JP2001509380A - ｉｎｖｉｔｒｏ選別法 - Google Patents

ｉｎｖｉｔｒｏ選別法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1種以上の遺伝子エレメントを単離するための方法に関する。この方法には、（a）遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステップと、（b）マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝子産物を産生するステップと、（c）所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを選別するステップと、が含まれる。本発明は、突然変異誘発の繰り返しおよび本発明方法の反復適用を行うことにより、核酸のin vitro進化を可能にする。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、分子ライブラリーのin vitro進化に使用するための方法に関する。
特に、本発明は、遺伝子産物をコードする核酸を選択する方法であって、核酸と
コードされた遺伝子産物の活性とがコンパートメント化によってリンクされるこ
とを特徴とする方法に関する。
【０００２】 進化を行うには、遺伝子的多様性（核酸の多様性）を誘発し、それに続いて、
有益な特性を生じる核酸を選択することが必要である。生物の核酸とコードされ
た遺伝子産物の活性とは物理的にリンクされているので（核酸は、それがコード
する細胞内に閉じ込められている）、多数回の突然変異および選択により、適応
性が増大し、生物の発展的生存が可能となる。in vitroで核酸またはタンパク質
を迅速に進化させるための系は、核酸とコードされた遺伝子産物の活性とがリン
クされていなければならずかつ遺伝子産物の活性が選択可能でなければならない
という点で、このプロセスを分子レベルで模倣したものでなければならない。
【０００３】 分子生物学の最近の進歩のおかげで、いくつかの分子を、それらの性質に従っ
て、それらをコードする核酸と共に、同時に選択することができるようになった
。選択された核酸は、その後、更なる分析または使用に供するためにクローン化
するか、または突然変異および選択を更に繰り返すために利用することができる
。 これらの方法に共通する点は、核酸の大きなライブラリーを作製することであ
る。所望の特性（活性）を有する分子は、コードされた遺伝子産物の所望の活性
、具体的には、所望の生化学的または生物学的活性、例えば、結合活性などに対
して選択を行う選択レジメに従って単離することができる。
【０００４】 ファージディスプレイ技術は、核酸とコードされた遺伝子産物の活性との本質
的なリンクを提供することによって、ディスプレイされたタンパク質の選択を可
能にするビヒクルを提供するものとしてうまく利用されてきた（Smith, 1985; B
ass et al., 1990; McCafferty et al., 1990; レビューに関しては、Clackson
and Wells, 1994を参照されたい）。繊維状ファージ粒子は、外部にタンパク質 を有し内部にそれをコードする遺伝子エレメントを有する遺伝子ディスプレイパ
ッケージとして作用する。核酸とコードされた遺伝子産物との密接なリンケージ
は、細菌内でのファージのアセンブリーの結果である。個々の細菌に多重感染す
ることはまれであるため、ほとんどの場合、個々の細菌から産生されるファージ
は、同じ遺伝子エレメントを有し、同じタンパク質をディスプレイするであろう
。
【０００５】 しかしながら、ファージディスプレイは、細菌中におけるin vivoでの核酸ラ イブラリーの形成に依存する。それゆえに、ファージディスプレイ技術で許容さ
れるライブラリーサイズの実用上の限界は、切除可能な繊維状ファージレプリコ
ンを有するλファージベクターを利用するときでさえ、107〜1011のオーダーで ある。この技術は、主に、結合活性を有する分子の選択に適用されてきた。この
ほか、触媒活性を有する小数のタンパク質が、この技術を用いて単離されてきた
。しかしながら、いずれの場合においても、所望の触媒活性についての直接的な
選択は行われず、トランジション状態類似体への結合（Widersten and Mannervi
k, 1995）または自殺インヒビターとの反応（Soumillion et al., 1994; Janda
et al., 1997）についての選択が行われた。
【０００６】 lacリプレッサーLaclのC末端にリンクされたペプチドの大きなライブラリーを
用いてアフィニティー選択を行うことにより、受容体への結合について特異的な
ペプチドリガンドの選択が行われた（Cull et al., 1992）。E. coli中で発現さ
せる場合、このリプレッサータンパク質は、プラスミド上のlacオペレーター配 列に結合することによって、コードプラスミドにリガンドを物理的にリンクさせ
る。
【０００７】 完全にin vitroのポリソームディスプレイシステムについても報告されている
（Mattheakis et al., 1994）。このシステムでは、新生ポリペプチドが、それ をコードするRNAにリボソームを介して物理的に結合される。 しかしながら、上記のシステムの範囲は、タンパク質の選択に限定されており
、更に、結合以外の活性、例えば、触媒活性または調節活性について直接的な選
択を行うことはできない。
【０００８】 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)（Tue
rk and Gold, 1990）と呼ばれることもあるin vitro RNA選択および進化（Ellin
gton and Szostak, 1990）では、結合活性と化学的活性の両方について選択を行
うことが可能であるが、核酸だけが対象となる。結合について選択を行う場合、
固定化基質と共に核酸のプールをインキュベートする。非結合体を洗浄除去し、
次に、結合体を放出させて増幅する。この全プロセスを反復ステップとして繰り
返して、より良好な結合配列を濃厚化する。また、この方法を適応して触媒RNA およびDNAの単離を行うことができる（Green and Szostak, 1992; レビューにつ
いては、Chapman and Szostak, 1994; Joyce, 1994; Gold et al., 1995; Moore
, 1995を参照されたい）。
【０００９】 しかしながら、SELEXを用いた場合、「触媒」活性または結合活性についての 選択だけが可能である。なぜなら、同一の分子が、遺伝情報を担うとともに触媒
分子または結合分子でもあるという二重の役割を果たしているからである（アプ
タマー）。「自己触媒作用」についての選択を行う場合、同一の分子が、基質で
もあるという第3の役割を果たす必要もある。遺伝子エレメントが基質と触媒の 両方の役割を果たさなければならないため、単一ターンオーバーイベントに対す
る選択だけが可能である。このプロセスでは「触媒」自体が改変されるため、定
義上、真の触媒ではない。このほか、SELEX法を用いた場合、タンパク質の選択 が行えない可能性もある。従って、選択可能な触媒、基質、および反応の範囲は
、かなり制限される。
【００１０】 上記の方法のうちで、突然変異および選択を繰り返して行うことのできるもの
は、一般に進化のプロセスに帰せられるin vitro機構、すなわち、反復性変異、
所望の活性についての発展的選択、および複製を模倣したものである。しかしな
がら、これまでに開発された方法の中には、天然に見いだされるものに匹敵する
多様性および機能的効果を有する分子を提供するものはなかった。このほか、核
酸とタンパク質の両方を進化させて生化学的活性および生物学的活性の全領域（
例えば、結合活性、触媒活性および調節活性）に影響を及ぼすことができ、しか
もいくつかのプロセスを組合せて所望の産物または活性へと至らせることができ
る人工の「進化」系は存在しない。 従って、以上で述べた制限を克服するin vitro系が非常に必要とされている。
【００１１】 （発明の簡単な説明） 本発明の第1の態様によれば、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1種
以上の遺伝子エレメントを単離する方法が提供される。この方法には、 （a）遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステ ップと、 （b）マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝 子産物を産生するステップと、 （c）所望の活性を有する遺伝子産物を産生する遺伝子エレメントを選別する ステップと、 が含まれる。
【００１２】 本発明に係るマイクロカプセルは、遺伝子エレメントおよび遺伝子産物を、そ
れらが互いに物理的にリンクされるように、コンパートメント化する。驚くべき
ことに、人工のマイクロカプセル内においても依然として核酸を発現させること
が可能であるため、核酸がコードする遺伝子産物の活性に基づいて核酸を単離す
ることができる。
【００１３】 本明細書中で使用する場合、遺伝子エレメントとは、核酸を含む分子または分
子状構築物である。本発明の遺伝子エレメントには、どのような核酸が含まれて
いてもよい（例えば、DNA、RNA、またはそれらの任意の天然もしくは人工の類似
体）。更に、遺伝子エレメントの核酸成分は、1種以上の分子または構造体、例 えば、タンパク質、化学的な成分および基、磁気ビーズのような固相支持体など
に共有結合または非共有結合でリンクされていてもよい。本発明の方法を用いる
と、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの選別および
／または単離が行えるように、これらの構造体または分子をデザインすることが
できる。
【００１４】 本明細書中で使用する場合、発現とは、遺伝子エレメント中に含まれる核酸が
その遺伝子産物に変換されるこを示すために、最も広い意味で使用されるもので
ある。従って、核酸がDNAである場合、発現とは、DNAからRNAへの転写を意味し 、このRNAがタンパク質をコードする場合、発現とは、RNAからタンパク質への翻
訳を意味するものであってもよい。核酸がRNAである場合、発現とは、このRNAか
ら更なるRNAコピーへの複製、RNAからDNAへの逆転写、および場合により、このD
NAから更なるRNA分子への転写、ならびに場合により、産生した任意のRNA種から
タンパク質への翻訳を意味するものであってよい。従って、好ましくは、発現は
転写、逆転写、複製、および翻訳からなる群より選ばれる1種以上のプロセスに よって行われる。
【００１５】 この場合、遺伝子産物を遺伝子エレメントと同じマイクロカプセル内に閉じ込
めるように、本発明のマイクロカプセル内で、DNA、RNA、もしくはタンパク質、
または自然界に存在しない塩基もしくはアミノ酸を含有する核酸もしくはタンパ
ク質（遺伝子産物）を得るべく、遺伝子エレメントの発現を指令することが可能
である。 遺伝子エレメントおよびそれがコードする遺伝子産物は、各遺伝子エレメント
と、その遺伝子エレメントがコードするそれぞれの遺伝子産物とを、同じマイク
ロカプセル内に閉じ込めることによって、リンクされている。
【００１６】 本明細書中において、「マイクロカプセル」という用語は、当技術分野で慣用
される意味で使用される。これについては、以下で更に説明する。しかしながら
、本質的には、マイクロカプセルとは、人工のコンパートメントであって、その
境界では、本明細書に記載の分子機構に関与する成分の交換が制限される。この
ため、遺伝子エレメントの選別を、それがコードする遺伝子産物の機能に基づい
て行うことができる。 好ましくは、本発明の方法で使用されるマイクロカプセルは、膨大な数の製造
が可能であって、遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのラ
イブラリーをコンパートメント化することが可能であろう。
【００１７】 本発明の第1の態様の好ましい実施形態によれば、本質的に4つの技法のうちの
１つによって遺伝子エレメントの選別を行うことが可能である。 （I）第1の実施形態では、全体としてマイクロカプセルを検出可能にする遺伝
子産物またはその誘導体の活性に基づいてマイクロカプセルの選別が行われる。
従って、本発明は、本発明の第1の態様に基づく方法であって、所望の活性を有 する遺伝子産物がマイクロカプセル中である変化を誘発する、すなわちマイクロ
カプセル内の1種以上の分子の改変を誘発することにより、遺伝子産物およびそ れをコードする遺伝子エレメントを含有するマイクロカプセルの選別が可能にな
ることを特徴とする方法を提供する。それゆえに、この実施形態では、マイクロ
カプセルが、マイクロカプセル中に含まれる遺伝子エレメントから発現される遺
伝子産物の活性に基づいて互いに物理的に選別されるので、所望の活性の遺伝子
産物を含有するマイクロカプセルを選択的に濃縮することができる。
【００１８】 （II）第2の実施形態では、マイクロカプセルを1つ以上の共通のコンパートメ
ントにプール化した後で遺伝子エレメントの選別が行われる。この実施形態では
、所望の活性を有する遺伝子産物が、後続のステップでの選択が可能になるよう
に、それをコードする（かつ同一のマイクロカプセル中にある）遺伝子エレメン
トを改変する。反応を停止させた後、個々のマイクロカプセルの全内容物がプー
ル化されるようにマイクロカプセルを破壊する。改変された遺伝子エレメントに
ついての選択を行うことにより、所望の活性を有する遺伝子産物（1種または複 数種）をコードする遺伝子エレメントを濃縮することができる。従って、本発明
は、本発明の第1の態様に基づく方法であって、ステップ(b)で、遺伝子エレメン
トの単離が可能になるように、所望の活性を有する遺伝子産物が、該遺伝子産物
をコードする遺伝子エレメントを改変することを特徴とする方法を提供する。も
ちろん、この改変は、遺伝子エレメントに対する遺伝子産物の直接的な作用によ
って生じるという点で直接的であってもよいし、または所望の活性を有する遺伝
子産物が関与する1以上の反応が含まれる一連の反応により遺伝子エレメントの 改変が行われるという点で間接的であってもよいことを理解すべきである。
【００１９】 （III）第3の実施形態では、マイクロカプセルを1つ以上の共通のコンパート メントにプール化した後で遺伝子エレメントの選別が行われる。この実施形態で
は、所望の活性を有する遺伝子が、遺伝子産物とそれをコードする遺伝子エレメ
ントとを含有するマイクロカプセル中である変化を誘発する。この変化は、検出
時に、コンパートメント内の遺伝子の改変を引き起こす。反応を停止させた後、
個々のマイクロカプセルの全内容物がプール化されるようにマイクロカプセルを
破壊する。改変された遺伝子エレメントについての選択を行うことにより、所望
の活性を有する遺伝子産物（1種または複数種）をコードする遺伝子エレメント を濃縮することができる。従って、本発明は、本発明の第1の態様に基づく方法 であって、ステップ(b)で、所望の活性を有する遺伝子産物が、コンパートメン ト中である変化を誘発し、その変化は検出時に、遺伝子エレメントの単離が可能
になるようにコンパートメント内の遺伝子エレメントの改変を引き起こすことを
特徴とする方法を提供する。コンパートメント中の検出される変化は、遺伝子産
物の直接的な作用、または間接的な作用（この場合には、所望の活性を有する遺
伝子産物が関与する1以上の反応が含まれる一連の反応により、検出対象の変化 が誘発される）によって誘発されるものであってよいことを理解すべきである。
【００２０】 （IV）第4の実施形態では、例えば、少なくとも2つの別個の反応を引き起こす
ことの可能な条件に遺伝子エレメントを暴露することができるように少なくとも
2つのステップを含む多段階法によって、遺伝子エレメントの選別を行うことが 可能である。当業者には自明であろうが、本発明の第1のマイクロカプセル化ス テップは、遺伝子エレメントの発現（それは転写、転写および／または翻訳、複
製などである）を可能にする条件を生じるものでなければならない。こうした条
件下では、特定の遺伝子産物活性について選択を行うことができないこともある
。その理由としては、例えば、遺伝子産物がこうした条件下で活性でない可能性
があること、および発現系に阻害活性が含まれることが挙げられる。従って、本
発明は、本発明の第1の態様に基づく方法であって、ステップ(b)で、遺伝子エレ
メントを発現させてマイクロカプセル内でそれぞれの遺伝子産物を産生させるこ
とにより、遺伝子産物とそれをコードする遺伝子エレメントとをリンクし、それ
により形成された複合体を単離することを特徴とする方法を提供する。この方法
を用いると、遺伝子エレメントおよびそれに関連した遺伝子産物をカプセルから
単離した後、遺伝子産物の活性に基づいて選別を行うことができる。好ましい実
施形態では、複合体を更にコンパートメント化ステップに通してから、所望の活
性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの単離を行う。この更なる
コンパートメント化ステップ（有利には、マイクロカプセル中で行われる）に通
すことによって、遺伝子エレメントとそれぞれの遺伝子産物とが物理的にリンク
される環境において異なる条件下で更なる反応を行うことが可能になる。遺伝子
エレメントの実際の選別は、上記の実施形態（I）、（II）、または（III）に従
って行うことができる。
【００２１】 また、他の手段により、例えば、ファージディスプレイ、ポリソームディスプ
レイ、RNA‐ペプチド融合またはlacリプレッサーペプチド融合により、遺伝子エ
レメントを遺伝子産物にリンクさせ、「第2のカプセル化」を行ってもよい。
【００２２】 また、本発明の方法の全部または所定のステップだけを再び適用することによ
り、選択された遺伝子エレメント（1種または複数種）を、反復ステップとして 繰り返される後続の恐らくよりストリンジェントな選別ラウンドに供してもよい
。条件を適切に合わせることにより、各ラウンドの選択後に、より良好に最適化
された活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離することが
できる。
【００２３】 更に、第1ラウンドの選別の後で単離された遺伝子エレメントに突然変異を起 こした後、上述の本発明の方法のステップを反復利用することにより、選別を繰
り返してもよい。各ラウンドの突然変異誘発の後、遺伝子エレメントの中には、
遺伝子産物の活性が増大するように改変を受けたものが存在するであろう。 このほか、選択された遺伝子エレメントを発現ベクター中にクローン化するこ
とにより、遺伝子エレメントおよびその産物の更なる特性付けを行うことができ
る。
【００２４】 第2の態様において、本発明は、本発明の第1の態様に従って選択を行った場合
に得られる産物を提供する。これに関連して使用される「産物」とは、本発明に
従って選択可能な遺伝子産物、または遺伝子エレメント（もしくはそれに含まれ
る遺伝情報）を意味するものであってよい。
【００２５】 第3の態様において、本発明は、遺伝子産物を調製するための方法であって、 （a）遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、 （b）遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステ ップと、 （c）マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝 子産物を産生するステップと、 （d）所望の活性を有する遺伝子産物（1種または複数種）を産生する遺伝子エ
レメントの選別を行うステップと、 （e）所望の活性を有する遺伝子産物を発現させるステップと、 を含む方法を提供する。
【００２６】 第3の態様によれば、ステップ(a)で、好ましくは、それぞれが潜在的に異なる
遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーの調製を行う。レパー
トリーは、ファージディスプレイのような方法で選択を行うことを目的としたラ
イブラリーの作製に利用される技術などの従来技術により生成させることが可能
である。所望の活性を有する遺伝子産物は、このレパートリーから本発明に従っ
て選択することが可能である。
【００２７】 第4の態様において、本発明は、遺伝子産物の活性を調節することのできる1種
または複数種の化合物をスクリーニングするための方法であって、 （a）遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製するス テップと、 （b）遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステ ップと、 （c）マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝 子産物を産生するステップと、 （d）所望の活性を有する遺伝子産物（1種または複数種）を産生する遺伝子エ
レメントの選別を行うステップと、 （e）所望の活性を有する遺伝子産物を1種または複数種の化合物と接触させ、
該化合物による遺伝子産物の活性の調節をモニターするステップと、 を含む方法を提供する。
【００２８】 有利には、この方法には更に、 （f）遺伝子産物の活性を調節できる1種または複数種の化合物を同定し、該1 種または複数種の化合物を合成するステップ、 が含まれる。 この選択系は、触媒活性、調節活性、または結合活性を有するRNA、DNA、また
はタンパク質分子についての選択を行うように構成することができる。
【００２９】 （発明の詳細な説明） （A）一般的な説明 本発明のマイクロカプセルは、本発明が実施可能となるように、適切な物理的
性質をもつ必要がある。 第1に、遺伝子エレメントおよび遺伝子産物がマイクロカプセル間を拡散でき ないことを保証するために、各マイクロカプセルの内容物を周囲のマイクロカプ
セルの内容物から孤立させ、結果として、実験の時間スケールにわたり遺伝子エ
レメントおよび遺伝子産物がマイクロカプセル間でまったくまたはほとんど交換
されないようにしなければならない。
【００３０】 第2に、本発明の方法では、マイクロカプセル1個あたり、ごく限られた数の遺
伝子エレメントが存在するようにしなければならない。これにより、個々の遺伝
子エレメントが他の遺伝子エレメントから孤立することが保証される。従って、
遺伝子エレメントと遺伝子産物との結びつきは、非常に特異的なものになるであ
ろう。マイクロカプセル1個あたりの遺伝子エレメントの数を平均で1個以下にし
、核酸とコードされた遺伝子産物の活性とのリンケージをできる限り密にすると
、濃縮因子が最大になる。なぜなら、個々の遺伝子エレメントの遺伝子産物が、
すべての他の遺伝子エレメントの産物から孤立すると考えられるからである。し
かしながら、マイクロカプセル1個あたり遺伝子エレメントの数を平均で1個以下
にするという理論上の最適条件を用いない場合でさえも、具体的には、マイクロ
カプセル1個あたり5、10、50、100、もしくは1000個、またはそれ以上の遺伝子 エレメントの割合であっても、大きなライブラリーの選別に有益なこともある。
異なる遺伝子エレメント分布を用いて更新されるカプセル化を含む後続ラウンド
の選別により、遺伝子エレメントのよりストリンジェントな選別が可能になるで
あろう。好ましくは、マイクロカプセル1個あたりの遺伝子エレメントの数は1個
以下である。
【００３１】 第3に、マイクロカプセルの形成および組成は、系の機能、すなわち、遺伝子 エレメントの発現および遺伝子産物の活性を阻害するものであってはならない。
従って、使用するマイクロカプセル系はいずれも、これらの3つの要件を満足 するものでなければならない。当業者には自明であろうが、適切な系（1つまた は複数）は、本発明の各用途ごとに、その要件の詳細事項に依存して変化する可
能性がある。
【００３２】 多種多様なマイクロカプセル化手順が利用可能であり（Benita, 1996を参照さ
れたい）、これらを用いて、本発明に従って使用されるマイクロカプセルを作製
することが可能である。実際には、200を超えるマイクロカプセル化法が文献中 に記載されている（Finch, 1993）。
【００３３】 これらの具体例としては、脂質ベシクル（リポソーム）（New, 1990）および 非イオン界面活性剤ベシクル（van Hal et al., 1996）のように膜で覆われた水
性ベシクルが挙げられる。これらは、非共有結合でアセンブリーされた分子の単
一または複数の二重層の閉じた膜のカプセルであり、各二重層は、水性コンパー
トメントによりその隣接二重層と分離している。リポソームの場合、膜は脂質分
子から構成されており、これらの分子は、通常、リン脂質であるが、コレステロ
ールのようなステロールを膜中に導入することも可能である（New, 1990）。RNA
およびDNA重合などの様々な酵素触媒生化学反応をリポソーム内で行うことがで きる（Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et
al., 1995b; Walde et al., 1994; Wich & Luisi, 1996）。
【００３４】 膜で覆われたベシクル系の場合、水性相の多くはベシクルの外側にあるため、
コンパートメント化されていない。反応をマイクロカプセルに制限するためには
、この連続水性相を取り去るかまたはその中の生物学的系を阻害もしくは破壊し
なければならない（例えば、DNaseまたはRNaseを用いて核酸を消化させることに
より）（Luisi et al., 1987）。
【００３５】 酵素触媒生化学反応はまた、様々な他の方法により発生させたマイクロカプセ
ル中でも行われた。多くの酵素は、AOT‐イソオクタン‐水の系（Menger & Yama
da, 1979）のような逆ミセル溶液中で活性である（Bru & Walde, 1991; Bru & W
alde, 1993; Creagh et al., 1993; Harber et al., 1993; Kumar et al., 1989
; Luisi & B., 1987; Mao & Walde, 1991; Mao et al., 1992; Perez et al.,
1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988）。 マイクロカプセルは、界面重合および界面複合体形成により発生させることも
できる（Whateley, 1996）。この種のマイクロカプセルは、硬質で非透過性の膜
または半透過性の膜であることができる。セルロースニトレート膜、ポリアミド
膜、及び脂質‐ポリアミド膜を境界とする半透過性のマイクロカプセルはいずれ
も、多酵素系を含む生化学反応を支持することができる（Chang, 1987; Chang,
1992; Lim, 1984）。また、非常にマイルドな条件下で形成することができるア リギネート／ポリリシンマイクロカプセル（Lim & Sun, 1980）は、非常に生体 適合性が高いことが判明しており、例えば、生きた細胞および組織をカプセル化
する有効な方法を提供する（Chang, 1992; Sun et al., 1992）。 エマルションのようにコロイド系中の水性領域の相分割に基づく非膜性マイク
ロカプセル系を使用してもよい。
【００３６】 好ましくは、本発明のマイクロカプセルは、エマルション、すなわち、顕微鏡
的サイズまたはコロイドサイズの液滴として一方の相を他方の相中に分散させて
なる2つの不混和性液相の不均一系、から形成する（Becher, 1957; Sherman, 19
68; Lissant, 1974; Lissant, 1984）。
【００３７】 エマルションは、不混和性液体の任意の好適な組合せから作製することが可能
である。好ましくは、本発明のエマルションには、細かく分割された液滴の形態
で存在する相（分散相、内相、または不連続相）としての水（生化学成分を含む
）と、これらの液滴を懸濁させるマトリックス（非分散相、連続相、または外相
）としての疎水性の不混和性液体（油）とが含まれる。このようなエマルション
は、「油中水型」（W/O型）と呼ばれる。これには、生化学成分を含有する水性 相全体が、離散した液滴中（内相）にコンパートメント化されるという利点があ
る。疎水性の油である外相には、一般に、生化学成分は含まれず、従って、不活
性である。
【００３８】 1種以上の界面活性剤を添加することにより、エマルションを安定化させても よい。こうした界面活性剤は、乳化剤と呼ばれ、水／油の界面に作用して相の分
離を防止する（または、少なくとも遅らせる）。多くの油および多くの界面活性
剤が、油中水型エマルションの発生に使用できる。最近まとめられたリストには
、16,000種を超える界面活性剤が記載されており、そのうちの多くが乳化剤とし
て使用される（Ash and Ash, 1993）。好適な油としては、軽質ホワイト鉱油、 ならびにソルビタンモノオレエート（SpanTM 80; ICI）およびポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレエート（TweenTM 80; ICI）のような非イオン界面活性剤 （Schick, 1966）が挙げられる。
【００３９】 また、アニオン界面活性剤の使用が有益なこともある。好適な界面活性剤とし
ては、コール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムが挙げられる。特に
好ましいのは、デオキシコール酸ナトリウムであり、好ましくは、0.5 % w/v以 下の濃度で使用される。このような界面活性剤を導入することにより、遺伝子エ
レメントの発現および／または遺伝子産物の活性を向上させることができる場合
もある。乳化されていない反応混合物に数種のアニオン界面活性剤を添加すると
、翻訳が完全に阻害される。しかしながら、乳化中に、界面活性剤は水相から界
面に移行し、活性は回復する。乳化される混合物にアニオン界面活性剤を添加す
ることにより、コンパートメント化の後でのみ反応が進行するようにできる。
【００４０】 エマルションを形成するためには、一般に、機械的エネルギーを相に加えて一
体化しなければならない。これを行う方法はいろいろ存在し、種々の機械的装置
が利用される。具体的には、スターラー（磁気攪拌棒、プロペラおよびタービン
スターラー、パドル装置、泡立て器など）、ホモジナイザー（回転子‐固定子ホ
モジナイザー、高圧バルブホモジナイザー、ジェットホモジナイザーなど）、コ
ロイドミル、超音波装置、および「膜乳化」装置が挙げられる（Becher, 1957;
Dickinson, 1994）。
【００４１】 油中水型エマルション中に形成される水性マイクロカプセルは、一般に、安定
であり、マイクロカプセル間での遺伝子エレメントまたは遺伝子産物の交換は、
たとえあったとしてもごくわすかである。更に、本発明者らは、エマルションマ
イクロカプセル中でいくつかの生化学反応が進行することを実証した。このほか
、複雑な生化学プロセス、特に、遺伝子転写および翻訳もまた、エマルションマ
イクロカプセル中で有効に機能する。数千リットルの工業規模までの全範囲にわ
たり様々な体積でエマルションを形成する技術が存在する（Becher, 1957; Sher
man, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984）。
【００４２】 好ましいマイクロカプセルサイズは、本発明に従って実施される任意の個々の
選択プロセスの詳細な要件に依存して変化するであろう。いずれの場合にも、遺
伝子産物の効率的な発現および反応性を達成するために、遺伝子ライブラリーサ
イズと、必要な濃縮度と、個々のマイクロカプセル中の成分の必要濃度との間に
、最適バランスが存在するであろう。
【００４３】 発現のプロセスは、本発明により提供される個々のマイクロカプセル内で行わ
れなければならない。in vitroでの転写および共役した転写‐翻訳はいずれも、
サブナノモルのDNA濃度では効率が低くなる。各マイクロカプセル中にごく限ら れた数のDNA分子を存在させる必要があるため、これによって、利用可能なマイ クロカプセルサイズの実用上の上限が決まる。好ましくは、マイクロカプセルの
平均体積は、5.2×10-16 m3未満（直径10 μm未満の球状マイクロカプセルに相 当する）、より好ましくは6.5×10-17 m3未満（5 μm）、更に好ましくは約4.2 ×10-18 m3未満（2 μm）、理想的には約9×10-18 m3未満（2.6 μm）である。
【００４４】 マイクロカプセル中の有効なDNAまたはRNA濃度は、当業者に周知の種々の方法
により人為的に増大させることが可能である。こうした方法としては、例えば、
ポリエチレングリコール(PEG)のような体積排除薬剤を添加する方法、および様 々な遺伝子増幅法、具体的には、E. coliなどの細菌（Roberts, 1969; Blattner
and Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975）、真 核生物など（Weil et al., 1979; Manley et al., 1983）、およびT7、T3、SP6 などのバクテリオファージ（Melton el al., 1984）から得られるようなRNAポリ
メラーゼを用いた転写；ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)（Saiki et al., 1988）；Q
βレプリカーゼ増幅（Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin a
nd Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995）；リガーゼ連鎖反応(LCR)（Landegr
en et al., 1988; Barany, 1991）；ならびに自己持続性配列複製系（Fahy et a
l., 1991）および鎖置換増幅（Walker et al., 1992）が挙げられる。エマルシ ョンおよびin vitro転写または共役した転写‐翻訳系が熱安定性を有する場合に
は、PCRおよびLCRのような熱サイクルを必要とする遺伝子増幅法でさえも使用可
能である（例えば、共役した転写‐翻訳系は、Thermus aquaticusのような熱安 定生物から作製可能である）。
【００４５】 有効局所核酸濃度を増大させることにより、より大きなマイクロカプセルを効
果的に使用することができる。この場合、マイクロカプセル体積の好ましい実用
上の上限は、約5.2×10-16 m3（直径10 μmの球に相当する）である。 マイクロカプセルサイズは、マイクロカプセル内で行う必要のある生化学反応
の必要成分をすべて収容するのに十分な程度の大きさでなければならない。例え
ば、in vitroでの転写反応および共役した転写‐翻訳反応では、いずれも、約2
mMの全ヌクレオシドトリホスフェート濃度が必要である。
【００４６】 例えば、遺伝子を長さ500塩基の単一短鎖RNA分子に転写するためには、マイク
ロカプセル1個あたり少なくとも500個のヌクレオシドトリホスフェート分子が必
要であろう（8.3×10-22 モル）。2 mM溶液を作製するためには、この数の分子 が、体積4.17×10-19リットル（4.17×10-22 m3、これが球であれば直径は93 nm
である）のマイクロカプセル内に包含されなければならない。
【００４７】 このほか、特に、転写を含む反応の場合には、転写を行うのに必要なリボソー
ム自体の直径が約20 nmであることに注目する必要がある。従って、マイクロカ プセルの好ましい下限は、直径で約0.1 μm（100 nm）である。 従って、マイクロカプセルの体積は、好ましくは、5.2×10-22 m3〜5.2×10-1 6 m3（球の直径0.1 μm〜10 μmに相当する）、より好ましくは5.2×10-19 m3〜
6.5×10-17 m3（1 μm〜5 μm）である。約2.6 μmの球の直径が最も有利である
。
【００４８】 コンパートメントの好ましい寸法（平均直径2.6 μmの液滴）が、細菌の寸法 （例えば、Escherichiaは1.1〜1.5×2.0〜6.0 μmの桿菌であり、Azotobacterは
、直径1.5〜2.0 μmの卵形細胞である）とかなり類似しているのは偶然の一致で
はない。その最も簡単な形式において、ダーウィン的進化は、「1遺伝子型1表現
型」機構に基づいている。単一コンパートメント化遺伝子すなわちゲノムの濃度
は、直径2 μmのコンパートメント中の0.4 nMから直径5 μmのコンパートメント
中の25 pMまで低下する。原核生物の転写／翻訳系は、直径約1〜2 μmのコンパ ートメント中で機能するまでに進化した。この場合、単一遺伝子の濃度は、ナノ
モル程度である。直径2.6 μmのコンパートメントの場合、単一遺伝子の濃度は0
.2 nMである。この遺伝子濃度は、効率的な転写を行うのに十分な程度に高い。 このような体積中にコンパートメント化すると、遺伝子産物の単一分子だけが形
成される場合でさえも、約0.2 nMの量で存在することが保証される。この濃度は
、遺伝子産物が遺伝子エレメント自体を改変する活性をもたなければならない場
合に重要となる。従って、マイクロカプセルの体積は、遺伝子エレメントの転写
および翻訳に対する要件だけでなく、本発明の方法において遺伝子産物に要求さ
れる改変活性についても考慮して選択しなければならない。
【００４９】 エマルションマイクロカプセルのサイズは、選択系の要件に応じてエマルショ
ンを形成すべく、使用する乳化条件を調節することにより、簡単に変化させるこ
とが可能である。最終的な限定因子はマイクロカプセルのサイズであるため、従
って、単位体積あたりに存在可能なマイクロカプセルの数であるため、マイクロ
カプセルのサイズを大きくすればする程、所定の遺伝子エレメントライブラリー
をカプセル化するのに必要な体積も増大する。
【００５０】 マイクロカプセルのサイズは、転写／翻訳系の要件だけでなく、遺伝子エレメ
ントに対して使用される選択系の要件をも考慮して選択される。この場合、化学
的改変系のような選択系の成分は、転写／翻訳には最適ではない反応体積および
／または試薬濃度を必要とすることがある。本明細書中に記載されているように
、このような要件は、二次的な再カプセル化ステップによって満たすことが可能
であり、更に、転写／翻訳および選択を全体として最大化すべく、マイクロカプ
セルのサイズを選択することによって満たすことも可能である。例えば、本明細
書中に記載されているように、最適なマイクロカプセルの体積および試薬の濃度
を経験的に決定することが好ましい。
【００５１】 本発明に係る「遺伝子エレメント」は、先に記載したとおりである。好ましく
は、遺伝子エレメントは、DNA分子、RNA分子、合成塩基だけからなるかまたは天
然の塩基と合成の塩基との混合物からなる一部分または全部が人工の核酸分子、
以上の物質がポリペプチドにリンクされたもの、ならびに以上の物質が任意の他
の分子基または構築物にリンクされたものからなる群より選ばれる分子または構
築物である。有利には、他の分子基または構築物は、核酸、高分子物質、特にビ
ーズ、例えば、ポリスチレンビーズ、磁気物質（例えば、磁性ビーズ）、標識（
例えば、蛍光体または同位体標識）、化学試薬、結合剤（例えば、大環状物質）
などからなる群より選ばれる。
【００５２】 遺伝子エレメントの核酸部分には、好適な調節配列、例えば、遺伝子産物を効
率的に発現するのに必要な配列、具体的には、プロモーター、エンハンサー、翻
訳開始配列、ポリアデニル化配列、スプライス部位などが含まれていてもよい。
【００５３】 以下の記載内容から明らかになるであろうが、多くの場合、ポリペプチドまた
は他の分子基もしくは構築物は、遺伝子エレメントをタグ付けすべく、遺伝子産
物に対して直接的または間接的な結合または反応を行うリガンドまたは基質であ
る。これにより、遺伝子産物の活性に基づいて遺伝子エレメントの選別を行うこ
とができる。
【００５４】 リガンドまたは基質は、当業者に自明な種々の手段によって核酸に結合させる
ことができる（例えば、Hermanson, 1996を参照されたい）。後に遺伝子エレメ ントの選択を可能にするタグであればいずれを用いてもよいであろう。選別は、
タグ付けされた遺伝子エレメントの優先的な選択、増幅、または残存を可能にす
る任意の方法で行うことができる。具体例としては、結合による選択（磁気分離
に基づく方法、例えば、DynabeadsTMを用いる方法を含む）および分解に対する 耐性による選択（例えば、制限エンドヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを用いる
方法）が挙げられる。
【００５５】 核酸分子をリガンドまたは基質にリンクさせうる方法の1つは、ビオチニル化 を利用する方法である。これは、5'‐ビオチニル化プライマーを用いてPCR増幅 することにより行うことができる。この場合、ビオチンと核酸とが共有結合でリ
ンクされる。
【００５６】 選択されるリガンドまたは基質は、当業者に自明な種々の手段によって、改変
された核酸に結合させることができる。ビオチニル化された核酸を、非常に強い
親和力で核酸に結合すると考えられるアビジンまたはストレプトアビジンで被覆
されたポリスチレンマイクロビーズ（直径0.035〜0.2 μm）に結合させてもよ い。このビーズは、ビオチニル化基質を添加するかまたは共有結合させるなどの
任意の好適な方法により基質またはリガンドで誘導体化できる。
【００５７】 このほか、チログロブリン（669 Kd）またはフェリチン（440 Kd）のような大
きなタンパク質分子に複合体化されたアビジンまたはストレプトアビジンに、ビ
オチニル化された核酸を結合させてもよい。この複合体は、例えば、リシンのε
‐アミノ基に共有結合させることにより、またはビオチン‐アビジンのような非
共有結合相互作用により、基質またはリガンドで誘導体化できる。基質は、遺伝
子エレメントにリンクされてないが光活性化のような活性化を行うために更なる
ステップが必要な不活性な「タグ」（例えば、「ケージ化」ビオチン類似体のタ
グ（Sundberg et al., 1995; Pirrung and Huang, 1996））を含有した状態で存
在してもよい。次に、選択される触媒が基質を産物に変換する。次に、「タグ」
を活性化し、「タグ付けされた」基質および／または産物を、核酸で複合体化さ
れたタグ結合分子（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）と結合させる
ことが可能である。従って、「タグ」を介して核酸に結合される産物に対する基
質の比には、溶液中の基質と産物との比が反映されるであろう。
【００５８】 このほかの方法として、核酸を産物特異的抗体（または、他の産物特異的分子
）に結合させる方法がある。このシナリオでは、基質（または基質のうちの1つ ）は、遺伝子エレメントにリンクされていない状態で各マイクロカプセル中に存
在するが、分子「タグ」（例えば、ビオチン、DIG、またはDNP）を有している。
選択される触媒が基質を産物に変換する場合、産物はタグを保持し、その状態で
産物特異的抗体によりマイクロカプセル中で捕獲される。このようにすると、遺
伝子エレメントが、基質を産物に変換することのできる酵素をコードまたは産生
する場合、その遺伝子エレメントだけが「タグ」と関連づけられることになる。
【００５９】 すべての反応を停止させ、マイクロカプセルを合体させたときに、「タグ」に
対して特異的な結合または反応を行う抗体または他の分子を用いることにより、
活性酵素をコードする遺伝子エレメントを濃縮することができる。基質と産物の
両方が分子タグをもっているにもかかわらず、活性遺伝子産物をコードする遺伝
子エレメントだけが同時精製されるであろう。
【００６０】 本明細書中では、「単離」、「選別」、および「選択」という用語、ならびに
それらの変化形を使用する。本発明に関して、単離とは、例えば、混合物などの
不均一集合体から、所定の部分を分離するプロセスを意味する。この場合、この
部分には、単離プロセスの前までは会合していた少なくとも1種の物質が除かれ ているものとする。好ましい実施形態では、単離とは、所定の部分を本質的に均
質なレベルまで精製することを意味する。所定の部分の選別とは、所望の部分を
望ましからぬ部分から優先的に単離するプロセスを意味する。所望の部分の単離
に関連する場合には、「単離」および「選別」という用語は、等価である。本発
明の方法を用いると、所望の遺伝子エレメントを含む遺伝子エレメントのプール
（ライブラリーまたはレパートリー）から、所望の遺伝子エレメントを選別する
ことができる。選択は、特定の性質に対応する部分を単離するプロセス（選別プ
ロセスを含む）を指す場合に使用する。
【００６１】 非常に好ましい用途において、本発明の方法は、遺伝子エレメントのライブラ
リーの選別に有用である。それに応じて、本発明は、本発明の上記の態様に基づ
く方法であって、遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのラ
イブラリーから遺伝子エレメントを単離する方法を提供する。本明細書中では、
当技術分野で慣用される意味に従って、「ライブラリー」、「レパートリー」、
および「プール」という用語を使用する。例えば、遺伝子エレメントのライブラ
リーは、遺伝子産物のレパートリーをコードする。一般に、ライブラリーは、遺
伝子エレメントのプールから作製され、選別を容易にする性質を備えている。
【００６２】 本発明を用いて遺伝子エレメントライブラリーから遺伝子エレメントを最初に
選択するには、多くの場合、多数の変異遺伝子エレメントをスクリーニングする
必要がある。遺伝子エレメントのライブラリーは、以下に示すような多種多様な
方法で作製することができる。
【００６３】 天然に存在する遺伝子エレメントのプールは、ゲノムDNAまたはcDNAからクロ ーン化することができる（Sambrook et al., 1989）。例えば、免疫化または非 免疫化ドナー由来の抗体遺伝子のレパートリーをPCR増幅することにより得られ るファージ抗体ライブラリーは、機能性抗体断片の非常に有効な供給源であるこ
とが判明している（Winter et al., 1994; Hoogenboom, 1997）。遺伝子のライ ブラリーはまた、ランダム化またはドープされた（doped）合成オリゴヌクレオ チドにより、遺伝子のすべて（例えば、Smith, 1985; Parmley and Smith, 1988
を参照されたい）もしくは一部分（例えば、Lowman et al., 1991を参照された い）または遺伝子のプール（例えば、Nissim et al., 1994を参照されたい）を コードすることによって、作製することもできる。また、E. coli mutD5のよう な細菌の「突然変異誘発株」を用いる方法（Liao et al., 1986; Yamagishi et
al., 1990; Low et al., 1996）；B-リンパ球の抗体高突然変異系を用いる方法 （Yelamos et al., 1995）など、種々の方法を用いて、in vivoで遺伝子エレメ ントまたは遺伝子エレメントのプールに「ランダム」に突然変異を導入すること
によって、ライブラリーを作製することもできる。ランダム突然変異はまた、化
学突然変異原および電離線もしくはUV照射を用いる方法（Friedberg et al., 19
95を参照されたい）または突然変異誘発性塩基類似体を組み込む方法（Freese,
1959; Zaccolo et al., 1996）により、in vivoおよびin vitroの両方でランダ ム突然変異を導入することもできる。このほか、例えば、誤りを生じ易いポリメ
ラーゼを用いて重合する際に、「ランダム」突然変異を遺伝子に導入することも
できる（Leung et al., 1989）。
【００６４】 in vivo（Kowalczykowski et al., 1994を参照されたい）またはin vitro（St
emmer, 1994a; Stemmer, 1994bを参照されたい）のいずれかで相同的組換えを行
うことによって、更なる多様性を導入することができる。
【００６５】 従って、本発明の更なる態様によれば、in vitro進化を行う方法であって、 （a）本発明に従って遺伝子エレメントライブラリーから1種以上の遺伝子エレ
メントを選択するステップと、 （b）選択された遺伝子エレメント（1種または複数種）を突然変異させて、遺
伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントの更なるライブラリーを
作製するステップと、 （c）ステップ（a）および（b）を繰り返して、活性の増大した遺伝子産物を 得るステップと、 を含む方法が提供される。
【００６６】 先に述べたように、突然変異を遺伝子エレメントに導入してもよい。 本発明に係る遺伝子エレメントは、有利には、酵素、好ましくは薬理学的もし
くは工業的に興味深い酵素、アクチベーターもしくはインヒビター、特に、細胞
シグナル伝達系のような生体系のもの、抗体およびその断片、診断用および治療
用に好適な他の結合剤をコードする。従って、好ましい態様において、本発明を
用いると、臨床的または工業的に有用な産物の同定および単離を行うことができ
る。本発明の更なる態様において、本発明の方法により単離を行って得られる産
物が提供される。
【００６７】 好適なカプセル化条件を選択することが望ましい。スクリーニングするライブ
ラリーの複雑さおよびサイズにもよるが、マイクロカプセル1個あたり1個または
1個未満の遺伝子エレメントをカプセル化するように、カプセル化手順を設定す ることが有益であると考えられる。これにより、最大の分離能が得られるであろ
う。しかしながら、ライブラリーがより大きいおよび／またはより複雑である場
合、これが実施不可能なこともある。この場合には、数個の遺伝子エレメントを
一緒にカプセル化し、本発明の方法を繰り返し適用することによって、所望の活
性の選別を達成することが好ましいこともある。カプセル化手順を組合せて使用
することにより、所望の濃縮が得られることもある。
【００６８】 理論的研究から、作製される遺伝子エレメント変異体の数が多くなるほど、所
望の性質を有する分子が形成される可能性は高くなることが示唆される（このこ
とが抗体のレパートリーにいかに適用されるかに関する解説については、Perels
on and Oster, 1979を参照されたい）。または、最近、より大きいファージ‐抗
体レパートリーを用いる方が、より小さいレパートリーを用いるよりも、確かに
、より良好な結合親和性を有する抗体がより多く得られることが実際に確認され
た（Griffiths et al., 1994）。微量の変異体を発生させ、これを選択できるよ
うにするためには、大きなライブラリーサイズであることが望ましい。この場合
、最適化された小さなマイクロカプセルを使用することが有益である。
【００６９】 in vivoステップを必要とする方法を用いてこれまでに作製された最大のレパ ートリーは（ファージディスプレイおよびLacI系）、15リットルの細菌の発酵を
必要とする1.6×1011クローンファージ‐ペプチドライブラリーであった（Fisch
et al., 1996）。SELEX実験は、非常に多数の変異体に対してしばしば行われる
（1015まで）。
【００７０】 2. 6 μmの好ましいマイクロカプセル直径で本発明を実施すると、20 mlエマ ルション中で1 ml水性相を用いて、少なくとも1011のレパートリーサイズを選択
することができる。
【００７１】 上記の遺伝子エレメントのほかに、本発明に係るマイクロカプセルには、選別
プロセスを行うのに必要な更なる成分が含まれるであろう。この系の他の成分と
しては、例えば、遺伝子エレメントの転写および／または翻訳を行うのに必要な
成分が挙げられるであろう。これらは、特定の系の要件に合わせて、次の物質：
すなわち、好適な緩衝剤、すべての必要な成分を含有するin vitro転写／複製系
および／またはin vitro翻訳系、酵素および補因子、RNAポリメラーゼ、ヌクレ オチド、核酸（天然または合成）、転移RNA、リボソームおよびアミノ酸、なら びに改変遺伝子産物の選択を可能にするための対象となる反応の基質、から選択
される。
【００７２】 好適な緩衝剤は、その中で生体系の所望の成分のすべてが活性状態で存在する
緩衝剤であり、従って、それぞれ特定の反応系の要件に依存するであろう。生物
学的および／または化学的反応に好適な緩衝剤は、当技術分野で公知であり、種
々の実験用テキスト（例えば、Sambrook et al., 1989）に、処方が記されてい る。
【００７３】 in vitro翻訳系には、通常、細胞抽出物、代表的には、細菌（Zubay, 1973; Z
ubay, 1980; Lesley et al., 1991；Lesley et al., 1995）、ウサギ網状赤血球
（Pelham and Jackson, 1976）、または小麦胚芽（Anderson et al., 1983）に 由来する抽出物、が含まれるであろう。多くの好適な系は、共役した転写／翻訳
の可能な系を含めて、（例えば、Promegaから）市販されている（細菌系ならび に網状赤血球および小麦胚芽TNTTM抽出物系はいずれもPromegaから市販されてい
る）。使用するアミノ酸の混合物には、ライブラリー中で生成するタンパク質の
数および種類をできるだけ増大させるように、所望により、合成のアミノ酸が含
まれていてもよい。これは、人為的なアミノ酸をtRNAに組み込み、これらのtRNA
を用いて、選択すべきタンパク質の翻訳をin vitroで行うことによって、達成す
ることができる（Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995）
。
【００７４】 選択の各ラウンドの後、対象の分子をコードする遺伝子エレメントに関して、
非コンパートメント化in vitro転写／複製反応または共役した転写‐翻訳反応に
より、遺伝子エレメントのプールの濃縮物をアッセイすることができる。選択さ
れたプールを好適なプラスミドベクター中にクローン化し、個々のクローンから
RNAまたは組換えタンパク質を産生させ、更なる精製およびアッセイに供する。
【００７５】 本発明は更に、遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを本発明の方法によ
り選別した後で遺伝子産物を産生する方法に関する。簡単に述べれば、遺伝子エ
レメント自体を従来の手段で直接発現させて遺伝子産物を産生させてもよい。し
かしながら、当業者には自明であろうが、代替法を利用してもよい。例えば、遺
伝子産物中に組み込まれた遺伝情報を好適な発現ベクター中に導入し、そこから
発現させいもよい。
【００７６】 本発明はまた、本発明の第1の態様により同定された遺伝子産物と相互作用す ることのできる化合物を同定するための、従来のスクリーニング法の使用に関す
る。好ましい実施形態において、遺伝子産物をコードする核酸をベクター中に組
み込み、更に、好適な宿主細胞中に導入することにより、遺伝子産物を発現する
形質転換された細胞系を産生する。次に、遺伝子産物の機能に影響を及ぼすこと
のできる薬剤の作用（1種または複数種）の再現性のある定性的および／または 定量的分析を行うために、得られた細胞系を産生することができる。この場合、
遺伝子産物の機能を調節する化合物、特に、低分子量の化合物を同定するために
、遺伝子産物を発現する細胞を利用することが可能である。従って、遺伝子産物
を発現する宿主細胞は、薬剤のスクリーニングに有用であり、遺伝子産物の活性
を調節する化合物を同定するための方法を提供することは、本発明の更なる目的
となる。この方法には、遺伝子産物をコードする異種DNAを含有する細胞（この 細胞は、機能性遺伝子産物を産生する）を、該遺伝子産物の活性を調節する能力
を測定するための対象となる少なくとも1種の化合物もしくは化合物の混合物ま たはシグナルに暴露するステップと、その後、該調節により引き起こされる該細
胞の変化をモニターするステップと、が含まれる。このようなアッセイにより、
アゴニスト、アンタゴニスト、およびアロステリックモジュレーターのような遺
伝子産物のモジュレーターの同定を行うことができる。本明細書中で使用する場
合、遺伝子産物の活性を調節する化合物またはシグナルとは、化合物またはシグ
ナルの存在下で遺伝子産物の活性が異なるように（該化合物またはシグナルが存
在しない場合と比較して）遺伝子産物の活性を変化させる化合物を意味する。
【００７７】 細胞に基づくスクリーニングアッセイは、リポータータンパク質、すなわち、
容易にアッセイできるタンパク質、例えば、bガラクトシダーゼ、クロラムフェ ニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、またはルシフェラーゼ、の発現 が、遺伝子産物に依存する細胞系を構築することにより、デザインすることがで
きる。このようなアッセイにより、遺伝子産物の機能を直接調節する化合物、例
えば、遺伝子産物と拮抗する化合物、または遺伝子産物の活性に必要な他の細胞
機能を抑制もしくは強化する化合物、を検出することができる。
【００７８】 本発明はまた、細胞中で起こる遺伝子産物依存性プロセスに外因的変化を誘発
する方法を提供する。組換え遺伝子産物を産生する宿主細胞、例えば、哺乳類細
胞、を試験化合物と接触させ、次に、試験化合物の存在下または不在下で遺伝子
産物媒介応答を比較するか、または試験細胞または対照細胞（すなわち、遺伝子
産物を発現しない細胞）の遺伝子産物媒介応答を化合物の存在と関連づけするこ
とにより、その調節作用を評価することができる。
【００７９】 更なる態様において、本発明は、ポリペプチドにより促進される少なくとも1 つのステップが関与する産生プロセスを最適化するための方法を提供する。例え
ば、このステップは、酵素により促進される触媒反応ステップであってよい。従
って、本発明は、1種または複数種の化合物を調製するための方法であって、 （a）少なくとも1つのステップがポリペプチドにより促進される合成プロトコ
ルを提供するステップと、 （b）このステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレ メントを調製するステップと、 （c）遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステ ップと、 （d）マイクロカプセル内で遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺伝 子産物を産生するステップと、 （e）所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物（1種または複数種）を産生
する遺伝子エレメントを選別するステップと、 （f）合成の関連ステップを促進すべく（e）で同定されたポリペプチド遺伝子
産物を用いて1種または複数種の化合物を調製するステップと、 を含む方法を提供する。
【００８０】 本発明を利用すると、化合物の調製に関連する酵素を、最適な活性になるよう
に選択することによって最適化することが可能である。この手順では、スクリー
ニングされたポリペプチドの変異体の調製を行うが、この変異体は、本明細書に
記載のポリペプチドのライブラリーと同じである。変異体は、本明細書中の他の
箇所に記載のライブラリーと同じようにして調製することが可能である。
【００８１】 （B）選択手順 RNA、DNA、または触媒活性、調節活性、もしくは結合活性を有するタンパク質
遺伝子産物に対して選択を行うべく、系を構成することができる。 （i）アフィニティー選択 特定のリガンドに対して親和性を有する遺伝子産物の選択を行う場合、遺伝子
エレメントを、リガンドを介してマイクロカプセル中の遺伝子産物にリンクさせ
ることが可能である。この場合、リガンドに対して親和性を有する遺伝子産物だ
けが遺伝子エレメント自体に結合するため、活性な産物を産生する遺伝子エレメ
ントだけが選択ステップで保持されるであろう。従って、この実施形態では、遺
伝子エレメントには、遺伝子産物用のリガンドにリンクされる遺伝子産物をコー
ドする核酸が含まれるであろう。
【００８２】 この実施形態では、選択されるすべての遺伝子産物が、選択対象となる推定結
合ドメインと、共通の特徴であるタグと、を含有する。各マイクロカプセル中の
遺伝子エレメントは、リガンドに物理的にリンクされる。遺伝子エレメントから
産生された遺伝子産物がリガンドに対して親和性を有する場合、遺伝子産物はリ
ガンドに結合し、それをコードする同じ遺伝子エレメントに物理的にリンクされ
、結果として、遺伝子エレメントは「タグ付け」されるであろう。反応の終了時
、マイクロカプセルをすべて合体させ、遺伝子エレメントおよび遺伝子産物をす
べて1つの環境下で一緒にプールする。所望の結合を呈する遺伝子産物をコード する遺伝子エレメントは、「タグ」に対して特異的な結合または特異的な反応を
行う分子を用いてアフィニティー精製することにより、選択することができる。
【００８３】 他の実施形態において、リガンドに結合する遺伝子産物は、単に、例えば、更
なる結合パートナーに対してリガンドを隠蔽しているにすぎないということに基
づいて、遺伝子エレメントを選別することが可能である。この最終的な結果とし
て、他の遺伝子エレメントを結合させながら、アフィニティー精製ステップの際
に保持することなく、遺伝子エレメントを選択的に溶出させることが可能である
。
【００８４】 他の実施形態において、本発明は、本発明の第1の態様に基づく方法であって 、ステップ（b）で、遺伝子産物を、それをコードする遺伝子エレメントに結合 させることを特徴とする方法を提供する。次に、リガンドと、所望の活性を有す
る遺伝子産物との結合の結果として、結合され遺伝子エレメントと一緒に遺伝子
産物を選別する。例えば、すべての遺伝子産物は、遺伝子エレメントに共有結合
または非共有結合で結合する不変領域と、所望の結合活性を発生させるために多
様化された第2の領域と、を含有することができる。
【００８５】 親和性による選別は、結合が起こりうる条件下における結合対の2つのメンバ ーの存在に依存する。この目的では、任意の結合対を使用することが可能である
。本明細書中で使用する場合、結合対という用語は、互いに結合可能な任意の分
子対を意味する。本発明に使用しうる結合対としては、例えば、抗原と該抗原に
結合可能な抗体もしくはその断片、ビオチン‐アビジン／ストレプトアビジン対
（Savage et al., 1994）、カルシウム依存性結合ポリペプチドとそのリガンド （例えば、カルモジュリンとカルモジュリン結合ペプチド（Stofko et al., 19
92; Montigiani et al., 1996））、ロイシンジッパーを形成するために集合す るポリペプチド対（Tripet et al., 1996）、ヒスチジン（典型的には、ヘキサ ヒスチジンペプチド）とキレート化Cu2+、Zn2+、およびNi2+（例えば、Ni-NTA;
Hochuli et al., 1987）、RNA‐結合タンパク質とDNA‐結合タンパク質（Klug,
1995）、具体的には、ジンクフィンガー（Klug and Schwabe, 1995）およびDNA メチルトランスフェラーゼ（Anderson, 1993）を含有するタンパク質、ならびに
それらの核酸結合部位、が挙げられる。
【００８６】 （ii）触媒作用 触媒作用に対して選択を行う場合、各マイクロカプセル中の遺伝子エレメント
には、反応の基質が含まれていてもよい。遺伝子エレメントが、触媒として作用
できる遺伝子産物をコードする場合、遺伝子産物は、基質から産物への変換を触
媒するであろう。従って、反応の終了時、遺伝子エレメントは、触媒される反応
の産物に物理的にリンクされる。マイクロカプセルを合体させて反応体をプール
化すると、産物に特異的な任意の性質に対して選択を行うことにより、触媒分子
をコードする遺伝子エレメントを濃縮することができる（図1）。
【００８７】 例えば、濃縮は遺伝子産物に特異的に結合する分子（例えば抗体）を用いたア
フィニティ精製によって行いうる。同等に、遺伝子産物は遺伝子エレメントの核
酸成分を改変する、例えば核酸のメチル化（または脱メチル化）あるいは変異に
よってそれに制限エンドヌクレアーゼのようなヌクレアーゼによる攻撃に対する
耐性や感受性を与えたりするような効果を有しうる。
【００８８】 このほか、第1の反応を、同じマイクロカプセル中で起こる後続の第2の反応と
共役させることにより、間接的に選択を行ってもよい。これを実施しうる一般的
な方法は、2つ存在する。最初に、第1の反応の産物を、第1の反応の基質と反応 しない分子と反応させるかまたはそれに結合させることが可能である。第2の共 役反応は、第1の反応の産物の存在下でのみ進行するであろう。次に、第2の反応
の産物の性質に対して選択を行うことにより、活性遺伝子エレメントを精製する
ことができる。
【００８９】 このほか、選択される反応の産物は、第2の酵素触媒反応に対する基質または 補因子であってよい。第2の反応を触媒する酵素は、マイクロカプセル中でin si
tuで翻訳するか、またはマイクロカプセル化する前に反応混合物中に導入するこ
とができる。第1の反応が進行する場合にのみ、共役酵素は選択可能な産物を生 成するであろう。
【００９０】 こうした共役という考え方を採り入れると、前の反応の産物を基質として使用
する多数の酵素を導入することができる。これにより、固定化基質と反応しない
酵素の選択を行うことが可能となる。1つの反応の産物が、選択可能な産物を生 成する第2の反応または一連の反応に対する触媒または補因子である場合、シグ ナル増幅により感度を増大させることもできる（例えば、Johnnsson and Bates,
1988; Johnnsson, 1991）。更に、酵素カスケード系は、酵素に対するアクチベ
ーターの産生、または酵素阻害剤の破壊に基づくものであってよい（Mize et al
., 1989を参照されたい）。また、共役には、同じ産物を生成しかつ単一ステッ プでは実施できない複雑な化学的変換の選択を可能にする酵素のグループ全体に
対して、共通の選択系を使用できるという利点がある。
【００９１】 従って、このような共役法を用いると、最初の1ステップの選択および改良、 続いて次のステップの選択および改良を行うというように段階的にin vitroで新
規な「代謝経路」を進化させることができる。選択ストラテジーは、経路の最終
産物に基づいている。従って、それよりも前のステップはいずれも、反応の各ス
テップに対する新しい選択系を設定することなく、独立にまたは逐次的に進化さ
せることができる。
【００９２】 このほかの方法で発現させると、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする
1種以上の遺伝子エレメントを単離する方法が提供される。この方法には、 （1）遺伝子エレメントを発現させて該遺伝子エレメントのそれぞれの遺伝子 産物を生成させるステップと、 （2）遺伝子産物を用い、所望の活性に従って、基質から、直接選択可能であ ってもなくてもよい産物への変換を触媒するステップと、 （3）場合により、第1の反応を1つ以上の後続反応と共役させるステップであ って、各反応が、前の反応の産物により調節され、最終的に選択可能な産物を生
成するステップと、 （4）（a）産物と遺伝子エレメントとの関連が保持されるように基質を遺伝子
エレメントにカップリングさせることにより、または （b）産物に保持される好適な分子「タグ」を基質に結合させることによ
って、選択可能な産物を遺伝子エレメントと反応させるかもしくはそれに結合さ
せることにより、または （c）産物特異的反応もしくは産物との相互作用によって、選択可能な産
物（基質ではない）を遺伝子エレメントにカップリングさせることにより、 触媒反応の選択可能な産物を遺伝子エレメントにリンクさせるステップと、 （5）産物との特異的反応もしくは相互作用を用いるか、または触媒反応の産 物に結合された好適な分子「タグ」を用いたアフィニティー精製により、触媒反
応の産物を、それが結合した遺伝子エレメントと共に、選択するステップと、 が含まれ、 ステップ（1）〜（4）で、各遺伝子エレメントおよびそれぞれの遺伝子産物は
、マイクロカプセル内に包含される。
【００９３】 （iii）調節 類似の系を用いて、酵素の調節特性の選択を行うことができる。 生化学プロセスのアクチベーターまたはインヒビターとして作用する調節分子
の選択を行う場合、生化学プロセスの成分は、各マイクロカプセル中でin situ で翻訳するか、またはマイクロカプセル化する前に反応混合物中に導入すること
ができる。選択される遺伝子エレメントがアクチベーターをコードすることがで
きる場合、触媒作用に関連して先に記載したように、調節される反応の産物に対
して選択を行うことができる。インヒビターが望まれる場合、調節される反応の
基質に特異的な化学的性質に対して選択を行うことができる。
【００９４】 従って、所望の調節活性を呈する遺伝子産物をコードする1種以上の遺伝子エ レメントを選別する方法が提供される。この方法には、 （1）遺伝子エレメントを発現させて該遺伝子エレメントのそれぞれの遺伝子 産物を生成させるステップと、 （2）遺伝子産物を用い、所望の活性に従って、選択可能な分子の発生または 存在が可能になるように生化学反応または一連の共役反応を活性化または抑制す
るステップと、 （3）（a）選択可能な分子、またはその分子の誘導に用いられた基質を、遺伝
子エレメントに結合させることにより、または （b）産物に保持される好適な分子「タグ」を基質に結合させることによ
って、選択可能な産物を遺伝子エレメントと反応させるかもしくはそれに結合さ
せることにより、または （c）産物特異的反応もしくは産物との相互作用によって、触媒反応の産
物（基質ではない）を遺伝子エレメントにカップリングさせることにより、 選択可能な分子を遺伝子エレメントにリンクさせるステップと、 （4）選択可能な産物との特異的反応もしくは相互作用を用いるか、または触 媒反応の産物に結合された好適な分子「タグ」を用いたアフィニティー精製によ
り、選択可能な産物を、それが結合した遺伝子エレメントと共に、選択するステ
ップと、 が含まれ、 ステップ（1）〜（4）で、各遺伝子エレメントおよびそれぞれの遺伝子産物は
、マイクロカプセル内に包含される。
【００９５】 （iv）マイクロカプセルの選別 本発明は、欠陥のないマイクロカプセルの選別法を提供する。ただし、利用す
る選別法が適用可能な場合にかぎられる。所望の遺伝子産物により誘発される変
化が、マイクロカプセルの表面で起こるかもしくはそれが表面に現れるか、また
はマイクロカプセルの外側からそれを検出できる場合には、マイクロカプセルの
選別を行うことが可能である。この変化は、遺伝子産物の直接的作用により誘発
されるものであってもよいし、所望の活性を有する遺伝子産物の関与する反応が
1つ以上含まれる一連の反応によって間接的に誘発される変化であってもよい。 例えば、遺伝子産物がマイクロカプセルの表面に出現し、試薬に接近できるよう
に、マイクロカプセルを構成してもよい。マイクロカプセルが膜のマイクロカプ
セルである場合、遺伝子産物をターゲットにしてもよいし、所定の分子をマイク
ロカプセルの膜までターゲッティングさせてもよい。このことは、例えば、膜タ
ンパク質から誘導される配列にように、融合またはリンクされた分子がマイクロ
カプセルの膜に優先的に組み込まれるようにする膜局在化配列を利用することに
より、達成することができる。このほか、油中水型エマルションのように相分離
によりマイクロカプセルを形成する場合、カプセルの外側相に多く溶解する部分
を有する分子は、マイクロカプセルの境界に存在するような配置をとるであろう
。
【００９６】 しかしながら、本発明の好ましい態様では、マイクロカプセルの選別は、マイ
クロカプセルの光学的性質、例えば、マイクロカプセルの吸収または発光特性、
の変化が関与した系を選別するために利用される。具体的には、マイクロカプセ
ルに関連付けられる吸収、ルミネセンス、燐光、または蛍光の変化を誘発する反
応の結果として生じるマイクロカプセルの光学的性質の変化が関与した系に適用
される。このような性質はいずれも、「光学的」という用語に含まれる。このよ
うな場合、ルミネセンス、蛍光、または燐光に基づく選別法により、マイクロカ
プセルの選別を行うことができる。非常に好ましい実施形態では、蛍光に基づく
選別法を利用して、所望の活性を有する遺伝子産物の産生が細胞中の蛍光分子の
産生を伴う場合のマイクロカプセルの選別を行う。例えば、遺伝子産物自体が、
蛍光物質、例えば、GFPのような蛍光タンパク質であってよい。このほか、遺伝 子産物は、他の分子に結合するかまたはそれと反応することにより、他の分子の
蛍光を誘発または変化させるものであってよい。
【００９７】 （v）マイクロカプセルの同定 第iii節（マイクロカプセルの選別）で述べたように、所望の遺伝子産物によ り誘発される変化が、マイクロカプセルの表面で起こるかもしくはそれが表面に
現れるか、または外側からそれを検出できる場合には、こうした変化を利用して
マイクロカプセルの同定を行うことが可能である。同定される場合には、この変
化を用いて、コンパートメント内の遺伝子の改変をトリガーすることができる。
本発明の好ましい態様では、マイクロカプセルの同定は、マイクロカプセル内で
ルミネセンス、燐光、または蛍光を誘発する反応の結果として生じるマイクロカ
プセルの光学的性質の変化に基づくものである。ルミネセンス、燐光、または蛍
光を同定することにより、マイクロカプセル内での遺伝子の改変がトリガーされ
るであろう。例えば、ルミネセンス、燐光、または蛍光を同定することにより、
遺伝子エレメントの改変を引き起こすフォトン（または他の粒子もしくは波）に
よるコンパートメントの照射をトリガーすることができる。細胞の迅速な選別を
行うための類似の手順が、既に報告されている（Keij et al., 1994）。例えば 、光活性保護基でケージ化された分子「タグ」を遺伝子エレメントにカップリン
グさせることにより、遺伝子エレメントの改変を起こしてもよい。この場合、適
切な波長のフォトンを照射すると、ケージが除去される。その後、マイクロカプ
セルをすべて合体させ、遺伝子エレメントを1つの環境下で一緒にプールする。 所望の活性を呈する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは、「タグ」に対
して特異的な結合または特異的な反応を行う分子を用いてアフィニティー精製す
ることにより、選択することができる。
【００９８】 （vi）多段階法 かならずしも、すべての反応を1つのマイクロカプセル中で行い、転写／複製 および／または翻訳ならびに選択のプロセスを単一ステップで行う必要がないこ
とは理解されるであろう。選択手順には、2ステップ以上が含まれていてもよい 。第1に、遺伝子エレメントライブラリーの各遺伝子エレメントの転写／複製お よび／または翻訳を第1のマイクロカプセル中で行ってもよい。次に、各遺伝子 産物を、それをコードする遺伝子エレメント（同じマイクロカプセル中に存在す
る）にリンクさせる。その後、マイクロカプセルを破壊し、それぞれの遺伝子産
物に結合された遺伝子エレメントを場合により精製する。このほか、遺伝子エレ
メントは、カプセル化によらない方法を用いて、該遺伝子エレメントのそれぞれ
の遺伝子産物に結合させることもできる。例えば、ファージディスプレイ（Smit
h, G.P., 1985）、ポリソームディスプレイ（Mattheakkis et al., 1994）、RNA
‐ペプチド融合（Roberts and Szostak, 1997）、またはlacリプレッサーペプチ
ド融合（Cull, et al., 1992）。
【００９９】 この手順の第2のステップでは、遺伝子産物に結合された各精製済み遺伝子エ レメントを、選択される反応の成分を含有する第2のマイクロカプセル中に導入 する。次に、この反応を開始させる。反応の終了後、再び、マイクロカプセルを
破壊し、改変された遺伝子エレメントを選択する。多くの異なる成分および反応
ステップが関与する複雑な多段階反応の場合、遺伝子産物の生成および遺伝子エ
レメントとのリンケージを行う初期のステップと、遺伝子エレメントに選択可能
な変化を起こす最終のステップとの間に、1つ以上の中間ステップを行っても良 い。
【０１００】 （vii）in situリポーター遺伝子発現の活性化による選択 遺伝子エレメントがコードする所望の結合活性、触媒活性、または調節活性に
より、すべてのマイクロカプセル中に存在する「リポーター遺伝子」の発現が直
接的または間接的に活性化されるように、系を構成することができる。所望の活
性を有する遺伝子産物だけが、リポーター遺伝子の発現を活性化する。リポータ
ー遺伝子発現の結果として生じる活性を利用すると、本明細書に記載の任意の方
法により、遺伝子エレメント（または、それを含むコンパートメント）の選択が
可能になる。
【０１０１】 例えば、リポーター遺伝子の活性化は、「2ハイブリッド系」の場合と同様に 、遺伝子産物の結合活性の結果であってもよい（Fields and Song, 1989）。ま た、活性化は、所望の遺伝子産物により触媒される反応の産物によっと生じるも
のであってもよい。例えば、反応の産物は、リポーター遺伝子の転写インジュー
サーであってよい。例えば、アラビノースを用いて、araBADプロモーターからの
転写を誘発することができる。また、所望の遺伝子産物の活性を用いて、リポー
ター遺伝子の発現を引き起こす転写因子の改変を行うこともできる。例えば、所
望の遺伝子産物がキナーゼまたはホスファターゼである場合、転写因子の燐酸化
または脱燐酸化により、リポーター遺伝子発現を活性化することが可能である。
【０１０２】 （viii）増幅 本発明の更なる態様によれば、本発明の方法には、遺伝子エレメントを増幅す
る更なるステップが含まれる。所望の遺伝子産物をコードする遺伝子エレメント
に対する濃縮を行う手段として選択的増幅を使用することができる。
【０１０３】 上記のいずれの構成を用いた場合にも、遺伝子エレメント中に含まれる遺伝物
質を増幅することが可能であり、このプロセスは、反復ステップとして繰り返す
ことが可能である。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（Saiki et al., 1988）を用
いて行ってもよいし、種々の他の遺伝子増幅法、具体的には、Qβレプリカーゼ 増幅（Cahill, Foster and Mahan., 1991; Chetverin and Spirin, 1995; Katan
aev, Kurnasov and Spirin, 1995）；リガーゼ連鎖反応(LCR)（Landegren et al
., 1988; Barany, 1991）；自己持続性配列複製系（Fahy, Kwoh and Gingeras,
1991）および鎖置換増幅（Walker et al., 1992）、のうちの1つを用いて行って
もよい。
【０１０４】 （ix）コンパートメント化 本発明の更なる態様によれば、遺伝子エレメントをコンパートメント化し、遺
伝子エレメントを発現させて、コンパートメント内で遺伝子産物を形成する方法
が提供される。この方法には、 （a）遺伝子エレメントと、それを発現させてその遺伝子産物を形成するのに 必要な成分とを含んでなる水溶液を作製するステップと、 （b）遺伝子エレメントを含む離散したマイクロカプセルが形成されるように 、溶液をマイクロカプセル化するステップと、 （c）遺伝子産物を形成すべく遺伝子エレメントの発現を進行させるのに好適 な条件にマイクロカプセルを暴露するステップと、 が含まれる。
【０１０５】 好適なマイクロカプセル化法については、上記の全般的な説明にところに詳細
に記載されている。 好ましくは、遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメントのライ
ブラリーを、上記の方法でカプセル化し、本発明に従って、遺伝子エレメントを
発現させて該遺伝子エレメントのそれぞれの遺伝子産物を産生する。非常に好ま
しい実施形態では、遺伝子エレメントを含有する水溶液の油中水型エマルション
を作製することによって、マイクロカプセル化を行う。
【０１０６】 それに応じて、本発明は、上記の方法で得られるマイクロカプセルを提供する
。 以下の実施例を用いて、本発明の種々の態様および実施形態について具体的に
説明する。本発明の範囲を逸脱することなく詳細事項の変更を行うことが可能で
あることは理解されるであろう。 本文中に記載の文献はいずれも、参照により組み入れる。
【０１０７】 （実施例） 実施例１ 油中水型エマルション系における約2 μm水性マイクロカプセルの作製 本発明の好ましいサイズ範囲内にあるマイクロカプセルは、油中水型エマルシ
ョン系を用いて作製することができる。 本明細書中では、連続相として軽質ホワイト鉱油（Sigma; M-3516）を使用し 、乳化剤のソルビタンモノオレエート（Span 80, Fluka; 85548）およびポリオ キシエチレンソルビタンモノオレエート（Tween 80, Signa Ultra; P-8074）、 ならびに場合に応じて、0.5 % w/vデオキシコール酸ナトリウム（Fluka; 30970 ）を用いてエマルションを安定化させる。
【０１０８】 油相は、鉱油（Sigma, #M-5904）中に4.5 % (v/v) Span 80 (Fluka)を溶解し 、続いて、0.5 % (v/v) Tween 80 (Signa Ultra; #P-8074)を溶解することによ り、新たに調製する。マグネチックスターラー（8×3 mm、ピボットリング付き;
Scientific Industries International, Loughborough, UK）で攪拌しながら、
氷冷されたin vitro反応混合物（50 μl）を、5 ml Costar Biofreeze Vial (#2
051)中で、氷冷された油相0.95 mlに徐々に添加する。氷上で更に1時間、攪拌（
1150 rpm）を継続する。いくつかのエマルションでは、アニオン界面活性剤、例
えば、デオキシコール酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、グリココール酸ナト
リウム、およびタウロコール酸ナトリウムを、典型的には0.5 % (w/v)になるよ うに、水性相に添加した。
【０１０９】 必要な場合には、直径8 mmの分散工具を備えたUltra-Turrax T25分散機（IKA ）を用いて、8 k、9 k、もしくは13.5 k rpmで1分間、または20 k rpmで1〜5分 間、更に均質化処理する。これによりマイクロカプセルのサイズが減少する。 反応を停止させ、各実施例中に記載されているように、3,000 g で5分間回転 させて油相を除去し、バイアルの底に濃縮エマルションを残すことより、エマル
ションを破壊することができる。クエンチング緩衝液（典型的には、W+B緩衝液 ：1 M NaCl 、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA pH 7.4に添加された25 μg/ml酵母R
NA 0.2 ml）および水飽和ジエチルエーテルを添加し、混合液の攪拌および簡単 な遠心分離処理を行ってエーテル相を除去する。水性相をエーテルで洗浄し、乾
燥させる（Speedvac中において周囲温度で5分間）。
【０１１０】 エマルション中の水性液滴のサイズ分布を、Coulter LS230 Particle Size An
alyserを用いてレーザー回折により測定した。鉱油で新たに希釈（1:10）したエ
マルションのアリコートを、鉱油の入った微小チャンバーに攪拌しながら添加す
る。装置に内蔵されたMie光学モデルを用い、鉱油の屈折率を1.468、水性相の屈
折率を1.350として、結果を解析する。エマルション中の水性液滴のサイズ分布 は、図2に示されている。デオキシコール酸ナトリウムを添加しても、サイズ分 布に有意な変化は見られない。
【０１１１】 実施例2 油中水型エマルションの水性マイクロカプセル中で行われる効率的なin vitro
転写反応 各マイクロカプセル内でDNAからRNAを産生するために、系の各水性マイクロカ
プセル内に存在するDNA分子1個を効率的に転写しなければならない。この場合、
in vitro転写は、マイクロカプセル内で行われる。
【０１１２】 Tetrahymena自己スプライシングイントロンの触媒コアーは、多くの研究がな されたリボザイムである。リボザイムは、種々のホスホエステル転移反応を触媒
することができる（Sag et al., 1986; Sag and Czech, 1986; Sag and Czech,
1986）。例えば、5'末端からP1ステム‐ループを除去し3'ステム‐ループP9.1お
よびP9.2を除去して改変されたTetrahymenaイントロンは、RNAリガーゼとして機
能し、鋳型鎖上に配置された2つ以上のオリゴヌクレオチドを効率的にスプライ スすることができる（Green and Szostak, 1992）。
【０１１３】 上記のTetrahymenaリボザイムをコードするDNAを、プライマーP2T7Ba（P2ルー
プ領域にアニールし、T7 DNAポリメラーゼプロモーターを追加する）およびP9Fo
（P9ループ領域にアニールする）を用いてPCR増幅する。これにより、T7 DNAポ リメラーゼプロモーターを有する311塩基対DNA断片が形成される。この断片を、
Wizard PCR Prep（Promega）を用いて直接精製し、T7 DNAポリメラーゼを用いて
in vitro転写反応を行うための鋳型として使用する。
【０１１４】 反応速度が本質的に直線的である初期の10分間にわたり、in vitro転写をアッ
セイする（Chamberlin and Ring, 1973）。 転写に対する反応条件は、Wyatt et al., 1991に記載されている。[γ-32P] U
TPを導入して、反応の進行をアッセイする。
【０１１５】 体積200 μl中で転写反応を行い、それぞれ3×1011個のDNA分子（5 nM）を含 有する2つのアリコートに分割する。一方の100 μlアリコートを、4.5 % Span 8
0および0.5 % Tween 80を含有するSigma軽質鉱油2 mlに添加し、実施例1の場合 に同様に、Ultra-Turrax T25分散機を用いて20,000 rpmで5分間均質化処理する 。これらのエマルション中の平均マイクロカプセル体積（直径0.81 μmのマイク
ロカプセルでは2.8×10-19 m3）に基づいて計算すると、100 μlの反応液は3.6 ×1011個のマイクロカプセルに分割されたことになる。従って、マイクロカプセ
ル1個あたり平均で1個のDNA分子が存在するはずである。
【０１１６】 両方のアリコートを37℃の水浴中でインキュベートする。インキュベーション
の開始前および10分後の両方でエマルションサンプル0.5 mlを採取して氷上に配
置する。同時に、乳化されていない対照の反応液から同様にサンプル25 μlを採
取する。実施例1に記載されているように、エマルションを破壊し、0.5 ml EDTA
（50 mM）および水飽和ジエチルエーテル2 mlを用いて反応を停止させる。次に 、20 mM EDTA中のサケ精液DNA（500 μg/ml）100 μlを添加する。その後、両方
のエマルションおよび対照から3つの100 μlアリコートを採取し、TCA沈降法お よびシンチレーション計数法により、標識RNAをアッセイする。
【０１１７】 転写速度は、37℃において10分間にわたるインキュベーションを行ったときも
酸認知cpmの増加として求める。乳化を行わない対照反応では、エマルションの 場合の147,000 cpmに対して、442,000 cpm酸認知物質である。従って、エマルシ
ョン中の転写速度は、乳化しない対照反応で得られる速度の33 %である。 以上のことから、この手順により、油中水型エマルションの水性マイクロカプ
セル中においてT7 DNAポリメラーゼによりRNAが効率的に合成できることが分か る。
【０１１８】 実施例3 油中水型エマルションの水性マイクロカプセル中で行われる効率的な共役in v
itro転写／翻訳反応 本発明の手順を用いてタンパク質を合成するために、本明細書に記載の油中水
型エマルションの水性マイクロカプセル中において転写が有効に行われなければ
ならない。 この実施例では、共役転写／翻訳系を用いて油中水型エマルションの水性マイ
クロカプセル中においてタンパク質（大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ）がDNA から効率的に産生できることが示される。
【０１１９】 ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードする大腸菌folA遺伝子を、オリゴ
ヌクレオチドEDHFRFoおよびEDHFRBaを用いてPCR増幅する。次に、このDNAを、Hi
ndIIIおよびKpnIを用いてlacプロモーターおよびT7 DNAポリメラーゼプロモータ
ーの両方の下流で消化したpGEM-4Zベクター（Promega）中にクローン化する。オ
リゴヌクレオチドEDHFRBaは、DHFR開始コドンの上流に、有効なファージT7遺伝 子10翻訳開始部位を追加する。
【０１２０】 DNA配列決定により、正しいヌクレオチド配列を有するクローンであることが 確認される。このクローン（pGEM-folA）を用いて形質転換させた細菌は、IPTG で誘発した場合、活性DHFR（lacプロモーターから駆動される）を過剰発現する ことが判明した。
【０１２１】 次に、上述したように、プライマーLMB2およびLMB3を用いてpGEM-folAプラス ミドをPCR増幅し、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳 開始部位、およびfolA遺伝子を含有する649bp DNA断片を形成する。Wizard PCR
Prep（Promega）を用いて、このPCR断片を直接精製し、これを用いて、線状鋳型
用にデザインされた原核in vitro共役転写／翻訳系をプログラムする（Lesley,
Brow and Burgess, 1991）。
【０１２２】 この系の市販品を用い（E. coli S30 Extract System for Linear Templates;
Promega）、これにT7 RNAポリメラーゼを追加する。 3×1012個のDNA分子を含有する翻訳反応液300 μlを氷上に配置する。T7 RNA ポリメラーゼ（104単位）を添加して転写を誘発し、[35S]メチオニンを添加する
ことにより、翻訳されたタンパク質を標識した。この反応液の150 μlアリコー トを、4.5 % Span 80および0.5 % Tween 80を含有するSigma軽質鉱油2.85 mlに 添加し、実施例1の場合に同様に、Ultra-Turrax T25分散機を用いて20,000 rpm で1分間均質化処理する。他方のアリコートは、乳化させなかった。
【０１２３】 エマルション中の平均マイクロカプセル体積（直径1.29 μmのマイクロカプセ
ルでは1.1×10-18 m3）に基づいて計算すると、150 μlの反応液は1.3×1011個 のマイクロカプセルに分割されたことになる。従って、マイクロカプセル1個あ たりおよそ11個のDNA分子が存在するはずである。 エマルション反応混合液から4つの0.5 mlアリコートを採取する。1つのアリコ
ートは直ちに氷上に配置し、他の3つは、25℃の水浴中で2時間インキュベートし
てから氷上に配置する。乳化されていない反応混合液からも4つの25 μlサンプ ルを採取する。1つは直ちに氷上に配置し、他の3つは、25℃の水浴中で2時間イ ンキュベートしてから氷上に配置する。
【０１２４】 4℃において5分間にわたり微量遠心分離器中でエマルションを13,000 r.p.m. で回転させ、鉱油を除去し、管の底に濃縮（しかし、依然として分散状態にある
）エマルションを残す。再び簡単に回転を行って残りの鉱油を除去した後、エマ
ルションを破壊し、125 μg/mlピューロマイシンおよび1 ml水飽和ジエチルエー
テルを含有する水100μlを添加することにより、更なる翻訳を停止させる。この
混合液を攪拌し、4℃において1分間にわたり微量遠心分離器中で再び13,000 r.p
.m.で回転させる。次に、エーテルおよび溶解した鉱油を吸引除去し、更に1 ml のエーテルを用いて抽出を繰り返す。室温においてSpeedvac中で5分間回転させ ることにより、残存するエーテルを除去する。
【０１２５】 乳化されていな対照反応液25 μlに、125 μg/mlピューロマイシンを含有する
水100μlを添加する。次に、各サンプル25 μlをアセトンで沈降させ、in vitro
転写／翻訳系の製造業者（Promega）の作製した取扱説明書に従って20 % SDS-PA
GEゲルで処理する。ゲルを乾燥させ、PhosphorImager （Molecular Dynamics） を用いてスキャンする。エマルション中および対照中で行われた両方の反応にお
いて、DHFRの分子量の期待値（18 kd）を有する単一の強いバンドが観測される 。このバンドを正確に定量する。
【０１２６】 乳化された反応液では、18 kdピークにおける平均面積は、15,073単位であり 、乳化されていない対照反応液では、同じピークにおける平均面積は、18,990単
位である。従って、乳化された反応液中のDHFRタンパク質の量は、乳化されてい
ない対照反応液中の量の79 %であることが計算から分かる。このことから、本発
明の油中水型エマルション中において、転写／翻訳系が機能することが示唆され
る。
【０１２７】 実施例4 共役in vitro転写／翻訳反応を用いて産生させたジヒドロ葉酸レダクターゼは
活性である この実施例では、油中水型エマルション系の水性マイクロカプセル中でのfolA
遺伝子の共役転写／翻訳により、タンパク質（大腸菌ジヒドロ葉酸レダクターゼ
）が触媒活性のある形態で効率的に産生できることが示される。このアッセイで
は、最適サイズ未満のマイクロカプセルを含むエマルションを使用する。マイク
ロカプセルのサイズが大きくなると、DHFR活性は高くなることが分かる。 実施例3で使用したfolA鋳型DNA分子2×1011個、6×1012個、もしくは1.8×101
2個を含有するか、またはDNAを含有しない翻訳反応液175 μl（未標識）を氷上 に配置する。各反応液にT7 RNAポリメラーゼ（6×103単位）を添加して転写を誘
発する。
【０１２８】 各反応液の100 μlアリコートを、4.5 % Span 80および0.5 % Tween 80を含有
するSigma軽質鉱油1.9 mlに添加し、実施例1の場合と同様に、直径8 mmの分散工
具を備えたUltra-Turrax T25ホモジナイザーを用いて20,000 rpmで1分間または5
分間均質化処理する。1分間均質化処理を行った後の粒子の平均直径（体積基準 ）は1.30 μm（中央値 1.28 μm）である。内（水性）相の98体積%は、0.63 μm
〜2.12 μmの粒子として存在する。5分間均質化処理を行った後のマイクロカプ セルの平均直径（体積基準）は0.81 μm（中央値 0.79 μm）であり、内（水性 ）相の98体積%は、0.41 μm〜1.38 μｍの粒子として存在する。
【０１２９】 1分間乳化のエマルション中の平均マイクロカプセル体積（直径1.299 μmのマ
イクロカプセルでは1.1×10-18 m3）に基づいて計算すると、100 μlの反応液は
8.7×1010個のマイクロカプセルに分割されることになる。従って、マイクロカ プセル1個あたりおよそ1.3個、3.9個、または11.8個のDNA分子が存在するはずで
ある。 5分間乳化のエマルション中の平均マイクロカプセル体積（直径0.81 μmのマ イクロカプセルでは2.8×10-19 M3）に基づいて計算すると、100 μlの反応液は
3.6×1011個のマイクロカプセルに分割されることになる。従って、マイクロカ プセル1個あたりおよそ0.3個、1.0個、または2.9個のDNA分子が存在するはずで ある。
【０１３０】 エマルションおよび乳化されていない反応混合液を25℃の水浴中でインキュベ
ートする。インキュベーションの開始直前および2時間後、エマルションサンプ ル0.5 mlを採取して氷上に配置する。同時に、乳化されていない対照の反応液か
らサンプル25 μlを採取する。
【０１３１】 エマルションを4℃において5分間にわたり微量遠心分離器中で13,000 r.p.m. で回転させ、鉱油を吸引除去し、管の底に濃縮（しかし、依然として分散状態に
ある）エマルションを残す。再び短時間の遠心を行って更に鉱油を除去した後、
エマルションを破壊し、125 μg/mlピューロマイシンおよび1 ml水飽和ジエチル
エーテルを含有する緩衝液A（100 mMイミダゾール pH 7.0、10 mM β-メルカプ トエタノール）100 μlを添加することにより、更なる翻訳を停止させる。この 混合液を攪拌し、4℃において1分間にわたり微量遠心分離器中で再び13,000 r.p
.m.で回転させる。エーテルおよび溶解した鉱油を吸引除去し、更に1 mlのエー テルを用いて抽出を繰り返す。室温においてSpeedvac中で5分間回転させること により、残存するエーテルを除去する。乳化されていない対照反応液25 μlにも
、（125 μg/ml）ピューロマイシンを含有する緩衝液A 100 μlを添加する。
【０１３２】 Williamsら, 1979; Maら, 1993に記載されているように、10分間にわたり経時
的に340 nmでNADPHからNADPへの酸化を分光学的にモニターすることにより、ジ ヒドロ葉酸レダクターゼ活性をアッセイする。クエンチングされた各in vitro翻
訳反応液10 μlを、150 μl緩衝液A（100 mMイミダゾール、pH 7.0、10 mM β- メルカプトエタノール）および1 mM NADPH20 μlに添加する。1分後、ジヒドロ 葉酸（Dihydrofolate）（1 mM）（H2F）を添加し、ThermoMaxマイクロプレート リーダー（Molecular Devices）を用いて340 nmで反応をモニターする。So>>Km の条件下（υmax）で初期速度により活性を計算する。S30抽出物中のバックグラ
ウンド活性をすべてのサンプルから差し引く。
【０１３３】 エマルション中で得られるDHFR活性は、0時間および2時間のインキュベーショ
ンで測定された活性の差から求める。0.1 μMメトトレキセート（DHFRの特異的 阻害剤）を添加した場合、0時間および2時間のサンプル間で、NADPH酸化の増大 は生じなかった。このことは、観察されたNADPH酸化の増大はすべて、in vitro 翻訳反応で産生したDHFRによるものであることを示している。
【０１３４】 20,000 rpmで1分間の均質化処理を行った場合、エマルションで得られるDHFR 活性は、マイクロカプセル1個あたりのDNA分子の数が1.3個の場合、乳化されて いない対照の反応液で観察される活性の31 %であり、マイクロカプセル1個あた りのDNA分子の数が3.9個の場合は45 %であり、マイクロカプセル1個あたりのDNA
分子の数が11.8個の場合は84 %である。
【０１３５】 20,000 rpmで5分間の均質化処理を行った場合、エマルションで得られるDHFR 活性は、平均で、マイクロカプセル1個あたりのDNA分子の数が0.3個の場合、乳 化されていない対照の反応液で観察される活性の7 %であり、マイクロカプセル1
個あたりのDNA分子の数が1個の場合は15 %であり、マイクロカプセル1個あたり のDNA分子の数が2.9個の場合は35 %である。
【０１３６】 このことは、DHFRのターンオーバー数がPosnerら, 1996に記載の通りであると
仮定すると、最大DNA濃度における収量が、反応液100 μlあたりDHFR 6.3 μg（
340 pmole）（乳化されていない状態）、反応液100 μlあたりDHFR 1.98 μg（
104 pmole）（1分間乳化）、または反応液100 μlあたりDHFR 0.46 μg（24.8 p
mole）（5分間乳化）であることに相当する。このことは、1分間乳化の場合、マ
イクロカプセル1個あたりDHFR74分子、5分間乳化の場合、マイクロカプセル1個 あたり44分子であることと同じである（すべてのマイクロカプセルが平均サイズ
を有すると仮定した場合）。
【０１３７】 攪拌だけを行った場合、または実施例1に記載されているように、攪拌した後 で更に、Ultra-Turrax T25分散機を用いて8,000 rpm、9,000 rpm、もしくは13,5
00 rpmで1分間均質化処理した場合に得られる、より大きなマイクロカプセルに おいても、folA遺伝子の共役転写／翻訳から得られるDHFR活性が測定される。結
果は、図2bに示されている。使用したfolA遺伝子の濃度（2.5 nM）において、13
,500 rpm、9,500 rpm、および8,000 rpmで均質化処理を行って得られたエマルシ
ョンでは、それぞれ、液滴1個あたり平均で1個、1.5個、および4.8個の遺伝子エ
レメントが存在し、攪拌だけを行って得られたエマルションでは、液滴1個あた り平均で14個の遺伝子エレメントが存在する。in vitro翻訳反応混合物にデオキ
シコール酸ナトリウム（0.5 %）を添加しても、破壊されたエマルション中で観 察されるDHFR活性には有意な変化が現れない。
【０１３８】 実施例5 高分子量タンパク質を介した遺伝子エレメントへの固定化基質のリンケージ folA遺伝子を含有するDNA断片に多数の固定化基質分子をリンクするために、D
NA断片をまずビオチニル化し、次に、アビジンとアポフェリチンとの複合体にカ
ップリングさせる。ウマ脾臓アポフェリチンは、直径12.5 nmの大きなほぼ球形 のタンパク質分子であり、従って、基質を用いて誘導体化できる多数の部位を提
供する（例えば、表面リシンのε-アミノ基）。プライマーLMB3および5'ビオチ ニル化LMB2（LMB2-ビオチン）を用いて、大腸菌 DHFRをコードするpGEM-folAプ ラスミドをPCR増幅し、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10 翻訳開始部位、およびfolA遺伝子を含有するビオチニル化649bp DNA断片を形成 する（実施例３を参照）。500 μl PCR反応混合液に100 μCi [α-32P]dCTP（Am
ersham; 3000 Ci/mmol）を添加することにより、DNAを放射能標識する。Wizard
PCR Prep（Promega）を用いてビオチニル化PCR断片を直接精製し、分光学的に濃
度を測定する。ストレプトアビジンM-280ダイナビーズ（Dynal）に結合させ、シ
ンチレーション計数を行うことにより、ビオチニル化DNAのパーセンテージをア ッセイする。この方法を用いて、DNAの83%が、ビオチニル化されていることが判
明した。
【０１３９】 Kadir及びMoore, 1990に記載されているように、アビジン‐フェリチンのPBS 溶液（1 mg/ml）を、0.12 Mチオグリコール酸、pH 4.25で一晩透析し（4℃）、 続いて、PBSで24時間透析することにより（4℃）、アビジンとフェリチンとのコ
ンジュゲートの市販品（Avidin-Ferritin；アビジン1モルあたりフェリチン約1.
1モル；Sigma）から遊離（sequestered）の鉄を除去する。吸収スペクトルを解 析することにより、鉄が除去されたかを調べる（遊離Fe(III）は310〜360 nmに 強い吸収を示す）。
【０１４０】 種々のモル比でアビジン‐アポフェリチンを含むPBS溶液（全体積9 μl）と共
に、0.3 pmoleの放射能標識されたビオチニル化DNAを室温で30分間インキュベー
トする。4.5 μlアリコートを採取し、Bermanら, 1987に記載されているように 、1.5 %アガロースゲル上でバンドシフトアッセイを行い、アビジン‐アポフェ リチンと複合体化したDNAのパーセンテージを調べる。次に、ゲルを乾燥させ、P
hosphorImager（Molecular Dynamics）を用いてスキャンする。シフトしないま まの（すなわち、アビジン‐アポフェリチンと複合体化しない）DNAのパーセン テージは、17 %（アビジン‐アポフェリチン：DNAのモル比1:1）、15 %（アビジ
ン‐アポフェリチン：DNAのモル比5:1）、または14%（アビジン‐アポフェリチ ン：DNAのモル比25:1）である。このことは、アビジン‐アポフェリチン：DNAの
モル比が1:1の場合でさえも、基本的にすべてのビオチニル化DNAが結合すること
を意味する。ビオチニル化DNAをアポフェリチンと混合した場合、または非ビオ チニル化DNAをアビジン‐アポフェリチンと混合した場合、バンドシフトは観察 されない。
【０１４１】 アビジン‐アポフェリチンと複合体化されたDNAの残りの4.5 μlを、in vitro
転写／翻訳反応液（E. coli S30 Extract System for Linear Template; Promeg
a）25 μlに対する鋳型として使用する。25℃において2時間後にピューロマイシ
ン（125 μg/ml）を含有する緩衝液A 100 μlを添加することにより、反応を停 止させる。上述したように、10分間にわたり経時でNADPHからNADPへの酸化を340
nmにおいて分光学的にモニターすることにより、ジヒドロ葉酸レダクターゼ活 性をアッセイする。
【０１４２】 各in vitro翻訳反応液10 μlを、緩衝液A 150 μlおよびNADPH（1 mM）20 μl
に添加する。1分後、ジヒドロ葉酸（1 mM）20 μl（実施例1に記載されているよ
うに、エマルションを破壊し、0.5 ml EDTA（50 mM）および2 ml水飽和ジエチル
エーテルで反応を停止させた）を添加し、ThermoMaxマイクロプレートリーダー （Molecular Devices）を用いて340 nmで反応をモニターする。アビジン‐アポ フェリチン：DNA比が最大のときでさえも、アビジン‐アポフェリチンが添加さ れていない対照と比較して、DHFR活性に差異は見られない。このことは、in vit
ro翻訳の効率を低下させることなくDNAの大多数を複合体化させることができる ことを示唆する。
【０１４３】 実施例6 in vitro転写‐翻訳とDHFR活性は共に同一の系で適合性を示す。 共役した転写‐翻訳によりin situで産生されるDHFRの活性に対して選択を行 うために、転写‐翻訳反応およびDHFRはいずれも、同一の緩衝系で活性でなけれ
ばならない。 340 nmにおいてNADPHからNADPへの酸化を分光学的にモニターすることに基づ いて、完全な大腸菌 in vitro翻訳系におけるDHFR活性を直接アッセイすること は、S30抽出物の濁度が原因で、実用的でない。
【０１４４】 しかしながら、DHFRがin vitro翻訳と同じ緩衝系中で活性であることを確認す
ることはできる。プラスミドpGEM-folAを含有する細菌のIPTG誘発、およびメト トレキセート‐セファロースカラムを用いたアフィニティー精製により、大腸菌
DHFRが得られる（Baccanariら, 1977）。
【０１４５】 上述の緩衝液A中、またはS30画分の代わりにS30透析緩衝液（Lesley 1995）（
10 mM Tris‐アセテート pH 8.0、14 mM酢酸マグネシウム、60 mM酢酸カリウム 、1 mM DTT）を用いること以外は完全であるin vitro翻訳混合物中において、DH
FR活性を比較する。いずれの場合においても、全反応液の体積は200 μlである 。実施例1に記載されているように、エマルションを破壊し、0.5 ml EDTA（50 m
M）および水飽和ジエチルエーテル2 mlをそれぞれ0.1 mMで用いて反応を停止さ せた。340 nmで反応を分光学的にモニターする。1.75 pmole (1.3 m単位)の大腸
菌 DHFRを添加したとき得られる初期速度は、-25.77 mOD/分（緩衝液A）および-11
.24 mOD/分（翻訳緩衝液）であり、従って、翻訳緩衝液中での反応効率は、最適
化緩衝液（緩衝液A）中での反応効率の44 %である。
【０１４６】 更に、DHFRの基質（NADPHおよびH2F）が0.1 mM濃度で存在しても（単独または
併用のいずれにおいても）、2時間の共役転写‐翻訳反応からの活性DHFRの産生 はまったく阻害されない。
【０１４７】 実施例7 固定化ジヒドロ葉酸基質を含有する遺伝子エレメントに対するDHFRの活性によ
り、DHFRをコードする核酸に結合したテトラヒドロ葉酸産物が形成される。 γ-カルボキシレートを介して結合した3個のグルタミン酸を含んでなるペプチ
ドを合成する（出発物質としてN-フルオレニルメトキシカルボニル-グルタミン 酸α-ベンジルエステルを使用する）。このペプチドは、カルボキシ末端にリシ ンを有し、更に、文献記載の手順（Krumdiekら, 1980）に変更を加えることによ
り、そのε-アミノ基にビオチンが結合する。アミノ末端に葉酸を結合し、既に 報告されているように、ベンジルおよびトリフルオロアセトアミド保護基をアル
カリ加水分解により除去する。このペプチドを逆相HPLCにより精製し、質量分析
法およびUV分光法により特性付けする。文献記載の手順（Zakrzewskiら., 1980 ）を適用することにより、この葉酸ペプチドを化学的に還元して、対応するジヒ
ドロ葉酸ペプチドとし（ジチオネートおよびアスコルビン酸を用いる）、更に、
対応するテトラヒドロ葉酸ペプチドとする（水素化硼素ナトリウムを用いる）。
これらの変換を、UV分光法により特性付けする。
【０１４８】 プライマーLMB2-ビオチン（配列番号9）およびLMB3を用いてプラスミドpGEM-f
olAからPCR増幅された、DHFRをコードするDNA 1分子と共に、平均で2〜3分子の 葉酸ペプチドをアビジン（またはストレプトアビジン）に結合させることによっ
て、遺伝子エレメントを構築する（実施例３を参照されたい）。固定化された葉
酸をジチオネートおよびアスコルビン酸を使用して化学的に還元してジヒドロ葉
酸とし、緩衝液Aで透析することにより精製する。プラスミドpGEM-folAを含む細
菌のIPTG誘発をおこなって、大腸菌DHFRを産生し、メトトレキセート‐セファロ
ースカラムを用いてアフィニティー精製する。0〜10 μMのアビジン結合ジヒド ロ葉酸ペプチドおよび0〜50 μMのNADPHを用いて、NADPHからNADPへの酸化を分 光学的にモニターすることにより、大腸菌DHFRが、この遺伝子エレメントに固定
されたジヒドロ葉酸と反応することが示される。従って、この反応の最後で、産
物テトラヒドロ葉酸は、その生成を触媒する酵素（すなわち、DHFR）をコードす
るfolA遺伝子に結合される。
【０１４９】 テトラヒドロ葉酸産物に結合されたこれらの遺伝子を単離する方法は2つある 。第1の方法は、テトラヒドロ葉酸に特異的なファージディスプレイ抗体を形成 するものである（Hoogenboom, 1997）。第2の方法は、固定化産物とは特異的に 反応するが基質とは特異的に反応しないタグ付け試薬の使用に基づくものである
。本発明者らは、14原子スペーサーを介してベンズアルデヒドに結合したジニト
ロフェニル(DNP)タグからなる分子を合成した。アルデヒド基は、テトラヒドロ 葉酸と特異的に反応して共有結合付加物を形成し（Kallen及びJenchs, 1966）、
抗DNP抗体を用いてアフィニティー精製を行うことができる。
【０１５０】 実施例8 DHFR活性に対して選択を行う代替法 酵母アルデヒドデヒドロゲナーゼにより触媒され、「タグ付け」された基質を
用いて行われる第2の反応に、in situで共役させることにより、DHFR触媒反応に
対して選択を行うことができる。 DHFR反応の産物の1つ（5,6,7,8-テトラヒドロ葉酸またはNADP+）に結合された
遺伝子に対して選択を行う代わりに、DHFR反応を第2の反応に共役させる。この 場合の選択は、DHFR触媒反応の第2の産物‐ニコチンアミドアデニンジヌクレオ チドリン酸(NADP+)の生成を媒介させて行われる。
【０１５１】 共役させるために本発明者らが選んだ反応は、酵母アルデヒドデヒドロゲナー
ゼ（YAD; EC 1.2.1.5）により触媒される。この酵素は、広範にわたる脂肪族お よび芳香族アルデヒドからそれらの対応するカルボン酸への酸化の際にNAD+また
はNADP+のいずれかを使用し、このプロセスでNADHまたはNADPHを生成する。この
反応には、本質的に不可逆的であるという大きな利点がある。すなわち、デヒド
ロゲナーゼ（DHFRおよびYADを含む）は、酸をアルデヒドに戻す還元を触媒しな い。酸化還元反応を触媒する酵素の中にはNAD+またはNADP+を生成するものが非 常に多く存在するので、こうした酵素の選択にYAD反応を利用することもできる 。従って、この反応は、ジヒドロ葉酸レダクターゼに対する選択だけに限定され
るものではない。
【０１５２】 ペンタアルデヒド基質を合成し、C20リンカーを介してDNP（ジニトロフェニル
）タグに結合させる（これ以降ではDNP-PAと記す）。DNP-PAから対応する酸（DN
P-PC）への酸化を、HPLC（逆相C18カラム；H2O/CH3CN勾配＋0.1 %トリフルオロ 酢酸；保持時間：DNP-PA、5.0分；DNP-PC、4.26分）で追跡する。DNP-PAからDNP
-PCへの変換は、YADおよびNADP+の両方の存在下でのみ観察される。また、反応 を分光学的に追跡する。340 nmの吸収の増大により、NADP+がNADPHへ同時に変換
されることが分かる。
【０１５３】 同じHPLCアッセイを用いて、共役DHFR‐YAD反応を追跡する。最初の反応混合 物は、pH 7.7の緩衝液（100 mMイミダゾール、5 mM β-メルカプトエタノール、
および25 mM KCl）中に、DHFRに対する基質‐NADPH（50 μM）および7,8-ジヒド
ロ葉酸（H2F; 50 μM）、YAD（Sigma, 0.5単位）、ならびにDNP-PA（50 μM）を
含むものであった。DNP-PAからDNP-PCへの変換は、DHFRを上記反応混合物に添加
した場合に観察される（DHFR 5 nM、83 %；1.25 nM、14.5 %、32分後）。
【０１５４】 コンパートメント化in vitro翻訳で得られるDHFRの濃度は、実際には、5 nMを
はるかに超える（実施例4を参照されたい）。DHFRの不在下、または酵素の強力 な阻害剤であるメトトレキセート(MTX)の存在下（10 μM）では、DNP-PAからDNP
-PCへの変換は無視できる。従って、これにより第2の産物DNP-PCの形成がDHFRの
存在にリンクされる。 この共役反応を使用すると、i) DNP-PAのカルボキシル化（carboxylic）産物 に特異的に結合する抗体に遺伝子をリンクさせ、更に、ii) 抗DNP抗体を用いた アフィニティー精製によりこれらの遺伝子を単離することによって、DHFR活性を
与えるタンパク質を選択することができる。
【０１５５】 このアプローチは、catELISAに基づく通常のイムノアッセイによって行われる
（Tawfikら, 1993）。抗ウサギ免疫グロブリン（Sigma, 10 μg／ウェル）でマ イクロタイタープレートをコーティングし、続いて、グルタル酸誘導体に特異的
に結合するウサギモノクロナール血清（Tawfikら, 1993）（リン酸緩衝塩類溶液
＋1 mg/ml BSAで1:500に希釈）でコーティングする。プレートを洗浄し、BSAで ブロックする。上記の共役反応混合物をTris/BSA緩衝液（50 mM Tris、150 mM塩
化ナトリウム、10 mg/ml BSA、pH 7.4）中に希釈し、1時間インキュベートする 。プレートを洗浄し、同じ緩衝液で希釈（1:10,000）された抗DNP抗体（マウス モノクローナルSPE21.11）を添加し、1時間インキュベートする。プレートを洗 浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（Jackson）を添加し、続いて、ペル オキシダーゼ基質（BM Blue; Boehringer Mannheim）を添加する。DHFR（H2F、N
ADPH、YAD、およびDNP-PAに加えて）を含有する共役反応サンプルの場合のみ、 特異的シグナルが観察される。
【０１５６】 高度に特異的な抗カルボン酸抗体（Tawfikら, 1993）を使用し、2つの様式で 選択を行う。 第1に、実施例5に記載されているように、高分子量アビジン（またはストレプ
トアビジン）含有複合体に抗カルボン酸抗体を化学的に結合させる。実施例5に 記載されているように、DHFRをコードするビオチニル化DNAは、アビジン‐ビオ チン相互作用を介して、この複合体に結合する。次に、YADおよびタグ付けYAD基
質、例えば、DNP-PA、をも含有するコンパートメント化共役転写／翻訳系で、こ
の複合体を使用する。コンパートメント中にDHFR活性が存在すれば、DNP-PAがDN
P-PCに変換される。高分子量複合体を介してDNAに結合した抗カルボン酸抗体は 、DNP-PC分子のみを捕獲し、アルデヒド分子を捕獲しない。次に、活性DHFRを含
有する（従ってコンパートメントあたり１分子のDNAのみが存在するならば活性D
HFRをコードする）こうしたコンパートメントから得られるDNAを、抗DNP抗体を 使用することによりアフィニティー精製する。
【０１５７】 第2の様式では、DHFRをコードするビオチニル化DNAに容易に結合させることの
できる高分子量複合体中に、多数のストレプトアビジン分子を結合させる（実施
例5を参照されたい）。YADおよびYAD基質、例えば、MeNPOC‐ビオチン‐ベンズ アルデヒド、をも含有するコンパートメント化共役転写／翻訳系で、この複合体
を使用する。MeNPOC‐ビオチン‐ベンズアルデヒド中のビオチン基は、「ケージ
化」されている（Sundbergら, 1995; Pirrung及びHuang, 1996）。すなわち、光
照射により光除去性ニトロベンジル基が切断除去されるまで、アビジンまたはス
トレプトアビジンをこのビオチン基に結合させることはできない。コンパートメ
ント中にDHFR活性が存在する場合、MeNPOC‐ビオチン‐ベンズアルデヒドはMeNP
OC‐ビオチン‐安息香酸に変換される。コンパートメント化反応をしばらくの間
行った後、反応液に光を照射してニトロベンジル基を除去すれば、この化合物は
ストレプトアビジン‐DNA複合体に結合するであろう。活性DHFRを含有する（従 ってコンパートメントあたり１分子のDNAのみが存在するならば活性DHFRをコー ドする）こうしたコンパートメント中のDNAを、ビオチン‐安息香酸（ビオチン ‐ベンズアルデヒドの代わりに）で複合体化し、固定化抗安息香酸抗体を用いア
フィニティー精製することができる。
【０１５８】 NAD+またはNADP+からNADHまたはNADPHへの酸化を触媒することのできる他の酵
素がin vitro転写／翻訳系に存在すると、ある状況下では、コンパートメント化
in vitro転写／翻訳系で直接選択を行うためにこのYAD系を使用することが困難 になる可能性がある。この場合には、先に述べた2段階コンパートメント化系を 使用して選択を行う。すなわち、最初に、コンパートメント中でDHFRを翻訳し、
次に、同じコンパートメント中で好適なアフィニティータグを用いてDNAにリン クさせる。エマルションを破壊し、コンパートメント中の内容物をプール化し、
DNA分子の一端に結合したジゴキシゲニン「タグ」に特異的な抗体を用いて、DNA
をアフィニティー精製し、転写／翻訳系の他の成分（混在する酸化還元酵素など
）から分離する。次に、pH 7.7の緩衝液（100 mMイミダゾール、5 mM β-メルカ
プトエタノール、および25 mM KCl）中に、DHFRに対する基質‐NADPH（50 μM）
および7,8-ジヒドロ葉酸（H2F; 50 μM）、YAD（Sigma, 0.5単位）、ならびにDN
P-PA（50 μM）を含んでなる反応混合物中に、結合したDHFRタンパク質と共に、
精製されたDNA分子を添加し、更に、コンパートメント1個あたり1分子だけ、ま たはせいぜい数分子のDNAが含まれるように乳化を行うことにより、反応液を再 度コンパートメント化する。上記の2つの様式のうちのいずれにおいても抗カル ボン酸抗体（Tawfikら, 1993）を使用して選択を行う。
【０１５９】 実施例9 遺伝子産物による遺伝子エレメントのメチル化 油中水型エマルションの水性コンパートメント中でin vitro転写／翻訳により
産生されるDNAメチルトランスフェラーゼは、それをコードするDNA分子を該コン
パートメント中でメチル化する。
【０１６０】 本明細書中に記載のコンパートメント化系を用いて結合活性または触媒活性を
有するタンパク質の選択を行うには、以下の2つの基本的要件が必要である。i)
油中水型エマルションの水性コンパートメント中において、選択されるタンパク
質をコードするDNA1分子（または多くとも数分子）が、共役転写／翻訳系により
生物学的に活性な形態で発現される。ii) 選択されるタンパク質は、後続のステ
ップでそれを選択できるように、それをコードする遺伝子エレメントを改変でき
るものでなければならない。この実施例では、共役転写／翻訳系を用いて油中水
型エマルション系の水性コンパートメント中で効率的に産生される一群のタンパ
ク質‐DNAメチルトランスフェラーゼ（タイプII）について説明する。更に、in
vitroで翻訳されたDNAメチルトランスフェラーゼは、それをコードするDNA分子 を水性コンパートメント中でin situで効率的に改変し、結果として、それらの 選択および増幅を可能にする。シトシンのC5位をメチル化することによってDNA 分子上の標的部位を改変し、これにより、同種の（cognate）制限エンドヌクレ アーゼによる開裂に対する耐性を標的部位に付与する（すなわち、M.HhaIに対す
るHhaIおよびM.HaeIIIに対するHaeIII）。従って、メチル化DNAは、制限エンド ヌクレアーゼ開裂に対する耐性を有するため、非メチル化DNAと区別することが できる。
【０１６１】 M.HhaIをコードする遺伝子は、Haemophilus parahaemolyticus（ATCC 10014）
から直接得られたオリゴヌクレオチドHhaI-Fo2SおよびHhaI-Bcを用いて、PCRに より増幅する。M.HaeIIIをコードする遺伝子は、Haemophilus influenzae（バイ
オグループaegyptius）（ATCC 11116）から直接得られたオリゴヌクレオチドHae
III-Fo2SおよびHaeIII-Bc（配列番号4）を用いて、PCRにより増幅する。HindIII
およびKpnIで消化させたベクターpGEM-4Z（Promega）のlacプロモーターおよびT
7 RNAポリメラーゼプロモーターの下流に両方のPCR断片をクローニングする。オ
リゴヌクレオチドHhaI-BcおよびHaeIII-Bc（配列番号4）は、メチルトランスフ ェラーゼ遺伝子開始コドンの上流に、有効なファージT7遺伝子10翻訳開始部位を
付加する。オリゴヌクレオチドHhaI-Foは、それぞれM.HhaIおよびM.HaeIIIに対 する基質として機能するHha Iメチル化／制限部位（M/R）およびHaeIII（/NotI ）部位を付加する。オリゴヌクレオチドHaeIII-Foは、M.HaeIIIに対する基質と して機能するNotI/HaeIII M/R部位を付加する（M.HaeIII遺伝子には、既に、2つ
の内部HhaI M/R部位が含まれている）。DNA配列決定により、正しいヌクレオチ ド配列を有するクローンであることを確認する。
【０１６２】 上記のプライマーLMB2-ビオチン（配列番号9）およびLMB3-DIG（配列番号10）
を用いて、上述したpGEM-M.HhaIおよびpGEM-M.HaeIIIプラスミドをPCRにより増 幅し、1167塩基対のDIG-M.HhaI-ビオチンまたは1171塩基対のDIG-M.HaeIII-ビオ
チンDNA断片を作製する。この断片は、一端がビオチンで、また他端がジゴキシ ゲニンで標識され、更に、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子
10翻訳開始部位、メチルトランスフェラーゼ遺伝子、ならびにHaeIIIおよびHhaI
のM/R部位を有する。Wizard PCR Preps（Promega）を用いてPCR断片をそれぞれ 直接精製する。
【０１６３】 鋳型としてそれぞれプラスミドpMB1（Betlachら, 1976）およびpLB1（Bouguel
eretら, 1984）、メチルトランスフェラーゼ遺伝子リボソーム結合部位の上流に
ファージT7遺伝子10翻訳開始部位およびLMB3を付加するバックプライマー（EcoR
I-BcまたはEcoRV-Bc）、及びLMB2を付加するフォワードプライマー（EcoRI-Foま
たはEcoRI-Fo）を用いて、M.EcoRIおよびM.EcoRVの共役in vitro転写‐翻訳に必
要な遺伝子をPCRにより増幅する。上述したようにプライマーLMB2-ビオチン（配
列番号9）およびLMB3-DIG（配列番号10）を用いて、これらの断片をPCRにより更
に増幅し、DIG-M.EcoRI-ビオチンおよびDIG-M.EcoRV-ビオチンDNA断片を作製す る。得られた断片は、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻
訳開始部位、メチルトランスフェラーゼ遺伝子、ならびにEcoRIおよびEcoRVのM/
R部位を有する。Wizard PCR Preps（Promega）を用いてこれらのPCR断片をそれ ぞれ直接精製する。
【０１６４】 線状鋳型用にデザインされた原核in vitro共役転写／翻訳系中で、上記のPCR 増幅DNAメチラーゼ遺伝子を発現させる（Lesleyら, 1991）。この系の市販品を 用い（E. coli S30 Extract System for Linear Templates; Promega）、これに
T7 RNAポリメラーゼおよびS-アデノシルメチオニン（SAM）を濃度80 μMで追加 する。 Boehringer-Mannheim DIG-ビオチンELISAまたは放射能標識DNA断片およびスト
レプトアビジン被覆磁性ビーズを用いて、同種制限酵素による開裂に対するDIG およびビオチン標識DNA断片の耐性を測定することにより、メチル化のアッセイ を行う。以下に記載されているように共役in vitro転写‐翻訳によりin situで 反応させるDIG-ビオチン標識断片含有in vitro反応混合物を、1xW&B緩衝液（1M
NaCl、10 mM Tris、1 mM EDTA、pH 7.4）＋0.1 % Tween-20で希釈し（このアッ セイにおけるDIG／ビオチン標識DNAの濃度は、0〜250 pMの範囲である）、スト レプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（高容量）中で30〜60分間インキ
ュベートする。プレートを洗浄し（2xW&Bで3回、最後に、50 mM Tris pH 7.4＋5
mM MgCl2で洗浄）、制限酵素（NEB）を添加し（対応する緩衝液0.2 ml中に10〜
50単位の酵素を含む）、37℃で3〜12時間インキュベートする。プレートを洗浄 し、ペルオキシダーゼ結合抗DIG抗体（PBS＋0.1 % Tween-20＋2 mg/ml BSAで1:1
,500に希釈したもの）を40〜60分間にわたり添加し、続いて、ペルオキシダーゼ
基質（BM Blue; 70 μl／ウェル）を添加する。0.5 M H2SO4（130 μl／ウェル ）でクエンチした後、吸光度（450マイナス650 nmで）を測定する。
【０１６５】 放射能アッセイを行うために、プライマーLMB2-ビオチン（配列番号9）および
LMB3ならびにα-P32-CTPを用いて、上記のプラスミドおよびPCR断片をPCRにより
増幅し、一端がビオチンで標識化されたP32標識DNA断片を作製する。この断片に
は、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳開始部位、メチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子、ならびに関連M/R部位が含まれる。Wizard PCR Pr
eps（Promega）を用いてこれらのPCR断片を直接精製する。共役in vitro転写‐ 翻訳によりin situで反応させたビオチン-P32-標識DNA含有反応混合物を、1xW&B
緩衝液＋0.1 % Tween-20で希釈し、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズ（Dynal,
M-280; 1〜5×106個のビーズ）と共に30〜60分間インキュベートする。ビーズを
分離し、洗浄する（2xW&B＋0.1 % Tween-20＋3 % BSAで3回、最後に、50 mM Tri
s pH 7.4＋5 mM MgCl2で洗浄）。制限酵素（NEB）を添加し（対応する緩衝液50 〜150 μl中に10〜50単位の酵素を含む）、37℃で5〜20時間インキュベートする
。上清を除去し、ビーズを洗浄し、水100 μl中に再懸濁させる。ビーズ上およ び上清中の放射能標識DNAの量をシンチレーション計数により測定する。
【０１６６】 本明細書中に記載の4つのメチラーゼ‐M.HaeIII、M.HhaI、M.EcoRI、およびM.
EcoRV‐はすべて、in vitro共役転写／翻訳において発現され、活性である。更 に、in vitroで翻訳されたメチラーゼは、それ自体の遺伝子をメチル化すること
により、同種メチラーゼによる開裂（自己メチル化）に対する耐性を付与するこ
とができる。メチラーゼ遺伝子の共役in vitro転写‐翻訳およびそのメチル化の
両方のプロセスは、同じ反応混合物中で効率的に進行する。より詳細には、T7 R
NAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳開始部位、メチルトラン
スフェラーゼ遺伝子、ならびにすべての4つのメチラーゼのM/R部位を含むDNA断 片（濃度0.5〜10 nM）は、同種制限エンドヌクレアーゼによる開裂に対して耐性
を示すようになる。例えば、M.EcoRIメチルトランスフェラーゼをコードするDNA
断片は、E. coli S30 Extract System for Linear Templates (Promega)、SAM（
80 μM）、およびT7 RNAポリメラーゼと共にインキュベートした場合、EcoRIに よる開裂に対して耐性を示すようになる（25℃で20〜90分後に75〜100 %）。メ チル化の結果としての開裂に対する耐性は、選択性および特異性があり、同じ条
件下において、HhaIまたはM.EcoRVによる開裂に対する耐性は観察されず、更に 、翻訳を抑制した場合（例えば、ピューロマイシンの存在下またはT7 RNAポリメ
ラーゼの不在下）、EcoRIによる開裂に対する耐性も観察されない。上述したよ うにDIG‐ビオチンELISAまたはビオチン-P32-標識DNA断片を用いて残存遺伝子を
アッセイする場合にも同様な結果が得られる。in transのメチル化、すなわち（
同種メチラーゼをコードするもの以外の）M/R部位を付加するDNA断片のメチル化
も、メチラーゼをコードする遺伝子の存在下で、大腸菌S30共役in vitro転写‐ 翻訳系において観察される。
【０１６７】 メチラーゼ遺伝子の共役in vitro転写‐翻訳およびその自己メチル化の両方の
プロセスは、油中水型エマルションの水性コンパートメント中で効率的に進行す
る。より詳細には、T7 RNAポリメラーゼプロモーター、ファージT7遺伝子10翻訳
開始部位、メチルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、M.HhaI）、ならびにHaeI
II、HhaI、およびEcoRIのM/R部位を有するDNA断片（濃度0.1〜10 nM）を、SAM（
80 μM）およびT7 RNAポリメラーゼの存在下で、E. coli S30 Extract System f
or Linear Templates (Promega)に添加する。実施例1に記載したように、Ultra-
Turrax T25分散機を用いて20,000 rpmで1分間均質化処理することにより、氷冷 反応混合物を乳化し、25〜30℃で0〜180分間インキュベートする。反応を停止し
、水性相を分離し（実施例1を参照されたい）、上述したようにDIG-ビオチンま たはビオチン-P32-標識DNA断片のメチル化のアッセイを行う。60〜180分間のイ ンキュベーションを行った後、HhaIによる開裂に対してコンパートメント化遺伝
子の20 %までのメチル化が観察される。調製直後に氷冷エマルションを破壊し、
エーテル抽出により反応をクエンチした場合（「0分後」）、耐性は観察されな い。メチル化は選択的であり、同じ条件下で、HaeIIIまたはEcoRIによる開裂に 対する耐性は観察されない。更に、P32-標識DNA断片のアッセイから、M.HaeIII およびM.HhaIの両方の自己メチル化が、コンパートメント1個あたり平均で1個未
満の遺伝子に対応する遺伝子濃度において進行することが分かった（0.1〜0.5 n
M；実施例4を参照されたい）。従って、メチラーゼ遺伝子の共役in vitro転写‐
翻訳およびその自己メチル化は、油中水型エマルションの水性コンパートメント
中にわずか1個の遺伝子エレメントが存在する場合でさえ、効率的に進行する。
【０１６８】 M.HaeIII遺伝子の共役転写／翻訳から得られるHaeIIIメチラーゼ活性は、攪拌
だけを行った場合、および実施例1に記載されているように、攪拌した後で更に 、Ultra-Turrax T25分散機を用いて8,000 rpm、9,000 rpm、または13,500 rpmで
1分間均質化処理した場合に得られる、より大きなマイクロカプセルにおいても 測定される。結果は、図2bに示されている。使用したM.HaeIII遺伝子の濃度（2.
5 nM）において、13,500 rpm、9,500 rpm、および8,000 rpmで均質化処理を行っ
て得られたエマルションでは、液滴1個あたり平均でそれぞれ1個、1.5個、およ び4.8個の遺伝子エレメントが存在し、攪拌だけを行って調製されたエマルショ ンでは、液滴1個あたり平均で14個の遺伝子エレメントが存在する。in vitro翻 訳混合物に、アニオン性界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウムを、
典型的には0.5 % (w/v)となるように添加すると、エマルション中でメチル化さ れる遺伝子エレメントのパーセンテージが有意に増大する。
【０１６９】 実施例10 油中水型エマルションの水性コンパートメント中で自己メチル化を行った後、
DNAメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子エレメントの選択および増幅 を行うことができる。 DNA‐メチラーゼをコードする遺伝子をメチル化することにより、後続のステ ップでその単離および増幅を行うことが可能になる。メチル化DNAは、制限エン ドヌクレアーゼ開裂に対する耐性を有するため、非メチル化DNAと区別すること ができる。従って、同種制限酵素で処理した後、インタクトなままの遺伝子エレ
メントをPCRにより増幅することができる。しかしながら、同じR/M部位を含むが
メチラーゼをコードしない他の遺伝子が同じ反応混合物中に存在する場合、この
ような選択を行えないことは自明である。なぜなら、（大過剰に存在する）非メ
チラーゼ遺伝子の交差メチル化によって、同種制限酵素による開裂に対する耐性
が付与され、PCRにより増幅可能になると考えられるからである。こうした状況 下では、メチラーゼをコードする遺伝子の選択は、それらがコンパートメント化
されている場合だけ、すなわち、自己メチル化がコンパートメント中における主
要なプロセスとなるように1個のコンパートメント中にわずか1個または数個の遺
伝子が存在する場合だけ、可能になるであろう。メチラーゼ遺伝子を含有しない
コンパートメント中に存在する非メチラーゼ遺伝子はメチル化されないまま残る
ため、交差メチル化は回避される。
【０１７０】 実験に使用した遺伝子は、メチラーゼHaeIIIをコードする1194塩基対のM.HaeI
II断片（DIG-M.HaeIII-3s-ビオチン）および酵素ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DH
FR）をコードする681塩基対のfolA断片（DIG-folA-3s-ビオチン）であり、これ らの断片には更に、HaeIIIおよびHhaI制限／改変部位が含まれている（図1bを参
照されたい）。両方のDNA断片は、一端がジゴキシゲニン（DIG）で、また他端が
ビオチンで標識され、更に、in vitroで発現させるために、T7 RNAポリメラーゼ
プロモーター（T7プロモーター）およびT7遺伝子10翻訳開始部位（rbs）が含ま れる。
【０１７１】 オリゴヌクレオチドHaeHha-PlおよびHaeHha-Mi（配列番号2）（表1）をアニー
ルし、それらをHindIIIおよびEcoRI切断pGEM-4Z（Promega）中にライゲートする
ことにより、pGEM-4Z-3sを作製する。M.HaeIII遺伝子は、オリゴヌクレオチドHa
eIII-FoNC（配列番号3）およびHaeIII-Bc（配列番号4）（表1）を用いてHaemoph
ilus influenzae（バイオグループaegyptius）（ATCC 11116）からPCRにより増 幅する。fol A遺伝子は、プライマーEDHFR-Fo（配列番号5）およびEDHFR-Ba（配
列番号6）（表1）を用いて大腸菌から増幅する。増幅された遺伝子の両方をHind
IIIおよびKpnIで消化し、pGEM-4Z-3s中にクローニングすることにより、発現ベ クターpGEM-HaeIII-3sおよびpGEM-folA-3sを作製する。DIG-M.HaeIII-3s-ビオチ
ンおよびDIG-folA-3s-ビオチン（図1bを参照されたい）は、プライマーLMB2-ビ オチン（配列番号9）およびLMB3-DIG（配列番号10）を用いてPCRによりPfuポリ メラーゼを用いてこれらのベクターから増幅し（20サイクル）、Wizard PCR Pre
ps（Promega）を用いて精製する。HaeIIIメチラーゼ活性のアッセイのために基 質として使用される4つのHaeIII R/M部位を含む942 bpのDNA断片であるDIG-D1.3
-ビオチンを、D1.3 1本鎖Fv遺伝子を含むpUC19誘導体（McCaffertyら, 1990）か
ら上記のように増幅する。プライマーG3FRAG-Fo（配列番号11）およびG3FRAG-Ba
（配列番号12）（表１）を用いてPCRによりTaqポリメラーゼを用いてpHEN1 DNA （Hoogenboomら, 1991）から558 bpのキャリアDNA（g3キャリアDNA；ファージfd
遺伝子IIIの内部断片であり、T7プロモーター、HaeIIIまたはHhaI R/M部位はい ずれも含まれない）を増幅し、フェノール‐クロロホルム抽出およびエタノール
沈降により精製する。このDNA（≧10 nM）を、この実施例中の反応に使用するす
べてのDNAの希釈時、キャリアとして使用した。
【０１７２】 図3は、過剰のfolA遺伝子（DNAをメチル化しないDHFRをコードする）からの、
DNAメチラーゼHaeIIIをコードするM.HaeIII遺伝子の選択を示している。両方の 遺伝子は、基質として作用させるために付加された同じHaeIII R/M配列を有する
（図1b）。エマルションの水性コンパートメント中で翻訳を行った後、メチラー
ゼ遺伝子に結合したHaeIII R/M配列をメチル化する。これらの遺伝子は、HaeIII
エンドヌクレアーゼによる開裂に対する耐性が付与され、続いて、PCRにより増 幅する。他のコンパートメント中に存在するfolA遺伝子は、メチル化されないま
ま残存し、開裂されるので、増幅されない。アガロースゲル電気泳動法によりPC
R産物を分析する。このとき、M.HaeIII遺伝子の濃縮化は、1194 bpバンドの出現
により可視化することができる（図3）。
【０１７３】 E. coli S30 Extract System for Linear DNA（Promega）を用い、これに、g3
キャリアDNA（10 nM）、DNA断片（DIG-M.HaeIII-3s-ビオチンおよびDIG-M.folA-
3s-ビオチン、以下に記載の比率および濃度）、T7 RNAポリメラーゼ（104単位）
、デオキシコール酸ナトリウム（Fluka、0.5 % w/v；乳化反応液の場合のみ）、
およびS-アデノシルメチオニン（NEB、80 μM）を追加する。DNA断片DIG-M.HaeI
II-3s-ビオチンおよびDIG-M.folA-3s-ビオチンを、1:103の比率および全濃度200
pM（図3a）、ならびに1:104〜1:107の比率および全濃度500 pM（図3b）で使用 して、反応を開始する。氷上で50 μlの反応液を調製し、実施例1に記載したよ うに攪拌だけを行って乳化させる。25℃で反応液を2時間インキュベートする。 反応混合物を回収するために、エマルションを3,000 g で5分間回転させ、油相 を除去し、バイアルの底に濃縮エマルションを残す。クエンチング緩衝液（25 μg/ml酵母RNAを含む0.2 mlのW+B緩衝液：1 M NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM EDT
A、pH7.4）および2 mlの水飽和エーテルを添加し、この混合物を攪拌し、短時間
の遠心分離処理にかけ、エーテル相を除去する。水相をエーテルで洗浄してから
乾燥させる（環境温度においてSpeedvac中で5分間）。100 μgのM-280 ストレプ
トアビジンダイナビーズを用いてDNAを捕獲する（環境温度で2時間）。ダイナビ
ーズをW+B緩衝液；2.25 Mグアニジン‐HCl、25 mM Tris-HCl、pH 7.4；W+B緩衝 液；更に、制限緩衝液で2回、逐次洗浄する。ビーズを10単位のHaeIII（またはH
haI）を含有する制限緩衝液100 μl中に再懸濁させ、37℃で5時間インキュベー トする。W+B緩衝液で3回、50 mM KCl、10 mM Tris-HCl、0.1 % Triton X-100、p
H 9.0で2回、ビーズを洗浄し、次いで、1.5 mM MgCl2を追加した同じ緩衝液（PC
R緩衝液）100 μl中に再懸濁させる。ビーズのアリコート（2〜20 μl）を94℃ でプライマーLMB2-ビオチンおよびLMB3-DIGと共に添加されるTaqポリメラーゼを
用いて、PCRにより増幅する（反応液50 μl；94°で1分間、55°で1分間、72° で2分間のサイクル32回）。このDNAをWizard PCR Prepsを用いて精製し、第2ラ ウンドの選択に使用する（1:104および1:105選択のときは20 pM、1:106および1:
107選択のときは500 pM）。ゲル電気泳動および活性アッセイを行うために、そ れぞれLMB2およびLMB3のすぐ内側にアニールするプライマーLMB2-NestおよびLMB
3-Nestを用いて、このDNA（約1 pMに希釈）を更に増幅し（94°で1分間、50°で
1分間、72°で1.5分間のサイクル25回）、上記のように精製する。また、DIGも ビオチンも付加されていないこのDNA（10 nM）を、10 nM DIG-D1.3-ビオチン（4
つのHaeIII R/M部位を含有する942 bp DNA）の存在下においてin vitroで翻訳す
る。実施例9の場合と同様に、DIG-D1.3-ビオチン基質のメチル化をDIG-ビオチン
ELISAにより測定する。
【０１７４】 エマルション中で1:1000の比率のM.HaeIII:folA遺伝子の1ラウンドの選択を行
うと、最終遺伝子比はおよそ1:1になる（図3a）。数種の対照実験から、選択は 上記の機構に従って進行することが示唆される。すなわち、以下の場合にはM.Ha
eIII遺伝子に対応するバンドは観察されない。遺伝子の初期混合物をPCRにより 増幅した場合；溶液（乳化されていない）中で反応を行った後；転写／翻訳の不
在下で乳化した場合（T7 RNAポリメラーゼを除いた場合）；HaeIIIのR/M部位以 外のR/M部位で反応遺伝子を開裂させた場合−例えば、HhaIで消化した後。選択 後のM.HaeIII DNAの収率は、100 %未満である。これは、メチラーゼ活性の不在 下で（T7ポリメラーゼを添加しない場合）大きなfolAバンドが観察されることか
ら示唆されるように、交差メチル化に起因するものではなく、主として、Hae II
Iによる消化が不完全であることに起因する。消化の間、DNAの濃度はHaeIIIのKM
（6 nM）よりもかなり低下し、消化は著しく非効率的になる。
【０１７５】 また、M.HaeIII:folA比率1:104〜1:105から開始して1ラウンドの選択を行った
後、M.HaeIII遺伝子に対応するバンドが見えるようになるが（図3b）、より小さ
い比率では、観察されない。このことから、濃縮率（factor）は少なくとも5000
倍であることが示唆される。従って、大きなプール（例えば、遺伝子ライブラリ
ー）から少数の遺伝子を選択するためには、更なる選択のラウンドが必要である
。第1ラウンドの選択から得られたHaeIII消化および増幅DNAを、第2ラウンドの 選択処理にかけると、M.HaeIII:folA比率1:106〜1:107から開始した場合にもM.H
aeIII遺伝子に対応するバンドが見えるようになった。また、M.HaeIII:folA比率1
:104〜1:105から開始して誘導されたDNAに対しても第2ラウンドの選択を行う。 この場合には、およそ3:1の比率まで更に濃縮され、M.HaeIII遺伝子が多くなる 。選択の各ラウンドの前後で、遺伝子の増幅、in vitro翻訳、および別のDNA基 質との反応を行い、HaeIIIメチラーゼ活性のアッセイを行う。こうしたアッセイ
により、ゲル電気泳動により観察されるM.HaeIII遺伝子の濃縮は、HaeIIIメチラ
ーゼ活性の対応した増加につながることが示される（図3b）。
【表１】
【０１７６】参考文献 Anderson,C.W., Straus,J.W.および Dudock,B.S. (1983) Methods Enzymol, 101
, 635-44. Anderson,J.E. (1993) Curr.Op.Struct.Biol., 3, 24-30. Ash,M.および Ash,I. (1993) Handbook of industrial surfactants. Gower, Al
dershot. Baccanari,D.P., Averett,D., Briggs,C.および Burchall,J. (1977) Biochemis
try, 16,3566-72. Barany,F. (1991) PCR Methods Applic., 1, 5-16. Bass,S., Greene,R.および Wells,J.A. (1990) Proteins, 8. 309-14. Becher,P. (1957) Emulsions: theory and practice. Reinhold, New York. Benita,S.編 (1996). Microencapsulation: methods and industrial applicati
ons. Drugs and pharmaceutical sciences. Edited by Swarbrick,J. New York
: Marcel Dekker. Benner,S.A. (1994) Trends Biotechnol, 12, 158-63. Berman,J., Eisenberg,S.および Tye,B.K. (1987) Methods Enzymol, 155, 528-
37. Betlach,L., Hershfield,V., Chow,L., Brown,W., Goodman,H.M.および Boyer,
H.W.(1976). A restriction endonuclease analysis of the bacterial plasmid
controlling the EcoRI restriction and modification of DNA. Federation P
roceedings 35, 2037-2043. Blattner,F.R.および Dahlberg,J.E. (1972) Nature New Biol, 237, 227-32. Bougueleret,L., Schwarzstein,M., Tsugita,A.および Zabeau,M. (1984). Char
acterization of the genes coding for the Eco RV restriction and modific
a tion system of Escherichia coli. Nucleic Acids Res 12(8), 3659-76. Bru,R.および Walde,P. (1991). Product inhibition of alpha-chymotrypsin i
n reverse micelles. Eur J Biochem 199(1), 95-103. Bru,R.および Walde,P. (1993). Catalytic activity of elastase in reverse
micelles. Biochem Mol Biol Int 31(4), 685-92. Cahill,P., Foster,K.および Mahan,D.E. (1991) Clin Chem. 37, 1482-5. Chakrabarti,A.C., Breaker,R.R., Joyce,G.F.および Deamer,D.W. (1994). Pro
duction of RNA by a polymerase protein encapsulated within phospholipid
vesicles. J Mol Evol 39(6), 555-9. Chamberlin,M.および Ring,J. (1973) J Biol Chem, 248, 2235-2244. Chang.T.M. (1987). Recycling of NAD(P) by muitlenzyme systems immobilize
d by microencapsulation in artificial cells. Methods Enzymol 136(67), 67
-82. Chang,T.M.S. (1992). Recent advances in artificial cells based on microe
ncapsulation. In Microcapsules and nanoparticles in medicine and pharma
cy (Donbrow,M.編), pp.323-339. CRC Press, Boca Raton, Florida. Chapman,K.B.および Szostak,J.W. (1994) Curr.op.Stroct.Biol., 4, 618-622.
Chetverin,A.B.および Spirin,A.S. (1995) Prog Nucleic Acid Res Mol Biol,
51, 225-70. Clackson,T.および Wells,J.A. (1994) Trends Biotechnol, 12, 173-84. Creagh,A.L., Prausnitz,J.M.および Blanch,H.W. (1993). Structual and cata
lytic properties of enzymes in reverse micelles. Enzyme Microb Technol 1
5(5), 383-92. Cull,M.G., Miller,J.F.および Schatz,P.J. (1992) Proc Natl Acad Sci U S A
, 89, 1865-9. Dickinson,E. (1994) In Wedlock,D.J.(編), Emulsions and droplet size cont
rol.Butterworth-Heine-mann, Oxford, Vol.pp.191-257. Ellington,A.D.および Szostak,J.W. (1990) Nature, 346, 81822. Ellman,J., Mendel,D., Anthony,C.S., Noren,C.J.および Schultz,P.G. (1991)
Methods Enzymol, 202, 301-36. Fahy,E., Kwoh,D.Y.および Gingeras,T.R. (1991) PCR Methods Appl, 1, 25-33
. Fields,S.および Song,0. (1989) A novel genetic system to detect protein-
protein interactions. Nature 340, 245-6. Finch,C.A. (1993). Encapsulation and controlled release. Spec.Publ.-R. S
oc.Chem. 138, 35. Fisch,I., Kontermman,R.E., Finnern,R., Hartley,0., Soler,G.A., Griffiths
, A.D.および Winter,G. (1996) ProcNatl Acad Sci U S A, 93, 7761-6. Freese,E. (1959) J.Mol.Biol., 1, 87. Friedberg,E.C., Walker,G.C. および Siede,W. (1995) DNA repair and mutage
nesis. ASM Press, Washington D.C. Gold,L., Polisky,B., Uhlenbeck,0.および Yarus,M. (1995) Annu Rev Biochem
, 64, 763-97. Green,R.および Szostak,J.W. (1992) Science, 258, 1910-5. Gregoriadis,G. (1976) Methods Enzymol, 44, 21 8-27. Griffiths,A.D., Williams,S.C., Hartley,0., Tomlinson,I.M., Waterhouse, P., Crosby,W.L., Kontermann,R.E., Jones,P.T., Low,N.M., Allison,T.J.ら、
(1994) Embo J, 13, 3245-60. Haber,J., Maslakiewicz,P., Rodakiewicz,N.J.および Walde,P. (1993). Activ
ity and spectroscopic properties of bovine liver catalase in sodium bis(
2-ethylhexyl)sulfosuccinate/isooctane reverse micelles. Eur J Biochem 21
7(2), 567-73. Hermanson,G.T. (1996) Bioconjugate techniques. Academic Press, San Diego
. Hochuli,E., Dobeli,H. および Schacher,A. (1987) J Chromatogr. 411, 177-8
4. Hoogenboom,H.R.ら、(1991) Nucl.Acids Res., 91, 4133-4137. Hoogenboom,H.R. (1997). Designing and optimizing library selection strat
egies for generating high-affinity antibodies. Trends Biotechnal. 15, 6
2-70. Hoogenboom,H.R. (1997) Trends Biotechnol., 15, 62-70. Janda,K.D., Lo,L.-C., Lo,C.-H.L., Sim,M., -M., Wang,R., Wang,C.-H.および
Lerner,R.A. (1997) Science, 275, 945-948. Johannsson,A. (1991) In Price,C.P.および Newman,D.J.(編), Heterogeneous
enzyme immunoassays. Stockton Press, New York, Vol.pp.295-325. Johannsson,A.および Bates,D.L. (1988) In Kemeny,D.M.および Challacombe,
S.i. (編), Amplification by second enzymes. John Wiley, Chichester, Vol.
pp.85-106. Joyce,G.F. (1994) Curr.op.Structural Biol., 4, 331-336. Kadir,F.H.および Moore,G.R. (1990) Febs Lett, 276, 81-4. Kallen,R.G.および Jencks,W.P. (1966). The mechanism of the condensation
of formaldehyde with tetrahydrofolic acid. J.Biol.Chem. 241, 5851-5863. Katanaev,V.L., Kurnasov,O.V.および Spirin,A.S. (1995) Febs Lett, 359, 89
-92. Keij,J.F., Groenewegen,A.C.および Visser,J.W.M. (1994) High-speed photod
amage cell sorting: An evaluation of the ZAPPER prototype. Methods in c
ell biology 42, 371-358. Klug,A. (1995) Ann N V Acad Sci, 758, 143-60. KIug,A.および Schwabe,J.W. (1995) Faseb T, 9, 597-604. Kolb,V.A., Makeyev,E.V., Kommer,A.および Spirin,A.S.(1995) Biochem Cell
Biol, 73, 1217-20. Kowalczykowski,S.C., Dixon,D.A., Eggleston,A.K., Lauder,S.D.および Rehra
uer,W.M. (1994) Microbial Rev, 58, 401-65. Krumdiek,C.L.および Baugh,C.M. (1980) Solid-phase synthesis of pteroyl p
olyglutamates. Methods Enzymol. pp.524-529 Kumar,A., Kumar,A.および Katiyar,S.S. (1989). Activity and kinetic chara
cteristics of glutathione reductase in vitro in reverse micellar waterpo
ol. Biochim Biophys Acta 996(1-2), 1-6. Landegren,U., Kaiser,R., Sanders,J.および Hood,L. (1988) Science, 241, 1
077-80. Lesley,S.A., Brow,M.A.および Burgess,R.R. (1991). Use of in vitro protei
n synthetis from polymerase chain reaction-generated templates to study
interaction of Escherichia coil transcription factors with core RHA poly
merase and for epitope mapping of monoclonal antibodies. J Biol Chem 266
(4), 2632-8. Lesley,S.A. (1995) Methods Mol Biol, 37, 265-78 Lesley,S.A., Brow,M.A.および Burgess,R.R. (1991) J Biol Chem, 266, 2632-
8. Leung,D.W., Chen,E.および Goeddel,D.V. (1989) Technique, 1, 11-15. Liao,H., McKenzie,T.および Hageman,R. (1986) Proc Natl Acad Sci U S A, 8
3, 576-80. Lim,F.および Sun,A.M. (1980). Microencapsulated islets as bioartificial
endocrine pancreas. Science 210(4472), 908-10. Lim,F.編、 (1984). Biomedical applications of microencapsulation. Boca R
aton, Florida: CRC Press. Lissant,K.J.編、Emulsions#and#emulsion#technology. Surfactant Science Ne
w York: Marcel Dekker, 1974. Lissant,K.J.編、Emulsions#and#emulsion#technologv. Surfactant Science Ne
w York: Marcel Dekker, 1974. Lissant,K.J.編、Emulsions#and#emulsion#technologv. Surfactant Science Ne
w York: Marcel Dekker, 1984. Low,N.M., Holliger, P.H.および Winter,G. (1996) J Mol Biol, 260, 359-68.
Lowman,H.B., Bass,S.H., Simpson,N.および Wells,J.A. (1991) Biochemistry,
30, 10832-8. Luisi,P.L.および B., S.-H. (1987). Activity and conformation of enzymes
in reverte micellar solutions. Methods Enzymol 136(188). 188-216. Ma,C., Kudlicki,W., Odom,O.W., Kramer,G.および Hardesty,B. (1993) Bioche
mistry, 32, 7939-45. Magdassi,S., Frenkel,M., Carti,N.および Cazan,R. (1984) 97, 377-379. Manley,J.L., Fire,A., Samuels,M.および Sharp,P.A. (1983) Methods Enzymol
, l01,568-82. Mao,Q.および Walde,P. (1991). Substrate effects on the enzymatic activit
y of alpha-chymotrypsin in reverse micelles. Biochem Biophys Res Coｍｍu
n 178(3), 1105-12. Mao,Q., Walde,P.および Luisi,P.L. (1992). Kinetic behaviour of alpha-chy
motryptin in reverse micelles. A stopped-flow study. Eur J Biochem 208(
1), 165-70. Mattheakis,L.C., Bhatt,R.R.および Dower,W.J. (1994) Proc Natl Acad Sci U
S A, 91,9022-6. McCafferty,J., Grifftths,A.D., Winter,G.および Chiswell,D.J. (1990) Natu
re, 348, 552-4. Melton,D.A., Krieg,P.A., Rebagliati,M.R., Maniatis,T., Zinn,K.および Gre
en,M.R. (1984) Nucleic Acids Res, 12, 703556. Mendel,D., Cornish,V.W.および Schultz,P.G. (1995) Annu Rev Biophys Biomo
l Struct, 24, 435-62. Menger,F.M.および Yamada,K. (1979). J.Am.Chem.Soc. 101, 6731-6734. Miele,E.A., Mills,D.R.および Kramer,F.R. (1983) J Mol Biol, 171, 281-95.
Mize,P.D., Hoke,R.A., Linn,C.P., Reardon,J.E.および Schulte,T.H. (1989)
Anal Biochem, 179, 229-35. Montigiani,S., Neri,G., Neri,P.および Neri,D. (1996) J Mol Biol, 258, 6-
13. Moore,M.J. (1995) Nature, 374, 766-7. New,R.R.C.編、(1990). Liposomes: a practical approach. The practical app
raoch series. Edited by Rickwood,D.および Hames,B.D. Oxford: Oxford Univ
ersity Press. Nissim,A., Hoogenboom,H.R. I Tomlinson,I.M., Flynn,G., Midgley,C., Lane,
D.および Winter,G. (1994) Embo J, 13, 692-8. Oberholzer,T., Albrizio,M.および Luisi,P.L. (1995a). Polymerase chain re
action in liposomes. Chemistry and Biology 2, 677-682. Oberholzer,T., Wick,R., Luisi,P.L.および Biebricher,C.K. (1995b). Enzyma
tic RNA replication in self-reproducing vesicles: an approach to a minim
al cell. Biochem Biophys Res Commun 207(1), 250-7. Parmley,S.F.および Smith,G.P. (1988) Gene, 73, 305-18. Pelham,H.R.および Jackson,R.J. (1976) Eur J Biochem, 67, 247-56. Perelson,A.S.および Oster,G.F. (1979) J Theor Biol, 81, 64570. Perez,G.M., Sanchez,F.A.および Garcia,C.F. (1992). Application of aetive
-phase plot to the kinetic analysis of lipoxygenase in reverse micelles.
Biochem J. Pirrung,M.C.および Huang,C.Y. (1996) Bioconjug Chem, 7, 31721. Posner,B.A., Li,L., Bethell,R., Tsuji,T.および Benkovic,S.J. (1996) Bioc
hemistry, 35,1653-63. Roberts,B.E., Gorecki,M., Mulligan,R.C., Danna,K.J., Rozenblatt,S.および
Rich,A. (1975) Proc Natl Acad Sci U S A, 72, 1922-6. Roberts,J.W. (1969) Nature, 224, 1168-74. Roberts,R.および Szostak,J. (1997) RNA-peptide fusions for the in vitro
selection of peptides and proteins. Proc Natl Acad Sci USA 94, 12297-123
02. Rosenberg,M., Weissman,S. および decrombrugghe,B. (1975) J Biol Chem. 25
0, 4755-64. Saiki,R.K., Gelfand,D.H., Stoffel,S., Scharf,S.J., Higuchi,R., Horn,G.T.
, Mullis,K.B.および Erlich,H.A. (1988) Science, 239, 487-91. Sambrook,J., Fritsch,E.F.および Maniatis,T. (1989) Molecular cloning: a
laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Savage,M.D., Mattson,G., Desai,S., Nielander,G.W., Morgensen,S.および Co
nklin,E.J. (1994) Avidin-biotin chemistry: a handbook. Pierce Chemical C
ompany, Rockford. Schick,M.J. (1966) Nonionic surfactants. Marcel Dekker, New York. Sherman,P. (1968) Emulsion science. Academic Press, London. Smith,G.P. (1985) Science, 228, 1315-7. Soumillion,P., Jaspers,L., Bouchet,M., Marchand,B.J., Winter,G.および Fa
strez,J. (1994) J Mol Biol, 237, 415-22. Stemmer,W.P. (1994a) Nature, 370, 389-91. Stemmer,W.P. (1994b) Proc Natl Acad Sci U S A, 91, 10747-51. Stofko,H.R., Carr,D.W.および Scott,J.D. (1992) Febs Lett, 302, 274-8. Sun,A.M., Vasek,I.および Tai,I. (1992). Microencapsulasion of living cel
ls and tissues. In Microencapsularion and nanoparticles in medicine and
pharmacy (Donbrow,M.編), pp.315-322. CRC Press, Boca Raton, Florida. Sundberg,S.A., Barrett,R.W., Pirrung,M., Lu,A.L., Kiangsoontra,B.および
Holmes,C.P. (1995) J.Am.CheM.Soc., 117, 12050-12057. Tawfik,D.S., Green,B.S., Chap,R., Sela,M.および Eshhar,Z. (1993). catELI
SA: a facile general route to catalytic antibodies. Proc Natl Acad Sci U
S.A 90(2), 373-7. Tokatlidis,K., Friguet,B., Deville,B.D., Baleux,F., Fedorov,A.N., Navon,
A., Djavadi,O.L.および Goldberg,M.E. (1995) Philos Trans R Soc Lond B B
iol Sci, 348, 89-95. Tripet,B., Yu,L., Bautista,D.L., Wong,W.Y., Irvin,R.T.および Hodges,R.S.
(1996) Protein Engng., 9, 1029-1042. Tuerk,C.および Gold,L. (1990) Science, 249, 505-10. van Hal,D.A., Bouwstra,J.A.および Junginger,H.E. (1996). Nonionic surfac
tant vesicles containing estradiol for topical application. In Microenca
psulation: methods and industrial applications (Benita,S.編), pp.329-347
. Marcel Dekker, New York. Walde,P., Goto,A., Monnard,P.-A., Wessicken,M.および Luisi,P.L. (1994).
Oparin's reactions revisited: enzymatic synthesis of poly(adenylic acid)
in micelles and self-reproducing vesicles. J.Am.Chem.Soc. 116. 7541-754
7. Walde,P., Han,D.および Luisi,P.L. (1993). Spectroscopic and kinetic stud
ies of lipases solubilized in reverse micelles. Biochemistry 32(15), 402
9-34. Walde,P., Peng,Q., Fadnavis,N.W., Battistel,E.および Luisi,P.L. (1988).
Structure and activity of trypsin in reverse micelles. Eur J Biochem 173
(2), 401-9. Walker,G.T., Fraiser,M.S., Schram,J.L., Little,M.C., Nadeau,J.G.および M
alinowski,D.P. (1992) Nucleic Acids Res, 20, 1691-6. Weil,P.A., Luse,D.S., Segall,J.および Roeder,R.G. (1979) Cell, 18, 469-8
4. Whateley,T.L. (1996). Microcapsules: preparation by interfacial polymeri
sation and interfacial complexation and their applications. In Microenc
apsulation: methods and industrial applications (Benits,S.編), pp.349-37
5. Marcel Dekker, New York. Wick,R.および Luisi,P.L. (1996). Enzyme-containing liposomes can endogen
ously produce membrane-constituting lipids. Chem Biol 3(4), 277-85. Widersten,M.および Mannervik,. B. (1995) J Mol Biol, 250, 115-22. Williams,J.W., Morrison,J.F.および Duggleby,R.G. (1979) Biochemistry. 18
, 2567-73. Winter,G., Griffiths,A.D., Hawkins,R.E.および Hoogenboom,H.R. (1994) Ann
u Rev Immunol, 12, 433-55. Wyatt,J.R.1 Chastain,M.および Puglisi,J.D. (1991) Biotechniques, 11, 764
-9. Yamagishi,J., Kawashima,H., Matsuo,N., Ohue,M., Yamayoshi,M., Fukui,T.,
Kotani,H., Furuta,R., Nakano,K.および Yamada,M. (1990) Protein Eng. 3, 7
13-9. Yelamos,J., Klix,N., Goyenechea,B., Lozano,F., Chui,Y.L., Gonzalez,F.A.,
Pannell,R., Neuberger,M.S.および Milstein,C. (1995) Nature, 376, 225-9.
Zaccolo,M., Williams,D.M., Brown,D.M. および Gherardi,E. (1996) J Mol Bi
ol, 255, 589-603. Zakrzewski,S.F. (1980) Preparation of tritiated dihydrofolic acid of hig
h specific activity. Methods Enzymol. pp.539-. Zaug,A.J.および Cech,T.R. (1986) Biochemistry. 25, 4478-82. Zaug,A.J.および Cech,T.R. (1986) Science, 231, 470-5. Zaug,A.J., Been,M.D.および Cech,T.R. (1986) Nature, 324, 429-33. Zubay,G. (1973) Annu Rev Genet, 7, 267-87. Zubay,G. (1980) Methods Enzymol, 65, 856-77.
【配列表】
(２)配列番号：１ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：６０塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：２ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：６０塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：３ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：５４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：４ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：８４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：５ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：４９塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：６ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：８２塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：７ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：８ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：９ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１０ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１１ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：２２塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１２ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：２２塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１３ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：４４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１４ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１５ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１６ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：１８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１７ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：６５塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１８ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：８３塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：１９ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：６７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：２０ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：７８塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：２１ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：５４塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：２２ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：７７塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列： (２) 配列番号：２３ (ｉ) 配列の特色 (Ａ) 配列の長さ：５９塩基対 (Ｂ) 配列の型：核酸 (Ｃ) 鎖の数：一本鎖 (Ｄ) トポロジー： 直鎖状 (ii） 配列の種類：他の核酸 （Ａ）説明：／ｄｅｓｃ＝「合成オリゴヌクレオチド」 （iii）ハイポセティカル：Ｎｏ (iv) アンチセンス：Ｎｏ (xi) 配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】 コンパートメント化による遺伝子の選択 ａ 選択手順の概略図 ステップ1において、選択される反応に対する基質にリンクされた遺伝子エレ メントのライブラリーを含んでなるin vitro転写／翻訳反応混合物を分散し、典
型的には、水性コンパートメント1個あたり1個の遺伝子エレメントを有する油中
水型エマルションを形成する。これらのコンパートメント内で、遺伝子エレメン
トの転写および翻訳を行う（ステップ2）。続いて（ステップ3）、酵素活性を有
するタンパク質（またはRNA）により、基質を、遺伝子エレメントにリンクされ たままの産物に変換する。コンパートメント化することにより、他のコンパート
メント中での遺伝子エレメントの改変が防止される。次に（ステップ4）、エマ ルションを破壊し、すべての反応を停止させ、水性コンパートメントを合体させ
る。産物にリンクされた遺伝子エレメントの選択的な濃縮、続いて増幅を行い、
更に、特性付けを行う（ステップ5）、または基質にリンクさせてコンパートメ ント化し、更なる選択のラウンドに供する（ステップ6）。 ｂ HaeIIIメチラーゼによる標的特異性DNAのメチル化に対する選択 基質は、HaeIII制限／改変（R/M）部位を含むDNAの断片である。ストレプトア
ビジン被覆磁気ビーズに結合させることにより遺伝子エレメントを単離し、同種
制限酵素HaeIIIで処理する。メチル化R/M部位を有する核酸だけが開裂に抵抗性 を示し、続いてPCRにより増幅される。
【図２】 a エマルション中の液滴サイズ分布ならびにDHFRおよびHaeIIIメチラーゼの 活性： レーザー回折により測定されるエマルション中の水性コンパートメント
のサイズ分布 攪拌により、または攪拌およびそれに続く8k、9.5k、もしくは13.5k rpmにお ける均質化により、DNAとデオキシコール酸ナトリウムとを含有するin vitro転 写／翻訳反応混合物を乳化する。水性粒子のサイズ分布は、全水性体積のパーセ
ントで示されている。 b エマルションの水性コンパートメント中において該当遺伝子の転写および 翻訳（図1b）によりin situで形成されたDHFRの活性 使用したfolA遺伝子の濃度（2.5 nM）では、最も細かいエマルション（13.5k
rpmで均質化）において液滴1個あたり平均で1個の遺伝子が含まれる。サイズ分 布のデータから計算した平均直径（図2）は、均質化のスピードの関数として表 されている（0k rpmは、更なる均質化を行わずに攪拌により調製したエマルショ
ンを意味する）。活性は、乳化されていないin vitro反応混合物を用いて同じ条
件下で観測された活性のパーセントとして表されている。 エマルションの水性コンパートメント中において該当遺伝子の転写および翻訳
（図1b）によりin situで形成されたHaeIIIメチラーゼの活性 使用したM.HaeIII遺伝子の濃度（2.5 nM）では、最も細かいエマルション（13
.5k rpmで均質化）において液滴1個あたり平均で1個の遺伝子が含まれる。サイ ズ分布のデータから計算した平均直径（図2a）は、均質化のスピードの関数とし
て表されている（0k rpmは、更なる均質化を行わずに攪拌により調製したエマル
ションを意味する）。活性は、乳化されていないin vitro反応混合物を用いて同
じ条件下で観測された活性のパーセントとして表されている。
【図３】 HaeIII DNAメチラーゼについての選択 ａ 1000倍過剰のfolA遺伝子からのM.HaeIII遺伝子の選択 0.2 nMのDIG-folA-3s-ビオチンDNA（コンパートメント1個あたり平均で1個の 遺伝子に相当する）を用いて反応を開始し、0.2 pMのDIG-M.HaeIII-3s-ビオチン
を用いてスパイクした。反応混合物を攪拌により乳化するかまたは溶液状態で放
置した。こうした反応により得られたDNAを採取し、HaeIII（またはHhaI）を用 いて消化し、更に、PCRにより増幅した。プライマーLMB2-NestおよびLMB3-Nest を用いたnested PCRにより、このDNAを更に増幅し、各nested PCRの5マイクロリ
ットルを、臭化エチジウムを含む1.5%アガロースゲルを用いて電気泳動処理にか
けた。マーカー、ΦX174-HaeIII消化物；マイナスT7、T7 RNAポリメラーゼなし ；マイナスNadCH、デオキシコール酸ナトリウムなし。 ｂ 2ラウンド選択 モル比1:104〜1:107のDIG-M.HaeIII-3s-ビオチン：DIG-folA-3s-ビオチン（5
pM）を含有する反応液を攪拌により乳化する。こうした反応により得られるDNA をHaeIIIで消化し、更に、プライマーLMB2-ビオチン（配列番号9）およびLMB3-D
IG（配列番号10）を用いてPCRにより増幅する。比1:104および1:105（20 pM）な
らびに比1:106および1:107（500 pM）の第1ラウンドの選択により得られる増幅 されたDNAを、第2ラウンドの選択に供する。プライマーLMB2-NestおよびLMB3-Ne
stを用いたnested PCRにより、このDNAを更に増幅し、選択の各ラウンドから得 られるnested PCRの5マイクロリットルを、上述したように電気泳動法により分 析する（上側パネル）。同じDNAをin vitroで翻訳し、得られたメチラーゼ活性 を測定した。結果は、メチル化された基質DNAのパーセントで表されている（下 側パネル）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 タウフィック，ダン イギリス国 シービー２ ２キューエイ チ，ケンブリッジ，ヒルズ ロード，エム アールシー センター，エムアールシー ラボラトリー オブ モレキュラー バイ オロジー Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FA11 HA02 4B024 AA19 AA20 BA08 BA80 CA02 DA20 EA04 FA02 GA11 GA30 HA20 4B063 QA08 QA20 QQ43 QR08 QR32 QR33 QR39 QR40 QR71 QR83 QS28 QS31 QS38 QX01 QX07

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 所望の活性を有する遺伝子産物をコードする1種以上の遺伝 子エレメントを単離するための方法であって、 （a）遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するステ ップと、 （b）該マイクロカプセル中で該遺伝子エレメントを発現させてそれらの対応 する遺伝子産物を産生するステップと、 （c）所望の活性を有する遺伝子産物を産生する該遺伝子エレメントを選別す るステップと、 を含む方法。
  2. 【請求項２】 所望の活性を有する前記遺伝子産物が、この遺伝子産物とそ
    れをコードする遺伝子エレメントとを含有するマイクロカプセルの選別を可能に
    する変化をマイクロカプセル中で誘発する、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項３】 所望の活性を有する前記遺伝子産物がマイクロカプセル内で
    1種以上の分子を改変し、それにより、この遺伝子産物とそれをコードする遺伝 子エレメントとを含有するマイクロカプセルの選別を可能にする、請求項2に記 載の方法。
  4. 【請求項４】 所望の活性を有する前記遺伝子産物がマイクロカプセルの光
    学的性質の変化を誘発し、それにより、マイクロカプセルの選別が行われる、請
    求項2または3に記載の方法。
  5. 【請求項５】 ステップ（b）において、マイクロカプセル内の所望の前記 遺伝子産物の活性により、この遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの改変
    が直接的または間接的に生じ、それにより、該遺伝子エレメントの単離が可能に
    なる、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項６】 所望の活性を有する前記遺伝子産物がマイクロカプセル中で
    の変化を誘発し、この変化が、検出時に、コンパートメント内の遺伝子エレメン
    トの改変を引き起こし、それにより、該遺伝子エレメントの単離が可能になる、
    請求項5に記載の方法。
  7. 【請求項７】 マイクロカプセル中での前記変化がマイクロカプセルの光学
    的性質の変化である、請求項6に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記遺伝子エレメントの一部分が基質であり、マイクロカプ
    セル内の所望の前記遺伝子産物の活性により、該基質から産物への変換が直接的
    または間接的に生じ、該産物が前記遺伝子エレメントの部分を保持し、それによ
    り、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項5に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記遺伝子エレメントの一部分がリガンドであり、マイクロ
    カプセル内の所望の前記遺伝子産物が直接的または間接的に該リガンドに結合し
    、それにより、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる、請求項5に記載の方 法。
  10. 【請求項１０】 マイクロカプセル内の所望の前記遺伝子産物の活性により
    、コンパートメント内の第2の遺伝子の発現を直接的または間接的に変化させ、 該第2の遺伝子の産物の活性により、前記遺伝子エレメントの単離が可能になる 、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ステップ（b）が、マイクロカプセル中で前記遺伝子エレ メントを発現させてそれらの対応する遺伝子産物を産生するステップと、この遺
    伝子産物を、それをコードする遺伝子エレメントにリンクさせるステップと、そ
    れにより形成された複合体を単離するステップと、を含む、請求項1に記載の方 法。
  12. 【請求項１２】 ステップ（c）において、前記複合体を直接に選別するこ とにより、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを単離
    する、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメ
    ントを単離するために、前記複合体を更なるコンパートメント化ステップにかけ
    る、請求項12に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 請求項2〜4のいずれか1項に従って前記マイクロカプセル の選別を行う、請求項13に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項5〜10のいずれか1項に従って前記遺伝子エレメント
    の選別を行う、請求項12に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメント
    のライブラリーから前記遺伝子エレメントを単離する、請求項1〜15のいずれか1
    項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 （d）ステップ（c）で単離された遺伝子エレメント（1種 または複数種）中に1つ以上の突然変異を導入する追加のステップ、 を更に含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ステップ（a）〜（d）のうちの1つ以上を繰り返して行う ステップを更に含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記遺伝子エレメントを増幅するステップを更に含む、請
    求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 遺伝子エレメントをコンパートメント化し、該コンパート
    メント中で該遺伝子エレメントを発現させてその遺伝子産物を形成するための方
    法であって、 （a）遺伝子エレメントと、それを発現させてその遺伝子産物を形成するのに 必要な成分とを含む水性溶液を形成するステップと、 （b）該遺伝子エレメントを含む離散マイクロカプセルを形成するように該溶 液をマイクロカプセル化するステップと、 （c）該マイクロカプセルを、遺伝子産物を形成すべく該遺伝子エレメントの 発現を進行させるのに好適な条件に暴露するステップと、 を含む方法。
  21. 【請求項２１】 遺伝子産物のレパートリーをコードする遺伝子エレメント
    のライブラリーをカプセル化し、マイクロカプセル内で各遺伝子エレメントを発
    現させてその遺伝子産物を形成する、請求項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 油をベースとする媒体中に水性溶液を含んでなる油中水型
    エマルションを形成することにより、マイクロカプセル化を行う、請求項20また
    は21に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 請求項20〜22のいずれか1項に記載の方法により得られる マイクロカプセル。
  24. 【請求項２４】 前記遺伝子エレメントがアフィニティー精製により選別さ
    れる、請求項5〜19のいずれか1項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記遺伝子エレメントが、所望の遺伝子産物をコードしな
    い遺伝子エレメントの選択的切除により選別される、請求項5〜19のいずれか1項
    に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法により単離される
    産物。
  27. 【請求項２７】 遺伝子産物を調製するための方法であって、 （a）遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを調製するステップと、 （b）該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するス テップと、 （c）マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺 伝子産物を産生するステップと、 （d）所望の活性を有する該遺伝子産物（1種または複数種）を産生する遺伝子
    エレメントの選別を行うステップと、 （e）所望の活性を有する該遺伝子産物を発現させるステップと、 を含む方法。
  28. 【請求項２８】 遺伝子産物の活性を調節することのできる1種または複数 種の化合物をスクリーニングするための方法であって、 （a）遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントのレパートリーを調製するス テップと、 （b）該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するス テップと、 （c）マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺 伝子産物を産生するステップと、 （d）所望の活性を有する該遺伝子産物（1種または複数種）を産生する遺伝子
    エレメントの選別を行うステップと、 （e）所望の活性を有する該遺伝子産物を1種または複数種の化合物と接触させ
    、該化合物による該遺伝子産物の活性の調節をモニターするステップと、 を含む方法。
  29. 【請求項２９】 1種または複数種の化合物を調製するための方法であって 、 （a）少なくとも1つのステップがポリペプチドにより促進される合成プロトコ
    ルを提供するステップと、 （b）このステップを促進するポリペプチドの変異体をコードする遺伝子エレ メントを調製するステップと、 （c）該遺伝子エレメントをマイクロカプセル中にコンパートメント化するス テップと、 （d）マイクロカプセル内で該遺伝子エレメントを発現させてその対応する遺 伝子産物を産生するステップと、 （e）所望の活性を有するポリペプチド遺伝子産物（1種または複数種）を産生
    する遺伝子エレメントを選別するステップと、 （f）該合成の関連ステップを促進すべく（e）で同定されたポリペプチド遺伝
    子産物を用いて1種または複数種の化合物を調製するステップと、 を含む方法。
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US (7) US6489103B1 (ja)
EP (6) EP1482036B1 (ja)
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AT (4) ATE487790T1 (ja)
AU (1) AU736836B2 (ja)
CA (3) CA2584453A1 (ja)
CY (1) CY1111537T1 (ja)
DE (4) DE69826697T2 (ja)
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GB (1) GB2342094B (ja)
PT (2) PT1801214E (ja)
WO (1) WO1999002671A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002534085A (ja) * 1999-01-07 2002-10-15 メディカル リサーチ カウンシル 光学的分取方法
JP2006522325A (ja) * 2003-03-31 2006-09-28 メディカル リサーチ カウンシル コンパートメント化スクリーニングによる選択
JP2007535892A (ja) * 2003-01-29 2007-12-13 ４５４ コーポレーション ビーズエマルジョン核酸増幅
JP2011019461A (ja) * 2009-07-16 2011-02-03 Japan Science & Technology Agency エマルジョンを用いたｒｎａの選択的増幅法
JP4829240B2 (ja) * 2004-10-12 2011-12-07 メディカル リサーチ カウンシル マイクロ流体制御による区画化されたスクリーニング
JP2012070750A (ja) * 2003-03-31 2012-04-12 Medical Research Council マイクロカプセルを用いたコンビナトリアルライブラリの合成および試験の方法
JP2022068841A (ja) * 2004-10-08 2022-05-10 メディカル リサーチ カウンシル マイクロ流体システム内のインビトロ進化

Families Citing this family (343)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7285416B2 (en) 2000-01-24 2007-10-23 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US7262055B2 (en) 1998-08-25 2007-08-28 Gendaq Limited Regulated gene expression in plants
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
AU6846698A (en) 1997-04-01 1998-10-22 Glaxo Group Limited Method of nucleic acid amplification
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
AU2004242526B2 (en) * 1999-01-07 2007-08-30 United Kingdom Research And Innovation Optical Sorting Method
US6410241B1 (en) 1999-03-24 2002-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods of screening open reading frames to determine whether they encode polypeptides with an ability to generate an immune response
GB9917027D0 (en) 1999-07-20 1999-09-22 Affibody Technology Sweeden Ab In vitro selection and optional identification of polypeptides using solid support carriers
US6770441B2 (en) 2000-02-10 2004-08-03 Illumina, Inc. Array compositions and methods of making same
GB0022458D0 (en) * 2000-09-13 2000-11-01 Medical Res Council Directed evolution method
AR031640A1 (es) 2000-12-08 2003-09-24 Applied Research Systems Amplificacion isotermica de acidos nucleicos en un soporte solido
WO2002074952A2 (de) * 2001-03-16 2002-09-26 Rina Netzwerk Rna-Technologien Gmbh Gegen abbau stabilisierte nukleinsäure
JP4838957B2 (ja) 2001-05-02 2011-12-14 独立行政法人理化学研究所 無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質の製造方法
GB0114854D0 (en) * 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Selective gene amplification
GB0115841D0 (en) 2001-06-28 2001-08-22 Medical Res Council Ligand
WO2003037302A1 (en) * 2001-10-30 2003-05-08 Windsor J Brian Method and system for the co-isolation of cognate dna, rna and protein sequences and method for screening co-isolates for defined activities
GB0127564D0 (en) * 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
EP1507003B1 (en) 2002-05-22 2011-09-21 Riken Process for producing protein in cell-free protein synthesis system using thioredoxin fused protein expression vector
AUPS298102A0 (en) * 2002-06-13 2002-07-04 Nucleics Pty Ltd Method for performing chemical reactions
US9321832B2 (en) 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
JP2006507921A (ja) * 2002-06-28 2006-03-09 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 流体分散のための方法および装置
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
ATE488586T1 (de) 2002-09-06 2010-12-15 Isogenica Ltd In vitro peptid-expressionsbank
GB0221053D0 (en) * 2002-09-11 2002-10-23 Medical Res Council Single-molecule in vitro evolution
JP4441170B2 (ja) 2002-11-28 2010-03-31 独立行政法人理化学研究所 Ｓ１２リボソームタンパク質に変異を有する大腸菌細胞抽出液及びそれを用いる無細胞系によるタンパク質の製造方法
GB0228819D0 (en) * 2002-12-11 2003-01-15 British American Tobacco Co Improvements relating to smoking articles
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
US7575865B2 (en) 2003-01-29 2009-08-18 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US7041481B2 (en) 2003-03-14 2006-05-09 The Regents Of The University Of California Chemical amplification based on fluid partitioning
US20060078893A1 (en) 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
FI20030615A0 (fi) * 2003-04-24 2003-04-24 Marko Virta Nanopartikkeli bioaffiniteettimäärityksiin
AU2004229440B2 (en) 2003-04-10 2010-08-12 President And Fellows Of Harvard College Formation and control of fluidic species
EP2357237A1 (en) 2003-05-14 2011-08-17 Domantis Limited A process for recovering polypeptides that unfold reversibly from a polypeptide repertoire
JP5183063B2 (ja) 2003-07-05 2013-04-17 ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ 遺伝的変異の検出および列挙のための方法ならびに組成物
EP1658133A1 (en) 2003-08-27 2006-05-24 President And Fellows Of Harvard College Electronic control of fluidic species
ATE386113T1 (de) * 2003-10-01 2008-03-15 Eth Zuerich Verfahren zur in vitro evolution von polypeptiden
GB0325653D0 (en) 2003-11-03 2003-12-10 Medical Res Council CST emulsions
EP1691792A4 (en) * 2003-11-24 2008-05-28 Yeda Res & Dev COMPOSITIONS AND METHODS FOR IN VITRO / I SORTING OF MOLECULAR AND CELLULAR BANKS
CA2553833C (en) 2004-01-28 2012-10-02 454 Corporation Nucleic acid amplification with continuous flow emulsion
US9477233B2 (en) 2004-07-02 2016-10-25 The University Of Chicago Microfluidic system with a plurality of sequential T-junctions for performing reactions in microdroplets
GB0418651D0 (en) 2004-08-20 2004-09-22 Medical Res Council Method
GB0419628D0 (en) 2004-09-03 2004-10-06 European Molecular Biology Lab Embl Method for determining protein solubility
CN101724071A (zh) 2004-10-08 2010-06-09 杜门蒂斯有限公司 抗肿瘤坏死因子受体1的单域抗体及其使用方法
WO2006051552A2 (en) * 2004-11-15 2006-05-18 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Directed evolution and selection using in vitro compartmentalization
JP4868731B2 (ja) 2004-11-17 2012-02-01 独立行政法人理化学研究所 哺乳動物培養細胞由来の無細胞タンパク質合成システム
JP4787488B2 (ja) 2004-11-19 2011-10-05 独立行政法人理化学研究所 直鎖状鋳型ｄｎａを用いた無細胞タンパク質合成方法及びそのための細胞抽出液
EP2241637A1 (en) 2005-02-01 2010-10-20 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Nucleic acid sequencing by performing successive cycles of duplex extension
EP2272983A1 (en) * 2005-02-01 2011-01-12 AB Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
US20070054119A1 (en) * 2005-03-04 2007-03-08 Piotr Garstecki Systems and methods of forming particles
US9039273B2 (en) 2005-03-04 2015-05-26 President And Fellows Of Harvard College Method and apparatus for forming multiple emulsions
US20060228721A1 (en) * 2005-04-12 2006-10-12 Leamon John H Methods for determining sequence variants using ultra-deep sequencing
CA2607532C (en) * 2005-04-29 2013-03-12 The J. Craig Venter Institute Amplification and cloning of single dna molecules using rolling circle amplification
WO2007145612A1 (en) 2005-06-06 2007-12-21 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
US20090233291A1 (en) * 2005-06-06 2009-09-17 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
WO2006138284A2 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Callida Genomics, Inc. Nucleic acid analysis by random mixtures of non-overlapping fragments
CA2618699C (en) 2005-08-11 2012-10-02 J. Craig Venter Institute, Inc. In vitro recombination method
JP5033949B2 (ja) * 2005-08-12 2012-09-26 国立大学法人豊橋技術科学大学 電気乳化法
WO2007024778A2 (en) * 2005-08-22 2007-03-01 Applera Corporation Device, system and method for depositing processed immiscible-fluid-discrete-volumes
EP2546360A1 (en) 2005-10-07 2013-01-16 Callida Genomics, Inc. Self-assembled single molecule arrays and uses thereof
WO2007133831A2 (en) 2006-02-24 2007-11-22 Callida Genomics, Inc. High throughput genome sequencing on dna arrays
KR100828714B1 (ko) 2005-10-25 2008-05-09 주식회사 엘지화학 리보핵산을 이용한 멀티플렉스 증폭방법
EP1801212A1 (en) * 2005-12-21 2007-06-27 Eidgenössische Technische Hochschule Zürich Selection of biocatalysts for chemical synthesis
WO2007081387A1 (en) 2006-01-11 2007-07-19 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic devices, methods of use, and kits for performing diagnostics
DE602007009811D1 (de) * 2006-01-27 2010-11-25 Harvard College Koaleszenz fluider tröpfchen
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
CN101495654A (zh) * 2006-04-19 2009-07-29 阿普里拉股份有限公司 无凝胶珠基测序的试剂、方法和文库
EP2047910B1 (en) 2006-05-11 2012-01-11 Raindance Technologies, Inc. Microfluidic device and method
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
CA2653321A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Althea Technologies, Inc. Biochemical analysis of partitioned cells
EP3536396B1 (en) 2006-08-07 2022-03-30 The President and Fellows of Harvard College Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008042067A2 (en) 2006-09-28 2008-04-10 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7910354B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US7682791B2 (en) * 2006-10-29 2010-03-23 Macevicz Stephen C Method of generating nested sets of double stranded DNA circles
US20090111705A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
WO2008093098A2 (en) 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
WO2008097559A2 (en) 2007-02-06 2008-08-14 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
EP2118280B1 (en) 2007-02-23 2010-12-01 New England Biolabs, Inc. Selection and enrichment of proteins using in vitro compartmentalization
US9029085B2 (en) 2007-03-07 2015-05-12 President And Fellows Of Harvard College Assays and other reactions involving droplets
JP2010521156A (ja) * 2007-03-16 2010-06-24 ４５４ ライフ サイエンシーズ コーポレイション Ｈｉｖ薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法
WO2008121342A2 (en) * 2007-03-28 2008-10-09 President And Fellows Of Harvard College Emulsions and techniques for formation
US8592221B2 (en) 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
EP2164985A4 (en) * 2007-06-01 2014-05-14 454 Life Sciences Corp SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUAL SAMPLES FROM A MULTIPLEX MIXTURE
US7883265B2 (en) * 2007-06-01 2011-02-08 Applied Biosystems, Llc Devices, systems, and methods for preparing emulsions
MX2009013137A (es) 2007-06-06 2010-04-30 Domantis Ltd Metodos para seleccionar polipeptidos resistentes a la proteasa.
EP2173898A2 (en) * 2007-06-28 2010-04-14 454 Life Sciences Corporation System and method for adaptive reagent control in nucleic acid sequencing
JP2010539982A (ja) * 2007-10-01 2010-12-24 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー チェイスライゲーション配列決定法
DK2213747T3 (da) 2007-11-05 2021-08-09 Riken Fremgangsmåde til fremstilling af membranprotein
WO2009067743A1 (en) 2007-11-27 2009-06-04 Human Genetic Signatures Pty Ltd Enzymes for amplification and copying bisulphite modified nucleic acids
EP2222709B1 (en) 2007-11-30 2016-11-23 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
US9797010B2 (en) 2007-12-21 2017-10-24 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for nucleic acid sequencing
EP2489744B1 (en) 2008-02-04 2014-09-03 Life Technologies Corporation Composition and method for sequencing nucleic acid
US20090203086A1 (en) * 2008-02-06 2009-08-13 454 Life Sciences Corporation System and method for improved signal detection in nucleic acid sequencing
SG189682A1 (en) 2008-03-31 2013-05-31 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
BRPI0911326B1 (pt) * 2008-04-04 2019-11-26 Allopartis Biotechnologies Inc método de seleção para atividade enzimática melhorada em um substrato insolúvel
GB0806562D0 (en) 2008-04-10 2008-05-14 Fermentas Uab Production of nucleic acid
US7888034B2 (en) 2008-07-01 2011-02-15 454 Life Sciences Corporation System and method for detection of HIV tropism variants
WO2010003132A1 (en) 2008-07-02 2010-01-07 Illumina Cambridge Ltd. Using populations of beads for the fabrication of arrays on surfaces
EP2315629B1 (en) 2008-07-18 2021-12-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet libraries
EP3216874A1 (en) 2008-09-05 2017-09-13 TOMA Biosciences, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US20110218123A1 (en) 2008-09-19 2011-09-08 President And Fellows Of Harvard College Creation of libraries of droplets and related species
US9492797B2 (en) 2008-09-23 2016-11-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US8663920B2 (en) 2011-07-29 2014-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Library characterization by digital assay
US9417190B2 (en) 2008-09-23 2016-08-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Calibrations and controls for droplet-based assays
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
US9399215B2 (en) 2012-04-13 2016-07-26 Bio-Rad Laboratories, Inc. Sample holder with a well having a wicking promoter
US8633015B2 (en) 2008-09-23 2014-01-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Flow-based thermocycling system with thermoelectric cooler
US9764322B2 (en) 2008-09-23 2017-09-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for generating droplets with pressure monitoring
WO2011120020A1 (en) 2010-03-25 2011-09-29 Quantalife, Inc. Droplet transport system for detection
US10512910B2 (en) 2008-09-23 2019-12-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based analysis method
US9132394B2 (en) 2008-09-23 2015-09-15 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for detection of spaced droplets
US8951939B2 (en) 2011-07-12 2015-02-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital assays with multiplexed detection of two or more targets in the same optical channel
US8709762B2 (en) 2010-03-02 2014-04-29 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for hot-start amplification via a multiple emulsion
US9598725B2 (en) 2010-03-02 2017-03-21 Bio-Rad Laboratories, Inc. Emulsion chemistry for encapsulated droplets
US11130128B2 (en) 2008-09-23 2021-09-28 Bio-Rad Laboratories, Inc. Detection method for a target nucleic acid
US8728764B2 (en) 2008-10-02 2014-05-20 Illumina Cambridge Limited Nucleic acid sample enrichment for sequencing applications
US20100261189A1 (en) 2008-10-03 2010-10-14 Roche Molecular Systems, Inc. System and method for detection of HLA Variants
US20100087325A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-08 Illumina, Inc. Biological sample temperature control system and method
US8541207B2 (en) 2008-10-22 2013-09-24 Illumina, Inc. Preservation of information related to genomic DNA methylation
US8486865B2 (en) 2008-11-03 2013-07-16 The Regents Of The University Of California Methods for detecting modification resistant nucleic acids
SG195652A1 (en) 2008-11-07 2013-12-30 Sequenta Inc Methods of monitoring conditions by sequence analysis
US9528160B2 (en) 2008-11-07 2016-12-27 Adaptive Biotechnolgies Corp. Rare clonotypes and uses thereof
US9365901B2 (en) 2008-11-07 2016-06-14 Adaptive Biotechnologies Corp. Monitoring immunoglobulin heavy chain evolution in B-cell acute lymphoblastic leukemia
US8628927B2 (en) 2008-11-07 2014-01-14 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US8748103B2 (en) 2008-11-07 2014-06-10 Sequenta, Inc. Monitoring health and disease status using clonotype profiles
US9506119B2 (en) 2008-11-07 2016-11-29 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of sequence determination using sequence tags
GB0822260D0 (en) 2008-12-05 2009-01-14 Merten Christoph Assay
CN102307897B (zh) 2008-12-05 2016-01-20 葛兰素集团有限公司 选出蛋白酶抗性多肽的方法
GB0822261D0 (en) 2008-12-05 2009-01-14 Merten Christoph Assay
EP3150724A1 (en) 2008-12-19 2017-04-05 President and Fellows of Harvard College Particle-assisted nucleic acid sequencing
WO2010075188A2 (en) 2008-12-23 2010-07-01 Illumina Inc. Multibase delivery for long reads in sequencing by synthesis protocols
HUE029424T2 (en) 2009-01-15 2017-02-28 Adaptive Biotechnologies Corp Adaptive immunity profiling and a method for producing monoclonal antibodies
US8581209B2 (en) * 2009-01-29 2013-11-12 Southwest Research Institute Fluorescent monitoring of microcapsule oxidation
US20110301335A1 (en) 2009-02-19 2011-12-08 Stephen Duffield Anti-tnfr1 polypeptides, antibody variable domains & antagonists
CA2753263A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs
CA2753332A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
CA2753287A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
EP2406003A2 (en) 2009-03-13 2012-01-18 President and Fellows of Harvard College Scale-up of flow-focusing microfluidic devices
GB0904957D0 (en) 2009-03-23 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Tumour gene profile
EP2411148B1 (en) 2009-03-23 2018-02-21 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
TW201100104A (en) 2009-03-27 2011-01-01 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
WO2010117456A2 (en) * 2009-04-08 2010-10-14 Applied Biosystems, Llc Column enrichment of pcr beads comprising tethered amplicons
WO2010129541A1 (en) * 2009-05-04 2010-11-11 Affomix Corporation Emulsion selection of antibodies
JP2012531202A (ja) 2009-06-25 2012-12-10 フレッド ハチンソン キャンサー リサーチ センター 適応免疫を測定する方法
CA2768460A1 (en) 2009-07-16 2011-01-20 Glaxo Group Limited Antagonists, uses & methods for partially inhibiting tnfr1
EP2473618B1 (en) 2009-09-02 2015-03-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for mixing fluids by coalescence of multiple emulsions
JP5869482B2 (ja) 2009-09-02 2016-02-24 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ジェッティングおよび他の技術を使用して生成された多重エマルジョン
US8182994B2 (en) 2009-09-15 2012-05-22 Illumina Cambridge Limited Centroid markers for image analysis of high denisty clusters in complex polynucleotide sequencing
US20120276098A1 (en) 2009-09-30 2012-11-01 Bruce Hamilton Drug fusions and conjugates with extended half life
US10520500B2 (en) 2009-10-09 2019-12-31 Abdeslam El Harrak Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
US8609339B2 (en) * 2009-10-09 2013-12-17 454 Life Sciences Corporation System and method for emulsion breaking and recovery of biological elements
GB0918564D0 (en) 2009-10-22 2009-12-09 Plasticell Ltd Nested cell encapsulation
ES2552177T3 (es) 2009-10-27 2015-11-26 Glaxo Group Limited Polipéptidos anti-TNFR1 estables, dominios variables de anticuerpos y antagonistas
AU2010315580B2 (en) 2009-10-27 2014-11-06 President And Fellows Of Harvard College Droplet creation techniques
EP2494353B1 (en) * 2009-10-30 2017-09-27 Illumina Inc. An apparatus comprising a plurality of encoded microvessels and a plurality of compartments and a method of reading a plurality of encoded micro vessels
EP2333102A1 (en) * 2009-12-14 2011-06-15 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for identifying RNA ligands
EP2517025B1 (en) 2009-12-23 2019-11-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods for reducing the exchange of molecules between droplets
CA2786660A1 (en) 2010-01-14 2011-07-21 Glaxo Group Limited Liver targeting molecules
PL2531880T3 (pl) 2010-02-01 2017-09-29 Illumina Inc. Sposoby ogniskowania oraz układy optyczne i zespoły optyczne realizujące te sposoby
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2011100604A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
CN202281746U (zh) 2010-03-06 2012-06-20 伊鲁米那股份有限公司 检测来自样品光信号的测定设备及其光学组件和光学系统
BR112012023441A2 (pt) * 2010-03-17 2016-05-24 Basf Se emulsificação por fusão
EP2550351A4 (en) 2010-03-25 2014-07-09 Quantalife Inc DETECTION SYSTEM FOR DROPLET-BASED ANALYZES
EP2550528B1 (en) 2010-03-25 2019-09-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet generation for droplet-based assays
WO2011135041A1 (en) 2010-04-30 2011-11-03 Roche Diagnostics Gmbh System and method for purification and use of inorganic pyrophosphatase from aquifex aeolicus
WO2011143194A2 (en) 2010-05-10 2011-11-17 Life Technologies Corporation System and method for processing a biological sample
US20110287432A1 (en) 2010-05-21 2011-11-24 454 Life Science Corporation System and method for tailoring nucleotide concentration to enzymatic efficiencies in dna sequencing technologies
US9650629B2 (en) 2010-07-07 2017-05-16 Roche Molecular Systems, Inc. Clonal pre-amplification in emulsion
CN105964312A (zh) 2010-07-22 2016-09-28 基因细胞生物系统有限公司 复合液体池
EP3572528A1 (en) 2010-09-24 2019-11-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
US20120077716A1 (en) 2010-09-29 2012-03-29 454 Life Sciences Corporation System and method for producing functionally distinct nucleic acid library ends through use of deoxyinosine
US8759038B2 (en) 2010-09-29 2014-06-24 Illumina Cambridge Limited Compositions and methods for sequencing nucleic acids
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
US20120322665A1 (en) 2010-10-08 2012-12-20 454 Life Sciences Corporation System and method for detection of hiv-1 clades and recombinants of the reverse transcriptase and protease regions
EP2633069B1 (en) 2010-10-26 2015-07-01 Illumina, Inc. Sequencing methods
CN106399472A (zh) 2010-10-28 2017-02-15 生命技术公司 化学增强型引物组合物、方法和试剂盒
EP4016086A1 (en) 2010-11-01 2022-06-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. System for forming emulsions
WO2012074855A2 (en) 2010-11-22 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Methods of identifying a cellular nascent rna transcript
WO2012069557A1 (en) 2010-11-24 2012-05-31 Glaxo Group Limited Multispecific antigen binding proteins targeting hgf
WO2012073045A2 (en) 2010-12-03 2012-06-07 Cyclogenix Ltd Polypeptide scaffold
US8951781B2 (en) 2011-01-10 2015-02-10 Illumina, Inc. Systems, methods, and apparatuses to image a sample for biological or chemical analysis
US9364803B2 (en) 2011-02-11 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
WO2012112804A1 (en) 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
WO2012129187A1 (en) 2011-03-18 2012-09-27 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays with combinatorial use of signals
US20120244523A1 (en) 2011-03-25 2012-09-27 454 Life Sciences Corporation System and Method for Detection of HIV Integrase Variants
WO2012136792A2 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Cck compositions
WO2012136790A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Glaxo Group Limited Compositions comprising fusion proteins or conjugates with an improved half -life
AU2012249759A1 (en) 2011-04-25 2013-11-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for nucleic acid analysis
GB201108259D0 (en) * 2011-05-17 2011-06-29 Cambridge Entpr Ltd Gel beads in microfluidic droplets
EP2714254B1 (en) 2011-05-23 2017-09-06 President and Fellows of Harvard College Control of emulsions, including multiple emulsions
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
DE202012013668U1 (de) 2011-06-02 2019-04-18 Raindance Technologies, Inc. Enzymquantifizierung
US9567628B2 (en) 2011-06-08 2017-02-14 Life Technologies Corporation Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points
CN106518696B (zh) 2011-06-08 2019-06-14 生命技术公司 用于pcr系统的新型去污剂的设计和开发
JP2014522718A (ja) 2011-07-06 2014-09-08 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 多相エマルションおよび多相エマルション形成法
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
JP5924888B2 (ja) * 2011-08-26 2016-05-25 関東化學株式会社 核酸抽出方法、核酸抽出試薬キットおよび核酸抽出用試薬
KR20130023091A (ko) * 2011-08-26 2013-03-07 (주)바이오니아 단백질 합성 키트, 자동추출장비를 이용한 단백질 발현 및 추출 방법
US10385475B2 (en) 2011-09-12 2019-08-20 Adaptive Biotechnologies Corp. Random array sequencing of low-complexity libraries
DK3623481T3 (da) 2011-09-23 2021-11-15 Illumina Inc Sammensætninger til nukleinsyresekventering
US10152569B2 (en) 2011-09-26 2018-12-11 Gen-Probe Incorporated Algorithms for sequence determinations
US10378051B2 (en) 2011-09-29 2019-08-13 Illumina Cambridge Limited Continuous extension and deblocking in reactions for nucleic acids synthesis and sequencing
DE102011054101A1 (de) 2011-09-30 2013-04-04 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur räumlichen Anordnung von Probenfragmenten zur Amplifikation und Immobilisierung für weitere Derivatisierungen
EP2768982A4 (en) 2011-10-21 2015-06-03 Adaptive Biotechnologies Corp QUANTIFICATION OF ADAPTIVE IMMUNOCELL GENOMES IN A COMPLEX MIX OF CELLS
DE102011085473A1 (de) 2011-10-28 2013-05-02 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Verfahren zur Identifikation von Aptameren
AU2012336040B2 (en) 2011-11-07 2015-12-10 Illumina, Inc. Integrated sequencing apparatuses and methods of use
GB201120711D0 (en) 2011-12-01 2012-01-11 Univ Erasmus Medical Ct Method for classifying tumour cells
EP2788499B1 (en) 2011-12-09 2016-01-13 Illumina, Inc. Expanded radix for polymeric tags
EP2788509B1 (en) 2011-12-09 2018-07-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection
US9499865B2 (en) 2011-12-13 2016-11-22 Adaptive Biotechnologies Corp. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes
CA2862364C (en) 2011-12-30 2021-02-23 Quest Diagnostics Investments Incorporated Nucleic acid analysis using emulsion pcr
US9777269B2 (en) 2012-01-25 2017-10-03 Gencell Biosystems Ltd. Biomolecule isolation
US9701959B2 (en) 2012-02-02 2017-07-11 Invenra Inc. High throughput screen for biologically active polypeptides
US20130217023A1 (en) 2012-02-22 2013-08-22 454 Life Sciences Corporation System And Method For Generation And Use Of Compact Clonally Amplified Products
EP2823060B1 (en) 2012-03-05 2018-02-14 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits
NO2694769T3 (ja) 2012-03-06 2018-03-03
US20130261984A1 (en) 2012-03-30 2013-10-03 Illumina, Inc. Methods and systems for determining fetal chromosomal abnormalities
DK2831276T3 (da) 2012-05-08 2016-08-01 Adaptive Biotechnologies Corp Sammensætninger og fremgangsmåde til at måle og kalibrere amplifikations-bias i multipleks-PCR-reaktioner
US10192024B2 (en) 2012-05-18 2019-01-29 454 Life Sciences Corporation System and method for generation and use of optimal nucleotide flow orders
WO2014008448A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sloan Kettering Institute For Cancer Research Quantitative assessment of human t-cell repertoire recovery after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation
US9977861B2 (en) 2012-07-18 2018-05-22 Illumina Cambridge Limited Methods and systems for determining haplotypes and phasing of haplotypes
AU2013302867A1 (en) 2012-08-13 2015-02-26 The Regents Of The University Of California Methods and systems for detecting biological components
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
CA2881685C (en) 2012-08-14 2023-12-05 10X Genomics, Inc. Microcapsule compositions and methods
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10584381B2 (en) 2012-08-14 2020-03-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US9567631B2 (en) 2012-12-14 2017-02-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
NL2017959B1 (en) 2016-12-08 2018-06-19 Illumina Inc Cartridge assembly
ES2749118T3 (es) 2012-10-01 2020-03-19 Adaptive Biotechnologies Corp Evaluación de la inmunocompetencia por la diversidad de los receptores de inmunidad adaptativa y caracterización de la clonalidad
WO2015160439A2 (en) 2014-04-17 2015-10-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells
US9776182B2 (en) 2012-11-27 2017-10-03 Gencell Biosystems Ltd. Handling liquid samples
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CA2900543C (en) 2013-02-08 2023-01-31 10X Genomics, Inc. Partitioning and processing of analytes and other species
WO2014144822A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Immumetrix, Inc. Methods and compositions for tagging and analyzing samples
US9708657B2 (en) 2013-07-01 2017-07-18 Adaptive Biotechnologies Corp. Method for generating clonotype profiles using sequence tags
US9348897B2 (en) 2013-08-07 2016-05-24 Google Inc. Method and system for providing scheduling suggestions
EP2840148B1 (en) 2013-08-23 2019-04-03 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for nucleic acid amplification
EP2848698A1 (en) 2013-08-26 2015-03-18 F. Hoffmann-La Roche AG System and method for automated nucleic acid amplification
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
JP6742238B2 (ja) 2013-10-25 2020-08-19 ライフ テクノロジーズ コーポレーション Ｐｃｒシステムにおいて使用するための新規化合物及びその用途
US10088973B2 (en) * 2013-11-08 2018-10-02 Google Llc Event scheduling presentation in a graphical user interface environment
WO2015069634A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 President And Fellows Of Harvard College Microparticles, methods for their preparation and use
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
EP3105326A4 (en) 2014-02-10 2018-01-10 Gencell Biosystems Limited Composite liquid cell (clc) mediated nucleic acid library preparation device, and methods for using the same
WO2015134787A2 (en) 2014-03-05 2015-09-11 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods using randomer-containing synthetic molecules
US10066265B2 (en) 2014-04-01 2018-09-04 Adaptive Biotechnologies Corp. Determining antigen-specific t-cells
US11390921B2 (en) 2014-04-01 2022-07-19 Adaptive Biotechnologies Corporation Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs)
CN106413896B (zh) 2014-04-10 2019-07-05 10X基因组学有限公司 用于封装和分割试剂的流体装置、系统和方法及其应用
CN110211637B (zh) 2014-06-26 2023-10-27 10X基因组学有限公司 核酸序列装配的方法和系统
JP6838969B2 (ja) 2014-06-26 2021-03-03 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 個々の細胞または細胞集団由来の核酸の分析方法
EP3160654A4 (en) 2014-06-27 2017-11-15 The Regents of The University of California Pcr-activated sorting (pas)
CN107002121B (zh) 2014-09-18 2020-11-13 亿明达股份有限公司 用于分析核酸测序数据的方法和系统
EP3201356A1 (en) 2014-10-03 2017-08-09 Life Technologies Corporation Genetic sequence verification compositions, methods and kits
EP3209419A4 (en) 2014-10-22 2018-10-03 The Regents of The University of California High definition microdroplet printer
CA2966201A1 (en) 2014-10-29 2016-05-06 Adaptive Biotechnologies Corp. Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from many samples
US20160122817A1 (en) 2014-10-29 2016-05-05 10X Genomics, Inc. Methods and compositions for targeted nucleic acid sequencing
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
US10246701B2 (en) 2014-11-14 2019-04-02 Adaptive Biotechnologies Corp. Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture
US11066705B2 (en) 2014-11-25 2021-07-20 Adaptive Biotechnologies Corporation Characterization of adaptive immune response to vaccination or infection using immune repertoire sequencing
CN112126675B (zh) 2015-01-12 2022-09-09 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和系统以及用其制备的文库
SG11201705425SA (en) 2015-01-13 2017-08-30 10X Genomics Inc Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
EP3253479B1 (en) 2015-02-04 2022-09-21 The Regents of The University of California Sequencing of nucleic acids via barcoding in discrete entities
CA2975529A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation and phasing using variant call data
AU2016222788B2 (en) 2015-02-24 2022-03-31 Adaptive Biotechnologies Corp. Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing
KR20170119710A (ko) 2015-02-24 2017-10-27 10엑스 제노믹스, 인크. 표적화된 핵산 서열 커버리지 방법
EP4286516A3 (en) 2015-02-24 2024-03-06 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
CN107406889B (zh) 2015-03-20 2021-11-02 诺维信公司 通过注射进行的基于液滴的选择
CA2979850C (en) 2015-03-24 2020-07-21 Illumina, Inc. Methods, carrier assemblies, and systems for imaging samples for biological or chemical analysis
AU2016242967B2 (en) 2015-04-01 2021-07-01 Adaptive Biotechnologies Corp. Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target
WO2016164583A2 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having enhanced activity
CN107864658A (zh) * 2015-04-07 2018-03-30 诺维信公司 用于选择具有脂肪酶活性的酶的方法
EP3307908B1 (en) 2015-06-09 2019-09-11 Life Technologies Corporation Methods for molecular tagging
WO2017022696A1 (ja) 2015-07-31 2017-02-09 国立研究開発法人理化学研究所 膜タンパク質の製造方法およびその利用
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
CN108289797B (zh) 2015-10-13 2022-01-28 哈佛学院院长及董事 用于制备和使用凝胶微球的系统和方法
US11371094B2 (en) 2015-11-19 2022-06-28 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid processing using degenerate nucleotides
SG11201804086VA (en) 2015-12-04 2018-06-28 10X Genomics Inc Methods and compositions for nucleic acid analysis
JP6735348B2 (ja) 2016-02-11 2020-08-05 １０エックス ジェノミクス， インコーポレイテッド 全ゲノム配列データのデノボアセンブリのためのシステム、方法及び媒体
US20190161786A1 (en) 2016-04-07 2019-05-30 Novozymes A/S Methods for selecting enzymes having protease activity
WO2017189973A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital polymerase fidelity assay
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
WO2018031691A1 (en) 2016-08-10 2018-02-15 The Regents Of The University Of California Combined multiple-displacement amplification and pcr in an emulsion microdroplet
US10428325B1 (en) 2016-09-21 2019-10-01 Adaptive Biotechnologies Corporation Identification of antigen-specific B cell receptors
WO2018064116A1 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Illumina, Inc. Methods and systems for data compression
IL290157B2 (en) 2016-10-14 2023-09-01 Illumina Inc cartridge kit
EP3555288B1 (en) 2016-12-19 2021-02-03 Editas Medicine, Inc. Emulsion-based screening methods
CA3047328A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 The Regents Of The University Of California Single cell genomic sequencing using hydrogel based droplets
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
WO2018140966A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for droplet-based single cell barcoding
US10995333B2 (en) 2017-02-06 2021-05-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation
GB201707143D0 (en) 2017-05-04 2017-06-21 Plasticell Ltd Method for producing cells
WO2018213774A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for analyzing datasets
US10844372B2 (en) 2017-05-26 2020-11-24 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
EP4230746A3 (en) 2017-05-26 2023-11-01 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
US10837047B2 (en) 2017-10-04 2020-11-17 10X Genomics, Inc. Compositions, methods, and systems for bead formation using improved polymers
WO2019076955A1 (en) 2017-10-18 2019-04-25 Novozymes A/S IMMUNOLOGICAL ASSAY FOR THE STABILITY OF A BIO-ACTIVE POLYPEPTIDE
US10501739B2 (en) 2017-10-18 2019-12-10 Mission Bio, Inc. Method, systems and apparatus for single cell analysis
US11634757B2 (en) 2017-10-20 2023-04-25 Stilla Technologies Emulsions with improved stability
WO2019084043A1 (en) 2017-10-26 2019-05-02 10X Genomics, Inc. METHODS AND SYSTEMS FOR NUCLEIC ACID PREPARATION AND CHROMATIN ANALYSIS
CN111479631B (zh) 2017-10-27 2022-02-22 10X基因组学有限公司 用于样品制备和分析的方法和系统
SG11201913654QA (en) 2017-11-15 2020-01-30 10X Genomics Inc Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
US11254980B1 (en) 2017-11-29 2022-02-22 Adaptive Biotechnologies Corporation Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements
WO2019108851A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 10X Genomics, Inc. Systems and methods for nucleic acid preparation and analysis
WO2019143622A1 (en) 2018-01-19 2019-07-25 Bio-Rad Laboratories, Inc. Mutant dna polymerases
EP3752832A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 10X Genomics, Inc. Methods characterizing multiple analytes from individual cells or cell populations
US11639928B2 (en) 2018-02-22 2023-05-02 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing analytes from individual cells or cell populations
CN112262218A (zh) 2018-04-06 2021-01-22 10X基因组学有限公司 用于单细胞处理中的质量控制的系统和方法
US11932899B2 (en) 2018-06-07 2024-03-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for characterizing nucleic acid molecules
US11703427B2 (en) 2018-06-25 2023-07-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for cell and bead processing
US20200032335A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 10X Genomics, Inc. Systems and methods for metabolome analysis
US11459607B1 (en) 2018-12-10 2022-10-04 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing-nucleic acid molecules from a single cell using sequential co-partitioning and composite barcodes
WO2020120442A2 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Dna Script Direct oligonucleotide synthesis on cells and biomolecules
US11845983B1 (en) 2019-01-09 2023-12-19 10X Genomics, Inc. Methods and systems for multiplexing of droplet based assays
US11851683B1 (en) 2019-02-12 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods and systems for selective analysis of cellular samples
US11467153B2 (en) 2019-02-12 2022-10-11 10X Genomics, Inc. Methods for processing nucleic acid molecules
SG11202108788TA (en) 2019-02-12 2021-09-29 10X Genomics Inc Methods for processing nucleic acid molecules
US11655499B1 (en) 2019-02-25 2023-05-23 10X Genomics, Inc. Detection of sequence elements in nucleic acid molecules
WO2020185791A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for processing optically tagged beads
AU2020280104A1 (en) 2019-05-22 2022-01-20 Mission Bio, Inc. Method and apparatus for simultaneous targeted sequencing of DNA, RNA and protein
WO2021003255A1 (en) 2019-07-01 2021-01-07 Mission Bio Method and apparatus to normalize quantitative readouts in single-cell experiments
US11851700B1 (en) 2020-05-13 2023-12-26 10X Genomics, Inc. Methods, kits, and compositions for processing extracellular molecules
CN116997411A (zh) 2021-01-13 2023-11-03 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 使用胶体组装的表面结构化
AU2022227563A1 (en) 2021-02-23 2023-08-24 10X Genomics, Inc. Probe-based analysis of nucleic acids and proteins
WO2023122363A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Illumina Software, Inc. Dynamic graphical status summaries for nucelotide sequencing
US20230215515A1 (en) 2021-12-23 2023-07-06 Illumina Software, Inc. Facilitating secure execution of external workflows for genomic sequencing diagnostics
WO2023129764A1 (en) 2021-12-29 2023-07-06 Illumina Software, Inc. Automatically switching variant analysis model versions for genomic analysis applications
WO2023225488A1 (en) 2022-05-16 2023-11-23 Enkefalos Biosciences, Inc. Blood-brain barrier translocating peptides and related molecules and methods of use thereof
US20240133892A1 (en) 2022-09-27 2024-04-25 Nautilus Subsidiary, Inc. Polypeptide capture, in situ fragmentation and identification

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2747570A (en) * 1954-05-19 1956-05-29 Jobst Conrad Means for assisting return circulation of fluids in an animal body
US3826249A (en) * 1973-01-30 1974-07-30 A Lee Leg constricting apparatus
US3908642A (en) * 1973-10-29 1975-09-30 Pred Vinmont Means for aerating and applying air pulsations within casts
US4206751A (en) * 1978-03-31 1980-06-10 Minnesota Mining And Manufacturing Company Intermittent compression device
US4801529A (en) * 1985-06-18 1989-01-31 Brandeis University Methods for isolating mutant microoganisms using microcapsules coated with indicator material
US5099030A (en) * 1987-03-09 1992-03-24 The Procter & Gamble Company Novel compounds, pharmaceutical compositions, and methods for treating inflammation and pain
KR0185192B1 (ko) * 1989-10-05 1999-04-01 제임스 더블유. 데이비 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리
WO1991012342A1 (en) * 1990-02-16 1991-08-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Improvements in the specificity and convenience of the polymerase chain reaction
DE476178T1 (de) 1990-09-21 1992-07-23 Bioplex Medical B.V., Vaals, Nl Geraet zum anbringen von blutstillendem stoff auf perforierten blutgefaessen.
GB9107628D0 (en) 1991-04-10 1991-05-29 Moonbrook Limited Preparation of diagnostic agents
US5955341A (en) * 1991-04-10 1999-09-21 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
WO1993003151A1 (en) * 1991-08-10 1993-02-18 Medical Research Council Treatment of cell populations
ATE161964T1 (de) 1991-10-15 1998-01-15 Multilyte Ltd Bindungstest unter benutzung eines markierten reagens
US5270170A (en) * 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5413924A (en) 1992-02-13 1995-05-09 Kosak; Kenneth M. Preparation of wax beads containing a reagent for release by heating
DE4223169C1 (de) 1992-07-10 1993-11-25 Ferring Arzneimittel Gmbh Verfahren zur Mikroverkapselung wasserlöslicher Wirkstoffe
RU2048522C1 (ru) * 1992-10-14 1995-11-20 Институт белка РАН Способ размножения нуклеиновых кислот, способ их экспрессии и среда для их осуществления
IL104384A (en) * 1993-01-13 1996-11-14 Yeda Res & Dev Method for screening catalytic non-enzyme polypeptides and proteins
US5436149A (en) 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension
AU6707194A (en) 1993-04-19 1994-11-08 Medisorb Technologies International L.P. Encapsulation of nucleic acids with conjugates that facilitate and target cellular uptake and gene expression
AU6815894A (en) * 1993-04-19 1994-11-08 Stuart A. Kauffman Random chemistry for the generation of new compounds
AU8124694A (en) * 1993-10-29 1995-05-22 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
DE4402038A1 (de) 1994-01-25 1995-07-27 Borries Horst Von Durchdrückpackung
AU710504B2 (en) * 1994-03-15 1999-09-23 Brown University Research Foundation Polymeric gene delivery system
US5508348A (en) * 1994-08-12 1996-04-16 The Research Foundation Of Suny Inverted emulsion pathways to conductive polymers
US5680283A (en) * 1994-09-30 1997-10-21 Kabushiki Kaisha Toshiba Magnetic head and magnetic disk drive
KR19990008000A (ko) 1995-04-24 1999-01-25 로버트 에스. 화이트 헤드 새로운 대사 경로를 만들고 이를 스크리닝하는 방법
US5910408A (en) * 1995-06-07 1999-06-08 The General Hospital Corporation Catalytic DNA having ligase activity
US5756122A (en) 1995-06-07 1998-05-26 Georgetown University Liposomally encapsulated nucleic acids having high entrapment efficiencies, method of manufacturer and use thereof for transfection of targeted cells
US5989892A (en) * 1995-06-14 1999-11-23 Tonen Corporation Microorganisms, demulsifiers and processes for breaking an emulsion
WO1997004748A2 (en) 1995-08-01 1997-02-13 Advanced Therapies, Inc. Enhanced artificial viral envelopes for cellular delivery of therapeutic substances
DE19646372C1 (de) * 1995-11-11 1997-06-19 Evotec Biosystems Gmbh Genotyp und Phänotyp koppelnde Verbindung
GB9608540D0 (en) * 1996-04-25 1996-07-03 Medical Res Council Isolation of enzymes
US5876711A (en) * 1996-05-31 1999-03-02 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for determining the tumor suppressor status of cells
US6083693A (en) 1996-06-14 2000-07-04 Curagen Corporation Identification and comparison of protein-protein interactions that occur in populations
US5876771A (en) * 1996-06-20 1999-03-02 Tetra Laval Holdings & Finance, Sa Process and article for determining the residence time of a food particle
WO1998013502A2 (en) 1996-09-27 1998-04-02 Icos Corporation Method to identify compounds for disrupting protein/protein interactions
US6395524B2 (en) 1996-11-27 2002-05-28 University Of Washington Thermostable polymerases having altered fidelity and method of identifying and using same
US6310354B1 (en) * 1996-12-03 2001-10-30 Erkki Soini Method and a device for monitoring nucleic acid amplification reactions
EP1712623B1 (en) 1997-01-21 2011-10-19 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
GB9703369D0 (en) * 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6023540A (en) * 1997-03-14 2000-02-08 Trustees Of Tufts College Fiber optic sensor with encoded microspheres
AU6571598A (en) 1997-03-18 1998-10-12 Chromaxome Corporation Methods for screening compounds using encapsulated cells
US6048551A (en) * 1997-03-27 2000-04-11 Hilfinger; John M. Microsphere encapsulation of gene transfer vectors
DE69826697T2 (de) 1997-07-07 2006-02-16 Medical Research Council In vitro selektionsmethode
JP2981547B1 (ja) * 1998-07-02 1999-11-22 農林水産省食品総合研究所長 クロスフロー型マイクロチャネル装置及び同装置を用いたエマルションの生成または分離方法
WO2000004139A1 (en) 1998-07-17 2000-01-27 Mirus Corporation Micellar systems
GB9900298D0 (en) * 1999-01-07 1999-02-24 Medical Res Council Optical sorting method
GB9921155D0 (en) 1999-09-08 1999-11-10 Medical Res Council Selection system
CN1189159C (zh) * 2000-05-05 2005-02-16 欧莱雅 含水溶性美容活性组分水性核的微胶囊及含其的组合物
GB0022458D0 (en) * 2000-09-13 2000-11-01 Medical Res Council Directed evolution method
US6936264B2 (en) * 2001-03-05 2005-08-30 The Procter & Gamble Company Delivery of reactive agents via multiple emulsions for use in shelf stable products
JP3570714B2 (ja) * 2001-05-24 2004-09-29 株式会社リコー 現像剤収納容器及び画像形成装置
GB0114856D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Selection by avidity capture
GB0127564D0 (en) * 2001-11-16 2002-01-09 Medical Res Council Emulsion compositions
GB0221053D0 (en) * 2002-09-11 2002-10-23 Medical Res Council Single-molecule in vitro evolution
AU2003302770B2 (en) 2002-12-20 2007-07-12 Caliper Life Sciences, Inc. Single molecule amplification and detection of DNA
WO2004069849A2 (en) * 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Bead emulsion nucleic acid amplification

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002534085A (ja) * 1999-01-07 2002-10-15 メディカル リサーチ カウンシル 光学的分取方法
JP2011092218A (ja) * 1999-01-07 2011-05-12 Medical Research Council 光学的分取方法
JP2007535892A (ja) * 2003-01-29 2007-12-13 ４５４ コーポレーション ビーズエマルジョン核酸増幅
JP2006522325A (ja) * 2003-03-31 2006-09-28 メディカル リサーチ カウンシル コンパートメント化スクリーニングによる選択
JP2011221028A (ja) * 2003-03-31 2011-11-04 Medical Research Council コンパートメント化スクリーニングによる選択
JP2012070750A (ja) * 2003-03-31 2012-04-12 Medical Research Council マイクロカプセルを用いたコンビナトリアルライブラリの合成および試験の方法
JP2015092164A (ja) * 2003-03-31 2015-05-14 メディカル リサーチ カウンシル コンパートメント化スクリーニングによる選択
JP2018194552A (ja) * 2003-03-31 2018-12-06 メディカル リサーチ カウンシルＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ コンパートメント化スクリーニングによる選択
JP2022068841A (ja) * 2004-10-08 2022-05-10 メディカル リサーチ カウンシル マイクロ流体システム内のインビトロ進化
JP4829240B2 (ja) * 2004-10-12 2011-12-07 メディカル リサーチ カウンシル マイクロ流体制御による区画化されたスクリーニング
JP2011019461A (ja) * 2009-07-16 2011-02-03 Japan Science & Technology Agency エマルジョンを用いたｒｎａの選択的増幅法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1908832A3 (en) 2009-05-20
CA2295324A1 (en) 1999-01-21
ES2294427T3 (es) 2008-04-01
AU8123198A (en) 1999-02-08
GB9929447D0 (en) 2000-02-09
EP1019496A1 (en) 2000-07-19
GB2342094A (en) 2000-04-05
ATE374815T1 (de) 2007-10-15
ATE358177T1 (de) 2007-04-15
JP4298912B2 (ja) 2009-07-22
DK1496120T3 (da) 2007-07-30
GB2342094B (en) 2002-10-23
US20070077579A1 (en) 2007-04-05
ES2402516T3 (es) 2013-05-06
DE69838521D1 (de) 2007-11-15
ATE278013T1 (de) 2004-10-15
DK1019496T3 (da) 2005-01-10
US20030124586A1 (en) 2003-07-03
JP2007143563A (ja) 2007-06-14
ES2230701T3 (es) 2005-05-01
CA2792122C (en) 2015-09-08
EP1482036B1 (en) 2007-10-03
CA2792122A1 (en) 1999-01-21
JP4299255B2 (ja) 2009-07-22
US9528106B2 (en) 2016-12-27
EP1801214B1 (en) 2010-11-10
EP2258846A2 (en) 2010-12-08
US7638276B2 (en) 2009-12-29
EP1801214A3 (en) 2009-05-20
EP1482036A2 (en) 2004-12-01
US20050069920A1 (en) 2005-03-31
DE69826697D1 (de) 2004-11-04
AU736836B2 (en) 2001-08-02
EP1908832A2 (en) 2008-04-09
EP1496120A2 (en) 2005-01-12
US20070259374A1 (en) 2007-11-08
PT1496120E (pt) 2007-04-30
US7582446B2 (en) 2009-09-01
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