ES2293161T3 - Procedimiento de clasificacion optica. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de: (a) formar microcápsulas acuosas en una emulsión agua en aceite, en la que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba y en la que una pluralidad de las microcápsulas incluyen una molécula de ácido nucleico, un soporte de fase sólida que puede ligarse a la molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende componentes necesarios para realizar la amplificación de ácidos nucleicos en la fase interna acuosa; (b) amplificar la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias de producto amplificado de la molécula de ácido nucleico; (c) capturar las copias de producto amplificado al soporte de fase sólida en las microcápsulas; y (d) clasificar según un cambio en las propiedades ópticas del ácido nucleico; aumentando así la concentración de la molécula de ácido nucleico.

Description

Procedimiento de clasificación óptica.

Un procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico y un procedimiento para producir producto génico.

La presente invención se refiere a procedimientos para uso en evolución in vitro de bibliotecas moleculares. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos para aumentar la concentración de productos génicos que codifican ácidos nucleicos en los que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están ligados por compartimentación. La presente invención también se refiere a procedimientos para producir productos génicos de uno o más elementos genéticos.

La evolución requiere la generación de diversidad genética (diversidad en ácido nucleico) seguida por la selección de aquellos ácidos nucleicos que dan como resultado características beneficiosas. Debido a que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado de un organismo están físicamente ligados (estando confinados los ácidos nucleicos dentro de las células que codifican), múltiples rondas de mutación y selección pueden dar como resultado la supervivencia progresiva de organismos con idoneidad creciente. Los sistemas para la rápida evolución de ácidos nucleicos o proteínas in vitro imitan ventajosamente este procedimiento a nivel molecular en el que el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado están ligados y puede seleccionarse la actividad del producto génico.

Avances recientes en la biología molecular han permitido coseleccionar algunas moléculas según sus propiedades junto con los ácidos nucleicos que codifican. Los ácidos nucleicos seleccionados pueden clonarse posteriormente para posterior análisis o usarse o someterse a rondas adicionales de mutación y selección.

Común a estos procedimientos es el establecimiento de grandes bibliotecas de ácidos nucleicos. Las moléculas que tienen las características deseadas (actividad) pueden aislarse mediante regímenes de selección que seleccionan la actividad deseada del producto génico codificado, tal como una actividad bioquímica o biológica deseada, por ejemplo actividad de unión.

La tecnología de expresión en fagos ha sido sumamente satisfactoria en proporcionar un vehículo que permita la selección de una proteína expresada mediante la proporción del enlace esencial entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado (Smith, 1985; Bass y col., 1990; McCafferty y col., 1990; para revisión véase Clackson y Wells, 1994). Las partículas de fagos filamentosos actúan como paquetes de expresión genética con proteínas en el exterior y los elementos genéticos que las codifican en el interior. El estrecho enlace entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado es un resultado de la unidad del fago dentro de bacterias. Como las bacterias individuales se multiplican rara vez infectadas, en la mayoría de los casos todos los fagos producidos a partir de una bacteria individual llevarán el mismo elemento genético y expresarán la misma proteína.

Sin embargo, la expresión en fagos se basa en la creación de bibliotecas de ácidos nucleicos in vivo en bacterias. Por tanto, la limitación práctica en el tamaño de la biblioteca permitida por la tecnología de expresión en fagos es del orden de 10^{7} a 10^{11}, incluso aprovechándose de los vectores del fago \lambda con replicones suprimibles del fago filamentoso. La técnica se ha aplicado principalmente a la selección de moléculas con actividad de unión. Usando esta técnica también se ha aislado un pequeño número de proteínas con actividad catalítica; sin embargo, la selección no fue directamente para la actividad catalítica deseada, pero tampoco para unirse a un análogo en estado de transición (Widersten y Mannervik, 1995) o reaccionar con un inhibidor suicida (Soumillion y col., 1994; Janda y col., 1997). Más recientemente ha habido algunos ejemplos de enzimas seleccionadas usando expresión en fagos mediante la formación de productos (Atwell y Wells, 1999; Demartis y col., 1999; Jestin y col., 1999; Pederson y col., 1998), pero en todos estos casos la selección no era para renovación múltiple.

Se han seleccionado ligandos de péptidos específicos para unirse a receptores mediante selección de afinidad usando grandes bibliotecas de péptidos ligadas al extremo de C del represor lac LacI (Cull y col., 1992). Cuando se expresa en E. coli, la proteína del represor liga físicamente el ligando al plásmido codificante uniéndose a una secuencia del operador lac en el plásmido.

También se ha informado de un sistema de expresión en polisoma completamente in vitro (Mattheakis y col., 1994; Hanes y Pluckthun, 1997) en el que los péptidos nacientes están unidos físicamente mediante el ribosoma al ARN que los codifica. También se ha descrito un sistema alternativo completamente in vitro para ligar el genotipo al fenotipo haciendo fusiones de ARN-péptidos (Roberts y Szostak, 1997; Nemoto y col., 1997).

Sin embargo, el alcance de los sistemas anteriores está limitado a la selección de proteínas y además permite selección directa de actividades distintas de la actividad de unión, por ejemplo actividad catalítica o reguladora.

La selección y evolución de ARN in vitro (Ellington y Szostak, 1990), algunas veces denominada en lo sucesivo SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) (Tuerk y Gold, 1990), permite la selección tanto para la actividad de unión como la química, pero sólo para ácidos nucleicos. Si la selección es para unir, una reunión de ácidos nucleicos se incuba con sustrato inmovilizado. Los no aglutinantes se lavan, entonces los aglutinantes se liberan, se amplifican y todo el procedimiento se repite en etapas iterativas para enriquecer mejores secuencias de unión. Este procedimiento también puede adaptarse para permitir el aislamiento de ARN y ADN catalítico (Green y Szostak, 1992; para revisiones véase Chapman y Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold y col., 1995; Moore, 1995).

Sin embargo, la selección de actividad "catalítica" o de unión usando SELEX sólo es posible porque la misma molécula desempeña el doble papel de llevar la información genética y ser el catalizador o molécula de unión (aptámero). Si la selección es para "autocatálisis", la misma molécula también debe desempeñar el tercer papel de ser un sustrato. Debido a que el elemento genético debe desempeñar el papel de tanto el sustrato como el catalizador, la selección sólo es posible para acontecimientos de una única renovación. Debido a que el "catalizador" está modificado por sí mismo en este procedimiento, por definición no es un catalizador real. Adicionalmente, las proteínas pueden no seleccionarse usando el procedimiento SELEX. Por tanto, la variedad de catalizadores, sustratos y reacciones que pueden seleccionarse está rigurosamente limitada.

Aquellos de los procedimientos anteriores que permiten rondas iterativas de mutación y selección están imitando mecanismos in vitro normalmente atribuidos al procedimiento de evolución: variación iterativa, selección progresiva para una actividad deseada y replicación. Sin embargo, ninguno de los procedimientos desarrollados hasta tal punto ha proporcionado moléculas de diversidad y eficacia funcional comparable a las de aquellas que se encuentran naturalmente. Adicionalmente, hay sistemas de "evolución" no hechos por el hombre que pueden desarrollar tanto ácidos nucleicos como proteínas para efectuar el intervalo completo de actividades bioquímicas y biológicas (por ejemplo, actividades de unión, catalítica y reguladora) y que pueden combinar varios procedimientos que conducen a un producto o actividad deseada.

Por tanto, hay una gran necesidad de un sistema in vitro que venza las limitaciones anteriormente tratadas.

En Tawfik y col. (1998), Nature Biotechnology, EE.UU., Nature Publishing volumen. 7(16), páginas 652-656, se describen compartimentos similares a células hechas por el hombre para la invención molecular. En Anarbaev y col. (1998), Biochemica et Biophysica Acta Protein Structure and Molecular Enzymology, Elservier, Ámsterdam, NL, volumen 1384(2): 315-324 se estudió la actividad del complejo ADN polimerasa \alpha-primasa de timo de ternera y fragmento de Klenow de ADN polimerasa de E. coli en microemulsiones inversas. En Oberholzer y col. (1995) Chemistry and Biology, Current Biology, Londres, RU, volumen 2(10) : 677-682 se describe que puede llevarse a cabo PCR en liposomas. En Tawfik y Griffiths (1998) y en la solicitud de patente internacional WO99/62671 se describe un sistema para evolución in vitro que vence muchas de las limitaciones descritas anteriormente usando compartimentación en microcápsulas para ligar a nivel molecular genotipo y fenotipo.

En Tawfik y Griffiths (1998) y en varias realizaciones de la solicitud de patente internacional WO99/02671, la actividad deseada de un producto génico da como resultado una modificación del elemento genético que lo codifica (y está presente en la misma microcápsula). Entonces, el elemento genético modificado puede seleccionarse en una etapa posterior.

En este documento se describe un procedimiento en el que la modificación del elemento genético produce un cambio en las propiedades ópticas del propio elemento, y que tiene muchas ventajas respecto a los procedimientos previamente descritos.

Breve descripción de la invención

Según un primer aspecto de la presente descripción se proporciona un procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene una actividad deseada cuyaexpresión puede dar como resultando, directamente o indirectamente, la modificación de una propiedad óptica de un elemento genético que codifica el producto génico, que comprende las etapas de:

(a)

compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;

(b)

expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;

(c)

clasificar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada según las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos.

Las microcápsulas según la presente invención compartimentan elementos genéticos y productos génicos de forma que pueden permanecer juntos físicamente ligados. Según un primer aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de:

(a)

formar microcápsulas acuosas en una emulsión agua en aceite, en la que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba y en la que una pluralidad de las microcápsulas incluyen una molécula de ácido nucleico, un soporte de fase sólida que puede ligarse a la molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende componentes necesarios para realizar la amplificación de ácidos nucleicos en la fase interna acuosa;

\newpage

(b)

amplificar la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias de producto amplificado de la molécula de ácido nucleico; y

(c)

capturar las copias de producto amplificado al soporte de fase sólida en las microcápsulas;

aumentando así la concentración de la molécula de ácido nucleico.

Según un segundo aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para producir producto génico de uno o más elementos genéticos que comprenden ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento:

(a)

proporcionar perlas y uno o más elementos genéticos que comprenden ácido nucleico, en el que dichas perlas están adaptadas para acoplarse a dicho uno o más elementos genéticos y producto génico producido de dichos elementos genéticos, y dicho uno o más elementos genéticos están adaptados para acoplarse a dichas perlas, y combinar dichas perlas y elementos genéticos de forma que dichos elementos genéticos se unan a dichas perlas;

(b)

compartimentar dicho uno o más elementos genéticos unidos a perlas en microcápsulas acuosas con componentes requeridos para producir producto génico de dicho uno o más elementos genéticos, formándose dichas microcápsulas en una emulsión agua en aceite y en el que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba;

(c)

expresar dicho uno o más elementos genéticos dentro de dichas microcápsulas para producir productos génicos respectivos, de forma que dichos productos génicos se vuelven a acoplar a dichas perlas;

en el que dicha etapa de expresión comprende transcripción, traducción inversa, replicación o traducción, y dicho producto génico se selecciona de ADN, ARN o proteína, o ácido nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales.

Como se usa en este documento, un elemento genético es una molécula o constructo molecular que comprende un ácido nucleico. Los elementos genéticos de la presente invención puede comprender cualquier ácido nucleico (por ejemplo ADN, ARN o cualquier análogo, natural o artificial, del mismo). Además, el componente de ácido nucleico del elemento genético puede estar ligado, covalente o no covalentemente, a una o más moléculas o estructuras que incluyen proteínas, entidades y grupos químicos, y soportes de fase sólida tales como perlas (que incluyen perlas no magnéticas, magnéticas y paramagnéticas) y similares. En el procedimiento de la invención, estas estructuras o moléculas pueden diseñarse para ayudar en la clasificación y/o aislamiento del elemento genético que codifica un producto génico con la actividad deseada.

Expresión, como se usa en este documento, se usa en su significado más amplio para significar que un ácido nucleico contenido en el elemento genético se convierte en su producto génico. Por tanto, cuando el ácido nucleico es ADN, la expresión se refiere a la transcripción del ADN en ARN; donde este ARN codifica para proteína, expresión también puede referirse a la traducción del ARN en proteína. Cuando el ácido nucleico es ARN, la expresión puede referirse a la replicación de este ARN en más copias de ARN, la transcripción inversa del ARN en ADN y opcionalmente la transcripción de este ADN en más molécula(s) de ARN, además de opcionalmente la traducción de cualquiera de las especies de ARN producidas en proteína. Por tanto, preferentemente, la expresión se realiza por uno o más procedimientos seleccionados del grupo que está constituido por transcripción, transcripción inversa, replicación y traducción.

Por tanto, la expresión del elemento genético puede dirigirse tanto a ADN, ARN o proteína, como a un ácido nucleico o proteína que contiene bases o aminoácidos no naturales (el producto génico) dentro de la microcápsula de la invención, de manera que el producto génico está confinado dentro de la misma microcápsula que el elemento genético.

El elemento genético y el producto génico así codificados se ligan confinando cada elemento genético y el producto génico respectivo codificado por el elemento genético dentro de la misma microcápsula. De este modo, el producto génico en una microcápsula no puede producir un cambio en cualquier otra microcápsula. Además, pueden emplearse más medios de enlace para ligar productos génicos a los elementos genéticos que los codifican, como se expone más adelante.

El término "microcápsula" se usa en este documento según el significado normalmente asignado al mismo en la técnica y además se describe más adelante en este documento. Sin embargo, en esencia, una microcápsula es un compartimento artificial cuyos bordes delimitantes limitan el intercambio de los componentes de los mecanismos moleculares descritos en este documento que permiten la clasificación de los elementos genéticos según la función de los productos génicos que codifican.

Preferentemente, las microcápsulas usadas en el procedimiento de la presente invención podrán producirse en cantidades muy grandes, y así compartimentan una biblioteca de elementos genéticos que codifica un repertorio de productos génicos.

Como se usa en este documento, un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos se refiere a cualquier cambio en la absorción o emisión de radiación electromagnética, que incluye cambios en la absorbancia, luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Todas estas propiedades están incluidas en el término "ópticas". Los elementos genéticos pueden clasificarse, por ejemplo, por clasificación activada por luminiscencia, fluorescencia o fosforescencia. En una realización preferida se emplea citometría de flujo para clasificar elementos genéticos, por ejemplo, puede usarse dispersión de la luz (Kerker, 1983) y polarización de fluorescencia (Rolland y col., 1985) para provocar la clasificación de flujo. En una realización sumamente preferida, los elementos genéticos se clasifican usando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) (Norman, 1980; Mackenzie y Pinder, 1986).

Los cambios en propiedades ópticas pueden ser directos o indirectos. Por tanto, el cambio puede dar como resultado la alteración de una propiedad óptica en el propio elemento genético o puede conducir indirectamente a un cambio tal. Por ejemplo, la modificación de un elemento genético puede alterar su capacidad para unir un ligando ópticamente activo, alterando así indirectamente sus propiedades ópticas.

Alternativamente, las técnicas de obtención de imágenes pueden usarse para seleccionar finas películas de elementos genéticos para permitir el enriquecimiento de un elemento genético con propiedades deseables, por ejemplo por aislamiento físico de la región en la que está situado un elemento genético con propiedades deseables o eliminación de elementos genéticos no deseados. Los elementos genéticos pueden detectarse por luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia.

Según una realización preferida del primer aspecto de la presente descripción, la clasificación de elementos genéticos puede realizarse en una de esencialmente dos técnicas.

(I) En una primera realización, los elementos genéticos se clasifican tras la reunión de las microcápsulas en uno o más compartimentos comunes. En esta realización, un producto génico que tiene la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica (y que reside en la misma microcápsula) de manera que hace que pueda seleccionarse en una etapa posterior como resultado de sus propiedades ópticas modificadas. Las reacciones se detienen y entonces se rompen las microcápsulas de manera que se reúne el contenido de todas las microcápsulas individuales. La modificación del elemento genético en la microcápsula puede dar directamente como resultado la modificación de las propiedades ópticas del elemento genético. Alternativamente, la modificación puede permitir que los elementos genéticos se modifiquen adicionalmente fuera de las microcápsulas de manera que se induzca un cambio en sus propiedades ópticas. La selección de los elementos genéticos con propiedades ópticas modificadas permite el enriquecimiento de los elementos genéticos que codifican el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada. Por consiguiente, la descripción proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la descripción, en el que en la etapa (b) el producto génico que tiene la actividad deseada modifica el elemento genético que lo codifica para permitir el aislamiento del elemento genético como resultado de un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético. Por supuesto, debe entenderse que la modificación puede ser directa, porque se produce por la acción directa del producto génico en el elemento genético, o indirecta, en la que una serie de reacciones, una o más de las que implica el producto génico que tiene la actividad deseada, conduce a la modificación del elemento genético.

(II) En una segunda realización, los elementos genéticos pueden clasificarse mediante un procedimiento de múltiples etapas que implica al menos dos etapas, por ejemplo, con el fin de permitir la exposición de los elementos genéticos a condiciones que permitan que se produzcan al menos dos reacciones separadas. Como será evidente para expertos en la materia, la primera etapa de microencapsulación de la descripción da ventajosamente como resultado condiciones que permiten la expresión de los elementos genéticos - sea transcripción, transcripción y/o traducción, replicación o similares. En estas condiciones puede no ser posible seleccionar una actividad del producto génico particular, por ejemplo porque el producto génico pueda no ser activo en estas condiciones, o porque el sistema de expresión contiene una actividad interferente. Por tanto, la descripción proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la presente descripción en el que la etapa (b) comprende expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas, ligar los productos génicos a los elementos genéticos que los codifican y aislar los complejos así formados. Esto permite aislar los elementos genéticos y sus productos génicos asociados de las cápsulas antes de que tenga lugar la clasificación según la actividad del producto génico. En una realización preferida, los complejos se someten a otra etapa de compartimentación antes de aislar los elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene la actividad deseada. Esta etapa de compartimentación, que ventajosamente tiene lugar en microcápsulas, permite la realización de otras reacciones, a diferentes condiciones, en un entorno en el que los elementos genéticos y sus productos génicos respectivos están físicamente ligados. La clasificación eventual de elementos genéticos puede realizarse según la realización (I) anterior.

La "encapsulación secundaria" también puede realizarse con elementos genéticos ligados a productos génicos por otros medios tales como por expresión en fago, expresión en polisoma, fusión de ARN-péptido o fusión de péptidos del represor lac.

El (Los) elemento(s) genético(s) seleccionado(s) también pueden someterse a rondas posteriores, opcionalmente más estrictas, de clasificación en etapas iterativamente repetidas, volviendo a aplicar el procedimiento de la descripción bien en su totalidad o sólo en etapas seleccionadas. Mediante la confección apropiada de las condiciones pueden aislarse elementos genéticos que codifican productos génicos que tienen una actividad mejor optimizada después de cada ronda de selección.

Adicionalmente, los elementos genéticos aislados después de una primera ronda de clasificación pueden someterse a mutagénesis antes de repetir la clasificación mediante repetición iterativa de las etapas del procedimiento de la descripción como se explican anteriormente. Después de cada ronda de mutagénesis, algunos elementos genéticos se habrán modificado de tal manera que se mejora la actividad de los productos génicos.

Además, los elementos genéticos seleccionados pueden clonarse en un vector de expresión para permitir la posterior caracterización de los elementos genéticos y sus productos.

En un segundo aspecto, la descripción proporciona un producto que se selecciona según el primer aspecto de la descripción. Como se usa en este contexto, un "producto" puede referirse a un producto génico que puede seleccionarse según la descripción, o el elemento genético (o información genética comprendida en él).

En un tercer aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para preparar un producto génico cuya expresión puede dar como resultado, directamente o indirectamente, la modificación de las propiedades ópticas de un elemento genético que lo codifica, que comprende las etapas de:

(a)

preparar un elemento genético que codifica el producto génico;

(b)

compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;

(c)

expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;

(d)

clasificar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada usando las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos; y

(e)

expresar el producto génico que tiene la actividad deseada.

Según el tercer aspecto, la etapa (a) comprende preferentemente preparar un repertorio de elementos genéticos, en el que cada elemento genético codifica un producto génico potencialmente diferenciado. Los repertorios pueden generarse mediante técnicas convencionales tales como aquellas empleadas para la generación de bibliotecas previstas para la selección por procedimientos tales como expresión en fago. Según la presente descripción, los productos génicos que tienen la actividad deseada pueden seleccionarse del repertorio según su capacidad para modificar las propiedades ópticas de los elementos genéticos de un modo que difiera de las de otros productos génicos. Por ejemplo, los productos génicos deseados pueden modificar las propiedades ópticas en mayor medida que otros productos génicos, o en menor medida, incluyendo nada en absoluto.

En un cuarto aspecto, la descripción proporciona un procedimiento para seleccionar un compuesto o compuestos que puedan modular la actividad de un producto génico cuya expresión pueda dar como resultado, directamente o indirectamente, la modificación de las propiedades ópticas de un elemento genético que lo codifica, que comprende las etapas de:

(a)

preparar un repertorio de elementos genéticos que codifican producto génico;

(b)

compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;

(c)

expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;

(d)

clasificar los elementos genéticos que producen el (los) producto(s) génico(s) que tienen la actividad deseada usando las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos; y

(e)

poner en contacto un producto génico que tiene la actividad deseada con el compuesto o compuestos y monitorizar la modulación de una actividad del producto génico por el compuesto o compuestos.

Ventajosamente, el procedimiento comprende además la etapa de:

(g)

identificar el compuesto o compuestos que pueden modular la actividad del producto génico y sintetizar dicho compuesto o compuestos.

Este sistema de selección puede configurarse para seleccionar ARN, ADN o moléculas de proteínas con actividad catalítica, reguladora o de unión.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. La dihidrofolato reductasa puede expresarse con idéntica eficiencia a partir de genes traducidos in vitro en disolución y genes unidos a perlas paramagnéticas. La actividad de DHFR resultante de la traducción in vitro de genes folA en disolución o genes folA unidos a microperlas paramagnéticas se determina monitorizando la oxidación de NADPH a NADP por espectrofotometría a 340 nm y la actividad se calcula mediante velocidades iniciales en condiciones de So>>K_{M} (\numáx). (\blacklozenge), traducido de genes en disolución; (\blacksquare), traducido de genes unidos a micro-
perlas. 2.

Figura 2. Microscopía de epifluorescencia de emulsiones agua en aceite que demuestran que GFP puede traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las emulsiones y el producto génico traducido se une de nuevo a las microperlas haciéndolas fluorescentes.

Figura 3. Análisis de citometría de flujo de expresión de GFP en microcápsulas y unión in situ al elemento genético (microperlas). A: las características de dispersión de la luz de las perlas antes de la reacción. 75% de las perlas se ejecutan como perlas individuales. B: las características de dispersión de la luz de las perlas después de la reacción de traducción in vitro. Aproximadamente el 50% de perlas se clasifican en la puerta para perlas individuales. C: la fluorescencia de microperlas (sólo graduada para perlas individuales) recubiertas con gen T7-GFP y anticuerpo policlonal anti-GFP es significativamente superior a la señal de las perlas en las que se omitieron tanto el gen de GFP como el anticuerpo anti-GFP.

Figura 4. Síntesis de biotina-GS-DNP por la reacción catalizada por glutatión S-transferasa M2-2 humana (GST M2-2) de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma) con glutatión biotinilado reducido (biotina-GSH).

Figura 5. Detección de perlas paramagnéticas recubiertas con el producto de una reacción catalizada por enzima por citometría de flujo. Las micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina Sera-Mag^{TM} se incubaron con biotina-GS-DNP preparada por la reacción catalizada por GST M2-2 de biotina-GSH y CDNB. La biotina-GS-DNP capturada se detectó mediante incubación de las micropartículas con un anticuerpo anti-dinitrofenol de ratón seguido por una IgG antiratón de cabra del fragmento F(ab')_{2} conjugado con (FITC), fragmento F(ab')2. Después del lavado se analizaron 2 x 10^{5} micropartículas por citometría de flujo. Todos los reactivos, no se omiten reactivos de la síntesis enzimática de con biotina-GS-DNP; menos GST, la enzima GST M2-2 se omitió de la síntesis; menos biotina-GSH, biotina-GSH se omitió de la síntesis; menos CDNB, CDNB se omitió de la síntesis.

Figura 6. Síntesis de MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH (biotina enjaulada-\betaala-GSH).

Se añadió cloruro de acetilo (5 ml) a metanol anhidro (80 ml). La disolución con agitación se dejó enfriar y se añadió d-biotina (4 g). Después de agitación durante toda la noche, los disolventes se evaporaron a vacío para proporcionar un sólido blanco. El sólido se trituró con éter, se filtró y se secó a vacío (en presencia de pentóxido de fósforo) y se guardó a -20ºC.

Figura 7. Reacción de biotina enjaulada-\betaala-GSH con 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB) y desenjaulamiento fotoquímico del grupo biotina.

Figura 8. Reacción de biotina enjaulada-\betaala-GSH con 4-cloro-3-nitrobenzoato (CNB) y desenjaulamiento fotoquímico del grupo biotina.

Figura 9. GST M2-2 humana cataliza la reacción de biotina enjaulada-\betaala-GSH con CDNB y CNB en disolución y los productos de reacción pueden desenjaularse por radiación UV, capturarse sobre perlas y detectarse usando anticuerpos anti-producto marcados fluorescentemente y citometría de flujo.

Panel A: características de dispersión de la luz de perlas y la puerta para perlas individuales (R1). Panel B: fluorescencia de microperlas (graduada por R1) de reacciones con CDNB. Panel C: fluorescencia de microperlas (graduada por R1) de reacciones con CNB. Las señales de microperlas de reacciones con y sin GST M2-2 se anotan +enz y -enz, respectivamente. Las señales de microperlas de reacciones que fueron irradiadas con UV y aquellas que no se anotaron +UV y -UV, respectivamente.

Figura 10. La citometría de flujo puede usarse para distinguir perlas de compartimentos acuosos de una emulsión que contiene GST M2-2 de perlas de compartimentos sin GST M2-2 usando biotina enjaulada-\betaAla-GSH y CNB como sustratos.

Panel A: características de dispersión de la luz de una mezcla de una mezcla de microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) o perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) y puertas establecidas para perlas individuales de Bangs (R1) y perlas individuales de Molecular Probes (R2). Panel B: fluorescencia de microperlas tomada de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de Bangs (sin GST) y 2% de perlas de Molecular Probes (con GST). Panel C: fluorescencia de microperlas tomada de una mezcla de dos emulsiones en una relación de perlas de Bangs que contiene 98% de emulsión (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas de Molecular Probes (con GST). Panel D: fluorescencia de microperlas tomada de una mezcla no emulsionada de 98% de perlas de Molecular Probes (sin GST) y 2% de perlas de Bangs (con GST). Panel E: fluorescencia de microperlas tomada de una mezcla de dos emulsiones en una relación de perlas de Molecular Probes que contienen 98% de emulsión (sin GST) y una emulsión que contiene 2% de perlas de Bangs (con GST). Se solapa la fluorescencia de perlas no graduadas (sin puerta), perlas graduadas a través de R1 (R1) y perlas graduadas a través de R2 (R2).

Figura 11. La GST M2-2 humana transcrita y traducida in vitro en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en aceite cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas co-compartimentadas.

Panel A: características de dispersión de la luz de perlas y puertas para perlas individuales (R1). Panel B: fluorescencia de microperlas (graduadas a través de R1) de reacciones no emulsionadas. Panel C: fluorescencia de microperlas (graduadas a través de R1) de reacciones emulsionadas. Las señales de microperlas de reacciones con y sin ADN de GSTM2-2.LMB2-3 se anotan +ADN y -ADN, respectivamente. Las señales de microperlas de reacciones con y sin GST M2-2 recombinante se anotan +GST y -GST, respectivamente.

Figura 12. Síntesis del sustrato biotinilado enjaulado EtNP-BzGlu-biotina enjaulada (17).

Figura 13. Hidrólisis del sustrato de PTE EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada (17) para dar el producto Et-Bz-Glu-biotina enjaulada y desenjaulamiento de tanto el sustrato como el producto para dar el sustrato biotinilado correspondiente (EtNP-Bz- Glu-biotina) y producto (EtNP-Bz-Glu-biotina).

Figura 14. Preparación de conjugados de proteínas de un sustrato de PTE y producto para inmunización y ELISA.

Figura 15. PTE cataliza la reacción de EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina, y los productos de reacción se desenjaulan por radiación UV, se capturan sobre perlas y se detectan usando anticuerpos anti-producto marcados fluorescentemente y citometría de flujo.

Panel A: características de dispersión de la luz de las perlas y puerta seleccionada para perlas individuales (R2). Panel B: fluorescencia de perlas (graduadas a través de R2) de reacciones con EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 10 \muM en presencia de fragmentos de ADN OPD.LMB3-2biotina (OPD) traducidos in vitro o fragmentos de ADN M.HaeIII.LMB3-2biotina (M.HaeIII). Panel C: como B pero con EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 20 \muM. Panel D: como B pero con EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 50 \muM.

Figura 16. Reacción de EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada en presencia de perlas a las que se unieron elementos genéticos que codifican la fosfotriesterasa marcada con el péptido Flag (N-Flag-OPD.LMB3-2biotina) u otra enzima (N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina) junto con un anticuerpo que une el péptido Flag. Las perlas se hicieron reaccionar y posteriormente se analizaron mediante citometría de flujo como se describe en el texto.

Panel A: características de dispersión de la luz de perlas y puerta para perlas individuales (R1). Panel B: fluorescencia de microperlas (graduadas a través de R1) a las que se unieron fragmentos de ADN N-Flag-OPD.LMB3-2biotina (OPD) o fragmentos de ADN M.HaeIII. LMB3-2biotina (M.HaeIII) de reacciones con EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 12,5 \muM. Panel C: como B pero con EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 25 \muM.

Figura 17. BirA de E. coli transcrito y traducido in vitro cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas marcadas en el sustrato en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en aceite y en disolución en gran cantidad.

Figura 18. Análisis de citometría de flujo de muestras preparadas para el experimento de clasificación.

Figura 19. Clasificación por citometría de flujo activada por fluorescencia de los elementos genéticos.

Panel A: muestras nº 1 a nº 4 antes de la clasificación y después de la clasificación. Panel B: genes recuperados de perlas individuales clasificadas de la muestra nº 3 clasificadas en una placa de 96 pocillos. Panel C: genes recuperados de perlas individuales clasificadas de la muestra nº 4 clasificadas en una placa de 96 pocillos. Los marcadores de ADN (M) son digesto de \phiX 174-HaeIII.

(A) Descripción general

Las microcápsulas de la presente invención requieren propiedades físicas apropiadas para permitir el trabajo de la invención. Primero, para garantizar que los elementos genéticos y productos génicos no puedan difundir entre microcápsulas, el contenido de cada microcápsula se aísla preferentemente del contenido de las microcápsulas de alrededor, de manera que no hay intercambio o poco de los elementos genéticos y productos génicos entre las microcápsulas durante la escala de tiempo del experimento.

Segundo, el procedimiento de la presente descripción sólo requiere que haya un número limitado de elementos genéticos por microcápsula. Esto garantiza que el producto génico de un elemento genético individual se aislará de otros elementos genéticos. Por tanto, el acoplamiento entre el elemento genético y el producto génico será sumamente específico. El factor de enriquecimiento es el mayor con, en promedio, uno o menos elementos genéticos por microcápsula, siendo el enlace entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado tan estrecho como sea posible, ya que el producto génico de un elemento genético individual se aislará de los productos de todos los otros elementos genéticos. Sin embargo, aunque no se usa la situación teóricamente óptima de, en promedio, un único elemento genético o menos por microcápsula, una relación de 5, 10, 50, 100 ó 1000 o más elementos genéticos por microcápsula puede resultar beneficiosa en la clasificación de una gran biblioteca. Rondas de clasificación posteriores, que incluyen nueva encapsulación con distribución de elementos genéticos diferenciados, permitirán clasificar más estrictamente los elementos genéticos. Preferentemente hay un único elemento genético, o menos, por microcápsula.

Tercero, la formación y la composición de las microcápsulas no suprime ventajosamente la función de la maquinaria de la expresión de los elementos genéticos y la actividad de los productos génicos.

El (Los) sistema(s) apropiado(s) pueden variar dependiendo de la naturaleza precisa de los requisitos en cada aplicación de la descripción, como será evidentes para el experto.

Están disponibles una amplia variedad de procedimientos de microencapsulación (véase Benita, 1996) y pueden usarse para crear la microcápsula usada según la presente invención. De hecho, en la bibliografía se han identificado más de 200 procedimientos de microencapsulación (Finch, 1993).

Éstos incluyen vesículas acuosas envueltas por membranas tales como vesículas de lípidos (liposomas) (New, 1990) y vesículas de tensioactivos no iónicos (van Hal y col., 1996). Éstas son cápsulas membranosas cerradas de una o múltiples bicapas de moléculas no covalentemente montadas, estando cada bicapa separada de su vecina por un compartimento acuoso. En el caso de liposomas, la membrana está compuesta de moléculas de lípidos; éstos son normalmente fosfolípidos, pero en las membranas también pueden incorporarse esteroles tales como colesterol (New, 1990). Dentro de los liposomas puede realizarse una variedad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas que incluyen polimerización de ARN y ADN, (Chakrabarti y col., 1994; Oberholzer y col., 1995a; Oberholzer y col., 1995b; Walde y col., 1994; Wick y Luisi, 1996).

Con un sistema de vesículas envueltas por membrana mucha de la fase acuosa está fuera de las vesículas y por tanto no está compartimentada. Esta fase acuosa continua se elimina o se inhiben o destruyen los sistemas biológicos en ella (por ejemplo, por digestión de ácidos nucleicos con DNasa o RNasa) con el fin de que las reacciones se limiten a las microcápsulas (Luisi y col., 1987).

Las reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas también se han demostrado en microcápsulas generadas por una variedad de otros procedimientos. Muchas enzimas son activas en disoluciones micelares inversas (Bru y Walde, 1991; Bru y Walde, 1993; Creagh y col., 1993; Haber y col., 1993; Kumar y col., 1989; Luisi y B., 1987; Mao y Walde, 1991; Mao y col., 1992; Perez y col., 1992; Walde y col., 1994; Walde y col., 1993; Walde y col., 1988) tales como el sistema AOT-isooctano-agua (Menger y Yamada, 1979).

Las microcápsulas también se han generado por polimerización interfacial y complejación interfacial (Whateley, 1996). Las microcápsulas de este tipo pueden tener membranas rígidas impermeables o membranas semipermeables. Todas las microcápsulas semipermeables rodeadas por membranas de nitrato de celulosa, membranas de poliamida y membranas de lípido-poliamida pueden soportar reacciones bioquímicas, incluyendo sistemas multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Las microcápsulas de alginato/polilisina (Lim y Sun, 1980), que pueden formarse en condiciones muy suaves, han resultado ser muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un procedimiento eficaz para encapsular células y tejidos vivos (Chang, 1992; Sun y col., 1992).

También pueden usarse los sistemas de microencapsulación no membranosa basados en la división de fases de un entorno acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión.

Preferentemente, las microcápsulas de la presente invención se forman a partir de emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersa en la otra como gotitas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

Las emulsiones pueden producirse a partir de cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. Preferentemente, la emulsión de la presente invención tiene agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotitas finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua) y un líquido inmiscible hidrófobo (un aceite) como la matriz en la que están suspendidas estas gotitas (la fase no dispersa, continua o externa). Tales emulsiones se denominan "agua en aceite" (W/O). Esto tiene la ventaja de que toda la fase acuosa que contiene los componentes bioquímicos está compartimentada en gotitas diferenciadas (la fase interna). La fase externa, que es un aceite hidrófobo, no contiene generalmente ninguno de los componentes bioquímicos y por tanto es inerte.

La emulsión puede estabilizarse mediante la adición de uno o más agentes superficialmente activos (tensioactivos). Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes y actúan en la interfase agua/aceite para evitar (o al menos retrasar) la separación de las fases. Pueden usarse muchos aceites y muchos emulsionantes para generar emulsiones agua en aceite; una recopilación reciente enumeró más de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se usan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Aceites adecuados incluyen aceite mineral blanco ligero y tensioactivos no iónicos (Schick, 1966) tales como monooleato de sorbitán (Span^{TM}80; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitán (Tween^{TM}80; ICI).

También puede ser beneficioso el uso de tensioactivos aniónicos. Tensioactivos adecuados incluyen colato sódico y taurocolato sódico. Se prefiere particularmente desoxicolato sódico, preferentemente a una concentración del 0,5% p/v, o inferior. La inclusión de tales tensioactivos puede aumentar en algunos casos la expresión de los elementos genéticos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada suprime completamente la traducción. Sin embargo, durante la emulsión, el tensioactivo se transfiere de la fase acuosa a la interfase y se restablece actividad. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas que van a emulsionarse garantiza que las reacciones sólo avanzan después de la compartimentación.

La creación de una emulsión requiere generalmente la aplicación de energía mecánica para forzar juntas las fases. Hay una variedad de modos para hacer esto que utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, que incluyen agitadores (tales como barras de agitación magnéticas, agitadores de hélice y de turbina, dispositivos de palas y batidoras), homogeneizadores (que incluyen homogeneizadores rotor-estator, homogeneizadores de válvula a alta presión y homogeneizadores de chorro), molinos coloidales, dispositivos de emulsión por ultrasonidos y de membrana (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones agua en aceite son generalmente estables con pequeño, si hay, intercambio de elementos genéticos o productos génicos entre microcápsulas. Adicionalmente se ha demostrado que en las microcápsulas de emulsión se producen varias reacciones bioquímicas. Además, en las microcápsulas de emulsión también están activos complicados procedimientos bioquímicos, en particular transcripción y traducción génica. La tecnología existe para crear emulsiones con volúmenes de hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

El tamaño de la microcápsula preferida variará dependiendo de los requisitos precisos de cualquier procedimiento de selección individual que vaya a realizarse según la presente invención. En todos los casos habrá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la biblioteca génica, el enriquecimiento requerido y la concentración requerida de componentes en las microcápsulas individuales para lograr una expresión y reactividad eficaz de los productos génicos. Los procedimientos de expresión se producen dentro de cada microcápsula individual proporcionada por la presente descripción. Tanto la transcripción in vitro como la transcripción-traducción acoplada es menos eficaz a concentraciones de ADN inferiores a nanomolar. Debido al requisito de sólo un número limitado de moléculas de ADN que vayan a estar presentes en cada microcápsula, esto fija por tanto un límite superior práctico del posible tamaño de microcápsula. Preferentemente, el volumen medio de las microcápsulas es inferior a 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondiente a una microcápsula esférica de diámetro inferior a 10 \mum), más preferentemente inferior a 6,5 x 10^{-17} m^{3} (5 \mum de diámetro), más preferentemente aproximadamente 4,2 x 10^{-18} m^{3} (2 \mum de diámetro) e idealmente aproximadamente 9 x 10^{-18} m^{3} (2,6 \mum de diámetro).

La concentración de ADN o ARN eficaz en las microcápsulas puede aumentarse artificialmente por diversos procedimientos que serán muy conocidos para aquellos versados en la técnica. Éstos incluyen, por ejemplo, la adición de productos químicos de exclusión de volumen tales como polietilenglicoles (PEG) y una variedad de técnicas de amplificación génica que incluyen transcripción usando ARN polimerasas que incluyen aquellas de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts y col., 1975; Rosenberg y col., 1975), por ejemplo eucariotas (Weil y col., 1979; Manley y col., 1983) y bacteriófago tal como T7, T3 y SP6 (Melton y col., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki y col., 1988); amplificación por Qb replicasa (Miele y col., 1983; Cahill y col., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev y col., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren y col., 1988; Barany, 1991); y sistema de replicación de secuencia autosostenida (Fahy y col., 1991) y amplificación por desplazamiento de cadenas (Walker y col., 1992). Las técnicas de amplificación génica que requieren ciclado térmico tal como PCR y LCR pueden usarse si las emulsiones y la transcripción in vitro o los sistemas de transcripción-traducción acoplada son termoestables (por ejemplo, los sistemas de transcripción-traducción acoplada pueden prepararse a partir de un organismo termoestable tal como Thermus aquaticus).

El aumento de la concentración de ácido nucleico local eficaz permite que se usen eficazmente mayores microcápsulas. Esto permite un límite superior práctico preferido para el volumen de la microcápsula de aproximadamente 5,2 x 10^{-16} m^{3} (correspondiente a una esfera de 10 \mum de diámetro).

El tamaño de la microcápsula es preferentemente suficientemente grande para alojar todos los componentes requeridos de las reacciones bioquímicas que necesitan producirse dentro de la microcápsula. Por ejemplo, in vitro, tanto las reacciones de transcripción como las reacciones de transcripción-traducción acoplada requieren una concentración de nucleósido-trifosfato total de aproximadamente 2 mM.

Por ejemplo, con el fin de transcribir un gen a una única molécula de ARN corta de 500 bases de longitud, esto requeriría un mínimo de 500 moléculas de nucleósido-trifosfato por microcápsula (8,33 x 10^{-22} moles). Con el fin de constituir una disolución 2 mM, este número de moléculas está contenido dentro de una microcápsula de volumen 4,17 x 10^{-19} litros (4,17 x 10^{-22} m^{3} que, si es esférica, tendría un diámetro de 93 nm.

Además, particularmente en el caso de reacciones que implican traducción, debe tenerse en cuenta que los ribosomas necesarios para que se produzca la traducción son ellos mismos de aproximadamente 20 nm de diámetro. Por tanto, el límite inferior preferido para microcápsulas es un diámetro de aproximadamente 0,1 \mum (100 nm).

Por tanto, el volumen de la microcápsula es preferentemente del orden de entre 5,2 x 10^{-22} m^{3} y 5,2 x 10^{-16} m^{3} correspondiente a una esfera de diámetro entre 0,1 \mum y 10 \mum, más preferentemente de entre aproximadamente 5,2 x 10^{-19} m^{3} y 6,5 x 10^{-17} m^{3} (1 \mum y 5 \mum). Son más ventajosos los diámetros de esfera de aproximadamente 2,6 \mum.

No es coincidencia que las dimensiones preferidas de los compartimentos (gotitas de 2,6 \mum de diámetro medio) se parezcan mucho a las de bacterias, por ejemplo, Escherichia son bastones de 1,1-1,5 x 2,0-6,0 \mum y Azotobacter son células ovoides de 1,5-2,0 \mum de diámetro. En su forma más simple, la evolución de Darwin se basa en un mecanismo de 'un genotipo un fenotipo'. La concentración de un único gen compartimentado, o genoma, cae de 0,4 nM en un compartimento de 2 \mum de diámetro a 25 pM en un compartimento de 5 \mum de diámetro. La maquinaria de transcripción/traducción procariota ha evolucionado para funcionar en compartimentos de \sim1-2 \mum de diámetro, en los que los genes únicos están a concentraciones aproximadamente nanomolares. Un único gen, en un compartimento de 2,6 \mum de diámetro, está a una concentración de 0,2 nM. Esta concentración de gen es suficientemente alta para la traducción eficaz. La compartimentación en un volumen tal también garantiza que, aunque sólo se forme una única molécula del producto génico, esté presente a aproximadamente 0,2 nM, que es importante si el producto génico va a tener una actividad cambiante del propio elemento genético. Por tanto, el volumen de la microcápsula se selecciona no sólo teniendo en cuenta los requisitos de la transcripción y traducción del elemento genético, sino también la actividad cambiante requerida del producto génico en el procedimiento de la invención.

El tamaño de las microcápsulas de emulsión puede variarse simplemente confeccionando las condiciones de emulsión usadas para formar la emulsión según requisitos del sistema de selección. Cuanto mayor sea el tamaño de la microcápsula, mayor es el volumen que se requerirá para encapsular una biblioteca de elementos genéticos dados, ya que el factor limitante será en última instancia el tamaño de la microcápsula y, por tanto, el número de microcápsulas posibles por unidad de volumen.

El tamaño de las microcápsulas se selecciona no sólo teniendo en cuenta los requisitos del sistema de transcripción/traducción, sino también aquellos del sistema de selección empleado para el elemento genético. Por tanto, los componentes del sistema de selección, tales como un sistema de modificación química, pueden requerir volúmenes de reacción y/o concentraciones de reactivo que no son óptimas para la transcripción/traducción. Como se expone en este documento, tales requisitos pueden satisfacerse mediante una etapa de reencapsulación secundaria; además, pueden satisfacerse seleccionando el tamaño de la microcápsula con el fin de maximizar la transcripción/traducción y selección como un todo. Se prefiere la determinación empírica del volumen óptimo de microcápsulas y la concentración de reactivo, por ejemplo, como se expone en este documento.

Un "elemento genético" según la presente invención es como se describe anteriormente. Preferentemente, un elemento genético es una molécula o constructo seleccionado del grupo que está constituido por una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcialmente o completamente artificial compuesta por bases exclusivamente sintéticas o una mezcla de bases de procedencia natural y sintéticas, uno cualquiera de los anteriores ligado a un polipéptido y uno cualquiera de los anteriores ligado a cualquier otro grupo o constructo molecular. Ventajosamente, el otro grupo o constructo molecular puede seleccionarse del grupo que está constituido por ácidos nucleicos, sustancias poliméricas, particularmente perlas, por ejemplo perlas de poliestireno, y sustancias magnéticas o paramagnéticas tales como perlas magnéticas o paramagnéticas.

La parte de ácido nucleico del elemento genético puede comprender secuencias reguladoras adecuadas tales como aquellas requeridas para la expresión eficaz del producto génico, por ejemplo promotores, potenciadores, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias de poliadenilación, sitios de corte y empalme y similares.

Como será aparente de lo siguiente, en muchos casos el polipéptido u otro grupo o constructo molecular es un ligando o un sustrato que directa o indirectamente se une a o reacciona con el producto génico con el fin de alterar las propiedades ópticas del elemento genético. Esto permite la clasificación del elemento genético basándose en la actividad del producto génico. El ligando o sustrato puede conectarse al ácido nucleico mediante una variedad de medios que serán evidentes para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996).

Una ruta por la que la molécula de ácido nucleico puede ligarse a un ligando o sustrato es mediante biotinilación. Esto puede hacerse mediante amplificación por PCR con un cebador de biotinilación en 5' de forma que la biotina y el ácido nucleico estén covalentemente ligados.

El ligando o sustrato puede unirse al ácido nucleico modificado mediante una variedad de medios que serán evidentes para aquellos expertos en la materia (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996). El ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a una microperla de poliestireno o paramagnética (0,01 a aprox. 5,0 \mum de diámetro) que está recubierta con avidina o estreptavidina, que por tanto unirá el ácido nucleico con afinidad muy alta. Esta perla puede derivatizarse con sustrato o ligando mediante cualquier procedimiento adecuado tal como añadiendo sustrato biotinilado o mediante acoplamiento covalente.

Alternativamente, un ácido nucleico biotinilado puede acoplarse a avidina o estreptavidina complejada con una gran molécula de proteína tal como tiroglobulina (669 Kd) o ferritina (440 Kd). Este complejo puede derivatizarse con sustrato o ligando, por ejemplo mediante acoplamiento covalente al grupo \varepsilon-amino de lisinas o mediante una interacción no covalente tal como biotina-avidina.

El sustrato puede estar presente en una forma no ligada al elemento genético, pero que contiene una "marca" inactiva que requiere otra etapa para activarla tal como fotoactivación (por ejemplo de un análogo de biotina "enjaulada", (Sundberg y col., 1995; Pirrung y Huang, 1996)). Entonces, el catalizador que va a seleccionarse convierte el sustrato en el producto. Entonces, la "marca" se activa y el sustrato y/o producto "marcado" se une mediante una molécula de unión a la marca (por ejemplo avidina o estreptavidina) complejada con el ácido nucleico. Por tanto, la relación de sustrato a producto unido al ácido nucleico mediante la "marca" reflejará la relación del sustrato y producto en disolución.

Una alternativa es acoplar el ácido nucleico a un anticuerpo específico del producto (u otra molécula específica del producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada microcápsula sin ligar al elemento genético, pero tiene una "marca" molecular (por ejemplo biotina, DIG o DNP o un grupo fluorescente). Cuando el catalizador que va a seleccionarse convierte el sustrato en el producto, el producto conserva la "marca" y entonces se captura en la microcápsula por el anticuerpo específico de producto. En esta ruta, el elemento genético sólo se asocia con la "marca" cuando codifica o produce una enzima que puede convertir el sustrato en producto.

En este documento se usan los términos "aislar", "clasificar" y "seleccionar", además de variaciones de los mismos. Aislamiento se refiere al procedimiento de separar una entidad de una población heterogénea, por ejemplo una mezcla, de forma que esté libre de al menos una sustancia con la que estaba asociada antes del procedimiento de aislamiento. En una realización preferida, el aislamiento se refiere a la purificación de una entidad esencialmente hasta la homogeneidad. La clasificación de una entidad se refiere al procedimiento de aislar preferencialmente entidades deseadas de entidades no deseadas. En la medida en que esto se refiere al aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislar" y "clasificar" son equivalentes. El procedimiento de la presente invención permite la clasificación de elementos genéticos deseados de reuniones (bibliotecas o repertorios) de elementos genéticos que contienen el elemento genético deseado. Seleccionar se usa para referirse al procedimiento (que incluye el procedimiento de clasificación) de aislar una entidad según una propiedad particular de la misma. En una aplicación sumamente preferida, el procedimiento de la presente descripción es útil para clasificar bibliotecas de elementos genéticos. Según la descripción se proporciona un procedimiento según aspectos precedentes de la descripción en el que los elementos genéticos se aíslan de una biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio de productos génicos. En este documento, los términos "biblioteca", "repertorio" y "reunión" se usan según su significado común en la técnica, de forma que una biblioteca de elementos genéticos codifica un repertorio de productos génicos. En general, las bibliotecas están construidas de reuniones de elementos genéticos y tienen propiedades que facilitan la clasificación.

La selección inicial de un elemento genético de una biblioteca de elementos genéticos usando la presente descripción requerirá en la mayoría de los casos la selección de un gran número de elementos genéticos variantes. Las bibliotecas de elementos genéticos pueden crearse en una variedad de formas diferentes, que incluyen las siguientes.

Las reuniones de elementos genéticos de procedencia natural pueden clonarse de ADN genómico o ADNc (Sambrook y col., 1989); por ejemplo, bibliotecas de anticuerpo en fagos preparadas por repertorios de amplificación por PCR de genes de anticuerpos de donantes inmunizados o no inmunizados han resultado fuentes muy eficaces de fragmentos de anticuerpos funcionales (Winter y col., 1994; Hoogenboom, 1997). La bibliotecas de genes también pueden prepararse codificando todos (véase por ejemplo Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de genes (véase, por ejemplo, Lowman y col., 1991) o reuniones de genes (véase, por ejemplo, Nissim y col., 1994) mediante un oligonucleótido aleatorio o sintético dopado. Las bibliotecas también pueden prepararse introduciendo mutaciones en un elemento genético o reunión de elementos genéticos "aleatoriamente" mediante una variedad de técnicas in vivo, que incluyen; usar cepas mutantes de bacterias tales como mutD5 de E. coli (Liao y col., 1986; Yamagishi y col., 1990; Low y col., 1996); usar el sistema de hipermutación de anticuerpos de linfocitos B (Yelamos y col., 1995). Las mutaciones aleatorias también pueden introducirse tanto in vivo como in vitro por mutágenos químicos y radiación de ionización o UV (véase Friedberg y col., 1995) o incorporando análogos de base mutagénica (Freese, 1959; Zaccolo y col., 1996). Las mutaciones aleatorias también pueden introducirse en genes in vitro durando la polimerización, por ejemplo, usando polimerasas propensas a errores (Leung y col., 1989). Puede introducirse más diversificación usando recombinación de homólogos tanto in vivo (véase Kowalczykowski y col., 1994) como in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).

Por tanto, según otro aspecto de la presente descripción se proporciona un procedimiento de evolución in vitro que comprende las etapas de:

(a)

seleccionar uno o más elementos genéticos de una biblioteca de elementos genéticos según la presente descripción;

(b)

mutar el (los) elemento(s) genético(s) seleccionado(s) con el fin de generar otra biblioteca de elementos genéticos que codifican un repertorio para dar productos génicos; y

(c)

repetir iterativamente las etapas (a) y (b) con el fin e obtener un producto génico con actividad mejorada.

Las mutaciones pueden introducirse en el (los) elemento(s) genéticos(s) como se exponen anteriormente.

Los elementos genéticos según la descripción codifican ventajosamente enzimas, preferentemente de interés farmacológico o industrial, activadores o inhibidores, especialmente de sistemas biológicos tales como mecanismos de transducción de señales celulares, anticuerpos y fragmentos de los mismos y otros aglutinantes (por ejemplo factores de transcripción) adecuados para aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. Por tanto, en un aspecto preferido, la descripción permite la identificación y el aislamiento de productos clínica o industrialmente útiles. En otro aspecto de la descripción se proporciona un producto cuando se aísla por el procedimiento de la descripción.

Se desea la selección de condiciones de encapsulación adecuadas. Dependiendo de la complejidad y tamaño de la biblioteca que va a seleccionarse puede ser beneficioso ajustar el procedimiento de encapsulación tal que por microcápsula se encapsule 1 o menos de 1 elemento genético. Esto proporcionará el mayor poder de resolución. Sin embargo, si la biblioteca es mayor y/o más compleja, esto puede ser imposible de llevar a cabo; puede preferirse encapsular varios elementos genéticos juntos y basarse en la aplicación repetida del procedimiento de la descripción para lograr la clasificación de la actividad deseada. La combinación de procedimientos de encapsulación puede usarse para obtener el enriquecimiento deseado.

Estudios teóricos indican que cuanto mayor sea el número de variantes de elementos genéticos creados, más probable es que una molécula se cree con las propiedades deseadas (véase Perelson y Oster, 1979, para una descripción de cómo esto se aplica a repertorios de anticuerpos). Recientemente se ha confirmado prácticamente que, de hecho, repertorios de anticuerpos en fago mayores dan lugar a más anticuerpos con mejores afinidades de unión que repertorios más pequeños (Griffiths y col., 1994). Para garantizar que se generan variantes raras y, por tanto, pueden seleccionarse, se desea un tamaño de biblioteca mayor. Por tanto, es beneficioso el uso de microcápsulas óptimamente pequeñas.

El mayor repertorio creado hasta la fecha usando procedimientos que requieren una etapa in vivo (expresión en fagos y sistemas LacI) ha sido una biblioteca de péptidos en fago de 1,6 x 10^{11} clones que requiere la fermentación de 15 litros de bacterias (Fisch y col., 1996). Los experimentos de SELEX se llevan a cabo frecuentemente en números de variantes muy grandes (hasta 10^{15}).

Usando la presente descripción, a un diámetro de microcápsula preferido de 2,6 \mum, puede seleccionarse un tamaño de repertorio de al menos 10^{11} usando 1 ml de fase acuosa en una emulsión de 20 ml.

Además de los elementos genéticos descritos anteriormente, las microcápsulas según la descripción comprenderán otros componentes requeridos para que tenga lugar el procedimiento de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán, por ejemplo, aquellos necesarios para la transcripción y/o traducción del elemento genético. Éstos se seleccionan de los requisitos de un sistema específico de los siguientes; un tampón adecuado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los componentes necesarios, enzimas y cofactores, ARN polimerasa, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARN de transferencia, ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés con el fin de permitir la selección del producto génico modificado.

Un tampón adecuado será uno en el que todos los componentes deseados del sistema biológico son activos y, por tanto, dependen de los requisitos de cada sistema de reacción específico. Tampones adecuados para reacciones biológicas y/o químicas se conocen en la técnica y las fórmulas se proporcionan en diversos textos de laboratorio, tales como Sambrook y col., 1989.

El sistema de traducción in vitro comprenderá normalmente un extracto de células, normalmente de bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley y col., 1991; Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976) o germen de trigo (Anderson y col., 1983). Muchos sistemas adecuados están comercialmente disponibles (por ejemplo de Promega), incluyendo algunos que permitirán transcripción/traducción acoplada (todos los sistemas bacterianos y los sistemas de reticulocito y de extracto de germen de trigo TNT^{TM} de Promega). La mezcla de aminoácidos usados puede incluir, si se desea, aminoácidos sintéticos para aumentar el número posible o variedad de proteínas producidas en la biblioteca. Esto puede llevarse a cabo cargando ARNt con aminoácidos artificiales y usando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que van a seleccionarse (Ellman y col., 1991; Benner, 1994; Mendel
y col., 1995).

Después de cada ronda de selección, el enriquecimiento de la reunión de elementos genéticos de aquellos que codifican las moléculas de interés puede ensayarse mediante reacciones de transcripción/replicación in vitro no compartimentada o de transcripción-traducción acopladas. La reunión seleccionada se clona en un vector de plásmido adecuado y el ARN o la proteína recombinante se producen a partir de los clones individuales para más purificación y ensayo.

En un aspecto preferido, el entorno interno de una microcápsula puede alterarse mediante la adición de reactivos a la fase aceitosa de la emulsión. Los reactivos difunden a través de la fase aceitosa hacia el entorno de la microcápsula acuosa. Preferentemente, los reactivos son al menos parcialmente solubles en agua, de forma que una proporción de los mismos se distribuye de la fase aceitosa al entorno de la microcápsula acuosa. Ventajosamente, los reactivos son sustancialmente insolubles en la fase aceitosa. Los reactivos se mezclan preferentemente en la fase aceitosa mediante mezclado mecánico, por ejemplo removiendo.

Los reactivos que pueden añadirse mediante la fase aceitosa incluyen sustratos, componentes de tamponamiento, factores y similares. En particular, el pH interno de microcápsulas puede alterarse in situ añadiendo componentes ácidos o básicos a la fase aceitosa.

La descripción se refiere además a un procedimiento para producir un producto génico, una vez que un elemento genético que codifica el producto génico se ha clasificado mediante el procedimiento de la descripción. Claramente, el propio elemento genético puede expresarse directamente mediante medios convencionales para producir el producto génico. Sin embargo, pueden emplearse técnicas alternativas, como serán evidentes para aquellos expertos en la materia. Por ejemplo, la información genética incorporada en el producto génico puede incorporarse en un vector de expresión adecuado y expresarse del mismo.

La descripción también describe el uso de técnicas de selección convencionales para identificar compuestos que pueden interactuar con los productos génicos identificados por el primer aspecto de la descripción. En realizaciones preferidas, el producto génico que codifica ácido nucleico se incorpora en un vector y se introduce en células huésped adecuadas para producir líneas celulares transformadas que expresan el producto génico. Entonces, las líneas celulares resultantes pueden producirse para análisis cualitativos y/o cuantitativos reproducibles del (de los) efecto(s) de fármacos potenciales que afectan la función del producto génico. Por tanto, las células que expresan el producto génico pueden emplearse para la identificación de compuestos, particularmente compuestos de peso molecular pequeño, que modulan la función del producto génico. Por tanto, las células huésped que expresan el producto génico son útiles para la selección de fármacos y es otro objeto de la presente descripción para proporcionar un procedimiento para identificar compuestos que modulan la actividad del producto génico, comprendiendo dicho procedimiento exponer células que contienen producto génico que codifica ADN heterólogo, en el que dichas células producen producto génico funcional, a al menos un compuesto o mezcla de compuestos o señal cuya capacidad para modular la actividad de dicho producto génico se busca para ser determinada y a partir de entonces monitorizar dichas células para cambios producidos por dicha modulación. Un ensayo tal permite la identificación de moduladores tales como agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos del producto génico. Como se usa en este documento, un compuesto o señal que modula la actividad del producto génico se refiere a un compuesto que altera la actividad del producto génico de un modo tal que la actividad del producto génico es diferente en presencia del compuesto o señal (con respecto a la ausencia de dicho compuesto o señal).

Los ensayos de selección basados en células pueden diseñarse construyendo líneas celulares en las que la expresión de una proteína indicadora, es decir, una proteína fácilmente ensayable, tal como \beta-galactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP) o luciferasa, depende del producto génico. Un ensayo tal permite la detección de compuestos que modulan directamente la función del producto génico tales como compuestos que antagonizan producto génico, o compuestos que inhiben o potencian otras funciones celulares requeridas para la actividad del producto génico.

La presente descripción también proporciona un procedimiento para afectar exógenamente procedimientos dependientes de productos génicos que se producen en células. Las células huésped que producen producto génico recombinante, por ejemplo células de mamíferos, pueden ponerse en contacto con un compuesto de prueba y entonces el (los) efecto(s) modulador(es) del mismo puede(n) evaluarse comparando la respuesta mediada por el producto génico en presencia y ausencia del compuesto de prueba, o refiriendo la respuesta mediada por el producto génico de células de prueba o células de control (es decir, células que no expresan producto génico) a la presencia del compuesto.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un procedimiento para optimizar un procedimiento de producción que implica al menos una etapa que se facilita por un polipéptido. Por ejemplo, la etapa puede ser una etapa catalítica que se facilita por una enzima. Por tanto, la descripción proporciona un procedimiento para preparar un compuesto o compuestos que comprenden las etapas de:

(a)

proporcionar un protocolo de síntesis en el que al menos una etapa se facilita por un polipéptido;

(b)

preparar elementos genéticos que codifican variantes del polipéptido que facilita esta etapa cuya expresión puede dar como resultado, directamente o indirectamente, la modificación de las propiedades ópticas de los elementos genéticos;

(c)

compartimentar elementos genéticos en microcápsulas;

(d)

expresar los elementos genéticos para producir sus productos génicos respectivos dentro de las microcápsulas;

(e)

clasificar los elementos genéticos que producen producto(s) génico(s) de polipéptido(s) que tienen la actividad deseada usando las propiedades ópticas cambiadas de los elementos genéticos; y

(f)

preparar el compuesto o compuestos usando el producto génico de polipéptidos identificado en (g) para facilitar la etapa relevante de la síntesis.

Por medio de la descripción, las enzimas implicadas en la preparación de un compuesto pueden optimizarse mediante selección de la óptima actividad. El procedimiento implica la preparación de variantes del polipéptido que va a seleccionarse, que se corresponden con una biblioteca de polipéptidos como se hace referencia en este documento. Las variantes pueden prepararse del mismo modo que las bibliotecas tratadas en otra parte en este documento.

(B) Procedimientos de selección

El sistema puede configurarse para seleccionar ARN, ADN o moléculas de producto génico de proteínas con actividad catalítica, reguladora o de unión.

(i) Selección de unión

En el caso de selección de un producto génico con afinidad por un ligando específico, el elemento genético puede ligarse al producto génico en la microcápsula mediante el ligando. Por tanto, sólo los productos génicos con afinidad por el ligando se unirán al elemento genético y sólo aquellos elementos genéticos con producto génico unido mediante el ligando adquirirán las propiedades ópticas cambiadas que les permiten ser retenidos en la etapa de selección. Por tanto, en esta realización, el elemento genético comprenderá un ácido nucleico que codifica el producto génico ligado a un ligando para el producto génico.

El cambio en las propiedades ópticas del elemento genético después de la unión del producto génico al ligando pueden inducirse en una variedad de formas, que incluyen:

(1) el propio producto génico puede tener propiedades ópticas distintivas, por ejemplo, es fluorescente (por ejemplo proteína verde fluorescente, (Lorenz y col., 1991)).

(2) las propiedades ópticas del producto génico pueden modificarse con la unión al ligando, por ejemplo, la fluorescencia del producto génico se inactiva o mejora con la unión (Guixe y col., 1998; Qi y Grabowski, 1998).

(3) las propiedades ópticas del ligando pueden modificarse con la unión del producto génico, por ejemplo, la fluorescencia del ligando se inactiva o mejora con la unión (Voss, 1993; Masui y Kuramitsu, 1998).

(4) las propiedades ópticas de tanto el ligando como el producto génico se modifican con la unión, por ejemplo, puede haber una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) del ligando al producto génico (o viceversa) dando como resultado la emisión a la longitud de onda de emisión del "receptor" cuando la excitación es a la longitud de onda de absorción del "donante" (Heim y Tsien, 1996; Mahajan y col., 1998; Miyawaki y col., 1997).

En esta realización, para unir el producto génico al elemento genético mediante el ligando no es necesario inducir directamente un cambio en las propiedades ópticas. Todos los productos génicos que van a seleccionarse pueden contener un dominio de unión putativo que es el que va a seleccionarse, y un característica común - una marca. El elemento genético en cada microcápsula está ligado físicamente al ligando. Si el producto génico producido a partir del elemento genético tiene afinidad por el ligando, se unirá a él y estarán físicamente ligados al mismo elemento genético que lo codifica, dando como resultado que el elemento genético está "marcado". Al final de la reacción, todas las microcápsulas se combinan y todos los elementos genéticos y productos génicos se reúnen juntos en un entorno. Elementos genéticos que codifican productos génicos que presentan la unión deseada pueden seleccionarse añadiendo reactivos que se unen específicamente a o reaccionan específicamente con la "marca" y así inducen un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético permitiendo su clasificación. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo anti-"marca" marcado fluorescentemente, o un anticuerpo anti-"marca" seguido por un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente que se une al primero.

En una realización alternativa, los elementos genéticos pueden clasificarse basándose en que el producto génico, que se une al ligando, simplemente esconde el ligando de, por ejemplo, otros componentes de unión que de otra manera modificarían las propiedades ópticas del elemento genético. En este caso se seleccionarían elementos genéticos con propiedades ópticas sin modificar.

En una realización alternativa, la descripción proporciona un procedimiento según el primer aspecto de la descripción en el que en la etapa (b) los productos génicos se unen a elementos genéticos que los codifican. Entonces, los productos génicos junto con los elementos genéticos unidos se clasifican como resultado de la unión de un ligando a productos génicos que tienen la actividad de unión deseada. Por ejemplo, todos los productos génicos pueden contener una región invariable que se une covalentemente o no covalentemente al elemento genético, y una segunda región que está diversificada de manera que genera la actividad de unión deseada. En una realización alternativa, el propio ligando para el producto génico está codificado por el elemento genético y se une al elemento genético. Dicho de otro modo, el elemento genético codifica dos (o de hecho más) productos génicos, al menos uno de los cuales se une al elemento genético, y que puede unirse potencialmente entre sí. Sólo cuando los productos génicos interactúan en una microcápsula se modifica el elemento genético de un modo que en última instancia da como resultado un cambio en un cambio en sus propiedades ópticas que permite que se clasifique. Esta realización se usa, por ejemplo, para buscar bibliotecas génicas de pares de genes que codifican pares de proteínas que se unen entre sí.

La fluorescencia puede mejorarse mediante el uso de amplificación de señales de tiramida (TSA^{TM}) para hacer fluorescentes los elementos genéticos. Esto implica la unión de peroxidasa (ligada a otra proteína) a los elementos genéticos y catalización de la conversión de fluoresceína-tiramina en una forma de radical libre que entonces reacciona (localmente) con los elementos genéticos. Los procedimientos para realizar TSA se conocen en la técnica y comercialmente están disponibles kits de NEN.

TSA puede configurarse de forma que dé como resultado un aumento directo en la fluorescencia del elemento genético, o de forma que un ligando esté unido al elemento genético que está unido mediante una segunda molécula fluorescente, o una secuencia de moléculas, siendo una o más fluorescentes.

(ii) Selección de catálisis

Cuando la selección es para catálisis, el elemento genético en cada microcápsula puede comprender el sustrato de la reacción. Si el elemento genético codifica un producto génico que puede actuar como un catalizador, el producto génico catalizará la conversión del sustrato en el producto. Por tanto, al final de la reacción, el elemento genético está ligado físicamente al producto de la reacción catalizada.

También puede desearse, en algunos casos, que el sustrato no sea un componente del elemento genético. En este caso el sustrato contendría una "marca" inactiva que requiere otra etapa para activarla tal como fotoactivación (por ejemplo de un análogo de biotina "enjaulado", (Sundberg y col., 1995; Pirrung y Huang, 1996)). Entonces, el catalizador que va a seleccionarse convierte el sustrato en el producto. Entonces, la "marca" se activa y el sustrato "marcado" y/o producto unido mediante una molécula de unión de marca (por ejemplo avidina o estreptavidina) se compleja con el ácido nucleico. Por tanto, la relación de sustrato a producto unido al ácido nucleico mediante la "marca" reflejará la relación de sustrato y producto en disolución.

Las propiedades ópticas de elementos genéticos con producto unido y que codifican productos génicos con la actividad catalítica deseada pueden modificarse mediante:

(1)

el complejo producto-elemento genético que tiene propiedades ópticas características no encontradas en el complejo sustrato-elemento genético debido a, por ejemplo;

(a)

el sustrato y el producto tienen diferentes propiedades ópticas (muchos sustratos de enzimas fluorogénicas están comercialmente disponibles (véase, por ejemplo, Haugland, 1996), incluyendo sustratos para glicosidasas, fosfatasas, peptidasas y proteasas (Craig y col., 1995; Huang y col., 1992; Brynes y col., 1982; Jones y col., 1997; Matayoshi y col., 1990; Wang y col., 1990)), o

(b)

el sustrato y el producto tienen propiedades ópticas similares, pero sólo el producto, y no el sustrato, se une a o reacciona con el elemento genético;

(2)

adición de reactivos que se unen específicamente a o reaccionan con el producto y así se induce un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos permitiéndose su clasificación (estos reactivos pueden añadirse antes o después de romper las microcápsulas y reunir los elementos genéticos). Los reactivos:

(a)

se unen específicamente a o reaccionan específicamente con el producto, y no el sustrato, si tanto el sustrato como el producto están unidos al elemento genético, u

(b)

opcionalmente se unen tanto al sustrato como al producto si solo el producto, y no el sustrato, se une a o reacciona con el elemento genético.

Entonces, los elementos genéticos reunidos que codifican moléculas catalíticas pueden enriquecerse mediante la selección de los elementos genéticos con propiedades ópticas modificadas.

Una alternativa es acoplar el ácido nucleico a un anticuerpo específico de producto (u otra molécula específica de producto). En este escenario, el sustrato (o uno de los sustratos) está presente en cada microcápsula sin ligarse al elemento genético, pero tiene una "marca" molecular (por ejemplo biotina, DIG o DNP o un grupo fluorescente). Si el catalizador que va a seleccionarse convierte el sustrato en producto, el producto conserva la "marca" y entonces se captura en la microcápsula por el anticuerpo específico de producto. De este modo, el elemento genético sólo se asocia con la "marca" cuando codifica o produce una enzima que puede convertir sustrato en producto. Cuando se detienen todas las reacciones y las microcápsulas se combinan, los elementos genéticos que codifican enzimas activas estarán "marcados" y puede que ya se hayan cambiado las propiedades ópticas, por ejemplo, si la "marca" era un grupo fluorescente. Alternativamente, un cambio en las propiedades ópticas de genes "marcados" puede inducirse mediante la adición de un ligando marcado fluorescentemente que se una a la "marca" (por ejemplo avidina/estreptavidina marcada fluorescentemente, un anticuerpo anti-"marca" que es fluorescente o un anticuerpo anti-"marca" no fluorescente que puede detectarse mediante un segundo anticuerpo marcado fluorescentemente).

Alternativamente, la selección puede realizarse indirectamente mediante acoplamiento de una primera reacción a reacciones posteriores que tienen lugar en la misma microcápsula. Hay dos rutas generales por las que puede realizarse esto. En una primera realización, el producto de la primera reacción se hace reaccionar con, o se une por, una molécula que no reacciona con el sustrato de la primera reacción. Una segunda reacción acoplada sólo avanzará en presencia del producto de la primera reacción. Entonces puede utilizarse un elemento genético que codifica un producto génico con una actividad deseada usando las propiedades del producto de la segunda reacción para inducir un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético como anteriormente.

Alternativamente, el producto de la reacción que va a seleccionarse puede ser el sustrato o cofactor para una segunda reacción catalizada por enzimas. La enzima para catalizar la segunda reacción puede o traducirse in situ en las microcápsulas o incorporarse en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. Sólo cuando avance la primera reacción, la enzima acoplada generará un producto que pueda usarse para inducir un cambio en las propiedades ópticas del elemento genético como anteriormente.

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Este concepto de acoplamiento puede elaborarse para incorporar múltiple enzimas, usando cada una como sustrato el producto de la reacción previa. Esto permite seleccionar enzimas que no reaccionarán con un sustrato inmovilizado. También puede diseñarse para proporcionar sensibilidad aumentada mediante la amplificación de señales si un producto de una reacción es un catalizador o un cofactor para una segunda reacción o serie de reacciones que conducen a un producto seleccionable (por ejemplo, véase Johannsson y Bates, 1988; Johannsson, 1991). Además, un sistema en cascada de enzimas puede basarse en la producción de un activador para una enzima o la destrucción de un inhibidor de enzimas (véase Mize y col., 1989). El acoplamiento también tiene la ventaja de que puede usarse un sistema de selección común para un grupo completo de enzimas que generan el mismo producto y permite la selección de transformaciones químicas complicadas que no pueden realizarse en una única etapa.

Por tanto, un procedimiento tal de acoplamiento permite la evolución de "vías metabólicas" novedosas in vitro de un modo escalonado seleccionando y mejorando primero una etapa y luego la siguiente. La estrategia de selección se basa en el producto final de la vía, de manera que todas las etapas tempranas pueden desarrollarse independientemente o secuencialmente sin establecer un nuevo sistema de selección para cada etapa de la reacción.

Expresado de un modo alternativo, se proporciona un procedimiento para aislar uno o más elementos genéticos que codifican un producto génico que tiene una actividad catalítica deseada, que comprende las etapas de:

(1)

expresar elementos genéticos para dar sus productos génicos respectivos;

(2)

permitir que los productos génicos catalicen la conversión de un sustrato a un producto, que puede o puede no seleccionarse directamente, según la actividad deseada;

(3)

opcionalmente acoplar la primera reacción a una o más reacciones posteriores, estando modulada cada reacción por el producto de las reacciones previas, y conducir a la creación de un producto final seleccionable;

(4)

ligar el producto de catálisis seleccionable a los elementos genéticos mediante:

a)

acoplamiento de un sustrato a los elementos genéticos de un modo tal que el producto permanezca asociado con los elementos genéticos, o

b)

reacción o unión del producto seleccionable a los elementos genéticos mediante una "marca" molecular adecuada unida al sustrato que permanece en el producto, o

c)

acoplamiento del producto seleccionable (pero no el sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o interacción con el producto; y

(5)

seleccionar el producto de catálisis, junto con el elemento genético al que está unido, o por medio de sus propiedades ópticas características o mediante la adición de reactivos que se unen específicamente a o reaccionan específicamente con el producto y que así inducen un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos, en el que en las etapas (1) a (4) cada elemento genético y producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.

(iii) Selección de especificidad/selectividad de sustratos de enzimas

Los elementos genéticos que codifican enzimas con especificidad o selectividad de sustrato pueden enriquecerse específicamente llevando a cabo una selección positiva de la reacción con un sustrato y una selección negativa de la reacción con otro sustrato. Tal presión de la selección positiva y negativa combinada debe ser de gran importancia en el aislamiento de enzimas regioselectivas y estereoselectivas (por ejemplo, enzimas que pueden distinguir entre dos enantiómeros del mismo sustrato). Por ejemplo, dos sustratos (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) están cada uno marcado con marcas diferentes (por ejemplo dos fluoróforos diferentes) de forma que las marcas se unen al elemento genético mediante la reacción catalizada por enzimas. Si las dos marcas confieren propiedades ópticas diferentes en el elemento genético, la especificidad del sustrato de la enzima puede determinarse a partir de las propiedades ópticas del elemento genético y rechazarse aquellos elementos genéticos que codifican productos génicos con especificidad errónea (o sin especificidad). También pueden usarse marcas que no confieran cambio en la actividad óptica si se añaden ligandos específicos de marca con diferentes propiedades ópticas (por ejemplo anticuerpos específicos de marca marcados con diferentes fluoróforos).

(iv) Selección de regulación

Puede usarse un sistema similar para seleccionar propiedades reguladoras de enzimas.

En el caso de la selección de una molécula reguladora que actúa como un activador o inhibidor de un procedimiento bioquímico, los componentes del procedimiento bioquímico pueden o traducirse in situ en cada microcápsula o pueden incorporarse en la mezcla de reacción antes de la microencapsulación. Si el elemento genético que va a seleccionarse es para codificar un activador, la selección puede realizarse para el producto de la reacción regulada como se describe anteriormente a propósito de la catálisis. Si se desea un inhibidor, la selección puede ser para una propiedad química específica para el sustrato de la reacción regulada.

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Por tanto, se proporciona un procedimiento para clasificar uno o más elementos genéticos que codifican para un producto génico que presenta una actividad reguladora deseada, que comprende las etapas de:

(1)

expresar elementos genéticos para dar sus productos génicos respectivos;

(2)

permitir que los productos génicos activen o inhiban una reacción bioquímica o secuencia de reacciones acopladas, según la actividad deseada, de tal modo que se permita la generación o supervivencia de una molécula seleccionable;

(3)

ligar la molécula seleccionable a los elementos genéticos bien

a)

teniendo la molécula seleccionable, o el sustrato del que se deriva, unido a los elementos genéticos, o bien

b)

haciendo reaccionar o uniendo el producto seleccionable a los elementos genéticos mediante un "marca" molecular adecuada unida al sustrato que permanece en el producto, o bien

c)

acoplando el producto de catálisis (pero no el sustrato) a los elementos genéticos por medio de una reacción específica de producto o interacción con el producto;

(4)

seleccionar el producto seleccionable, junto con el elemento genético al que está unido, o por medio de sus propiedades ópticas características o mediante la adición de reactivos que se unen específicamente a o reaccionan específicamente con el producto y que así inducen un cambio en las propiedades ópticas de los elementos genéticos, en el que en las etapas (1) a (3) cada elemento genético y producto génico respectivo está contenido dentro de una microcápsula.

\vskip1.000000\baselineskip

(v) Selección de propiedades ópticas del producto génico

Es posible seleccionar propiedades ópticas inherentes de productos génicos si, en las microcápsulas, el producto génico se une de nuevo al elemento genético, por ejemplo, mediante un elemento común del producto génico que se une a un ligando que es parte del elemento genético. Entonces, después de reunir los elementos genéticos pueden clasificarse usando las propiedades ópticas de los productos génicos unidos. Esta realización puede usarse, por ejemplo, para seleccionar variantes de proteína verde fluorescente (GFP) (Cormack y col., 1996; Delagrave y col., 1995; Ehrig y col., 1995) con fluorescencia mejorada y/o espectros de absorción y emisión novedosos.

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(vi) Clasificación del flujo de elementos genéticos

En una realización preferida de la descripción los elementos genéticos se clasificarán por citometría de flujo. Puede usarse una variedad de propiedades ópticas para provocar la clasificación, incluyendo dispersión de la luz (Kerker, 1983) y polarización de fluorescencia (Rolland y col., 1985). En una realización sumamente preferida, la diferencia en las propiedades ópticas de los elementos genéticos será una diferencia en la fluorescencia y los elementos genéticos se clasificarán usando un clasificador de células activado por fluorescencia (Norman, 1980; Mackenzie y Pinder, 1986) o dispositivo similar. En una realización especialmente preferida, el elemento genético comprende una microperla no magnética (por ejemplo poliestireno) o paramagnética no fluorescente (véase Fomusek y Vetvicka, 1986), óptimamente de 0,6 a 1,0 \mum de diámetro, a la que están unidas tanto los genes como los grupos implicados en la generación de una señal fluorescente:

(1)

el equipo de clasificación de células activada por fluorescencia comercialmente disponible de fabricantes establecidos (por ejemplo Becton- Dickinson, Coulter) permite la clasificación de hasta 10^{8} elementos genéticos (acontecimientos) por hora;

(2)

la señal de fluorescencia de cada perla se corresponde rigurosamente con el número de moléculas fluorescentes unidas a la perla. Actualmente tan sólo pueden detectarse cuantitativamente uno pocos cientos de moléculas fluorescentes por partícula;

(3)

el amplio intervalo dinámico de los detectores de fluorescencia (normalmente 4 unidades logarítmicas) permite establecer fácilmente el rigor del procedimiento de clasificación, permitiéndose así la recuperación de números óptimos de elementos genéticos de la reunión de partida (las puertas pueden establecerse para separar perlas con pequeñas diferencias en fluorescencia o sólo para separar perlas con grandes diferencias en fluorescencia, dependiendo de la selección que se realice;

(4)

el equipo de clasificación de células activada por fluorescencia comercialmente disponible puede realizar la excitación simultánea a hasta dos longitudes de onda diferentes y detectar fluorescencia a hasta cuatro longitudes de onda diferentes (Shapiro, 1983) permitiendo que se realicen simultáneamente selecciones positivas y negativas mediante la monitorización del marcado del elemento genético con dos (o más) marcadores fluorescentes diferentes, por ejemplo, si se marcan dos sustratos alternativos para una enzima (por ejemplo dos enantiómeros diferentes) con diferentes marcas fluorescentes, el elemento genético puede marcarse con diferentes fluoróforos dependiendo del sustrato usado y sólo se seleccionan los genes que codifican enzimas con enantioselectividad.

(5)

las micropartículas (perlas) no magnéticas y paramagnéticas derivatizadas de manera sumamente uniforme y no derivatizadas están comercialmente disponibles de muchas fuentes (por ejemplo Sigma y Molecular Probes) (Fornusek y Vetvicka, 1986).

(vii) Procedimiento de múltiples etapas

También se apreciará que según la presente descripción no es necesario para todos los procedimientos de transcripción/replicación y/o traducción y selección avanzar en una única etapa, teniendo lugar todas las reacciones en una microcápsula. El procedimiento de selección puede comprender dos o más etapas. Primera, la transcripción/replicación y/o traducción de cada elemento genético de una biblioteca de elementos genéticos puede tener lugar en una primera microcápsula. Entonces, cada producto génico se liga al elemento genético que lo codifica (que reside en la misma microcápsula), por ejemplo, mediante un ligando específico de producto génico tal como un anticuerpo. Entonces las microcápsulas se rompen y los elementos genéticos unidos a sus productos génicos respectivos se purifican opcionalmente. Alternativamente, los elementos genéticos pueden unirse a sus productos génicos respectivos usando procedimientos que no se basan en la encapsulación. Por ejemplo, expresión en fagos (Smith, G.P.,1985), expresión en polisoma (Mattheakkis y col., 1994), fusión de ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997) o fusión de péptidos del represor lac (Cull y col., 1992).

En la segunda etapa del procedimiento, cada elemento genético purificado unido a su producto génico se pone en una segunda microcápsula que contiene componentes de la reacción que van a seleccionarse. Entonces se inicia esta reacción. Después de completarse las reacciones, las microcápsulas se rompen de nuevo y se seleccionan los elementos genéticos modificados. En el caso de reacciones de múltiples etapas complicadas en las que participan muchos componentes individuales y etapas de reacción pueden realizarse una o más etapas de intervención entre la etapa inicial de creación y enlace del producto génico al elemento genético y la etapa de final de generar el cambio seleccionable en el elemento genético.

Si fuera necesario, la liberación del producto génico del elemento genético dentro de una microcápsula secundaria puede lograrse en una variedad de formas, incluyendo mediante competición específica por un producto de bajo peso molecular por el sitio de unión o escisión de una región conectora que une el dominio de unión del producto génico del dominio catalítico bien enzimáticamente (usando proteasas específicas) o autocatalíticamente (usando un dominio de integrina).

(viii) Selección mediante activación de la expresión del gen indicador in situ

El sistema puede configurarse de forma que la actividad de unión, catalítica o reguladora deseada codificada por un elemento genético conduzca, directamente o indirectamente, a la activación de expresión de un "gen indicador" que está presente en todas las microcápsulas. Sólo los productos génicos con la actividad deseada activan la expresión del gen indicador. La actividad resultante de la expresión del gen indicador permite la selección del elemento genético (o del compartimento que lo contiene) mediante cualquiera de los procedimientos descritos en este documento.

Por ejemplo, la activación del gen indicador puede ser el resultado de una actividad de unión del producto génico de un modo análogo al "sistema de dos híbridos" (Fields y Song, 1989). La activación también puede resultar del producto de una reacción catalizada por un producto génico deseable. Por ejemplo, el producto de reacción puede ser un inductor de la transcripción del gen indicador. Por ejemplo, la arabinosa puede usarse para inducir la transcripción del promotor araBAD. La actividad del producto génico deseable también puede dar como resultado la modificación de un factor de transcripción, dando como resultado la expresión del gen indicador. Por ejemplo, si el producto génico deseado es una cinasa o fosfatasa, la fosforilación o desfosforilación de un factor de transcripción puede conducir a la activación de la expresión del gen indicador.

(ix) Amplificación

Según otro aspecto de la presente descripción, el procedimiento comprende la etapa adicional de amplificar los elementos genéticos. La amplificación selectiva puede usarse como un medio para enriquecer elementos genéticos que codifican el producto génico deseado.

En todas las configuraciones anteriores, el material genético comprendido en los elementos genéticos puede amplificarse y repetirse el procedimiento en etapas iterativas. La amplificación puede ser mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki y col., 1988) o usando una de una variedad de otras técnicas de amplificación génica que incluyen; amplificación por Qb replicasa (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren y col., 1988; Barany, 1991); el sistema de replicación de secuencia autosostenida (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991) y amplificación por desplazamiento de cadenas (Walker y col., 1992).

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En los siguientes ejemplos se ilustran diversos aspectos y realizaciones de la presente invención y la presente descripción.

Todos los documentos mencionados en el texto se incorporan mediante referencia.

Ejemplos Ejemplo 1 Las enzimas pueden expresarse con idéntica eficiencia a partir de genes en disolución y genes unidos a microperlas paramagnéticas.

Un formato para la selección de elementos genéticos usando un cambio en sus propiedades ópticas es uno en el que el elemento genético comprende una microperla a la que se ha unido el gen. En este documento se muestra cómo un gen puede ligarse por una enzima (dihidrofolato reductasa de E. coli) a una perla paramagnética y se traduce in vitro tan eficientemente como en disolución.

El gen folA de E. coli que codifica dihidrofolato reductasa (DHFR) se amplifica por PCR usando oligonucleótidos EDHFRFo y EDHFRBa. Entonces, este ADN se clona en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y Kpnl aguas abajo del promotor lac y el promotor de ARN polimerasa de T7. El oligonucleótido EDHFRBa añade el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz aguas arriba del codón de iniciación de DHFR. La secuenciación de ADN identifica un clon que tiene la correcta secuencia nucleotídica. Se encuentra que las bacterias transformadas con este clon (pGEM-folA) sobreexpresan DHFR activa (conducidas por el promotor lac) cuando se inducen con IPTG.

Entonces, el gen folA en el plásmido pGEM-folA se amplifica por PCR usando cebadores folA-FW y folA-BW, el fragmento de ADN resultante en HindIII y XhoI se digiere y se subclona en el vector de expresión pET23a digerido con HindIII/XhoI (Novagen) para dar el constructo pET23a/folA. La secuencia del gen folA amplificada por PCR se verificó mediante secuenciación.

pET23a/folA se amplificó adicionalmente con cebadores pETfor.b y pETrev.b biotinilados en 5' y radiomarcados incluyendo \alpha^{35}S-dATP 10 \muCi (Amersham Pharmacia Biotech, RU) en la mezcla de PCR. El fragmento biotinilado doble de 1765 pb resultante T7-folA se purificó en gel usando un kit de Qiagen y se cuantificó espectrofotométricamente. La actividad específica del producto fue 210000 CPM/pmol de ADN de T7-folA, como se mide en el contador de centelleo Beckman LS6000SC. Se hicieron diluciones de 10 nM y 1 nM de este ADN en 1 mg/ml de ADN lambda digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al plástico. Este fragmento de PCR se usó a partir de entonces para programar un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley, Brow y Burgess, 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (10^{3} unidades).

El fragmento de ADN se une a perlas paramagnéticas de estreptavidina (perlas Sera-Mag de 0,74 \mum de diámetro, capacidad de unión a biotina de 46 nmol/mg, Seradyn, EE.UU.) parcialmente recubiertas previamente con proteína A biotinilada (Sigma). Se añaden 2 \mul de proteína A biotinilada 80 \muM a 100 \mul (1 mg) de perlas, se deja unir a temperatura ambiente durante 1 hora, se lava una vez y se recubre durante una hora a temperatura ambiente con IgG de conejo (10 \mul, 1 mg/ml de anticuerpo por 1 mg de perlas en TBS/Tween 20 al 0,1% (TBST)). A partir de entonces las perlas se lavaron dos veces con TBS/T antes de que se añadiera ADN de T7-folA biotinilado radiomarcado y se dejó unir durante 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de ADN de T7-folA unido se calculó contando la radioactividad unida a una alícuota de perlas. Se unió \sim50% del ADN total.

Los fragmentos de ADN unidos a perlas o fragmento de ADN sin unir se añaden directamente al sistema de extracto S30. Las reacciones se incuban durante 2 horas a 37ºC.

La actividad de dihidrofolato reductasa se ensaya mediante monitorización espectrofotométrica de la oxidación de NADPH a NADP a 340 nm durante un espacio de tiempo de 10 minutos como se describe por (Williams y col., 1979; Ma y col., 1993). Se añaden 2 \mul de cada reacción de traducción in vitro inactivada a 150 \mul de tampón A (imidazol 100 mM, pH 7,0, \beta-mercaptoetanol 10 mM) y 20 \mul de NADPH 1 mM. Después de 1 minuto se añaden 20 \mul de dihidrofolato (1 mM) (H_{2}F) y la reacción se monitoriza a 340 nm usando un lector de microplacas de ThennoMax (Molecular Devices). La actividad se calcula mediante velocidades iniciales en condiciones de So>>K_{M} (\numáx).

No hay diferencia significativa en la cantidad de DHFR activa producida si el ADN está libre o unido mediante biotinas terminales a una perla recubierta con estreptavidina (véase la figura 1).

Ejemplo 2 Una proteína fluorescente (GFP) puede traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en aceite y el producto génico traducido se une de nuevo a las microperlas haciéndolas fluorescentes.

Un formato para la selección de elementos genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a una microperla y el producto se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de la microcápsula dando como resultado, directamente o indirectamente, un cambio en las propiedades ópticas de la microperla que permite que se clasifique.

En este documento se muestra que una proteína fluorescente (proteína verde fluorescente o GFP) puede transcribirse y traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en aceite y el producto génico traducido se une de nuevo a las microperlas haciéndolas fluorescentes.

La GFP en el plásmido pBS/GFP6 (Siemering y col., 1996) se amplificó por PCR usando cebadores GFP-FW y GFPBW, el fragmento de ADN resultante se digirió en HindIII y Xhol y se subclonó en el vector de expresión pET23a digerido con HindIII/XhoI (Novagen) para dar el constructo pET23a/GFP. La secuencia del gen de GFP amplificado por PCR se verificó mediante secuenciación. pET23a/GFP se amplificó adicionalmente con cebadores pETfor.b y pETrev.b biotinilados en 5'. El fragmento biotinilado doble de 2038 pb resultante T7-GFP se purificó en gel usando un kit de Qiagen y se cuantificó espectrofotométricamente. Se hicieron diluciones de 10 nM y 1 nM de este ADN en 1 mg/ml de ADN lambda digerido con HindIII para eliminar la unión no específica al plástico. Este fragmento de PCR se usó a partir de entonces para programar un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley, Brow y Burgess, 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (10^{3} unidades).

Como control se usó un fragmento de ADN de 1765 pb biotinilado T7-folA (sintetizado mediante PCR como en el ejemplo 1) para programar la síntesis de la proteína no fluorescente DHFR.

Se suspendieron 150 \mul de perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina ProActive (Bangs Laboratories, 2 x 10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl 1 M/Tween 20 al 0,1% y se dividieron en tres alícuotas de 50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \muM (T7-folA o T7-GFP) a cada alícuota de perlas, se incubaron a 43ºC durante 15 min, se lavaron tres veces en NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0 (PBS/Tween 20 al 0,1%), se volvieron a suspender en 40 \mul de TBST y se añadieron 10 \mul de proteína A biotinilada 80 mM (Sigma) (para dar la concentración final de 15 \muM). Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a suspender en 20 \mul de anticuerpo policlonal anti-GFP de conejo de dilución 1:10 (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no inmunizado (Sigma). Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a suspender en 15 \mul de premezcla S30 de un sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales (Promega), se sonicaron durante un minuto en un baño de sonicación, luego se añadió el resto de la mezcla de traducción in vitro S30 (en hielo) y se complementó con ARN polimerasa de T7 (10^{3} unidades).

Los 50 \mul de reacciones de traducción in vitro enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de fase aceitosa enfriada en hielo (recientemente preparada disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074) en un vial Biofreeze de Costar de 5 ml (nº 2051)) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante 3 minutos adicionales en hielo. Entonces, las reacciones se incubaron 3 h a 32ºC.

Se extendieron 2 \mul de emulsión en un portaobjetos de microscopio debajo de un cubreobjetos redondo de 13 mm y se visualizó usando un objetivo 20 x Neofluar en un microscopio Axioplan (Zeiss) equipado con una cámara RTEACCD-1300-YCCD (Princeton Instruments). Se usaron filtros habituales de excitación y emisión para fluoresceína y las imágenes se procesaron con el software IPLab.

Como puede verse de la figura 2, la GFP traducida de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las emulsiones está unida a las microperlas in situ cuando las microperlas se recubren con un anticuerpo anti-GFP. Esta unión se observa como concentración de fluorescencia en las perlas mediante microscopía de epifluorescencia. No se observa fluorescencia de perlas cuando falta o el gen de GFP o el anticuerpo anti-GFP.

Ejemplo 3 Una proteína fluorescente (GFP) puede traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en aceite, el producto génico traducido se une de nuevo a las microperlas y el aumento de fluorescencia de las microperlas se detecta por citometría de flujo.

Se suspendieron 150 \mul de perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina (diámetro 1 \muM; Bangs Laboratories, 2 x 10^{7} perlas/\mul) en Tris 7,4 5 mM/NaCl 1 M /Tween 20 al 0,1% y se dividieron en tres alícuotas de 50 \mul. Se añadieron 0,5 \mul de ADN 0,2 \muM (T7-folA o T7-GFP) a cada alícuota de perlas, se incubaron a 43ºC durante 15 min, se lavaron tres veces en NaH_{2}PO_{4} 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0,1%, pH 7,0 (PBS/Tween 20 al 0,1%), se volvieron a suspender en 40 \mul de TBST y se añadieron 10 \mul de proteína A biotinilada 80 \muM (Sigma) (para dar la concentración final de 15 \muM). Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a suspender en 20 \mul de anticuerpo policlonal anti-GFP de conejo de dilución 1:10 (Clontech) o 1 mg/ml de IgG de conejo no inmunizado (Sigma). Después de la incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente, las perlas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1% y se volvieron a suspender en 15 \mul de premezcla S30 de un sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales (Promega), se sonicaron durante un minuto en un baño de sonicación, luego se añadió el resto de la mezcla de traducción in vitro S30 (en hielo) y se complementó con ARN polimerasa de T7 (10^{3} unidades). Los 50 \mul de reacciones de traducción in vitro enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,95 ml de fase aceitosa enfriada en hielo (recientemente preparada disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074) en un vial Biofreeze de Costar de 5 ml (nº 2051)) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante 3 minutos adicionales en hielo. Entonces, las reacciones se incubaron 3 h a 32ºC. Para recuperar las mezclas de reacción, las emulsiones se centrifugaron a 3.000 g durante 5 minutos y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del vial. Se añadieron PBS y 2 ml de éter saturado en agua y la mezcla se removió, se centrifugó brevemente y se eliminó la fase etérea. Las perlas se lavaron dos veces con PBS y finalmente se volvieron a suspender a 10^{8} perlas/ml en PBS. Se analizaron 10^{4} perlas usando un citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson) usando excitación a 488 nm y el filtro de emisión de fluoresceína. La GFP traducida de genes unidos a microperlas individuales encapsuladas en los compartimentos acuosos de las emulsiones está unida a las microperlas in situ cuando las microperlas se recubren con un anticuerpo anti-GFP. La unión de GFP a las microperlas las hace fluorescentes (fig. 2) y aquellas perlas con GFP unida pueden distinguirse claramente de aquellas que no están mediante citometría de flujo (figura 3).

Ejemplo 4 El producto de una reacción catalizada por enzima puede capturarse en perlas paramagnéticas y perlas derivatizadas con producto identificado por citometría de flujo.

Se realizó una reacción catalizada por la enzima glutatión S-transferasa humana M2-2 (GST M2-2) para generar un producto biotinilado (figura 4). Los dos sustratos usados fueron 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma) y glutatión biotinilado reducido (biotina-GSH). El producto generado (biotina-GS-DNP) tiene biotina en un extremo para permitir el acoplamiento a micropartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y un grupo 2,4-dinitrofenol (DNP) que puede unirse mediante un anticuerpo anti-DNP.

El biotina-GSH se sintetizó añadiendo 100 mg de éster de N-hidroxisuccinimida de biotinamidocaproato (biotina-NHS; Sigma) en 1 ml de DMF a una disolución de glutatión oxidado (Fluka) en 1 ml de agua, 30 \mul de NaOH 12,5 N más 1 ml de DMF. Se añadió la biotina-NHS, en hielo, en alícuotas de 100 \mul durante 20 minutos. Entonces, el pH se ajustó a 7,0 con NaOH 1 N. El precipitado similar a jarabe que se formó durante la reacción se disolvió mediante calentamiento hasta temperatura ambiente, se removió y se añadieron 300 \mul de agua. La agitación continuó durante 2 horas a temperatura ambiente, el pH se devolvió a 7,0 añadiendo NaOH 1 N y se agitó durante toda la noche a temperatura ambiente. Entonces se usó NaOH para devolver el pH a 7,5, la reacción se agitó durante otros 30 minutos a temperatura ambiente y entonces se incubó 30 minutos más después de añadir 500 \mul de DTT 1 M. Los disolventes se evaporaron a vacío y el producto se purificó por HPLC en fase inversa usando una columna C8 y un gradiente de acetonitrilo del 10-40%, TFA al 0,1%. Biotina-GS-DNP se sintetizó enzimáticamente en una reacción de 100 \mul que contenía 1 \mug de GST M2-2 recombinante purificada, CDNB 500 \muM y biotina-GSH 200 \muM en KH_{2}PO_{4} 0,1 M, EDTA 1 mM, pH 6,5. La incubación fue durante 1 hora a 25ºC. La reacción finalizó esencialmente como se juzgó siguiendo el aumento en la absorbancia a 340 nm. También se realizaron reacciones de control 1) sin GST, 2) sin CDNB y 3) sin biotina-GSH. Las reacciones se diluyeron 200 veces (dando una concentración final de biotina 1 \muM) en Tris-HCl 5 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 1,0 M, pH 7,4 (tampón B/A). 50 \mul de las reacciones diluidas se mezclaron con 50 \mul de tampón de unión/lavado que contenía 29,3 \mug (10^{8} micropartículas) de micropartículas magnéticas recubiertas con estreptavidina Sera-Mag^{TM} de 0,737 \mum de diámetro (MG-SA; Seradyn) y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente. Las micropartículas se separaron en una placa de microtitulación (Falcon 3911) usando un imán (Dynal MPC-96) y se lavaron tres veces con Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,4 (2 x tampón de unión/lavado), luego dos veces con PBS, Tween 20 al 0,1%. Las micropartículas se volvieron a suspender en una dilución 1:2500 del anticuerpo monoclonal anti-dinitrofenol de ratón SPE21-11 (un obsequio del Prof. Zelig Eshhar) en PBS/Tween 20 al 0,1% y se incubaron 45 minutos a temperatura ambiente. Las micropartículas se lavaron tres veces en PBS/Tween 20 al 0,1%, se volvieron a suspender en PBS/Tween 20 al 0,1%que contenía 15 \mug/ml de IgG antiratón de cabra del fragmento F(ab')_{2} conjugado con fluoresceína (FITC), fragmento F(ab')2 (Jackson; 115-096-006) y se incubaron 30 minutos a temperatura ambiente. Las micropartículas se lavaron cuatro veces en PBS/Tween 20 al 0,1%, se volvieron a suspender en 1 ml de PBS/Tween 20 al 0,1% y se analizaron 2 x 10^{5} micropartículas usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson). Como puede verse de la figura 5, no hay diferencia en la distribución de intensidad de fluorescencia de perlas de las tres reacciones de control (sin GST, sin CDNB y sin biotina-GSH), en las que la fluorescencia media es \sim3. A diferencia, las perlas de la reacción catalizada por enzima tienen una fluorescencia media de 34, más 10 veces mayor. De hecho, usando la puerta mostrada (fig. 5), el 81,1% de perlas de la reacción catalizada por enzima (y recubierta con el producto biotinilado) están en la puerta, mientras que en las reacciones de control no más del 0,06% de las perlas están en la puerta. Por tanto, las perlas recubiertas con el producto de la reacción catalizada con GST pueden clasificarse fácilmente de aquellas que no están.

Ejemplo 5 Se usará glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) como un sustrato de glutatión biotinilado enjaulado y el producto biotinilado enjaulado generado puede desenjaularse posteriormente mediante radiación UV, capturarse en perlas recubiertas con avidina y detectarse por citometría de flujo.

La síntesis de biotina enjaulada (5) y sus derivados (7) se basó en los protocolos publicados (Pirrung y Huang, 1996; Sundberg y col. (1995). Sin embargo, se hicieron modificaciones significativas de estos protocolos en varias etapas de la síntesis como se describe a continuación.

Éster metílico de biotina (3, biotina-OMe) se preparó esencialmente como se describe en Sundberg y col. (1995) (véase la fig. 6):

\quad

Alcohol metilnitropiperonílico (1, MeNPOH). Se disolvió 3',4-(metilendioxi)-6'-nitroacetofenona (Lancaster; 6,2 g, 29,6 mmol) en una mezcla de THF (100 ml) y etanol (100 ml). Se añadió borohidruro sódico (1,12 g, 29,6 mmol) y la disolución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. CCF (en placas recubiertas con sílice; disolvente - metanol al 3% en DCM) indicó la conversión completa del material de partida (Rf = 0,8) en el alcohol (Rf = 0,6). Se añadió lentamente ácido clorhídrico (1 N) hasta que se detuvo el desprendimiento de hidrógeno y los disolventes se evaporaron a vacío. El sólido residual se disolvió en DCM (500 ml) y se lavó con salmuera (40 ml). La fase orgánica se secó (sobre MgSO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. La recristalización en DCM y hexano caliente dio 6,1 g de 1 (un sólido cristalino amarillo).

\quad

O-Metilnitropiperonil-carbonilimdazol (2, MeNPO-CO-Im).

\quad

Se añadió alcohol metilnitropiperonílico (1,69 g, 8 mmol) (en varias partes durante 20 minutos) a una disolución de carbonildiimidazol (CDI, 2,6 g, 16 mmol) en DCM (50 ml). La disolución se agitó durante 3 h, tras lo que CCF indicó la conversión completa del alcohol (Rf = 0,6 - metanol al 3% en DCM) en el producto (Rf = 0,45). Se añadieron DCM (100 ml) y agua (30 ml) y la mezcla de reacción se transfirió a un embudo de decantación. La mezcla se mezcló y se añadió HCl 1 N (en alícuotas de 1 ml) hasta que el pH de la fase acuosa bajó a 6. La fase acuosa se eliminó, se añadió más agua (30 ml) y se acidificó hasta pH 6 mientras se mezclaba. Finalmente, la fase de DCM se lavó con salmuera, se secó (sobre MgSO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. El sólido restante se recristalizó en DCM y hexano caliente para dar 2,2 g de 2 (un sólido cristalino amarillo).

\quad

Éster metílico de N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina (4, MeNPO-CO-biotina-OMe). Se añadió hidruro de sodio (suspensión al 60% en aceite; 100 mg, 2,5 mmol) a una suspensión con agitación de biotina-OMe (517 mg, 2 mmol) y MeNPO-CO-Im (305 mg, 1 mmol) en DCM anhidro (10 ml) en hielo. La disolución se agitó durante 30 minutos en hielo y 30 minutos a temperatura ambiente. CCF indicó la completa desaparición de MeNPO-CO-Im (Rf = 0,6 - metanol al 5% en DCM) y la aparición del producto (Rf = 0,45). También se observaron trazas del alcohol 1 (Rf = 0,7) y un producto secundario con Rf = 0,95 (probablemente di-MeNPO-carbonato) (la relación del producto frente al producto secundario anterior varió de una preparación a otra; el secado cuidadoso de los materiales de partida y la realización de la reacción en hielo dio generalmente mayores rendimientos del producto).

Una vez que se había completado la reacción se añadió DCM (100 ml) y la disolución se extrajo tres veces con NaH_{2}PO_{4} 1 M. La fase orgánica se secó (MgSO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. El jarabe restante se disolvió en DCM caliente (aprox. 5 ml), se añadió hexano (aprox. 5 ml) al punto de enturbiamiento y la disolución se dejó reposar a 4ºC durante toda la noche. Esto dio como resultado la precipitación del exceso de biotina-OMe como un sólido cristalino blanco (que se lavó con éter, se secó y se usó en reacciones posteriores). El filtrado se concentró a vacío y se purificó mediante cromatografía sobre sílice (metanol del 1,5 al 3% en DCM) para dar 4 como una espuma amarilla (con rendimientos de hasta 385 mg, o el 80% basado en equivalentes molares de 2 como material de partida).

\quad

N-(O-Metilnitropiperonil-carbonil)-biotina (5, MeNPO-CO-biotina-OH).

\quad

Se disolvió MeNPO-CO-biotina-OMe (940 mg; 1,73 mmol) en 25 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; lavado con argón). La disolución se agitó a 44ºC durante 24 horas bajo argón. Los disolventes se redujeron a vacío hasta aprox. 1 ml, se añadió agua (10 ml) y se liofilizó la mezcla resultante. El sólido resultante se disolvió en DCM con metanol al 2% (20 ml) y se añadió carbón. La mezcla se llevó a ebullición durante unos pocos minutos y se filtró. CCF (metanol al 10% en DCM) indicó la aparición del producto de la hidrólisis (Rf =0,2) y aproximadamente 5% de material de partida (MeNPO-CO-biotina-OMe; Rf = 0,9). Los disolventes se eliminaron a vacío para dar un sólido amarillo que se secó a vacío (860 mg de aprox. 95% de 5 más 5% de 4). Mayores concentraciones de HCl (por ejemplo 1 N) y mayores temperaturas (por ejemplo reflujo con THF como codisolvente) dieron como resultado la hidrólisis completa del éster metílico. Sin embargo, también se observó una cantidad significativa de alcohol 1 y biotina, que indica la hidrólisis del carbamato en estas condiciones. Debe tenerse en cuenta que se encontró que el éster metílico 4, y en particular el producto de su hidrólisis (5), eran sensibles a la oxidación. El calentamiento o incluso el almacenamiento de disoluciones de 5 en presencia de aire dio como resultado pardeamiento. Similarmente, los intentos por purificar 5 (o derivados de, por ejemplo, 7) mediante cromatografía sobre sílice condujeron a pérdidas muy altas debido a la oxidación.

\quad

Éster terc-butílico del ácido N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotin)-3-aminopropiónico (6, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OBu^{t}). Se disolvió MeNPO-CO-biotina-OH (860 mg que contiene \sim5% de MeNPO-CO-biotina-Ome; \sim1,6 mmol) en 20 ml de DCM anhidro. Se añadieron sal clorhidrato de éster terc-butílico de \beta-alanina (H-\beta-Ala-OBu^{t}) (Bachem; 362 mg; 2 mmol), N-hidroxisuccinimida (172 mg; 1,5 mmol) y trietilamina (280 \mul; 2 mmol). La disolución con agitación se enfrió en hielo y se añadió EDCI (420 mg; 2,2 mmol). La reacción se agitó durante 24 horas a 4ºC y 2 horas a temperatura ambiente. CCF (metanol al 5% en DCM) indicó la aparición del producto (Rf = 0,3) y el MeNPO-CO-biotina-OMe restante sin reaccionar (Rf = 0,45). La reacción se diluyó con DCM (30 ml) y se extrajo tres veces con NaH_{2}PO_{4} 1 M y una vez con NaHCO_{3} saturado. La fase orgánica se secó (Na_{2}SO_{4}) y el disolvente se eliminó a vacío. El jarabe restante se purificó mediante cromatografía sobre sílice (metanol al 3,0-4,5% en DCM) para dar 640 mg de 6 (una espuma amarilla).

\quad

Ácido N-(N-(O-metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropiónico (7, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH). Se disolvió éster terc-butílico 6 (510 mg; 0,84 mmol) en 15 ml de HCl 0,5 N y dioxano (4:6; lavado con argón). La disolución se agitó a 52ºC durante 24 horas bajo argón. Se añadió agua (10 ml) y la disolución resultante se liofilizó para dar un sólido que contenía (como se juzga por CCF) el producto de la hidrólisis (7) y material de partida (6; \sim 10%). Esta mezcla se purificó mediante cromatografía en columna sobre sílice (metanol al 10% en acetona más ácido acético al 0,1%) para dar 60 mg de 7 (los rendimientos bajos fueron principalmente el resultado de la oxidación de 7 sobre la sílice).

\quad

N-(N-(N-(O-Metilnitropiperonil-carbonil)-biotina)-3-aminopropionil)-glutatión (8, MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH). Se añadió carbonildiimidazol (20 mg, 120 \mumol) a una disolución de MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-OH (7,49 mg, 89 \mumol) en DMF (1,5 ml). La disolución se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y entonces se añadió, en varias alícuotas, a una disolución de glutatión oxidado (62 mg, 100 \mumol) y trietilamina (55 \mul, 0,4 mmol), en DMF (2 ml) más agua (0,15 ml), agitada en hielo. La disolución se agitó en hielo durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente. Se añadió trietilamina hasta que la disolución se volvió transparente (25 \mul) y entonces la reacción se agitó durante otras 2 horas a temperatura ambiente. Entonces se añadió DTT (0,25 ml de disolución M; 0,25 mmol) y la disolución se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos.

\quad

El producto de la reacción anterior se purificó por HPLC en fase inversa, en una columna preparativa RP-8, usando un gradiente de agua-acetonitrilo en presencia de ácido trifluoroacético al 0,1%. Se recogió el pico correspondiente a 8 (tiempo de retención = 28,6 minutos). Entonces, el producto se aisló mediante liofilización y se purificó de nuevo en HPLC en fase inversa (usando la misma columna y sistema de disolventes). El análisis del producto después de la segunda purificación por HPLC, usando HPLC analítica en fase inversa, indicó un producto (>95%) cuyo espectro UV se corresponde con 8 (específicamente, \lambda^{máx} a 355 nm indicó la presencia del grupo O-metilnitropiperonil-carbonilo de la biotina enjaulada). La concentración de 8 se determinó mediante titulación de los grupos tiol libres (usando DTNB, ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico), como Hermanson, 1996) derivados del glutatión, y también mediante absorbancia a 355 nm (correspondiente a la biotina enjaulada). Ambas mediciones independientes dieron el mismo resultado dentro del error experimental.

El 8 purificado también se encontró que era un sustrato para M2-2 GST humana en la sustitución electrófila de CDNB (monitorizada por el cambio de absorbancia a 340 nm; Habig y Jakoby, 1981) con velocidades que son aproximadamente 10 veces más lentas que las observadas con glutatión en condiciones similares.

La MeNPO-CO-biotina-\beta-Ala-GSH (biotina enjaulada-\betaala-GSH) reducida se hizo reaccionar con o 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB; Sigma) o 4-cloro-3-nitrobenzoato (CNB, Acros). El producto enjaulado generado no se une a avidina o estreptavidina. Sin embargo, después del desenjaulamiento fotoquímico mediante radiación ultravioleta, el producto tiene una biotina en un extremo que se unirá a micropartículas recubiertas con avidina o estreptavidina y o un grupo 2,4-dinitrofenol (DNP) o 3-nitrobenzoato que puede unirse mediante anticuerpos anti-DNP o anti-3-nitrobenzoato apropiados (véanse las figs. 7 y 8)

Se centrifugaron 5 \mul (10^{8} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min y se eliminó el sobrenadante. Las perlas se volvieron a suspender en 5 \mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM, biotina enjaulada-\betaala-GSH 10 mM, y o CDNB 500 \muM o CNB 500 \muM. Las mezclas de reacción de 5 \mul contuvieron o 0,75 \mug de GST M2-2 humana recombinante purificada o no contuvieron enzima.

Las reacciones se incubaron durante 30 min (reacciones con CDNB) o 4 horas (reacciones con CNB) a 25ºC, tiempo después del cual se detuvieron mediante la adición de 35 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0 y se transfirieron a hielo. Entonces, cada reacción se dividió en dos alícuotas de 20 \mul cada una, una de las cuales se colocó como un punto en una capa de parafilm sobre la superficie de un bloque de aluminio enfriado en hielo. Entonces, este punto se irradió durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. La otra alícuota se dejó sin irradiar. Entonces, todas las muestras se incubaron 30 min a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado.

Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% que contiene 20 ng/\mul de anticuerpo anti-DNP de conejo marcado con Alexa-488 (Dako, nº V0401), 20 ng/\mul de antisueros anti-CNB marcado con Alexa-488 y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El antisuero anti-CNB se obtuvo en conejos mediante inmunización con conjugados de CNB-CH_{2}-KLH preparados añadiendo alícuotas de una disolución 200 mM de ácido 4-(bromometil)-3-nitrobenzoico (CNB-CH_{2}Br) en DMF a disoluciones de 5 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH) en borato 50 mM, pH 8,8 (para dar de 1,5 a 6 \mumol de CNB-CH_{2}Br por mg de proteína). Las mezclas de reacción se agitaron durante 6 horas a temperatura ambiente y temperatura y los conjugados resultantes de proteína se dializaron exhaustivamente contra solución salina de tampón fosfato (PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación (densidad de haptenos o Hd) se determinó midiendo densidades ópticas de los conjugados a 355 nm. Se encontró que éstas eran: de 7 a 11 grupos CNB-CH_{2} por molécula de BSA y de 9,4 a 24,3 por molécula de KLH, dependiendo de la cantidad de CNB-CH_{2}Br añadida a las muestras de proteína. El conjugado de CNB-CH_{2}-KLH con Hd de 14,2 se usó para inmunizar conejos usando protocolos publicados (Tawfik y col., 1993; Tawfik y col., 1997) (por el Prof. Z Eshhar, Instituto de Ciencias de Weizmann, Rehovot). Los sueros se probaron mediante ELISA para unir el conjugado CNB-CH_{2}-BSA (Hd=11) y a BSA. El primer sangrado de ambos conejos inmunizados (cuando se diluyeron 50 veces o más) presentó la selectividad deseable, dando una alta señal cuando se incubaron con el conjugado de CNB-CH_{2}-BSA y ruido muy bajo (<5%) con BSA. El suero anti-CNB se purificó usando una columna de proteína A HiTrap (Pharmacia). Ambos anticuerpos anti-CDNB y anti-CNB se marcaron con un kit de marcado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante.

Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se volvieron a suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).

Como puede verse de la fig. 9, el resto de biotina enjaulada se desenjaula con radiación UV y se une a perlas. Se observó un aumento de 19 veces en la fluorescencia media de perlas después de la reacción catalizada con GST M2-2 de biotina enjaulada-\betaala-GSH con CDNB, incluso en ausencia de radiación UV. Esto concuerda con la aparente presencia de \sim4% de biotina-\betaala-GSH en la preparación de biotina enjaulada-\betaala-GSH como se determina usando fluorimetría para medir el desplazamiento del ácido 2-anilinonaftaleno-6-sulfónico (2,6-ANS) de avidina (Mock y col., 1985). Estos resultados son coherentes con la inmovilización del ruido previamente observada de biotina enjaulada respecto a avidina 'en la oscuridad' (es decir, sin iluminación UV) que era tan alta como el 15% de la señal observada después de la iluminación (Sundberg y col. 1995). La señal 'oscura' previamente observada se atribuyó o a contaminantes traza de biotina en la preparación de biotina enjaulada, o a interacciones débiles entre avidina y componentes de la biotina enjaulada que incluyen el conector (Sundberg y col. 1995). Después de la radiación UV se observó una gran diferencia en la fluorescencia media de aquellas perlas incubadas en presencia y ausencia de GST. La fluorescencia media de las perlas con GST era 84 veces y 56 veces de la observada sin GST con CDNB y CNB como sustratos, respectivamente (fig. 9).

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Ejemplo 6 La glutatión S-transferasa M2-2 (GST M2-2) compartimentada en las gotitas acuosas de una emulsión agua en aceite cataliza la reacción del glutatión biotinilado enjaulado con 4-cloro-3-nitrobenzoato (CNB). El producto biotinilado enjaulado generado permanece compartimentado y posteriormente puede desenjaularse mediante radiación UV en los compartimentos, capturarse en una perla recubierta con avidina en el mismo compartimento y detectarse las perlas recubiertas con producto mediante citometría de flujo.

Se centrifugaron alícuotas de 20 \mul (4 x 10^{8} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) o perlas de poliestireno recubiertas con estreptavidina de 0,93 \mum de diámetro (Bangs Laboratories) cada una en una microcentrífuga a 2.600 g (6.500 rpm) durante 3 min. El sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender, en hielo, en 20 \mul de KH_{2}PO_{4} 0,1 M, pH 6,5, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2 mM, biotina enjaulada-\betaala-GSH 50 \muM, que contenía o 3 \mug de GST M2-2 humana recombinante purificada o no contenía enzima.

Entonces se emulsionaron seis mezclas de reacción esencialmente como Tawfik y Griffiths (1998):

a)

Perlas de Bangs, sin GST

b)

Perlas de Bangs, más GST

c)

Perlas de Molecular Probes, sin GST

d)

Perlas de Molecular Probes, más GST

e)

Perlas de Bangs, sin GST

f)

Perlas de Molecular Probes, sin GST

La fase aceitosa se preparó recientemente disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074). Las mezclas de reacción frías en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 4 \mul durante \sim2 minutos) a 0,4 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante un 1 minuto adicional en hielo.

Se añadieron 8 \mul de la emulsión d) a 0,4 ml de la emulsión e), y 8 \mul de la emulsión b) se añadieron a 0,4 ml de la emulsión f) (para dar diluciones 1:50) y las mezclas de emulsiones se removieron durante 5 segundos para mezclarse.

Se dejaron sin emulsionar seis mezclas de reacción:

a)

Perlas de Bangs, sin GST

b)

Perlas de Bangs, más GST

c)

Perlas de Molecular Probes, sin GST

d)

Perlas de Molecular Probes, más GST

e)

Perlas de Bangs, sin GST

f)

Perlas de Molecular Probes, sin GST

Se añadieron 0,4 \mul de d) a 20 \mul de e), y se añadieron 0,4 \mul de b) a 20 \mul de f) (para dar diluciones 1:50).

Tanto las emulsiones como las reacciones no emulsionadas se incubaron durante 15 min a 25ºC. Entonces, a cada 0,4 ml de emulsión se añadieron 0,8 \mul de CNB 500 mM (en etanol absoluto) y la emulsión se removió durante 5 segundos (el CNB se transfiere a través del aceite mineral a los compartimentos acuosos). A las reacciones no emulsionadas se añadieron 5 \mul de CNB 5 mM (en KH_{2}PO_{4} 0,1 M, EDTA 1 mM, pH, 6,5).

Todas las reacciones se incubaron durante 4 horas a 25ºC.

El pH de las gotitas acuosas se disminuyó para inactivar la reacción catalizada por GST removiendo las emulsiones con 200 \mul de aceite mineral de Sigma para biología molecular (M-5904) que contiene Span 80 al 4,5% (Fluka), Tween 80 al 0,5% (Sigma Ultra) en aceite mineral de Sigma para biología molecular y ácido acético 25 mM. Las reacciones no emulsionadas se enfriaron añadiendo 25 \mul de ácido acético 0,5 M.

Todas las reacciones se transfirieron a una placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) que flotaba en agua con hielo y se irradiaron durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Entonces, todas las muestras se incubaron 30 min a temperatura ambiente.

Las emulsiones se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min a 13,5 krpm en una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de acetato de Na 0,1 M, pH 5,0, y la emulsión se rompió extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, removiendo entre cada adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente a vacío en una Speedvac (Farmingdale, NY).

Entonces, todas las muestras se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado. Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1%. Entonces se añadieron 25 \mul (\sim5 x 10^{7} perlas) a 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% que contiene 20 ng/\mul de anticuerpo anti-DNP marcado con Alexa-488 o 20 ng/\mul de anticuerpo anti-CNB marcado con Alexa-488 (véase el ejemplo 5) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se volvieron a suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 300.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).

En las mezclas no emulsionadas, en las que no se compartimentaron ni GST ni el producto de la reacción catalizada por GST, (biotina enjaulada-\betaAla-NB), todas las perlas tienen una fluorescencia similarmente baja (fig. 10, paneles B y D). A diferencia, en las mezclas de emulsiones, en las que se compartimentaron tanto GST como el producto de la reacción catalizada por GST, (biotina enjaulada-\betaAla-NB), están claramente visibles dos poblaciones de perlas, una de baja y una de alta fluorescencia (fig. 10, paneles C y E). La graduación a través de R1 y R2 permite separar en gran parte las perlas de Bangs y de Molecular Probes basándose en sus características de dispersión de la luz ligeramente diferentes (fig. 10, panel A). La relación de perlas de Bangs a perlas de Molecular Probes que pasan a través de R1 es del 68%:0,1% y la relación que pasan a través de R2 es del 0,08%:87%. Usando estas puertas está claro que las perlas con alta fluorescencia son aquellas que se compartimentaron con la enzima GST. Por tanto, la compartimentación de perlas, enzima y producto de reacción se obtuvo mediante emulsión y aquellas perlas presentes en compartimentos que contenían enzimas pueden distinguirse de aquellas que no contenían por sus características de fluorescencia.

Ejemplo 7 La GST M2-2 humana puede transcribirse y traducirse in vitro en los compartimentos acuosos de una emulsión aceite en agua y cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de microesferas cocompatimentadas.

El gen que codifica glutatión S-transferasa humana M2-2 (GST M2-2) se amplifica por PCR usando oligonucleótidos GSTM2-2Fo y GSTM2-2Bc de un clon de ADNc de GST M2-2 humana en pGEM-3Z (Baez y col., 1997). El fragmento de PCR se clona en el vector pGEM-4Z (Promega) digerido con HindIII y KpnI aguas abajo del promotor lac y el promotor de ARN polimerasa de T7. El oligonucleótido GSTM2-2Bc añade el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz aguas arriba del codón de iniciación del gen de metiltransferasa. La secuenciación de ADN identifica un clon con la correcta secuencia nucleotídica, denominada pGEM-hGSTM2-2. El plásmido de pGEM-hGSTM2-2 descrito anteriormente se amplifica por PCR usando cebadores LMB2 y LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de 826 pares de bases (GSTM2-2.LMB2-3) que lleva el promotor de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen de GST. El fragmento de PCR se purifica directamente usando Wizard PCR Preps (Promega).

Se centrifugaron alícuotas de 60 \mul (1,2 x 10^{9} perlas) de microesferas marcadas con neutravidina no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Molecular Probes, F-8777) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender, en hielo, en 60 \mul de un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley y col., 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con ácido acético 12,5 mM (para reducir el pH hasta -7,0), ARN polimerasa de T7 (2.000 unidades), 12,5 \mug/ml de digesto de HindIII de ADN \lambda (New England Biolabs), biotina enjaulada-\betaala-GSH 50 \muM y, opcionalmente, ADN de GSTM2-2.LMB2-3 5 nM o 5,0 \mug de GST M2-2 humana recombinante purificada por 50 \mul (o ninguno).

De cada mezcla de reacción se tomó una alícuota de 5 \mul y se dejó sin emulsionar. Se emulsionaron 50 \mul de la mezcla de reacción restante esencialmente como Tawfik y Griffiths (1998).

La fase aceitosa se preparó recientemente disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074). Las mezclas de reacción frías en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante un 1 minuto adicional en hielo.

Tanto las emulsiones como las reacciones no emulsionadas se incubaron durante 45 min a 25ºC para permitir que avanzara la traducción. Entonces, a cada emulsión de 1,0 ml se añadieron 5 \mul de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno 100 mM (CDNB) (en etanol absoluto) y la emulsión se removió durante 5 segundos (el CDNB se transfiere a través del aceite mineral a los compartimentos acuosos). Se añadió 1,0 \mul de CDNB 2,5 mM (en agua) a las reacciones no emulsionadas. CDNB inhibe la traducción in vitro y añadiéndolo de este modo, después de que se complete la traducción, maximiza el rendimiento de GST.

Todas las reacciones se incubaron durante 30 min a 25ºC. Entonces, el pH de las gotitas acuosas se disminuyó para inactivar la reacción removiendo las emulsiones con 500 \mul de aceite mineral de Sigma para biología molecular (M-5904) que contiene Span 80 al 4,5% (Fluka), Tween 80 al 0,5% (Sigma Ultra) en aceite mineral de Sigma para biología molecular y ácido acético 25 mM. Las reacciones no emulsionadas se enfriaron añadiendo 5 \mul de ácido acético 0,5 M y 20 \mul de acetato de Na 0,1 M, pH 5,0.

Todas las reacciones se transfirieron a una placa de fondo plano de 24 pocillos (Corning, nº 25820) que flotaba en agua con hielo y se irradiaron durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Todas las muestras se incubaron 30 min a temperatura ambiente.

Las emulsiones se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min a 13,5 krpm en una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de acetato de Na 0,1 M, pH 5,0, y la emulsión se rompió extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, removiendo entre cada adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente a vacío en una Speedvac (Farmingdale, NY).

Entonces, aproximadamente 5 x 10^{7} perlas de las emulsiones rotas y las reacciones no emulsionadas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado. Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% que contiene 10 ng/\mul de anticuerpo anti-DNP marcado con Alexa-488 (véase el ejemplo 5) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se volvieron a suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).

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Como puede verse de la fig. 11, tanto en las reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la reacción catalizada por GST M2-2 traducida in vitro da como resultado perlas con mayor fluorescencia que cuando no estaba presente la enzima. Sin embargo, esta diferencia en la fluorescencia no sería suficiente para una clasificación activada por fluorescencia eficaz (FACS). Sin embargo, las perlas de tanto las reacciones emulsionadas como las no emulsionadas que contienen 5,0 \mug de GST M2-2 recombinante purificada por 50 \mul fueron incluso más fluorescentes que aquellas que contienen GST M2-2 traducida in vitro, permitiendo un enriquecimiento eficaz de estas perlas mediante FACS a partir de aquellas incubadas en ausencia de GST. Esto simula la situación en la que una GST mutante de actividad mayor que el tipo salvaje se traduce in vitro.

Ejemplo 8 Los genes unidos a microperlas se expresan in vitro y el producto génico resultante (una enzima) se une a las microperlas, a la vez que conserva la actividad catalítica.

Un formato para la selección de elementos genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos (por ejemplo proteínas o enzimas) unidos al gen que los codifica. Estos complejos podrían seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el ejemplo 12) o para actividad enzimática mediante una segunda reacción compartimentada.

En este documento se muestra que una enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas y la enzima traducida se une de nuevo a las microperlas. También se muestra que la enzima traducida puede modificarse, ensamblarse o complementarse con un cofactor mientras que esté unida sobre las perlas - en este ejemplo se añaden iones metálicos a la apoenzima para dar una metaloenzima activa. Además, se muestra que la actividad catalítica de la enzima se conserva mientras que esté unida a la microperla junto con el gen que la codifica.

El gen opd que codifica una fosfotriesterasa (PTE; también conocida como paraoxonasa; Mulbry y Karns, 1989) se amplifica de la cepa de Flavobacterium sp. ATCC 27551 mediante PCR usando un cebador directo que añade codones de terminación y un sitio EcoRI (OPD-Fo; véase la tabla 1), y un cebador inverso que añade el sitio de transición del gen 10 del fago T7 (RBS) y un sitio de clonación de HindIII (OPD-Bc). Este ADN se clona en pGEM-4Z usando HindIII y los sitios EcoRI aguas abajo del promotor de ARN polimerasa de T7. La secuenciación de ADN identifica un clon que tiene la correcta secuencia nucleotídica. Se encuentra que las bacterias (E. coli, TG1) transformadas con este clon (Gem-OPD) sobreexpresan PTE activa cuando crecen en presencia de cloruro de cobalto y se inducen con IPTG (Omburo y col., 1992).

El gen OPD también se clona con un péptido Flag^{TM} (Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; Sigma-Aldrich) añadido a su extremo N. El gen OPD se amplifica de cepa de Flavobacterium sp. ATCC 27551 mediante PCR usando un cebador directo (N-Flag-OPD-Fo) que añade codones de terminación y un sitio KpnI, y un cebador inverso (N-Flag-OPD-Bc) que añade un sitio NcoI, un péptido Flag y un conector corto entre el péptido Flag y el marco de lectura de OPD. El fragmento de ADN resultante se clona en el plásmido pGEM-4Z^{Ncol} (usando los sitios KpnI y NcoI). pGEM-4Z^{Ncol} es una modificación de p-GEM-4Z en el que el sitio de transición del gen 10 del fago T7 (RBS) y un codón de iniciación ATG se añaden aguas abajo al promotor de ARN polimerasa de T7 para crear un sitio NcoI que permita clonar los marcos de lectura en el contexto de RBS y el codón ATG. La secuencia de la sección incorporada en pGEM-4Z (entre HindIII y los sitios KpnI aguas abajo del promotor de ARN polimerasa de T7), para dar pGEM-4Z^{Ncol}, se indica en el esquema I (ID SEC Nº: 1).

El resto de pGEM-4Z, que incluye los sitios de clonación KpnI y EcoRI, permanecieron intactos.

100

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Esquema I

La secuenciación de ADN identifica un clon que tiene la correcta secuencia nucleotídica. Se encuentra que las bacterias transformadas con este clon (Gem-N-Flag-OPD) sobreexpresan una PTE activa cuando crecen en presencia de cloruro de cobalto y se inducen con IPTG. Los plástidos de gem-OPD y gem-N-Flag-OPD descritos anteriormente se amplifican por PCR usando cebadores LMB2-biotina y LMB3 para crear fragmentos de ADN (OPD.LMB3-2biotina y N-Flag-OPD.LMB3-2biotina, respectivamente) que llevan el promotor de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y el OPD o los genes de N-Flag-OPD y se marcan con biotina en el extremo 3'. Los fragmentos de PCR se purifican directamente usando Wizard PCR Preps (Promega). Se centrifugan alícuotas de una suspensión de microesferas marcadas con estreptavidina no fluorescente de 0,95 \mum (Bangs, \sim2 x 10^{7} perlas por \mul de suspensión) en una microcentrífuga a 10.000 g (13.500 rpm) durante 3 min. El sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender en tampón TNT (Tris 7,5 0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). Un anticuerpo que puede unir péptidos Flag de los extremos amino y está marcado mediante biotinilación (BioM5, un anticuerpo anti-Flag marcado con biotina; Sigma) se añade a las suspensiones de perlas a un promedio de 4 x 10^{4} moléculas de anticuerpo por perla. La mezcla resultante se incuba durante varias horas con mezclado ocasional. Las perlas se aclaran dos veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT. Los fragmentos de ADN biotinilado (fragmentos OPD.LMB3-2biotina, N-Flag-OPD.LMB3-2biotina o fragmentos que llevan el promotor de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y un gen que codifica una enzima diferente que también está marcada con péptido N-Flag, por ejemplo, metiltransferasa HaeIII - N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina) se añaden a una suspensión de perlas recubiertas con anticuerpo y la mezcla se incuba durante toda la noche a 4ºC. Las perlas se aclaran 3 veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT.

Se centrifugan alícuotas de 50 \mul de la suspensión anterior de perlas (\sim10^{9} perlas) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender cuidadosamente, en hielo, en 50 \mul de un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley y col., 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (2.000 unidades). Las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas y se centrifugan en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender en 100 \mul de Tris 50 mM, 10 mM de carbonato potásico, pH 8,0. Se añade una disolución acuosa de cloruro de cobalto a una concentración de 1 mM y las reacciones se incuban durante varias horas a temperatura ambiente (o durante toda la noche a 4ºC). Las perlas se aclaran 4 veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT.

Se añaden alícuotas de las perlas anteriores a una disolución de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM, pH 8,3. Las perlas se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante diferentes periodos de tiempo. Las perlas se centrifugan en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min, el sobrenadante se elimina y se mide su densidad óptica a 405 nm. No se observa un cambio significativo en la densidad óptica respecto a la densidad óptica observada en las mismas condiciones en ausencia de perlas o fosfotriesterasa cuando las perlas a las que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado OPD.LMB3-2biotina o N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina (y posteriormente se hacen reaccionar como se describe anteriormente) se incuban con Paraoxon. Sin embargo, se observa un cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las perlas a las que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina (y posteriormente se hacen reaccionar como se describe anteriormente) se incuban con Paraoxon. Por ejemplo, cuando se añaden los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina a una concentración de 1 nM (a una suspensión de 50 \mul de perlas (\sim10^{9} perlas) que luego se vuelve a suspender en 50 \mul de transcripción/traducción in vitro) y se hacen reaccionar como se describe anteriormente, el cambio en la densidad óptica observada después de 3 horas se corresponde con más del 50% de la hidrólisis de Paraoxon (a 0,25 mM en un volumen de reacción de 50 \mul). Por tanto, las microperlas que llevan un gen que codifica una proteína con la actividad catalítica deseada (fosfotriesterasa en el ejemplo anterior) pueden distinguirse claramente de microperlas que llevan genes que no codifican una proteína con la actividad catalítica deseada (metiltransferasa HaeIII en el ejemplo anterior). Además, apenas se observa cambio en la densidad óptica a 405 nm cuando los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina están unidos a perlas y se hacen reaccionar como se describe anteriormente, excepto que no se añade cloruro de cobalto a las perlas que se volvieron a suspender después de la transcripción/traducción.

Estos resultados muestran que una enzima (fosfotriesterasa) puede transcribirse y traducirse in vitro a partir de genes que codifican esta enzima y están unidos a microperlas. Cuando los genes codifican una marca - un péptido Flag en el extremo N en el ejemplo anterior -, la enzima traducida se une de nuevo a las microperlas a las que están unidas los genes. Entonces, si fuera necesario, la enzima traducida puede modificarse mientras permanece unida a las microperlas (junto con el gen de la codifica) - en este ejemplo se añaden iones de cobalto para dar una metaloenzima reactiva. Estos resultados también indican que la enzima es catalíticamente activa, mientras está unida a microperlas junto con el gen que la codifica.

Ejemplo 9 Una enzima cataliza una reacción con un sustrato biotinilado enjaulado y el producto biotinilado enjaulado generado se desenjaula mediante radiación UV y se captura sobre microperlas recubiertas con estreptavidina. Posteriormente estas perlas se detectan mediante citometría de flujo.

Un formato para la selección de elementos genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos (por ejemplo proteínas o enzimas) unidos al gen que los codifica. Estos complejos podrían seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el ejemplo 12) o para determinar la actividad enzimática mediante una segunda reacción compartimentada.

Sin embargo, para tales complejos que van a seleccionarse para determinar la actividad enzimática debe estar disponible un sustrato soluble para la enzima inmovilizada y, una vez se ha completado la reacción catalítica, el producto de la actividad enzimática que se ha seleccionado debe unirse al gen que codifica esta enzima. Entonces, los complejos resultantes pueden clasificarse o seleccionarse en virtud del producto que se ha ligado a ellos, por ejemplo usando un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconozca el producto. En otros compartimentos, que contienen complejos de genes y productos génicos que no codifican proteínas con la actividad enzimática deseada, el sustrato sin reaccionar debería ligarse al gen. Estos complejos no se marcarán con el producto y por tanto se desecharán.

En este documento se muestra que una enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede reaccionar con un sustrato biotinilado enjaulado en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina. Entonces, el producto biotinilado enjaulado generado puede desenjaularse mediante radiación UV y capturarse sobre perlas recubiertas con avidina. Posteriormente, estas perlas se detectan mediante citometría de flujo y se distinguen claramente de perlas incubadas con un sustrato biotinilado enjaulado en presencia de otras enzimas o proteínas que no presentan actividad fosfotriesterasa.

Un sustrato biotinilado enjaulado para PTE (EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada; fig. 12) se sintetiza del siguiente modo:

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Boc-5-aminopentanol: Se añade dicarbonato de di-terc-butilo (20,8 g; 0,095 mol) a una disolución con agitación de 5-aminopentanol (10,37 g; 0,1 mol) en diclorometano (DCM) (200 ml) en hielo. Tras la adición, la disolución se vuelve turbia y se separa un jarabe. Se añade gota a gota trietilamina (13,8 ml; 0,1 mol) y la disolución resultante se agita durante 10 minutos en hielo y luego durante toda la noche a temperatura ambiente. Los disolventes se eliminan a vacío, el jarabe resultante se disuelve en acetato de etilo (500 ml), se extrae 3 veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío y el jarabe resultante (después de secado exhaustivo a vacío en presencia de hidróxido potásico), compuesto principalmente de Boc-5-aminopentanol, se usa sin más purificación.

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(11) Se añade gota a gota trietilamina (3 ml; 22 mmol) a una disolución con agitación de fosfodicloridato de p-nitrofenilo (5,15 g; 20 mmol) y etanol (1,15 ml, 20 mmol) enfriado en nieve carbónica en acetona en el plazo de 30 minutos. La disolución se deja calentar lentamente hasta temperatura ambiente y se agita durante 90 minutos adicionales. Entonces se añade gota a gota una disolución de Boc-5-aminopentanol (4,3 g; aprox. 20 mmol) y trietilamina (3 ml; 22 mmol) en DCM (20 ml). La reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante 10 minutos, se añade 1H-tetrazol (0,35 g; 5 mmol) y la reacción se agita durante otras 2 horas. Se añade DCM (100 ml) y la disolución se extrae 3 veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol del 1% al 2% en DCM) para dar 3,52 g de 11 (un jarabe).

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Éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico: Se añade diciclohecildicarbodiimida (DCC; 5,15 g; 25 mmol) a una suspensión con agitación de ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (Tiger, Monmouth NJ; 5,2 g; 25 mmol) y N-hidroxisuccinimida (2,88 g; 25 mmol) en DCM (200 ml) más acetonitrilo (20 ml). La reacción se agita durante toda la noche a 4ºC y luego 3 horas a temperatura ambiente. El precipitado de diciclohecilurea se elimina mediante filtración y el filtrado se concentra a vacío para dar un jarabe. El jarabe se disuelve en cloroformo y DCM y se trata con carbón activado. La adición de éter da un sólido cristalino blanco. La recristalización en DCM y éter de petróleo da 6,2 g del éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico.

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(12) Se añade ácido trifluoroacético (TFA; 4 ml) a una disolución de 11 (900 mg; 2,07 mmol) en DCM (5 ml). La disolución se deja a temperatura ambiente durante 45 minutos y los disolventes se eliminan a vacío. El jarabe residual se tritura disolviéndolo en DCM y metanol y añadiendo éter. El 12 resultante (como sal de TFA; jarabe) se seca a vacío en presencia de hidróxido potásico y luego se hace reaccionar inmediatamente sin más purificación (véase más adelante).

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(13) Se añaden éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 4-N-Boc-aminometilbenzoico (670 mg; 2,2 mmol) y trietilamina (0,345 ml; 2,5 mmol) a 12 (véase anteriormente) en DCM (15 ml). La disolución se agita durante 30 minutos, se añade trietilamina (0,1 ml; 0,72 mmol) y la disolución se agita durante 3 horas adicionales. Se añade DCM (20 ml) y la disolución se extrae dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 5% en DCM) para dar 0,86 g de 13 (un jarabe).

\quad

(14) Se tratan 0,84 g 13 de 14 (1,6 mmol) con TFA como se describe anteriormente para dar 14 (como sal de TFA; jarabe) que se hace reaccionar inmediatamente como se describe más adelante.

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(15) Se añaden Boc-Glu(OSu)-OBu' (Bachem; 641 mg; 1,6 mmol) y trietilamina (0,235 ml; 1,7 mmol) a 14 (véase anteriormente) en DCM (15 ml). La disolución se agita durante 1 hora, se añade trietilamina (60 \mul; 0,43 mmol) y la disolución se agita durante 1 hora. Se añade DCM (20 ml) y la disolución se extrae dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4), una vez con NaHCO_{3} saturado y finalmente con salmuera, y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 7% en DCM) para dar 0,8 g de 15 (un sólido cristalino blanco).

\quad

EtNP-Bz-Glu (16) Se disuelven 0,4 g de 15 (0,56 mmol) en DCM (5 ml) y TFA (5 ml). La disolución se agita durante 1 hora a temperatura ambiente y los disolventes se eliminan a vacío. El jarabe residual se cristaliza disolviéndolo en metanol y añadiendo éter. La recristalización (en metanol y éter) da 200 mg de 16 (como sal de TFA; sólido blanco).

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EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada (17) Se añade carbonildiimidazol (6 mg, 37,5 \mumol) a una disolución de MeNPO-CO-biotina-OH (5,17 mg, 35 \mumol) en DMF (1 ml). La disolución se agita durante 60 minutos a temperatura ambiente y se añade a 16 (20 mg, 30 \mumol). Se añaden trietilamina (5,5 \mul, 40 \mumol), DMF (1 ml) y agua (0,5 ml) a la mezcla de reacción con agitación hasta que se vuelve transparente. La disolución se agita durante 2 horas a temperatura ambiente y se almacena a -20ºC.

El producto de la reacción anterior se purifica por HPLC en fase inversa en una columna preparativa C8 usando un gradiente de agua-acetonitrilo en presencia de ácido trifluoroacético al 0,1%. Se recoge el pico correspondiente a 17 (tiempo de retención = 23,1 minutos). El producto se aísla mediante liofilización como un sólido amarillo. El análisis del producto después de la purificación por HPLC usando HPLC analítica en fase inversa indicó un producto principal (>80%) cuyo espectro UV se corresponde con 17. Específicamente, \lambda^{máx} a 355 nm indica la presencia del grupo O-metilnitropiperonil-carbonilo de la biotina enjaulada (Pirrung y Huang, 1996), y un "hombro" a 277 nm, ausente en biotina enjaulada, indica la presencia del éster de p-nitrofenilfosfato de 17. La concentración de 17 se verifica hidrolizando el éster de p-nitrofenilfosfato en hidróxido potásico 0,1 M y determinado la cantidad de p-nitrofenol liberada (densidad óptica a 405 nm).

También se encuentra que el 17 purificado es un sustrato para PTE que conduce a la liberación de p-nitrofenol (fig. 13; monitorizado por el cambio en la densidad óptica a 405 nm) con velocidades que sólo son aproximadamente 6 veces más lentas que las observadas con Paraoxon. Particularmente, a diferencia de la hidrólisis catalizada por base de 17 que avanza hasta la finalización (y la hidrólisis catalizada por PTE de Paraoxon), la hidrólisis catalizada por PTE de 17 avanza con velocidades significativas sólo hasta que se haya hidrolizado la mitad del sustrato. También puede hidrolizarse la segunda mitad del sustrato, pero sólo en presencia de cantidades mucho mayores de PTE y después de largas incubaciones (varias horas hasta toda la noche). Esto es probablemente debido al hecho que 17 está compuesto de dos diaestereómeros (correspondientes a dos enantiómeros con respecto al fosfotriéster quiral), siendo solamente uno de ellos un sustrato eficaz para la enzima. De hecho, la estereoselectividad se observó previamente con PTE y otros fosfotriésteres quirales (Hong y Raushel, 1999).

Se generan anticuerpos que reconocerían fosfodiésteres de etilo que son los productos de hidrólisis de los fosfotriésteres de p-nitrofenilo correspondientes. Con este fin se sintetiza un derivado de fosfodiéster de etilo adecuado y se conjuga a proteínas portadoras como se describe más adelante (fig. 14).

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EtNPBG (18) Se añaden anhídrido glutárico (180 mg; 1,6 mmol) y trietilamina (0,22 ml; 1,6 mmol) a 12 (preparado mediante desprotección de 1,6 mmol de 11, como se describe anteriormente) en DCM (15 ml). La disolución se agita durante 20 minutos, se añade trietilamina (0,12 ml; 0,85 mmol) y la disolución se agita durante una 1 hora adicional. Se añade DCM (20 ml) y la disolución se extrae dos veces con Na_{2}HPO_{4} 1 M (pH 4) y luego se seca sobre MgSO_{4}. Los disolventes se eliminan a vacío para dar un jarabe que se purifica mediante cromatografía en columna sobre sílice (disolvente: metanol al 12,5% en DCM más ácido acético al 0,1%) para dar 445 mg de 18 (un jarabe).

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Conjugados de sustratos EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH. Se añade carbonildiimidazol (CDI; 32 mg, 200 \mumol) a una disolución de 18 (60 mg, 134 \mumol) en DMF (1 ml). La disolución se agita durante 60 minutos a temperatura ambiente. Entonces se añaden alícuotas de 18 activado a disoluciones de 5 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) o hemocianina de lapa californiana (KLH) en fosfato 0,1 M, pH 8,0 (a de 0,5 a 4 \mumol de 18 por mg de proteína).

Las reacciones se agitan durante 1 hora a temperatura ambiente y los conjugados de proteínas resultantes se dializan exhaustivamente contra solución salina de tampón fosfato (PBS) a 4ºC. El nivel de conjugación (densidad de haptenos o Hd) se determina hidrolizando una muestra de los conjugados dializados en hidróxido potásico 0,1 M y monitorizando la cantidad de p-nitrofenol liberada (a 405 nm). Se encuentra que éstas son: de 8,5 a 24 moléculas de EtNPBG por molécula de BSA y de 14 a 63 por molécula de KLH, dependiendo de la cantidad de 18 activado añadido a las muestras de proteína.

Conjugados de productos EtBG-KLH y EtBG-KLH. Los conjugados EtNPBG-KLH y EtNPBG-KLH descritos anteriormente se dializan contra carbonato 0,1 M, pH 11,8, durante 44 horas a temperatura ambiente y luego exhaustivamente contra PBS (a 4ºC).

Se obtuvieron anticuerpos anti-EtBG en conejos mediante inmunización con EtBG-KLH (Hd = 14) usando protocolos publicados (Tawfik y col., 1993; Tawfik y col., 1997) (obsequio del Prof. Z Eshhar, Instituto de Ciencias de Weizmann, Rehovot). Los sueros se probaron mediante ELISA para unión tanto al sustrato conjugado EtNPBG-BSA (Hd = 8,5) como al conjugado de producto correspondiente (EtBG-BSA; Hd = 8,5). El primer sangrado de uno de los conejos inmunizados (cuando se diluyó 500 veces o más) presenta la selectividad deseable, dando una alta señal cuando se incuba con el conjugado de producto y un ruido bajo (<20%) con el conjugado del sustrato. La dilución de los sueros en tampón COVAp (NaCl 2 M, 10 g, 1 MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, Tween 20 al 0,04%, fosfato 10 mM, p-nitrofenol 0,1 mM, pH 6,5) aumenta adicionalmente la selectividad, con niveles de ruido bajos del 5%. El suero anti-EtBG se purifica usando una columna de proteína A HiTrap (Pharmacia). Los anticuerpos de conejo purificados se marcan con un kit de marcado de proteínas Alexa Fluor 488 (Molecular Probes) según las instrucciones del fabricante.

Se centrifugan 10 \mul (\sim2 x10^{8} perlas) de microperlas recubiertas con estreptavidina de 0,95 \mum (Bangs, \sim2 x 10^{7} perlas por \mul de suspensión) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min y se elimina el sobrenadante. Las perlas se vuelven a suspender en 10 \mul de Tris 50 mM, pH 8,3, que contiene EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada (17) para dar una concentración final de 10 \muM, 20 \muM o 30 \muM. Se expresa PTE in vitro mediante transcripción/traducción de fragmentos de ADN OPD.LMB3-2biotina (a 5 nM). Se usa una preparación comercial (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (2.000 unidades) y las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas. Entonces, la PTE se ensambla mediante la adición de carbonato potásico (10 mM) y cloruro de cobalto (1 mM) en tampón Tris (10 mM pH 8,0) y se incuba durante toda la noche a 4ºC. Otra enzima, que no presenta actividad fosfotriesterasa, la metiltransferasa Haelll, también se expresa in vitro mediante transcripción/traducción de fragmentos de ADN M.HaeIII.LMB3-2biotina (a 5 nM) y luego se trata con carbonato y cobalto como la PTE. Se añade una alícuota de 5 \mul de las mezclas de reacción anteriores a las suspensiones de perlas y las reacciones se incuban durante 1 hora a 25ºC en la oscuridad. La reacción se detiene mediante la adición de 15 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, y se transfiere a hielo. Entonces, cada reacción se divide en dos alícuotas de 15 \mul cada una, una de las cuales se coloca como un punto en una capa de parafilm sobre la superficie de un bloque de aluminio enfriado en hielo. Entonces, esta alícuota se irradia durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. La otra alícuota se deja en la oscuridad. Entonces, todas las muestras de perlas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavan tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado. Entonces, las perlas (\sim2 x 10^{7}) se vuelven a suspender en 200 \mul de COVAp que contienen 100 ng/\mul de anticuerpos anti-EtBG de conejo marcados con Alexa-488 y se incuban durante 1 hora a temperatura ambiente y luego 1 hora a 4ºC. Las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se volvieron a suspender en 1 ml de PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).

Como puede verse en la fig. 15, se observa hasta un aumento de 20 veces en la fluorescencia media de la perla tras la hidrólisis catalizada por PTE de EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada en presencia de perlas recubiertas con estreptavidina y después de radiación UV. Este aumento observado con respecto a las perlas tratadas esencialmente es el mismo, pero en presencia de otra enzima (M.HaeIII), sin actividad fosfotriesterasa. En particular, las diferencias en la señal de fluorescencia se observan cuando tanto PTE como M.HaeIII se expresan in vitro a partir de los genes correspondientes y se añaden junto con todo el contenido de la mezcla de reacción de transcripción/traducción in vitro.

A altas concentraciones de sustrato, la fluorescencia media observada es menor que la observada a 20 \muM. Además, a concentraciones de sustrato superiores a 20 \muM, esencialmente no hay diferencia en la señal de fluorescencia entre reacciones mantenidas en la oscuridad y aquellas irradiadas con UV (datos no mostrados). Debido a que las perlas, a las condiciones de reacción descritas anteriormente, empiezan a presentar saturación de la señal de unión a concentraciones superiores a 10 \muM (de producto como se detecta por la posterior adición de anticuerpos anti-EtBG marcados fluorescentemente), estos resultados pueden explicarse por la presencia de una contaminación de ETNP-Bz-Glu-biotina en la preparación de EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada. Estos resultados también concuerdan con la inmovilización del ruido previamente observada de biotina enjaulada respecto a avidina "en la oscuridad" (es decir, sin iluminación UV) que era tan alta como el 15% de la señal observada después de la iluminación (Sundberg y col. 1995). La señal "oscura" previamente observada se atribuye o a contaminantes traza de biotina en la preparación de biotina enjaulada, o a interacciones débiles entre avidina y componentes de la biotina enjaulada que incluyen el conector (Sundberg y col. 1995). Ambos mecanismos pueden responder al hecho de que a altas concentraciones de sustrato biotinilado enjaulado (y anteriormente la capacidad de unión de las perlas), la señal "oscura" se vuelve significativa. Sin embargo, a concentraciones de sustrato de 20 \muM, o inferiores, la señal "oscura" sólo constituye el 25%, o incluso menos del 10% (por ejemplo, a EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 10 \muM) de la señal iluminada. Esto indica que la mayoría de las hidrólisis catalizadas por PTE de EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada tienen lugar mientras que el sustrato está en disolución y no unido a las perlas, y que el producto resultante (Et-Bz-Glu-biotina enjaulada), después de la iluminación con luz UV, está desenjaulado y se inmoviliza sobre las microperlas.

Ejemplo 10 Genes unidos a perlas se expresan in vitro y los productos génicos resultantes (enzimas) se inmovilizan a las microperlas, a la vez que conservan la actividad catalítica. La enzima inmovilizada cataliza una reacción con un sustrato biotinilado enjaulado y el producto biotinilado enjaulado resultante se desenjaula posteriormente mediante radiación UV y se une a estas perlas junto con el gen que codifica la enzima que conduce a esta formación. Posteriormente, estas perlas se detectan mediante citometría de flujo.

Un formato para la selección de elementos genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos (por ejemplo proteínas o enzimas) unidos al gen que los codifica. Estos complejos podrían seleccionarse posteriormente para unir un ligando (véase el ejemplo 12) o para actividad enzimática mediante una segunda reacción compartimentada.

Para tales complejos que van a seleccionarse para determinar la actividad catalítica debe estar disponible un sustrato soluble para la enzima inmovilizada y, una vez se ha completado la reacción catalítica, el producto de la actividad enzimática que se ha seleccionado debe unirse al gen que codifica esta enzima. Entonces, los complejos resultantes pueden clasificarse o seleccionarse en virtud del producto que se ha ligado a ellos, por ejemplo usando un anticuerpo marcado fluorescentemente que reconozca el producto. En otros compartimentos, que contienen complejos de genes y productos génicos que no presentan la actividad enzimática deseada, el sustrato sin reaccionar debería ligarse al gen. Estos complejos no se marcarán con el producto y por tanto se desecharán.

En este documento se muestra que una enzima (fosfotriesterasa o PTE) puede transcribirse y traducirse in vitro a partir de genes unidos a microperlas y la enzima traducida se une de nuevo a las microperlas. Entonces, la enzima traducida puede modificarse para incorporar el sitio activo cobalto y su actividad catalítica se conserva mientras esté unida a la microperla junto al gen que la codifica. La PTE inmovilizada reacciona posteriormente con un sustrato biotinilado enjaulado y el producto biotinilado enjaulado generado se desenjaula mediante radiación UV y se captura sobre las mismas perlas recubiertas por avidina a las que está unido el gen que codifica la PTE. Posteriormente, estas perlas se detectan mediante citometría de flujo y se distinguen claramente de perlas que llevan un gen que codifican una proteína que no presenta actividad fosfotriesterasa.

Se centrifugan alícuotas de una suspensión de microesferas recubiertas con estreptavidina de 0,95 \mum (Bangs, \sim2 x 10^{7} perlas por \mul suspensión) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender en tampón TNT (Tris 7,5 0,1 M, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%). Un anticuerpo, que puede unirse al péptido Flag y biotinilado (BioM5, un anticuerpo anti-Flag marcado con biotina; Sigma), se añade a las suspensiones de perlas para dar un promedio de 10^{4} moléculas de anticuerpo por perla y la mezcla se incuba durante varias horas. Las perlas se aclaran mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT al volumen original. Los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina, o fragmentos que llevan el promotor de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la transición del gen 10 del fago T7 y un gen que codifica a diferentes enzima (también marcado con péptido N-Flag), por ejemplo, metiltransferasa HaeIII-N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina) se añaden a la suspensión de perlas cubiertas con anticuerpo a concentración 1,6 nM y la mezcla se incuba durante toda la noche a 4ºC. Las perlas se aclaran 3 veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT.

Se centrifugan alícuotas de 50 \mul de la suspensión anterior de perlas (\sim10^{9} perlas) en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender cuidadosamente, en hielo, en 50 \mul de un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley y col., 1991). Se usa una preparación comercial de este sistema (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (2.000 unidades). Las reacciones se incuban a 25ºC durante 1,5 horas y se centrifugan en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min. El sobrenadante se elimina y las perlas se vuelven a suspender en 100 \mul de Tris 50 mM, 10 mM de carbonato potásico, pH 8,0. Se añade una disolución acuosa de cloruro de cobalto a una concentración de 1 mM y las reacciones se incuban durante 2 horas a temperatura ambiente. Las perlas se aclaran 4 veces mediante centrifugación lenta y volviéndolas a suspender en tampón TNT. Finalmente, las perlas se vuelven a suspender en tampón TNT al volumen original.

Se añaden alícuotas de las perlas anteriores a disoluciones de Paraoxon 0,25 mM en Tris 50 mM, pH 8,3. Las perlas se incuban a 25ºC con agitación ocasional durante diferentes periodos de tiempo. Las perlas se centrifugan en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min, el sobrenadante se elimina y se mide su densidad óptica a 405 nm. Se observa un cambio significativo en la densidad óptica a 405 nm cuando las perlas a las que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-OPD.LMB3-2biotina (y posteriormente se hacen reaccionar como se describe anteriormente), a diferencia de reacciones realizadas en las mismas condiciones pero en ausencia de perlas o fosfotriesterasa, o con perlas a las que se han unido los fragmentos de ADN biotinilado N-Flag-M.HaeIII.LMB3-2biotina y posteriormente se hacen reaccionar como se describe anteriormente.

A continuación se centrifugan 10 \mul (\sim2 x10^{8} perlas) de las perlas anteriores en una microcentrífuga a 10.000 g durante 3 min y se elimina el sobrenadante. Las perlas se vuelven a suspender en 10 \mul de EtNP-Bz-Glu-biotina enjaulada 12,5 o 25 \muM en Tris 50 mM, pH 8,3. Las suspensiones de perlas se incuban durante 1,5 horas a 25ºC en la oscuridad. La reacción se detiene mediante la adición de 10 \mul de acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, y se transfiere a hielo y se irradia durante 2 min con una lámpara UV B 100 AP (UVP) mantenida a una distancia de \sim 6 cm. Entonces, todas las muestras de perlas se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se lavan tres veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado. Entonces, las perlas (\sim7 x 10^{7}) se vuelven a suspender en 125 \mul de un suero anti-EtBG de conejo diluido 1:125 en COVAp y se incuban durante toda la noche a 4ºC. Las perlas se lavan una vez con 200 \mul de COVAp y luego 3 veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente y se vuelven a suspender en 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1%. Se añaden 70 \mul de las suspensiones de perlas anteriores (\sim2 x 10^{7}) a 50 \mul de 40 ng/\mul de Fab de anti-conejo de cabra marcado con FITC (Jackson 115-095-006) en PBS, Tween 20 al 0,1% y se incuba 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas se lavan 3 veces con 200 \mul de PBS, Tween 20 al 0,1% como anteriormente, luego se vuelven a suspender en 1 ml PBS, Tween 20 al 0,1% y se analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton
Dickinson).

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Por consiguiente, como se observa en la fig. 16, las perlas a las que se unieron los genes que codifican la fosfotriesterasa marcada con el péptido Flag (junto con un anticuerpo que se une al péptido Flag) pueden distinguirse claramente de genes a los que se unieron otros genes que codifican enzimas sin actividad fosfotriesterasa (por ejemplo, N-Flag-M.HaeIII).

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Ejemplo 11 BirA de E. coli transcrito y traducido in vitro cataliza una reacción que da lugar a un cambio en las propiedades de fluorescencia de las microesferas marcadas en el sustrato en los compartimentos acuosos de una emulsión agua en aceite.

El gen que codifica un péptido de Propionibacterium shermanii que se biotinila in vivo en E. coli se amplifica usando oligonucleótidos BCCP5 y BCCP3 del vector Pinpoint Xa-1 (Promega). El fragmento de PCR se clona en el vector pET-23d(FLAG) digerido con BamHI y HindIII, aguas abajo de un promotor de ARN polimerasa de T7 y el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7, y en el marco con una región codificante del péptido FLAG del extremo N; este vector se denomina pET-23d(FLAG-BCCP). El vector pET-23d(FLAG) es idéntico al vector pET-23d (Novagen), excepto por la región entre los sitios NcoI y BamHI únicos, que se ha modificado para incluir una región codificante del péptido FLAG del extremo N como se muestra más adelante en el esquema 2 (ID SEC Nº: 2, 3). Con el fin de añadir una marca de hexahistidina al extremo de carbono de la proteína, los dos oligonucleótidos BCCPHis+ y BCCPHis- se hibridaron y luego se ligaron en el vector pET- 23d(FLAG-BCCP) digerido con SacI y NotI, dando el vector pET-(FLAG-BCCP-His). La proteína FLAG-BCCPHis (denominada FBH) se sobreexpresa en la cepa C41 (DE3) (Miroux y Walker, 1996), se recolecta y se purifica con Ni-NTA agarosa (Qiagen) en condiciones nativas, siguiendo el protocolo del fabricante. La proteína biotinilada se reduce por incubación con un volumen igual de avidina-agarosa (Sigma), se equilibra previamente con un tampón de lavado (NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 8,0; NaCl 300 mM; imidazol 20 mM) durante 1 hora a 4ºC. Entonces, la suspensión se centrifuga a 10.000 g durante 2 minutos y el sobrenadante se conserva, se coge en alícuotas y se almacena en líquido nitrógeno (largo plazo) o a 4ºC.

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Esquema 2

El gen que codifica BirA de E. coli se amplificó por PCR usando oligonucleótidos BirA5 y BirA3 de un vector pBluescript 2SK+ que contiene el gen BirA de E. coli (obsequio de P. Wang, sin publicar). El fragmento de PCR se clona en el vector pGEM-4Z(K2) digerido con KpnI y XhoI aguas abajo del promotor lac, promotor de ARN polimerasa de T7 y el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 eficaz. El vector pGEM-4Z(K2) es idéntico al vector pGEM-4Z^{Ncol} (véase el ejemplo 8, esquema 1), excepto por la región entre los únicos sitios NcoI y KpnI, que se ha modificado según el esquema 3 mostrado más adelante para que contenga un único sitio XhoI aguas abajo del sitio NcoI (ID SEC Nº: 4, 5).

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Esquema 3

La secuenciación de ADN identifica un clon con la correcta secuencia nucleotídica, denominado pGEM-BirA. El plásmido pGEM-BirA descrito anteriormente se amplifica por PCR usando cebadores LMB2 y LMB3 como anteriormente para crear un fragmento de PCR de 1139 pares de bases (BirA_LMB2-3) que lleva el promotor de ARN polimerasa de T7, el sitio de iniciación de la traducción del gen 10 del fago T7 y el gen BirA. El fragmento de PCR se purifica directamente usando Wizard PCR Preps (Promega).

Se centrifugaron alícuotas de 60 \mul (1,2 x 10^{9} perlas) de microesferas marcadas con IgG anti-ratón de cabra no fluorescente de 1,0 \mum de diámetro (Bangs Laboratories, CP03N) en una microcentrífuga a aproximadamente 2.600 g (6.000 rpm) durante 3 minutos. El sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender en 60 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5%. Las perlas se centrifugaron de nuevo, se volvieron a suspender en 60 \mul de anticuerpo M5 anti-FLAG (Sigma F4042) y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. Las perlas se centrifugaron de nuevo (2.600 g) durante 3 minutos, el sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender en una mezcla de 30 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5% y 30 \mul de proteína FBH obtenida como anteriormente (concentración final de proteína de aprox. 4 mg/ml) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

Mientras tanto se prepararon alícuotas de 60 \mul de un sistema de transcripción/traducción acoplada in vitro procariota diseñado para moldes lineales (Lesley y col., 1991) usando un kit comercial (sistema de extracto S30 de E. coli para moldes lineales; Promega) complementado con ARN polimerasa de T7 (2.000 unidades), ADN de BirA_LMB2-3 10 nM (o sin nada ADN). Estas alícuotas se incubaron a 25ºC durante 1 hora para permitir la traducción.

Las alícuotas de 60 \mul de de perlas se centrifugaron a 2.600 g (6.000 rpm) en una microcentrífuga durante 3 minutos y se eliminó el sobrenadante. Se volvieron a suspender en 60 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5%, se volvieron a centrifugar y se eliminó el sobrenadante. Finalmente se volvieron a suspender en hielo en una alícuota de 54 \mul de las reacciones de transcripción/traducción acopladas in vitro procariotas descritas anteriormente, complementadas con 3 \mul de d-biotin 2 mM y 3 \mul de ATP 0,2 M.

De cada mezcla de reacción se tomó una alícuota de 5 \mul y se dejó sin emulsionar. Se emulsionaron 50 \mul de la mezcla de reacción restante esencialmente como Tawfik y Griffiths (1998).

La fase aceitosa se preparó recientemente disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074). Las mezclas de reacción frías en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 1,0 ml de fase aceitosa enfriada en hielo en un vial Biofreeze de 5 ml (Costar, nº 2051) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante un 1 minuto adicional en hielo.

Todas las reacciones se incubaron durante 4 horas a 37ºC para permitir que avanzara la reacción de biotinilación.

Las emulsiones se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 1 min a 13,5 krpm en una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5% y la emulsión se rompió extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, removiendo entre cada adición de hexano. El hexano residual se eliminó centrifugando durante 10 min a temperatura ambiente a vacío en una Speedvac (Farmingdale, NY).

Entonces, aproximadamente 1 x 10^{8} perlas de las emulsiones rotas y las reacciones no emulsionadas se lavaron dos veces con 100 \mul de TNT/BSA en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado. Entonces, las perlas se volvieron a suspender en 50 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5% que contiene 1 \mul de una disolución de estreptavidina-HRP (proporcionada con el kit TSA^{TM}-Direct de NEN) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron dos veces con 100 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, como anteriormente, luego se volvieron a suspender en 50 \mul de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, H_{2}O_{2} al 0,01%. Se añadió 1 \mul de una disolución madre de fluoresceína-tiramida (preparada según las instrucciones del fabricante (kit TSA^{TM}-Direct de NEN)) y la reacción se dejó avanzar durante diez minutos. Las perlas se lavaron dos veces con PBS, como anteriormente, y finalmente se volvieron a suspender en un total de 500 \mul de PBS, se transfirieron a un tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 ml (Falcon) y se analizaron 10.000 acontecimientos usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson).

Como puede verse de la fig. 17, tanto en las reacciones emulsionadas como en las no emulsionadas, la reacción catalizada por BirA traducido in vitro da como resultado perlas con fluorescencia más alta que cuando no estaba presente la enzima. Parece que las perlas que se han incubado en una emulsión con BirA traducido in vitro son más fluorescentes que las perlas que no se han incubado en emulsiones.

Ejemplo 12 Un cambio en la fluorescencia de elementos genéticos puede usarse para enriquecer selectivamente elementos genéticos que codifican péptidos con una actividad de unión. Los elementos genéticos marcados fluorescentemente se aíslan mediante clasificación de citometría de flujo.

Un formato para la selección de elementos genéticos es cuando el elemento genético comprende un gen ligado a una microperla, que se traduce en una microcápsula, y el producto génico traducido se vuelve a acoplar sobre la microperla dentro de la microcápsula. Por tanto, la compartimentación conduce a la formación de complejos de productos génicos unidos al gen que los codifica. Estos complejos pueden seleccionarse posteriormente para unirse a un ligando mediante clasificación de citometría de flujo si la interacción de unión da como resultado un cambio en la fluorescencia de microperlas. El vector pET-23d(FLAG) codifica el péptido FLAG en el extremo N condensado con la región policonectora de pET23d (Novagen). pET23d se digirió con NcoI/BamHI, se purificó en gel y se volvió a disolver en agua. Se mezclaron dos oligonucleótidos fosforilados sintéticos (Vh Bio Ltd, Newcastle upon Tyne, RU), FLAG y FLAGas, a una concentración de 1 \muM cada uno en agua, se calentaron durante 3 min a 94ºC y se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente antes de añadirse al vector digerido en la mezcla de ligadura. La reacción de ligadura se usó impurificada para transformar TG-1 de E. coli. Los clones que contienen el inserto se identificaron por digesto KpnI y se verificaron por secuenciación (Oswel Research Product Ltd, Southampton, RU). La región policonectora de pET-23d(FLAG) es del siguiente modo (ID SEC Nº : 6, 7):

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El constructo de expresión FLAG-HA biotinilado se preparó a partir del vector pET-23d(FLAG) por PCR. La secuencia de péptidos YPYDVPDYA de hemaglutinina de gripe se añadió a la marca FLAG en pET-23d(FLAG) usando el cebador FLAGHA y el cebador biotinilado en 5' pETrev.b. El producto de amplificación tiene 903 bases de longitud y la región codificante del constructo (ID SEC Nº: 8-10) es:

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El constructo competidor en el procedimiento de selección es el gen folA de E. coli que codifica dihidrofolato reductasa amplificada de pET23a/folA usando cebadores pETfor y pETrev.b.

Los fragmentos de PCR se purificaron en gel usando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen). La concentración de ADN se midió mediante espectrofotometría UV. Las diluciones de PCR - los constructos de expresión preparados se hicieron en 0,5 mg/ml de ADN portador preparado a partir de ADN de fago lambda digerido con HindIII (40 min a 80ºC, seguido por precipitación en etanol y disolución en agua).

Se centrifugaron 2 x 10^{9} perlas de poliestireno de 0,95 \mum recubiertas con estreptavidina en una alícuota de 100 \mul de suspensión al 1% (Bangs Laboratories, Inc. CP01N) en una microcentrífuga a aproximadamente 2.600 g (6.000 rpm) durante 3 minutos. El sobrenadante se eliminó y las perlas se volvieron a suspender en 100 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,5% (TNTB). Se añadieron 7 \mul de 2 mg/ml de anticuerpo monoclonal M5 anti-FLAG biotinilado (Sigma) a las perlas que se volvieron a suspender y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante dos horas. Tras el recubrimiento con el anticuerpo, las perlas se lavaron tres veces con 200 \mul de TNTB, se volvieron a suspender en 100 \mul de TNTB y se dividieron en las alícuotas 1 y 2 de 10 \mul y las alícuotas 3 y 4 de 40 \mul. Se preparó disolución madre 0,7 nM de o, (nº 1) ADN de FLAG-HA puro,(nº 2) ADN de folA puro o (nº 3 y nº 4) ADN de FLAG-HA puro diluido en un exceso de 1000 veces de ADN de folA en ADN lambda digerido con HindIII y se aplicó a las alícuotas de perlas. La reacción de unión se dejó avanzar durante toda la noche a 4ºC. El máximo número de genes por perla fue 2 en las alícuotas 1-3 y 0,2 en la alícuota 4. Las perlas recubiertas con el constructo de FLAG-HA sirvieron como control positivo y las perlas recubiertas con folA como control negativo.

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Después de incubación durante toda la noche a 4ºC, las perlas se lavaron dos veces en TNTB y se volvieron a suspender en mezcla de traducción in vitro S30 (sistema de extracto S30 para moldes lineales, Promega) complementada con ARN polimerasa de T7 (20 unidades/\mul).

Las reacciones de traducción in vitro enfriadas en hielo se añadieron gradualmente (en 5 alícuotas de 10 \mul durante \sim2 minutos) a 0,5 ml de fase aceitosa enfriada en hielo (recientemente preparada disolviendo Span 80 al 4,5% (v/v) (Fluka) en aceite mineral (Sigma, nº M-5904) seguido por Tween 80 al 0,5% (v/v) (Sigma Ultra; nº P-8074) en un vial Biofreeze de Costar de 5 ml (nº 2051)) mientras se agitaba con una barra magnética (8x3 mm con un anillo de pivote; Scientific Industries International, Loughborough, RU). La agitación (a 1150 rpm) continuó durante 3 minutos adicionales en hielo. Entonces, las reacciones se incubaron 90 min a 30ºC.

Las emulsiones se transfirieron a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se centrifugaron 8 min 6,5 krpm en una microcentrífuga y la fase aceitosa se eliminó dejando la emulsión concentrada (pero todavía intacta) en el fondo del tubo. Se añadieron 200 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween 20 al 0,05% (TNT) y la emulsión se rompió extrayendo 4 veces con 1 ml de hexano, removiendo entre cada adición de hexano. El hexano residual se eliminó burbujeando aire a través de la suspensión de perlas durante 1-2 min a temperatura ambiente.

Entonces, las perlas de las emulsiones rotas se lavaron dos veces con 100 \mul de TNT en una placa de filtración MultiScreen-HV de 0,45 \mum (Millipore, MAHVN4510), volviéndose a suspender perfectamente entre cada lavado. Entonces, las perlas se volvieron a suspender en TNTB a 10^{6} perlas/\mul y que contenía 100 mU/ml de conjugado de alta afinidad anti-HA-peroxidasa de rata (3F10) (Boehringer Mannheim).

Las perlas se incubaron con el anticuerpo durante 30 minutos a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con 200 \mul de TNT antes de volver a suspenderse en 2 ml de Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. Las perlas suspendidas se sonicaron durante 1 min en hielo usando un ultrasonidos de Heat Systems a una potencia del 1,95% del ciclo, punta de 3,4 mm. Las perlas sonicadas se volvieron a suspender a 10^{8} perlas/ml en Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8. A esta suspensión de perlas se añadió un volumen igual de amplificación de señal de tiramina (TSA), tampón Tris 0,2 M, imidazol 10 mM, pH 8,8, H_{2}O_{2} al 0,004%, 5 \mug/ml de fluoresceína-tiramina.

La fluoresceína-tiramina se sintetizó como se describe por Hopman y col. (Anthon H.N. Hopman, Frans C.S. Ramaekers, Ernst J.M. Speel, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, volumen 46(6), 771-777, 1998).

La reacción se deja avanzar durante cinco minutos a temperatura ambiente y se detiene mediante la adición de 1/10 del volumen de albúmina de suero bovino al 10% en PBS (BSA, Sigma). Las perlas se centrifugaron lentamente en alícuotas de 2 ml de la reacción de marcado y se lavaron 2 veces en TNTB y una vez en PBS. Finalmente, las perlas se volvieron a suspender en 2 ml de PBS y se sonicaron como anteriormente.

Las perlas recubiertas con genes que codifican folA, FLAG-HA o dilución de 1000 veces de FLAG-HA en folA se analizaron en un citómetro de flujo FACScan de Becton Dickinson.

En la figura 18, el histograma A de baja resolución demuestra que las perlas que llevan ADN de FLAG-HA (muestra nº 1) están significativamente marcadas de manera más fluorescente que el control negativo folA (muestra nº 2). Las mezclas nº 3 y nº 4 pinchadas se ejecutan de manera predominantemente idéntica a la muestra de control negativo, excepto por un pequeño número de perlas sumamente fluorescentes (panel B). El 0,04% de perlas en la muestra nº 3 y el 0,02% de perlas en la muestra nº 4 se clasifican en la región M1 que cubre el 95% de los acontecimientos positivos.

Las perlas en las muestras nº 3 y nº 4 que se clasifican en la región M1 se clasificaron usando un clasificador de células activado por fluorescencia de MoFlo. Se adquirieron dos conjuntos de perlas clasificadas para ambas muestras nº 3 y nº 4. En el conjunto uno se recogieron 500 perlas en un único tubo. En el conjunto dos se recogieron 96 perlas individualmente en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Ambos conjuntos de perlas se sometieron a PCR de 35 ciclos usando los cebadores pETrev.b y FLAGrev1.

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Los productos de amplificación se analizaron por electroforesis en gel (figura 19). Los tamaños de producto son de 903 bases para FLAG-HA y 1390 pb para folA.

El análisis electroforético en gel de los productos de reacciones de amplificación sugiere un enriquecimiento significativo durante el transcurso de la clasificación. En el panel A no hay bandas de FLAG-HA visibles en los carriles de los productos amplificados de las reacciones sin clasificar nº 3 y nº 4, mientras que la banda de FLAG-HA en las muestras de las perlas clasificadas es fuertemente visible. Los datos definitivos respecto a la naturaleza del ADN amplificado se obtuvieron de los análisis de ADN amplificado de perlas individuales. En total, 22 perlas de 96 dieron un producto de ADN para la reacción nº 3 y el 50% de éstas eran FLAG-HA puro. Para la reacción nº 4, 9 perlas dieron productos y 8 fueron FLAG-HA.

Los datos de perlas individuales para la reacción nº 3 sugieren que, a la concentración aplicada, nominalmente 2 moléculas de ADN/perla, la mayoría de las perlas sólo tienen de hecho un gen unido que permita el enlace inequívoco entre el gen y su producto. Sin embargo, un número relativamente alto de perlas marcadas positivamente significa que aproximadamente el 50% de las perlas recuperadas fueron positivos falsos. En la muestra nº 4, donde solo hubo \approx0,1 genes/perla, la pureza del ADN recuperado se aproximó al 90%, que indica un enriquecimiento de casi 1000 veces en una etapa.

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia insertada en el vector pET-23d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tataccatgg actacaaaga tgacgatgat aaaatgcatg gcaacgaagg taccggatcc

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> secuencia codificada por el inserto pET-23d

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met His Gly Asn Glu Gly Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia insertada en el vector pGEM-4Z(K2)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgggggg ctcgagc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia codificada por el inserto pGEM-4Z(K2)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Gly Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Región policonectora de pET-23d(FLAG)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

200

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> marca de péptido FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> región codificante del constructo de expresión FLAG-HA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

300

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> marca de péptido FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met His Gly Asn Glu Gly Thr}

\sac{Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> marca de péptido HA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Gly Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Gly Gly}

\sac{Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> EDHFR-Fo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagctagag gtaccttatt accgccgctc cagaatctca aagcaatag

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> EDHFR-Ba

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

201

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> LMB2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac ggccagt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> folA-FW

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaagct tcgatcagtc tgattgcggc g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> folA-BW

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcctcgag ttccgccgct ccagaatctc

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pET for.b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactccaacg tcaaagggcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pETrev.b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttttcacc gtcatcaccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> GFP-FW

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcgaagct tcgagtaaag gagaagaact tttc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> GFP-BW

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcgcctcgag ttttgtatag ttcatccatg ccatg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> GSTM2-2Fo

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgatgccggt accttattac ttgttgcccc agacagcc

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> GSTM2-2Ba

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> LMB2

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac ggccagt

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> LMB3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgatacgtc ggtaccttat tatgacgccc gcaaggtcgg tg

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> N-Flag-OPD-Bc

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

203

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> BCCP5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaggtcatg gatccatgaa actgaaggta acagtcaacg gc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> BCCP3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagatagcta agcttttatt attcgatgag ctcgagatcc cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> BCCPHis+

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcgaaggt ggcagctctg c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> BCCPHis-

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccgcagag ctgccacctt cgatgagct

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> BirA5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcgtagcac tcgagcatga aggataacac cgtgcca

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> BirA3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcatgactg gtaccttatt atttttctgc actacgcag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catggactac aaagatgacg atgataaaat gcatggcaac gaaggtaccg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> FLAGas

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatccggtac cttcgttgca tgcattttat catcgtcatc tttgtagtc

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> FLAGHA

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pETrev..b

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggttttcacc gtcatcaccg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> pETfor

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gactccaacg tcaaagggcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> FLAGrev1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aactcagctt cctttcgggc

\hfill

20

Claims (26)

1. Un procedimiento para aumentar la concentración de una molécula de ácido nucleico que comprende las etapas de:

(a) formar microcápsulas acuosas en una emulsión agua en aceite, en la que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba y en la que una pluralidad de las microcápsulas incluyen una molécula de ácido nucleico, un soporte de fase sólida que puede ligarse a la molécula de ácido nucleico y una disolución acuosa que comprende componentes necesarios para realizar la amplificación de ácidos nucleicos en la fase interna acuosa;

(b) amplificar la molécula de ácido nucleico en las microcápsulas para formar copias de producto amplificado de la molécula de ácido nucleico;

(c) capturar las copias de producto amplificado al soporte de fase sólida en las microcápsulas; y

(d) clasificar según un cambio en las propiedades ópticas del ácido nucleico; aumentando así la concentración de la molécula de ácido nucleico.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha amplificación de ácidos nucleicos se realiza usando amplificación por Q\beta replicasa, reacción en cadena de la ligasa, replicación de secuencia autosostenida o amplificación por desplazamiento de cadenas.

3. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha amplificación de ácidos nucleicos se realiza usando la reacción en cadena de la polimerasa.

4. Un procedimiento según la reivindicación 1, la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que la emulsión agua en aceite incluye al menos un estabilizador de emulsión.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho estabilizador de emulsión es un tensioactivo no iónico.

6. Un procedimiento según la reivindicación 4 o reivindicación 5, en el que el estabilizador de emulsión se selecciona de monooleato de sorbitán y monooleato de polioxietilensorbitán.

7. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicho estabilizador de emulsión es un tensioactivo aniónico.

8. Un procedimiento según la reivindicación 4 o reivindicación 7, en el que el estabilizador de emulsión se selecciona de colato sódico, glicocolato sódico, taurocolato sódico y desoxicolato sódico.

9. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la emulsión es termoestable.

10. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula de ácido nucleico comprende una marca de biotina.

11. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el soporte de fase sólida es una perla.

12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicha perla comprende un recubrimiento de avidina o estreptavidina.

13. Un procedimiento según la reivindicación 11 o reivindicación 12, en el que dicha perla se selecciona de perlas de poliestireno, paramagnéticas y magnéticas.

14. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que el soporte de fase sólida es una perla, la amplificación de ácidos nucleicos se realiza utilizando reacción en cadena de la polimerasa y la emulsión es termoestable.

15. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula de ácido nucleico es ADN genómico o ADNc.

16. Un procedimiento según cualquier reivindicación precedente en el que, cuando se forma una pluralidad de microcápsulas, cada una contiene, en promedio, una o menos de una molécula de ácido nucleico.

17. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-15 en el que, cuando se forma una pluralidad de microcápsulas, cada una contiene, en promedio, entre 5 y 1000 moléculas de ácidos nucleicos.

18. Un procedimiento para producir producto génico de uno o más elementos genéticos que comprenden ácido nucleico, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) proporcionar perlas y uno o más elementos genéticos que comprenden ácido nucleico, en el que dichas perlas están adaptadas para acoplarse a dicho uno o más elementos genéticos y producto génico producido de dichos elementos genéticos, y dicho uno o más elementos genéticos están adaptados para acoplarse a dichas perlas, y combinar dichas perlas y elementos genéticos de forma que dichos elementos genéticos se unan a dichas perlas;

(b) compartimentar dicho uno o más elementos genéticos unidos a perlas en microcápsulas acuosas con componentes requeridos para producir producto génico de dicho uno o más elementos genéticos, formándose dichas microcápsulas en una emulsión agua en aceite y en el que dichas microcápsulas comprenden una fase interna acuosa suspendida como gotitas diferenciadas en una fase externa hidrófoba;

(c) expresar dicho uno o más elementos genéticos dentro de dichas microcápsulas para producir productos génicos respectivos, de forma que dichos productos génicos se vuelven a acoplar a dichas perlas, en el que dicha etapa de expresión comprende transcripción o replicación, y dicho producto génico se selecciona de ADN, ARN o ácido nucleico; y

(d) clasificar según un cambio en las propiedades ópticas de uno o más elementos genéticos.

19. Un procedimiento según la reivindicación 18, en el que dichas perlas comprenden perlas de poliestireno, no magnéticas, magnéticas o paramagnéticas.

20. Un procedimiento según la reivindicación 18 ó 19, en el que dicho uno o más elementos genéticos comprenden una biblioteca de elementos genéticos que está compartimentada en dichas microcápsulas.

21. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que dichas perlas están recubiertas con una sustancia para unir los elementos genéticos con muy alta afinidad, por ejemplo avidina o estreptavidina.

22. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 18-21, que comprende aumentar la concentración de dicho ácido nucleico dentro de dichas microcápsulas mediante amplificación.

23. Un procedimiento según la reivindicación 22, en el que dicha amplificación comprende transcripción usando ARN polimerasas, la reacción en cadena de la polimerasa, amplificación por Q\beta replicasa, la reacción en cadena de la ligasa o sistema de replicación de secuencia autosostenida y amplificación por desplazamiento de cadenas.

24. Un procedimiento según la reivindicación 22 ó 23, en el que dicha emulsión es termoestable y dicha amplificación comprende ciclado térmico.

25. Un procedimiento según la reivindicación 21, en el que dicho ácido nucleico se biotinila para acoplarse a dichas perlas.

26. Un procedimiento según la reivindicación 25, en el que dicho ácido nucleico se biotinila mediante amplificación por PCR con un cebador de biotinilización en 5'.