MX2010010798A - Metodo para incrementar la actividad enzimatica. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos y medios para incrementar la actividad enzimática hacia substratos insolubles. Esto se logra por medios de compartimentalización in vitro en la cual una micropartícula insoluble funciona tanto como el substrato enzimático y como una estructura para selección negativa. Las enzimas incrementadas expresadas de una biblioteca de polinucleótidos enlazados a micropartículas degradan preferentemente la micropartícula que libera variantes de genes específicos en solución. Variantes de genes que codifican menos variantes de enzimas activas permanecen enlazadas a la micropartícula y pueden ser removidas a través de la centrifugación, de esta forma enriqueciendo la biblioteca de polinucleótidos para más variantes de enzimas activas. Estos métodos pueden ser usados para incrementar la actividad de celulasa y ligninasa hacia biomasa celulósica insoluble.

Description

METODO PARA INCREMENTAR LA ACTIVIDAD ENZIMATIC CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuentra en ico de modificación, diseño y selección de prote icularmente, la presente invención se relaciona nzimas por medio de evolución dirigida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La biomasa celulósica es la fuente vable más abundante. Generado en una proporción ones de toneladas secas/año por la bioesfera, l lósica tiene el potencial para reemplazar la ial para disminuir combustibles fósiles. Sin emb rdo a Zhang, Y. H.P. "uno de los retos tecnológ rtantes y difíciles es solucionar la recalcitr riales lignocelulósicos naturales, los cuales pu iases de celulasa (endoglucanasa, exoglucan osidasa) trabajan en forma sinergística para h elulosa. Las endoglucanasas hidrolizan los enlac ucosídicos intramoleculares en material c luble para producir nuevos extremos de cade lucanasas hidrolizan progresivamente los ext na liberando pequeños productos de oligosac rido gua. Los productos solubles son hidrolizados f ß-glucosidasa en glucosa (Schulein, M. , neering of cellulases" Biochim. Biophys, Act ct. olec. Enzym. 2000, 1543 (2) : 239-252) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención incluye un sistema para me vidad enzimática hacia un substrato sólido, eto, la invención incluye un método para selecc vidad de celulasa incrementada por me s incluye un medio para enlazar copias indivi das de variantes de genes individuales partícula compuesta del substrato sólido objeti ma también incluye un medio para compartimenta icropartículas individuales con genes enlazados ión la cual contiene una reacci cripción/traducción in vi ro. Adicionalmente , el ye un medio para expresar cada variante de gen el fin de producir una enzima en cada compartim ión la cual tiene diferente actividad h partícula. Las micropartículas dentro rtimientos de emulsión que contienen varia as altamente activas son degradadas, de est ando la variante de gen enlazada a partir partícula. Adicionalmente, el sistema incluye rom er los com artimientos de emulsión r ador puede, por ejemplo, estar compuesto de c elulosa, o lignina. Dentro de los compartimie ión que contienen variantes de enzimas a as, el enlazador es degradado, de esta forma l ariante de gen enlazada a partir de la microp dora .

La invención puede incluir una o más entes ventajas. La invención utiliza un procedim de selección, a base de IVC novedoso para opti idad enzimática de celulasas en substratos de ubles, y es extensible para optimizar la a atica en cualquier substrato insoluble . La sele as es realizada en material celulósico i al. Por lo tanto, la actividad enzimática es ade rato actual de interés comercial, ningún S le substituto o fluoro énico . Las oblaci s, las cuales ilustran, por la forma de ejem ipios de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención puede ser entendida por referen ente descripción tomada junto con los dibujos an ran modalidades específicas de la presente invención La Figura 1 es una representación en diagram s de proceso implicadas en evolución dirigida por rtimentalización in vítro (IVC por sus siglas en ing La Figura 2 es una representación en diagram s de proceso implicadas en selección de enzimas d a presente invención.

La Figura 3 muestra la Secuencia 1, la cu ncía de ADN del gen de endoglucanasa egll de Tr i (EMBL Base de Datos #M15665) . (Secuencia 1527 BP 411 G 270 T 0 otro .

El término "polinucleotido" se refiere ero de deoxirribonucleótido o ribonucleótido, y se indique de otra forma, incluye análogos cono ótidos naturales que pueden funcionar en un lar a los nucleótidos que se encuentran en forma érmino "polinucleotido" se refiere a cualquier o ARN, la cual incluye, por ejemplo, ADN genóm lementario (ADNc) , el cual es una representació AR mensajero (ARNm) , usualmente obteni scripción inversa de ARNm o amplificación; las m DN producidas sintéticamente o por amplificación; érmino "polinucleotido" comprende moléculas d eico de doble cadena, así como también moléc a sencilla. En polinucleótidos de doble cade nas de polinucleotido no necesitan ser coextens Un "substrato insoluble" , como se usa nte, se refiere a un substrato de enzima qu le en agua en 37°C.

Como se usa en la presente, una "fase so re a cualquier material que es un sólido c a en los métodos de selección de la invención, a es el material al cual los polinucleóti ados para llevar a cabo estos métodos de selecci El término "enlazador" , como se usa en la p efiere a cualquier porción que une un polinucl ase sólida.

Los términos "aminoácido" o "un res ácido" , incluyen residuos o L-aminoácidos ntran en forma natural, a menos que se especi forma. Los términos "aminoácido" y "res " - oácidos" . lución de proteína usando compartimentalizacion i La presente invención emplea compart menta •i tro (IVC por sus siglas en inglés) para evol as de alta y rápida capacidad. En lugar de dep nlace físico entre el genotipo y fenotipo ementa en tecnologías de exhibición, IVC enlaza notipo por confinamiento espacial en una got illa de una emulsión agua en aceite (Tawfik, D.S. -made cell-like compartments for molecular ev Biotechnol . , 1998, 16(7): 652-656; US citud WO 1999/002671 Al) . IVC está rámaticamente en la Figura 1 (100) . Como se pract ción de transcripción/traducción in vitro (IVTT as en inglés) es mezclada con una solución rotein in vitro by DNA Shuffling" . Nature, 488); 389-391; Zhao, H.M. et al . , "Molecular e staggered extensión process (StEP) in bination". Nat . Biotechnol . , 1998, 16 (3): 258- oteca de polinucleótidos (102) y solución 1 adas y dispersadas (107) en una solución de al/tensioactivo (114) para producir una emulsió olumen de una gota promedio (112) en emulsió mina la concentración inicial de la solució oteca de polinucleótido (102) de tal forma dio solamente una variante de gen (103) conteni oteca de polinucleótido (102) estará pres uier gota acuosa dada (112) en emulsión (1 ión (110) se incuba en 30°C mientras que el sist cribe y traduce (115) la variante de gen ( e, por ejemplo, cuando variantes de genes rec son pasados a través de una columna con afi e (122) al producto (118) . Las variantes de gen codifican variante de enzima de" proteína catalít ior son retenidas. Las variantes de genes (124) enriquecidas son amplificadas por medio de énicas previamente descritas para generar una bi polinucleótido refinada para vueltas adicion ificación y selección.

La selección de fenotipos deseables usando practicados previamente se realiza en una var s. El substrato es enlazado al gen, y la transf substrato enlazado a genes objetiva el genotipo selección de afinidad como se describe anter sti, J.J. et al., "Selection of ribozymes that i le-turnover Diels-Alder c cloaddtions b usin . , 2001; 98 (8): 4552-4557). El tamizado de gota idad por medio de la clasificación celular acti escencia ha sido también usada para identi strar genes que codifican catalizadores que tra substrato fluorogénico o enlazan un an escente específico para el producto objetivo (Gr , et al., "Directed evolution of an extreme hotriesterase by in vitro compartmentalizatio 2003, 22(1): 24-35; Aharoni , A. et al., "High-th ning of enzyme librarles: Thiolactonases evo escence-activated sorting of single cells in rtments." Chem. Biol . , 2005, 12(12): 12 obattista, E. et al., "high-throughput scree e librarles: In vitro evolution of a beta-galac luorescence-activated sorting of double emulsions . 2005 12 12 : 1291-1300 . métodos no exhiben actividad incrementad ratos que se encuentran en forma natural, insolu Por lo tanto, es deseable desarrollar un si mento enzimático que permita la objetiva idad enzimática en un substrato de fase sólida i ante y que es realizado in vitro para elimi os antecedentes metabólicos y genómicos del o están presentes in vivo. En general, el esquem ción opera en el modo de selección, donde las v ropiedades catalíticas deseables son seleccionad cedente de una población de variantes inde s, la selección puede ser realizada en un t ción de billones de variantes o más con el trear efectivamente la imagen de optimización enz Método de Selección General ucleótidos puede liberar los polinucleótidos a p fases sólidas, ya sea por escindir el enlazado dar la microperla o partícula.

En modalidades particulares, el método nder las fases sólidas enlazadas a polinucle fase acuosa la cual comprende component scripción/traducción in vitro. La fase acuosa formar una emulsión agua en aceite, en donde l as enlazadas a polinucleótido son compartament otas acuosas en una fase continua en aceite. sa de la emulsión incluye los reactivos necesar scripción/traducción in vitro, y la emulsión se ondiciones adecuadas para estos procesos, de t las variantes de enzima codificadas ucleótidos son expresadas dentro de las gotas ac ucleótidos que codifican variantes de enzimas e desea, la variación genética adicional pu ducida en los polinucleótidos recuperados, por reacción de cadena polimerasa (PCR por sus s s)de disposición de error, y el método repetido.

Polinucleótidos Los polinucleótidos útiles en la i ican una enzima o variante de enzima y pueden ncías regulatorias , tales como aquellas requeri sión eficiente del producto de gen, por tores, incrementadores, secuencias de ini cción, secuencias de poliadenilación, sitios de ilares .

En ciertas modalidades, los métodos de la ción son útiles para clasificar bibliote ucleótidos. En modalidades articulares los ntran en forma natural pueden ser clonados a p o ADNc genómico. (Sambrook et al., 1989); por otecas de anticuerpo de fagos, hechas por repert ficación de PCR de genes de anticuerpo de d izados o no inmunizados tienen fuentes muy e das de fragmentos de anticuerpo funcionales (W 1994; Hoogenboom, 1997) . Las bibliotecas de gene én ser hechas por codificar todos (ver por , 1985; Parmley and Smith, 1988) o parte de ge ejemplo Lowman et al., 1991) o grupos de genes lo Nissim et al, 1994) por una sínte nucleótidos aleatoria o dopada. Las biblioteca ién ser hechas por introducir mutaciones ucleótido o grupo de polinucleótidos aleatorios dad de técnicas in vivo, incluyendo; usando r de bacterias como E. coli mutD5 Liao et al (Leung et al . , 1989). Además puede ser int sificación adicional por usar recombinación hom in vivo (ver Kowalczykowski et al., 1994 o i mer, 1994a; Stemmer, 1994b) ) . Bibliotecas d etos o parciales pueden también ser sint camente a partir de bases de datos o se chas computacionalmente .

Fases sólidas Los polinucleótidos de la invención son sólidas, las cuales pueden, pero no necesitan rato insoluble para la enzima o variante de icada por los polinucleótidos. Los materiales fases sólidas en la invención pueden hidratos poliméricos naturales y sus d icados sintéticamente, reticulados o substituido lizados parcialmente, poliacrilamidas , polimetac imeros y terpolimeros de los policondensados ant poliésteres, poliamidas y otros polímero retanos o poliepóxidos ; materiales inorgánicos sulfatos o carbonatos de metales alcalino t sio, incluyendo sulfato de bario, sulfato de nato de calcio, silicatos de metales alca ino térreos, aluminio y magnesio; y aluminio u ó ío o hidratos, tales como arcillas, alúmina, ina, zeolita, gel de sílice, o vidrio (estos ma n ser usados como filtros con los materiales pol iores) ; y mezclas o copolímeros de las iores, como copolímeros de injerto obtenidos por olimerización de polímeros sintéticos en un ral preexistente . etrafluoroetileno, poliacrilonitrilo, policarb íales similares. Las micropartículas preferidas ias que promedian entre aproximadamente imadamente 35 mieras, más preferentemente imadamente 1 a 20 mieras en diámetro, micropa nadas, micropartículas impregnadas por rentemente por lo menos dos tintes fluor icularmente aquellos que pueden ser ident és del aislamiento individual en una célula de ación por un láser) , ferrofluidos (es decir, pa ticas menores a aproximadamente 0.1 miera en esferas magnéticas (por ejemplo, pa aramagnéticas aproximadamente de 3 mieras en ta micropartículas recolectables o removibl entación y/o filtración. ar los polinucleótidos a partir de las fases sól En varias modalidades, aproximadamente 1, 6 (o cualquier intervalo con estos valores com es) diferentes polinucleótidos son enlazados a a sencilla. En modalidades preferidas, los di ucleótidos codifican tipos diferentes de enzi ío, enzimas que trabajan en concierto para deg particular de substrato insoluble .

Una forma en la cual puede ser enla ucleótido a una fase sólida es a través gación epoxi . Esto puede ser hecho por activar a (es decir, micropartículas de celulosa 1 a tro) por usar un epóxido bifuncional como 1,4-bu icidil éter. La amplificación PCR del polinucleó cebador 5'-amino modificado puede ser usa ducir una amina rimaria enlazada covalentem eryodato de sodio. La amplificación P ucleótido con un cebador modificado con amino p para introducir una amina primaria lentemente. Alternativamente, la modificación ami interna. Un polinucleótido amino modificado p lado covalentemente a grupos .aldehido generados xidación de la fase sólida a través del ret robifuncional como succinimidil -hidrazinoni ona hidrazona.

Otra forma en la cual el polinucleótido ? zado a una fase sólida es a través de la biotin puede ser hecho por amplificación de PCR con un biotinilación (por ejemplo, un cebador inilación) de tal forma que la biotina nucleótido son enlazados covalentement nucleótido bioe tañado uede ser aco lado Milwaukee, Wis.) y ( 3 -mercapto-propil) -trimetox a Chemical Co. , St . Louis, Mo.) puede ser us ducir grupos reactivos tales como amino, vinilo ctivamente. Las superficies activadas pueden se enlazar el polinucleótido directamente (en los o tiol) , o la superficie activada puede se ionada con enlazadores tal como glutara uccinimidil) suberato, SPPD 9 succinimidil ilditio]propionato) , S CC (succini eimidometil]ciclohexano-l-carboxilato) , SIAB (suc oacetiljaminobenzoato) , y S PB (succini eimidofenil]butirato) para separar el polinucle r de la superficie. Los grupos vinilo pue dos para proporcionar un medio para unión covale s vinilo pueden también ser usados como un ancl olimerización de varios olímeros como ácid ñero de 1988, y la solicitud de los Estados U américa No. 375,029, presentada el 7 de julio una de los cuales se incorpora para referenci nte . ación de Fases Acuosas las cuales contienen React Transcripción/Traducción in vitro De acuerdo a la invención, las fases adas a polinucleótido son suspendidas en una fas ual incluye componentes para transcripción/tradu . Los componentes pueden ser seleccionados p rimientos de un sistema específico a partir entes: un amortiguador adecuado, un sist cripción/replicación in vitro y/o un sis cción in vitro el cual contiene todos los ingr arios, enzimas y cofactores, ARN pol ótidos ARJST de transferencia ribosomas ami ir un extracto celular, típicamente de bacterias ; Zubay, 1980; Lesley et al . , 1991; Lesley, ulocitos de conejo (Pelham and Jackson, 1976) , rigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas a comercialmente disponibles (por ejemplo de yendo algunos los cuales pe cripción/traducción acoplada (todos los rianos y el reticulocito y sistemas de extr n de trigo TNT.TM a partir de Promega) . La m ácidos usada puede incluir aminoácidos sintétic , para incrementar el número posible o vari ínas producidas en la biblioteca. Esto pu izado por cargar ARNt con aminoácidos artific o estos ARNt para la traducción in vitro eínas a ser seleccionadas (Ellman et al., 1991; ; Mendel et al . , 1995) . na) . Las emulsiones son nombradas agua en ace us siglas en inglés agua/aceite) .

La emulsión puede ser estabilizada por ad o más agentes tensioactivos (tensioactivos) oactivos son nombrados agentes emulsificantes a interfase de agua/aceite para evitar (o por sar) la separación de las fases. Muchos aceites ificadores pueden ser usados, para la genera iones agua en aceite; una compilación reciente e 16,000 tensioactivos; muchos de los cuales so agentes emulsificantes (Ash and Ash, 1993) . Los ados incluyen aceite mineral blanco y tensioac os (Schick, 1966) como monooleato de sorbita 0; ICI) y monooleato de polioxietilensorbitán CI) .

El uso de tensioactivos aniónicos uede tam ioactivo es transferido a partir de la fase acuo rfase y se restablece la actividad. La adició ioactivo aniónico a las mezclas a ser emuls ura que las reacciones procedan solamente despu artimentalización .

La creación de una emulsión generalmente plicación de energía mecánica para forzar a las r juntas. Hay una variedad de formas de hacer izan una variedad de dispositivos mecánicos, in adores (como las barras de agitación mag adores de propulsor y turbina, dispositivos de dores) , homogenizadores (incluyendo homogeniza r-estator, homogenizadores de válvula de alta p genizadores de chorro) , molinos de coloides, disp ltrasonido y "emulsificación de membrana" (Beche inso 1 4 . idual que es para ser realizado de acuerdo a la ición. En todos los casos, habrá un equilibri el tamaño de biblioteca de polinucleóti uecimiento requerido y la concentración reque nentes en las gotas individuales para lograr e ente y reactividad de las enzimas/variantes de e Los procesos de expresión ocurren prefere o de cada gota individual proporcionada por la ción. Tanto la transcripción in vitro cripción/traducción acoplada llega a ser menos e concentraciones de ADN subnanomolares . De rimiento para solamente un número limitado de m D para estar presentes en cada gota, esto por un límite superior práctico en el tamaño le. El volumen promedio de las gotas está gene puede ser incrementada artificialmente por os que serán bien conocidos para aquellos versad ca. Estos incluyen, por ejemplo, la adición de excluye químicos como polietilenglicoles (PEG s en inglés) y una variedad de técnicas de ampli enes, incluyendo transcripción usando AR pol yendo aquellas de bacterias como E. coli (Robert ner and Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; R l., 1975), eucariotes por ejemplo ( eil et al. y et al., 1983) y bacteriófagos como T7, T on et al., 1984); la reacción de cadena po ) (Saiki et al., 1988); Amplificación de <2ß r e et al., 1983; Cahill et al., 1991); Chetv in, 1995; atanaev et al., 1995); la reacción d a (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); efectiva permite que gotas más grandes sea ivamente. Esto permite un límite superior rido para la mayoría de aplicaciones al volumen roximadamente 2.2 x 10"14 m3 (que corresponde a un iámetro de 35 µp?) .

El tamaño de gota debe ser suficientement acomodar todos los componentes requeridos iones bioquímicas que son necesarias para ocurri la gota, además de la fase sólida enl ucleótido. In vitro, tanto las reaccio scripción y las reacciones de transcripción/tr ladas emplea típicamente una concentración t eotidos de aproximadamente 2 mM. Por ejemplo, co ranscribir un gen a una molécula de ARN corta sen bases en longitud, esto puede requerir un mínim "22 do simplemente por adecuar las condiciones de s para formar la emulsión de acuerdo rimientos del sistema de selección. Entre mayo o de la gota, mayor es el volumen que será r emulsificar una biblioteca de polinucleótidos l último factor limitante será el tamaño de la g forma el número de gotas posible por unidad de odalidades de ejemplo, la emulsión incluye por imadamente: 102, 103, 105, 106, 107, 108, 1 y 10 gotas/ml de emulsión.

Dependiendo de la complej idad y tamaño oteca a ser tamizada, puede ser benéfico fo ión de tal forma que en general 1 ó menos de a enlazada a polinucleótido está incluida en c a emulsión. El número de polinucleótidos por g gota proporcionan emulsiones que contienen un po ientemente alto de gotas que tienen 1 fase ada a polinucleótido por gota, con un po ientemente bajo de gotas que tienen 2 ó ma as enlazadas a polinucleótido por gota dimiento proporcionará generalmente el mayor ución. Donde la biblioteca es mayor y/o más c embargo, esto puede ser impracticable, pu rible incluir varias fases sólidas enlaz ucleótidos y depender de aplicación repetida de a invención para lograr la clasificación de la a da. En varias modalidades, la emulsión agua en a da bajo condiciones en donde por lo imadamente : 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% S acuosas incluyen 1 ó menos de 1 fase sólida en ucleótido . generadas y de esta forma son capaces cionadas, un tamaño de biblioteca gra aímente deseable.

Usando la presente invención, en un diá acuosa preferido de 2.6 µt?, un tamaño de reper lo menos 1011 pueden fácilmente ser clasificado fase acuosa en una emulsión de 20 mi.

Recuperación de polinucleotidos liberados La emulsión es mantenida por un tiempo su condiciones adecuadas para transcripción/tradu enzimas/variantes de enzimas. Las enzimas/vari as actúan para escindir un enlazador escindible polinucleotidos a las fases sólidas, si están pr para degradar las fases sólidas que consiste trato insoluble para la enzima. La actividad e moléculas de interés puede ser ensayado por reac cripción/ traducción no compartament al izadas . La cionada puede ser amplificada y/o clonada en u ado para propagación y/o expresión. El AR y/o inante pueden ser producidos a partir de lo iduales para purificación adicional y ensayo. Las nzimas recombinantes seleccionadas usando los la invención pueden ser empleadas para c cación para la cual se emplea la enzima na . forma, por ejemplo, puede ser puesta en cont ante de celulasa con un substrato celulósi plo, biomasa. En una modalidad de ejemplo, la . en la forma de materia particulada, en etro de partículas promedio está en el interv 0 µt? . En esta materia, una variante de celulo nción puede ser empleada en la producció Como se muestra en la Figura 2, el elección de enzimas 200, en una modalidad, in reación de una biblioteca de polinucleótido específicamente, la biblioteca de polinuc e ser creada a partir de una secuencia de g fica una enzima con actividad hacia el sub enzimas que catalizan su degradación son most abla posterior. e Ej emplos Enzimas sacáridos Celulosa, Celulasa, lubles hemicelulosa , hemicelulas quitina, sefarosa quitinasa, eínas Amiloides, Neprilisina, lubles queratinas proteasa, ueratinasa ser usada para substratos o enlazadores compu osa. Símilármente, la secuencia 2, la cual cod de ligninasa LiP H8 a partir de Phane osporium, puede ser usada para substratos o enl estos de lignina. Las secuencias pueden ser sint camente por varios vendedores (por ejemplo, . , BioPioneer, Codon Devices, Exon BioSyste ular Cloning Laboratories) . Las secuencias d n incluir un sitio de inicio de transcripción ncía de promotor T7 así como también la secu 1 de enlace ribosomal Kozak para eficiente trans aducción en la reacción de traducción/traducción ) descrita posteriormente. La secuencia CGACTCACTATAGGGAGAGCCACCATGG- 3 ' puede ser agreg encia de genes para proporcionar este in scri ción sitios de enlace ribosomal. lumen total de 88 µ? con agua. Después, 10 -L de 5 unidades (2 µ?.) de Taq ADN polimerasa son a un volumen final a 100 µ? . Se mezcla la mente por pipeteo. La reacción es ciclada térm por 1 minuto en 94°C, 1 minuto en 45°C, y 1 m La amplificación mutagénica usando cebador a adelante 5"-amino modificado proporciona un e (204) de variantes de genes (203) a una microp uble (206) . Las micropartículas puede partículas de celulosa (SigmaCell S3504, Sigma- rado como a continuación: 1 g de micropartí o con 100 mi de 95% de etanol , 100 mi de agua, .6N NaOH. Las micropartículas son combinadas co , 4 -butanodiol diglicidil éter (Eastman Kodak) y 2 0.6 N la cual contiene 4 m ml de NaBH . La rea al solamente una variante de gen (203) es enlaza dar cualquier microperla dada (206) como se dict ibución de Poisson. Ver (Moss, L.G. et al., "A ient method for coupling DNA to cellulose" . 1981, 256(24): 12655-12658).

En una modalidad ilustrativa, alternat ificación mutagénica usando una PCR amino modif para enlazar (204) variantes de genes (203) partícula insoluble (206) , tal como una microp elulosa (SigmaCell S3504, Sigma-Aldrich) , se real itinuación : 5 mg de micropartículas se lava con agua, y 3x40 mi de acetato de sodio 100 partículas son oxidadas en 100 mM de metapery , 100 mM de solución de acetato de sodio 100 en temperatura ambiente. La solución es ida or lavar las micro artículas 3x40 mi de a na NAP-5 (GE Healthcare Life Sciences) . Las vari activadas (203) son enlazadas (204) partículas preparadas (206) en amortiguador de a de ácido 2 - (N-morfolino) etansulfónico lx en 21 en una proporción estequiométrica de 1:3 a 1:1 que en general solamente una variante de gen ada (204) a cualquier microperla dada (206) por la distribución de Poisson. Ver, (Bioc iques, 2a edición, Greg T. Hermanson, public mic Press, Inc., 2008).

La biblioteca de polinucleótido (202) pu ificada (207) usando el siguiente procedimie ra la mezcla de tensioactivo aceite (214) (4% imero de polisiloxano-policetilpolietilenglico , Goldschmidt) (disuelto en aceite mineral liger v para permitir la transcripción y traducción (21 nte de genes (203) en la variante de enzima de ) .

Una vez traducida, la variante de enzim a la degradación de la micropartícula de celulos variantes de genes (203) que codifican las vari as (216) que exhiben actividad incrementada partícula de celulosa (206) degradan la microp ) . Las variantes de genes son estadísticame bles para ser liberadas (218) a partir partícula degradada (217) que las variantes de g fican variantes de enzimas que exhiben menor ac eriodo de incubación variable de 1-4 horas c ingencia del ensayo. En la práctica, uno inicia o de incubación menor y progresivamente acorta e incubación a través de las vueltas subsecue idad incrementada permanecen suspendidas en a y son de esta forma selectivamente enriquec de la selección negativa de variantes d adas a micropartículas (206, 202). Las varia (224) pueden ser recuperadas a partir de la a por usar PCR, por ejemplo el kit de purific QIAquick (Qiagen) , y sometidas a vueltas adi ) de amplificación mutagénica y selecció mentar además la actividad enzimática.

El proceso 200 es distinto de aquel prese igura 1 (100) en la cual el substrato (106), ) , y variante de genes (103) permanecen enlazados i cual se realiza la selección positiva por ra de afinidad (122, 123) del producto (118).

Mientras que la invención ha sido particu rada descrita con referencia a modalidades es e algunas modalidades pueden incluir iteraciones m na técnica o múltiples aplicaciones de un mec s que se indique otra cosa. Por lo tanto, el al nvención debe ser determinado con referencia indicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta f r método conocido por la solicitante para llev tica la citada invención, es el que resulta cia ente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como ant ma como propiedad lo contenido en las si ndicaciones : 1. Un método de selección para a ática incrementada en un substrato in terizado porque comprende: (a) proporcionar una pluralidad de polinucleóti codifican variantes de una o más enzimas qu en un substrato insoluble, en donde la plura polinucleótidos es enlazada a una pluralidad sólidas y el enlazador o las fases sólidas co un substrato para la una o más enzimas; (b) suspender las fases sólidas enlaza polinucleótido en una fase acuosa la cual c los componentes para transcripción/traduc y aceite para recuperar los polinucleotidos sido liberados de las fases sólidas. 2. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque la pluralidad de polinuc ende por lo menos 106 diferentes polinucleotidos . 3. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque cada fase sólida enl ucleótido comprende 1-6 polinucleotidos diferent e los cuales está presente en una o más copias. 4. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque no más de 6 di ucleótidos codifica 2 a 6 tipos diferentes de en 5. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque las fases sólidas co perías o partículas. 6. El método de conformidad con la reivin a la cual contiene una fase sólida enl ucleótido . 8. El método de conformidad con la reivin aracterizeado porque la emulsión comprende por imadamente 109 gotas acuosas/ml de emulsión. 9. El método de conformidad con la reivin racterizado porque la fase acuosa se separa de l as y de aceite por sedimentación usando una cent 10. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque los polinucleótidos recuper ficados y enlazados a una pluralidad de fases onde el enlazador o las fases sólidas compre rato para la una o más enzimas y se repiten la (e) . 11. El método de conformidad con la reivin aracterizado porque los polinucleótidos recuper aracterizado porque uno o más de los polinuc erados son clonados en un vector. 14. El método de conformidad con la reivin donde el vector comprende un vector de ex terizado porque adicionalmente comprende: a) expresar uno o más de los polinucleótidos rec para producir una o más variantes de enzimas; b) recuperar la una o más variantes de enzimas del cultivo; y c) poner en contacto una o más variantes de enz un substrato insoluble . 15. El método de conformidad con la reivin caracterizado porque el substrato insoluble c sa .