BRPI0911326B1

BRPI0911326B1 - método de seleção para atividade enzimática melhorada em um substrato insolúvel

Info

Publication number: BRPI0911326B1
Authority: BR
Inventors: M Paegel Brian; G Blazej Robert
Original assignee: Allopartis Biotechnologies Inc; Novozymes As; Scripps Research Inst
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-03
Publication date: 2019-11-26
Also published as: AU2009231585B2; US20110046012A1; WO2009124296A2; BRPI0911326A2; US20140045723A1; EP2260130A2; ES2443047T3; WO2009124296A3; DK2260130T3; CA2719211C; US8557742B2; EP2260130B1; AU2009231585A1; EP2260130A4; CA2719211A1; MX2010010798A

Abstract

método de seleção para atividade enzimática melhorada em um substrato insolúvel são descritos métodos e meios para melhoria da atividade enzimática no sentido de substratos insolúveis. isto é obtido por meio de compartimentalização in vitro em que uma micropartícula insolúvel funciona tanto como o substrato de enzima quanto como uma estrutura para seleção negativa. enzimas melhoradas expressas de uma biblioteca de polinucleotídeos ligada a micropartícula preferencialmente degradam a micropartícula, liberando variantes do gene específicas na solução. as variantes do gene que codificam menos variantes enzimáticas ativas permanecem ligadas à micropartícula e podem ser removidas por meio de centrifugação, enriquecendo assim a biblioteca de polinucleotídeos para mais variantes enzimáticas ativas. esses métodos podem ser usados para melhorar atividade de celulase e ligninase no sentido de biomassa celulósica insolúvel.

Description

“MÉTODO DE SELEÇÃO PARA ATIVIDADE ENZIMÁTICA MELHORADA EM UM SUBSTRATO INSOLÚVEL”

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001]Este pedido reivindica prioridade e benefício para USSN 61/042.637, depositado em 4 de abril de 2008, no qual está incorporado aqui pela referência na sua íntegra com todos os propósitos.

Campo da Invenção [002]A presente invenção diz respeito ao campo técnico de modificação por engenharia, projeto e seleção de proteínas. Mais particularmente, a presente invenção diz respeito à melhoria de enzima por meio de evolução direcionada a proteína.

Antecedentes da Invenção [003]Biomassa celulósica é a recurso natural renovável mais abundante.

[004]Gerado a uma taxa de ~ 100 bilhões tons secas/ano pela biosfera, biomassa celulósica tem potencial de substituir a demanda mundial para diminuir combustíveis fósseis. Entretanto, de acordo com Zhang, Y. H. P. Um dos mais importantes e difíceis desafios tecnológicos é superar a recalcitrância de materiais linocelulósicos naturais, que devem ser enzimaticamente hidrolisados para produzir açúcares fermentáveis. Ver, (Zhang, Y. H. P., et al., Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotechnol. Adv., 2006, 24: 452-481) [005]Celulose é um polissacarídeo que consiste em 100 a 20.000 unidades de glicose ligadas a β-1-4. Celulase, a classe de enzimas que hidrolisa celulose, tem atraído imenso interesse por sua capacidade de degradar biomassa celulósica em glicose para produção de biocombustível. Três subclasses de celulase (endoglucanase, exoglucanase, β-glicosidase) atuam sinergisticamente para hidrolisar celulose. Endoglucanases hidrolisam ligações e-1-4-glicosídicas intramoleculares em material celulósico insolúvel para produzir extremidades de cadeia inéditas. Exoglucanases hidrolisam progressivamente as extremidades de cadeia liberando pequenos produ

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 14/48

2/26 tos oligossacarídeos solúveis em água. Os produtos solúveis são finalmente hidrolisados por β-glicosidase em glicose (Schulein, M., Protein in cellulases engennering. Biochim. Biophys. Acta-Protein Struct. Molec. Enzym., 2000, 1543(2): 239252).

Sumário da Invenção [006]A invenção diz respeito a um sistema para melhorar atividade enzimática no sentido de um substrato sólido. Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de selecionar atividade celulase melhorada por meio de compartimentalização in vitro na qual uma micropartícula celulósica funciona tanto como o substrato sólido visado quanto como uma estrutura para seleção negativa. Em outro aspecto, a micropartícula pode ser composta de lignina ou outro substrato insolúvel.

[007]Várias implementações da invenção dizem respeito a um sistema para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos. A biblioteca codifica variantes enzimáticas com atividade diferente no sentido do substrato sólido visado. O sistema inclui adicionalmente um meio de ligar cópias individuais ou clonais de variantes individuais de gene a um composto de micropartícula do substrato sólido visado. O sistema também inclui meios para compartimentalizar micropartículas individuais com genes ligados em uma emulsão contendo uma reação de transcrição/tradução in vitro. Adicionalmente, o sistema inclui meios para expressar cada variante do gene ligado a fim de produzir enzima em cada compartimento de emulsão com atividade diferente no sentido da micropartícula. Micropartículas dentro dos compartimentos de emulsão contendo variantes enzimáticas altamente ativas são degradadas, liberando assim a variante do gene ligado da micropartícula. Além disso, o sistema inclui meios para quebrar os compartimentos de emulsão e recuperar seletivamente as variantes do gene liberados que codificam enzimas com atividade enzimática melhorada no sentido do substrato da micropartícula. Melhoria da atividade enzimática adicional pode ser obtida gerando-se uma nova biblioteca de polinucleotídeos derivada das varian

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 15/48

3/26 tes do gene recuperadas e repetindo-se as etapas anteriores.

[008]Outras implementações da invenção podem incluir o uso de um ligante clivável entre a variante do gene e uma micropartícula de veículo não reativa. O ligante pode, por exemplo, ser composto de celulose, hemicelulose ou lignina. Nos compartimentos de emulsão contendo variantes enzimáticas altamente ativas, o ligante é degradado, liberando assim a variante do gene ligado na micropartícula do veículo.

[009]A invenção pode incluir uma ou mais das seguintes vantagens. A invenção utiliza uma abordagem de modo de seleção inédita a base de IVC, para otimizar atividade enzimática de celulases nos substratos de celulose insolúveis, e é extensível para otimizar atividade enzimática em qualquer substrato insolúvel. A seleção de enzima é realizada no material celulósico insolúvel natural. Portanto, atividade enzimática é adaptada ao substrato real de interesse comercial, e não a um substrato substituto solúvel ou fluorgênico. Populações de 10¹⁰-10¹² variantes do gene podem sobreviver, o que é uma enorme melhoria em relação às abordagens baseadas em classificação que são normalmente limitadas a 10.000 variantes. A seleção de enzima é realizada completamente in vitro, eliminando o fundo metabólico e genômico organismal que leva a otimização fora do alvo.

[0010]Estes e outros recursos e vantagens da presente invenção serão apresentados com mais detalhes na especificação seguinte da invenção e nas figuras em anexo, que ilustram, a título de exemplo, os princípios da invenção.

Descrição Resumida dos Desenhos [0011]A invenção pode ser entendida pela referência à descrição seguinte em conjunto com os desenhos em anexo que ilustram modalidades específicas da presente invenção.

[0012]A figura 1 é a representação diagramática das etapas do processo envolvidas em evolução direcionada por meio de compartimentalização in vitro (IVC).

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 16/48

4/26 [0013]A figura 2 é uma representação diagramática das etapas do processo envolvidas em A seleção de enzima de acordo com a presente invenção.

[0014]A figura 3 mostra Sequência 1, que é a sequência de DNA do gene endoglucanase egll de Trichoderma reesei (EMBL Database #M15665).

[0015]Figura 4 mostra Sequência 2, que é a sequência de DNA de o gene ligninase LiP H8 de Phanerochaete chrysosporium (EMBL Database #Y00262).

Descrição Detalhada

Definições [0016]Os termos usados nas reivindicações e especificação são definidos da maneira apresentada a seguir, a menos que de outra forma especificada.

[0017]O termo polinucleotídeo refere-se a um polímero desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo e, a menos que de outra forma limitada, inclui análogos conhecidos de nucleotídeos naturais que podem funcionar de uma maneira similar aos nucleotídeos de ocorrência natural. O termo polinucleotídeo refere-se a qualquer forma de DNA ou RNA, incluindo, por exemplo, DNA genômico; DNA complementar (cDNA), que é uma representação de DNA de RNA mensageiro (mRNA), normalmente obtido pela transcrição reversa de mRNA ou amplificação; moléculas de DNA produzidas sinteticamente ou por amplificação; e mRNA. O termo polinucleotídeo engloba moléculas de ácido nucléico de fita dupla, bem como moléculas de fita única. Em polinucleotídeos de fita dupla, as fitas de polinucleotídeo não precisam ser coextensivas (isto é, um polinucleotídeo de fita dupla não precisa ser de fita dupla ao longo de todo o comprimento de ambas as fitas).

[0018]Polinucleotídeos são considerados diferentes se eles diferirem na estrutura, por exemplo, sequência de nucleotídeo.

[0019]Da maneira aqui usada, o termo substrato no geral refere-se a um substrato para uma enzima; isto é, o material no qual uma enzima age para produzir um produto de reação.

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 17/48

5/26 [0020]Um substrato insolúvel, da maneira aqui usada, refere-se a um substrato de enzima que é não solúvel em água a 37 °C.

[0021]Da maneira aqui usada, uma fase sólida refere-se a qualquer material que é um sólido quando empregado nos métodos de seleção da invenção. A fase sólida é o material no qual os polinucleotídeos são ligados para realizar esses métodos de seleção.

[0022]O termo ligante, da maneira aqui usada, refere-se a qualquer fração que anexa um polinucleotídeo a uma fase sólida.

[0023]Os termos aminoácido ou resíduo de aminoácido, inclui Laminoácidos ou resíduos de aminoácidos de ocorrência natural, a menos que de outra forma especificamente indicada. Os termos aminoácido e resíduo de aminoácido também incluem D-aminoácidos bem como aminoácidos quimicamente modificados, tais como análogos de aminoácidos, aminoácidos de ocorrência natural que não são normalmente incorporados nas proteínas, e compostos quimicamente sintetizados tendo as propriedades características de aminoácidos (coletivamente, aminoácidos atípicos). Por exemplo, análogos ou miméticos de fenilalanina ou prolina, que permite a mesma restrição conformacional dos compostos de peptídeo como Phe ou Pro natural são incluídos na definição de aminoácido

Evolução da Proteína Usando Compartimentalização in vitro [0024]A presente invenção emprega compartimentalização in vitro (IVC) para evolução de enzima rápida e de alta produção. Em vez de basear-se em uma ligação física entre o genótipo e fenótipo da maneira implementada nas tecnologias exibidas, IVC liga genótipo e fenótipo por confinamento espacial em uma única gotícula aquosa de uma emulsão água em óleo (Tawfik, D. S. et al., Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. Biotechnol, 1998, 16(7): 652-656; US 6489103; WO 1999/002671 Al). IVC é apresentada diagramaticamente na figura 1 (100). Como praticado, uma reação de transcrição/tradução in vitro (IVTT) é mistura

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 18/48

6/26 da com uma solução contendo a biblioteca de polinucleotídeos (102). A biblioteca de polinucleotídeos (102), comumente preparada por amplificação ou recombinação mutagênica, contém variantes do gene (103) da sequência genética tipo selvagem ligada por téter (104) na fração do substrato (106) (Cadwell, R.C. et al., Mutagenic PCR. PCR-Methods and Applications, 1994, 3(6): S136-S140; Vartanian, J.P. et al., Hypermutagenic PCR involving all four transitions and a sizeable proportion of trans versions. Nucleic Acids Res., 1996, 24(14): 2627-2631; Stemmer, W.P.C., Rapid Evolution of a protein in vitro by DNA Shuffling. Nature, 1994, 370(6488): 389-391; Zhao, H.M. et al., Molecular evolution by staggered extension process (Step) in vitro recombination. Nat. Biotechnol., 1998, 16(3): 258-261). A biblioteca de polinucleotídeos (102) e solução IVTT são misturadas e dispersas (107) em uma solução de óleo mineral/agente tensoativo (114) para produzir emulsão (110). O volume de uma gotícula média (112) na emulsão (110) determina a concentração inicial da solução da biblioteca de polinucleotídeos (102) de maneira tal que, em média somente uma variante do gene (103) contida na biblioteca de polinucleotídeos (102) esteja presente em qualquer dada gotícula aquosa (112) na emulsão (110). Emulsão (110) é incubada a 30 ^oC mediante o que o sistema IVTT transcreve e traduz (115) variante do gene (103) na variante da enzima da proteína (116) (Miller, OJ. et al., Directed Evolution by in vitro compartmentalization. Nat. Methods, 2006, 3(7): 561-570).

[0025]Uma vez traduzida, a variante da proteína (116) catalisa a transformação de substrato ligado na variante do gene (106) no produto (118) se a variante da proteína (116) for cataliticamente ativa. Emulsão (110) é quebrada (119) por meio de extração ou centrifugação, e variantes do gene (120) são recuperadas. Antes das implementações desta técnica, uma seleção positiva (123) ocorre, por exemplo, quando variantes do gene recuperadas (120) são passadas através de uma coluna com afinidade de ligação (122) com produto (118). As variantes do gene (124) que codificam cataliticamente variante da enzima da proteína superior e são retidas. As

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 19/48

7/26 variantes do gene (124) assim enriquecidas são amplificadas por meio de técnicas mutagênicas previamente descritas para gerar uma biblioteca de polinucleotídeos refinada para rodadas adicionais de emulsificação e seleção.

[0026]A seleção de fenótipos desejáveis usando métodos IVC praticados previamente foi realizada de inúmeras maneiras. O substrato foi ligado ao gene, e transformação do substrato ligado ao gene alvejou o genótipo com sucesso para A seleção de afinidade da maneira descrita anteriormente (Agresti, JJ. et al., Selection of ribozymes that catalyse multiple-turnover Diels-Alder cycloadditions by using in vitro compartmentalization. Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A., 2005, 102(45): 1617016175; Tawfik, D. S. et al., Man-made cell-like compartments for molecular evolution. Nat. BiotechnoL, 1998, 16(7): 652-656). Alternativamente, se o fenótipo for atividade polimerase, seleção ocorreu por meio de enriquecimento onde polimerases mais ativas amplificam o gene co-encapsulado com o polimerase (Ghadessy, FJ. et al., Directed Evolution of polimerase function by compartmentalized self replication. Proc. Natl. Acad. ScL U. S. A., 2001,98(8): 4552-4557). A classificação por gotículas de alta produção por meio de classificação de célula ativada por fluorescência tem também sido usada para identificar e sequestrar genes que codificam catalisadores que transformam um substrato fluorgênico ou se ligam a um anticorpo fluorescente específico para o produto alvo (Griffiths, A. D. et al., Directed Evolution of a extremely fast phosphotriesterase by in vitro compartmentalization. Embo J., 2003, 22(1): 24-35; Aharoni, A. et al., High-throughput screening of enzyme libraries: Thiolactonases evolved by fluorescence-ativacted classification of single cells in emulsion compartments. Chem. Biol, 2005, 12(12): 1281-1289; Mastrobattista, E. et al., High-throughput screening of enzyme libraries: In vitro Evolution of a beta- galactosidase by fluorescene-ativacted classification of double emulsions. Chem. Biol, 2005, 12(12): 1291-1300).

[0027]A despeito das vantagens de IVC em relação às técnicas de seleção

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 20/48

8/26 de enzima in vivo, esses métodos praticados previamente IVC não são adequados para melhoria da atividade enzimática no sentido de substratos insolúveis tais como biomassa celulósica. Métodos IVC prévios exigem um substrato ligado a gene solúvel que é convertido em um produto que permanece ligado ao gene ou um substrato fluorgênico não natural da maneira descrita anteriormente.

[0028]Em ambos os casos, enzimas selecionadas usando esses métodos não exibem maior atividade no sentido de substratos de ocorrência natural insolúveis.

[0029]Portanto, foi desejável desenvolver um sistema de melhoria de enzima que permitiu alvejamento de atividade enzimática em um substrato de fase sólida insolúvel relevante e que foi realizada in vitro para eliminar efeitos de fundo metabólico e genômico do organismo que estão presentes in vivo. No geral, o esquema da invenção opera em modo de seleção, onde variantes com propriedades catalíticas desejáveis são selecionadas no fundo de uma população de variantes indesejáveis. Além do mais, a seleção pode ser realizada em um tamanho de população de bilhões de variantes ou mais a fim de amostrar efetivamente o cenário de otimização de enzima.

Método de Seleção Geral [0030]A invenção diz respeito a um método de seleção da atividade enzimática melhorada em um substrato insolúvel. O método emprega uma coleção de polinucleotídeos que codifica variantes de uma ou mais enzimas que agem em um substrato insolúvel, tal como uma biblioteca de polinucleotídeos. A coleção de polinucleotídeos é ligada a uma coleção de fases sólidas, tais como microesferas ou partículas. O ligante ou as fases sólidas incluem um substrato para a uma ou mais enzimas, de maneira tal que a atividade do tipo de enzima codificada nos polinucleotídeos pode liberar os polinucleotídeos das fases sólidas, tanto clivando-se o ligante quanto degradando-se a microesfera ou partícula.

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 21/48

9/26 [0031]Em modalidades particulares, o método envolve suspender as fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo em uma fase aquosa compreendendo componentes para transcrição/tradução in vitro. A fase aquosa é usada para formar uma emulsão água em óleo, em que as fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo são compartimentalizadas em gotículas aquosas em uma fase contínua oleosa. A fase aquosa da emulsão inclui os reagentes necessários para transcrição/tradução in vitro, e a emulsão é mantida nas condições adequadas para esses processos, de maneira tal que variantes enzimáticas codificadas nos polinucleotídeos sejam expressas nas gotículas aquosas da emulsão. Uma variante da enzima ativa em uma dada gotícula aquosa clivará o ligante anexando o(s) polinucleotídeo(s) nesta gotícula à microesfera ou partícula e/ou degradará a microesfera ou partícula anexada ao polinucleotídeo. Desta maneira, polinucleotídeos são liberados das microesferas ou partículas na fase aquosa.

[0032]A emulsão é quebrada, e a fase aquosa é separada das fases sólidas e oleosas para recuperar polinucleotídeos que foram liberadas das fases sólidas, permitindo por meio dessa seleção de polinucleotídeos que codificam variantes enzimáticas ativas. Se desejado, variação genética adicional pode ser introduzida nos polinucleotídeos recuperados, por exemplo, por reação em cadeia de polimerase por propensa a erro (PCR), e o método repetido.

Polinucleotídeos [0033]Polinucleotídeos usados na invenção codificam uma enzima ou variante da enzima e podem incluir sequências regulatórias adequadas, tais como aquelas exigidas para expressão eficiente do produto genético, por exemplo, promotores, melhoradores, sequências de iniciação translacional, sequências de poliadenilação, sítios de união e similares.

[0034]Em certas modalidades, os métodos da presente invenção são usados para classificar bibliotecas de polinucleotídeos. Em modalidades particulares, os méPetição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 22/48

10/26 todos empregam bibliotecas tendo pelo menos cerca de: 10², 103, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 109, 10¹⁰, 10¹¹ e 10¹² polinucleotídeos diferentes. No geral, o tamanho da biblioteca será menos que cerca de 10¹⁵ polinucleotídeos diferentes.

[0035]As bibliotecas de polinucleotídeos podem ser criadas em qualquer de uma variedade de modos diferentes que são bem conhecidos pelos versados na técnica. Em particular, agrupamentos de polinucleotídeos de ocorrência natural podem ser clonados de DNA ou cDNA genômico (Sambrook et al., 1989); por exemplo, bibliotecas de anticorpo de fago, feitas por genes de repertórios de amplificação de PCR de anticorpo de doadores imunizados ou não imunizados têm provido fontes muito efetivas de fragmentos de anticorpo funcional (Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997). Bibliotecas de genes podem também ser feitas codificando-se todos (ver, por exemplo, Smith, 1985; Parmley and Smith, 1988) ou parte dos genes (ver, por exemplo, Lowman et al., 1991) ou de genes (ver, por exemplo, Nissim et al., 1994) por uma síntese de oligonucleotídeo randomizado ou dopado. Bibliotecas podem também ser feitas introduzindo-se aleatoriamente mutações em um polinucleotídeo ou agrupamento de polinucleotídeos por uma variedade de técnicas in vivo, incluindo; usando cepas mutantes, de bactéria tal como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996); usando o sistema de hipermutação de anticorpo de B-linfócitos (Yelamos et al., 1995). Mutações aleatórias podem também ser introduzidas tanto in vivo quanto in vitro por mutações químicas, e ionização ou irradiação UV (ver Friedberg et al., 1995), ou incorporação de análogos de base mutagênica (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Mutações aleatórias podem também ser introduzidas em genes in vitro durante polimerização, por exemplo, usando polimerases propensas a erro (Leung et al., 1989). Diversificação adicional pode ser introduzida usando recombinação homóloga tanto in vivo (ver Kowalczykowski et al., 1994) quanto in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b)). Bibliotecas de genes completos ou parciais podem também ser quimicamente sintetizadas a partir das

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 23/48

11/26 bases de dados da sequência ou preditas computacionalmente.

Fases Sólidas [0036]Polinucleotídeos da invenção são anexados nas fases sólidas, que podem, mas não precisam, ser um substrato insolúvel para a enzima ou variante da enzima codificada pelos polinucleotídeos. Materiais usados como fases sólidas na invenção podem incluir: carboidratos poliméricos naturais e seus derivados modificados, reticulados, ou substituídos sinteticamente, tais como ágar, agarose, ácido algínico reticulado, quitina, gomas guar substituídas e reticuladas, ésteres de celulose, especialmente com ácido nítrico e ácidos carboxílicos, ésteres de celulose misturados, e éteres de celulose; polímeros naturais contendo nitrogênio, tais como proteínas e derivados, incluindo gelatinas reticuladas ou modificadas, e queratinas; polímeros de hidrocarboneto natural, tais como látex e borracha; polímeros sintéticos, tal como polímeros de vinila, incluindo polietileno, polipropileno, poliestireno, poli(cloreto de vinila), poli(acetato de vinila) e seus derivados parcialmente hidrolisados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copolímeros e terpolímeros dos policondensados anteriores, tais como poliésteres, poliamidas, e outros polímeros, tais como poliuretanos ou poliepóxidos; materiais inorgânicos porosos tais como sulfatos ou carbonatos de metais alcalinos terrosos e magnésio, incluindo sulfato de bário, sulfato de cálcio, carbonato de cálcio, silicatos de álcali e metais alcalinos terrosos, alumínio e magnésio; e alumínio ou óxidos ou hidratos de silicone, tais como argilas, alumínio, talco, caulim, zeólita, sílica gel, ou vidro (esses materiais podem ser usados como filtros com os materiais poliméricos anteriores); e misturas ou copolímeros das classes anteriores, tais como copolímeros de enxerto obtidos inicializando-se polimerização de polímeros sintéticos em um polímero natural pré-existente.

[0037]As fases sólidas no geral têm um tamanho e forma que permitem sua suspensão em um meio aquoso, seguido por formação de uma emulsão água em óleo. As fases sólidas adequadas incluem microesferas ou partículas (ambas deno

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 24/48

12/26 minadas micropartículas para facilidade de discussão). Micropartículas usadas na invenção podem ser selecionadas por versados na técnica de qualquer tipo adequado de material particulado e inclui aquele composto de celulose, sefarose, poliestireno, polimetilacrilato, polipropileno, látex, politetrafluoretileno, poliacrilonitrila, policarbonato, ou materiais similares. Micropartículas preferidas inclui aquelas medindo entre cerca de 0,01 e cerca de 35 microns, mais preferivelmente entre cerca de 1 a 20 microns em diâmetro, micropartículas haptenadas, micropartículas impregnadas por um ou preferivelmente pelo menos dois pigmentos fluorescentes (particularmente aqueles que podem ser identificados depois de isolamento individual em uma célula de fluxo e excitação por um laser), ferrofluidos (isto é, partículas magnéticas menos que cerca de 0,1 mícron de tamanho), microesferas magnéticas (por exemplo, partículas superparamagnéticas cerca de 3 microns de tamanho), e outras micropartículas coletáveis ou removível por sedimentação e/ou filtração.

Ligação de Polinucleotídeos nas Fases sólidas [0038]Polinucleotídeos são ligados nas fases sólidas por qualquer meio conhecido pelos versados na técnica que não interfere com transcrição/tradução. Em modalidades preferidas, o ligante é anexado a uma extremidade de cada polinucleotídeo, ancorando por meio deste o polinucleotídeo na fase sólida. Se a fase sólida não for um substrato para as enzimas/variantes de enzimas codificadas pelos polinucleotídeos, o ligante será ou incluirá uma fração que pode ser clivada pela enzima e/ou variantes ativos para liberar os polinucleotídeos das fases sólidas.

[0039]Em várias modalidades, aproximadamente: 1,2, 3, 4, 5, ou 6 (ou qualquer faixa com esses valores como pontos finais) polinucleotídeos diferentes são ligados a uma fase sólida única. Em modalidades preferidas, os polinucleotídeos diferentes codificam diferentes tipos de enzimas, por exemplo, enzimas que trabalham juntas para degradar um tipo particular de substrato insolúvel.

[0040]Uma maneira na qual o polinucleotídeo pode ser ligado a uma fase só

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 25/48

13/26 lida é através de conjugação epóxi. Isto pode ser feito ativando-se a fase sólida (isto é, micropartículas de celulose 1 a 20 pm em diâmetro) usando um epóxido bifuncional tal como éter 1,4-butanodiol diglicidila. Amplificação de PCR do polinucleotídeo com um iniciador modificado por amino 5'- pode ser usada para introduzir uma amina primária covalentemente ligada. Em outras modalidades, a modificação de amino pode ser interna. Um polinucleotídeo modificado por amino ou não modificado pode ser covalentemente acoplado à fase sólida ativada por epóxi através de uma conjugação de abertura do anel epóxi.

[0041]Em modalidades ilustrativas, o polinucleotídeo pode ser ligado a uma fase sólida através de uma reticulação heterobifuncional. Isto pode ser feito ativando-se a fase sólida (isto é, micropartículas de celulose 1 a 20 pm em diâmetro) usando um agente oxidante tal como metaperiodoato de sódio. Amplificação de PCR do polinucleotídeo com um iniciador modificado por amino pode ser usada para introduzir uma amina primária covalentemente ligada. Alternativamente, a modificação de amino pode ser interna. Um polinucleotídeo modificado por amino pode ser covalentemente acoplado aos grupos aldeído gerados durante a oxidação da fase sólida através de uma reticulação heterobifuncional tal como succinimidila 4hidrazinonicotinato acetona hidrazona.

[0042]Um outro modo em que o polinucleotídeo pode ser ligado a uma fase sólida é através de biotinilação. Isto pode ser feito por amplificação de PCR com um iniciador de biotinilação (por exemplo, um iniciador de biotinilação 5 ') de maneira tal que a biotina e polinucleotídeo sejam covalentemente ligados. Um polinucleotídeo biotinilado pode ser acoplado a uma microesfera de poliestireno (0,035 a 10 pm em diâmetro) que é revestido com avidina ou estreptavidina, que ligará, portanto, o polinucleotídeo biotinilado com afinidade muito alta.

[0043]Se a fase sólida for silicone ou vidro, a superfície deve no geral ser ativada antes de anexar os polinucleotídeos. Compostos silano ativados tais como

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 26/48

14/26 trietóxi amino propil silano (from Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), trietóxi vinil silano (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.), e (3-mercapto- propil)-trimetóxi silano (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) podem ser usados para introduzir grupos reativos tais como amino-, vinil, e tiol, respectivamente. Superfícies ativadas como essas podem ser usadas para ligar o polinucleotídeo diretamente (nos casos de amino ou tiol), ou a superfície ativada pode ser adicionalmente reagida com ligantes tais como glutaraldeído, bis (succinimidil) suberato, SPPD 9 succinimidila 3-[2piridilditio] propionato), SMCC (succinimidila-4-[Nmaleimidometil] cicloexano-1- carboxilato), SIAB (succinimidila [4-iodoacetil] aminobenzoato), e SMPB (succinimidila 4-[lmaleimidofenil] butirato) para separar o polinucleotídeo da superfície. Grupos vinila podem ser oxidados para fornecer um meio para anexação covalente. Grupos vinila podem também ser usados como uma âncora para a polimerização de vários polímeros tal como ácido poliacrílico, que pode fornecer múltiplos pontos de anexação para polinucleotídeos específicos. Grupos amino podem ser reagidos com dextranos oxidados de vários pesos moleculares para fornecer ligantes hidrofílicos de diferente tamanho e capacidade. Adicionalmente, interações de polieletrólito podem ser usadas para imobilizar um polinucleotídeo específico em uma fase sólida usando técnicas e químicas descritas em App. U.S. No. 150.278, depositada em 29 de janeiro de 1988, e App. U.S. No. 375.029, depositada em 7 de julho de 1989, cada qual está incorporada aqui pela referência.

Formação de Fases Aquosas Contendo Reagentes de Transcrição/Tradução In vitro [0044]De acordo com a invenção, as fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo são suspensas em uma fase aquosa incluindo componentes para transcrição/tradução in vitro. Tais componentes podem ser selecionados pelas exigências de um sistema específico a partir do seguinte: um tampão adequado, um sistema de transcrição/replicação in vitro e/ou um sistema de tradução in vitro contendo todos

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 27/48

15/26 os ingredientes necessários, enzimas e cofatores, polimerase RNA, nucleotídeos, RNAs de transferência, ribossomos e aminoácidos (natural ou sintético).

[0045]Um tampão adequado será um no qual todos os componentes desejados do sistema biológico são ativos e dependerá, portanto, das exigências de cada sistema de reação específico. Tampões adequados para reações biológicas e/ou químicas são conhecidos na técnica e receitas fornecidas em vários textos de laboratório, tais como Sambrook et al., 1989.

[0046]Sistemas de tradução in vitro exemplares podem incluir um extrato celular, tipicamente da bactéria (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), reticulócitos de coelho (Pelham e Jackson, 1976), ou germe de trigo (Anderson et al., 1983). Muitos sistemas adequados são comercialmente disponíveis (por exemplo, pela Promega) incluindo alguns que permitirão transcrição/tradução acoplada (todos os sistemas bacterianos e os reticulócito e germe de trigo TNT.TM. Sistemas de extrato pela Promega). A mistura de aminoácidos usada pode incluir aminoácidos sintéticos se desejado, para aumentar o número ou variedade possível de proteínas produzidas na biblioteca. Isto pode ser realizado carregando-se tRNAs com aminoácidos artificiais e usando esses tRNAs para a tradução in vitro das proteínas a ser selecionadas (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).

Formação de Emulsões [0047]Emulsões podem ser produzidas de qualquer combinação adequada de líquidos imiscíveis. Preferivelmente, a emulsão da presente invenção tem água (contendo os componentes bioquímicos) como a fase presente na forma de gotículas finamente divididas (a fase dispersa, interna ou descontínua) e um líquido hidrofóbico, imiscível (um óleo) como a matriz em que essas gotículas são suspensas (a fase não dispersa, contínua ou externa). Tais emulsões são denominadas água em óleo (W/O).

[0048]A emulsão pode ser estabilizada por adição de um ou mais agentes de

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 28/48

16/26 superfície ativa (agentes tensoativos). Esses agentes tensoativos são denominados agentes de emulsificação e agem como a interface água/óleo para prevenir (ou pelo menos atrasar) a separação das fases. Muitos óleos e muitos emulsificantes podem ser usados para a geração de emulsões água em óleo; uma compilação recente listada acima de 16.000 agentes tensoativos, muitos dos quais são usados como agentes de emulsificação (Ash e Ash, 1993). Óleos adequados incluem óleo mineral branco leve e agentes tensoativos não iônicos (Schick, 1966) tais como mono-oleato de sorbitano (Span.TM.80; ICI) e mono-oleato de polioxietilenosorbitano (Tween™ 80; ICI).

[0049]O uso de agentes tensoativos aniônicos pode também ser benéfico. Agentes tensoativos adequados incluem colato de sódio e taurocolato de sódio. Deoxicolato de sódio é particularmente preferido, preferivelmente a uma concentração de 0,5 % peso/volume, ou menos. Inclusão de tais agentes tensoativos pode em alguns casos aumentar a expressão dos polinucleotídeos e/ou a atividade das enzimas/variantes de enzimas. Adição de alguns agentes tensoativos aniônicos a uma mistura da reação não emulsificada abole completamente a tradução. Durante a emulsificação, entretanto, o agente tensoativo é transferido da fase aquosa na interface e a atividade é restaurada. Adição de um agente tensoativo aniônico nas misturas a ser emulsificadas garante que as reações procedam somente após a compartimentalização.

[0050]Criação de uma emulsão no geral exige a aplicação de energia mecânica para forçar o agrupamento das fases juntas. Existe uma variedade de maneiras de fazer isto que utilize uma variedade de dispositivos mecânicos, incluindo agitadores (tais como barras de agitação magnética, agitadores de propulsor e turbina, dispositivos de pá e de movimento rápido), homogeneizadores (incluindo homogeneizadores rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta pressão e homogeneizadores a jato), moinhos coloidais, dispositivos de emulsificação por ultrassom e

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 29/48

17/26 membrana (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

[0051]Gotículas aquosas formadas em emulsões água em óleo são no geral estáveis com pouca se nenhuma troca de polinucleotídeos ou enzimas/variantes de enzimas entre gotículas. A tecnologia existe para criar emulsões com volumes até em escalas industriais de milhares de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

[0052]O tamanho preferido da gotícula variará dependendo das exigências precisas de qualquer processo de seleção individual que deve ser realizado de acordo com a presente invenção. De qualquer maneira, existirá um equilíbrio ideal entre o tamanho da biblioteca de polinucleotídeos, o enriquecimento exigido e a concentração exigida de componentes nas gotículas individuais para obter expressão eficiente e reatividade das enzimas/variantes de enzimas.

[0053]Os processos de expressão preferivelmente ocorrem em cada gotícula individual provido pela presente invenção. Tanto transcrição in vitro quanto transcrição/tradução acoplada tornam-se menos eficiente a subconcentrações nanomolares de DNA. Em virtude da exigência para somente um número limitado de moléculas de DNA ser presente em cada gotícula, isto, portanto, apresenta um limite superior prático no tamanho possível da gotícula. O volume médio das gotículas é no geral entre cerca de 1 femtolitro e cerca de 1 nanolitro, inclusive. O diâmetro médio das gotículas aquosas tipicamente fica na faixa de 1 pm e cerca de 100 pm, inclusive. Em certas modalidades, o volume médio das gotículas é preferivelmente menos que 5,2x10^-16 m³, (correspondente a uma gotícula esférica de diâmetro menor que 10 pm, mais preferivelmente menor que 6,5x10~¹⁷ m³, (5 pm), mais preferivelmente cerca de 4.2x10^-18 m³ (2 pm) e acima de tudo preferivelmente cerca de 9x10^-18 m³ (2,6 pm).

[0054]A concentração de polinucleotídeo efetiva nas gotículas pode ser aumentada artificialmente por vários métodos que serão bem conhecidos pelos versa

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 30/48

18/26 dos na técnica. Esta inclui, por exemplo, a adição de volume excluindo produtos químicos tais como polietileno glicóis (PEG) e uma variedade técnicas de amplificação genética, incluindo transcrição usando RNA polimerases incluindo aquelas da bactéria tal como E. coli (Roberts, 1969; Blattner and Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), eucariotos, por exemplo, (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) e bacteriófagos tais como T7, T3 e SP6 (Melton et al., 1984); a reação de cadeia polimerase (PCR) (Saiki et al., 1988); amplificação Qp replicase (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin and Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); a reação de cadeia ligase (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); sistema de replicação de sequência auto sustentada (Fahy et al., 1991) e amplificação de deslocamento de fita (Walker et al., 1992). Mesmo técnicas de amplificação genética que exigem ciclagem térmica tais como PCR e LCR podem ser usadas se as emulsões e a transcrição in vitro ou sistemas de transcrição/tradução acoplados forem termostáveis (por exemplo, os sistemas de transcrição/tradução acoplados devem ser feitos de um organismo termostável tal como Thermus aquaticus).

[0055]O aumento da concentração de ácido nucléico local efetivo permite que maiores gotículas sejam usadas efetivamente. Isto permite um limite superior prático preferido para a maioria das aplicações do volume de gotícula de cerca de 2,2x10^-14 m³ (correspondente a uma esfera de diâmetro 35 pm).

[0056]O tamanho da gotícula deve ser suficientemente grande para acomodar todos os componentes exigidos das reações bioquímicas que são necessárias para ocorrer dentro da gotícula, além da fase sólida ligada ao polinucleotídeo. Tanto reações de transcrição in vitro quanto reações de transcrição/tradução acopladas empregam tipicamente uma concentração de nucleotídeo total de cerca de 2 mM. Por exemplo, a fim de transcrever um gene para uma molécula de RNA pequena única de 500 bases em comprimento, isto exigiria um mínimo de 500 moléculas de nucleotídeos por gotícula (8,33x10^-22 mols). A fim de constituir uma solução 2 mM,

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 31/48

19/26 este número de moléculas deve estar contido em uma gotícula de volume 4,17x10^-19litros (4,17x10^-22 m3 que, se esférica, deverá ter um diâmetro de 93 nm.

[0057]Além disso, os ribossomos necessários para a tradução para ocorrer têm por si aproximadamente 20 nm em diâmetro. Consequentemente, o limite inferior preferido para gotículas é um diâmetro de aproximadamente 0,1 pm (100 nm).

[0058]O tamanho de gotículas de emulsão pode ser variado simplesmente talhando as condições da emulsão usada para formar a emulsão de acordo com as exigências do sistema de seleção. Quanto maior o tamanho da gotícula, maior é o volume que será exigido para emulsificar uma dada biblioteca de polinucleotídeos, uma vez que o fator finalmente limitante será o tamanho da gotícula e assim o número de gotículas possível por volume de unidade. Em modalidades exemplares, a emulsão inclui pelo menos cerca de 10², 103, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ e 10¹² gotículas/mL de emulsão.

[0059]Dependendo da complexidade e tamanho da biblioteca a ser classificada, ela pode ser benéfica para formar uma emulsão de maneira tal que no geral 1 ou menos que 1 fase sólida ligada ao polinucleotídeo seja incluída em cada gotícula da emulsão. O número de polinucleotídeos por gotícula é governado pela distribuição de Poisson. Dessa maneira, se condições são ajustadas de forma que exista, em média, 0,1 fase sólida ligada ao polinucleotídeo por gotícula, então, na prática, aproximadamente: 90 % de gotículas não conterão nenhuma fase sólida ligada ao polinucleotídeo, 9 % de gotículas conterão 1 fase sólida ligada ao polinucleotídeo, e 1 % de gotículas conterão 2 ou mais fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo. Na prática, valores médios de cerca de 0,1 a cerca de 0,5, mais preferivelmente cerca de 0,3, fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo por gotícula fornecem emulsões que contêm uma porcentagem suficientemente alta de gotículas tendo 1 fase sólida ligada ao polinucleotídeo por gotícula, com uma porcentagem suficientemente baixa de gotículas tendo 2 ou mais fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo por gotícula. Esta

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 32/48

20/26 abordagem proporcionará no geral o maior poder de resolução. Onde a biblioteca é maior e/ou mais complexa, entretanto, isto pode ser impraticável; pode ser preferível incluir diversas fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo e basear-se na aplicação repetida do método da invenção para obter classificação da atividade desejada. Em várias modalidades, a emulsão água em óleo é formada nas condições em que pelo menos cerca de: 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, ou 90 % de gotículas aquosas inclui 1 ou menos que 1 fase sólida ligada ao polinucleotídeo.

[0060]Estudos teóricos indicam que, quanto maior o número de variantes polinucleotídeo criadas, tanto mais provável será que a molécula seja criada com as propriedades desejadas (ver Perelson e Oster, 1979 para uma descrição de como isto se aplica a repertórios de anticorpos). Recentemente, foi também confirmado na prática que maiores repertórios fago do anticorpo certamente dão origem a uma maior quantidade de anticorpos com maior afinidade de ligação do que repertórios menores (Griffiths et al., 1994). Para garantir que variantes raras sejam geradas e possam ser selecionadas, um maior tamanho de biblioteca é no geral desejável.

[0061]Usando a presente invenção, em um diâmetro de gotícula aquosa preferida de 2,6 pm, um tamanho de repertório de pelo menos 10¹¹ pode facilmente ser classificado usando 1 mL de fase aquosa em uma emulsão de 20 mL.

Recuperação de Polinucleotídeos Liberados [0062]A emulsão é mantida por um tempo suficiente em condições adequadas para transcrição/tradução das enzimas/variantes de enzimas. As enzimas/variantes de enzimas agem para clivar um ligante clivável anexando os polinucleotídeos nas fases sólidas, se presente, e/ou para degradar fases sólidas que consistem em um substrato insolúvel para a enzima. Atividade enzimática assim resulta na liberação de polinucleotídeos que codificam enzimas/variantes de enzimas ativas de suas fases sólidas na fase aquosa.

[0063]A fase aquosa é separada das fases sólidas e oleosas por qualquer

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 33/48

21/26 técnica adequada, tais como, por exemplo, sedimentação, usando uma centrífuga. Os polinucleotídeos liberados podem então ser recuperados da fase aquosa por qualquer de inúmeras técnicas convencionais.

[0064]Após cada rodada de seleção, o enriquecimento do agrupamento de polinucleotídeos para aqueles que codificam as moléculas de interesse pode ser ensaiado por reações não compartimentalizadas de transcrição/tradução. O agrupamento selecionado pode ser amplificado e/ou clonado em um vetor adequado para propagação e/ou expressão. RNA e/ou proteína recombinante podem ser produzidos a partir dos clones individuais para purificação e ensaio adicionais. As variantes enzimáticas recombinantes selecionadas usando os métodos da invenção podem ser empregadas para qualquer aplicação para que a enzima nativa seja empregada. Assim, por exemplo, uma variante de celulase pode ser colocada em contato com um substrato celulósico, por exemplo, biomassa. Em uma modalidade exemplar, a biomassa é na forma de matéria particulada, em que o diâmetro da partícula médio é na faixa de 1 a 100 pm. Neste caso, uma variante de celulose da invenção pode ser empregada na produção de um biocombustível.

Modalidades exemplares [0065]O sistema e método da presente invenção serão descritos junto com enzimas expressas a partir das sequências genéticas de DNA sintético. Entretanto, o sistema e método podem também ser usados com sequências de DNA derivadas de fontes naturais ou com sequências genéticas de RNA sintético ou natural.

[0066]Conforme mostrado pela Figura 2, o processo de seleção de enzima 200, em uma modalidade, começa com a criação de uma biblioteca de polinucleotídeos (202). Mais especificamente, a biblioteca de polinucleotídeos pode ser criada a partir de uma sequência genética que codifica uma enzima com atividade no sentido do substrato insolúvel alvejado. Exemplos de substratos insolúveis e as enzimas que catalisaram suas degradações são mostrados na tabela a seguir.

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 34/48

22/26

Classe	Exemplos	Enzimas
Polissacarídeos insolúveis	Celulose, hemicelulose, quitina, sefarose	Celulase, hemicelulase, quitinase, agarase
Proteína insolúvel	Amilóides, queratinas	Neprilisina, protease, queratinas
Polímeros orgânicos, plásticos	Lignina, ácido polilático, succinato de polibutileno, policaprolactina, poliidroxibutirato	peroxidase de lignina, lipase, cutinase

[0067]Por exemplo, Sequência 1, que codifica o gene endoglucanase egll de Trichoderma reesei, pode ser usada para substratos ou composto ligantes de celulose. Similarmente, Sequência 2, que codifica o gene ligninase LiP H8 de Phanerochaete chrysosporium, pode ser usada para substratos ou composto ligantes de lignina. As sequências podem ser quimicamente sintetizadas por vários vendedores (por exemplo, Biomatik Corp., BioPioneer, Codon Devices, Exon BioSystems, and Molecular Cloning Laboratories). As sequências genéticas podem incluir um sítio de iniciação de transcrição tais como a sequência promotora T7 bem como a sequência de sinal de ligação ribossomal Kozak para transcrição e tradução eficientes na reação de transcrição/tradução in vitro (IVTT) descrita a seguir. A sequência 5'-(N)i0TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCCACCATGG-S' pode ser adicionada à sequência genética para fornecer essa iniciação de transcrição e sítios de ligação ribossomal.

[0068]Variantes do gene (203) na biblioteca de polinucleotídeos (202) podem ser criadas usando amplificação mutagênica. Mais especificamente, 10 pL de tampão PCR mutagênica 10x (MgCl2 70 mM, KCl 500 mM, Tris-HCl 100 mM pH 8,3,

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 35/48

23/26

0,1% (peso/volume) gelatina) são combinados com 10 μΙ_ de 10 x dNTP mix (dGTP 2 mM, dATP 2 mM, dCTP 10 mM, dTTP 10 mM), 30 pmol de iniciador PCR direto modificado por 5'-amino, 30 pmol ou iniciador PCR reverso, 20 fmol de sequência genética 1 ou 2, e levar para um volume total de 88 μ_ com água. Em seguida, 10 μ_ de MnCl2 5 mM e 5 unidades (2 μ_) de DNA polimerase Taq são adicionados para um volume final de 100 μ_. A solução é misturada suavemente por pipetagem. A reação é termociclada 30 x para 1 minuto a 94 ⁰C, 1 minuto a 45 ⁰C, e 1 minuto a 72 ⁰C.

[0069]Amplificação mutagênica usando um PCR de iniciador direto modificado por 5'- amino fornece um meio de ligar (204) variantes do gene (203) a uma micropartícula insolúvel (206). As micropartículas podem ser micropartículas de celulose (SigmaCell S3504, Sigma- Aldrich) preparada como a seguir: 1 g de micropartículas é lavado com 100 m_ de etanol 95 %, 100 m_ de água, e 20 m_ de NaOH 0,6 N. As micropartículas são combinadas com 2,5 m_ de 1,4-butanodiol diglicidil éter (Eastman Kodak) e 2,5 m_ de NaOH 0,6 N contendo 4 mg/m_ de NaBH4. A reação é realizada à temperatura ambiente por 18 horas com agitação contínua. A reação é interrompida por lavagem com água até pH neutro ser obtido. Lavagem com 50 m_ de etanol 95 % remove 1,4-butanodiol diglicidil éter residual. As variantes do gene modificadas por 5'-amino (203) são ligadas (204) nas micropartículas preparadas (206) em NaOH 0,1 N a 21 ⁰C por 4-8 horas em uma razão estequiométrica de 1:3 para 1:10 de maneira tal que no geral somente uma variante do gene (203) seja ligada (204) a qualquer dada microesfera (206) como ditado pela distribuição de Poisson. Ver, (Moss, L.G., et al., A simple, efficient method for coupling DNA to celullose. /. “Bio. Chem., 1981,256(24): 12655-12658 [0070]Em uma modalidade ilustrativa alternativa, amplificação mutagênica usando um PCR modificado por amino é usada para ligar (204) variantes do gene (203) a uma micropartícula insolúvel (206), tal como uma micropartícula de celulose

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 36/48

24/26 (SigmaCell S3504, Sigma- Aldrich), é realizada da maneira a seguir: 5 mg de micropartículas são lavados com 3 x 40 mL de água, e 3 x 40 mL de acetato de sódio 100 mM. As micropartículas são oxidadas em um metaperiodoato de sódio 100 mM, solução de acetato sódio 100 mM por 1 hora à temperatura ambiente. A solução é então removida lavando-se as micropartículas 3 x 40 mL de água. As variantes do gene modificado por amino são ativadas com uma reticulação heterobifuncional combinando 10 % em peso/volume de succinimidila 4-hidrazinonicotinato acetona hidrazona dissolvidos em dimetilformamida com 5 pg de variantes do gene em solução salina tamponada com fosfato 1x por 3 horas à temperatura ambiente. As variantes do gene ativadas são purificadas de reticulação heterobifuncional residual e trocadas em 1x tampão de salina de ácido 2-(N- morfolino)etanossulfônico usando uma coluna NAP-5 (GE Healthcare Life Sciences). As variantes do gene ativadas (203) são ligadas (204) nas micropartículas preparadas (206) em 1x tampão de salina do ácido

2-(N-morfolino)etanossulfônico a 21 ⁰C por 1 hora em uma razão estequiométrica de 1:3 para 1:10 de maneira tal que no geral somente uma variante do gene (203) seja ligada (204) a qualquer dada microesfera (206) da maneira ditada pela distribuição de Poisson. Ver, (Bioconjugate Technics, 2nd Edition, Greg T. Hermanson, Published by Academic Press, Inc., 2008).

[0071]A biblioteca de polinucleotídeos (202) pode ser emulsificada (207) usando o seguinte procedimento: mistura óleo - agente tensoativo (214) (4% em volume/volume de copolímero polisiloxano-policeil- polietileno glicol (Abil EM90, Goldschmidt) dissolvida em óleo mineral claro) é preparada e 950 pL são transferidos para um frasco CryoTube (1,8 mL, bases redondas, pés de estrela; Nunc), resfriado no gelo, e uma barra de agitação magnética é adicionada. A mistura é agitada a 1,150 rpm em um agitador magnético. A mistura da reação IVTT é preparada (35 pL EcoPro T7 (Promega), 2 pL de metionina 5 mM, 1,66 fmo biblioteca de polinucleotídeos (202), água até 50 pL) são adicionados à mistura de óleo-agente tensoativo

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 37/48

25/26 (214) em alíquotas de 10-μ_ por um período de 2 minutos para gerar emulsão (210) contendo gotículas 10¹⁰-10¹² (212) (compartimentos). A emulsão é incubada a 23-30 ^oC por 1-4 para permitir transcrição e tradução (215) de variante do gene (203) na variante da enzima da proteína (216).

[0072]Uma vez traduzida, variante da enzima (216) começa a degradar a micropartícula da celulose (206). As variantes do gene (203) que codificam variantes enzimáticas (216) que exibem melhor atividade no sentido da micropartícula da celulose (206) degradam a micropartícula (217). Tais variantes do gene são probabilisticamente mais prováveis de serem liberadas (218) da micropartícula degradada (217) do que variantes do gene que codificam variantes enzimáticas que exibem menor atividade. Um período de incubação variável de 1-4 horas ajusta o rigor do ensaio. Na prática, inicia-se com um maior tempo de incubação e diminui progressivamente o tempo de incubação através de rodas de seleção subsequentes uma vez que a enzima seja refinada para um estado mais ativo. Após a incubação, a emulsão (210) é quebrada por centrifugação (219) a 13.000 g por 5 minutos a 25 ⁰C. As variantes do gene (220) que codificam enzimas com pouca ou nenhuma atividade no sentido da micropartícula (206) co-precipitam com as micropartículas (206) durante a centrifugação (219). Micropartícula degradadas (217) também precipitam durante a centrifugação (219). As variantes do gene (224) que codificam variantes enzimáticas que exibem melhor atividade permanecem suspensas em solução aquosa e são assim seletivamente enriquecidas por meio de seleção negativa de variantes do gene ligadas à micropartícula (206,202). As variantes do gene (224) podem ser recuperadas da solução aquosa usando PCR, por exemplo, o Estojo de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen), e submetidas a rodadas adicionais (226) de amplificação e seleção mutagênica para melhorar adicionalmente a atividade enzimática.

[0073]Processo 200 é distinto daquele apresentado na figura 1 (100) em que o produto do substrato (106), (118), e variante do gene (103) permanecem ligados

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 38/48

26/26 (104) e em que a seleção positiva é realizada por meio de captura de afinidade (122, 123) do produto (118).

[0074]Embora a invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência às modalidades específicas, será também entendido pelos versados na técnica que mudanças na forma e detalhes das modalidades reveladas podem ser feitos sem fugir do âmbito ou escopo da invenção. Por exemplo, as modalidades descritas anteriormente podem ser implementadas usando uma variedade de substratos insolúveis, ligantes, micropartículas, e sequências genéticas. Além disso, técnicas e mecanismos da presente invenção foram algumas vezes descritos em forma singular para clareza. Entretanto, deve-se notar que algumas modalidades podem incluir múltiplas iterações de uma técnica ou múltiplas aplicações de um mecanismo a menos que de outra forma notada. Portanto, o escopo da invenção deve ser determinado com referência às reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de seleção para atividade enzimática melhorada em um substrato insolúvel, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos que codifica variantes de uma ou mais enzimas que agem em um substrato insolúvel, em que a pluralidade de polinucleotídeos é ligada a uma pluralidade de fases sólidas e o ligante ou as fases sólidas compreendem um substrato para a uma ou mais enzimas;

(b) suspender as fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo em uma fase aquosa compreendendo componentes para transcrição/tradução in vitro;

(c) formar uma emulsão de água em óleo, em que as fases sólidas ligadas ao polinucleotídeo são compartimentalizadas em gotículas aquosas em uma fase contínua oleosa;

(d) realizar transcrição/tradução in vitro para expressar variantes enzimáticas nas gotículas aquosas da emulsão;

(e) permitir que as enzimas atuem sobre o ligante ou as fases sólidas que compreendem um substrato insolúvel, para que a uma ou mais enzimas liberem os polinucleotídeos que codificam as enzimas ativas de suas fases sólidas na fase aquosa; e (f) separar a fase aquosa das fases sólidas e oleosas para recuperar polinucleotídeos na fase aquosa que foram liberados das fases sólidas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a pluralidade de polinucleotídeos compreende pelo menos 106 polinucleotídeos diferentes.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que cada fase sólida ligada ao polinucleotídeo compreende 1-6 polinucleotídeos diferentes, cada um dos quais está presente em uma ou mais cópias.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 40/48

2/3 que os ditos não mais que 6 polinucleotídeos diferentes codificam 2 a 6 diferentes tipos de enzimas.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que as fases sólidas compreendem microesferas ou partículas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a emulsão de água em óleo é formada em condições em que pelo menos 20 % de gotículas aquosas compreendem 1 ou menos que 1 fase sólida ligada ao polinucleotídeo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que cada fase sólida ligada ao polinucleotídeo compreende 1 a 6 polinucleotídeos, cada um dos quais está presente em uma ou mais cópias, de modo que, 1 a 6 variantes enzimáticas, respectivamente, são expressas por gotícula aquosa contendo uma fase sólida ligada ao polinucleotídeo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a emulsão compreende pelo menos 10⁹ gotículas aquosas/mL de emulsão.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a fase aquosa é separada das fases sólida e oleosa por sedimentação usando uma centrífuga.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que polinucleotídeos recuperados são amplificados e ligados a uma pluralidade de fases sólidas, em que o ligante ou as fases sólidas compreendem um substrato para a uma ou mais enzimas, e as etapas (b)-(f) são repetidas.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que polinucleotídeos recuperados são mutagenizados e então ligados a uma pluralidade de fases sólidas, em que o ligante ou as fases sólidas compreendem um substrato para a uma ou mais enzimas, e as etapas (b)-(f) são repetidas.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato

Petição 870190072326, de 29/07/2019, pág. 41/48

3/3 de que o um ou mais dos polinucleotídeos recuperados são traduzidos in vitro para produzir uma ou mais variantes enzimáticas.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais dos polinucleotídeos recuperados são clonados em um vetor.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor compreende um vetor de expressão, e o método compreende adicionalmente:

(a) expressar um ou mais dos polinucleotídeos recuperados para produzir um ou mais variantes enzimáticas;

(b) recuperar a uma ou mais variantes enzimáticas da cultura; e (c) colocar a uma ou mais variantes enzimáticas em contato com um substrato insolúvel.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o substrato insolúvel compreende biomassa.