ES2374910T3 - Polimerasas de adn termoestables modificadas para secuenciación. - Google Patents
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Abstract
SE PROPORCIONAN POLIMERASAS TERMOESTABLES Y MODIFICADAS DE DNA QUE TIENEN UNA MAYOR EFICIENCIA PARA INCORPORAR NUCLEOTIDOS NO CONVENCIONALES, TALES COMO LOS MARCADOS CON COLORANTES DE LA FAMILIA DE LA FLUORESCEINA. ESTAS POLIMERASAS TERMOESTABLES MODIFICADAS DE DNA PUEDEN PREPARARSE POR PROCEDIMIENTOS CORRESPONDIENTES A LA TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE. LAS POLIMERASAS DE DNA TERMOESTABLES RECOMBINANTES PREPARADAS DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCION SON VENTAJOSAS EN MUCHAS APLICACIONES DE SINTESIS DEL DNA IN VITRO, TALES COMO EL SECUENCIAMIENTO DEL DNA, LA SINTESIS DEL DNA MARCADO Y LA PRODUCCION DE PRODUCTOS DE EXTENSION DE INICIADOR MARCADOS. LOS CITADOS ENZIMAS DE POLIMERASA SON PARTICULARMENTE UTILES EN LOS PROCEDIMIENTOS DE SECUENCIAMIENTO DEL ACIDO NUCLEICO DE TERMINACION DE LA CADENA. SE PROPORCIONAN IGUALMENTE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LAS POLIMERASAS RECOMBINANTES TERMOESTABLES DE DNA DE LA PRESENTE INVENCION, ASI COMO LOS VECTORES Y CELULAS HUESPEDES QUE LOS COMPRENDEN. SE PROPORCIONAN AL MISMO TIEMPO KITS QUE INCLUYEN LAS POLIMERASAS RECOMBINANTES TERMOESTABLES DEL DNA DE LA PRESENTE INVENCION. LAS POLIMERASAS Y PROCEDIMIENTO DE LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONAN IMPORTANTES VENTAJAS, EN CUANTO A COSTE Y EFICIENCIA, PARA EL SECUENCIAMIENTO DEL DNA.
Description
Polimerasas de ADN termoestables modificadas para secuenciación
Ámbito de la presente invención
La presente invención se refiere a polimerasas de ADN termoestables con mayor eficiencia para incorporar nucleósido trifosfatos marcados con colorantes de la familia de las fluoresceínas. La presente invención proporciona medios para aislar y producir este tipo de polimerasas modificadas. Los enzimas de la presente invención sirven para muchas aplicaciones en biología molecular.
Antecedentes de la presente invención
La incorporación de nucleósido trifosfatos (dNTPs) marcados con colorantes fluorescentes es importante para muchas aplicaciones de síntesis de ADN in vitro. Por ejemplo, las reacciones de secuenciación de ADN mediante terminador marcado con colorante requieren la incorporación de análogos de didesoxinucleótidos fluorescentes para la terminación y el marcado. Además la síntesis in vitro de productos marcados puede implicar la incorporación de nucleótidos o análogos de nucleótidos fluorescentes. Por ejemplo, se ha empleado ADN con marcador fluorescente en ensayos de hibridación, usando micromatrices de muestras inmovilizadas (Cronin y otros, 1996, Human Mutation 7:244).
Para asegurar la fidelidad de la replicación de ADN, las polimerasas de ADN tienen una fuerte tendencia a la incorporación de sus substratos normales, denominados aquí desoxinucleótido trifosfatos (dNTPs) convencionales, y contra la incorporación de dNTPs no convencionales, incluyendo dNTPs y análogos de dNTPs marcados con colorantes fluorescentes. En la célula esta propiedad atenúa la incorporación de bases anormales como el dUTP a una cadena creciente de ADN. Esta característica es particularmente evidente in vitro, donde se encuentran ambos tipos de nucleósido trifosfato con marcador fluorescente, los convencionales y no convencionales, tal como en las reacciones de secuenciación de ADN con el uso de una versión del método didesoxi de terminación de la cadena mediante terminadores colorantes (Lee y otros, 1992, Nuc. Acids. Res. 20:2471, la cual se incorpora aquí como referencia).
Los kits de secuenciación cíclica de ADN disponibles en el comercio para los métodos de terminación con colorante llevan como terminadores de cadena ddNTPs marcados con colorantes fluorescentes de la familia de la rodamina. Sin embargo los colorantes de rodamina son de carga zwitteriónica y los nucleósido trifosfatos marcados con estos colorantes migran anormalmente en los geles electroforéticos usados para separar los productos de secuenciación a detectar. Esta propiedad de la familia de los colorantes de rodamina obliga a modificar el protocolo de secuenciación estándar, incluyendo el uso de dITP y una etapa de proceso adicional antes de la electroforesis.
En cambio los colorantes de carga negativa, como los de la familia de la fluoresceína, permiten 1) mejor separación entre los nucleósido trifosfatos marcados y los productos de extensión del cebador marcado, y 2) mejor migración electroforética de los productos de secuenciación marcados, en comparación con los colorantes de carga neutra o positiva. Por tanto el uso de colorantes de la familia de la fluoresceína evita la necesidad de las etapas adicionales de proceso que requiere el uso de colorantes de la familia de la rodamina. Sin embargo los colorantes disponibles de la familia de la fluoresceína no son ideales para los formatos comerciales de secuenciación cíclica de ADN usuales, porque al emplear estos formatos los ddNTPs marcados con estos colorantes no se incorporan eficientemente a los productos de secuenciación. Por consiguiente se necesitan polimerasas de ADN termoestables, comercialmente disponibles, capaces de incorporar eficientemente tanto nucleótidos convencionales como nucleótidos marcados con fluoresceína. La presente invención sirve para satisfacer esta necesidad. Además, una propiedad inesperada de los enzimas mutantes de la presente invención es la mayor tasa de extensión del cebador respecto al correspondiente enzima natural. Otra propiedad inesperada es una incorporación más uniforme de varios nucleótidos terminadores en el análisis automatizado de la secuencia de ADN.
Resumen de la presente invención
La presente invención proporciona enzimas termoestables de polimerasa de ADN dependientes de molde con menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con los enzimas caracterizados anteriormente. Estos enzimas incorporan nucleótidos, incluyendo desoxinucleótidos (dNTPs) y análogos de bases como los didesoxinucleótidos (ddNTPs), que están marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína de manera más eficiente que los enzimas termoestables convencionales.
Por la presente invención, en las polimerasas de ADN termoestables se identifica una región crítica que afecta a la capacidad de la polimerasa para incorporar nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, pero manteniendo la capacidad de incorporar fielmente nucleótidos naturales.
Así, en un aspecto, la presente invención proporciona enzimas recombinantes termoestables de polimerasa de ADN, que se caracterizan por haber sido mutados para producir el motivo crítico y tener menor discriminación contra la
incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con los correspondientes enzimas de tipo natural.
Se describen enzimas recombinantes termoestables de polimerasa de ADN caracterizados porque a) en su forma nativa dicha polimerasa comprende la secuencia aminoácida (indicada en código de una letra) LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es un aminoácido cualquiera; b) la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada en comparación con dicha secuencia nativa, pero no a E; y c) dicha polimerasa termoestable de ADN tiene una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 1), donde “Xaa” en las posiciones 3, 4, 6, 9 y 10 de esta secuencia es cualquier resto de aminoácido y “Xaa” en la posición 7 de esta secuencia es Val o Ile.
En una forma de ejecución las polimerasas recombinantes termoestables de ADN se caracterizan porque a) la forma nativa de la polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSQXL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 2), donde la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada a K; y c) dicha polimerasa termoestable de ADN tiene una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 2), donde “Xaa” en la posición 3 es Gln, “Xaa” en la posición 4 es Lys y “Xaa” en la posición 6 es Ser o Ala. En una forma de ejecución preferida la secuencia de aminoácidos es LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), donde es Lys. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida está representada por LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), donde “Xaa” en la posición 4 es Lys.
Además se describen polimerasas recombinantes termoestables de ADN caracterizadas porque a) la forma nativa de la polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 4); b) la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada en comparación con dicha secuencia nativa, pero no a E; y c) dicha polimerasa termoestable de ADN tiene una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 4), donde “Xaa” en la posición 4 es un aminoácido cualquiera y “Xaa” en la posición 7 es Val o Ile. Asimismo la secuencia aminoácida es LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO: 5), donde la X en posición 4 es un aminoácido cualquiera. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida está representada por LeuSerVaIXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO: 5), donde “Xaa” en la posición 4 es un aminoácido cualquiera o Arg. Además la secuencia aminoácida es LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO: 6), donde la X en la posición 4 es un aminoácido cualquiera. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerValXaaLeuGlyIleProvalLysGlu (SEQ ID NO: 6), donde “Xaa” en la posición 4 es un aminoácido cualquiera o Arg.
En otro aspecto se describe que la región crítica particular de la presente invención se puede combinar con motivos de otras regiones del gen de polimerasa que como es sabido proporcionan polimerasas termoestables de ADN con menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos no convencionales tales como rNTPs y ddNTPs. Tal como se ejemplifica aquí, se construyó un enzima recombinante de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) que contenía dos mutaciones. La primera fue una mutación de E a K en el resto X de la posición 4 del motivo crítico de la presente invención. La segunda fue una mutación que permite una incorporación más eficiente de ddNTPs, conocida como la mutación F667Y. Esta mutación es de fenilalanina a tirosina en la posición 667 de la ADN taq polimerasa (descrita en las patentes U.S. nº 5,614,365 y U.S. nº de serie 8/448,223).
Al usarlo en una reacción de secuenciación con ddNTPs marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína se encontró que el enzima doble mutante E681K F667Y producía una escalera de secuenciación legible. De este modo, un motivo que confiere menor discriminación hacia los didesoxinucleótidos se combina con el motivo crítico de la presente invención para producir un enzima que incorpora con mayor eficiencia los ddNTPs, tanto marcados como no marcados.
Además se encontró de manera inesperada que el enzima mutante E681K F667Y mostraba una tasa de extensión significativamente mayor en comparación con un enzima que solo tenía la mutación F667Y. Así pues, en otra forma de ejecución de la presente invención, la introducción del motivo crítico en un enzima termoestable de polimerasa de ADN, solo o combinado con otros motivos, produce enzimas con una mayor tasa de extensión. De modo inesperado se encontró que el enzima doble mutante también producía picos de altura uniforme en la secuenciación didesoxi con terminadores marcados con colorantes de rodamina. Por tanto la introducción del motivo crítico en un enzima termoestable de ADN polimerasa produce enzimas que presentan picos de altura más uniforme al usar terminadores marcados con colorantes de la familia de la rodamina.
También se describe una mutación que permite una incorporación más eficiente de rNTPs, tales como la mutación de ácido glutámico a glicina en la posición 615 de la ADN taq polimerasa, o la mutación E615G (descrita en la solicitud de patente europea nº EP-A-823 479, incorporada aquí como referencia), que se combina con el motivo crítico de la presente invención para proporcionar un enzima capaz de incorporar de manera más eficiente los ribonucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína.
También se describen genes que codifican las polimerasas proporcionadas por la presente invención. En concreto se proporcionan genes codificadores de las polimerasas recombinantes termoestables que comprenden el motivo crítico de la presente invención. En este aspecto también se incluyen genes codificadores de combinaciones de dos
o más mutaciones productoras del motivo crítico de la presente invención.
También se describen mejores métodos de secuenciación de ADN, que permiten usar menores concentraciones de ddNTPs marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y reducir por tanto el coste de realización de las reacciones. Los métodos mejorados permiten asimismo usar menores proporciones de los ddNTPs marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína respecto a los dNTPs. El uso de estos métodos proporciona numerosas ventajas, incluyendo polimerización más eficiente, menores concentraciones del ácido nucleico molde necesario y una menor probabilidad de introducción de inhibidores en la mezcla reactiva. Estas ventajas también facilitan la secuenciación de moldes largos. Además se describen métodos de secuenciación cuyas reacciones se pueden cargar directamente en geles de secuenciación para la subsiguiente electroforesis, sin purificación intermedia.
También se describen mejores métodos para determinar la secuencia de un ácido nucleico diana mediante el uso de un enzima recombinante que tiene a) una mutación en la posición 4 que produce el motivo crítico de la presente invención y b) una menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con el correspondiente enzima de tipo natural. También se describen mejores métodos de secuenciación, mediante el uso de enzimas termoestables de ADN polimerasa, derivados de especies termófilas, que contienen variaciones de la secuencia natural productoras del motivo crítico de la presente invención. Estos enzimas nativos también pueden disminuir la discriminación contra la incorporación de nucleótidos no convencionales. Asimismo se describen mejores métodos de secuenciación mediante el empleo de una ADN polimerasa nativa termoestable que tiene a) el motivo crítico de la presente invención, donde el aminoácido en posición 4 no es Glu y b) menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína.
También caen dentro del ámbito de la presente invención los métodos mejorados de producción de ADN marcado con colorantes de la familia de la fluoresceína. Los enzimas de la presente invención incorporan eficientemente dNTPs marcados con fluoresceína a un método de reacción en cadena de la polimerasa, produciendo productos amplificados que están marcados en varios sitios con colorantes de la familia de la fluoresceína. Por tanto, según una forma de ejecución, un método mejorado para marcar ADN comprende a) preparar una mezcla reactiva que comprenda dNTPs marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y un enzima de la presente invención y b) efectuar una reacción de amplificación de ácido nucleico.
Descripción breve del dibujo
La figura 1 es una representación esquemática del gen de ADN taq polimerasa. Se indican los sitios de restricción referidos al ejemplo I y a la descripción de los métodos de preparación de mutantes adicionales y de vectores de expresión aquí facilitados.
Descripción detallada de la presente invención
Para facilitar la comprensión de la presente invención se define seguidamente una serie de términos.
El término “gen” se refiere a una secuencia de ADN que comprende secuencias de control y codificación necesarias para producir un polipéptido o precursor bioactivo recuperable. El polipéptido puede ser codificado por la secuencia completa de un gen o por cualquier porción de la secuencia codificadora que mantenga la actividad enzimática.
El término “nativo” se refiere a un gen o producto genético aislado de una fuente natural. Este término también se refiere a una forma recombinante de la forma proteica natural, producida por técnicas de biología molecular, que tiene una secuencia aminoácida idéntica a la de la forma natural.
El término “mutante” se refiere a un gen cuya secuencia de ácido nucleico ha sido variada o a un producto genético cuya secuencia aminoácida ha sido modificada, dando como resultado un producto genético cuyas propiedades funcionales pueden estar alteradas en comparación con el gen o producto genético nativo. Estas modificaciones incluyen mutaciones puntuales, deleciones e inserciones.
El término “célula(s) huésped” se refiere a organismos unicelulares procariotas y eucariotas tales como bacterias, levaduras, y actinomicetos y a células simples de plantas superiores o de animales, cuando se hacen crecer en cultivos celulares.
El término “sistema de expresión” se refiere a secuencias de ADN que contienen una secuencia codificadora deseada y secuencias de control en ligamiento operable, de manera que las células huésped transformadas con estas secuencias son capaces de producir las proteínas codificadas. Para efectuar la transformación el sistema de expresión se puede incluir en un vector, no obstante el ADN relevante también puede integrarse en el cromosoma huésped.
Tal como se emplea aquí, el término “oligonucleótido” se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres y usualmente más de diez. El tamaño exacto de un oligonucleótido dependerá de muchos factores, incluyendo su función o uso fundamental.
Los oligonucleótidos se pueden preparar por cualquier método adecuado, incluyendo por ejemplo la clonación y restricción de secuencias apropiadas y la síntesis química directa mediante procedimientos tales como el método de fosfotriéster de Narang y otros, 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; el método de fosfotriéster de Brown y otros, 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; el método de dietilfosforamidita de Beaucage y otros, 1981, Tetrahedron Lett. 22:18591862; el método de triéster de Matteucci y otros, 1981, J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191 o por métodos de síntesis automatizados; y mediante el método de soporte sólido de la patente U.S. nº 4,458,066.
Tal como se emplea aquí, el término “cebador” se refiere a un oligonucleótido, natural o sintético, capaz de actuar como punto de iniciación de síntesis cuando se halla en las condiciones en que se inicia la extensión del cebador. Un cebador es preferiblemente un oligodesoxirribonucleótido monocatenario. La longitud apropiada de un cebador depende del uso previsto; normalmente es de 15 a 35 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas requieren en general temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. No hace falta que el cebador refleje la secuencia exacta del molde, pero debe ser suficientemente complementario para que se hibride con un molde, a fin de que se produzca el alargamiento del cebador.
Si se desea, un cebador se puede marcar incorporando un marcador detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Como marcadores útiles cabe mencionar, por ejemplo, 32P, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (como los empleados frecuentemente en los ensayos ELISA), biotina o haptenos y proteínas para las cuales se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales.
El término “polimerasa termoestable” se refiere a un enzima estable y resistente al calor que conserva suficiente actividad para efectuar las subsiguientes reacciones de extensión del cebador y que no se desnaturaliza (inactiva) irreversiblemente cuando está sometido a temperaturas altas durante el tiempo que requiere la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos son bien conocidas del estado técnico y están ejemplificadas en las patentes U.S. nº 4,683,202 y 4,683,195, las cuales se incorporan aquí como referencia. Tal como se usa aquí, una polimerasa termoestable es apropiada para ser empleada en una reacción térmica cíclica como la reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”). Para los fines de la presente invención, la desnaturalización irreversible se refiere a la pérdida permanente y completa de la actividad enzimática. Actividad enzimática de una polimerasa termoestable se refiere a la catálisis idónea de los nucleótidos para formar los productos de extensión del cebador complementarios de una cadena molde de ácido nucleico.
El término “convencional” o “natural”, aplicado a bases de ácido nucleico, nucleósido trifosfatos o nucleótidos, se refiere a los de origen natural que hay en el polinucleótido descrito (p.ej. dATP, dGTP, dCTP y dTTP para el ADN). Además en reacciones de síntesis de ADN in vitro como la secuenciación se usa frecuentemente dTTP y 7-deazadGTP en lugar de dGTP y también se puede usar 7-deaza-dATP en lugar de dATP. Todos ellos pueden designarse colectivamente como dNTPs.
El término “no convencional” o “modificado”, aplicado a una base de ácido nucleico, nucleósido o nucleótido, incluye modificaciones, derivaciones o análogos de bases, nucleósidos o nucleótidos de origen natural en un polinucleótido concreto. La forma desoxirribonucleótida de uracilo es una base no convencional o modificada en el ADN (dUMP), mientras que la forma ribonucleótida de uracilo es una base convencional en el ARN (UMP). Tal como se usan aquí, los nucleótidos no convencionales incluyen, sin limitarse a ellos, los compuestos empleados como terminadores para secuenciar los ácidos nucleicos. Los compuestos terminadores incluyen, sin limitarse a ellos, aquellos que tienen una estructura 2’,3’ didesoxi y se designan como didesoxinucleósido trifosfatos. Los didesoxinucleósido trifosfatos ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se designan colectivamente como ddNTPs. Otros nucleótidos no convencionales incluyen fósforotioato dNTPs ([a-S]dNTPs), 5’-a-borano-dNTPs, a-metil-fosfonato dNTPs y ribonucleósido trifosfatos (rNTPs). Las bases no convencionales se pueden marcar con isótopos radiactivos P32, P33 o S35; con marcadores fluorescentes; con marcadores quimioluminiscentes; con marcadores bioluminiscentes; con haptenos como biotina o con marcadores enzimáticos como estreptavidina o avidina. Los marcadores fluorescentes pueden incluir colorantes de carga negativa como los de la familia de la fluoresceína, de carga neutra como los de la familia de la rodamina o de carga positiva como los de la familia de la cianina. Los colorantes de la familia de la fluoresceína incluyen p.ej. FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Los colorantes de la familia de la rodamina incluyen rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA. Perkin-Elmer (Foster City, CA) comercializa FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, y TAMRA y Molecular Probes el rojo Texas. Los colorantes de la familia de la cianina incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y son comercializados por Amersham (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).
El término “reacción de síntesis de ADN” se refiere a métodos para producir copias de ADN, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, PCR, amplificación por desplazamiento de la hebra, amplificación mediada por transcripción, extensión del cebador y transcripción inversa.
Se describen composiciones nuevas y mejoradas que son ADN polimerasas termoestables. Los enzimas descritos incluyen polimerasas recombinantes que incorporan de manera más eficiente los nucleósido trifosfatos marcados
con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con los correspondientes enzimas naturales. Las ADN polimerasas termoestables son más adecuadas y deseadas para usar en procesos tales como la secuenciación de ADN y la síntesis in vitro de productos marcados que las polimerasas del estado técnico anterior. Los métodos mejorados de secuenciación de ADN incluyen el uso de estas polimerasas recombinantes, así como el empleo de enzimas nativos que incorporan más eficientemente nucleósido trifosfatos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con los enzimas anteriormente caracterizados.
Las ADN polimerasas termoestables descritas poseen una región crítica en la secuencia aminoácida del dominio activo de polimerasa del enzima. La región crítica en la secuencia aminoácida de una ADN polimerasa termoestable descrita se indica más adelante, usando el código convencional de una sola letra para los aminoácidos (Lehninger, Biochemistry, Nueva York, Nueva York, Worth Publishers Inc., 1970, página 67). SEQ ID NO: 7 LSXXLX(V/I)PXXE, donde la “X” en la posición 4 representa cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras para los aminoácidos esta secuencia está representada por LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 7), donde “Xaa” en las posiciones 3, 6, 9 y 10 es cualquier aminoácido, “Xaa” en la posición 4 de esta secuencia es cualquier aminoácido menos un resto de ácido glutámico (Glu) y “Xaa” en la posición 7 es Val o Ile. Esta región crítica proporciona enzimas de ADN polimerasa termoestable caracterizados por la capacidad de incorporar de modo eficiente nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína.
Por ejemplo, en un derivado del gen de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) que ya contiene una mutación de glicina a ácido aspártico en la posición 46 (G46D) y una mutación F667Y, una mutación de G a A en la primera posición del codón para ácido glutámico en el resto 681 de la secuencia completa de la ADN taq polimerasa (que corresponde a la posición 4 del motivo crítico) da como resultado un enzima que posee el motivo crítico. Este enzima muestra 1) un incremento de 2 a 10 veces aproximadamente en la eficiencia de la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, sin que empeore la capacidad del enzima para mediar en la PCR en presencia de nucleótidos convencionales y 2) un incremento de 3 a 4,3 veces en la tasa de extensión. En la ADN taq polimerasa esta mutación concreta produce un cambio del aminoácido E (ácido glutámico) a K (lisina).
Aunque este cambio concreto de aminoácido produjo el motivo crítico y altera significativamente la capacidad del enzima para incorporar nucleótidos no convencionales, se espera que el cambio específico de E a K no sea tan crítico para la presente invención como la posición identificada ahora dentro de la región crítica.
En una forma de ejecución preferida la presente invención se caracteriza porque el enzima (a) tiene una menor discriminación contra los nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y (b) comprende la secuencia aminoácida LSQXL(S/A)IPYEE, donde X es K (SEQ ID NO: 2). En el código de tres letras esta secuencia aminoácida se representa del modo siguiente: LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu, donde “Xaa” en la posición 3 es Gln, “Xaa” en la posición 4 es Lys y “Xaa” en la posición 6 es Ser o Ala.
En una forma de ejecución más preferida la presente invención el enzima que tiene menor discriminación contra los nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína lleva la secuencia aminoácida LSQXLAIPYEE, donde X es K (SEQ ID NO: 3). En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu, donde “Xaa” en la posición 4 es un resto K.
La caracterización de la mutación E681K aquí descrita identificó una región del gen de la ADN polimerasa que afecta a la capacidad de la polimerasa para interactuar con nucleótidos fluorescentes de carga negativa. El sitio, distal respecto a la hélice O, se halla al final de la hélice Oa y al comienzo de la hélice Ob de la polimerasa (Kim, y otros, 1995, Nature, 376:612). Basándose en principios de modelado molecular bien conocidos del estado técnico cabe esperar que otros cambios en la estructura de la hélice Oa-Ob, aparte de la mutación E a K en posición 681, también produzcan variaciones en la capacidad de discriminación de la polimerasa contra los nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína. También se describe una ADN polimerasa recombinante termoestable que se caracteriza porque (a) en su forma nativa la polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido, (b) la polimerasa recombinante incluye al menos una mutación dentro de la secuencia aminoácida, exceptuando que en la posición 4 X no está mutado a E, y
(c) el enzima tiene menor discriminación hacia la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con el correspondiente enzima nativo.
La capacidad de los enzimas de la presente invención para incorporar eficientemente nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína se mide mediante ensayos de incorporación de ddNTP. Uno de ellos es un ensayo competitivo de extensión del cebador en condiciones de molde limitante. En este ensayo un cebador DG48 (5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC), (SEQ ID NO: 11), unido al molde M13mp18 (Innis y otros, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436) se extiende en presencia de [a-P33]dCTP y enzima en exceso, con varios niveles de ddNTP con marcador fluorescente, Zowie-ddCTP. Como la incorporación de un resto de ddCTP termina la reacción de extensión, cuanto mayor es la facilidad de una ADN polimerasa para incorporar un ddCTP a un cebador extendido, menor es la posibilidad de incorporar [a-P33]dCTP. Así pues, al aumentar la eficiencia de incorporación de ddCTP con marcador fluorescente se incrementa el grado de inhibición de la síntesis de ADN. Las reacciones también se realizaron con varios niveles de un ddCTP no marcado. Se calcularon las concentraciones de ddCTP y Zowie-ddCTP necesarias para un 50% de inhibición y se compararon con el fin de indicar una medida relativa de la
capacidad del enzima para incorporar el nucleótido marcado con colorante fluorescente. Los detalles del ensayo de incorporación de ddNTP se indican en el ejemplo II.
Por tanto, en una forma de ejecución de la presente invención, la característica de menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína se mide mediante el ensayo de incorporación de ddNTP fluorescente que está descrito en el ejemplo II. En una forma de ejecución preferida la concentración de un ddNTP marcado con un colorante de fluoresceína, Zowie-ddCTP, necesaria para un 50% de inhibición de la síntesis de ADN se reduce al menos 3 veces en el caso de un enzima mutante de la presente invención, respecto al enzima natural. En una forma de ejecución más preferida la concentración se reduce al menos 5 veces. En la forma de ejecución más preferida la concentración se reduce al menos 10 veces. En otra forma de ejecución la característica de menor discriminación se ensaya midiendo la incorporación de dNTP fluorescente.
Como se describe más adelante la secuencia genética y el enzima de ADN polimerasa termoestable proceden de varias especies termófilas. En una forma de ejecución la secuencia genética y el enzima de ADN polimerasa son del Thermus aquaticus. También se describe la secuencia genética y el enzima de otras especies termófilas distintas de Thermus. Se dispone de la secuencia ácido nucleica y aminoácida completa para numerosas ADN polimerasas termoestables. Las secuencias de las respectivas polimerasas de Taq, Thermus thermopilus (Tth), Thermus especie Z05, Thermus especie sps17, Thermotoga maritima (Tma) y Thermosipho africanus (Taf) se han revelado en la solicitud de patente internacional nº PCT/U.S.91/07035, publicada el 16 de abril de 1992 como patente PCT nº WO 92/06200.
Las secuencias de las ADN polimerasas de Thermus flavus, Bacillus caldotenax y Bacillus stearothermophilus han sido publicadas respectivamente por Akhmetzjanov y Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20 (21):5839, Uemori y otros, 1993, J. Biochem. 113:401-410, y como número de acceso BSU23149.ng de la base de datos NG:New GenBank. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable procedente de Thermus caldophilus se encuentra en el EMBL/GenBank con el número de acceso U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable procedente de Thermus filiformis se puede recuperar de la ATCC, nº de depósito 42380, empleando los métodos aportados en la patente U.S. nº 4,889,818, así como la información de secuencias ofrecida en la tabla 1. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana procede de la base de datos de patentes GeneSeq, nº de acceso R98144 (también revelada en la patente PCT WO 97/09451).
- Tabla 1
- Organismo
- Motivo crític o Pos. de am inoácido crítico
- J
- Consenso
- L S/a - - L/i - - - - - E
- Thermus aquaticus
- L S Q E L A I P Y E E 681
- Thermus flavus
- L S G E L S I P Y E E 679
- Thermus thermophilus
- L S Q E L A I P Y E E 683
- Thermus especie Z05
- L S Q E L A I P Y E E 683
- Thermus especie sps17
- L S Q E L S I P Y E E 679
- Thermus caldophilus
- L S Q E L A I P Y E E 683
- Thermus filiformis
- L S Q E L S I P Y E E 679
- Thermotoga maritima
- L S V R L G V P V K E 744
- Thermotoga neapolitana
- L S V R L G I P V K E 744
- Thermosipho africanus Bacillus caldotenax1
- L L S A K Q R N I L G N L I S S V R S K E E 743 725, 724
- Bacillus stearothermophilus2
- L A Q N L N I T R K E 724, 727, 802
- 1.
- Secuencia proteica del nº de acceso D12982, Uemori T., Ishino Y., Fujita K., Asada K., Kato I. “Clonación del gen de ADN polimerasa de Bacillus caldotenax y caracterización del producto genético” J. Biochem. 113:401 (1993). En esta secuencia el resto crítico es 725. Se proporciona una secuencia proteica casi idéntica como putativa, ADN polimerasa de “Bacillus stearothermophilus” en el nº de acceso R45155 y WPI 93-408323/51. En esta secuencia el resto crítico es 724.
- 2.
- Hay varias presentaciones de secuencias de ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus en las bases de datos GeneBank o SwissProt/PIR. Aunque estas secuencias están muy relacionadas y difieren algo entre sí, cada una contiene el mismo motivo L(S/A)XX(L/I)XXXXXE (SEQ ID NO: 9), donde X es cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida equivale a LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 9), donde “Xaa” en las posiciones 3, 6, 7, 8, 9 y 10 es cualquier aminoácido, “Xaa” en la posición 2 es Ser o Ala, “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu y “Xaa” en la posición 5 es Leu o Ile.
Las secuencias proteicas de la tabla anterior que comprenden el resto crítico del motivo crítico en la posición 724 están disponibles a través de las patentes J 05 304 964A, EP 699.760 y del nº de acceso U33536. Otra secuencia proteica afín, aunque algo diferente, publicada en Gene 163:65-68 (1995), contiene el resto crítico del motivo crítico en la posición 727. Otra secuencia proteica afín, aunque algo diferente, con el nº de acceso U23149, para la Bst ADN polimerasa contiene el resto crítico del motivo crítico en la posición 802.
Como las ADN polimerasas de cada especie termófila son únicas, la posición del aminoácido de la región crítica es distinta para cada enzima. Los programas de alineación de secuencias aminoácidas y ácido nucleicas son de fácil acceso y, una vez reconocida la región específica, sirven de ayuda para identificar la secuencia exacta de la región de la presente invención. Estos programas de alineación de secuencias están disponibles a través de Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Una vez identificado el motivo concreto, estos programas, incluyendo “GAP”, “BESTFIT” y “PILEUP”, sirven de ayuda para localizar el motivo crítico. En la tabla 1 se muestra la posición de las regiones críticas para las ADN polimerasas termoestables de las especies termófilas ejemplificadas.
Independientemente de la posición exacta del motivo crítico LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7) en el dominio de polimerasa de una ADN polimerasa termoestable, en que la X en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto E, la presencia del motivo sirve para proporcionar ADN polimerasas termoestables que puedan incorporar de manera eficiente nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína. Por lo tanto la mutación del ácido glutámico conservado de las ADN polimerasas termoestables de Thermus flavus (Glu 679), Thermus thermophilus (Glu 683), Thermus especie Z05 (Glu 683), Thermus especie sps17 (Glu 679) Thermus caldophilus (Glu 683), Thermus filiformis (Glu 679) para producir el motivo crítico aumentarán la capacidad de la polimerasa de incorporar eficientemente nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína.
Asimismo, en vista de la naturaleza altamente conservada del motivo crítico ahora identificado, las nuevas ADN polimerasas termoestables se pueden identificar a base de su homología con, por ejemplo, la Taq ADN polimerasa o con las secuencias de otras ADN polimerasas de la tabla 1 (véanse por ejemplo las patentes U.S. 5,618,711 y 5,624,833).
Por lo tanto se describe una clase de enzimas que también incluye, por ejemplo, la ADN polimerasa termoestable y el correspondiente gen y los vectores de expresión de Thermus oshimai (Williams RA y otros, 1996, Int J Syst Bacteriol 46 (2): 403-408); Thermus silvanus y Thermus chliarophilus (Tenreiro S y otros, 1995, Int. J. Syst. Bacteriol 45 (4): 633-639); Thermus scotoductus (Tenreiro S y otros, 1995, Res. Microbiol 146 (4): 315-324); Thermus ruber ATCC 35948, (L.G. Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol 34: 498-499); y Thermus brockianus (Munster, M.J., 1986,
J. Gen. Microbiol 132: 1677).
Los especialistas en la materia reconocerán que dichas ADN polimerasas termoestables con mayor eficiencia para incorporar nucleótidos marcados con fluoresceína se construyen muy fácilmente por técnicas de ADN recombinante tales como la mutagénesis sitio-dirigida. Véase por ejemplo Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, segunda edición, capítulo 15.51, “Mutagénesis mediada por oligonucleótidos”, que se incorpora aquí como referencia. Esta técnica es actualmente estándar del estado técnico y se puede usar para crear todas las posibles clases de cambios de pares de bases en cualquier sitio determinado de un gen. El método se lleva a cabo mediante el empleo de un cebador de oligonucleótido sintético complementario de un fago monocatenario o ADN plásmido que debe mutarse, exceptuando una falta de coincidencia limitada que representa la mutación deseada. Resumiendo, el oligonucleótido sintético se emplea como cebador para dirigir la síntesis de una cadena complementaria del fago o del plásmido y el ADN bicatenario resultante se transforma en una bacteria huésped que soporta el fago o el plásmido. Las bacterias resultantes se pueden ensayar, por ejemplo, mediante análisis secuencial del ADN o hibridación de sondas, para identificar las placas o colonias que llevan la deseada secuencia genética mutada.
Tras la invención de la PCR, la mutagénesis dirigida por cebador (descrita en la patente U.S. nº 4,683,195, que se incorpora aquí como referencia) y el “solapamiento por PCR” (Higuchi, 1989, en PCR Technology, ed. Erlich, Stockton Press, New York, NY, págs. 61-70) han llegado a ser medios rutinarios para introducir cualquier mutación en cualquier posición de un gen.
El ADN mutado se puede recuperar del plásmido, del fásmido, del fago o de la reacción de amplificación por medios convencionales y se puede ligar a un vector de expresión para cultivar y purificar después el enzima resultante. Hay numerosos vectores de clonación y expresión que son adecuados para llevar a la práctica la presente invención, incluyendo sistemas mamíferos y bacterianos descritos, por ejemplo, en Sambrook y otros, 1989, arriba citado. La presente invención se ejemplifica, por conveniencia, empleando el promotor PL derivado de lambda (Shimatake y otros, 1981, Nature 292:128). El uso de este promotor se describe específicamente en la patentes U.S. nº 4,711,845 y 5,079,352, las cuales se incorporan aquí como referencia.
El plásmido pCS1 ha sido depositado en la ATCC el 28 de agosto de 1997 y se le dado el nº de acceso 98521. Este plásmido contiene un gen que codifica una ADN polimerasa termoestable y está mutado en la posición 681 del codón, de manera que en el polipéptido resultante el ácido glutámico está sustituido por lisina, y proporciona un medio de producir ADN polimerasas termoestables con mayor eficiencia para incorporar nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína. El ejemplo I ilustra el uso de sitios de restricción flanqueantes adecuados para la subclonación de la mutación E681K, a fin de crear otros enzimas de ADN polimerasa termoestable. Alternativamente, como se conoce la secuencia genética completa de numerosas ADN polimerasas termoestables, los especialistas en la materia que tienen acceso a los depósitos de la ATCC y a la información sobre secuencias ahí facilitada disponen fácilmente de otros medios para introducir la mutación E681K, tales como la digestión restrictiva y la sustitución de fragmentos.
Cuando se desea producir uno de los enzimas mutantes o nativos de la presente invención, o un derivado u homólogo de los mismos, la preparación del enzima implica normalmente la transformación de una célula huésped con el vector de expresión y el cultivo de la célula huésped transformada en condiciones que permitan la expresión. Los medios para transformar y cultivar células huésped transformadas son bien conocidos del estado técnico y están descritos detalladamente, por ejemplo, en Sambrook y otros, 1989, arriba citado.
Las ADN polimerasas termoestables de la presente invención se purifican normalmente a partir de la cepa de E. coli DG116 (depositada como ATCC 53606 el 7 de abril de 1987) transformada con un vector de expresión ligado operativamente a un gen que codifica una ADN polimerasa termoestable natural o modificada. Los métodos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen, por ejemplo, en el ejemplo I y en Lawyer y otros, 1993, PCR Methods and Applications 2:275-87, que se incorpora aquí como referencia.
Los enzimas termoestables descritos se pueden usar en cualquier aplicación en la cual se necesite o desee su actividad. Como ejemplos de aplicación cabe citar la secuenciación de ADN, el marcado de ADN y el marcado de productos de extensión del cebador. La presente invención mejora especialmente el método de Sanger de secuenciación de ADN mediante didesoxinucleótidos (Sanger y otros, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463). Los avances respecto al método básico de Sanger y otros han aportado nuevos vectores (Yanisch-Perron y otros, 1985 Gene 33:103-119) y análogos de bases (Mills y otros, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2232-2235, y Barr y otros, 1986, Biotechniques 4:428-432). Por lo general la secuenciación de ADN requiere una extensión del cebador dependiente de molde, en presencia de análogos de bases terminadores de cadena, que da como resultado una distribución de fragmentos parciales que luego se separan por tamaño. El procedimiento básico de secuenciación didesoxi implica (i) hibridar un cebador oligonucleótido, opcionalmente marcado, a un molde; (ii) extender el cebador con ADN polimerasa en cuatro reacciones separadas que contienen respectivamente una mezcla de dNTPs no marcados y una cantidad limitada de un agente terminador de cadena, tal como un ddNTP opcionalmente marcado; y (iii) resolver las cuatro series de productos de reacción en un gel de poliacrilamida/urea desnaturalizante de alta resolución. Los productos de reacción pueden detectarse en el gel por autorradiografía o por fluorescencia, dependiendo del marcador usado, y la imagen se puede examinar para inferir la secuencia nucleótida. Estos métodos emplean ADN polimerasas como el fragmento Klenow de E. coli Pol I o una ADN polimerasa de T7 modificada.
La disponibilidad de polimerasas termorresistentes tales como la Taq ADN polimerasa dio lugar a mejores métodos de secuenciación con ADN polimerasa termoestable (véase Innis y otros, 1988, arriba citado) y a modificaciones de los mismos, designados como “” (Murray, 1989, Nuc Acids Res. 17:8889). Como alternativa a la secuenciación didesoxi básica, la secuenciación cíclica es una amplificación asimétrica lineal de secuencias diana complementarias de la secuencia molde en presencia de terminadores de cadena. Un solo ciclo produce una familia de productos de extensión de todas las longitudes posibles. Tras la desnaturalización del producto de la reacción de extensión procedente del molde de ADN tienen lugar múltiples ciclos de hibridación y extensión del cebador en presencia de terminadores tales como los ddNTPs. La secuenciación cíclica requiere menos ADN molde que la secuenciación con terminación convencional de cadena. En la secuenciación cíclica las ADN polimerasas termoestables tienen varias ventajas; toleran las rigurosas temperaturas que requiere la hibridación específica del cebador a los ácidos nucleicos diana y los múltiples ciclos de desnaturalización a alta temperatura que tienen lugar en cada ciclo, p.ej. a 90-95ºC. Por este motivo la AmpliTaq® ADN polimerasa y sus derivados y descendientes han sido incluidos en los kits de secuenciación cíclica Taq comercializados por compañías como Perkin-Elmer, Norwalk, CT.
Existen dos versiones de métodos de secuenciación por terminación de cadena, secuenciación mediante colorantes acoplados al cebador y secuenciación por terminadores marcados con colorante. En la secuenciación mediante colorantes acoplados al cebador los terminadores ddNTP no están marcados y se utiliza un cebador marcado para detectar productos de extensión (Smith y otros, 1986, Nature 32:674-679). En la secuenciación de ADN mediante terminadores marcados con colorante se usa una ADN polimerasa para incorporar dNTPs y ddNTPs marcados con colorante fluorescente al final de un cebador de ADN (Lee y otros, arriba citado). Este proceso tiene la ventaja de no tener que sintetizar cebadores marcados con colorante. Además las reacciones de terminadores marcados con colorante son más convenientes, porque en el mismo tubo se pueden realizar las cuatro reacciones.
Ambos métodos, el de cebador-colorante y el de terminador-colorante, pueden automatizarse empleando un aparato de secuenciación automático fabricado por Applied Biosystems, Foster City, CA. (patente U.S. nº 5,171,534). Al usar el aparato, la mezcla reactiva de la secuenciación acabada se fracciona en un gel de poliacrilamida desnaturalizante montado en el aparato. En el fondo del aparato hay un láser que detecta los productos fluorescentes a medida que van electroforizándose a través del gel según su tamaño.
Para marcar los terminadores empleados en la secuenciación por terminadores marcados con colorante se usan habitualmente dos tipos de colorantes fluorescentes, los de carga negativa y los zwitteriónicos. Como colorantes fluorescentes de carga negativa cabe mencionar los de las familias de la fluoresceína y del BODIPY. Los colorantes de BODIPY (4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) están descritos en la solicitud de patente internacional nº WO 97/00967. Los colorantes zwitteriónicos incluyen los de la familia de la rodamina. En los kits de secuenciación cíclica comercialmente disponibles se usan terminadores marcados con derivados de rodamina. Sin embargo los terminadores marcados con rodamina son bastante caros y, antes de cargarlo en el gel, el producto debe separarse
de los ddNTPs marcados con colorante no incorporados, ya que migran junto con los productos de secuenciación. Los terminadores con colorantes de la familia de la rodamina estabilizan al parecer las estructuras en forma de horquilla en las regiones ricas en GC, haciendo que los productos migren anormalmente. Ello requiere el uso de dITP, que relaja la estructura secundaria, pero también afecta a la eficiencia de incorporación del terminador.
En cambio los terminadores marcados con fluoresceína eliminan la etapa de separación anterior a la carga del gel, porque tienen mayor carga negativa neta y migran más rápidamente que los productos de secuenciación. Además la migración electroforética de los productos de secuenciación marcados con fluoresceína es mejor que la de los productos de secuenciación marcados con rodamina. Aunque la Taq ADN polimerasa de tipo natural no incorpora eficientemente terminadores marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, ahora es posible hacerlo con el empleo de los enzimas modificados aquí descritos.
Por tanto también se describen métodos de secuenciación didesoxi mediante el empleo de enzimas que tienen el motivo crítico, así como kits para la realización del método. En una forma de ejecución el método de secuenciación de la presente invención consiste en:
a) proporcionar un enzima termoestable de ADN polimerasa recombinante caracterizado porque
i) en su forma nativa dicha polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1),
donde X es cualquier aminoácido,
ii) la X en la posición 4 de dicha secuencia está mutada respecto a dicha secuencia nativa, exceptuando la
mutación de X a E, y
iii) dicha ADN polimerasa termoestable tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos
marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína en comparación con la forma nativa de dicho enzima,
y
b) efectuar una reacción de secuenciación mediante terminadores marcados con colorante.
En otros métodos descritos posteriormente la forma nativa del enzima corresponde a la secuencia de aminoácidos LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 2), donde X es cualquier aminoácido. En el código de tres letras esta secuencia de aminoácidos está representada por LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 2), donde “Xaa” en la posición 3 es Gln o Gly, “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido y “Xaa” en la posición 6 es Ser o Ala. En una forma de ejecución más preferida la forma nativa de la secuencia aminoácida es LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), en que X es K. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida equivale a LeuSerGInXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), donde “Xaa” en la posición 4 es Lys.
Como se ha descrito arriba la secuenciación de ADN con ADN polimerasas termoestables requiere una mezcla de análogos de bases no convencionales que actúan como terminadores de cadena y nucleótidos convencionales en una relación específica de concentraciones que asegure la generación de una población de productos de extensión representativa de todos los posibles fragmentos de longitud comprendida en un intervalo de varios centenares de bases. Algunas ADN polimerasas termoestables utilizadas anteriormente para la secuenciación, tales como la Taq polimerasa de tipo natural, se caracterizan por incorporar preferentemente nucleótidos convencionales en presencia de una mezcla de nucleótidos convencionales y no convencionales. No obstante últimamente algunos han descrito que las ADN polimerasas termoestables permiten variar la relación entre análogos de bases no convencionales y bases convencionales desde cien hasta varios cientos o más de mil veces.
Una de estas polimerasas es el mutante F667Y de la Taq ADN polimerasa. Otro mutante similar es una Taq ADN polimerasa que tiene una mutación F667Y y otra mutación en la posición 46, en la cual un resto de glicina está reemplazado por un resto de ácido aspártico (G46D). Esta polimerasa mutante, conocida como AmpliTaq, FS, es producida por Hoffmann-La Roche y vendida por Perkin-Elmer. La F730YTma30 ADN polimerasa es otra de estas polimerasas. Esta polimerasa mutante es una combinación de 1) los nucleótidos 1-570 de la Taq ADN polimerasa modificada para codificar una mutación G46D y 2) los nucleótidos 571-2679 de la Tma ADN polimerasa modificada para codificar una mutación de ácido aspártico a alanina en la posición 323, una mutación de ácido glutámico a alanina en la posición 325 y una mutación de fenilalanina a tirosina en la posición 730 (solicitud de patente U.S. nº de serie 60/052065 y solicitud de patente europea nº 98112327.6). Otra polimerasa que incorpora análogos de bases no convencionales es una ADN polimerasa mutante F730Y de Thermotoga neapolitana (solicitud de patente internacional, nº de publicación WO 96/10640, WO 96/41014 y WO 97/09451). Para una determinada concentración de dNTP, el uso de estos enzimas permite reducir la concentración de rodamina-ddNTP aproximadamente 50 hasta varios cientos de veces, en comparación con las ADN polimerasas termoestables anteriormente disponibles.
La mutación F667Y de la presente invención se combinó, usando métodos de ADN recombinante, con una mutación F667Y, para producir el enzima doble mutante de Taq ADN polimerasa utilizado en las reacciones de secuenciación descritas en el ejemplo IV. El doble mutante se usó en una reacción de secuenciación con terminadores marcados con colorante de fluoresceína. Los resultados, descritos en el ejemplo IV, demuestran que el enzima es capaz de incorporar terminadores marcados con colorante de fluoresceína en una reacción de secuenciación y que produce escaleras de secuenciación legibles con exactitud en un aparato de secuenciación automática. Inesperadamente se halló que la combinación de las mutaciones E681K y F667Y también producía una ADN polimerasa termoestable, con una tasa de extensión 3 a 4 veces mayor que la de un enzima con solo la mutación F667Y, según la medición efectuada mediante el ensayo descrito en el ejemplo III.
Por tanto se describe que el motivo crítico identificado en la presente invención se puede combinar con motivos que reduzcan la discriminación contra los ddNTPs, con el fin de producir polimerasas que tengan mayor eficiencia para la incorporación de ddNTPs marcados y sin marcar. Estas polimerasas son útiles en los métodos de secuenciación de ADN. En una forma de ejecución de la presente invención una ADN polimerasa termoestable que posee el motivo crítico aquí definido también comprende el motivo crítico que incluye la mutación F667Y, descrita en la patente U.S. nº de serie 08/448,223. También se describe una ADN polimerasa termoestable caracterizada porque
i) en su forma nativa dicha polimerasa comprende una primera secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido, ii) la X en la posición 4 de dicha secuencia aminoácida está mutada respecto a dicha secuencia nativa, excepto la mutación de X a E, y iii) dicha ADN polimerasa termoestable tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicho enzima, y iv) dicha polimerasa comprende una segunda secuencia aminoácida MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12), donde X es cualquier aminoácido, v) ADN polimerasa termoestable también tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos no convencionales, en comparación con la forma nativa de dicho enzima. En el código de tres letras la segunda secuencia aminoácida está representada por MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly (SEQ ID NO: 12), donde “Xaa” en las posiciones 4, 5, 7, 8, 11, 12 y 13 es cualquier aminoácido. Asimismo “Xaa” en la posición 4 de la primera secuencia aminoácida está mutado a Lys. Además el enzima es Taq ADN polimerasa y comprende las mutaciones E681K y F667Y.
También se describe el método de secuenciación de la presente invención mejorado mediante el uso de enzimas de ADN polimerasa termoestable que tienen un motivo crítico no derivado de una mutación, sino existente como una variante natural. La ADN polimerasa de una especie bacteriana termófila tiene un motivo crítico cuyo resto en la posición 4 no es Glu. Por ejemplo, en la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana la X en la posición 4 del motivo LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7), donde X es cualquier aminoácido excepto E, es un resto de arginina. Por tanto se describen métodos de secuenciación de ADN mejorados con el uso de una ADN polimerasa nativa que contiene la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7), donde X puede ser cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida equivale a LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 7), donde “Xaa” en las posiciones 3, 6, 9 y 10 es cualquier aminoácido y “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu y “Xaa” en la posición 7 es Val o Ile. Se describe un método de secuenciación que consiste en:
a) proporcionar una ADN polimerasa termoestable caracterizada porque i) dicha polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7), donde X en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto E, ii) dicha ADN polimerasa termoestable tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, y
b) proporcionar un terminador marcado con un colorante de la familia de la fluoresceína, y
c) realizar una reacción de secuenciación mediante terminador marcado con colorante.
En una forma de ejecución más preferida el método de secuenciación de la presente invención consiste en:
a) proporcionar una ADN polimerasa termoestable caracterizada porque i) dicha polimerasa comprende una primera secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 7), donde X en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto E, ii) dicha ADN polimerasa termoestable tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, iii) dicha polimerasa comprende una segunda secuencia aminoácida MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12), donde X es cualquier aminoácido, iv) dicha ADN polimerasa termoestable tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos no convencionales, y
b) proporcionar un terminador marcado con un colorante de la familia de la fluoresceína, y
c) realizar una reacción de secuenciación mediante terminador marcado con colorante.
También se describe un enzima que comprende la secuencia aminoácida LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO: 13), donde X en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida se representa por LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 13), donde “Xaa” en la posición 3 es Gln o Gly, “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu y “Xaa” en la posición 6 es Ser o Ala. La secuencia aminoácida también es LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:14), donde X es cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida se representa por LeuSerGInXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO: 14), donde “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu.
También se describe que este enzima tiene la secuencia aminoácida LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO: 15), donde X es cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida está representada por LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 15), donde “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu y “Xaa” en la posición 7 es Val o Ile.
La secuencia aminoácida también es LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO: 16), donde X es cualquier aminoácido excepto
E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida se representa por LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO: 15), donde “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu. “Xaa” en la posición 4 también es Arg. La secuencia aminoácida también es LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO: 17), donde X es cualquier aminoácido excepto E. En el código de tres letras esta secuencia aminoácida equivale a LeuSerValXaaLeuGlyDeProValLysGlu (SEQ ID NO: 17), donde “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu o es Arg.
También se describen métodos de secuenciación mediante el uso de un enzima nativo que tiene un nivel reducido de discriminación contra nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, medido en un ensayo de incorporación de ddNTP como el descrito en el ejemplo II. Se determina la concentración de ddCTP necesaria para inhibir la síntesis de AND en un 50%, al igual que la concentración de Zowie-ddCTP necesaria para una inhibición del 50%. Se calcula la relación de concentración de Zowie-ddCTP a concentración de ddCTP; la relación es 10 o menos, 4 o menos, o 1,2 o menos.
Aunque en los ejemplos aquí facilitados se usan didesoxinucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, el uso de otros nucleótidos no convencionales y colorantes fluorescentes también cae en el ámbito de la presente invención. Otros nucleótidos no convencionales incluyen dNTPs marcados con colorantes fluorescentes que pueden usarse para marcar los productos de la síntesis de ADN y rNTPs marcados con colorantes fluorescentes que pueden utilizarse para marcar los productos de extensión del cebador. Otros colorantes incluye otros de tipo fluorescente con carga negativa, como los BODIPY, que son estructural y químicamente similares a la fluoresceína. Otros colorantes incluye también los de cianina. Se añadieron dNTPs marcados con cianina a una reacción de PCR estándar que incluía una Taq ADN polimerasa con la mutación E681K (y una mutación G46D). Inesperadamente se encontró que los dNTPs marcados con cianina se incorporaban a productos de amplificación en mayor proporción que en el caso del enzima natural. Por tanto, en este aspecto, un método de marcación de ADN según la presente invención emplea una polimerasa nativa o mutante de la presente invención en combinación con un nucleótido marcado con un colorante fluorescente de carga negativa o con un colorante de cianina. En una forma de ejecución el método de marcación de ADN de la presente invención consiste en:
a) proporcionar una ADN polimerasa termoestable caracterizada porque
i) dicha polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSQXL(S/A)PYEE (SEQ ID NO:3), donde X en la
posición 4 es K,
ii) dicha polimerasa tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos no convencionales, y
b) proporcionar un nucleótido marcado con un colorante fluorescente de carga negativa, y
c) realizar una reacción de síntesis de ADN.
En otra forma de ejecución el método de marcación de ADN de la presente invención consiste en:
a) proporcionar una ADN polimerasa termoestable caracterizada porque
i) dicha polimerasa comprende la secuencia aminoácida LSQXL(S/A)PYEE (SEQ ID NO:3), donde X en la
posición 4 es Lys,
ii) dicha polimerasa tiene menor discriminación contra la incorporación de nucleótidos no convencionales, y
b) proporcionar un nucleótido marcado con un colorante fluorescente de cianina, y
c) realizar una reacción de síntesis de ADN.
También se describe una ADN polimerasa termoestable en la cual se combina una mutación que permite incorporar rNTPs con mayor eficiencia, tal como la de ácido glutámico a glicina en la posición 615 de la Taq ADN polimerasa, y el motivo crítico de la presente invención. Es de esperar que el enzima resultante incorpore con mayor eficiencia ribonucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína. Por tanto se describe una ADN polimerasa termoestable recombinante que (1) en su forma nativa contiene la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido y (2) la X en la posición 4 está mutada, pero no a E, y (3) también contiene la región crítica, que es la secuencia aminoácida SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO: 18), donde “X” es cualquier aminoácido excepto E, y (4) es capaz de incorporar eficientemente ribonucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína. En el código de tres letras la última secuencia está representada por SerGlnIleXaaLeuArgXaa, donde “Xaa” en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu y “Xaa” en la posición 7 es Val o Ile.
Los dominios de polimerasa mutante, como el de la Taq que contiene las mutaciones E615G y E681K, son útiles para los métodos de producción de productos de extensión del cebador marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína. Por ejemplo, en una reacción de extensión del cebador tal como la PCR, los rNTPs marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína sustituyen, al menos parcialmente, uno de los 4 dNTPs estándar y se incluye una polimerasa doble mutante tal como la E681K E615G Taq ADN polimerasa. La polimerasa mutante sintetiza los productos de extensión del cebador que tienen restos de ribonucleótidos marcados con fluoresceína en varias posiciones a lo largo de su extensión. Al efectuar un tratamiento térmico o alcalino los productos de extensión del cebador se fraccionan en cada resto de ribonucleótido, produciendo una población de fragmentos marcados en su extremo. Esta población de fragmentos uniformemente marcados representa una distribución del marcador fluorescente a lo largo del producto de extensión del cebador. Los fragmentos marcados de estas características son útiles en los formatos de detección de ácidos nucleicos basados en chips de silicona, tales como los de Cronin y otros (arriba citado). Por tanto se describe un método para marcar productos de extensión del cebador que consiste en (1) proporcionar una ADN polimerasa termoestable que (a) en su forma nativa contiene la secuencia aminoácida
LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido, (b) la X en la posición 4 está mutada, pero no a E, (c) también comprende la región crítica, que es la secuencia aminoácida SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO: 18), donde “X” es cualquier aminoácido excepto E, y (d) es capaz de incorporar eficientemente ribonucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y/o de la familia de la cianina, y (2) realizar una reacción de extensión del cebador.
Asimismo se describen enzimas con el motivo crítico de la presente invención que muestran una mayor tasa de extensión respecto al enzima natural, tal como se demuestra en el ejemplo IV para un mutante E681K F667Y. El enzima se caracteriza porque (1) en su forma nativa comprende la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido, (2) la secuencia aminoácida está mutada en la posición 4 de modo que en esta posición X no está mutado a E, y (3) tiene una mayor tasa de extensión respecto al enzima natural, o el enzima se caracteriza porque (1) en su forma nativa comprende la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido, (2) la secuencia aminoácida está mutada en la posición 4 de modo que en esta posición X no está mutado a E, y (3) también comprende la secuencia aminoácida MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO: 12), donde X es cualquier aminoácido, y (4) tiene una mayor tasa de extensión, o el enzima se caracteriza porque (1) en su forma nativa comprende la secuencia aminoácida LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO: 1), donde X es cualquier aminoácido y (2) la secuencia aminoácida está mutada en la posición 4 de modo que en esta posición X está mutado a K, o el enzima es Taq ADN polimerasa y contiene las mutaciones E681K y F667Y.
Asimismo se describe un método de secuenciación de ADN que incluye pirofosfatasa termoestable en la mezcla reactiva. Se ha demostrado que la pirofosfatasa mejora los datos de secuenciación en el rango mesofílico tan bien como las ADN polimerasas mutantes termoestables descritas en la solicitud de patente nº EP-A-763 599 y en la patente U.S. nº 5,665,551.
También se describe una ADN polimerasa termoestable con una mutación en el dominio 5’-nucleasa que sirve para atenuar mucho esta actividad de nucleasa. Se han descrito formas modificadas de Taq polimerasa en la patente PCT nº WO 92/06200, publicada el 16 de abril de 1992, y en la patente U.S. nº 5,466,591. Asimismo se describe que el codón para el resto de glicina en la posición del aminoácido 46 ha sido reemplazado por un codón para ácido aspártico (mutación G46D). El enzima resultante tiene mayor utilidad en las reacciones de secuenciación cíclica debido a la menor actividad 5’-nucleasa. En el mutante G46D la secuencia aminoácida del dominio polimerasa y la actividad de polimerasa no varían en comparación con el enzima natural.
Los ejemplos siguientes sirven de ilustración y no pretenden de ningún modo limitar el alcance de la invención reivindicada.
Ejemplo I
Expresión de un gen de Taq polimerasa modificada que tiene menor discriminación contra nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína
La porción de aminoácido C-terminal de la Taq ADN polimerasa codifica el dominio del sitio activo de la polimerasa (Lawyer y otros, 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287, Freemont y otros, 1986, Proteins: Structure, Function and Genetics 1:66-73, que se incorpora aquí como referencia). Un fragmento de ADN que contenía esta región se aisló del gen Taq completo y se mutagenizó por amplificación PCR en presencia de manganeso (Leung y otros, Technique 1(1):11-15). Todos los enzimas de restricción para este ejemplo se adquirieron de New England Biolabs, Beverly MA. Los fragmentos mutagenizados se digirieron con PstI y BglII y se clonaron en un plásmido de expresión de Taq, pLK102, que se había digerido con PstI y BglII. El plásmido pLK102 es un derivado del pLK101 en el cual el fragmento PstI-BglII de 900 bp se sustituye por un conector corto de PstI-BglII. El plásmido pLK101 es una forma modificada del pSYC1578 (Lawyer y otros, 1993, arriba citado y patente U.S. nº 5,079,352 ), del cual se ha eliminado el pequeño fragmento HincII/EcoRV en posición 3’ respecto a la región codificante de polimerasa.
Los plásmidos de expresión resultantes se transformaron en la cepa de E. coli N1624 (disponible en el E. coli Genetic Stock Center de la universidad de Yale, cepa nº CGSC #5066) y los transformantes obtenidos fueron analizados para ver cuál podía incorporar [a-P32]Tet-dCTP con mayor eficiencia, en comparación con el enzima de tipo natural. Utilizando este procedimiento se identificó el mutante CS1 como el de mayor capacidad para incorporar eficientemente [a-P32]Tet-dCTP. El plásmido de expresión del Taq mutagenizado del mutante CS1 se digirió con HindIII/NheI y el fragmento de restricción resultante se subclonó en el gen natural de pLK101, reemplazando el fragmento de HindIII/NheI no mutagenizado, para precisar qué porción del gen mutagenizado de Taq polimerasa era responsable del fenotipo alterado. Los subclones que contenían el fragmento de restricción HindIII/NheI confirieron el fenotipo alterado al enzima natural, lo cual indica que la mutación se hallaba dentro de este fragmento. El análisis subsiguiente de los subclones determinó que la mutación estaba situada en el fragmento BamHI-NheI de 265 bp.
El análisis secuencial de ADN del fragmento NheI-BamHI 265 se realizó en pCS1, utilizando el kit de secuenciación cíclica con terminador TaqFS DyeDeoxy® de Applied Biosystems, Foster City, CA, y el sistema de secuenciación de ADN modelo Prism 377 de Applied Biosystems. El análisis secuencial identificó una mutación de sentido erróneo del gen de Taq polimerasa en la posición del aminoácido 681, causante de la sustitución de un resto de ácido glutámico
(E) por un resto de lisina (K). La numeración se inicia en el codón que codifica el primer resto de metionina de la proteína madura, como en la patente U.S. nº 5,079,352, que se incorpora aquí como referencia. Esta mutación, E681K, fue causada específicamente por un cambio de GAG a AAG en la secuencia del codón. El plásmido pCS1 se depositó en la ATCC el 28 de agosto de 1997 y recibió el nº de acceso 98521.
El plásmido pCS1 puede contener otras mutaciones en la secuencia codificadora de la Taq polimerasa, pero en otros experimentos de subclonación se determinó que la mutación E681K era la única responsable de la mayor eficiencia para la incorporación de nucleósido trifosfatos marcados con colorantes de fluoresceína. Esta mutación puntual está localizada en el fragmento de ADN BamHI-NheI de 265 pares de bases representado en la figura 1. En el fragmento ADN de 265 bp la mutación E681K es el único cambio respecto a la secuencia genética de la Taq polimerasa de tipo natural.
De cara a posteriores análisis y para cuantificar la eficiencia de la incorporación de análogos de nucleótidos, el fragmento BamHI-NheI de 265 bp del plásmido pCS1 se clonó en un vector de expresión Taq, pRDA3-2, que contenía la secuencia natural dentro del dominio de polimerasa. El plásmido pRDA3-2, designado como clon 3-2, está totalmente descrito en la patente PCT nº WO 92/06200, que se incorpora aquí como referencia. Un segundo clon que codifica tanto la mutación E681K como una mutación F667Y se creó por mutagénesis dirigida por cebador y subsiguiente clonación de un producto de PCR que contenía ambas mutaciones, en los sitios BamHI-NheI del plásmido pRDA3-2.
El vector de expresión pRDA3-2 lleva el gen entero de Taq ADN polimerasa ligado operativamente al promotor PL del fago lambda. En el vector pRDA3-2, el dominio 5’-nucleasa del gen de Taq ADN polimerasa contiene una mutación puntual en el codón codificador de glicina en la posición 46, que reduce la actividad 5’-nucleasa (mutación G46D). Sin embargo la secuencia genética dentro del dominio de polimerasa del vector de expresión pRDA3-2 es idéntica a la secuencia genética de la Taq ADN polimerasa natural. Los plásmidos pRDA3-2, pCS 1 y el producto de PCR con E681K y F667Y se digirieron con BamHI y NheI y el fragmento de ADN de 265 bp del plásmido pRDA3-2 o el producto de PCR se ligó al vector pRDA3-2 por métodos convencionales. Los plásmidos resultantes, pLK112 y pLK113 respectivamente, se transformaron en la cepa DG116 de E. coli (ATCC nº 53606). Estos plásmidos codifican ADN polimerasas termoestables denominadas aquí G46D E681K Taq y G46D E681K F667Y Taq, respectivamente. La proteína termoestable de ADN polimerasa G46D E681K F667Y Taq expresada se purificó conforme al método descrito por Lawyer y otros, 1993, arriba citado.
El enzima G46D E681K Taq se purificó mediante un método de preparación similar, pero a escala más pequeña, del modo siguiente: de no indicarse lo contrario, todas las etapas se realizaron a 4ºC. Células procedentes de un cultivo de 475 ml se resuspendieron en 30 ml de tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, pH 8,0, Pefabloc© SC 0,5 mM, leupeptina 0,5 μg/ml, N-a-p-tosil-L-lisina-clorometilcetona 0,1 mM, DTT 1 mM). Las células se sonicaron al 50% de potencia, posición 5 durante 1 minuto, y se enfriaron sobre hielo durante 1 minuto. Esta etapa se repitió dos veces más. Luego se añadieron 1,5 ml de sulfato amónico 4,0 M y la mezcla se calentó a 75ºC en un baño de agua durante 15 minutos y después se enfrió sobre hielo. Se agregó polietilenimina hasta el 0,6% y la mezcla se incubó sobre hielo durante 10 minutos. La mezcla se centrifugó a 16.000xg durante 30 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna de fenil-sefarosa de 1,8 ml de volumen (columna cromatográfica de Bio-rad Polyprep) y se equilibró con una solución de Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, pH 8,0, DTT 1 mM, (NH4)2SO4 0,2 M. La columna se lavó con 6 ml de cada una de estas tres soluciones: 1) Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, (NH4)2SO4 0,2 M, 2) Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, y 3) Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 20% de etilenglicol. La polimerasa se eluyó con 6 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, 20% de etilenglicol, urea 2,5 M. Después de ajustar la preparación de polimerasa a KCl 100 mM con KCl 3 M la mezcla se cargó en una columna de heparina-sefarosa (columna Bio-rad Polyprep de 1,8 ml de volumen) y se equilibró en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, KCl 100 mM. Después de lavar con el mismo tampón la mezcla se eluyó en un tampón de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, KCl 400 mM.
Tras la purificación se determinó la actividad de los enzimas modificados mediante el ensayo descrito en Lawyer y otros, 1989, J. Biol. Chem. 264:6427-6437, el cual se incorpora aquí como referencia. La actividad de los enzimas purificados se calculó del modo siguiente: una unidad de enzima corresponde a 10 nmoles de producto sintetizado en 30 min. La actividad de la ADN polimerasa es linealmente proporcional a la concentración de enzima hasta la incorporación de 80-100 pmoles de dCMP (enzima diluido a 0,024-0,03 unidades/μl). Los enzimas purificados se utilizaron en las reacciones de incorporación y secuenciación descritas en los ejemplos II-IV.
Ejemplo II
Ensayo para comparar la eficiencia de la incorporación de ddNTPs
Las capacidades relativas de las ADN polimerasas G46D F667Y Taq, G46D F667Y E681K Taq y F730Y Tma30 para incorporar un ddCTP marcado con colorantes de la familia de la fluoresceína se comparó mediante un ensayo competitivo de extensión del cebador con molde limitante. La ADN polimerasa F730Y Tma30 está descrita en el ejemplo I de la solicitud de patente U.S. nº 60/052065, registrada el 9 de julio de 1997, y en la solicitud de patente europea nº 98112327.6, ambas incorporadas aquí como referencia. En este ensayo competitivo, teniendo en cuenta
que la incorporación de un ddCTP termina la reacción de extensión, cuanto más fácilmente incorpore la polimerasa un ddCTP a un cebador extendido, menos [a-P33]dCTP podrá incorporarse. Por tanto al aumentar la eficiencia de incorporación de ddCTP se incrementa el grado de inhibición de la síntesis de ADN. La eficiencia de incorporación de ddCTP se compara luego con la eficiencia de incorporación de ddCTP marcado con colorante fluorescente, a fin de indicar una medida relativa de la eficiencia de incorporación de ddCTPs marcados con colorante fluorescente para un enzima determinado.
El ensayo se realizó del modo descrito anteriormente (Lawyer y otros, 1989, J. Biol. Chem. 264:6427), incluyendo las siguientes modificaciones. La mezcla de ensayo se compuso de manera que la concentración final fue bicina 50 mM pH 8,3, 25ºC, MgCl2 2,5 mM, �-mercaptoetanol 1 mM, dATP, dGTP y dTTP 20 μM respectivamente (Perkin-Elmer), dCTP 20 μM (Perkin-Elmer) y [a-P33]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). Se hibridó M13mp18 (Perkin-Elmer) al cebador DG48 (SEQ ID NO: 10) y se añadió el equivalente a 0,085 pmoles del molde hibridado a la mezcla de ensayo para cada reacción. Se introdujeron treinta y cinco μl de la mezcla de ensayo con molde de ADN en cada uno de los 38 tubos Eppendorf de 0,5 ml. Se prepararon diluciones de Zowie-ddCTP en tampón CAPSO 25 mM, de pH 9,6, de modo que al añadir 10 μl de cada una de ellas al tubo de reacción la concentración final de Zowie-ddCTP fuera de 3, 1, 0,5, 0,25, 0,125 o 0,0625 μM. Se prepararon respectivamente dos tubos de Zowie-ddCTP 3, 1, 0,5, 0,25 y 0,125 μM para la G46D F667Y Taq ADN polimerasa. Para las ADN polimerasas G46D F667Y E681K Taq y F730Y Tma30 se prepararon respectivamente dos tubos de Zowie-ddCTP 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,0625 μM. Los ocho tubos restantes recibieron 10 μl de tampón CAPSO 25 mM, de pH 9,6. Por tanto cada uno de los treinta y ocho tubos contenía 35 μl de mezcla de ensayo y 10 μl de tampón CAPSO 25 mM, de pH 9,6, o de una de las diluciones de Zowie-ddCTP.
Para cada enzima ensayado se inició la polimerización en un tubo de cada dilución de Zowie-ddCTP y en dos tubos que solo contenían el tampón CAPSO, empleando 5 μl de enzima. Se utilizaron las siguientes concentraciones de enzima, cada una prefijada de manera que en el ensayo hubiera una cantidad en exceso de enzima respecto a la cantidad de substrato: 2,5 unidades de F667Y G46D Taq ADN polimerasa preparadas como en el ejemplo I; 1,25 unidades de G46D, F667Y, E681K Taq ADN polimerasa preparadas como en el ejemplo I; o 2 unidades de F730Y Tma30 ADN polimerasa. Como control del nivel de fondo, los controles negativos restantes se iniciaron con tampón de dilución de enzima en vez de polimerasa. Todos los tubos de reacción se agitaron inmediatamente con vórtex durante un breve tiempo y luego se incubaron 10 minutos a 75ºC. Las reacciones se pararon añadiendo 10 μl de EDTA 60 mM y se conservaron a 0ºC.
En un experimento análogo se diluyó ddCTP en tampón CAPSO 25 mM, pH 9,6, de manera que al añadir 10 μl de cada dilución a los tubos de reacción la concentración final fuera de 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 o 0,0312 μM. Luego se pipetearon diez μl de cada dilución en cada uno de tres tubos Eppendorf de 0,5 ml que contenía 35 μl de la mezcla de ensayo arriba descrita. Asimismo se prepararon cuatro tubos que contenían 35 μl de la mezcla de ensayo y 10 μl de tampón CAPSO 25 mM, pH 9,6. Por tanto cada uno de los 19 tubos contenía 35 μl de mezcla de ensayo y 10 μl de CAPSO 25 mM, pH 9,6, o de una de las diluciones de ddCTP.
La polimerización se inició en un tubo de cada dilución de ddCTP y en un tubo de tampón CAPSO con 2,5 unidades de G46D F667Y Taq ADN polimerasa, 1,25 unidades de G46D F667Y E681K Taq ADN polimerasa o 2 unidades de F730Y Tma30 ADN polimerasa. El tubo restante que contenía CAPSO se inició con tampón de dilución de enzima en vez del tampón que contenía polimerasa, como control negativo. A continuación todas las reacciones se agitaron con vórtex y se incubaron durante 10 minutos a 75ºC. Las reacciones se pararon añadiendo 10 microlitros de EDTA 60 mM y se conservaron a 0ºC.
Para cada una de las reacciones se diluyó un alícuota de 50 μl de la reacción de 60 μl en 1 ml de EDTA 2 mM con 50 μg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado como soporte. El ADN se precipitó con TCA por procedimientos estándar y se recogió en discos filtrantes GF/C (Whatman). La cantidad de [a-P33]dCMP incorporada se determinó para cada muestra y se normalizó respecto a las muestras de CAPSO sin ddNTP (0% de inhibición). Se calculó de cada muestra la concentración de ddCTP o de Zowie-ddCTP necesaria para el 50% de inhibición y se mostró en la tabla 2. La comparación entre la cantidad de ddCTP necesaria para inhibir un 50% la síntesis y la cantidad de ZowieddCTP necesaria para inhibir un 50% la síntesis mediante un enzima concreto refleja la capacidad relativa de cada enzima para incorporar análogos marcados con colorante fluorescente. Estos datos demuestran que de los tres enzimas ensayados la G46D F667Y Taq ADN polimerasa es la que incorpora Zowie-ddCTP con menos eficiencia (relación de concentraciones para el 50% de inhibición entre Zowie-ddCTP y ddCTP = 25). La F730Y Tma30 ADN polimerasa incorpora este análogo marcado con mayor eficiencia que la G46D F667Y Taq ADN polimerasa (relación de concentraciones para el 50% de inhibición entre Zowie-ddCTP y ddCTP = 4), mientras que la G46D F667Y E681K Taq ADN polimerasa ddCTP marcado y sin marcar con una eficiencia prácticamente igual (relación de concentraciones para el 50% de inhibición entre Zowie-ddCTP y ddCTP = 1,2).
Tabla 2
Concentración (μM de Zowie-ddCTP o de ddCTP) necesaria para el 50% de inhibición
- ADN polimerasa
- Zowie-ddCTP ddCTP Zowie-ddCTP/ddCTP
- G46D F667Y Taq
- 1,4 0,056 25
- G46D F667Y E681K Taq
- 0,14 0,116 1,2
- F730Y Tma30
- 0,236 0,057 4
5
Ejemplo III
Ensayo de la tasa de extensión
10 La tasa de extensión de G46D F667Y Taq y G46D F667Y E681K Taq se determinó mediante un ensayo. En este ensayo los enzimas se usaron para extender un cebador hibridado a un molde M13 en presencia de [a-P33]dCTP. Las reacciones de extensión se desnaturalizaron y los productos se analizaron por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante.
15 El ensayo se efectuó del modo anteriormente descrito (Lawyer y otros, 1989, J. Biol. Chem. 264:6427), incluyendo las siguientes modificaciones. La mezcla de ensayo se compuso de manera que la concentración final fue bicina 50 mM pH 8,3, 25ºC, MgCl2 2,5 mM, -mercaptoetanol 1 mM, dATP, dGTP y dTTP 200 μM respectivamente (Perkin-Elmer), dCTP 100 μM (Perkin-Elmer) que contenía [a-P33]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). Se hibridó M13mp18 (Perkin-Elmer) al cebador DG48 (SEQ ID NO: 11) y se añadió el equivalente a 0,085 pmoles del molde
20 hibridado a la mezcla de ensayo para cada reacción. Se introdujeron cuarenta y cinco μl de la mezcla de ensayo con molde de ADN en cada uno de los catorce tubos Eppendorf de 0,5 ml. Cada tubo se preincubó a 75ºC durante al menos 30 segundos, antes de iniciar la reacción de polimerización.
La polimerización se inició en seis de los catorce tubos de ensayo con 5 μl de G46D F667Y Taq ADN polimerasa
25 (2,5 unidades) o de G46D F667Y E681K Taq ADN polimerasa (1,25 unidades). Ambos enzimas se prepararon como en ejemplo I y la concentración empleada representa una cantidad prefijada del enzima en exceso respecto a la cantidad de substrato en el ensayo. Como control del nivel de fondo, el control negativo restante se inició con tampón de dilución de enzima en vez de polimerasa. Todos los tubos de reacción se agitaron inmediatamente con vórtex durante un breve tiempo y luego se incubaron a 75ºC. Dos de los seis tubos que contenían G46D F667Y Taq
30 ADN polimerasa se incubaron durante 3 minutos, dos durante 6 minutos y dos durante 10 minutos. De manera similar dos de los tubos iniciados con G46D F667Y E681K Taq ADN polimerasa se incubaron durante 30 segundos, dos durante 1 minuto y dos durante 2 minutos. Los tubos de control se incubaron durante 3 minutos. Las reacciones se pararon añadiendo 10 μl de EDTA 60 mM y se conservaron a 0ºC.
35 Para cada una de las reacciones se diluyó un alícuota de 25 μl de la reacción de 60 μl en 1 ml de EDTA 2 mM con 50 μg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado como soporte. El ADN se precipitó con TCA por procedimientos estándar y se recogió en discos filtrantes GF/C (Whatman). La cantidad de [a-P33]dCMP incorporada se determinó para cada muestra.
40 Se combinaron los 35 μl restantes de cada duplicado y la muestra de 70 μl se precipitó con etanol, se secó y se resuspendió en NaOH 50 mM, EDTA 1 mM. Se extrajeron alícuotas de estas muestras, tomando un número igual de cuentas de [a-P33] de cada una. Estos alícuotas se cargaron en un gel de agarosa alcalino al 0,9%, se sometieron a electroforesis y se autorradiografiaron tal como se ha descrito anteriormente (Maniatis y otros, 1982, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Como patrón de peso
45 molecular se utilizó ADN de bacteriófago lambda cortado con enzima de restricción HindIII (BRL) y marcado en el extremo 5’ con [P32].
Se determinó en cada muestra la longitud del producto de extensión en pares de bases, comparando la distancia de migración de cada muestra con la distancia migrada por el patrón de ADN lambda. El número de pares de bases de
50 cada producto se dividió por el número de segundos de incubación de cada reacción de extensión, para dar la tasa de extensión abajo indicada.
ADN polimerasa Tiempo Pares de bases/seg G46D F667Y Taq 3 min. 12,5 G46D F667Y Taq 6 min. 12,2 G46D F667Y Taq 10 min. 11,8 G46D F667Y E681K Taq 30 seg. 36,7 G46D F667Y E681K Taq 1 min. 31,7 G46D F667Y E681K Taq 2 min. 52,9
Estos resultados indican que la presencia de la mutación E681K aumenta de 3 a 4,3 veces la tasa de extensión de 55 un enzima G46D F667Y.
Ejemplo IV
Secuenciación cíclica con G46D F667Y E681K Taq ADN polimerasa y ddNTPs marcados con fluoresceína
Este ejemplo demuestra la aplicación de la polimerasa modificada según la presente invención a la secuenciación cíclica con terminador didesoxi marcado con colorante de fluoresceína, empleando 1 μM o menos de ddNTP y una relación ddNTP:dNTP de al menos 1:100. Los terminadores didesoxi marcados con colorante de fluoresceína son reactivos de los kits de secuenciación con terminador PRISM Sequenase® de Applied Biosystems (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) y se optimizaron para usarlos con la ADN polimerasa secuenasa y alfa-tio dNTPs. Las reacciones de secuenciación cíclica se efectuaron en un volumen de 20 μl que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 8,8), MgCl2 2,0 mM, dATP, dCTP y dTTP 100 μM (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) respectivamente, dITP 500 μM (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 0,2 μg de molde de ADN monocatenario M13mp18 (Perkin-Elmer), cebador directo LacZ 0,15 μM (Perkin-Elmer), 5 unidades de G46D F667Y E681K Taq ADN polimerasa, 20 unidades de pirofosfatasa termostable rTth (solicitud de patente europea nº EP-A-763 599 y patente U.S. nº 5,665,551), Sequenase-terminador colorante A 0,05 μM, Sequenase-terminador colorante C 0,80 μM, Sequenase-terminador colorante G 0,08 μM y Sequenaseterminador colorante T 1,0 μM. Las cuatro Sequenase con terminador colorante se adquirieron de Perkin-Elmer. Las reacciones se colocaron en un ciclador térmico Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 9600 precalentado (75ºC) y se sometieron a 25 ciclos de 96ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 5 segundos y 60ºC durante 4 minutos. Los fragmentos marcados con colorante se purificaron con columnas Centri-Sep® (Princeton Separations, Adelphia, NJ) según las instrucciones del fabricante y se secaron en una centrífuga de vacío. Los sedimentos se resuspendieron en 6 μl de formamida desionizada : 50 mg/ml de azul dextrano (en EDTA 25 mM, pH 8,0) 5:1 (v/v), se calentaron a 90ºC durante 3 minutos y se cargaron directamente en un gel de 4% de poliacrilamida/urea 6 M de preelectroforesis, se sometieron a electroforesis y se analizaron en un secuenciador de ADN Perkin-Elmer ABI PRISM 377 según las instrucciones del fabricante (manual del usuario del secuenciador ABI PRISM 377 DNA). La lectura automática de nucleótidos mediante el programa de análisis secuencial de ADN ABI PRISM 377 de Perkin-Elmer dio una exactitud mayor del 98,5% para 450 bases (6 errores en las bases + 10 hasta + 460 del cebador).
LISTADO DE SECUENCIAS
- (1)
- INFORMACIÓN GENERAL:
- (i)
- SOLICITANTE:
- (A)
- NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche Ltd
- (B)
- DIRECCIÓN: Grenzacherstrasse 124
- (C)
- CIUDAD: Basel
- (D)
- CANTÓN: BS
- (E)
- PAÍS: Suiza
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4070
- (G)
- TELÉFONO: (0)61 688 24 03
- (H)
- TELEFAX: (0)61 688 13 95
- (I)
- TÉLEX: 962292/965512 hlr ch
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Polimerasas de ADN termoestables modificadas para secuenciación
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
- (iv)
- FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPO)
- (vi)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
- (A)
- SOLICITUD NÚMERO: US 60/052,065
- (B)
- FECHA DE REGISTRO: 09-JUL-1997
- (2)
- INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 7
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 7 es Val o Ile."
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
- (2)
- INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2: 10
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple 15 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS: 20 (A) NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 3..6
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 3 es Gln o Gly. Xaa en la posición 6 es Ser o Ala."
25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:
30 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal 35
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos 45 (B) TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido 50
(ix) ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 7
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 7 es Val o Ile." 55
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
(A) LONGITUD: 11 aminoácidos
(B) TIPO: aminoácido 15 (C) CADENA: simple
(D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
20 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:
25 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal 30
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región 35 (B) SITUACIÓN: 4..7
(D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido, pero no un resto de ácido glutámico. Xaa en la posición 7 es Val o Ile."
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 45 (A) LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
50 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(ix) ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 4
55 (D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu."
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:9:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 2..5
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 2 es Ser o Ala, Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu y Xaa en la posición 5 es Leu o Ile."
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
- (2)
- INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:10:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 4
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu."
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
- (2)
- INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:11:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11: GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC 30
- (2)
- INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:12:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
- (2)
- INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:13:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple 5 (D) TOPOLOGÍA: lineal
(ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS: 10 (A) NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 3..6
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 3 es Gln o Gly. Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu. Xaa en la posición 6 es Ser o Ala."
15 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:14:
20 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal 25
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región 30 (B) SITUACIÓN: 4
(D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu."
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:15:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
45 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(ix) ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 4..7
50 (D) INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu. Xaa en la posición 7 es Val o Ile."
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:16:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos 60 (B) TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
- (ix)
- ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 4
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido excepto Glu."
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:17:
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 15 (A) LONGITUD: 11 aminoácidos
- (B)
- TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
20 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido
(ix) ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 4
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:18:
(i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos 35 (B) TIPO: aminoácido
- (C)
- CADENA: simple
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido 40
(ix) ATRIBUTOS:
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Región
- (B)
- SITUACIÓN: 4..7
- (D)
- INFORMACIÓN ADICIONAL: /marcación= Xaa /nota= "Xaa en la posición 4 es cualquier aminoácido 45 excepto Glu. Xaa en la posición 7 es Val o Ile."
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Método para producir ADN marcado, que consiste en: i) proporcionar una ADN polimerasa recombinante termoestable, derivada de Thermus aquaticus, caracterizada5 porque a) en su forma nativa dicha polimerasa lleva la secuencia aminoácida LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO: 1), donde “Xaa” en la posición 3 es Gln, “Xaa” en la posición 9 es Tyr, “Xaa” en la posición 10 es Glu y “Xaa” en la posición 7 de dicha secuencia es Ile; b) dicho “Xaa” en la posición 4 está mutado a Lys, en comparación con dicha secuencia nativa;10 c) dicho “Xaa” en la posición 6 es Ser o Ala; d) dicha ADN polimerasa termoestable contiene las mutaciones G46D y F667Y; y e) dicha ADN polimerasa termoestable tiene un menor nivel de discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicha polimerasa, siendo dicho nucleótido un didesoxinucleótido y siendo dicho nivel de discriminación al menos15 3 veces inferior al de dicha forma nativa de dicha polimerasa, y dicho nivel de discriminación se mide calculando la concentración de didesoxinucleótido, marcado con un colorante de fluoresceína, que es necesaria para inhibir la síntesis de ADN en un 50%;ii) proporcionar un nucleótido marcado con un colorante fluorescente cargado negativamente o con un colorante de cianina; y 20 iii) efectuar una reacción de síntesis de ADN.
- 2. El método de la reivindicación 1, en que dicha ADN polimerasa recombinante termoestable se caracteriza porque a) en su forma nativa dicha polimerasa lleva la secuencia aminoácida LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu25 (SEQ ID NO:3), b) dicho “Xaa” en la posición 4 está mutado a Lys, y c) dicha ADN polimerasa termoestable tiene un menor nivel de discriminación contra la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína, en comparación con la forma nativa de dicha polimerasa, y dicho nucleótido está marcado con un colorante de cianina.
- 3. El método de la reivindicación 1 o 2, en que la reacción de síntesis de ADN es una PCR, una amplificación por desplazamiento de hebra, una amplificación mediada por transcripción, una extensión del cebador o una reacción de transcripción inversa.Taq ADN Polimerasa
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