadas de la muestra nº 3
clasificadas en una placa de 96 pocillos. Panel C: genes recuperados
de perlas individuales clasificadas de la muestra nº 4 clasificadas
en una placa de 96 pocillos. Los marcadores de ADN (M) son digesto
de \phiX 174-HaeIII.
Las microcápsulas de la presente invención
requieren propiedades físicas apropiadas para permitir el trabajo
de la invención. Primero, para garantizar que los elementos
genéticos y productos génicos no puedan difundir entre
microcápsulas, el contenido de cada microcápsula se aísla
preferentemente del contenido de las microcápsulas de alrededor, de
manera que no hay intercambio o poco de los elementos genéticos y
productos génicos entre las microcápsulas durante la escala de
tiempo del experimento.
Segundo, el procedimiento de la presente
descripción sólo requiere que haya un número limitado de elementos
genéticos por microcápsula. Esto garantiza que el producto génico de
un elemento genético individual se aislará de otros elementos
genéticos. Por tanto, el acoplamiento entre el elemento genético y
el producto génico será sumamente específico. El factor de
enriquecimiento es el mayor con, en promedio, uno o menos elementos
genéticos por microcápsula, siendo el enlace entre el ácido
nucleico y la actividad del producto génico codificado tan estrecho
como sea posible, ya que el producto génico de un elemento genético
individual se aislará de los productos de todos los otros elementos
genéticos. Sin embargo, aunque no se usa la situación teóricamente
óptima de, en promedio, un único elemento genético o menos por
microcápsula, una relación de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más elementos
genéticos por microcápsula puede resultar beneficiosa en la
clasificación de una gran biblioteca. Rondas de clasificación
posteriores, que incluyen nueva encapsulación con distribución de
elementos genéticos diferenciados, permitirán clasificar más
estrictamente los elementos genéticos. Preferentemente hay un único
elemento genético, o menos, por microcápsula.
Tercero, la formación y la composición de las
microcápsulas no suprime ventajosamente la función de la maquinaria
de la expresión de los elementos genéticos y la actividad de los
productos génicos.
El (Los) sistema(s) apropiado(s)
pueden variar dependiendo de la naturaleza precisa de los requisitos
en cada aplicación de la descripción, como será evidentes para el
experto.
Están disponibles una amplia variedad de
procedimientos de microencapsulación (véase Benita, 1996) y pueden
usarse para crear la microcápsula usada según la presente invención.
De hecho, en la bibliografía se han identificado más de 200
procedimientos de microencapsulación (Finch, 1993).
Éstos incluyen vesículas acuosas envueltas por
membranas tales como vesículas de lípidos (liposomas) (New, 1990) y
vesículas de tensioactivos no iónicos (van Hal y col., 1996). Éstas
son cápsulas membranosas cerradas de una o múltiples bicapas de
moléculas no covalentemente montadas, estando cada bicapa separada
de su vecina por un compartimento acuoso. En el caso de liposomas,
la membrana está compuesta de moléculas de lípidos; éstos son
normalmente fosfolípidos, pero en las membranas también pueden
incorporarse esteroles tales como colesterol (New, 1990). Dentro de
los liposomas puede realizarse una variedad de reacciones
bioquímicas catalizadas por enzimas que incluyen polimerización de
ARN y ADN, (Chakrabarti y col., 1994; Oberholzer y col., 1995a;
Oberholzer y col., 1995b; Walde y col., 1994; Wick y Luisi,
1996).
Con un sistema de vesículas envueltas por
membrana mucha de la fase acuosa está fuera de las vesículas y por
tanto no está compartimentada. Esta fase acuosa continua se elimina
o se inhiben o destruyen los sistemas biológicos en ella (por
ejemplo, por digestión de ácidos nucleicos con DNasa o RNasa) con el
fin de que las reacciones se limiten a las microcápsulas (Luisi y
col., 1987).
Las reacciones bioquímicas catalizadas por
enzimas también se han demostrado en microcápsulas generadas por
una variedad de otros procedimientos. Muchas enzimas son activas en
disoluciones micelares inversas (Bru y Walde, 1991; Bru y Walde,
1993; Creagh y col., 1993; Haber y col., 1993; Kumar y col., 1989;
Luisi y B., 1987; Mao y Walde, 1991; Mao y col., 1992; Perez y
col., 1992; Walde y col., 1994; Walde y col., 1993; Walde y col.,
1988) tales como el sistema
AOT-isooctano-agua (Menger y Yamada,
1979).
Las microcápsulas también se han generado por
polimerización interfacial y complejación interfacial (Whateley,
1996). Las microcápsulas de este tipo pueden tener membranas rígidas
impermeables o membranas semipermeables. Todas las microcápsulas
semipermeables rodeadas por membranas de nitrato de celulosa,
membranas de poliamida y membranas de
lípido-poliamida pueden soportar reacciones
bioquímicas, incluyendo sistemas multienzimáticos (Chang, 1987;
Chang, 1992; Lim, 1984). Las microcápsulas de alginato/polilisina
(Lim y Sun, 1980), que pueden formarse en condiciones muy suaves,
han resultado ser muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo,
un procedimiento eficaz para encapsular células y tejidos vivos
(Chang, 1992; Sun y col., 1992).
También pueden usarse los sistemas de
microencapsulación no membranosa basados en la división de fases de
un entorno acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.
Preferentemente, las microcápsulas de la
presente invención se forman a partir de emulsiones; sistemas
heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases
dispersa en la otra como gotitas de tamaño microscópico o coloidal
(Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
Las emulsiones pueden producirse a partir de
cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles.
Preferentemente, la emulsión de la presente invención tiene agua
(que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en
forma de gotitas finamente divididas (la fase dispersa, interna o
discontinua) y un líquido inmiscible hidrófobo (un aceite) como la
matriz en la que están suspendidas estas gotitas (la fase no
dispersa, continua o externa). Tales emulsiones se denominan
"agua en aceite" (W/O). Esto tiene la ventaja de que toda la
fase acuosa que contiene los componentes bioquímicos está
compartimentada en gotitas diferenciadas (la fase interna). La fase
externa, que es un aceite hidrófobo, no contiene generalmente
ninguno de los componentes bioquímicos y por tanto es inerte.
La emulsión puede estabilizarse mediante la
adición de uno o más agentes superficialmente activos
(tensioactivos). Estos tensioactivos se denominan agentes
emulsionantes y actúan en la interfase agua/aceite para evitar (o
al menos retrasar) la separación de las fases. Pueden usarse muchos
aceites y muchos emulsionantes para generar emulsiones agua en
aceite; una recopilación reciente enumeró más de 16.000
tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes
emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Aceites adecuados incluyen aceite
mineral blanco ligero y tensioactivos no iónicos (Schick, 1966)
tales como monooleato de sorbitán (Span^{TM}80; ICI) y monooleato
de polioxietilensorbitán (Tween^{TM}80; ICI).
También puede ser beneficioso el uso de
tensioactivos aniónicos. Tensioactivos adecuados incluyen colato
sódico y taurocolato sódico. Se prefiere particularmente
desoxicolato sódico, preferentemente a una concentración del 0,5%
p/v, o inferior. La inclusión de tales tensioactivos puede aumentar
en algunos casos la expresión de los elementos genéticos y/o la
actividad de los productos génicos. La adición de algunos
tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada
suprime completamente la traducción. Sin embargo, durante la
emulsión, el tensioactivo se transfiere de la fase acuosa a la
interfase y se restablece actividad. La adición de un tensioactivo
aniónico a las mezclas que van a emulsionarse garantiza que las
reacciones sólo avanzan después de la compartimentación.
La creación de una emulsión requiere
generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar juntas
las fases. Hay una variedad de modos para hacer esto que utilizan
una variedad de dispositivos mecánicos, que incluyen agitadores
(tales como barras de agitación magnéticas, agitadores de hélice y
de turbina, dispositivos de palas y batidoras), homogeneizadores
(que incluyen homogeneizadores rotor-estator,
homogeneizadores de válvula a alta presión y homogeneizadores de
chorro), molinos coloidales, dispositivos de emulsión por
ultrasonidos y de membrana (Becher, 1957; Dickinson, 1994).
Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones
agua en aceite son generalmente estables con pequeño, si hay,
intercambio de elementos genéticos o productos génicos entre
microcápsulas. Adicionalmente se ha demostrado que en las
microcápsulas de emulsión se producen varias reacciones bioquímicas.
Además, en las microcápsulas de emulsión también están activos
complicados procedimientos bioquímicos, en particular transcripción
y traducción génica. La tecnología existe para crear emulsiones con
volúmenes de hasta escalas industriales de miles de litros (Becher,
1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).
El tamaño de la microcápsula preferida variará
dependiendo de los requisitos precisos de cualquier procedimiento
de selección individual que vaya a realizarse según la presente
invención. En todos los casos habrá un equilibrio óptimo entre el
tamaño de la biblioteca génica, el enriquecimiento requerido y la
concentración requerida de componentes en las microcápsulas
individuales para lograr una expresión y reactividad eficaz de los
productos génicos. Los procedimientos de expresión se producen
dentro de cada microcápsula individual proporcionada por la
presente descripción. Tanto la transcripción in vitro como la
transcripción-traducción acoplada es menos eficaz a
concentraciones de ADN inferiores a nanomolar. Debido al requisito
de sólo un número limitado de moléculas de ADN que vayan a estar
presentes en cada microcápsula, esto fija por tanto un límite
superior práctico del posible tamaño de microcápsula.
Preferentemente, el volumen medio de las microcápsulas es inferior
a 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondiente a una microcápsula
esférica de diámetro inferior a 10 \mum), más preferentemente
inferior a 6,5 x 10^{-17} m^{3} (5 \mum de diámetro), más
preferentemente aproximadamente 4,2 x 10^{-18} m^{3} (2 \mum
de diámetro) e idealmente aproximadamente 9 x 10^{-18} m^{3}
(2,6 \mum de diámetro).
La concentración de ADN o ARN eficaz en las
microcápsulas puede aumentarse artificialmente por diversos
procedimientos que serán muy conocidos para aquellos versados en la
técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, la adición de productos
químicos de exclusión de volumen tales como polietilenglicoles (PEG)
y una variedad de técnicas de amplificación génica que incluyen
transcripción usando ARN polimerasas que incluyen aquellas de
bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y
Dahlberg, 1972; Roberts y col., 1975; Rosenberg y col., 1975), por
ejemplo eucariotas (Weil y col., 1979; Manley y col., 1983) y
bacteriófago tal como T7, T3 y SP6 (Melton y col., 1984); la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y col., 1988);
amplificación por Qb replicasa (Miele y col., 1983; Cahill y col.,
1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev y col., 1995); la reacción
en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren y col., 1988; Barany,
1991); y sistema de replicación de secuencia autosostenida (Fahy y
col., 1991) y amplificación por desplazamiento de cadenas (Walker y
col., 1992). Las técnicas de amplificación génica que requieren
ciclado térmico tal como PCR y LCR pueden usarse si las emulsiones y
la transcripción in vitro o los sistemas de
transcripción-traducción acoplada son termoestables
(por ejemplo, los sistemas de
transcripción-traducción acoplada pueden prepararse
a partir de un organismo termoestable tal como Thermus
aquaticus).
El aumento de la concentración de ácido nucleico
local eficaz permite que se usen eficazmente mayores microcápsulas.
Esto permite un límite superior práctico preferido para el volumen
de la microcápsula de aproximadamente 5,2 x 10^{-16} m^{3}
(correspondiente a una esfera de 10 \mum de diámetro).
El tamaño de la microcápsula es preferentemente
suficientemente grande para alojar todos los componentes requeridos
de las reacciones bioquímicas que necesitan producirse dentro de la
microcápsula. Por ejemplo, in vitro, tanto las reacciones de
transcripción como las reacciones de
transcripción-traducción acoplada requieren una
concentración de nucleósido-trifosfato total de
aproximadamente 2 mM.
Por ejemplo, con el fin de transcribir un gen a
una única molécula de ARN corta de 500 bases de longitud, esto
requeriría un mínimo de 500 moléculas de
nucleósido-trifosfato por microcápsula (8,33 x
10^{-22} moles). Con el fin de constituir una disolución 2 mM,
este número de moléculas está contenido dentro de una microcápsula
de volumen 4,17 x 10^{-19} litros (4,17 x 10^{-22} m^{3} que,
si es esférica, tendría un diámetro de 93 nm.
Además, particularmente en el caso de reacciones
que implican traducción, debe tenerse en cuenta que los ribosomas
necesarios para que se produzca la traducción son ellos mismos de
aproximadamente 20 nm de diámetro. Por tanto, el límite inferior
preferido para microcápsulas es un diámetro de aproximadamente 0,1
\mum (100 nm).
Por tanto, el volumen de la microcápsula es
preferentemente del orden de entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y 5,2 x
10^{-16} m^{3} correspondiente a una esfera de diámetro entre
0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de entre
aproximadamente 5,2 x 10^{-19} m^{3} y 6,5 x 10^{-17} m^{3}
(1 \mum y 5 \mum). Son más ventajosos los diámetros de esfera de
aproximadamente 2,6 \mum.
No es coincidencia que las dimensiones
preferidas de los compartimentos (gotitas de 2,6 \mum de diámetro
medio) se parezcan mucho a las de bacterias, por ejemplo,
Escherichia son bastones de 1,1-1,5 x
2,0-6,0 \mum y Azotobacter son células
ovoides de 1,5-2,0 \mum de diámetro. En su forma
más simple, la evolución de Darwin se basa en un mecanismo de 'un
genotipo un fenotipo'. La concentración de un único gen
compartimentado, o genoma, cae de 0,4 nM en un compartimento de 2
\mum de diámetro a 25 pM en un compartimento de 5 \mum de
diámetro. La maquinaria de transcripción/traducción procariota ha
evolucionado para funcionar en compartimentos de
\sim1-2 \mum de diámetro, en los que los genes
únicos están a concentraciones aproximadamente nanomolares. Un
único gen, en un compartimento de 2,6 \mum de diámetro, está a una
concentración de 0,2 nM. Esta concentración de gen es
suficientemente alta para la traducción eficaz. La compartimentación
en un volumen tal también garantiza que, aunque sólo se forme una
única molécula del producto génico, esté presente a aproximadamente
0,2 nM, que es importante si el producto génico va a tener una
actividad cambiante del propio elemento genético. Por tanto, el
volumen de la microcápsula se selecciona no sólo teniendo en cuenta
los requisitos de la transcripción y traducción del elemento
genético, sino también la actividad cambiante requerida del producto
génico en el procedimiento de la invención.
El tamaño de las microcápsulas de emulsión puede
variarse simplemente confeccionando las condiciones de emulsión
usadas para formar la emulsión según requisitos del sistema de
selección. Cuanto mayor sea el tamaño de la microcápsula, mayor es
el volumen que se requerirá para encapsular una biblioteca de
elementos genéticos dados, ya que el factor limitante será en
última instancia el tamaño de la microcápsula y, por tanto, el
número de microcápsulas posibles por unidad de volumen.
El tamaño de las microcápsulas se selecciona no
sólo teniendo en cuenta los requisitos del sistema de
transcripción/traducción, sino también aquellos del sistema de
selección empleado para el elemento genético. Por tanto, los
componentes del sistema de selección, tales como un sistema de
modificación química, pueden requerir volúmenes de reacción y/o
concentraciones de reactivo que no son óptimas para la
transcripción/traducción. Como se expone en este documento, tales
requisitos pueden satisfacerse mediante una etapa de reencapsulación
secundaria; además, pueden satisfacerse seleccionando el tamaño de
la microcápsula con el fin de maximizar la transcripción/traducción
y selección como un todo. Se prefiere la determinación empírica del
volumen óptimo de microcápsulas y la concentración de reactivo, por
ejemplo, como se expone en este documento.
Un "elemento genético" según la presente
invención es como se describe anteriormente. Preferentemente, un
elemento genético es una molécula o constructo seleccionado del
grupo que está constituido por una molécula de ADN, una molécula de
ARN, una molécula de ácido nucleico parcialmente o completamente
artificial compuesta por bases exclusivamente sintéticas o una
mezcla de bases de procedencia natural y sintéticas, uno cualquiera
de los anteriores ligado a un polipéptido y uno cualquiera de los
anteriores ligado a cualquier otro grupo o constructo molecular.
Ventajosamente, el otro grupo o constructo molecular puede
seleccionarse del grupo que está constituido por ácidos nucleicos,
sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo perlas
de poliestireno, y sustancias magnéticas o paramagnéticas tales como
perlas magnéticas o paramagnéticas.
La parte de ácido nucleico del elemento genético
puede comprender secuencias reguladoras adecuadas tales como
aquellas requeridas para la expresión eficaz del producto génico,
por ejemplo promotores, potenciadores, secuencias de iniciación de
la traducción, secuencias de poliadenilación, sitios de corte y
empalme y similares.
Como será aparente de lo siguiente, en muchos
casos el polipéptido u otro grupo o constructo molecular es un
ligando o un sustrato que directa o indirectamente se une a o
reacciona con el producto génico con el fin de alterar las
propiedades ópticas del elemento genético. Esto permite la
clasificación del elemento genético basándose en la actividad del
producto génico. El ligando o sustrato puede conectarse al ácido
nucleico mediante una variedad de medios que serán evidentes para
aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson,
1996).
Una ruta por la que la molécula de ácido
nucleico puede ligarse a un ligando o sustrato es mediante
biotinilación. Esto puede hacerse mediante amplificación por PCR
con un cebador de biotinilación en 5' de forma que la biotina y el
ácido nucleico estén covalentemente ligados.
El ligando o sustrato puede unirse al ácido
nucleico modificado mediante una variedad de medios que serán
evidentes para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo,
Hermanson, 1996). El ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a
una microperla de poliestireno o paramagnética (0,01 a aprox. 5,0
\mum de diámetro) que está recubierta con avidina o
estreptavidina, que por tanto unirá el ácido nucleico con afinidad
muy alta. Esta perla puede derivatizarse con sustrato o ligando
mediante cualquier procedimiento adecuado tal como añadiendo
sustrato biotinilado o mediante acoplamiento covalente.
Alternativamente, un ácido nucleico biotinilado
puede acoplarse a avidina o estreptavidina complejada con una gran
molécula de proteína tal como tiroglobulina (669 Kd) o ferritina
(440 Kd). Este complejo puede derivatizarse con sustrato o ligando,
por ejemplo mediante acoplamiento covalente al grupo
\varepsilon-amino de lisinas o mediante una
interacción no covalente tal como
biotina-avidina.
El sustrato puede estar presente en una forma no
ligada al elemento genético, pero que contiene una "marca"
inactiva que requiere otra etapa para activarla tal como
fotoactivación (por ejemplo de un análogo de biotina
"enjaulada", (Sundberg y col., 1995; Pirrung y Huang, 1996)).
Entonces, el catalizador que va a seleccionarse convierte el
sustrato en el producto. Entonces, la "marca" se activa y el
sustrato y/o producto "marcado" se une mediante una molécula
de unión a la marca (por ejemplo avidina o estreptavidina)
complejada con el ácido nucleico. Por tanto, la relación de
sustrato a producto unido al ácido nucleico mediante la "marca"
reflejará la relación del sustrato y producto en disolución.
Una alternativa es acoplar el ácido nucleico a
un anticuerpo específico del producto (u otra molécula específica
del producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los
sustratos) está presente en cada microcápsula sin ligar al elemento
genético, pero tiene una "marca" molecular (por ejemplo
biotina, DIG o DNP o un grupo fluorescente). Cuando el catalizador
que va a seleccionarse convierte el sustrato en el producto, el
producto conserva la "marca" y entonces se captura en la
microcápsula por el anticuerpo específico de producto. En esta
ruta, el elemento genético sólo se asocia con la "marca" cuando
codifica o produce una enzima que puede convertir el sustrato en
producto.
En este documento se usan los términos
"aislar", "clasificar" y "seleccionar", además de
variaciones de los mismos. Aislamiento se refiere al procedimiento
de separar una entidad de una población heterogénea, por ejemplo
una mezcla, de forma que esté libre de al menos una sustancia con la
que estaba asociada antes del procedimiento de aislamiento. En una
realización preferida, el aislamiento se refiere a la purificación
de una entidad esencialmente hasta la homogeneidad. La
clasificación de una entidad se refiere al procedimiento de aislar
preferencialmente entidades deseadas de entidades no deseadas. En
la medida en que esto se refiere al aislamiento de las entidades
deseadas, los términos "aislar" y "clasificar" son
equivalentes. El procedimiento de la presente invención permite la
clasificación de elementos genéticos deseados de reuniones
(bibliotecas o repertorios) de elementos genéticos que contienen el
elemento genético deseado. Seleccionar se usa para referirse al
procedimiento (que incluye el procedimiento de clasificación) de
aislar una entidad según una propiedad particular de la misma. En
una aplicación sumamente preferida, el procedimiento de la presente
descripción es útil para clasificar bibliotecas de elementos
genéticos. Según la descripción se proporciona un procedimiento
según aspectos precedentes de la descripción en el que los
elementos genéticos se aíslan de una biblioteca de elementos
genéticos que codifican un repertorio de productos génicos. En este
documento, los términos "biblioteca", "repertorio" y
"reunión" se usan según su significado común en la técnica, de
forma que una biblioteca de elementos genéticos codifica un
repertorio de productos génicos. En general, las bibliotecas están
construidas de reuniones de elementos genéticos y tienen propiedades
que facilitan la clasificación.
La selección inicial de un elemento genético de
una biblioteca de elementos genéticos usando la presente descripción
requerirá en la mayoría de los casos la selección de un gran número
de elementos genéticos variantes. Las bibliotecas de elementos
genéticos pueden crearse en una variedad de formas diferentes, que
incluyen las siguientes.
Las reuniones de elementos genéticos de
procedencia natural pueden clonarse de ADN genómico o ADNc (Sambrook
y col., 1989); por ejemplo, bibliotecas de anticuerpo en fagos
preparadas por repertorios de amplificación por PCR de genes de
anticuerpos de donantes inmunizados o no inmunizados han resultado
fuentes muy eficaces de fragmentos de anticuerpos funcionales
(Winter y col., 1994; Hoogenboom, 1997). La bibliotecas de genes
también pueden prepararse codificando todos (véase por ejemplo
Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de genes (véase, por
ejemplo, Lowman y col., 1991) o reuniones de genes (véase, por
ejemplo, Nissim y col., 1994) mediante un oligonucleótido aleatorio
o sintético dopado. Las bibliotecas también pueden prepararse
introduciendo mutaciones en un elemento genético o reunión de
elementos genéticos "aleatoriamente" mediante una variedad de
técnicas in vivo, que incluyen; usar cepas mutantes de
bacterias tales como mutD5 de E. coli (Liao y col., 1986;
Yamagishi y col., 1990; Low y col., 1996); usar el sistema de
hipermutación de anticuerpos de linfocitos B (Yelamos y col.,
1995). Las mutaciones aleatorias también pueden introducirse tanto
in vivo como in vitro por mutágenos químicos y
radiación de ionización o UV (véase Friedberg y col., 1995) o
incorporando análogos de base mutagénica (Freese, 1959; Zaccolo y
col., 1996). Las mutaciones aleatorias también pueden introducirse
en genes in vitro durando la polimerización, por ejemplo,
usando polimerasas propensas a errores (Leung y col., 1989). Puede
introducirse más diversificación usando recombinación de homólogos
tanto in vivo (véase Kowalczykowski y col., 1994) como in
vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).
Por tanto, según otro aspecto de la presente
descripción se proporciona un procedimiento de evolución in
vitro que comprende las etapas de:
- (a)
- seleccionar uno o más elementos genéticos de una biblioteca de elementos genéticos según la presente descripción;
- (b)
- mutar el (los) elemento(s) genético(s) seleccionado(s) con el fin de generar otra biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio para dar productos génicos; y
- (c)
- repetir iterativamente las etapas (a) y (b) con el fin e obtener un producto génico con actividad mejorada.
Las mutaciones pueden introducirse en el (los)
elemento(s) genéticos(s) como se exponen
anteriormente.
Los elementos genéticos según la descripción
codifican ventajosamente enzimas, preferentemente de interés
farmacológico o industrial, activadores o inhibidores, especialmente
de sistemas biológicos tales como mecanismos de transducción de
señales celulares, anticuerpos y fragmentos de los mismos y otros
aglutinantes (por ejemplo factores de transcripción) adecuados para
aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Por tanto, en un aspecto
preferido, la descripción permite la identificación y el aislamiento
de productos clínica o industrialmente útiles. En otro aspecto de
la descripción se proporciona un producto cuando se aísla por el
procedimiento de la descripción.
Se desea la selección de condiciones de
encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y tamaño de
la biblioteca que va a seleccionarse puede ser beneficioso ajustar
el procedimiento de encapsulación tal que por microcápsula se
encapsule 1 o menos de 1 elemento genético. Esto proporcionará el
mayor poder de resolución. Sin embargo, si la biblioteca es mayor
y/o más compleja, esto puede ser imposible de llevar a cabo; puede
preferirse encapsular varios elementos genéticos juntos y basarse en
la aplicación repetida del procedimiento de la descripción para
lograr la clasificación de la actividad deseada. La combinación de
procedimientos de encapsulación puede usarse para obtener el
enriquecimiento deseado.
Estudios teóricos indican que cuanto mayor sea
el número de variantes de elementos genéticos creados, más probable
es que una molécula se cree con las propiedades deseadas (véase
Perelson y Oster, 1979, para una descripción de cómo esto se aplica
a repertorios de anticuerpos). Recientemente se ha confirmado
prácticamente que, de hecho, repertorios de anticuerpos en fago
mayores dan lugar a más anticuerpos con mejores afinidades de unión
que repertorios más pequeños (Griffiths y col., 1994). Para
garantizar que se generan variantes raras y, por tanto, pueden
seleccionarse, se desea un tamaño de biblioteca mayor. Por tanto, es
beneficioso el uso de microcápsulas óptimamente pequeñas.
El mayor repertorio creado hasta la fecha usando
procedimientos que requieren una etapa in vivo (expresión en
fagos y sistemas LacI) ha sido una biblioteca de péptidos en fago de
1,6 x 10^{11} clones que requiere la fermentación de 15 litros de
bacterias (Fisch y col., 1996). Los experimentos de SELEX se llevan
a cabo frecuentemente en números de variantes muy grandes (hasta
10^{15}).
Usando la presente descripción, a un diámetro de
microcápsula preferido de 2,6 \mum, puede seleccionarse un tamaño
de repertorio de al menos 10^{11} usando 1 ml de fase acuosa en
una emulsión de 20 ml.
Además de los elementos genéticos descritos
anteriormente, las microcápsulas según la descripción comprenderán
otros componentes requeridos para que tenga lugar el procedimiento
de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán, por
ejemplo, aquellos necesarios para la transcripción y/o traducción
del elemento genético. Éstos se seleccionan de los requisitos de un
sistema específico de los siguientes; un tampón adecuado, un
sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema
de traducción in vitro que contiene todos los componentes
necesarios, enzimas y cofactores, ARN polimerasa, nucleótidos,
ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARN de transferencia,
ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés
con el fin de permitir la selección del producto génico
modificado.
Un tampón adecuado será uno en el que todos los
componentes deseados del sistema biológico son activos y, por
tanto, dependen de los requisitos de cada sistema de reacción
específico. Tampones adecuados para reacciones biológicas y/o
químicas se conocen en la técnica y las fórmulas se proporcionan en
diversos textos de laboratorio, tales como Sambrook y col.,
1989.
El sistema de traducción in vitro
comprenderá normalmente un extracto de células, normalmente de
bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley y col., 1991; Lesley,
1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976) o germen de
trigo (Anderson y col., 1983). Muchos sistemas adecuados están
comercialmente disponibles (por ejemplo de Promega), incluyendo
algunos que permitirán transcripción/traducción acoplada (todos los
sistemas bacterianos y los sistemas de reticulocito y de extracto
de germen de trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de aminoácidos
usados puede incluir, si se desea, aminoácidos sintéticos para
aumentar el número posible o variedad de proteínas producidas en la
biblioteca. Esto puede llevarse a cabo cargando ARNt con aminoácidos
artificiales y usando estos ARNt para la traducción in vitro
de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman y col., 1991;
Benner, 1994; Mendel
y col., 1995).
y col., 1995).
Después de cada ronda de selección, el
enriquecimiento de la reunión de elementos genéticos de aquellos que
codifican las moléculas de interés puede ensayarse mediante
reacciones de transcripción/replicación in vitro no
compartimentada o de transcripción-traducción
acopladas. La reunión seleccionada se clona en un vector de
plásmido adecuado y el ARN o la proteína recombinante se producen a
partir de los clones individuales para más purificación y
ensayo.
En un aspecto preferido, el entorno interno de
una microcápsula puede alterarse mediante la adición de reactivos a
la fase aceitosa de la emulsión. Los reactivos difunden a través de
la fase aceitosa hacia el entorno de la microcápsula acuosa.
Preferentemente, los reactivos son al menos parcialmente solubles en
agua, de forma que una proporción de los mismos se distribuye de la
fase aceitosa al entorno de la microcápsula acuosa. Ventajosamente,
los reactivos son sustancialmente insolubles en la fase aceitosa.
Los reactivos se mezclan preferentemente en la fase aceitosa
mediante mezclado mecánico, por ejemplo removiendo.
Los reactivos que pueden añadirse mediante la
fase aceitosa incluyen sustratos, componentes de tamponamiento,
factores y similares. En particular, el pH interno de microcápsulas
puede alterarse in situ añadiendo componentes ácidos o
básicos a la fase aceitosa.
La descripción se refiere además a un
procedimiento para producir un producto génico, una vez que un
elemento genético que codifica el producto génico se ha clasificado
mediante el procedimiento de la descripción. Claramente, el propio
elemento genético puede expresarse directamente mediante medios
convencionales para producir el producto génico. Sin embargo,
pueden emplearse técnicas alternativas, como serán evidentes para
aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la información
genética incorporada en el producto génico puede incorporarse en un
vector de expresión adecuado y expresarse del mismo.
La descripción también describe el uso de
técnicas de selección convencionales para identificar compuestos
que pueden interactuar con los productos génicos identificados por
el primer aspecto de la descripción. En realizaciones preferidas,
el producto génico que codifica ácido nucleico se incorpora en un
vector y se introduce en células huésped adecuadas para producir
líneas celulares transformadas que expresan el producto génico.
Entonces, las líneas celulares resultantes pueden producirse para
análisis cualitativos y/o cuantitativos reproducibles del (de los)
efecto(s) de fármacos potenciales que afectan la función del
producto génico. Por tanto, las células que expresan el producto
génico pueden emplearse para la identificación de compuestos,
particularmente compuestos de peso molecular pequeño, que modulan la
función del producto génico. Por tanto, las células huésped que
expresan el producto génico son útiles para la selección de fármacos
y es otro objeto de la presente descripción para proporcionar un
procedimiento para identificar compuestos que modulan la actividad
del producto génico, comprendiendo dicho procedimiento exponer
células que contienen producto génico que codifica ADN heterólogo,
en el que dichas células producen producto génico funcional, a al
menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal cuya capacidad
para modular la actividad de dicho producto génico se busca para ser
determinada y a partir de entonces monitorizar dichas células para
cambios producidos por dicha modulación. Un ensayo tal permite la
identificación de moduladores tales como agonistas, antagonistas y
moduladores alostéricos del producto génico. Como se usa en este
documento, un compuesto o señal que modula la actividad del producto
génico se refiere a un compuesto que altera la actividad del
producto génico de un modo tal que la actividad del producto génico
es diferente en presencia del compuesto o señal (con respecto a la
ausencia de dicho compuesto o señal).
Los ensayos de selección basados en células
pueden diseñarse construyendo líneas celulares en las que la
expresión de una proteína indicadora, es decir, una proteína
fácilmente ensayable, tal como
\beta-galactosidasa, cloranfenicol
acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP) o
luciferasa, depende del producto génico. Un ensayo tal permite la
detección de compuestos que modulan directamente la función del
producto génico tales como compuestos que antagonizan producto
génico, o compuestos que inhiben o potencian otras funciones
celulares requeridas para la actividad del producto génico.
La presente descripción también proporciona un
procedimiento para afectar exógenamente procedimientos dependientes
de productos génicos que se producen en células. Las células huésped
que producen producto génico recombinante, por ejemplo células de
mamíferos, pueden ponerse en contacto con un compuesto de prueba y
entonces el (los) efecto(s) modulador(es) del mismo
puede(n) evaluarse comparando la respuesta mediada por el
producto génico en presencia y ausencia del compuesto de prueba, o
refiriendo la respuesta mediada por el producto génico de células
de prueba o células de control (es decir, células que no expresan
producto génico) a la presencia del compuesto.
En otro aspecto, la descripción se refiere a un
procedimiento para optimizar un procedimiento de producción que
implica al menos una etapa que se facilita por un polipéptido. Por
ejemplo, la etapa puede ser una etapa catalítica que se facilita
por una enzima. Por tanto, la descripción proporciona un
procedimiento para preparar un compuesto o compuestos que comprenden
las etapas de:
- (a)
- proporcionar un protocolo de síntesis en el que al menos una etapa se facilita por un polipéptido;
- (b)
- preparar elementos genéticos que codifican variantes del polipéptido que facilita esta etapa cuya expresión puede dar como resultado, directamente o indirectamente, la modificación de las propiedades ópticas de los elementos genéticos;
- (c)
- compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;
- (d)
- expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;
- (e)
- clasificar los elementos genéticos que producen producto(s) génico(s) de polipéptido(s) que tienen la actividad deseada usando las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos; y
- (f)
- preparar el compuesto o compuestos usando el producto génico de polipéptidos identificado en (g) para facilitar la etapa relevante de la síntesis.
Por medio de la descripción, las enzimas
implicadas en la preparación de un compuesto pueden optimizarse
mediante selección de la óptima actividad. El procedimiento implica
la preparación de variantes del polipéptido que va a seleccionarse,
que se corresponden con una biblioteca de polipéptidos como se hace
referencia en este documento. Las variantes pueden prepararse del
mismo modo que las bibliotecas tratadas en otra parte en este
documento.
El sistema puede configurarse para seleccionar
ARN, ADN o moléculas de producto génico de proteínas con actividad
catalítica, reguladora o de unión.
En el caso de selección de un producto génico
con afinidad por un ligando específico, el elemento genético puede
ligarse al producto génico en la microcápsula mediante el ligando.
Por tanto, sólo los productos génicos con afinidad por el ligando
se unirán al elemento genético y sólo aquellos elementos genéticos
con producto génico unido mediante el ligando adquirirán las
propiedades ópticas cambiadas que les permiten ser retenidos en la
etapa de selección. Por tanto, en esta realización, el elemento
genético comprenderá un ácido nucleico que codifica el producto
génico ligado a un ligando para el producto génico.
El cambio en las propiedades ópticas del
elemento genético después de la unión del producto génico al ligando
pueden inducirse en una variedad de formas, que incluyen:
(1) el propio producto génico puede tener
propiedades ópticas distintivas, por ejemplo, es fluorescente (por
ejemplo proteína verde fluorescente, (Lorenz y col., 1991)).
(2) las propiedades ópticas del producto génico
pueden modificarse con la unión al ligando, por ejemplo, la
fluorescencia del producto génico se inactiva o mejora con la unión
(Guixe y col., 1998; Qi y Grabowski, 1998).
(3) las propiedades ópticas del ligando pueden
modificarse con la unión del producto génico, por ejemplo, la
fluorescencia del ligando se inactiva o mejora con la unión (Voss,
1993; Masui y Kuramitsu, 1998).
(4) las propiedades ópticas de tanto el ligando
como el producto génico se modifican con la unión, por ejemplo,
puede haber una transferencia de energía por resonancia de
fluorescencia (FRET) del ligando al producto génico (o viceversa)
dando como resultado la emisión a la longitud de onda de emisión del
"receptor" cuando la excitación es a la longitud de onda de
absorción del "donante" (Heim y Tsien, 1996; Mahajan y col.,
1998; Miyawaki y col., 1997).
En esta realización, para unir el producto
génico al elemento genético mediante el ligando no es necesario
inducir directamente un cambio en las propiedades ópticas. Todos los
productos génicos que van a seleccionarse pueden contener un
dominio de unión putativo que es el que va a seleccionarse, y un
característica común - una marca. El elemento genético en cada
microcápsula está ligado físicamente al ligando. Si el producto
génico producido a partir del elemento genético tiene afinidad por
el ligando, se unirá a él y estarán físicamente ligados al mismo
elemento genético que lo codifica, dando como resultado que el
elemento genético está "marcado". Al final de la reacción,
todas las microcápsulas se combinan y todos los elementos genéticos
y productos génicos se reúnen juntos en un entorno. Elementos
genéticos que codifican productos génicos que presentan la unión
deseada pueden seleccionarse añadiendo reactivos que se unen
específicamente a o reaccionan específicamente con la "marca"
y así inducen un cambio en las propiedades ópticas del elemento
genético permitiendo su clasificación. Por ejemplo, puede usarse un
anticuerpo anti-"marca" marcado fluorescentemente, o un
anticuerpo anti-"marca" seguido por un segundo anticuerpo
marcado fluorescentemente que se une al primero.
En una realización alternativa, los elementos
genéticos pueden clasificarse basándose en que el producto génico,
que se une al ligando, simplemente esconde el ligando de, por
ejemplo, otros componentes de unión que de otra manera modificarían
las propiedades ópticas del elemento genético. En este caso se
seleccionarían elementos genéticos con propiedades ópticas sin
modificar.
En una realización alternativa, la descripción
proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la
descripción en el que en la etapa (b) los productos génicos se unen
a elementos genéticos que los codifican. Entonces, los productos
génicos junto con los elementos genéticos unidos se clasifican como
resultado de la unión de un ligando a productos génicos que tienen
la actividad de unión deseada. Por ejemplo, todos los productos
génicos pueden contener una región invariable que se une
covalentemente o no covalentemente al elemento genético, y una
segunda región que está diversificada de manera que genera la
actividad de unión deseada. En una realización alternativa, el
propio ligando para el producto génico está codificado por el
elemento genético y se une al elemento genético. Dicho de otro
modo, el elemento genético codifica dos (o de hecho más) productos
génicos, al menos uno de los cuales se une al elemento genético, y
que puede unirse potencialmente entre sí. Sólo cuando los productos
génicos interactúan en una microcápsula se modifica el elemento
genético de un modo que en última instancia da como resultado un
cambio en un cambio en sus propiedades ópticas que permite que se
clasifique. Esta realización se usa, por ejemplo, para buscar
bibliotecas génicas de pares de genes que codifican pares de
proteínas que se unen entre sí.
La fluorescencia puede mejorarse mediante el uso
de amplificación de señales de tiramida (TSA^{TM}) para hacer
fluorescentes los elementos genéticos. Esto implica la unión de
peroxidasa (ligada a otra proteína) a los elementos genéticos y
catalización de la conversión de
fluoresceína-tiramina en una forma de radical libre
que entonces reacciona (localmente) con los elementos genéticos. Los
procedimientos para realizar TSA se conocen en la técnica y
comercialmente están disponibles kits de NEN.
TSA puede configurarse de forma que dé como
resultado un aumento directo en la fluorescencia del elemento
genético, o de forma que un ligando esté unido al elemento genético
que está unido mediante una segunda molécula fluorescente, o una
secuencia de moléculas, siendo una o más fluorescentes.
Cuando la selección es para catálisis, el
elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato
de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico
que puede actuar como un catalizador, el producto génico catalizará
la conversión del sustrato en el producto. Por tanto, al final de la
reacción, el elemento genético está ligado físicamente al producto
de la reacción catalizada.
También puede desearse, en algunos casos, que el
sustrato no sea un componente del elemento genético. En este caso
el sustrato contendría una "marca" inactiva que requiere otra
etapa para activarla tal como fotoactivación (por ejemplo de un
análogo de biotina "enjaulado", (Sundberg y col., 1995; Pirrung
y Huang, 1996)). Entonces, el catalizador que va a seleccionarse
convierte el sustrato en el producto. Entonces, la "marca" se
activa y el sustrato "marcado" y/o producto unido mediante una
molécula de unión de marca (por ejemplo avidina o estreptavidina)
se compleja con el ácido nucleico. Por tanto, la relación de
sustrato a producto unido al ácido nucleico mediante la
"marca" reflejará la relación de sustrato y producto en
disolución.
Las propiedades ópticas de elementos genéticos
con producto unido y que codifican productos génicos con la
actividad catalítica deseada pueden modificarse mediante:
- (1)
- el complejo producto-elemento genético que tiene propiedades ópticas características no encontradas en el complejo sustrato-elemento genético debido a, por ejemplo;
- (a)
- el sustrato y el producto tienen diferentes propiedades ópticas (muchos sustratos de enzimas fluorogénicas están comercialmente disponibles (véase, por ejemplo, Haugland, 1996), incluyendo sustratos para glicosidasas, fosfatasas, peptidasas y proteasas (Craig y col., 1995; Huang y col., 1992; Brynes y col., 1982; Jones y col., 1997; Matayoshi y col., 1990; Wang y col., 1990)), o
- (b)
- el sustrato y el producto tienen propiedades ópticas similares, pero sólo el producto, y no el sustrato, se une a o reacciona con el elemento genético;
- (2)
- adición de reactivos que se unen específicamente a o reaccionan con el producto y así se induce un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos permitiéndose su clasificación (estos reactivos pueden añadirse antes o después de romper las microcápsulas y reunir los elementos genéticos). Los reactivos:
- (a)
- se unen específicamente a o reaccionan específicamente con el producto, y no el sustrato, si tanto el sustrato como el producto están unidos al elemento genético, u
- (b)
- opcionalmente se unen tanto al sustrato como al producto si solo el producto, y no el sustrato, se une a o reacciona con el elemento genético.
Entonces, los elementos genéticos reunidos que
codifican moléculas catalíticas pueden enriquecerse mediante la
selección de los elementos genéticos con propiedades ópticas
modificadas.
Una alternativa es acoplar el ácido nucleico a
un anticuerpo específico de producto (u otra molécula específica de
producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los sustratos)
está presente en cada microcápsula sin ligarse al elemento
genético, pero tiene una "marca" molecular (por ejemplo
biotina, DIG o DNP o un grupo fluorescente). Si el catalizador que
va a seleccionarse convierte el sustrato en producto, el producto
conserva la "marca" y entonces se captura en la microcápsula
por el anticuerpo específico de producto. De este modo, el elemento
genético sólo se asocia con la "marca" cuando codifica o
produce una enzima que puede convertir sustrato en producto. Cuando
se detienen todas las reacciones y las microcápsulas se combinan,
los elementos genéticos que codifican enzimas activas estarán
"marcados" y puede que ya se hayan cambiado las propiedades
ópticas, por ejemplo, si la "marca" era un grupo fluorescente.
Alternativamente, un cambio en las propiedades ópticas de genes
"marcados" puede inducirse mediante la adición de un ligando
marcado fluorescentemente que se una a la "marca" (por ejemplo
avidina/estreptavidina marcada fluorescentemente, un anticuerpo
anti-"marca" que es fluorescente o un anticuerpo
anti-"marca" no fluorescente que puede detectarse mediante un
segundo anticuerpo marcado fluorescentemente).
Alternativamente, la selección puede realizarse
indirectamente mediante acoplamiento de una primera reacción a
reacciones posteriores que tienen lugar en la misma microcápsula.
Hay dos rutas generales por las que puede realizarse esto. En una
primera realización, el producto de la primera reacción se hace
reaccionar con, o se une por, una molécula que no reacciona con el
sustrato de la primera reacción. Una segunda reacción acoplada sólo
avanzará en presencia del producto de la primera reacción. Entonces
puede utilizarse un elemento genético que codifica un producto
génico con una actividad deseada usando las propiedades del producto
de la segunda reacción para inducir un cambio en las propiedades
ópticas del elemento genético como anteriormente.
Alternativamente, el producto de la reacción que
va a seleccionarse puede ser el sustrato o cofactor para una
segunda reacción catalizada por enzimas. La enzima para catalizar la
segunda reacción puede o traducirse in situ en las
microcápsulas o incorporarse en la mezcla de reacción antes de la
microencapsulación. Sólo cuando avance la primera reacción, la
enzima acoplada generará un producto que pueda usarse para inducir
un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético como
anteriormente.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Este concepto de acoplamiento puede elaborarse
para incorporar múltiple enzimas, usando cada una como sustrato el
producto de la reacción previa. Esto permite seleccionar enzimas que
no reaccionarán con un sustrato inmovilizado. También puede
diseñarse para proporcionar sensibilidad aumentada mediante la
amplificación de señales si un producto de una reacción es un
catalizador o un cofactor para una segunda reacción o serie de
reacciones que conducen a un producto seleccionable (por ejemplo,
véase Johannsson y Bates, 1988; Johannsson, 1991). Además, un
sistema en cascada de enzimas puede basarse en la producción de un
activador para una enzima o la destrucción de un inhibidor de
enzimas (véase Mize y col., 1989). El acoplamiento también tiene la
ventaja de que puede usarse un sistema de selección común para un
grupo completo de enzimas que generan el mismo producto y permite
la selección de transformaciones químicas complicadas que no pueden
realizarse en una única etapa.
Por tanto, un procedimiento tal de acoplamiento
permite la evolución de "vías metabólicas" novedosas in
vitro de un modo escalonado seleccionando y mejorando primero
una etapa y luego la siguiente. La estrategia de selección se basa
en el producto final de la vía, de manera que todas las etapas
tempranas pueden desarrollarse independientemente o secuencialmente
sin establecer un nuevo sistema de selección para cada etapa de la
reacción.
Expresado de un modo alternativo, se proporciona
un procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos que
codifican un producto génico que tiene una actividad catalítica
deseada, que comprende las etapas de:
- (1)
- expresar elementos genéticos para dar sus productos génicos respectivos;
- (2)
- permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato a un producto, que puede o puede no seleccionarse directamente, según la actividad deseada;
- (3)
- opcionalmente acoplar la primera reacción a una o más reacciones posteriores, estando modulada cada reacción por el producto de las reacciones previas, y conducir a la creación de un producto final seleccionable;
- (4)
- ligar el producto de catálisis seleccionable a los elementos genéticos mediante:
- a)
- acoplamiento de un sustrato a los elementos genéticos de un modo tal que el producto permanezca asociado con los elementos genéticos, o
- b)
- reacción o unión del producto seleccionable a los elementos genéticos mediante una "marca" molecular adecuada unida al sustrato que permanece en el producto, o
- c)
- acoplamiento del producto seleccionable (pero no el sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o interacción con el producto; y
- (5)
- seleccionar el producto de catálisis, junto con el elemento genético al que está unido, o por medio de sus propiedades ópticas características o mediante la adición de reactivos que se unen específicamente a o reaccionan específicamente con el producto y que así inducen un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos, en el que en las etapas (1) a (4) cada elemento genético y producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.
Los elementos genéticos que codifican enzimas
con especificidad o selectividad de sustrato pueden enriquecerse
específicamente llevando a cabo una selección positiva de la
reacción con un sustrato y una selección negativa de la reacción
con otro sustrato. Tal presión de la selección positiva y negativa
combinada debe ser de gran importancia en el aislamiento de enzimas
regioselectivas y estereoselectivas (por ejemplo, enzimas que pueden
distinguir entre dos enantiómeros del mismo sustrato). Por ejemplo,
dos sustratos (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) están cada
uno marcado con marcas diferentes (por ejemplo dos fluoróforos
diferentes) de forma que las marcas se unen al elemento genético
mediante la reacción catalizada por enzimas. Si las dos marcas
confieren propiedades ópticas diferentes en el elemento genético, la
especificidad del sustrato de la enzima puede determinarse a partir
de las propiedades ópticas del elemento genético y rechazarse
aquellos elementos genéticos que codifican productos génicos con
especificidad errónea (o sin especificidad). También pueden usarse
marcas que no confieran cambio en la actividad óptica si se añaden
ligandos específicos de marca con diferentes propiedades ópticas
(por ejemplo anticuerpos específicos de marca marcados con
diferentes fluoróforos).
Puede usarse un sistema similar para seleccionar
propiedades reguladoras de enzimas.
En el caso de la selección de una molécula
reguladora que actúa como un activador o inhibidor de un
procedimiento bioquímico, los componentes del procedimiento
bioquímico pueden o traducirse in situ en cada microcápsula
o pueden incorporarse en la mezcla de reacción antes de la
microencapsulación. Si el elemento genético que va a seleccionarse
es para codificar un activador, la selección puede realizarse para
el producto de la reacción regulada como se describe anteriormente
a propósito de la catálisis. Si se desea un inhibidor, la selección
puede ser para una propiedad química específica para el sustrato de
la reacción regulada.
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Por tanto, se proporciona un procedimiento para
clasificar uno o más elementos genéticos que codifican para un
producto génico que presenta una actividad reguladora deseada, que
comprende las etapas de:
- (1)
- expresar elementos genéticos para dar sus productos génicos respectivos;
- (2)
- permitir que los productos génicos activen o inhiban una reacción bioquímica o secuencia de reacciones acopladas, según la actividad deseada, de tal modo que se permita la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;
- (3)
- ligar la molécula seleccionable a los elementos genéticos bien
- a)
- teniendo la molécula seleccionable, o el sustrato del que se deriva, unido a los elementos genéticos, o bien
- b)
- haciendo reaccionar o uniendo el producto seleccionable a los elementos genéticos mediante un "marca" molecular adecuada unida al sustrato que permanece en el producto, o bien
- c)
- acoplando el producto de catálisis (pero no el sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o interacción con el producto;
- (4)
- seleccionar el producto seleccionable, junto con el elemento genético al que está unido, o por medio de sus propiedades ópticas características o mediante la adición de reactivos que se unen específicamente a o reaccionan específicamente con el producto y que así inducen un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos, en el que en las etapas (1) a (3) cada elemento genético y producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.
\vskip1.000000\baselineskip
Es posible seleccionar propiedades ópticas
inherentes de productos génicos si, en las microcápsulas, el
producto génico se une de nuevo al elemento genético, por ejemplo,
mediante un elemento común del producto génico que se une a un
ligando que es parte del elemento genético. Entonces, después de
reunir los elementos genéticos pueden clasificarse usando las
propiedades ópticas de los productos génicos unidos. Esta
realización puede usarse, por ejemplo, para seleccionar variantes
de proteína verde fluorescente (GFP) (Cormack y col., 1996;
Delagrave y col., 1995; Ehrig y col., 1995) con fluorescencia
mejorada y/o espectros de absorción y emisión novedosos.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida de la descripción
los elementos genéticos se clasificarán por citometría de flujo.
Puede usarse una variedad de propiedades ópticas para provocar la
clasificación, incluyendo dispersión de la luz (Kerker, 1983) y
polarización de fluorescencia (Rolland y col., 1985). En una
realización sumamente preferida, la diferencia en las propiedades
ópticas de los elementos genéticos será una diferencia en la
fluorescencia y los elementos genéticos se clasificarán usando un
clasificador de células activado por fluorescencia (Norman, 1980;
Mackenzie y Pinder, 1986) o dispositivo similar. En una realización
especialmente preferida, el elemento genético comprende una
microperla no magnética (por ejemplo poliestireno) o paramagnética
no fluorescente (véase Fomusek y Vetvicka, 1986), óptimamente de
0,6 a 1,0 \mum de diámetro, a la que están unidas tanto los genes
como los grupos implicados en la generación de una señal
fluorescente:
- (1)
- el equipo de clasificación de células activada por fluorescencia comercialmente disponible de fabricantes establecidos (por ejemplo Becton- Dickinson, Coulter) permite la clasificación de hasta 10^{8} elementos genéticos (acontecimientos) por hora;
- (2)
- la señal de fluorescencia de cada perla se corresponde rigurosamente con el número de moléculas fluorescentes unidas a la perla. Actualmente tan sólo pueden detectarse cuantitativamente uno pocos cientos de moléculas fluorescentes por partícula;
- (3)
- el amplio intervalo dinámico de los detectores de fluorescencia (normalmente 4 unidades logarítmicas) permite establecer fácilmente el rigor del procedimiento de clasificación, permitiéndose así la recuperación de números óptimos de elementos genéticos de la reunión de partida (las puertas pueden establecerse para separar perlas con pequeñas diferencias en fluorescencia o sólo para separar perlas con grandes diferencias en fluorescencia, dependiendo de la selección que se realice;
- (4)
- el equipo de clasificación de células activada por fluorescencia comercialmente disponible puede realizar la excitación simultánea a hasta dos longitudes de onda diferentes y detectar fluorescencia a hasta cuatro longitudes de onda diferentes (Shapiro, 1983) permitiendo que se realicen simultáneamente selecciones positivas y negativas mediante la monitorización del marcado del elemento genético con dos (o más) marcadores fluorescentes diferentes, por ejemplo, si se marcan dos sustratos alternativos para una enzima (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) con diferentes marcas fluorescentes, el elemento genético puede marcarse con diferentes fluoróforos dependiendo del sustrato usado y sólo se seleccionan los genes que codifican enzimas con enantioselectividad.
- (5)
- las micropartículas (perlas) no magnéticas y paramagnéticas derivatizadas de manera sumamente uniforme y no derivatizadas están comercialmente disponibles de muchas fuentes (por ejemplo Sigma y Molecular Probes) (Fornusek y Vetvicka, 1986).
También se apreciará que según la presente
descripción no es necesario para todos los procedimientos de
transcripción/replicación y/o traducción y selección avanzar en una
única etapa, teniendo lugar todas las reacciones en una
microcápsula. El procedimiento de selección puede comprender dos o
más etapas. Primera, la transcripción/replicación y/o traducción de
cada elemento genético de una biblioteca de elementos genéticos
puede tener lugar en una primera microcápsula. Entonces, cada
producto génico se liga al elemento genético que lo codifica (que
reside en la misma microcápsula), por ejemplo, mediante un ligando
específico de producto génico tal como un anticuerpo. Entonces las
microcápsulas se rompen y los elementos genéticos unidos a sus
productos génicos respectivos se purifican opcionalmente.
Alternativamente, los elementos genéticos pueden unirse a sus
productos génicos respectivos usando procedimientos que no se basan
en la encapsulación. Por ejemplo, expresión en fagos (Smith,
G.P.,1985), expresión en polisoma (Mattheakkis y col., 1994), fusión
de ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997) o fusión de
péptidos del represor lac (Cull y col., 1992).
En la segunda etapa del procedimiento, cada
elemento genético purificado unido a su producto génico se pone en
una segunda microcápsula que contiene componentes de la reacción que
van a seleccionarse. Entonces se inicia esta reacción. Después de
completarse las reacciones, las microcápsulas se rompen de nuevo y
se seleccionan los elementos genéticos modificados. En el caso de
reacciones de múltiples etapas complicadas en las que participan
muchos componentes individuales y etapas de reacción pueden
realizarse una o más etapas de intervención entre la etapa inicial
de creación y enlace del producto génico al elemento genético y la
etapa de final de generar el cambio seleccionable en el elemento
genético.
Si fuera necesario, la liberación del producto
génico del elemento genético dentro de una microcápsula secundaria
puede lograrse en una variedad de formas, incluyendo mediante
competición específica por un producto de bajo peso molecular por
el sitio de unión o escisión de una región conectora que une el
dominio de unión del producto génico del dominio catalítico bien
enzimáticamente (usando proteasas específicas) o autocatalíticamente
(usando un dominio de integrina).
El sistema puede configurarse de forma que la
actividad de unión, catalítica o reguladora deseada codificada por
un elemento genético conduzca, directamente o indirectamente, a la
activación de expresión de un "gen indicador" que está
presente en todas las microcápsulas. Sólo los productos génicos con
la actividad deseada activan la expresión del gen indicador. La
actividad resultante de la expresión del gen indicador permite la
selección del elemento genético (o del compartimento que lo
contiene) mediante cualquiera de los procedimientos descritos en
este documento.
Por ejemplo, la activación del gen indicador
puede ser el resultado de una actividad de unión del producto
génico de un modo análogo al "sistema de dos híbridos" (Fields
y Song, 1989). La activación también puede resultar del producto de
una reacción catalizada por un producto génico deseable. Por
ejemplo, el producto de reacción puede ser un inductor de la
transcripción del gen indicador. Por ejemplo, la arabinosa puede
usarse para inducir la transcripción del promotor araBAD. La
actividad del producto génico deseable también puede dar como
resultado la modificación de un factor de transcripción, dando como
resultado la expresión del gen indicador. Por ejemplo, si el
producto génico deseado es una cinasa o fosfatasa, la fosforilación
o desfosforilación de un factor de transcripción puede conducir a
la activación de la expresión del gen indicador.
Según otro aspecto de la presente descripción,
el procedimiento comprende la etapa adicional de amplificar los
elementos genéticos. La amplificación selectiva puede usarse como un
medio para enriquecer elementos genéticos que codifican el producto
génico deseado.
En todas las configuraciones anteriores, el
material genético comprendido en los elementos genéticos puede
amplificarse y repetirse el procedimiento en etapas iterativas. La
amplificación puede ser mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (Saiki y col., 1988) o usando una de una variedad de
otras técnicas de amplificación génica que incluyen; amplificación
por Qb replicasa (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin,
1995; Katanaev, Kurnasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de
la ligasa (LCR) (Landegren y col., 1988; Barany, 1991); el sistema
de replicación de secuencia autosostenida (Fahy, Kwoh y Gingeras,
1991) y amplificación por desplazamiento de cadenas (Walker y col.,
1992).
\newpage
En los siguientes ejemplos se ilustran diversos
aspectos y realizaciones de la presente invención y la presente
descripción.
Todos los documentos mencionados en el texto se
incorporan mediante referencia.
Un formato para la selección de elementos
genéticos usando un cambio en sus propiedades ópticas es uno en el
que el elemento genético comprende una microperla a la que se ha
unido el gen. En este documento se muestra cómo un gen puede
ligarse por una enzima (dihidrofolato reductasa de E. coli) a
una perla paramagnética y se traduce in vitro tan
eficientemente como en disolución.
El gen folA de E. coli que
codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) se amplifica por PCR usando
oligonucleótidos EDHFRFo y EDHFRBa. Entonces, este ADN se clona en
el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con
HindIII y Kpnl aguas abajo del promotor lac y el
promotor de ARN polimerasa de T7. El oligonucleótido EDHFRBa añade
el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7
eficaz aguas arriba del codón de iniciación de DHFR. La
secuenciación de ADN identifica un clon que tiene la correcta
secuencia nucleotídica. Se encuentra que las bacterias
transformadas con este clon (pGEM-folA) sobreexpresan DHFR
activa (conducidas por el promotor lac) cuando se inducen con
IPTG.
Entonces, el gen folA en el plásmido
pGEM-folA se amplifica por PCR usando cebadores
folA-FW y folA-BW, el fragmento de
ADN resultante en HindIII y XhoI se digiere y se
subclona en el vector de expresión pET23a digerido con
HindIII/XhoI (Novagen) para dar el constructo
pET23a/folA. La secuencia del gen folA amplificada por PCR se
verificó mediante secuenciación.
pET23a/folA se amplificó adicionalmente con
cebadores pETfor.b y pETrev.b biotinilados en 5' y radiomarcados
incluyendo \alpha^{35}S-dATP 10 \muCi
(Amersham Pharmacia Biotech, RU) en la mezcla de PCR. El fragmento
biotinilado doble de 1765 pb resultante T7-folA se
purificó en gel usando un kit de Qiagen y se cuantificó
espectrofotométricamente. La actividad específica del producto fue
210000 CPM/pmol de ADN de T7-folA, como se mide en
el contador de centelleo Beckman LS6000SC. Se hicieron diluciones de
10 nM y 1 nM de este ADN en 1 mg/ml de ADN lambda digerido con
HindIII para eliminar la unión no específica al plástico. Este
fragmento de PCR se usó a partir de entonces para programar un
sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro
procariota diseñado para moldes lineales (Lesley, Brow y Burgess,
1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (sistema de
extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega)
complementada con ARN polimerasa de T7 (10^{3} unidades).
El fragmento de ADN se une a perlas
paramagnéticas de estreptavidina (perlas Sera-Mag de
0,74 \mum de diámetro, capacidad de unión a biotina de 46
nmol/mg, Seradyn, EE.UU.) parcialmente recubiertas previamente con
proteína A biotinilada (Sigma). Se añaden 2 \mul de proteína A
biotinilada 80 \muM a 100 \mul (1 mg) de perlas, se deja unir a
temperatura ambiente durante 1 hora, se lava una vez y se recubre
durante una hora a temperatura ambiente con IgG de conejo (10
\mul, 1 mg/ml de anticuerpo por 1 mg de perlas en TBS/Tween 20 al
0,1% (TBST)). A partir de entonces las perlas se lavaron dos veces
con TBS/T antes de que se añadiera ADN de T7-folA
biotinilado radiomarcado y se dejó unir durante 1 hora a
temperatura ambiente. La cantidad de ADN de T7-folA unido se
calculó contando la radioactividad unida a una alícuota de perlas.
Se unió \sim50% del ADN total.
Los fragmentos de ADN unidos a perlas o
fragmento de ADN sin unir se añaden directamente al sistema de
extracto S30. Las reacciones se incuban durante 2 horas a 37ºC.
La actividad de dihidrofolato reductasa se
ensaya mediante monitorización espectrofotométrica de la oxidación
de NADPH a NADP a 340 nm durante un espacio de tiempo de 10 minutos
como se describe por (Williams y col., 1979; Ma y col., 1993). Se
añaden 2 \mul de cada reacción de traducción in vitro
inactivada a 150 \mul de tampón A (imidazol 100 mM, pH 7,0,
\beta-mercaptoetanol 10 mM) y 20 \mul de NADPH 1
mM. Después de 1 minuto se añaden 20 \mul de dihidrofolato (1 mM)
(H_{2}F) y la reacción se monitoriza a 340 nm usando un lector de
microplacas de ThennoMax (Molecular Devices). La actividad se
calcula mediante velocidades iniciales en condiciones de
So>>K_{M} (\numáx).
No hay diferencia significativa en la cantidad
de DHFR activa producida si el ADN está libre o unido mediante
biotinas terminales a una perla recubierta con estreptavidina (véase
la figura 1).
Un formato para la selección de elementos
genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a
una microperla y el producto se vuelve a acoplar sobre la microperla
dentro de la microcápsula dando como resultado, directamente o
indirectamente, un cambio en las propiedades ópticas de la
microperla que permite que se clasifique.
En este documento se muestra que una proteína
fluorescente (proteína verde fluorescente o GFP) puede transcribirse
y traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas
individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una
emulsión agua en aceite y el producto génico traducido se une de
nuevo a las microperlas haciéndolas fluorescentes.
La GFP en el plásmido pBS/GFP6 (Siemering y
col., 1996) se amplificó por PCR usando cebadores
GFP-FW y GFPBW, el fragmento de ADN resultante se
digirió en HindIII y Xhol y se subclonó en el vector
de expresión pET23a digerido con HindIII/XhoI
(Novagen) para dar el constructo pET23a/GFP. La secuencia del gen
de GFP amplificado por PCR se verificó mediante secuenciación.
pET23a/GFP se amplificó adicionalmente con cebadores pETfor.b y
pETrev.b biotinilados en 5'. El fragmento biotinilado doble de 2038
pb resultante T7-GFP se purificó en gel usando un
kit de Qiagen y se cuantificó espectrofotométricamente. Se hicieron
diluciones de 10 nM y 1 nM de este ADN en 1 mg/ml de ADN lambda
digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al
plástico. Este fragmento de PCR se usó a partir de entonces para
programar un sistema de transcripción/traducción acoplada in
vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley, Brow y
Burgess, 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema
(sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales;
Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (10^{3}
unidades).
Como control se usó un fragmento de ADN de 1765
pb biotinilado T7-folA (sintetizado mediante PCR
como en el ejemplo 1) para programar la síntesis de la proteína no
fluorescente DHFR.
Se suspendieron 150 \mul de perlas
paramagnéticas recubiertas con estreptavidina ProActive (Bangs
Laboratories, 2 x 10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl 1
M/Tween 20 al 0,1% y se dividieron en tres alícuotas de 50 \mul.
Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \muM (T7-folA o
T7-GFP) a cada alícuota de perlas, se incubaron a
43ºC durante 15 min, se lavaron tres veces en NaH_{2}PO_{4} 25
mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0 (PBS/Tween 20 al 0,1%),
se volvieron a suspender en 40 \mul de TBST y se añadieron 10
\mul de proteína A biotinilada 80 mM (Sigma) (para dar la
concentración final de 15 \muM). Después de la incubación durante
30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces
en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a suspender en 20 \mul de
anticuerpo policlonal anti-GFP de conejo de dilución
1:10 (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no inmunizado (Sigma).
Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente,
las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se
volvieron a suspender en 15 \mul de premezcla S30 de un sistema
de extracto S30 de E. coli para moldes lineales (Promega), se
sonicaron durante un minuto en un baño de sonicación, luego se
añadió el resto de la mezcla de traducción in vitro S30 (en
hielo) y se complementó con ARN polimerasa de T7 (10^{3}
unidades).
Los 50 \mul de reacciones de traducción in
vitro enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5
alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de fase
aceitosa enfriada en hielo (recientemente preparada disolviendo
Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº
M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma
Ultra; nº P-8074) en un vial Biofreeze de Costar de
5 ml (nº 2051)) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm
con un anillo de pivote; Scientific Industries International,
Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante 3
minutos adicionales en hielo. Entonces, las reacciones se incubaron
3 h a 32ºC.
Se extendieron 2 \mul de emulsión en un
portaobjetos de microscopio debajo de un cubreobjetos redondo de 13
mm y se visualizó usando un objetivo 20 x Neofluar en un microscopio
Axioplan (Zeiss) equipado con una cámara
RTEACCD-1300-YCCD (Princeton
Instruments). Se usaron filtros habituales de excitación y emisión
para fluoresceína y las imágenes se procesaron con el software
IPLab.
Como puede verse de la figura 2, la GFP
traducida de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas
en los compartimentos acuosos de las emulsiones está unida a las
microperlas in situ cuando las microperlas se recubren con
un anticuerpo anti-GFP. Esta unión se observa como
concentración de fluorescencia en las perlas mediante microscopía
de epifluorescencia. No se observa fluorescencia de perlas cuando
falta o el gen de GFP o el anticuerpo anti-GFP.
Se suspendieron 150 \mul de perlas de
poliestireno recubiertas con estreptavidina (diámetro 1 \muM;
Bangs Laboratories, 2 x 10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5
mM/NaCl 1 M /Tween 20 al 0,1% y se dividieron en tres alícuotas de
50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \muM (T7-folA
o T7-GFP) a cada alícuota de perlas, se incubaron a
43ºC durante 15 min, se lavaron tres veces en NaH_{2}PO_{4} 25
mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0 (PBS/Tween 20 al 0,1%),
se volvieron a suspender en 40 \mul de TBST y se añadieron 10
\mul de proteína A biotinilada 80 \muM (Sigma) (para dar la
concentración final de 15 \muM). Después de la incubación durante
30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces
en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a suspender en 20 \mul de
anticuerpo policlonal anti-GFP de conejo de dilución
1:10 (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no inmunizado (Sigma).
Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente,
las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se
volvieron a suspender en 15 \mul de premezcla S30 de un sistema
de extracto S30 de E. coli para moldes lineales (Promega),
se sonicaron durante un minuto en un baño de sonicación, luego se
añadió el resto de la mezcla de traducción in vitro S30 (en
hielo) y se complementó con ARN polimerasa de T7 (10^{3}
unidades). Los 50 \mul de reacciones de traducción in
vitro enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5
alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de fase
aceitosa enfriada en hielo (recientemente preparada disolviendo Span
80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº
M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma
Ultra; nº P-8074) en un vial Biofreeze de Costar de
5 ml (nº 2051)) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm
con un anillo de pivote; Scientific Industries International,
Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante 3
minutos adicionales en hielo. Entonces, las reacciones se incubaron
3 h a 32ºC. Para recuperar las mezclas de reacción, las emulsiones
se centrifugaron a 3.000 g durante 5 minutos y la fase aceitosa se
eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el
fondo del vial. Se añadieron PBS y 2 ml de éter saturado en agua y
la mezcla se removió, se centrifugó brevemente y se eliminó la fase
etérea. Las perlas se lavaron dos veces con PBS y finalmente se
volvieron a suspender a 10^{8} perlas/ml en PBS. Se analizaron
10^{4} perlas usando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton
Dickinson) usando excitación a 488 nm y el filtro de emisión de
fluoresceína. La GFP traducida de genes unidos a microperlas
individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las
emulsiones está unida a las microperlas in situ cuando las
microperlas se recubren con un anticuerpo anti-GFP.
La unión de GFP a las microperlas las hace fluorescentes (fig. 2) y
aquellas perlas con GFP unida pueden distinguirse claramente de
aquellas que no están mediante citometría de flujo (figura 3).
Se realizó una reacción catalizada por la enzima
glutatión S-transferasa humana M2-2
(GST M2-2) para generar un producto biotinilado
(figura 4). Los dos sustratos usados fueron
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB; Sigma) y glutatión biotinilado reducido
(biotina-GSH). El producto generado
(biotina-GS-DNP) tiene biotina en un
extremo para permitir el acoplamiento a micropartículas
paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y un grupo
2,4-dinitrofenol (DNP) que puede unirse mediante un
anticuerpo anti-DNP.
El biotina-GSH se sintetizó
añadiendo 100 mg de éster de N-hidroxisuccinimida de
biotinamidocaproato (biotina-NHS; Sigma) en 1 ml de
DMF a una disolución de glutatión oxidado (Fluka) en 1 ml de agua,
30 \mul de NaOH 12,5 N más 1 ml de DMF. Se añadió la
biotina-NHS, en hielo, en alícuotas de 100 \mul
durante 20 minutos. Entonces, el pH se ajustó a 7,0 con NaOH 1 N.
El precipitado similar a jarabe que se formó durante la reacción se
disolvió mediante calentamiento hasta temperatura ambiente, se
removió y se añadieron 300 \mul de agua. La agitación continuó
durante 2 horas a temperatura ambiente, el pH se devolvió a 7,0
añadiendo NaOH 1 N y se agitó durante toda la noche a temperatura
ambiente. Entonces se usó NaOH para devolver el pH a 7,5, la
reacción se agitó durante otros 30 minutos a temperatura ambiente y
entonces se incubó 30 minutos más después de añadir 500 \mul de
DTT 1 M. Los disolventes se evaporaron a vacío y el producto se
purificó por HPLC en fase inversa usando una columna C8 y un
gradiente de acetonitrilo del 10-40%, TFA al 0,1%.
Biotina-GS-DNP se sintetizó
enzimáticamente en una reacción de 100 \mul que contenía 1 \mug
de GST M2-2 recombinante purificada, CDNB 500
\muM y biotina-GSH 200 \muM en KH_{2}PO_{4}
0,1 M, EDTA 1 mM, pH 6,5. La incubación fue durante 1 hora a 25ºC.
La reacción finalizó esencialmente como se juzgó siguiendo el
aumento en la absorbancia a 340 nm. También se realizaron
reacciones de control 1) sin GST, 2) sin CDNB y 3) sin
biotina-GSH. Las reacciones se diluyeron 200 veces
(dando una concentración final de biotina 1 \muM) en
Tris-HCl 5 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,4
(tampón B/A). 50 \mul de las reacciones diluidas se mezclaron con
50 \mul de tampón de unión/lavado que contenía 29,3 \mug
(10^{8} micropartículas) de micropartículas magnéticas recubiertas
con estreptavidina Sera-Mag^{TM} de 0,737 \mum
de diámetro (MG-SA; Seradyn) y se incubaron 1 hora a
temperatura ambiente. Las micropartículas se separaron en una placa
de microtitulación (Falcon 3911) usando un imán (Dynal
MPC-96) y se lavaron tres veces con
Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,4 (2 x
tampón de unión/lavado), luego dos veces con PBS, Tween 20 al 0,1%.
Las micropartículas se volvieron a suspender en una dilución 1:2500
del anticuerpo monoclonal anti-dinitrofenol de ratón
SPE21-11 (un obsequio del Prof. Zelig Eshhar) en
PBS/Tween 20 al 0,1% y se incubaron 45 minutos a temperatura
ambiente. Las micropartículas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20
al 0,1%, se volvieron a suspender en PBS/Tween 20 al 0,1%que
contenía 15 \mug/ml de IgG antiratón de cabra del fragmento
F(ab')_{2} conjugado con fluoresceína (FITC), fragmento
F(ab')2 (Jackson;
115-096-006) y se incubaron 30
minutos a temperatura ambiente. Las micropartículas se lavaron
cuatro veces en PBS/Tween 20 al 0,1%, se volvieron a suspender en 1
ml de PBS/Tween 20 al 0,1% y se analizaron 2 x 10^{5}
micropartículas usando un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson). Como puede verse de la figura 5, no hay diferencia en
la distribución de intensidad de fluorescencia de perlas de las tres
reacciones de control (sin GST, sin CDNB y sin
biotina-GSH), en las que la fluorescencia media es
\sim3. A diferencia, las perlas de la reacción catalizada por
enzima tienen una fluorescencia media de 34, más 10 veces mayor. De
hecho, usando la puerta mostrada (fig. 5), el 81,1% de perlas de la
reacción catalizada por enzima (y recubierta con el producto
biotinilado) están en la puerta, mientras que en las reacciones de
control no más del 0,06% de las perlas están en la puerta. Por
tanto, las perlas recubiertas con el producto de la reacción
catalizada con GST pueden clasificarse fácilmente de aquellas que no
están.
La síntesis de biotina enjaulada (5) y sus
derivados (7) se basó en los protocolos publicados (Pirrung y Huang,
1996; Sundberg y col. (1995). Sin embargo, se hicieron
modificaciones significativas de estos protocolos en varias etapas
de la síntesis como se describe a continuación.
Éster metílico de biotina (3,
biotina-OMe) se preparó esencialmente como se
describe en Sundberg y col. (1995) (véase la fig. 6):
- \quad
- Alcohol metilnitropiperonílico (1, MeNPOH). Se disolvió 3',4-(metilendioxi)-6'-nitroacetofenona (Lancaster; 6,2 g, 29,6 mmol) en una mezcla de THF (100 ml) y etanol (100 ml). Se añadió borohidruro sódico (1,12 g, 29,6 mmol) y la disolución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. CCF (en placas recubiertas con sílice; disolvente - metanol al 3% en DCM) indicó la conversión completa del material de partida (Rf = 0,8) en el alcohol (Rf = 0,6). Se añadió lentamente ácido clorhídrico (1 N) hasta que se detuvo el desprendimiento de hidrógeno y los disolventes se evaporaron a vacío. El sólido residual se disolvió en DCM (500 ml) y se lavó con salmuera (40 ml). La fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. La recristalización en DCM y hexano caliente dio 6,1 g de 1 (un sólido cristalino amarillo).
- \quad
- O-Metilnitropiperonil-carbonilimdazol (2, MeNPO-CO-Im).
- \quad
- Se añadió alcohol metilnitropiperonílico (1,69 g, 8 mmol) (en varias partes durante 20 minutos) a una disolución de carbonildiimidazol (CDI, 2,6 g, 16 mmol) en DCM (50 ml). La disolución se agitó durante 3 h, tras lo que CCF indicó la conversión completa del alcohol (Rf = 0,6 - metanol al 3% en DCM) en el producto (Rf = 0,45). Se añadieron DCM (100 ml) y agua (30 ml) y la mezcla de reacción se transfirió a un embudo de decantación. La mezcla se mezcló y se añadió HCl 1 N (en alícuotas de 1 ml) hasta que el pH de la fase acuosa bajó a 6. La fase acuosa se eliminó, se añadió más agua (30 ml) y se acidificó hasta pH 6 mientras se mezclaba. Finalmente, la fase de DCM se lavó con salmuera, se secó (sobre MgSO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. El sólido restante se recristalizó en DCM y hexano caliente para dar 2,2 g de 2 (un sólido cristalino amarillo).
- \quad
- Éster metílico de N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina (4, MeNPO-CO-biotina-OMe). Se añadió hidruro de sodio (suspensión al 60% en aceite; 100 mg, 2,5 mmol) a una suspensión con agitación de biotina-OMe (517 mg, 2 mmol) y MeNPO-CO-Im (305 mg, 1 mmol) en DCM anhidro (10 ml) en hielo. La disolución se agitó durante 30 minutos en hielo y 30 minutos a temperatura ambiente. CCF indicó la completa desaparición de MeNPO-CO-Im (Rf = 0,6 - metanol al 5% en DCM) y la aparición del producto (Rf = 0,45). También se observaron trazas del alcohol 1 (Rf = 0,7) y un producto secundario con Rf = 0,95 (probablemente di-MeNPO-carbonato) (la relación del producto frente al producto secundario anterior varió de una preparación a otra; el secado cuidadoso de los materiales de partida y la realización de la reacción en hielo dio generalmente mayores rendimientos del producto).
Una vez que se había completado la reacción se
añadió DCM (100 ml) y la disolución se extrajo tres veces con
NaH_{2}PO_{4} 1 M. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y el
disolvente se eliminó a vacío. El jarabe restante se disolvió en
DCM caliente (aprox. 5 ml), se añadió hexano (aprox. 5 ml) al punto
de enturbiamiento y la disolución se dejó reposar a 4ºC durante
toda la noche. Esto dio como resultado la precipitación del exceso
de biotina-OMe como un sólido cristalino blanco (que
se lavó con éter, se secó y se usó en reacciones posteriores). El
filtrado se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía
sobre sílice (metanol del 1,5 al 3% en DCM) para dar 4 como una
espuma amarilla (con rendimientos de hasta 385 mg, o el 80% basado
en equivalentes molares de 2 como material de partida).
- \quad
- N-(O-Metilnitropiperonil-carbonil)-biotina (5, MeNPO-CO-biotina-OH).
- \quad
- Se disolvió MeNPO-CO-biotina-OMe (940 mg; 1,73 mmol) en 25 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; lavado con argón). La disolución se agitó a 44ºC durante 24 horas bajo argón. Los disolventes se redujeron a vacío hasta aprox. 1 ml, se añadió agua (10 ml) y se liofilizó la mezcla resultante. El sólido resultante se disolvió en DCM con metanol al 2% (20 ml) y se añadió carbón. La mezcla se llevó a ebullición durante unos pocos minutos y se filtró. CCF (metanol al 10% en DCM) indicó la aparición del producto de la hidrólisis (Rf =0,2) y aproximadamente 5% de material de partida (MeNPO-CO-biotina-OMe; Rf = 0,9). Los disolventes se eliminaron a vacío para dar un sólido amarillo que se secó a vacío (860 mg de aprox. 95% de 5 más 5% de 4). Mayores concentraciones de HCl (por ejemplo 1 N) y mayores temperaturas (por ejemplo reflujo con THF como codisolvente) dieron como resultado la hidrólisis completa del éster metílico. Sin embargo, también se observó una cantidad significativa de alcohol 1 y biotina, que indica la hidrólisis del carbamato en estas condiciones. Debe tenerse en cuenta que se encontró que el éster metílico 4, y en particular el producto de su hidrólisis (5), eran sensibles a la oxidación. El calentamiento o incluso el almacenamiento de disoluciones de 5 en presencia de aire dio como resultado pardeamiento. Similarmente, los intentos por purificar 5 (o derivados de, por ejemplo, 7) mediante cromatografía sobre sílice condujeron a pérdidas muy altas debido a la oxidación.
- \quad
- Éster terc-butílico del ácido N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotin)-3-aminopropiónico (6, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OBu^{t}). Se disolvió MeNPO-CO-biotina-OH (860 mg que contiene \sim5% de MeNPO-CO-biotina-Ome; \sim1,6 mmol) en 20 ml de DCM anhidro. Se añadieron sal clorhidrato de éster terc-butílico de \beta-alanina (H-\beta-Ala-OBu^{t}) (Bachem; 362 mg; 2 mmol), N-hidroxisuccinimida (172 mg; 1,5 mmol) y trietilamina (280 \mul; 2 mmol). La disolución con agitación se enfrió en hielo y se añadió EDCI (420 mg; 2,2 mmol). La reacción se agitó durante 24 horas a 4ºC y 2 horas a temperatura ambiente. CCF (metanol al 5% en DCM) indicó la aparición del producto (Rf = 0,3) y el MeNPO-CO-biotina-OMe restante sin reaccionar (Rf = 0,45). La reacción se diluyó con DCM (30 ml) y se extrajo tres veces con NaH_{2}PO_{4} 1 M y una vez con NaHCO_{3} saturado. La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. El jarabe restante se purificó mediante cromatografía sobre sílice (metanol al 3,0-4,5% en DCM) para dar 640 mg de 6 (una espuma amarilla).
- \quad
- Ácido N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropiónico (7, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH). Se disolvió éster terc-butílico 6 (510 mg; 0,84 mmol) en 15 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; lavado con argón). La disolución se agitó a 52ºC durante 24 horas bajo argón. Se añadió agua (10 ml) y la disolución resultante se liofilizó para dar un sólido que contenía (como se juzga por CCF) el producto de la hidrólisis (7) y material de partida (6; \sim 10%). Esta mezcla se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (metanol al 10% en acetona más ácido acético al 0,1%) para dar 60 mg de 7 (los rendimientos bajos fueron principalmente el resultado de la oxidación de 7 sobre la sílice).
- \quad
- N-(N-(N-(O-Metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropionil)-glutatión (8, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH). Se añadió carbonildiimidazol (20 mg, 120 \mumol) a una disolución de MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH (7,49 mg, 89 \mumol) en DMF (1,5 ml). La disolución se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y entonces se añadió, en varias alícuotas, a una disolución de glutatión oxidado (62 mg, 100 \mumol) y trietilamina (55 \mul, 0,4 mmol), en DMF (2 ml) más agua (0,15 ml), agitada en hielo. La disolución se agitó en hielo durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente. Se añadió trietilamina hasta que la disolución se volvió transparente (25 \mul) y entonces la reacción se agitó durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Entonces se añadió DTT (0,25 ml de disolución M; 0,25 mmol) y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- \quad
- El producto de la reacción anterior se purificó por HPLC en fase inversa, en una columna preparativa RP-8, usando un gradiente de agua-acetonitrilo en presencia de ácido trifluoroacético al 0,1%. Se recogió el pico correspondiente a 8 (tiempo de retención = 28,6 minutos). Entonces, el producto se aisló mediante liofilización y se purificó de nuevo en HPLC en fase inversa (usando la misma columna y sistema de disolventes). El análisis del producto después de la segunda purificación por HPLC, usando HPLC analítica en fase inversa, indicó un producto (>95%) cuyo espectro UV se corresponde con 8 (específicamente, \lambda^{máx} a 355 nm indicó la presencia del grupo O-metilnitropiperonil-carbonilo de la biotina enjaulada). La concentración de 8 se determinó mediante titulación de los grupos tiol libres (usando DTNB, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico), como Hermanson, 1996) derivados del glutatión, y también mediante absorbancia a 355 nm (correspondiente a la biotina enjaulada). Ambas mediciones independientes dieron el mismo resultado dentro del error experimental.
El 8 purificado también se encontró que era un
sustrato para M2-2 GST humana en la sustitución
electrófila de CDNB (monitorizada por el cambio de absorbancia a
340 nm; Habig y Jakoby, 1981) con velocidades que son
aproximadamente 10 veces más lentas que las observadas con glutatión
en condiciones similares.
La
MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH
(biotina enjaulada-\betaala-GSH)
reducida se hizo reaccionar con o
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
(CDNB; Sigma) o
4-cloro-3-nitrobenzoato
(CNB, Acros). El producto enjaulado generado no se une a avidina o
estreptavidina. Sin embargo, después del desenjaulamiento
fotoquímico mediante radiación ultravioleta, el producto tiene una
biotina en un extremo que se unirá a micropartículas recubiertas con
avidina o estreptavidina y o un grupo
2,4-dinitrofenol (DNP) o
3-nitrobenzoato que puede unirse mediante
anticuerpos anti-DNP o
anti-3-nitrobenzoato apropiados
(véanse las figs. 7 y 8)
Se centrifugaron 5 \mul (10^{8} perlas) de
microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0
\mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min y se eliminó el
sobrenadante. Las perlas se volvieron a suspender en 5 \mul de
KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM,
biotina enjaulada-\betaala-GSH 10
mM, y o CDNB 500 \muM o CNB 500 \muM. Las mezclas de reacción
de 5 \mul contuvieron o 0,75 \mug de GST M2-2
humana recombinante purificada o no contuvieron enzima.
Las reacciones se incubaron durante 30 min
(reacciones con CDNB) o 4 horas (reacciones con CNB) a 25ºC, tiempo
después del cual se detuvieron mediante la adición de 35 \mul de
acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfirieron a hielo. Entonces,
cada reacción se dividió en dos alícuotas de 20 \mul cada una, una
de las cuales se colocó como un punto en una capa de parafilm sobre
la superficie de un bloque de aluminio enfriado en hielo. Entonces,
este punto se irradió durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP
(UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. La otra alícuota se
dejó sin irradiar. Entonces, todas las muestras se incubaron 30 min
a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con 200 \mul
de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de filtración
MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada
lavado.
Entonces, las perlas se volvieron a suspender en
200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% que contiene 20 ng/\mul de
anticuerpo anti-DNP de conejo marcado con
Alexa-488 (Dako, nº V0401), 20 ng/\mul de
antisueros anti-CNB marcado con
Alexa-488 y se incubaron durante 1 hora a
temperatura ambiente. El antisuero anti-CNB se
obtuvo en conejos mediante inmunización con conjugados de
CNB-CH_{2}-KLH preparados
añadiendo alícuotas de una disolución 200 mM de ácido
4-(bromometil)-3-nitrobenzoico
(CNB-CH_{2}Br) en DMF a disoluciones de 5 mg/ml
de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana
(KLH) en borato 50 mM, pH 8,8 (para dar de 1,5 a 6 \mumol de
CNB-CH_{2}Br por mg de proteína). Las mezclas de
reacción se agitaron durante 6 horas a temperatura ambiente y
temperatura y los conjugados resultantes de proteína se dializaron
exhaustivamente contra solución salina de tampón fosfato (PBS) a
4ºC. El nivel de conjugación (densidad de haptenos o Hd) se
determinó midiendo densidades ópticas de los conjugados a 355 nm. Se
encontró que éstas eran: de 7 a 11 grupos
CNB-CH_{2} por molécula de BSA y de 9,4 a 24,3 por
molécula de KLH, dependiendo de la cantidad de
CNB-CH_{2}Br añadida a las muestras de proteína.
El conjugado de CNB-CH_{2}-KLH con
Hd de 14,2 se usó para inmunizar conejos usando protocolos
publicados (Tawfik y col., 1993; Tawfik y col., 1997) (por el Prof.
Z Eshhar, Instituto de Ciencias de Weizmann, Rehovot). Los sueros se
probaron mediante ELISA para unir el conjugado
CNB-CH_{2}-BSA (Hd=11) y a BSA. El
primer sangrado de ambos conejos inmunizados (cuando se diluyeron
50 veces o más) presentó la selectividad deseable, dando una alta
señal cuando se incubaron con el conjugado de
CNB-CH_{2}-BSA y ruido muy bajo
(<5%) con BSA. El suero anti-CNB se purificó
usando una columna de proteína A HiTrap (Pharmacia). Ambos
anticuerpos anti-CDNB y anti-CNB se
marcaron con un kit de marcado de proteínas Alexa Fluor 488
(Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante.
Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul
de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se volvieron a
suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 10.000
acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).
Como puede verse de la fig. 9, el resto de
biotina enjaulada se desenjaula con radiación UV y se une a perlas.
Se observó un aumento de 19 veces en la fluorescencia media de
perlas después de la reacción catalizada con GST
M2-2 de biotina
enjaulada-\betaala-GSH con CDNB,
incluso en ausencia de radiación UV. Esto concuerda con la aparente
presencia de \sim4% de
biotina-\betaala-GSH en la
preparación de biotina
enjaulada-\betaala-GSH como se
determina usando fluorimetría para medir el desplazamiento del ácido
2-anilinonaftaleno-6-sulfónico
(2,6-ANS) de avidina (Mock y col., 1985). Estos
resultados son coherentes con la inmovilización del ruido
previamente observada de biotina enjaulada respecto a avidina 'en la
oscuridad' (es decir, sin iluminación UV) que era tan alta como el
15% de la señal observada después de la iluminación (Sundberg y col.
1995). La señal 'oscura' previamente observada se atribuyó o a
contaminantes traza de biotina en la preparación de biotina
enjaulada, o a interacciones débiles entre avidina y componentes de
la biotina enjaulada que incluyen el conector (Sundberg y col.
1995). Después de la radiación UV se observó una gran diferencia en
la fluorescencia media de aquellas perlas incubadas en presencia y
ausencia de GST. La fluorescencia media de las perlas con GST era 84
veces y 56 veces de la observada sin GST con CDNB y CNB como
sustratos, respectivamente (fig. 9).
\vskip1.000000\baselineskip
Se centrifugaron alícuotas de 20 \mul (4 x
10^{8} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no
fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes,
F-8777) o perlas de poliestireno recubiertas con
estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) cada
una en una microcentrífuga a 2.600 g (6.500 rpm) durante 3 min. El
sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender, en
hielo, en 20 \mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6,5, EDTA 1 mM,
ditiotreitol 2 mM, biotina
enjaulada-\betaala-GSH 50 \muM,
que contenía o 3 \mug de GST M2-2 humana
recombinante purificada o no contenía enzima.
Entonces se emulsionaron seis mezclas de
reacción esencialmente como Tawfik y Griffiths (1998):
- a)
- Perlas de Bangs, sin GST
- b)
- Perlas de Bangs, más GST
- c)
- Perlas de Molecular Probes, sin GST
- d)
- Perlas de Molecular Probes, más GST
- e)
- Perlas de Bangs, sin GST
- f)
- Perlas de Molecular Probes, sin GST
La fase aceitosa se preparó recientemente
disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma,
nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma
Ultra; nº P-8074). Las mezclas de reacción frías en
hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 4 \mul durante
\sim2 minutos) a 0,4 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en un
vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se agitaba con una
barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific
Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150
rpm) continuó durante un 1 minuto adicional en hielo.
Se añadieron 8 \mul de la emulsión d) a 0,4 ml
de la emulsión e), y 8 \mul de la emulsión b) se añadieron a 0,4
ml de la emulsión f) (para dar diluciones 1:50) y las mezclas de
emulsiones se removieron durante 5 segundos para mezclarse.
Se dejaron sin emulsionar seis mezclas de
reacción:
- a)
- Perlas de Bangs, sin GST
- b)
- Perlas de Bangs, más GST
- c)
- Perlas de Molecular Probes, sin GST
- d)
- Perlas de Molecular Probes, más GST
- e)
- Perlas de Bangs, sin GST
- f)
- Perlas de Molecular Probes, sin GST
Se añadieron 0,4 \mul de d) a 20 \mul de e),
y se añadieron 0,4 \mul de b) a 20 \mul de f) (para dar
diluciones 1:50).
Tanto las emulsiones como las reacciones no
emulsionadas se incubaron durante 15 min a 25ºC. Entonces, a cada
0,4 ml de emulsión se añadieron 0,8 \mul de CNB 500 mM (en etanol
absoluto) y la emulsión se removió durante 5 segundos (el CNB se
transfiere a través del aceite mineral a los compartimentos
acuosos). A las reacciones no emulsionadas se añadieron 5 \mul de
CNB 5 mM (en KH_{2}PO_{4} 0,1 M, EDTA 1 mM, pH, 6,5).
Todas las reacciones se incubaron durante 4
horas a 25ºC.
El pH de las gotitas acuosas se disminuyó para
inactivar la reacción catalizada por GST removiendo las emulsiones
con 200 \mul de aceite mineral de Sigma para biología molecular
(M-5904) que contiene Span 80 al 4,5% (Fluka),
Tween 80 al 0,5% (Sigma Ultra) en aceite mineral de Sigma para
biología molecular y ácido acético 25 mM. Las reacciones no
emulsionadas se enfriaron añadiendo 25 \mul de ácido acético 0,5
M.
Todas las reacciones se transfirieron a una
placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) que flotaba
en agua con hielo y se irradiaron durante 2 min con una lámpara UV B
100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Entonces,
todas las muestras se incubaron 30 min a temperatura ambiente.
Las emulsiones se transfirieron a tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min a 13,5 krpm en
una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Se añadieron 200 \mul de acetato de Na 0,1 M, pH 5,0, y la
emulsión se rompió extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano,
removiendo entre cada adición de hexano. El hexano residual se
eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente a vacío
en una Speedvac (Farmingdale, NY).
Entonces, todas las muestras se lavaron tres
veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de
filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada
lavado. Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 200 \mul
de PBS, Tween 20 al 0,1%. Entonces se añadieron 25 \mul (\sim5
x 10^{7} perlas) a 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% que
contiene 20 ng/\mul de anticuerpo anti-DNP
marcado con Alexa-488 o 20 ng/\mul de anticuerpo
anti-CNB marcado con Alexa-488
(véase el ejemplo 5) y se incubaron durante 1 hora a temperatura
ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS,
Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se volvieron a suspender
en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 300.000
acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).
En las mezclas no emulsionadas, en las que no se
compartimentaron ni GST ni el producto de la reacción catalizada
por GST, (biotina
enjaulada-\betaAla-NB), todas las
perlas tienen una fluorescencia similarmente baja (fig. 10, paneles
B y D). A diferencia, en las mezclas de emulsiones, en las que se
compartimentaron tanto GST como el producto de la reacción
catalizada por GST, (biotina
enjaulada-\betaAla-NB), están
claramente visibles dos poblaciones de perlas, una de baja y una de
alta fluorescencia (fig. 10, paneles C y E). La graduación a través
de R1 y R2 permite separar en gran parte las perlas de Bangs y de
Molecular Probes basándose en sus características de dispersión de
la luz ligeramente diferentes (fig. 10, panel A). La relación de
perlas de Bangs a perlas de Molecular Probes que pasan a través de
R1 es del 68%:0,1% y la relación que pasan a través de R2 es del
0,08%:87%. Usando estas puertas está claro que las perlas con alta
fluorescencia son aquellas que se compartimentaron con la enzima
GST. Por tanto, la compartimentación de perlas, enzima y producto de
reacción se obtuvo mediante emulsión y aquellas perlas presentes en
compartimentos que contenían enzimas pueden distinguirse de aquellas
que no contenían por sus características de fluorescencia.
El gen que codifica glutatión
S-transferasa humana M2-2 (GST
M2-2) se amplifica por PCR usando oligonucleótidos
GSTM2-2Fo y GSTM2-2Bc de un clon de
ADNc de GST M2-2 humana en pGEM-3Z
(Baez y col., 1997). El fragmento de PCR se clona en el vector
pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y
KpnI aguas abajo del promotor lac y el promotor de ARN
polimerasa de T7. El oligonucleótido GSTM2-2Bc añade
el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7
eficaz aguas arriba del codón de iniciación del gen de
metiltransferasa. La secuenciación de ADN identifica un clon con la
correcta secuencia nucleotídica, denominada
pGEM-hGSTM2-2. El plásmido de
pGEM-hGSTM2-2 descrito anteriormente
se amplifica por PCR usando cebadores LMB2 y LMB3 como anteriormente
para crear un fragmento de PCR de 826 pares de bases
(GSTM2-2.LMB2-3) que lleva el
promotor de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la
traducción del gen 10 del fago T7 y el gen de GST. El fragmento de
PCR se purifica directamente usando Wizard PCR Preps (Promega).
Se centrifugaron alícuotas de 60 \mul (1,2 x
10^{9} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no
fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes,
F-8777) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3
min. El sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a
suspender, en hielo, en 60 \mul de un sistema de
transcripción/traducción acoplada in vitro procariota
diseñado para moldes lineales (Lesley y col., 1991). Se usa una
preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de
E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con
ácido acético 12,5 mM (para reducir el pH hasta -7,0), ARN
polimerasa de T7 (2.000 unidades), 12,5 \mug/ml de digesto de
HindIII de ADN \lambda (New England Biolabs), biotina
enjaulada-\betaala-GSH 50 \muM
y, opcionalmente, ADN de
GSTM2-2.LMB2-3 5 nM o 5,0 \mug de
GST M2-2 humana recombinante purificada por 50
\mul (o ninguno).
De cada mezcla de reacción se tomó una alícuota
de 5 \mul y se dejó sin emulsionar. Se emulsionaron 50 \mul de
la mezcla de reacción restante esencialmente como Tawfik y Griffiths
(1998).
La fase aceitosa se preparó recientemente
disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma,
nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma
Ultra; nº P-8074). Las mezclas de reacción frías en
hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul
durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en
hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se
agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote;
Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación
(a 1150 rpm) continuó durante un 1 minuto adicional en hielo.
Tanto las emulsiones como las reacciones no
emulsionadas se incubaron durante 45 min a 25ºC para permitir que
avanzara la traducción. Entonces, a cada emulsión de 1,0 ml se
añadieron 5 \mul de
1-cloro-2,4-dinitrobenceno
100 mM (CDNB) (en etanol absoluto) y la emulsión se removió durante
5 segundos (el CDNB se transfiere a través del aceite mineral a los
compartimentos acuosos). Se añadió 1,0 \mul de CDNB 2,5 mM (en
agua) a las reacciones no emulsionadas. CDNB inhibe la traducción
in vitro y añadiéndolo de este modo, después de que se
complete la traducción, maximiza el rendimiento de GST.
Todas las reacciones se incubaron durante 30 min
a 25ºC. Entonces, el pH de las gotitas acuosas se disminuyó para
inactivar la reacción removiendo las emulsiones con 500 \mul de
aceite mineral de Sigma para biología molecular
(M-5904) que contiene Span 80 al 4,5% (Fluka), Tween
80 al 0,5% (Sigma Ultra) en aceite mineral de Sigma para biología
molecular y ácido acético 25 mM. Las reacciones no emulsionadas se
enfriaron añadiendo 5 \mul de ácido acético 0,5 M y 20 \mul de
acetato de Na 0,1 M, pH 5,0.
Todas las reacciones se transfirieron a una
placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) que flotaba
en agua con hielo y se irradiaron durante 2 min con una lámpara UV B
100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Todas las
muestras se incubaron 30 min a temperatura ambiente.
Las emulsiones se transfirieron a tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min a 13,5 krpm en
una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Se añadieron 200 \mul de acetato de Na 0,1 M, pH 5,0, y la
emulsión se rompió extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano,
removiendo entre cada adición de hexano. El hexano residual se
eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente a vacío
en una Speedvac (Farmingdale, NY).
Entonces, aproximadamente 5 x 10^{7} perlas de
las emulsiones rotas y las reacciones no emulsionadas se lavaron
tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de
filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum
(Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre
cada lavado. Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 200
\mul de PBS, Tween 20 al 0,1% que contiene 10 ng/\mul de
anticuerpo anti-DNP marcado con
Alexa-488 (véase el ejemplo 5) y se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres
veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente,
luego se volvieron a suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y
se analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo
FACScan (Becton Dickinson).
\newpage
Como puede verse de la fig. 11, tanto en las
reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la reacción
catalizada por GST M2-2 traducida in vitro da
como resultado perlas con mayor fluorescencia que cuando no estaba
presente la enzima. Sin embargo, esta diferencia en la fluorescencia
no sería suficiente para una clasificación activada por
fluorescencia eficaz (FACS). Sin embargo, las perlas de tanto las
reacciones emulsionadas como las no emulsionadas que contienen 5,0
\mug de GST M2-2 recombinante purificada por 50
\mul fueron incluso más fluorescentes que aquellas que contienen
GST M2-2 traducida in vitro, permitiendo un
enriquecimiento eficaz de estas perlas mediante FACS a partir de
aquellas incubadas en ausencia de GST. Esto simula la situación en
la que una GST mutante de actividad mayor que el tipo salvaje se
traduce in vitro.
Un formato para la selección de elementos
genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a
una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto
génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de
la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos (por ejemplo proteínas
o enzimas) unidos al gen que los codifica. Estos complejos podrían
seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el ejemplo
12) o para actividad enzimática mediante una segunda reacción
compartimentada.
En este documento se muestra que una enzima
(fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y traducirse in
vitro a partir de genes unidos a microperlas y la enzima
traducida se une de nuevo a las microperlas. También se muestra que
la enzima traducida puede modificarse, ensamblarse o complementarse
con un cofactor mientras que esté unida sobre las perlas - en este
ejemplo se añaden iones metálicos a la apoenzima para dar una
metaloenzima activa. Además, se muestra que la actividad catalítica
de la enzima se conserva mientras que esté unida a la microperla
junto con el gen que la codifica.
El gen opd que codifica una
fosfotriesterasa (PTE; también conocida como paraoxonasa; Mulbry y
Karns, 1989) se amplifica de la cepa de Flavobacterium sp.
ATCC 27551 mediante PCR usando un cebador directo que añade codones
de terminación y un sitio EcoRI (OPD-Fo;
véase la tabla 1), y un cebador inverso que añade el sitio de
transición del gen 10 del fago T7 (RBS) y un sitio de clonación de
HindIII (OPD-Bc). Este ADN se clona en
pGEM-4Z usando HindIII y los sitios
EcoRI aguas abajo del promotor de ARN polimerasa de T7. La
secuenciación de ADN identifica un clon que tiene la correcta
secuencia nucleotídica. Se encuentra que las bacterias (E.
coli, TG1) transformadas con este clon (Gem-OPD)
sobreexpresan PTE activa cuando crecen en presencia de cloruro de
cobalto y se inducen con IPTG (Omburo y col., 1992).
El gen OPD también se clona con un péptido
Flag^{TM}
(Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys;
Sigma-Aldrich) añadido a su extremo N. El gen OPD
se amplifica de cepa de Flavobacterium sp. ATCC 27551
mediante PCR usando un cebador directo
(N-Flag-OPD-Fo) que
añade codones de terminación y un sitio KpnI, y un cebador
inverso
(N-Flag-OPD-Bc) que
añade un sitio NcoI, un péptido Flag y un conector corto
entre el péptido Flag y el marco de lectura de OPD. El fragmento de
ADN resultante se clona en el plásmido
pGEM-4Z^{Ncol} (usando los sitios KpnI y
NcoI). pGEM-4Z^{Ncol} es una modificación
de p-GEM-4Z en el que el sitio de
transición del gen 10 del fago T7 (RBS) y un codón de iniciación ATG
se añaden aguas abajo al promotor de ARN polimerasa de T7 para
crear un sitio NcoI que permita clonar los marcos de lectura
en el contexto de RBS y el codón ATG. La secuencia de la sección
incorporada en pGEM-4Z (entre HindIII y los
sitios KpnI aguas abajo del promotor de ARN polimerasa de
T7), para dar pGEM-4Z^{Ncol}, se indica en el
esquema I (ID SEC Nº: 1).
El resto de pGEM-4Z, que incluye
los sitios de clonación KpnI y EcoRI, permanecieron
intactos.
Esquema
I
La secuenciación de ADN identifica un clon que
tiene la correcta secuencia nucleotídica. Se encuentra que las
bacterias transformadas con este clon
(Gem-N-Flag-OPD)
sobreexpresan una PTE activa cuando crecen en presencia de cloruro
de cobalto y se inducen con IPTG. Los plástidos de
gem-OPD y
gem-N-Flag-OPD
descritos anteriormente se amplifican por PCR usando cebadores
LMB2-biotina y LMB3 para crear fragmentos de ADN
(OPD.LMB3-2biotina y
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina,
respectivamente) que llevan el promotor de ARN polimerasa de T7, el
sitio de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y el
OPD o los genes de N-Flag-OPD y se
marcan con biotina en el extremo 3'. Los fragmentos de PCR se
purifican directamente usando Wizard PCR Preps (Promega). Se
centrifugan alícuotas de una suspensión de microesferas marcadas
con estreptavidina no fluorescente de 0,95 \mum (Bangs, \sim2 x
10^{7} perlas por \mul de suspensión) en una microcentrífuga a
10.000 g (13.500 rpm) durante 3 min. El sobrenadante se elimina y
las perlas se vuelven a suspender en tampón TNT (Tris 7,5 0,1 M,
NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). Un anticuerpo que puede unir
péptidos Flag de los extremos amino y está marcado mediante
biotinilación (BioM5, un anticuerpo anti-Flag
marcado con biotina; Sigma) se añade a las suspensiones de perlas a
un promedio de 4 x 10^{4} moléculas de anticuerpo por perla. La
mezcla resultante se incuba durante varias horas con mezclado
ocasional. Las perlas se aclaran dos veces mediante centrifugación
lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT. Los fragmentos de
ADN biotinilado (fragmentos OPD.LMB3-2biotina,
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
o fragmentos que llevan el promotor de ARN polimerasa de T7, el
sitio de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y un
gen que codifica una enzima diferente que también está marcada con
péptido N-Flag, por ejemplo, metiltransferasa
HaeIII -
N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina)
se añaden a una suspensión de perlas recubiertas con anticuerpo y
la mezcla se incuba durante toda la noche a 4ºC. Las perlas se
aclaran 3 veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a
suspender en tampón TNT.
Se centrifugan alícuotas de 50 \mul de la
suspensión anterior de perlas (\sim10^{9} perlas) en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se
elimina y las perlas se vuelven a suspender cuidadosamente, en
hielo, en 50 \mul de un sistema de transcripción/traducción
acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales
(Lesley y col., 1991). Se usa una preparación comercial de este
sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes
lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (2.000
unidades). Las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas y se
centrifugan en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El
sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender en 100
\mul de Tris 50 mM, 10 mM de carbonato potásico, pH 8,0. Se añade
una disolución acuosa de cloruro de cobalto a una concentración de 1
mM y las reacciones se incuban durante varias horas a temperatura
ambiente (o durante toda la noche a 4ºC). Las perlas se aclaran 4
veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en
tampón TNT.
Se añaden alícuotas de las perlas anteriores a
una disolución de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM, pH 8,3. Las
perlas se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante diferentes
periodos de tiempo. Las perlas se centrifugan en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min, el sobrenadante se elimina
y se mide su densidad óptica a 405 nm. No se observa un cambio
significativo en la densidad óptica respecto a la densidad óptica
observada en las mismas condiciones en ausencia de perlas o
fosfotriesterasa cuando las perlas a las que se han unido los
fragmentos de ADN biotinilado OPD.LMB3-2biotina o
N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina
(y posteriormente se hacen reaccionar como se describe
anteriormente) se incuban con Paraoxon. Sin embargo, se observa un
cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las
perlas a las que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
(y posteriormente se hacen reaccionar como se describe
anteriormente) se incuban con Paraoxon. Por ejemplo, cuando se
añaden los fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
a una concentración de 1 nM (a una suspensión de 50 \mul de
perlas (\sim10^{9} perlas) que luego se vuelve a suspender en
50 \mul de transcripción/traducción in vitro) y se hacen
reaccionar como se describe anteriormente, el cambio en la densidad
óptica observada después de 3 horas se corresponde con más del 50%
de la hidrólisis de Paraoxon (a 0,25 mM en un volumen de reacción de
50 \mul). Por tanto, las microperlas que llevan un gen que
codifica una proteína con la actividad catalítica deseada
(fosfotriesterasa en el ejemplo anterior) pueden distinguirse
claramente de microperlas que llevan genes que no codifican una
proteína con la actividad catalítica deseada (metiltransferasa
HaeIII en el ejemplo anterior). Además, apenas se observa
cambio en la densidad óptica a 405 nm cuando los fragmentos de ADN
biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
están unidos a perlas y se hacen reaccionar como se describe
anteriormente, excepto que no se añade cloruro de cobalto a las
perlas que se volvieron a suspender después de la
transcripción/traducción.
Estos resultados muestran que una enzima
(fosfotriesterasa) puede transcribirse y traducirse in vitro
a partir de genes que codifican esta enzima y están unidos a
microperlas. Cuando los genes codifican una marca - un péptido Flag
en el extremo N en el ejemplo anterior -, la enzima traducida se une
de nuevo a las microperlas a las que están unidas los genes.
Entonces, si fuera necesario, la enzima traducida puede modificarse
mientras permanece unida a las microperlas (junto con el gen de la
codifica) - en este ejemplo se añaden iones de cobalto para dar una
metaloenzima reactiva. Estos resultados también indican que la
enzima es catalíticamente activa, mientras está unida a microperlas
junto con el gen que la codifica.
Un formato para la selección de elementos
genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a
una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto
génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de
la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos (por ejemplo proteínas
o enzimas) unidos al gen que los codifica. Estos complejos podrían
seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el ejemplo
12) o para determinar la actividad enzimática mediante una segunda
reacción compartimentada.
Sin embargo, para tales complejos que van a
seleccionarse para determinar la actividad enzimática debe estar
disponible un sustrato soluble para la enzima inmovilizada y, una
vez se ha completado la reacción catalítica, el producto de la
actividad enzimática que se ha seleccionado debe unirse al gen que
codifica esta enzima. Entonces, los complejos resultantes pueden
clasificarse o seleccionarse en virtud del producto que se ha ligado
a ellos, por ejemplo usando un anticuerpo marcado fluorescentemente
que reconozca el producto. En otros compartimentos, que contienen
complejos de genes y productos génicos que no codifican proteínas
con la actividad enzimática deseada, el sustrato sin reaccionar
debería ligarse al gen. Estos complejos no se marcarán con el
producto y por tanto se desecharán.
En este documento se muestra que una enzima
(fosfotriesterasa o PTE) puede reaccionar con un sustrato
biotinilado enjaulado en presencia de perlas recubiertas con
estreptavidina. Entonces, el producto biotinilado enjaulado
generado puede desenjaularse mediante radiación UV y capturarse
sobre perlas recubiertas con avidina. Posteriormente, estas perlas
se detectan mediante citometría de flujo y se distinguen claramente
de perlas incubadas con un sustrato biotinilado enjaulado en
presencia de otras enzimas o proteínas que no presentan actividad
fosfotriesterasa.
Un sustrato biotinilado enjaulado para PTE
(EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada; fig. 12) se sintetiza del siguiente modo:
- \quad
- Boc-5-aminopentanol: Se añade dicarbonato de di-terc-butilo (20,8 g; 0,095 mol) a una disolución con agitación de 5-aminopentanol (10,37 g; 0,1 mol) en diclorometano (DCM) (200 ml) en hielo. Tras la adición, la disolución se vuelve turbia y se separa un jarabe. Se añade gota a gota trietilamina (13,8 ml; 0,1 mol) y la disolución resultante se agita durante 10 minutos en hielo y luego durante toda la noche a temperatura ambiente. Los disolventes se eliminan a vacío, el jarabe resultante se disuelve en acetato de etilo (500 ml), se extrae 3 veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío y el jarabe resultante (después de secado exhaustivo a vacío en presencia de hidróxido potásico), compuesto principalmente de Boc-5-aminopentanol, se usa sin más purificación.
- \quad
- (11) Se añade gota a gota trietilamina (3 ml; 22 mmol) a una disolución con agitación de fosfodicloridato de p-nitrofenilo (5,15 g; 20 mmol) y etanol (1,15 ml, 20 mmol) enfriado en nieve carbónica en acetona en el plazo de 30 minutos. La disolución se deja calentar lentamente hasta temperatura ambiente y se agita durante 90 minutos adicionales. Entonces se añade gota a gota una disolución de Boc-5-aminopentanol (4,3 g; aprox. 20 mmol) y trietilamina (3 ml; 22 mmol) en DCM (20 ml). La reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añade 1H-tetrazol (0,35 g; 5 mmol) y la reacción se agita durante otras 2 horas. Se añade DCM (100 ml) y la disolución se extrae 3 veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol del 1% al 2% en DCM) para dar 3,52 g de 11 (un jarabe).
- \quad
- Éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico: Se añade diciclohecildicarbodiimida (DCC; 5,15 g; 25 mmol) a una suspensión con agitación de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (Tiger, Monmouth NJ; 5,2 g; 25 mmol) y N-hidroxisuccinimida (2,88 g; 25 mmol) en DCM (200 ml) más acetonitrilo (20 ml). La reacción se agita durante toda la noche a 4ºC y luego 3 horas a temperatura ambiente. El precipitado de diciclohecilurea se elimina mediante filtración y el filtrado se concentra a vacío para dar un jarabe. El jarabe se disuelve en cloroformo y DCM y se trata con carbón activado. La adición de éter da un sólido cristalino blanco. La recristalización en DCM y éter de petróleo da 6,2 g del éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico.
- \quad
- (12) Se añade ácido trifluoroacético (TFA; 4 ml) a una disolución de 11 (900 mg; 2,07 mmol) en DCM (5 ml). La disolución se deja a temperatura ambiente durante 45 minutos y los disolventes se eliminan a vacío. El jarabe residual se tritura disolviéndolo en DCM y metanol y añadiendo éter. El 12 resultante (como sal de TFA; jarabe) se seca a vacío en presencia de hidróxido potásico y luego se hace reaccionar inmediatamente sin más purificación (véase más adelante).
- \quad
- (13) Se añaden éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (670 mg; 2,2 mmol) y trietilamina (0,345 ml; 2,5 mmol) a 12 (véase anteriormente) en DCM (15 ml). La disolución se agita durante 30 minutos, se añade trietilamina (0,1 ml; 0,72 mmol) y la disolución se agita durante 3 horas adicionales. Se añade DCM (20 ml) y la disolución se extrae dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 5% en DCM) para dar 0,86 g de 13 (un jarabe).
- \quad
- (14) Se tratan 0,84 g 13 de 14 (1,6 mmol) con TFA como se describe anteriormente para dar 14 (como sal de TFA; jarabe) que se hace reaccionar inmediatamente como se describe más adelante.
- \quad
- (15) Se añaden Boc-Glu(OSu)-OBu' (Bachem; 641 mg; 1,6 mmol) y trietilamina (0,235 ml; 1,7 mmol) a 14 (véase anteriormente) en DCM (15 ml). La disolución se agita durante 1 hora, se añade trietilamina (60 \mul; 0,43 mmol) y la disolución se agita durante 1 hora. Se añade DCM (20 ml) y la disolución se extrae dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 7% en DCM) para dar 0,8 g de 15 (un sólido cristalino blanco).
- \quad
- EtNP-Bz-Glu (16) Se disuelven 0,4 g de 15 (0,56 mmol) en DCM (5 ml) y TFA (5 ml). La disolución se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y los disolventes se eliminan a vacío. El jarabe residual se cristaliza disolviéndolo en metanol y añadiendo éter. La recristalización (en metanol y éter) da 200 mg de 16 (como sal de TFA; sólido blanco).
- \quad
- EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada (17) Se añade carbonildiimidazol (6 mg, 37,5 \mumol) a una disolución de MeNPO-CO-biotina-OH (5,17 mg, 35 \mumol) en DMF (1 ml). La disolución se agita durante 60 minutos a temperatura ambiente y se añade a 16 (20 mg, 30 \mumol). Se añaden trietilamina (5,5 \mul, 40 \mumol), DMF (1 ml) y agua (0,5 ml) a la mezcla de reacción con agitación hasta que se vuelve transparente. La disolución se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y se almacena a -20ºC.
El producto de la reacción anterior se purifica
por HPLC en fase inversa en una columna preparativa C8 usando un
gradiente de agua-acetonitrilo en presencia de ácido
trifluoroacético al 0,1%. Se recoge el pico correspondiente a 17
(tiempo de retención = 23,1 minutos). El producto se aísla mediante
liofilización como un sólido amarillo. El análisis del producto
después de la purificación por HPLC usando HPLC analítica en fase
inversa indicó un producto principal (>80%) cuyo espectro UV se
corresponde con 17. Específicamente, \lambda^{máx} a 355 nm
indica la presencia del grupo
O-metilnitropiperonil-carbonilo de
la biotina enjaulada (Pirrung y Huang, 1996), y un "hombro" a
277 nm, ausente en biotina enjaulada, indica la presencia del éster
de p-nitrofenilfosfato de 17. La concentración de
17 se verifica hidrolizando el éster de
p-nitrofenilfosfato en hidróxido potásico 0,1 M y
determinado la cantidad de p-nitrofenol liberada
(densidad óptica a 405 nm).
También se encuentra que el 17 purificado es un
sustrato para PTE que conduce a la liberación de
p-nitrofenol (fig. 13; monitorizado por el cambio
en la densidad óptica a 405 nm) con velocidades que sólo son
aproximadamente 6 veces más lentas que las observadas con Paraoxon.
Particularmente, a diferencia de la hidrólisis catalizada por base
de 17 que avanza hasta la finalización (y la hidrólisis catalizada
por PTE de Paraoxon), la hidrólisis catalizada por PTE de 17 avanza
con velocidades significativas sólo hasta que se haya hidrolizado la
mitad del sustrato. También puede hidrolizarse la segunda mitad del
sustrato, pero sólo en presencia de cantidades mucho mayores de PTE
y después de largas incubaciones (varias horas hasta toda la noche).
Esto es probablemente debido al hecho que 17 está compuesto de dos
diaestereómeros (correspondientes a dos enantiómeros con respecto
al fosfotriéster quiral), siendo solamente uno de ellos un sustrato
eficaz para la enzima. De hecho, la estereoselectividad se observó
previamente con PTE y otros fosfotriésteres quirales (Hong y
Raushel, 1999).
Se generan anticuerpos que reconocerían
fosfodiésteres de etilo que son los productos de hidrólisis de los
fosfotriésteres de p-nitrofenilo correspondientes.
Con este fin se sintetiza un derivado de fosfodiéster de etilo
adecuado y se conjuga a proteínas portadoras como se describe más
adelante (fig. 14).
- \quad
- EtNPBG (18) Se añaden anhídrido glutárico (180 mg; 1,6 mmol) y trietilamina (0,22 ml; 1,6 mmol) a 12 (preparado mediante desprotección de 1,6 mmol de 11, como se describe anteriormente) en DCM (15 ml). La disolución se agita durante 20 minutos, se añade trietilamina (0,12 ml; 0,85 mmol) y la disolución se agita durante una 1 hora adicional. Se añade DCM (20 ml) y la disolución se extrae dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4) y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 12,5% en DCM más ácido acético al 0,1%) para dar 445 mg de 18 (un jarabe).
- \quad
- Conjugados de sustratos EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH. Se añade carbonildiimidazol (CDI; 32 mg, 200 \mumol) a una disolución de 18 (60 mg, 134 \mumol) en DMF (1 ml). La disolución se agita durante 60 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añaden alícuotas de 18 activado a disoluciones de 5 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH) en fosfato 0,1 M, pH 8,0 (a de 0,5 a 4 \mumol de 18 por mg de proteína).
Las reacciones se agitan durante 1 hora a
temperatura ambiente y los conjugados de proteínas resultantes se
dializan exhaustivamente contra solución salina de tampón fosfato
(PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación (densidad de haptenos o Hd) se
determina hidrolizando una muestra de los conjugados dializados en
hidróxido potásico 0,1 M y monitorizando la cantidad de
p-nitrofenol liberada (a 405 nm). Se encuentra que
éstas son: de 8,5 a 24 moléculas de EtNPBG por molécula de BSA y de
14 a 63 por molécula de KLH, dependiendo de la cantidad de 18
activado añadido a las muestras de proteína.
Conjugados de productos
EtBG-KLH y EtBG-KLH. Los
conjugados EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH
descritos anteriormente se dializan contra carbonato 0,1 M, pH
11,8, durante 44 horas a temperatura ambiente y luego
exhaustivamente contra PBS (a 4ºC).
Se obtuvieron anticuerpos
anti-EtBG en conejos mediante inmunización con
EtBG-KLH (Hd = 14) usando protocolos publicados
(Tawfik y col., 1993; Tawfik y col., 1997) (obsequio del Prof. Z
Eshhar, Instituto de Ciencias de Weizmann, Rehovot). Los sueros se
probaron mediante ELISA para unión tanto al sustrato conjugado
EtNPBG-BSA (Hd = 8,5) como al conjugado de producto
correspondiente (EtBG-BSA; Hd = 8,5). El primer
sangrado de uno de los conejos inmunizados (cuando se diluyó 500
veces o más) presenta la selectividad deseable, dando una alta
señal cuando se incuba con el conjugado de producto y un ruido bajo
(<20%) con el conjugado del sustrato. La dilución de los sueros
en tampón COVAp (NaCl 2 M, 10 g, 1 MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, Tween
20 al 0,04%, fosfato 10 mM, p-nitrofenol 0,1 mM, pH
6,5) aumenta adicionalmente la selectividad, con niveles de ruido
bajos del 5%. El suero anti-EtBG se purifica usando
una columna de proteína A HiTrap (Pharmacia). Los anticuerpos de
conejo purificados se marcan con un kit de marcado de proteínas
Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) según las instrucciones del
fabricante.
Se centrifugan 10 \mul (\sim2 x10^{8}
perlas) de microperlas recubiertas con estreptavidina de 0,95 \mum
(Bangs, \sim2 x 10^{7} perlas por \mul de suspensión) en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min y se elimina el
sobrenadante. Las perlas se vuelven a suspender en 10 \mul de Tris
50 mM, pH 8,3, que contiene
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada (17) para dar una concentración final de 10 \muM, 20
\muM o 30 \muM. Se expresa PTE in vitro mediante
transcripción/traducción de fragmentos de ADN
OPD.LMB3-2biotina (a 5 nM). Se usa una preparación
comercial (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes
lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (2.000
unidades) y las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas.
Entonces, la PTE se ensambla mediante la adición de carbonato
potásico (10 mM) y cloruro de cobalto (1 mM) en tampón Tris (10 mM
pH 8,0) y se incuba durante toda la noche a 4ºC. Otra enzima, que no
presenta actividad fosfotriesterasa, la metiltransferasa
Haelll, también se expresa in vitro mediante
transcripción/traducción de fragmentos de ADN
M.HaeIII.LMB3-2biotina (a 5 nM) y luego se
trata con carbonato y cobalto como la PTE. Se añade una alícuota de
5 \mul de las mezclas de reacción anteriores a las suspensiones de
perlas y las reacciones se incuban durante 1 hora a 25ºC en la
oscuridad. La reacción se detiene mediante la adición de 15 \mul
de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, y se transfiere a hielo. Entonces,
cada reacción se divide en dos alícuotas de 15 \mul cada una, una
de las cuales se coloca como un punto en una capa de parafilm sobre
la superficie de un bloque de aluminio enfriado en hielo. Entonces,
esta alícuota se irradia durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP
(UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. La otra alícuota se
deja en la oscuridad. Entonces, todas las muestras de perlas se
incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavan tres
veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de
filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada
lavado. Entonces, las perlas (\sim2 x 10^{7}) se vuelven a
suspender en 200 \mul de COVAp que contienen 100 ng/\mul de
anticuerpos anti-EtBG de conejo marcados con
Alexa-488 y se incuban durante 1 hora a temperatura
ambiente y luego 1 hora a 4ºC. Las perlas se lavaron tres veces con
200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se
volvieron a suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se
analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo
FACScan (Becton Dickinson).
Como puede verse en la fig. 15, se observa hasta
un aumento de 20 veces en la fluorescencia media de la perla tras
la hidrólisis catalizada por PTE de
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina y
después de radiación UV. Este aumento observado con respecto a las
perlas tratadas esencialmente es el mismo, pero en presencia de
otra enzima (M.HaeIII), sin actividad fosfotriesterasa. En
particular, las diferencias en la señal de fluorescencia se
observan cuando tanto PTE como M.HaeIII se expresan in
vitro a partir de los genes correspondientes y se añaden junto
con todo el contenido de la mezcla de reacción de
transcripción/traducción in vitro.
A altas concentraciones de sustrato, la
fluorescencia media observada es menor que la observada a 20 \muM.
Además, a concentraciones de sustrato superiores a 20 \muM,
esencialmente no hay diferencia en la señal de fluorescencia entre
reacciones mantenidas en la oscuridad y aquellas irradiadas con UV
(datos no mostrados). Debido a que las perlas, a las condiciones de
reacción descritas anteriormente, empiezan a presentar saturación
de la señal de unión a concentraciones superiores a 10 \muM (de
producto como se detecta por la posterior adición de anticuerpos
anti-EtBG marcados fluorescentemente), estos
resultados pueden explicarse por la presencia de una contaminación
de
ETNP-Bz-Glu-biotina
en la preparación de
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada. Estos resultados también concuerdan con la
inmovilización del ruido previamente observada de biotina enjaulada
respecto a avidina "en la oscuridad" (es decir, sin
iluminación UV) que era tan alta como el 15% de la señal observada
después de la iluminación (Sundberg y col. 1995). La señal
"oscura" previamente observada se atribuye o a contaminantes
traza de biotina en la preparación de biotina enjaulada, o a
interacciones débiles entre avidina y componentes de la biotina
enjaulada que incluyen el conector (Sundberg y col. 1995). Ambos
mecanismos pueden responder al hecho de que a altas concentraciones
de sustrato biotinilado enjaulado (y anteriormente la capacidad de
unión de las perlas), la señal "oscura" se vuelve
significativa. Sin embargo, a concentraciones de sustrato de 20
\muM, o inferiores, la señal "oscura" sólo constituye el 25%,
o incluso menos del 10% (por ejemplo, a
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 10 \muM) de la señal iluminada. Esto indica que la
mayoría de las hidrólisis catalizadas por PTE de
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada tienen lugar mientras que el sustrato está en disolución
y no unido a las perlas, y que el producto resultante
(Et-Bz-Glu-biotina
enjaulada), después de la iluminación con luz UV, está desenjaulado
y se inmoviliza sobre las microperlas.
Un formato para la selección de elementos
genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a
una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto
génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de
la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos (por ejemplo proteínas
o enzimas) unidos al gen que los codifica. Estos complejos podrían
seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el ejemplo
12) o para actividad enzimática mediante una segunda reacción
compartimentada.
Para tales complejos que van a seleccionarse
para determinar la actividad catalítica debe estar disponible un
sustrato soluble para la enzima inmovilizada y, una vez se ha
completado la reacción catalítica, el producto de la actividad
enzimática que se ha seleccionado debe unirse al gen que codifica
esta enzima. Entonces, los complejos resultantes pueden
clasificarse o seleccionarse en virtud del producto que se ha ligado
a ellos, por ejemplo usando un anticuerpo marcado fluorescentemente
que reconozca el producto. En otros compartimentos, que contienen
complejos de genes y productos génicos que no presentan la actividad
enzimática deseada, el sustrato sin reaccionar debería ligarse al
gen. Estos complejos no se marcarán con el producto y por tanto se
desecharán.
En este documento se muestra que una enzima
(fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y traducirse in
vitro a partir de genes unidos a microperlas y la enzima
traducida se une de nuevo a las microperlas. Entonces, la enzima
traducida puede modificarse para incorporar el sitio activo cobalto
y su actividad catalítica se conserva mientras esté unida a la
microperla junto al gen que la codifica. La PTE inmovilizada
reacciona posteriormente con un sustrato biotinilado enjaulado y el
producto biotinilado enjaulado generado se desenjaula mediante
radiación UV y se captura sobre las mismas perlas recubiertas por
avidina a las que está unido el gen que codifica la PTE.
Posteriormente, estas perlas se detectan mediante citometría de
flujo y se distinguen claramente de perlas que llevan un gen que
codifican una proteína que no presenta actividad
fosfotriesterasa.
Se centrifugan alícuotas de una suspensión de
microesferas recubiertas con estreptavidina de 0,95 \mum (Bangs,
\sim2 x 10^{7} perlas por \mul suspensión) en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se
elimina y las perlas se vuelven a suspender en tampón TNT (Tris 7,5
0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). Un anticuerpo, que puede
unirse al péptido Flag y biotinilado (BioM5, un anticuerpo
anti-Flag marcado con biotina; Sigma), se añade a
las suspensiones de perlas para dar un promedio de 10^{4}
moléculas de anticuerpo por perla y la mezcla se incuba durante
varias horas. Las perlas se aclaran mediante centrifugación lenta y
volviéndolas a suspender en tampón TNT al volumen original. Los
fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina,
o fragmentos que llevan el promotor de ARN polimerasa de T7, el
sitio de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y un
gen que codifica a diferentes enzima (también marcado con péptido
N-Flag), por ejemplo, metiltransferasa
HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina)
se añaden a la suspensión de perlas cubiertas con anticuerpo a
concentración 1,6 nM y la mezcla se incuba durante toda la noche a
4ºC. Las perlas se aclaran 3 veces mediante centrifugación lenta y
volviéndolas a suspender en tampón TNT.
Se centrifugan alícuotas de 50 \mul de la
suspensión anterior de perlas (\sim10^{9} perlas) en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se
elimina y las perlas se vuelven a suspender cuidadosamente, en
hielo, en 50 \mul de un sistema de transcripción/traducción
acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales
(Lesley y col., 1991). Se usa una preparación comercial de este
sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes
lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (2.000
unidades). Las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas y se
centrifugan en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El
sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender en 100
\mul de Tris 50 mM, 10 mM de carbonato potásico, pH 8,0. Se añade
una disolución acuosa de cloruro de cobalto a una concentración de 1
mM y las reacciones se incuban durante 2 horas a temperatura
ambiente. Las perlas se aclaran 4 veces mediante centrifugación
lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT. Finalmente, las
perlas se vuelven a suspender en tampón TNT al volumen original.
Se añaden alícuotas de las perlas anteriores a
disoluciones de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM, pH 8,3. Las perlas
se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante diferentes
periodos de tiempo. Las perlas se centrifugan en una
microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min, el sobrenadante se elimina
y se mide su densidad óptica a 405 nm. Se observa un cambio
significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las perlas a las
que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-OPD.LMB3-2biotina
(y posteriormente se hacen reaccionar como se describe
anteriormente), a diferencia de reacciones realizadas en las mismas
condiciones pero en ausencia de perlas o fosfotriesterasa, o con
perlas a las que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado
N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina
y posteriormente se hacen reaccionar como se describe
anteriormente.
A continuación se centrifugan 10 \mul (\sim2
x10^{8} perlas) de las perlas anteriores en una microcentrífuga a
10.000 g durante 3 min y se elimina el sobrenadante. Las perlas se
vuelven a suspender en 10 \mul de
EtNP-Bz-Glu-biotina
enjaulada 12,5 o 25 \muM en Tris 50 mM, pH 8,3. Las suspensiones
de perlas se incuban durante 1,5 horas a 25ºC en la oscuridad. La
reacción se detiene mediante la adición de 10 \mul de acetato
sódico 0,1 M, pH 5,0, y se transfiere a hielo y se irradia durante
2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia
de \sim 6 cm. Entonces, todas las muestras de perlas se incuban
durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se lavan tres
veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de
filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum
(Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre
cada lavado. Entonces, las perlas (\sim7 x 10^{7}) se vuelven a
suspender en 125 \mul de un suero anti-EtBG de
conejo diluido 1:125 en COVAp y se incuban durante toda la noche a
4ºC. Las perlas se lavan una vez con 200 \mul de COVAp y luego 3
veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente y
se vuelven a suspender en 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1%. Se
añaden 70 \mul de las suspensiones de perlas anteriores (\sim2 x
10^{7}) a 50 \mul de 40 ng/\mul de Fab de
anti-conejo de cabra marcado con FITC (Jackson
115-095-006) en PBS, Tween 20 al
0,1% y se incuba 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavan
3 veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente,
luego se vuelven a suspender en 1 ml PBS, Tween 20 al 0,1% y se
analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo
FACScan (Becton
Dickinson).
Dickinson).
\newpage
Por consiguiente, como se observa en la fig. 16,
las perlas a las que se unieron los genes que codifican la
fosfotriesterasa marcada con el péptido Flag (junto con un
anticuerpo que se une al péptido Flag) pueden distinguirse
claramente de genes a los que se unieron otros genes que codifican
enzimas sin actividad fosfotriesterasa (por ejemplo,
N-Flag-M.HaeIII).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen que codifica un péptido de
Propionibacterium shermanii que se biotinila in vivo
en E. coli se amplifica usando oligonucleótidos BCCP5 y
BCCP3 del vector Pinpoint Xa-1 (Promega). El
fragmento de PCR se clona en el vector
pET-23d(FLAG) digerido con BamHI y
HindIII, aguas abajo de un promotor de ARN polimerasa de T7
y el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7, y
en el marco con una región codificante del péptido FLAG del extremo
N; este vector se denomina
pET-23d(FLAG-BCCP). El vector
pET-23d(FLAG) es idéntico al vector
pET-23d (Novagen), excepto por la región entre los
sitios NcoI y BamHI únicos, que se ha modificado para
incluir una región codificante del péptido FLAG del extremo N como
se muestra más adelante en el esquema 2 (ID SEC Nº: 2, 3). Con el
fin de añadir una marca de hexahistidina al extremo de carbono de
la proteína, los dos oligonucleótidos BCCPHis+ y BCCPHis- se
hibridaron y luego se ligaron en el vector pET-
23d(FLAG-BCCP) digerido con SacI y
NotI, dando el vector
pET-(FLAG-BCCP-His). La proteína
FLAG-BCCPHis (denominada FBH) se sobreexpresa en la
cepa C41 (DE3) (Miroux y Walker, 1996), se recolecta y se purifica
con Ni-NTA agarosa (Qiagen) en condiciones nativas,
siguiendo el protocolo del fabricante. La proteína biotinilada se
reduce por incubación con un volumen igual de
avidina-agarosa (Sigma), se equilibra previamente
con un tampón de lavado (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 8,0; NaCl 300
mM; imidazol 20 mM) durante 1 hora a 4ºC. Entonces, la suspensión
se centrifuga a 10.000 g durante 2 minutos y el sobrenadante se
conserva, se coge en alícuotas y se almacena en líquido nitrógeno
(largo plazo) o a 4ºC.
Esquema
2
El gen que codifica BirA de E. coli se
amplificó por PCR usando oligonucleótidos BirA5 y BirA3 de un vector
pBluescript 2SK+ que contiene el gen BirA de E. coli
(obsequio de P. Wang, sin publicar). El fragmento de PCR se clona
en el vector pGEM-4Z(K2) digerido con
KpnI y XhoI aguas abajo del promotor lac,
promotor de ARN polimerasa de T7 y el sitio de iniciación de la
traducción del gen 10 del fago T7 eficaz. El vector
pGEM-4Z(K2) es idéntico al vector
pGEM-4Z^{Ncol} (véase el ejemplo 8, esquema 1),
excepto por la región entre los únicos sitios NcoI y
KpnI, que se ha modificado según el esquema 3 mostrado más
adelante para que contenga un único sitio XhoI aguas abajo
del sitio NcoI (ID SEC Nº: 4, 5).
Esquema
3
La secuenciación de ADN identifica un clon con
la correcta secuencia nucleotídica, denominado
pGEM-BirA. El plásmido pGEM-BirA
descrito anteriormente se amplifica por PCR usando cebadores LMB2 y
LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de 1139
pares de bases (BirA_LMB2-3) que lleva el promotor
de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la traducción
del gen 10 del fago T7 y el gen BirA. El fragmento de PCR se
purifica directamente usando Wizard PCR Preps (Promega).
Se centrifugaron alícuotas de 60 \mul (1,2 x
10^{9} perlas) de microesferas marcadas con IgG
anti-ratón de cabra no fluorescente de 1,0 \mum
de diámetro (Bangs Laboratories, CP03N) en una microcentrífuga a
aproximadamente 2.600 g (6.000 rpm) durante 3 minutos. El
sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender en 60
\mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween
20 al 0,05%, BSA al 0,5%. Las perlas se centrifugaron de nuevo, se
volvieron a suspender en 60 \mul de anticuerpo M5
anti-FLAG (Sigma F4042) y se incubaron durante toda
la noche a 4ºC. Las perlas se centrifugaron de nuevo (2.600 g)
durante 3 minutos, el sobrenadante se eliminó y las perlas se
volvieron a suspender en una mezcla de 30 \mul de
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al
0,05%, BSA al 0,5% y 30 \mul de proteína FBH obtenida como
anteriormente (concentración final de proteína de aprox. 4 mg/ml) y
se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
Mientras tanto se prepararon alícuotas de 60
\mul de un sistema de transcripción/traducción acoplada in
vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley y col.,
1991) usando un kit comercial (sistema de extracto S30 de E.
coli para moldes lineales; Promega) complementado con ARN
polimerasa de T7 (2.000 unidades), ADN de
BirA_LMB2-3 10 nM (o sin nada ADN). Estas alícuotas
se incubaron a 25ºC durante 1 hora para permitir la traducción.
Las alícuotas de 60 \mul de de perlas se
centrifugaron a 2.600 g (6.000 rpm) en una microcentrífuga durante
3 minutos y se eliminó el sobrenadante. Se volvieron a suspender en
60 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M,
Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5%, se volvieron a centrifugar y se
eliminó el sobrenadante. Finalmente se volvieron a suspender en
hielo en una alícuota de 54 \mul de las reacciones de
transcripción/traducción acopladas in vitro procariotas
descritas anteriormente, complementadas con 3 \mul de
d-biotin 2 mM y 3 \mul de ATP 0,2 M.
De cada mezcla de reacción se tomó una alícuota
de 5 \mul y se dejó sin emulsionar. Se emulsionaron 50 \mul de
la mezcla de reacción restante esencialmente como Tawfik y Griffiths
(1998).
La fase aceitosa se preparó recientemente
disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma,
nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma
Ultra; nº P-8074). Las mezclas de reacción frías en
hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul
durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en
hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se
agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote;
Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación
(a 1150 rpm) continuó durante un 1 minuto adicional en hielo.
Todas las reacciones se incubaron durante 4
horas a 37ºC para permitir que avanzara la reacción de
biotinilación.
Las emulsiones se transfirieron a tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min a 13,5 krpm en
una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la
emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo.
Se añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5,
NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5% y la emulsión se rompió
extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, removiendo entre cada adición
de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando durante 10
min a temperatura ambiente a vacío en una Speedvac (Farmingdale,
NY).
Entonces, aproximadamente 1 x 10^{8} perlas de
las emulsiones rotas y las reacciones no emulsionadas se lavaron
dos veces con 100 \mul de TNT/BSA en una placa de filtración
MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado.
Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 50 \mul de
Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al
0,05%, BSA al 0,5% que contiene 1 \mul de una disolución de
estreptavidina-HRP (proporcionada con el kit
TSA^{TM}-Direct de NEN) y se incubaron durante 30
minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron dos veces con
100 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, como
anteriormente, luego se volvieron a suspender en 50 \mul de Tris
0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, H_{2}O_{2} al 0,01%. Se añadió 1
\mul de una disolución madre de
fluoresceína-tiramida (preparada según las
instrucciones del fabricante (kit TSA^{TM}-Direct
de NEN)) y la reacción se dejó avanzar durante diez minutos. Las
perlas se lavaron dos veces con PBS, como anteriormente, y
finalmente se volvieron a suspender en un total de 500 \mul de
PBS, se transfirieron a un tubo de fondo redondo de poliestireno de
5 ml (Falcon) y se analizaron 10.000 acontecimientos usando un
citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).
Como puede verse de la fig. 17, tanto en las
reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la reacción
catalizada por BirA traducido in vitro da como resultado
perlas con fluorescencia más alta que cuando no estaba presente la
enzima. Parece que las perlas que se han incubado en una emulsión
con BirA traducido in vitro son más fluorescentes que las
perlas que no se han incubado en emulsiones.
Un formato para la selección de elementos
genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a
una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto
génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de
la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la
formación de complejos de productos génicos unidos al gen que los
codifica. Estos complejos pueden seleccionarse posteriormente para
unirse a un ligando mediante clasificación de citometría de flujo si
la interacción de unión da como resultado un cambio en la
fluorescencia de microperlas. El vector
pET-23d(FLAG) codifica el péptido FLAG en el
extremo N condensado con la región policonectora de pET23d
(Novagen). pET23d se digirió con NcoI/BamHI, se
purificó en gel y se volvió a disolver en agua. Se mezclaron dos
oligonucleótidos fosforilados sintéticos (Vh Bio Ltd, Newcastle
upon Tyne, RU), FLAG y FLAGas, a una concentración de 1 \muM cada
uno en agua, se calentaron durante 3 min a 94ºC y se dejaron
enfriar hasta temperatura ambiente antes de añadirse al vector
digerido en la mezcla de ligadura. La reacción de ligadura se usó
impurificada para transformar TG-1 de E.
coli. Los clones que contienen el inserto se identificaron por
digesto KpnI y se verificaron por secuenciación (Oswel
Research Product Ltd, Southampton, RU). La región policonectora de
pET-23d(FLAG) es del siguiente modo (ID SEC
Nº : 6, 7):
El constructo de expresión
FLAG-HA biotinilado se preparó a partir del vector
pET-23d(FLAG) por PCR. La secuencia de
péptidos YPYDVPDYA de hemaglutinina de gripe se añadió a la marca
FLAG en pET-23d(FLAG) usando el cebador
FLAGHA y el cebador biotinilado en 5' pETrev.b. El producto de
amplificación tiene 903 bases de longitud y la región codificante
del constructo (ID SEC Nº: 8-10) es:
El constructo competidor en el procedimiento de
selección es el gen folA de E. coli que codifica
dihidrofolato reductasa amplificada de pET23a/folA usando
cebadores pETfor y pETrev.b.
Los fragmentos de PCR se purificaron en gel
usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). La
concentración de ADN se midió mediante espectrofotometría UV. Las
diluciones de PCR - los constructos de expresión preparados se
hicieron en 0,5 mg/ml de ADN portador preparado a partir de ADN de
fago lambda digerido con HindIII (40 min a 80ºC, seguido por
precipitación en etanol y disolución en agua).
Se centrifugaron 2 x 10^{9} perlas de
poliestireno de 0,95 \mum recubiertas con estreptavidina en una
alícuota de 100 \mul de suspensión al 1% (Bangs Laboratories, Inc.
CP01N) en una microcentrífuga a aproximadamente 2.600 g (6.000 rpm)
durante 3 minutos. El sobrenadante se eliminó y las perlas se
volvieron a suspender en 100 \mul de Tris-HCl 0,1
M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5% (TNTB). Se
añadieron 7 \mul de 2 mg/ml de anticuerpo monoclonal M5
anti-FLAG biotinilado (Sigma) a las perlas que se
volvieron a suspender y la mezcla se incubó a temperatura ambiente
durante dos horas. Tras el recubrimiento con el anticuerpo, las
perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de TNTB, se volvieron a
suspender en 100 \mul de TNTB y se dividieron en las alícuotas 1
y 2 de 10 \mul y las alícuotas 3 y 4 de 40 \mul. Se preparó
disolución madre 0,7 nM de o, (nº 1) ADN de FLAG-HA
puro,(nº 2) ADN de folA puro o (nº 3 y nº 4) ADN de
FLAG-HA puro diluido en un exceso de 1000 veces de
ADN de folA en ADN lambda digerido con HindIII y se
aplicó a las alícuotas de perlas. La reacción de unión se dejó
avanzar durante toda la noche a 4ºC. El máximo número de genes por
perla fue 2 en las alícuotas 1-3 y 0,2 en la
alícuota 4. Las perlas recubiertas con el constructo de
FLAG-HA sirvieron como control positivo y las
perlas recubiertas con folA como control negativo.
Después de incubación durante toda la noche a
4ºC, las perlas se lavaron dos veces en TNTB y se volvieron a
suspender en mezcla de traducción in vitro S30 (sistema de
extracto S30 para moldes lineales, Promega) complementada con ARN
polimerasa de T7 (20 unidades/\mul).
Las reacciones de traducción in vitro
enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10
\mul durante \sim2 minutos) a 0,5 ml de fase aceitosa enfriada
en hielo (recientemente preparada disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v)
(Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido
por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074)
en un vial Biofreeze de Costar de 5 ml (nº 2051)) mientras se
agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de
pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La
agitación (a 1150 rpm) continuó durante 3 minutos adicionales en
hielo. Entonces, las reacciones se incubaron 90 min a 30ºC.
Las emulsiones se transfirieron a tubos de
microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 8 min 6,5 krpm en una
microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión
concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se
añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl
0,15 M, Tween 20 al 0,05% (TNT) y la emulsión se rompió extrayendo
4 veces con 1 ml de hexano, removiendo entre cada adición de hexano.
El hexano residual se eliminó burbujeando aire a través de la
suspensión de perlas durante 1-2 min a temperatura
ambiente.
Entonces, las perlas de las emulsiones rotas se
lavaron dos veces con 100 \mul de TNT en una placa de filtración
MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore,
MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado.
Entonces, las perlas se volvieron a suspender en TNTB a 10^{6}
perlas/\mul y que contenía 100 mU/ml de conjugado de alta afinidad
anti-HA-peroxidasa de rata (3F10)
(Boehringer Mannheim).
Las perlas se incubaron con el anticuerpo
durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces
con 200 \mul de TNT antes de volver a suspenderse en 2 ml de Tris
0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. Las perlas suspendidas se sonicaron
durante 1 min en hielo usando un ultrasonidos de Heat Systems a una
potencia del 1,95% del ciclo, punta de 3,4 mm. Las perlas sonicadas
se volvieron a suspender a 10^{8} perlas/ml en Tris 0,2 M,
imidazol 10 mM, pH 8,8. A esta suspensión de perlas se añadió un
volumen igual de amplificación de señal de tiramina (TSA), tampón
Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, H_{2}O_{2} al 0,004%, 5
\mug/ml de fluoresceína-tiramina.
La fluoresceína-tiramina se
sintetizó como se describe por Hopman y col. (Anthon H.N. Hopman,
Frans C.S. Ramaekers, Ernst J.M. Speel, The Journal of
Histochemistry and Cytochemistry, volumen 46(6),
771-777, 1998).
La reacción se deja avanzar durante cinco
minutos a temperatura ambiente y se detiene mediante la adición de
1/10 del volumen de albúmina de suero bovino al 10% en PBS (BSA,
Sigma). Las perlas se centrifugaron lentamente en alícuotas de 2 ml
de la reacción de marcado y se lavaron 2 veces en TNTB y una vez en
PBS. Finalmente, las perlas se volvieron a suspender en 2 ml de PBS
y se sonicaron como anteriormente.
Las perlas recubiertas con genes que codifican
folA, FLAG-HA o dilución de 1000 veces de
FLAG-HA en folA se analizaron en un citómetro
de flujo FACScan de Becton Dickinson.
En la figura 18, el histograma A de baja
resolución demuestra que las perlas que llevan ADN de
FLAG-HA (muestra nº 1) están significativamente
marcadas de manera más fluorescente que el control negativo
folA (muestra nº 2). Las mezclas nº 3 y nº 4 pinchadas se
ejecutan de manera predominantemente idéntica a la muestra de
control negativo, excepto por un pequeño número de perlas sumamente
fluorescentes (panel B). El 0,04% de perlas en la muestra nº 3 y el
0,02% de perlas en la muestra nº 4 se clasifican en la región M1 que
cubre el 95% de los acontecimientos positivos.
Las perlas en las muestras nº 3 y nº 4 que se
clasifican en la región M1 se clasificaron usando un clasificador
de células activado por fluorescencia de MoFlo. Se adquirieron dos
conjuntos de perlas clasificadas para ambas muestras nº 3 y nº 4.
En el conjunto uno se recogieron 500 perlas en un único tubo. En el
conjunto dos se recogieron 96 perlas individualmente en los
pocillos de una placa de 96 pocillos. Ambos conjuntos de perlas se
sometieron a PCR de 35 ciclos usando los cebadores pETrev.b y
FLAGrev1.
\newpage
Los productos de amplificación se analizaron por
electroforesis en gel (figura 19). Los tamaños de producto son de
903 bases para FLAG-HA y 1390 pb para
folA.
El análisis electroforético en gel de los
productos de reacciones de amplificación sugiere un enriquecimiento
significativo durante el transcurso de la clasificación. En el panel
A no hay bandas de FLAG-HA visibles en los carriles
de los productos amplificados de las reacciones sin clasificar nº 3
y nº 4, mientras que la banda de FLAG-HA en las
muestras de las perlas clasificadas es fuertemente visible. Los
datos definitivos respecto a la naturaleza del ADN amplificado se
obtuvieron de los análisis de ADN amplificado de perlas
individuales. En total, 22 perlas de 96 dieron un producto de ADN
para la reacción nº 3 y el 50% de éstas eran FLAG-HA
puro. Para la reacción nº 4, 9 perlas dieron productos y 8 fueron
FLAG-HA.
Los datos de perlas individuales para la
reacción nº 3 sugieren que, a la concentración aplicada,
nominalmente 2 moléculas de ADN/perla, la mayoría de las perlas
sólo tienen de hecho un gen unido que permita el enlace inequívoco
entre el gen y su producto. Sin embargo, un número relativamente
alto de perlas marcadas positivamente significa que aproximadamente
el 50% de las perlas recuperadas fueron positivos falsos. En la
muestra nº 4, donde solo hubo \approx0,1 genes/perla, la pureza
del ADN recuperado se aproximó al 90%, que indica un enriquecimiento
de casi 1000 veces en una etapa.
\vskip1.000000\baselineskip
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<120> PROCEDIMIENTO DE CLASIFICACIÓN
ÓPTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
21465-202-019
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia insertada en el plásmido
pGEM-4Z
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaagcttaata attttgttta actttaagaa ggagatatag ccatgg
\hfill46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia insertada en el vector
pET-23d
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptataccatgg actacaaaga tgacgatgat aaaatgcatg gcaacgaagg taccggatcc
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia codificada por el inserto
pET-23d
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met His
Gly Asn Glu Gly Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia insertada en el vector
pGEM-4Z(K2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatgggggg ctcgagc
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia codificada por el inserto
pGEM-4Z(K2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Gly Ser Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Región policonectora de
pET-23d(FLAG)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> marca de péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> región codificante del constructo de
expresión FLAG-HA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> marca de péptido FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met His
Gly Asn Glu Gly Thr}
\sac{Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> marca de péptido HA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gly Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp
Tyr Ala Gly Gly Gly}
\sac{Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> EDHFR-Fo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgagctagag gtaccttatt accgccgctc cagaatctca aagcaatag
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> EDHFR-Ba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LMB2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> folA-FW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgaagct tcgatcagtc tgattgcggc g
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> folA-BW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcctcgag ttccgccgct ccagaatctc
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pET for.b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactccaacg tcaaagggcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pETrev.b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttttcacc gtcatcaccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> GFP-FW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcgaagct tcgagtaaag gagaagaact tttc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> GFP-BW
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgcctcgag ttttgtatag ttcatccatg ccatg
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> GSTM2-2Fo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgatgccggt accttattac ttgttgcccc agacagcc
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> GSTM2-2Ba
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LMB2
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtaaaacgac ggccagt
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> LMB3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggaaacag ctatgac
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgatacgtc ggtaccttat tatgacgccc gcaaggtcgg tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>
N-Flag-OPD-Bc
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BCCP5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctaggtcatg gatccatgaa actgaaggta acagtcaacg gc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BCCP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatagcta agcttttatt attcgatgag ctcgagatcc cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BCCPHis+
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatcgaaggt ggcagctctg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BCCPHis-
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggccgcagag ctgccacctt cgatgagct
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BirA5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcgtagcac tcgagcatga aggataacac cgtgcca
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> BirA3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtcatgactg gtaccttatt atttttctgc actacgcag
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> FLAG
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcatggactac aaagatgacg atgataaaat gcatggcaac gaaggtaccg
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> FLAGas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccggtac cttcgttgca tgcattttat catcgtcatc tttgtagtc
\hfill49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> FLAGHA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pETrev..b
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttttcacc gtcatcaccg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> pETfor
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactccaacg tcaaagggcg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> FLAGrev1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaactcagctt cctttcgggc
\hfill20
Claims (26)
1. Un procedimiento para aumentar la
concentración de una molécula de ácido nucleico que comprende las
etapas de:
(a) formar microcápsulas acuosas en una emulsión
agua en aceite, en la que dichas microcápsulas comprenden una fase
interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase
externa hidrófoba y en la que una pluralidad de las microcápsulas
incluyen una molécula de ácido nucleico, un soporte de fase sólida
que puede ligarse a la molécula de ácido nucleico y una disolución
acuosa que comprende componentes necesarios para realizar la
amplificación de ácidos nucleicos en la fase interna acuosa;
(b) amplificar la molécula de ácido nucleico en
las microcápsulas para formar copias de producto amplificado de la
molécula de ácido nucleico;
(c) capturar las copias de producto amplificado
al soporte de fase sólida en las microcápsulas; y
(d) clasificar según un cambio en las
propiedades ópticas del ácido nucleico; aumentando así la
concentración de la molécula de ácido nucleico.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha amplificación de ácidos nucleicos se realiza usando
amplificación por Q\beta replicasa, reacción en cadena de la
ligasa, replicación de secuencia autosostenida o amplificación por
desplazamiento de cadenas.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que dicha amplificación de ácidos nucleicos se realiza usando
la reacción en cadena de la polimerasa.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1,
la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que la emulsión
agua en aceite incluye al menos un estabilizador de emulsión.
5. Un procedimiento según la reivindicación 4,
en el que dicho estabilizador de emulsión es un tensioactivo no
iónico.
6. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
reivindicación 5, en el que el estabilizador de emulsión se
selecciona de monooleato de sorbitán y monooleato de
polioxietilensorbitán.
7. Un procedimiento según la reivindicación 4,
en el que dicho estabilizador de emulsión es un tensioactivo
aniónico.
8. Un procedimiento según la reivindicación 4 o
reivindicación 7, en el que el estabilizador de emulsión se
selecciona de colato sódico, glicocolato sódico, taurocolato sódico
y desoxicolato sódico.
9. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que la emulsión es
termoestable.
10. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que la molécula de ácido nucleico
comprende una marca de biotina.
11. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que el soporte de fase sólida es
una perla.
12. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que dicha perla comprende un recubrimiento de avidina o
estreptavidina.
13. Un procedimiento según la reivindicación 11
o reivindicación 12, en el que dicha perla se selecciona de perlas
de poliestireno, paramagnéticas y magnéticas.
14. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que el soporte de fase sólida es
una perla, la amplificación de ácidos nucleicos se realiza
utilizando reacción en cadena de la polimerasa y la emulsión es
termoestable.
15. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente, en el que la molécula de ácido nucleico
es ADN genómico o ADNc.
16. Un procedimiento según cualquier
reivindicación precedente en el que, cuando se forma una pluralidad
de microcápsulas, cada una contiene, en promedio, una o menos de una
molécula de ácido nucleico.
17. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-15 en el que, cuando se forma una
pluralidad de microcápsulas, cada una contiene, en promedio, entre 5
y 1000 moléculas de ácidos nucleicos.
18. Un procedimiento para producir producto
génico de uno o más elementos genéticos que comprenden ácido
nucleico, comprendiendo dicho procedimiento:
(a) proporcionar perlas y uno o más elementos
genéticos que comprenden ácido nucleico, en el que dichas perlas
están adaptadas para acoplarse a dicho uno o más elementos genéticos
y producto génico producido de dichos elementos genéticos, y dicho
uno o más elementos genéticos están adaptados para acoplarse a
dichas perlas, y combinar dichas perlas y elementos genéticos de
forma que dichos elementos genéticos se unan a dichas perlas;
(b) compartimentar dicho uno o más elementos
genéticos unidos a perlas en microcápsulas acuosas con componentes
requeridos para producir producto génico de dicho uno o más
elementos genéticos, formándose dichas microcápsulas en una emulsión
agua en aceite y en el que dichas microcápsulas comprenden una fase
interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase
externa hidrófoba;
(c) expresar dicho uno o más elementos genéticos
dentro de dichas microcápsulas para producir productos génicos
respectivos, de forma que dichos productos génicos se vuelven a
acoplar a dichas perlas, en el que dicha etapa de expresión
comprende transcripción o replicación, y dicho producto génico se
selecciona de ADN, ARN o ácido nucleico; y
(d) clasificar según un cambio en las
propiedades ópticas de uno o más elementos genéticos.
19. Un procedimiento según la reivindicación 18,
en el que dichas perlas comprenden perlas de poliestireno, no
magnéticas, magnéticas o paramagnéticas.
20. Un procedimiento según la reivindicación 18
ó 19, en el que dicho uno o más elementos genéticos comprenden una
biblioteca de elementos genéticos que está compartimentada en dichas
microcápsulas.
21. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 18-20, en el que dichas perlas
están recubiertas con una sustancia para unir los elementos
genéticos con muy alta afinidad, por ejemplo avidina o
estreptavidina.
22. Un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 18-21, que comprende aumentar la
concentración de dicho ácido nucleico dentro de dichas microcápsulas
mediante amplificación.
23. Un procedimiento según la reivindicación 22,
en el que dicha amplificación comprende transcripción usando ARN
polimerasas, la reacción en cadena de la polimerasa, amplificación
por Q\beta replicasa, la reacción en cadena de la ligasa o sistema
de replicación de secuencia autosostenida y amplificación por
desplazamiento de cadenas.
24. Un procedimiento según la reivindicación 22
ó 23, en el que dicha emulsión es termoestable y dicha amplificación
comprende ciclado térmico.
25. Un procedimiento según la reivindicación 21,
en el que dicho ácido nucleico se biotinila para acoplarse a dichas
perlas.
26. Un procedimiento según la reivindicación 25,
en el que dicho ácido nucleico se biotinila mediante amplificación
por PCR con un cebador de biotinilización en 5'.
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