ES2403591T3 - ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados - Google Patents

Abstract

ADN polimerasa, que comprende A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8- X9- X10-X11-L-X12-X13-X14X15, en la que: X1 es E, X2 es P, X3 es N, X4 es I, X5 es N, X6 es P, X7 es K, X8 es V, X9 es S, X10 es R, X11 es I, X12 es F, X13 es G, X14 es K, y X15 es L, en la que la polimerasa presenta una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADNpolimerasa de otro modo idéntica con la excepción de que X13 es E.

Description

ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de las ADN polimerasas y su utilización en diversas aplicaciones, incluyendo la extensión y amplificación de cebadores de ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y mantenimiento del genoma, un papel que es crucial para transmitir de manera fidedigna la información genética de generación en generación. Las ADN polimerasas funcionan en las células como enzimas responsables de la síntesis del ADN. Polimerizan desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un activador metálico, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o el polinucleótido molde que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un abanico de procesos sintéticos del ADN, incluyendo la replicación del ADN, la reparación, recombinación y amplificación génica del ADN. Durante cada proceso sintético del ADN, se copia el molde de ADN una vez, o como máximo unas cuantas veces, para producir réplicas idénticas. En contraste, in vitro, la replicación del ADN puede repetirse muchas veces, tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.683.202, de Mullis).

En los estudios iniciales con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se añadió la ADN polimerasa al inicio de cada ronda de replicación del ADN (ver la patente US nº 4.683.202, supra). Posteriormente, se determinó que las ADN polimerasas termoestables podían obtenerse de bacterias que viven a temperaturas elevadas, y que estos enzimas necesitan añadirse sólo una vez (ver la patente US nº 4.889.818, de Gelfand, y la patente US nº 4.965.188, de Mullis). A las temperaturas elevadas que se utilizan durante la PCR, estos enzimas no resultan inactivados irreversiblemente. En consecuencia, pueden llevarse a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la polimerasa sin añadir enzimas nuevos al inicio de cada procedimiento de adición sintética. Las ADN polimerasas, particularmente las polimerasas termoestables, son la clave de un gran número de técnicas en los estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de las enfermedades. Para las aplicaciones diagnósticas en particular, una secuencia de ácidos nucleicos diana puede ser sólo una parte pequeña del ADN o ARN en cuestión, de manera que puede resultar difícil detectar la presencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos sin la amplificación.

El patrón global de plegamiento de las polimerasas es similar al de la mano derecha humana y contiene tres subdominios claros: palma, dedos y pulgar (ver Beese et al., Science 260:352-355, 1993; Patel et al., Biochemistry

34: 5351-5363, 1995). Aunque la estructura de los subdominios de los dedos y del pulgar varían mucho entre polimerasas que difieren de tamaño y funciones celulares, todos los subdominios catalíticos de palma son superponibles. Por ejemplo, el motivo A, que interactúa con el flujo de entrada de dNTP y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, es superponible, con una desviación promedio de aproximadamente un Å entre las familias de pol Q de mamífero y pol I procariótica de ADN polimerasas (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997). El motivo A se inicia estructuralmente en una cadena � antiparalela que contiene residuos predominantemente hidrofóbicos y continúa en una hélice Q. La secuencia de aminoácidos primaria de los sitios activos de la ADN polimerasa se encuentra excepcionalmente conservada. En el caso del motivo A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR (SEC ID nº 30) se encuentra conservada en las polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución, incluyendo, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli. Conjuntamente, estas observaciones indican que las polimerasas funcionan mediante mecanismos catalíticos similares.

Además de encontrarse bien conservada, también se ha demostrado que el sitio activo de las ADN polimerasas es relativamente mutable, siendo capaz de incluir determinadas sustituciones de aminoácidos sin que se reduzca la actividad de ADN polimerasa significativamente (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.602.695, de Patel et al.). Las ADN polimerasas termoestables que presentan una tasa de extensión elevada (transcripción inversa) derivada de una cepa de arqueobacteria hipertermofílica o que comprenden secuencias de motivo críticas definidas son conocidas (por ejemplo a partir de las patentes EP nº 0 745 675 y nº 1 152 062). Además, se han descrito diversas ADN polimerasas mutantes definidas que comprenden una renovación catalítica mejorada o una actividad enzimática mejorada en, por ejemplo, los documentos nº WO2005/045015 y nº WO01/051621, respectivamente. Dichas ADN polimerasas mutantes pueden proporcionar diversas ventajas selectivas en, por ejemplo, aplicaciones diagnósticas y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácidos nucleicos. La presente invención, tal como se describe en la presente memoria, cumple dichas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona ADN polimerasas que presentan una actividad enzimática mejorada respecto a la polimerasa no modificada correspondiente y que resulta útil en una diversidad de aplicaciones de síntesis de ácidos

nucleicos. En algunas realizaciones, se aíslan o se purifican las polimerasas. La ADN polimerasa de la invención comprende la secuencia de aminoácidos A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8- X9- X10-X11-L-X12-X13-X14X15, en la que:

X1 es E, X2 es P, X3 es N, X4 es I, X5 es N, X6 es P, X7 es K, X8 es V, X9 es S, X10 es R, X11 es I, X12 es F, X13 es G, X14 es K, y X15 es L;

en la que la polimerasa presenta una tasa de extensión de ácidos nucleicos mejorada respecto a una ADN polimerasa de otro modo idéntica en la que X13 es E. La polimerasa mutante presenta G en la posición X13 (SEC ID nº 33).

Las ADN polimerasas de la invención se refieren a ADN polimerasas que son versiones modificadas de una polimerasa no modificada. En la forma no modificada, la polimerasa generalmente es funcional, presentando actividad de incorporación de nucleótidos, e incluye una secuencia de aminoácidos que presenta el motivo siguiente en el dominio polimerasa:

A-G-X1-x2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15 (SEC ID nº 29); en la que X2, X5, X6, X9 y X10 son cualquier aminoácido; X1 es H, E o Q; X3 es N o H; X4 es L o I; X7 es D, K o T; X8 es L o V; X11 es V, I o L; X12 es F

o Y; X13 es D o E; X14 es K o E; X15 es L o Q.

La polimerasa mutante (es decir, modificada a partir de SEC ID nº 29) se caracteriza adicionalmente porque incluye una sustitución de aminoácido respecto a la forma no modificada, por lo menos en la posición X13, y porque presenta una tasa de extensión de ácidos nucleicos mejorada respecto a la forma no modificada. La polimerasa mutante presenta un aminoácido diferente de D o E en la posición X13, en particular la polimerasa mutante presenta G en la posición X13.

Diversas ADN polimerasas se prestan a mutación según la presente invención. Resultan particularmente adecuadas las polimerasas termoestables, incluyendo las polimerasas termoestables de tipo salvaje o naturales de diversas especies de bacterias termofílicas, así como polimerasas termoestables derivadas de dichos enzimas de tipo salvaje

o naturales mediante sustitución, inserción o deleción de aminoácidos u otra modificación. Entre las formas no modificadas ejemplares de polimerasa se incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa CS5 ó CS6, o una ADN polimerasa funcional que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90% ó 95% respecto a la misma. Entre otras polimerasas no modificadas se incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas de cualquiera de las especies siguientes de bacterias termofílicas (o una ADN polimerasa funcional que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a dicha polimerasa): Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Thermus sp. Z05, Thermotoga neopolitana, Thermosipho africanus, Thermus caldophilus o Bacillus caldotenax. Entre las polimerasas adecuadas también se incluyen aquéllas que presentan actividad de transcriptasa inversa (RT) y/o la capacidad de incorporar nucleótidos no convencionales, tales como ribonucleótidos u otros nucleótidos modificados en la posición 2'.

En algunas realizaciones, la forma no modificada de la polimerasa comprende una polimerasa quimérica. Según la invención, la forma no modificada de la polimerasa quimérica en particular es la ADN polimerasa CS5 (SEC ID nº 20), la ADN polimerasa CS6 (SEC ID nº 21) o una polimerasa que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a la ADN polimerasa CS5 ó la ADN polimerasa CS6. En variaciones específicas, la forma no modificada de la polimerasa quimérica incluye una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 que se seleccionan de entre G46E, L329A y E678G. Por ejemplo, la forma no modificada de la polimerasa mutante puede ser G46E CS5; G46E L329A CS5; G46E E678G CS5 ó G46E L329A E678G CS5 Estas formas no modificadas se sustituyen para proporcionar una polimerasa mutante con una sustitución E558G. Por ejemplo, la ADN polimerasa mutante puede ser cualquiera de las siguientes: G46E E558G CS5; G46E L329A E558G CS5; G46E E558G E678G CS5; G46E L329A E558G E678G CS5 ó similar. En algunas realizaciones, la forma no modificada de la polimerasa quimérica incluye una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID

nº 20 ó SEC ID nº 21 que se seleccionan de entre S671F, D640G, Q601R y I669F. Por ejemplo, la forma no modificada de la polimerasa mutante puede ser S671F CS5; D640G CS5; Q601R CS5; I669F CS5; S671F D640G CS5; S671F Q601R CS5; S671F I669F CS5; D640G Q601R CS5; D640G I669F CS5; Q601 R I669F CS5; S671F D640G Q601R CS5; S671F D640G I669F CS5; S671F Q601R I669F CS5; D640G Q601R I669F CS5 ó S671F D640G Q601R I669F CS5. Estas formas no modificadas se sustituyen para proporcionar una polimerasa mutante con una sustitución E558G. Por ejemplo, la ADN polimerasa mutante puede ser cualquiera de las siguientes: E558G S671F CS5; E558G D640G CS5; E558G Q601R CS5; E558G I669F CS5; E558G S671F D640G CS5; E558G S671F Q601R CS5; E558G S671F I669F CS5; E558G D640G Q601R CS5; E558G D640G I669F CS5; E558G Q601R I669F CS5; E558G S671F D640G Q601R CS5; E558G S671F D640G I669F CS5; E558G S671F Q601R I669F CS5; E558G D640G Q601R I669F CS5; E558G S671F D640G Q601R I669F CS5 ó similar. En algunas realizaciones, la forma no modificada de la polimerasa quimérica incluye una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 que se seleccionan de entre G46E, L329A y E678G, e incluye además una

o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 que se seleccionan de entre S671F, D640G, Q601R e I669F. Por ejemplo, la forma no modificada de la polimerasa mutante puede ser G46E L329A S671F E678G CS5 ó similar. Según la invención, estas formas no modificadas se sustituyen para proporcionar una polimerasa mutante con una sustitución E558G. Por ejemplo, una polimerasa mutante según la invención puede ser E558G G46E L329A S671F E678G CS5 ó similar.

La actividad enzimática de la ADN polimerasa puede mejorarse adicionalmente con otras modificaciones no por sustitución. Una de dichas modificaciones es una modificación covalente térmicamente reversible que inactiva el enzima pero que se revierte al activar el enzima tras la incubación a una temperatura elevada, tal como una temperatura utilizada típicamente para la extensión de cebadores. En una realización, la ADN polimerasa que comprende la modificación covalente térmicamente reversible se produce mediante una reacción, llevada a cabo a pH alcalino a una temperatura que es inferior a aproximadamente 25ºC, de una mezcla de una ADN polimerasa termoestable y un anhídrido de ácido dicarboxílico que presenta una de las fórmulas I ó II siguientes:

en la que R1 y R2 son hidrógeno o radicales orgánicos, que pueden encontrarse unidos, o:

en la que R1 y R2 son radicales orgánicos, que pueden encontrarse unidos, y los hidrógenos se encuentran en cis. En una variación específica de dicho enzima, la forma no modificada de la polimerasa es G64E CS5.

En otros aspectos diversos, la presente invención proporciona un ácido nucleico recombinante que codifica una ADN polimerasa según las reivindicaciones, un vector que comprende el ácido nucleico recombinante y una célula huésped transformada con el vector. En determinadas realizaciones, el vector es un vector de expresión. Las células huésped que comprenden dichos vectores de expresión resultan útiles en métodos de la invención para producir la polimerasa mediante cultivo de las células huésped bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico recombinante.

En todavía otro aspecto, se proporciona un método para llevar a cabo la extensión de cebadores. El método incluye generalmente poner en contacto una ADN polimerasa de la invención con un cebador, un polinucleótido molde y nucleótidos libres bajo condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido. El polinucleótido molde puede ser, por ejemplo, un molde de ARN o ADN. Los nucleótidos libres pueden incluir nucleótidos no convencionales, tales como, por ejemplo, ribonucleótidos y/o nucleótidos marcados. Además, el cebador y/o el molde pueden incluir uno o más análogos de nucleótidos. En algunas variaciones, el método de extensión de cebadores es un método para la amplificación de polinucleótidos que incluye poner en contacto una ADN polimerasa de la invención con una pareja de cebadores, el polinucleótido molde y los nucleótidos libres bajo condiciones adecuadas para la amplificación del polinucleótido.

La presente invención proporciona además un kit que resulta útil en dicho método de extensión de cebadores. Generalmente, el kit incluye por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa de la invención según se describe en las reivindicaciones. El kit según la invención incluye además uno o más recipientes adicionales que proporcionan uno o más reactivos adicionales. Según la invención, el recipiente o recipientes adicionales proporcionan nucleótidos libres, un tampón adecuado para la extensión de cebadores y un cebador hibridable, bajo condiciones de extensión de cebadores, con un polinucleótido molde predeterminado.

DEFINICIONES

A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comúnmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invención. Aunque pueden utilizarse esencialmente cualesquiera métodos y materiales similares a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, se describen únicamente métodos y materiales ejemplares. Para los fines de la presente invención, se define a continuación los términos siguientes.

Los términos "un", "una" y "el" o "la" incluyen los referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Un "aminoácido" se refiere a cualquier unidad monomérica que puede incorporarse en un péptido, polipéptido o proteína. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido" incluye los veinte Q-aminoácidos naturales o genéticamente codificados siguientes: alanina (Ala o A), arginina (arg o R), asparagina (Asn o N), ácido aspártico (Asp o D), cisteína (Cys o C), glutamina (Gln o Q), ácido glutámico (Glu o E), glicina (Gly o G), histidina (His o H), isoleucina (Ile o I), leucina (Leu o L), lisina (Lys o K), metionina (Met o M), fenilalanina (Phe o F), prolina (Pro o P), serina (Ser o S), treonina (Thr o T), triptófano (Trp o W), tirosina (Tyr o Y) y valina (Val o V). Las estructuras de estos veinte aminoácidos naturales se muestran en, por ejemplo, Stryer et al., Biochemistry, 5a edición, Freeman and Company, 2002. Algunos aminoácidos adicionales, tales como la selenocisteína y la pirrolisina, también se pueden encontrarse genéticamente codificados (Stadtman, "Selenocysteine", Annu. Rev. Biochem. 65:83-100, 1998, e Ibba et al., "Genetic code: introducing pyrrolysine", Curr. Biol. 12(13):R464-R466, 2002). El término "aminoácido" también incluye los aminoácidos no naturales, los aminoácidos modificados (por ejemplo los que presentan cadenas laterales y/o esqueletos modificados) y los análogos de aminoácidos. Ver, por ejemplo, Zhang et al., "Selective incorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, 2004; Anderson et al., "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, 2004; Ikeda et al., "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Des. Sel. 16 (9):699-706, 2003; Chin et al., "An Expanded Eukaryotic Genetic Code", Science 301(5635):964-967, 2003; James et al., "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, 2001; Kohrer et al., "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):1431014315, 2001; Bacher et al., "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic Tryptophan Analogue", J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, 2001; Hamano-Takaku et al., "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, 2000, y Budisa et al., "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl) alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids", Protein Sci. 10(7):1281-1292, 2001.

A título ilustrativo adicional, un aminoácido es típicamente un ácido orgánico que incluye un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo carboxi sustituido o no sustituido, y uno o más grupos o cadenas laterales, o análogos de cualquiera de dichos grupos. Entre las cadenas laterales ejemplares se incluyen, por ejemplo, tiol, seleno, sulfonilo, alquilo, arilo, acilo, ceto, azido, hidroxilo, hidrazina, ciano, halo, hidrazida, alquenilo, alquinilo, éter, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, éster, tioácido, hidroxilamina o cualquier combinación de dichos grupos. Entre otros aminoácidos representativos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, aminoácidos que comprenden reticulantes fotoactivables, aminoácidos ligantes de metales, aminoácidos con marcador espín, aminoácidos fluorescentes, aminoácidos que contienen metal, aminoácidos con grupos funcionales nuevos, aminoácidos que interactúan covalente o no covalentemente con otras moléculas, aminoácidos fotoenjaulados y/o fotoisomerizables, aminoácidos radioactivos, aminoácidos que comprenden biotina o un análogo de biotina, aminoácidos glucosilados, aminoácidos modificados con otros carbohidratos, aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter, aminoácidos sustituidos con átomos pesados, aminoácidos escindibles químicamente y/o fotoescindibles, aminoácidos que contienen azúcar unido mediante carbono, aminoácidos redox-activos, aminoácidos que contienen amino-tioácido y aminoácidos que comprenden una o más fracciones tóxicas.

El término "mutante" en el contexto de las ADN polimerasas de la presente invención se refiere a un polipéptido, típicamente recombinante, que comprende una o más sustituciones de aminoácidos respecto a una ADN polimerasa funcional correspondiente.

La expresión "forma no modificada", en el contexto de una polimerasa mutante, es una expresión utilizada en la presente memoria para definir una ADN polimerasa mutante de la presente invención: la expresión "forma no modificada" se refiere a una ADN polimerasa funcional que presenta la secuencia de aminoácidos de la polimerasa mutante, excepto en una o más posiciones de aminoácidos, especificadas como caracterizadoras de la polimerasa mutante. De esta manera, la referencia a una ADN polimerasa mutante en términos de: (a) su forma no modificada, y

(b) una o más sustituciones de aminoácidos especificadas, se refiere a que, con la excepción de la sustitución o sustituciones de aminoácidos especificadas, la polimerasa mutante presenta una secuencia de aminoácidos idéntica a la forma no modificada en el motivo especificado. La polimerasa puede contener mutaciones adicionales que proporcionen la funcionalidad deseada, por ejemplo una incorporación mejorada de dideoxiribonucleótidos, ribonucleótidos, análogos de ribonucleótidos, nucleótidos marcados con pigmento; modulación de la actividad de 5'nucleasa, modulación de la actividad de 3'-nucleasa (o correctora de errores), o similar. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, al llevar a cabo la presente invención tal como se ha descrito en la presente memoria, la forma no modificada de una ADN polimerasa se encuentra predeterminada. La forma no modificada de una ADN polimerasa puede ser, por ejemplo, una ADN polimerasa de tipo salvaje y/o natural, o una ADN polimerasa que ya ha sido modificada intencionadamente. Una forma no modificada de la polimerasa preferentemente es una ADN polimerasa termoestable, tal como ADN polimerasas de diversas bacterias termofílicas, así como variantes funcionales de las mismas que presentan una identidad de secuencia sustancial respecto a una polimerasa termoestable de tipo salvaje o natural. Entre dichas variantes pueden incluirse, por ejemplo, ADN polimerasas quiméricas, tales como, por ejemplo, las ADN polimerasas quiméricas descritas en las patentes US nº 6.228.628 y nº 7.148.049. En determinadas realizaciones, la forma no modificada de polimerasa presenta actividad de transcriptasa inversa (RT).

La expresión "polimerasa termoestable" se refiere a un enzima polimerasa que es estable frente al calor, es decir, resistente al calor, y que conserva suficiente actividad para llevar a cabo posteriormente reacciones de extensión de cebador y no se desnaturaliza irreversiblemente al ser sometido a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para llevar a cabo la desnaturalización de los ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de los ácidos nucleicos son bien conocidas de la técnica y se ejemplifican en, por ejemplo, las patentes US nº 4.683.202, nº 4.683.195 y nº 4.965.188. Tal como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable resulta adecuada para la utilización en una reacción de ciclado de la temperatura, tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). La desnaturalización irreversible para los fines de la presente memoria se refiere a la pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Para una polimerasa termoestable, la actividad enzimática se refiere a la catálisis de la combinación de los nucleótidos de la manera adecuada para formar productos de extensión de cebador que sean complementarios a una cadena de ácido nucleico molde. Entre las ADN polimerasas termoestables de bacterias termofílicas se incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas de Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, especie de Thermus sps17, especie de Thermus Z05, Thermus caldophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga neopolitana y Thermosipho africanus

Tal como se utiliza en la presente memoria, una proteína "quimérica" se refiere a una proteína cuya secuencia de aminoácidos representa un producto de fusión de subsecuencias de las secuencias de aminoácidos procedentes de por lo menos dos proteínas diferentes. Una proteína quimérica típicamente no es producida mediante manipulación directa de las secuencias de aminoácidos sino que, por el contrario, se expresa a partir de un gen "quimérico" que codifica la secuencia de aminoácidos quimérica. En determinadas realizaciones, por ejemplo, una forma no modificada de una ADN polimerasa mutante de la presente invención es una proteína quimérica que consiste de una región aminoterminal (N-terminal) derivada de una ADN polimerasa de una especie de Thermus y una región carboxiterminal (C-terminal) derivada de ADN polimerasa Tma. La región N-terminal se refiere a una región que se extiende entre el extremo N-terminal (posición aminoácida 1) y un aminoácido interno. De manera similar, la región C-terminal se refiere a una región que se extiende entre un aminoácido terminal y el extremo C-terminal.

En el contexto de las ADN polimerasas mutantes, "correspondencia" con otra secuencia (por ejemplo regiones, fragmentos, posiciones de nucleótidos o de aminoácidos, o similares) se basa en la convención de numerar según el número de la posición del nucleótido o aminoácido, alineando después las secuencias de manera que maximicen el porcentaje de identidad de las secuencias. Debido a que no todas las posiciones dentro de una "región correspondiente" dada son idénticas necesariamente, las posiciones no correspondientes dentro de una región correspondiente pueden considerarse "posiciones correspondientes". Por consiguiente, tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "posición aminoácida correspondiente a la posición aminoácida [X]" de una ADN polimerasa especificada se refiere a una colección de posiciones equivalentes en otras ADN polimerasas reconocidas y homólogos estructurales y familias. En realizaciones típicas de la presente invención, la "correspondencia" de posiciones aminoácidas se determina con respecto a una región de la polimerasa que comprende el motivo de la secuencia SEC ID nº 1 ó de la SEC ID nº 33, tal como se comenta en mayor detalle en la presente memoria.

El término "recombinante", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una secuencia de aminoácidos o a una secuencia de nucleótidos que ha sido modificada intencionadamente mediante métodos recombinantes. La expresión "ácido nucleico recombinante" en la presente memoria se refiere a un ácido nucleico, originalmente formando in vitro, en general, mediante la manipulación de un ácido nucleico con endonucleasas, en una forma no observada normalmente en la naturaleza. De esta manera, tanto un ácido nucleico aislado de ADN polimerasa mutante en una forma lineal, como un vector de expresión formado in vitro mediante ligación de moléculas de ADN que normalmente no se unen, se consideran recombinantes para los fines de la presente invención. Se entiende que, tras generar un ácido nucleico recombinante y reintroducirlo en una célula huésped, se replicará de manera no recombinante, es decir, utilizando la maquinaria celular in vivo de la célula huésped y no mediante manipulaciones in vitro; sin embargo, dichos ácidos nucleicos, tras producirse recombinantemente, aunque posteriormente se repliquen no recombinantemente, todavía se consideran recombinantes para los fines de la invención. Una "proteína recombinante" es una proteína generada utilizando técnicas recombinantes, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se ha ilustrado anteriormente. Una proteína recombinante típicamente se distingue de la proteína natural en por lo menos una o más características.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se encuentre situado en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, un promotor o un intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia, o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se sitúe de manera que se facilite la traducción.

La expresión "célula huésped" se refiere tanto a procariotas unicelulares como a organismos eucarióticos (por ejemplo bacterias, levaduras y actinomicetos) y a células individuales de plantas de orden superior o animales cultivadas en cultivo celular.

El término "vector" se refiere a un fragmento de ADN, típicamente de doble cadena, en el que puede haberse insertado un trozo de ADN foráneo. El vector puede ser, por ejemplo, de origen plasmídico. Los vectores contienen secuencias polinucleótidas de "replicón" que facilitan la replicación autónoma del vector en una célula huésped. El ADN foráneo se define como ADN heterólogo, que es ADN que no se encuentra naturalmente en la célula huésped, que, por ejemplo, replica la molécula del vector, codifica un marcador seleccionable o cribable, o codifica un transgén. El vector se utiliza para transportar el ADN foráneo o heterólogo a una célula huésped adecuada. Una vez se encuentra dentro de la célula huésped, el vector puede replicarse independientemente o concurrentemente con el ADN cromosómico del huésped, y pueden generarse varias copias del vector y su ADN insertado. Además, el vector también puede contener los elementos necesarios para permitir la transcripción del ADN insertado, formando una molécula de ARNm, o por el contrario causar la replicación del ADN insertado en múltiples copias de ARN. Algunos vectores de expresión contienen además elementos de secuencia contiguos al ADN insertado que incrementan la vida media del ARNm expresado y/o que permiten al traducción del ARNm en una molécula de proteína. De esta manera, muchas moléculas de ARNm y de polipéptido codificado por el ADN insertado pueden sintetizarse con rapidez.

El término "nucleótido" además de referirse a los monómeros ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos naturales, en la presente memoria se entiende que se refiere a variantes estructurales relacionadas de los mismos, incluyendo derivados y análogos que son funcionalmente equivalentes con respecto al contexto particular en el que se utiliza el nucleótido (por ejemplo la hibridación con una base complementaria), a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

La expresión "ácido nucleico" o "polinucleótido" se refiere a un polímero que puede corresponder a un polímero ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN), o a un análogo de los mismos. Lo anterior incluye polímeros de nucleótidos, tales como ARN y ADN, así como formas sintéticas, formas modificadas (por ejemplo modificadas química o bioquímicamente) de las mismas, y polímeros mixtos (por ejemplo que incluyen subunidades tanto de ARN como de ADN). Entre las modificaciones ejemplares se incluyen la metilación, la sustitución de uno o más nucleótidos naturales por un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces sin carga (por ejemplo metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos y similares), fracciones colgantes (por ejemplo polipéptidos), intercalantes (por ejemplo acridina, psoralén y similares), quelantes, alquilantes y enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos Q-anoméricos y similares). También se encuentran incluidas moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad de unirse a una secuencia designada, mediante enlaces de hidrógeno y otras interacciones químicas. Típicamente, los monómeros nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster, aunque las formas sintéticas de los ácidos nucleicos pueden comprender otros enlaces (por ejemplo ácidos péptidonucleicos, tal como se describe en Nielsen et al., Science 254:1497-1500, 1991). Un ácido nucleico puede ser o puede incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento cromosómico, un vector (por ejemplo un vector de expresión), un casete de expresión, un polímero de ADN o ARN desnudo, el producto de una reacción en cadena de polimerasa (PCR), un oligonucleótido, una sonda y un cebador. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla, de doble cadena o de triple cadena, y no se encuentra limitado a ninguna longitud particular. A menos que se indique lo contrario, una secuencia particular de ácidos nucleicos comprende o codifica opcionalmente secuencias complementarias, además de cualquier secuencia indicada explícitamente.

El término "oligonucleótido" se refiere a un ácido nucleico que incluye por lo menos dos unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo nucleótidos). Un oligonucleótido típicamente incluye entre aproximadamente seis y aproximadamente 175 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, más típicamente entre aproximadamente ocho y aproximadamente 100 unidades monoméricas de ácidos nucleicos, y todavía más típicamente entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 unidades monoméricas de ácidos nucleicos (por ejemplo aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 35 ó más unidades monoméricas de ácidos nucleicos). El tamaño exacto de un oligonucleótido dependerá de muchos factores, incluyendo la función o uso último del oligonucleótido. Los oligonucleótidos se preparan opcionalmente mediante cualquier método adecuado, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, el aislamiento de una secuencia existente o natural, la replicación o amplificación del ADN, la transcripción inversa, la clonación y digestión de restricción de secuencias apropiadas o la síntesis química directa mediante un método tal como el método del fosfotriéster de Narang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979); el método del fosfodiéster de Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979); el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981); el método del triéster de Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981); los métodos de síntesis automatizada, o el método en soporte sólido de la patente US nº 4.458.066 titulado "Process for preparing polynucleotides", publicada el 3 de julio de 1984, de Caruthers et al., u otros métodos conocidos por el experto en la materia.

El término "cebador" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polinucleótido capaz de actuar como punto de inicio de la síntesis de ácidos nucleicos dirigida por un molde en el caso de que se someta a condiciones en las que se inicia la extensión de cebadores (por ejemplo bajo condiciones que comprenden la presencia de nucleósidos trifosfato necesarios (tal como dicta el molde que se copia) y una polimerasa en un tampón apropiado y a una temperatura adecuada o uno o más ciclos de temperaturas (por ejemplo tal como en una reacción en cadena de polimerasa )). A título ilustrativo adicional, los cebadores también pueden utilizarse en una diversidad de otros procesos de síntesis mediada por oligonucleótidos, incluyendo como iniciadores de la síntesis de novo de ARN y procesos relacionados con la transcripción in vitro (por ejemplo la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), la amplificación mediada por la transcripción (TMA), etc.). Un cebador típicamente es un oligonucleótido de cadena sencilla (por ejemplo un oligodesoxirribonucleótido). La longitud apropiada de un cebador depende del uso pretendido para el cebador, aunque típicamente se encuentra comprendida entre 6 y 40 nucleótidos, más típicamente entre 15 y 35 nucleótidos. Las moléculas de cebador cortas generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Un cebador no refleja necesariamente la secuencia exacta del molde sino que debe ser suficientemente complementaria para hibridarse con un molde para que se produzca el alargamiento del cebador. En determinadas realizaciones, la expresión "pareja de cebadores" se refiere a un conjunto de cebadores que incluye un cebador sentido 5' (en ocasiones denominado "directo") que se hibrida con el complemento del extremo 5' de la secuencia de ácidos nucleicos que debe amplificarse, y un cebador antisentido 3' (en ocasiones denominado "inverso") que se hibrida con el extremo 3' de la secuencia que debe amplificarse (por ejemplo en el caso de que la secuencia diana se exprese como ARN o sea un ARN). Un cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de un marcaje detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, entre los marcajes útiles se incluyen 32P, pigmentos fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (utilizados comúnmente en los ensayos de ELISA), biotina o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales.

El término "convencional" o "natural" en referencia a las bases de ácidos nucleicos, a los nucleósidos trifosfato o a los nucleótidos se refiere a los que se encuentran naturalmente en el polinucleótido que se describe (es decir, para el ADN estos son dATP, dGTP, dCTP y dTTP). Además, dITP y 7-deaza-dGTP se utilizan frecuentemente en lugar de dGTP y puede utilizarse 7-deaza-dATP en lugar de dATP en reacciones in vitro de síntesis de ADN, tal como la secuenciación. Colectivamente éstas pueden denominarse dNTP.

La expresión "no convencional" o "modificado" en referencia a una base de ácidos nucleicos, a un nucleósido o a un nucleótido incluye modificaciones, derivaciones o análogos de bases convencionales, nucleósidos o nucleótidos que se encuentran naturalmente en un polinucleótido particular. Determinados nucleótidos no convencionales se encuentran modificados en la posición 2' del azúcar ribosa en comparación con los dNTP convencionales. De esta manera, aunque para ARN los nucleótidos naturales son ribonucleótidos (es decir, ATP, GTP, CTP, UTP, colectivamente, rNTP), debido a que estos nucleótidos presentan un grupo hidroxilo en la posición 2' del azúcar, que, por el contrario, se encuentra ausente en los dNTP, tal como se utiliza en la presente memoria los ribonucleótidos son nucleótidos no convencionales que son sustratos de las ADN polimerasas. Tal como se utiliza en la presente memoria, entre los nucleótidos no convencionales se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, los compuestos utilizados como terminadores de la secuenciación de los ácidos nucleicos. Entre los compuestos terminadores ejemplares se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, aquellos compuestos que presentan una estructura 2',3'-dideoxi y se denominan dideoxinucleósidos trifosfato. Los dideoxinucleósidos trifosfato ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se denominan colectivamente ddNTP. Entre los ejemplos adicionales de compuestos terminadores se incluyen los análogos 2'-PO4 de ribonucleótidos (ver, por ejemplo, las solicitudes publicadas de patente US nº 2005/0037991 y nº 2005/0037398). Entre otros nucleótidos no convencionales se incluyen los fosforotioato dNTP ([[Q]-S]dNTP), los 5'-[Q]-borano-dNTP, los [Q]-metilfosfonato dNTP y los ribonucleósidos trifosfato (rNTP). Las bases no convencionales pueden marcarse con isótopos radioactivos tales como 32P, 33P ó 35S; marcajes fluorescentes; marcajes quimioluminiscentes; marcajes bioluminiscentes; marcajes hapteno tales como biotina; o marcajes enzimáticos tales como estreptavidina o avidina. Entre los marcajes fluorescentes pueden incluirse pigmentos que se encuentran cargados negativamente, tales como pigmentos de la familia de la fluoresceína, o pigmentos que presentan una carga neutra, tales como pigmentos de la familia de la rodamina, o pigmentos que presentan una carga positiva, tales como los pigmentos de la familia de la cianina. Entre los pigmentos de la familia de la fluoresceína se incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Entre los pigmentos de la familia de la rodamina se incluyen Rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA. Diversos pigmentos o nucleótidos marcados con FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G, Rojo Texas TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) o Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR). Entre los pigmentos de la familia de la cianina se incluyen Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7, y son comercializados por GE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, Inglaterra).

Tal como se utiliza en la presente memoria, el "porcentaje de identidad de secuencias" se determina mediante comparación de dos secuencias alineadas óptimamente en una ventana de comparación, en el que la parte de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinación del número de posiciones en las que se encuentra una base de ácido nucleico o residuo aminoácido idéntico en ambas secuencias, rindiendo el número de posiciones correspondientes, dividiendo el número de posiciones correspondientes por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencias.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que presentan un porcentaje especificado de nucleótidos o de residuos aminoácidos que son iguales (por ejemplo una identidad de 60%, opcionalmente de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% en una región especificada), al comparar y alinear para la máxima correspondencia en una ventana de comparación, o a una región designada que se ha medido utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si son idénticas por lo menos al 20%, por lo menos al 25%, por lo menos al 30%, por lo menos al 35%, por lo menos al 40%, por lo menos al 45%, por lo menos al 50% o por lo menos al 55%. Estas definiciones se refieren también al complemento de una secuencia de ensayo. Opcionalmente, existe identidad en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más típicamente en una región que presenta una longitud de 100 a 500 ó 1.000 ó más nucleótidos.

Los términos "similitud" o "porcentaje de similitud", en el contexto de dos o más secuencias polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que presentan un porcentaje especificado de residuos aminoácidos que son iguales o similares según definen unas sustituciones conservadoras de aminoácidas (por ejemplo una identidad de 60%, opcionalmente de 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ó 95% en una región especificada), al comparar y alinear para la máxima correspondencia en una ventana de comparación, o a una región designada que se ha medido utilizando uno de los algoritmos de comparación de secuencias siguientes o mediante alineación manual e inspección visual. Las secuencias son "sustancialmente similares" si son similares por lo menos al 20%, por lo menos al 25%, por lo menos al 30%, por lo menos al 35%, por lo menos al 40%, por lo menos al 45%, por lo menos al 50% o por lo menos al 55%. Opcionalmente, esta similitud se produce en una región que presenta una longitud de por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, o más típicamente en una región que presenta una longitud de 100 a 500 ó 1.000 ó más aminoácidos.

Para la comparación entre secuencias, típicamente una secuencia actúa como secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Al utilizar un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen en un ordenador las secuencias de ensayo y de referencia, se designan las coordenadas de las subsecuencias, en caso necesario, y se fijan los parámetros del programa algorítmico de secuencias. Habitualmente se utilizan parámetros por defecto del programa, o pueden fijarse parámetros alternativos. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad o similitud de secuencias para las secuencias de ensayo respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa.

Una "ventana de comparación", tal como se utiliza en la presente memoria, incluye la referencia a un segmento de entre cualquiera de las posiciones contiguas seleccionadas de entre el grupo que consiste de 20 a 600, habitualmente de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200, más habitualmente de entre aproximadamente 100 y aproximadamente 150, en el que una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas tras la alineación óptima de las dos secuencias. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos de la técnica. La alineación óptima de secuencias para la comparación puede llevarse a cabo, por ejemplo, con el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970), mediante el algoritmo de alineación de homologías de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), mediante implementaciones computerizadas de dichos algoritmos (por ejemplo GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o mediante alineación manual e inspección visual (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de 1995)).

Un ejemplo de un algoritmo que resulta adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y de similitud de secuencias son los algoritmos de BLAST y de BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977), y en Altschul et al. (J Mol. Biol. 215:403-10, 1990), respectivamente. El software para llevar a cabo los análisis de BLAST se encuentra disponible públicamente en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar en primer lugar parejas de secuencias de alta puntuación (HSP) mediante la identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta, que se corresponden o satisfacen alguna puntuación umbral T de valor positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabra vecina (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra vecina actúan como núcleos para iniciar búsquedas de HSP más largas que dichos núcleos. Los aciertos de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde se incrementa la puntuación acumulada de alineación. Las puntuaciones acumuladas se calculan utilizando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para una pareja de residuos correspondientes; en todos los casos >0) y N (puntuación de penalización para residuos no correspondientes; en todos los casos <0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuaciones para calcular la puntuación acumulada. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulada de alineación cae en una cantidad X respecto al valor máximo alcanzado; la puntuación acumulada cae hasta cero o menos debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa, o se alcanza el final de cualquiera de las dos secuencias. Los parámetros de algoritmo de BLAST, W, T y X, determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) utiliza como valores por defecto la longitud de palabra (W) de 11, un valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como valores por defecto una longitud de palabra de 3, y un valor esperado (E) de 10, y las alineaciones de la matriz de puntuaciones BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989) (B) de 50, valor esperado (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas.

El algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo de BLAST es la probabilidad de suma mínima (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que se produciría al azar una correspondencia entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia en el caso de que la probabilidad de suma mínima en una comparación del ácido nucleico de ensayo y el ácido nucleico de referencia se inferior a aproximadamente 0,2, típicamente inferior a aproximadamente 0,01, y más típicamente inferior a aproximadamente 0,001.

La expresión "tasa de extensión de ácidos nucleicos" se refiere a la tasa a la que un biocatalizador (por ejemplo un enzima, tal como una polimerasa, ligasa o similar) extiende un ácido nucleico (por ejemplo un cebador u otro oligonucleótido) de una manera dependiente de molde o independiente de molde mediante la unión (por ejemplo covalente) de uno o más nucleótidos al ácido nucleico. A título ilustrativo, determinadas ADN polimerasas mutantes descritas en la presente memoria presentan tasas de extensión de ácidos nucleicos mejoradas respecto a las formas no modificadas de dichas ADN polimerasas, de manera que pueden extender cebadores a tasas más altas que dichas formas no modificadas bajo un conjunto dado de condiciones de reacción.

La expresión "eficiencia de transcripción inversa" se refiere a la fracción de moléculas de ARN que son transcritas inversamente como ADNc en una reacción de transcripción inversa dada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 ilustra una alineación de secuencias de aminoácidos de una región del dominio de polimerasa de las ADN polimerasas termoestables ejemplares de diversas especies de bacterias termofílicas y del bacteriófago T7: Thermus thermophilus (Tth) (SEC ID nº 3), Thermus caldophilus (Tca) (SEC ID nº 4), Thermus sp. Z05 (Z05) (SEC ID nº 5), Thermus aquaticus (Taq) (SEC ID nº 6), Thermus flavus (Tfl) (SEC ID nº 7), Thermus filiformis (Tfi) (SEC ID nº 8), Thermus sp. sps 17 (Sps17) (SEC ID nº 9), Deinococcus radiodurans (Dra) (SEC ID nº 10), Hot Spring family Blclone 7 (HspB) (SEC ID nº11), Bacillus stearothermophilus (Bst) (SEC ID nº 12), Bacillus caldotenax (Bca) (SEC ID nº 13), Escherichia coli (Eco) (SEC ID nº 14), Thermotoga maritime (Tma) (SEC ID nº 15), Thermotoga neapolitana (Tne) (SEC ID nº 16), Thermosipho africanus (Taf) (SEC ID nº 17), Hot Spring family A (HspA) (SEC ID nº18) y el bacteriófago T7 (T7) (SEC ID nº 19). La alineación de secuencias de aminoácidos también incluye una reación (SEC ID nº 31 y nº 32) del dominio de polimerasa de ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas, es decir, CS5 y CS6. Además, también se incluye una secuencia (Cons) (SEC ID nº 24) que muestra residuos aminoácidos de consenso entre estas secuencias ejemplares. Además, las regiones de polipéptido mostradas comprenden el motivo de aminoácidos AGXXFXXXSXXQXXXXLXXXX (SEC ID nº 1), las posiciones variables del cual se definen adicionalmente en la presente memoria. Estos motivos se encuentran subrayados en negrita para las secuencias de polimerasa CS5 y CS6. La posición aminoácida susceptible de mutación según la presente invención o mutaciones relacionadas se indica con un asterisco (*). Los huecos en las alineaciones se indican con un punto (.).

La figura 2A presenta la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 (SEC ID nº 20).

La figura 2B presenta una secuencia de ácidos nucleicos codificante de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS5 (SEC ID nº 22).

La figura 3A presenta la secuencia de aminoácidos de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 (SEC ID nº 21).

La figura 3B presenta una secuencia de ácidos nucleicos codificante de la ADN polimerasa termoestable quimérica CS6 (SEC ID nº 23).

La figura 4 es un gráfico de columnas que muestra las tasas de extensión normalizadas de diversos mutantes de una ADN polimerasa CS5 G46E L329A E678G (GLE). El eje y representa las tasas de extensión relativas, mientras que el eje x representa las ADN polimerasa que presentan mutaciones puntuales especificadas (GLE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A E678G, GLDE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A D640G E678G, GLEE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A E558G E678G, GLEQDSE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A E558G Q601R D640G S671F E678G, GLQDSE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A Q601R D640G S671F E678G, GLQE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A Q601R E678G, GLSE = ADN polimerasa CS5 G46E L329A S671F E678G). Los valores de la tasa de extensión obtenidos para las polimerasas mutantes se normalizan respecto al valor obtenido para la ADN polimerasa CS5 GLE, que se fija en 1,00.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención proporciona nuevas ADN polimerasas que presentan tasas mejoradas de extensión de cebador. Las ADN polimerasas de la invención pueden utilizarse a concentraciones más bajas para un rendimiento superior o equivalente al de los enzimas parentales. En vista de las actividades similares de otros mutantes identificados previamente, se prevé que las ADN polimerasas de la presente invención en determinadas realizaciones presenten incrementos concomitantes de la actividad de transcriptasa inversa y/o la actividad de amplificación. Por lo tanto, las ADN polimerasas de la invención resultan útiles en una diversidad de aplicaciones que implican la extensión de los cebadores, así como la transcripción inversa o la amplificación de moldes polinucleótidos, incluyendo, por ejemplo, aplicaciones en estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de enfermedades.

Según la invención, las ADN polimerasas de la invención comprenden el motivo de aminoácidos siguiente:

Ala-Gly-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (también denominado en la presente memoria con el código de una letra como A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9- X10-X11-L-X12-X13-X14-X15 (SEC ID nº 1)), en el que:

X1 es Glu (E); X2 es Pro (P); X3 es Asn (N); X4 es Ile (I); X5 es Asn (N); X6 es Pro (P); X7 es Lys (K); X8 es Val (V); X9 es Ser (S); X10 es Arg (R); X11 es Ile (I); X12 es Phe (F); X13 es Gly (G); X14 es Lys (K); y

X15 es Leu (L),

en el que la polimerasa presenta una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADN polimerasa de otro modo idéntica en la que X13 es Glu (E). Según la invención, X13 es G (SEC ID nº 33).

En otras realizaciones de SEC ID nº 1, X2, X5, X6, X9 y X10 son cualesquiera aminoácidos presentes en posiciones correspondientes en cualquier ADN polimerasa. Entre las ADN polimerasas ejemplares se incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, Hot Spring family B/clone 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escherichia coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Hot Spring family A y el bacteriófago T7. Según la invención, X2 es Pro (P), X5 es Asn (N), X6 es Pro (P), X9 es Ser (S) y X10 es Arg (R).

La invención se refiere además a ADN polimerasas que comprenden el motivo de aminoácidos siguiente:

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (también denominado en la presente memoria con el código de una letra como T1-T2-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-T3-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15 (SEC ID nº 2));

en el que:

T1 es Ala (A) o Val (V), T2 es Gly (G) o Val (V), T3 es Gln (L) o Hes (H), X2, X5, X6, X9, y X10 son cualquier aminoácido o ningún aminoácido, X1 es Hes (H), Glu (E), Gln (Q) o ningún aminoácido, X3 es Asn (N) o Hes (H), X4 es Leu (L), Ile (I) o Pro (P), X7 es Asp (D), Lys (K) o Thr (T), X8 es Leu (L), Val (V) o Ile (I), X11 es Val (V), Ile (I), Leu (L) o Lys (K), X12 es Phe (F), Tyr (Y) o Gln (Q), X13 es un aminoácido diferente de Asp (D) o Glu (E), X14 es Lys (K), Glu (E) o Ala (A), y X15 es Leu (L), Gln (Q) o Gly (G),

en el que la polimerasa presenta una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADN polimerasa de otros idéntica en la que X13 es D o E. En realizaciones especialmente preferentes, X13 es G. El motivo anteriormente indicado (SEC ID nº 2) se generó mediante alineación de todas las secuencias mostradas en la figura 1, mientras que el motivo mostrado en SEC ID nº 1 se generó mediante alineación de todas las secuencias mostradas en al figura 1 excepto la de los residuos aminoácidos de la ADN polimerasa de T7.

En algunas otras realizaciones de SEC ID nº 2, X2, X5, X6, X9 y X10 son cualesquiera aminoácidos presentes en posiciones correspondientes en cualquier ADN polimerasa, por ejemplo las ADN polimerasas de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, clon 7/ familia B de Hot Spring, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escherichia coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, familia A de Hot Spring y bacteriófago T7. Por ejemplo, X2 se selecciona de entre el grupo que consiste de P, A, E, T y V, o se encuentra ausente; X5 se selecciona de entre el grupo que consiste de N, R, G y S; X6 se selecciona de entre el grupo que consiste de R, P, S y T; X9 se selecciona de entre el grupo que consiste de E, G, Q, S y A; y X10 se selecciona de entre el grupo que consiste de R, T, A, V, Y, S, N y K.

Tal como se ha comentado anteriormente, X2, X5, X6, X9 y X10 pueden ser cualquier aminoácido. Por ejemplo, X2 se selecciona de entre el grupo que consiste de Pro (P), Ala (A), Glu (E), Thr (T) y Val (V). X5 se selecciona de entre el grupo que consiste de Asn (N), Arg (R), Gly (G) y Ser (S). En otras realizaciones, X6 se selecciona de entre el grupo que consiste de Arg (R), Pro (P), Ser (S) y Thr (T). X9 se selecciona de entre el grupo que consiste de Glu (E), Gly (G), Gln (Q), Ser (S) y Ala (A). X10 se selecciona de entre el grupo que consiste de Arg (R), Thr (T), Ala (A), Val (V), Tyr (Y), Ser (S) y Asn (N).

La presente invención se refiere además a formas no modificadas de ADN polimerasas susceptibles de mutación que presentan un dominio de polimerasa funcional que comprende el motivo de aminoácidos siguiente:

Ala-Gly-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (también denominado en la presente memoria con el código de una letra como A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14X15 (SEC ID nº 29));

en el que:

X2, X5, X6, X9 y X10 son cualquier aminoácido;

X1 es Hes (H), Glu (E) o Gln (Q),

X3 es Asn (N) o Hes (H),

X4 es Leu (L) o Ile (I),

X7 es Asp (D), Lys (K) o Thr (T),

X8 es Leu (L) o Val (V),

X11 es Val (V), Ile (I) o Leu (L),

X12 es Phe (F) o Tyr (Y),

X13 es es Asp (D) o Glu (E),

X14 es Lys (K) o Glu (E) y

X15 es Leu (L) o Gln (Q).

El motivo presentado anteriormente (SEC ID nº 29) se encuentra presente dentro del subdominio "thumb" en el sitio activo de muchas ADN polimerasas de familia A dependientes de ADN, particularmente ADN polimerasas termoestables de bacterias termofílicas y del bacteriófago T7. Por ejemplo, la figura 1 muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de una región del dominio de polimerasa de las ADN polimerasas de varias especies de bacterias: Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, clon 7 familia B Hot Spring, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escherichia coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Familia A Hot Spring y el bacteriófago T7. La alineación de secuencias de aminoácidos mostrada en la figura 1 también incluye una región del dominio de polimerasa de ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas. Tal como se muestra, el motivo de SEC ID nº 29 se encuentra presente en cada una de dichas polimerasas, lo que indica una función conservada para esta región del sitio activo.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en algunas realizaciones la forma no modificada de la ADN polimerasa es una ADN polimerasa de tipo salvaje o una ADN polimerasa natural, tal como, por ejemplo, una polimerasa de cualquiera de las especies de bacterias indicadas anteriormente. En una variación, la polimerasa no modificada es de una especie del género Thermus. En otras realizaciones de la invención, la polimerasa no modificada es de una especie termofílica diferente de Thermus. Se encuentran disponibles las secuencias completas de ácidos nucleicos y de aminoácidos de numerosas ADN polimerasa termoestables. Las secuencias de cada una de las polimerasas de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus species Z05, Thermus species sps17, Thermotoga maritima (Tma) y Thermosipho africanus (Taf) han sido publicadas en la solicitud publicada de patente PCT nº WO 92/06200. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermus flavus ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992). La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus caldophilus se encuentra en EMBL/GenBank nº de acceso U62584. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Thermus filiformis puede recuperarse del depósito de la ATCC nº 42380 utilizando, por ejemplo, los métodos proporcionados en la patente US nº 4.889.818, así como la información de secuencia proporcionada en la misma. La secuencia de la ADN polimerasa de Thermotoga neapolitana procede del nº de acceso de la base de datos de patentes GeneSeq y del documento nº WO 97/09451. La secuencia de la ADN polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax se describe en, por ejemplo, Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993; ver también el nº de acceso de la base de datos Swiss-Prot Q04957 y los nº de acceso de GenBank D 12982 y BAA02361). La secuencia de la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus ha sido publicada en la patente US nº 6.066.483. También se describen ejemplos de formas no modificadas de ADN polimerasa que pueden modificarse tal como se indica en la presente memoria en, por ejemplo, las patentes US nº 6.228.628, titulada "Mutant chimeric DNA polymerasa", publicada el 8 de mayo de 2001, de Gelfand et al.; nº 6.346.379, titulada "Thermostable DNA polymerases incorporating nucleoside triphosphates labeled with fluorescein family dyes", publicada el 12 de febrero de 2002, de Gelfand et al.; nº 7.030.220, titulada "Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerasesfor improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro", publicada el 18 de abril de 2006, de Ankenbauer et al.; nº 6.881.559, titulada "Mutant B-type DNA polymerases exhibiting improved performance in PCR", publicada el 19 de abril de 2005, de Sobek et al.; nº 6.794.177, titulada "modified DNA-polymerase from Carboxydothermus hydrogenoformans and its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction", publicada el 21 de septiembre de 2004, de Markau et al.; nº 6.468.775, titulada "Thermostable DNA polymerase from Carboxydothermus hydrogenoformans", publicada el 22 de octubre de 2002, de Ankenbauer et al.; nº 7.148.049, titulada "Thermostable or thermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3'-5' exonuclease activity", publicada el 12 de diciembre de 2007, de Schoenbrunner et al.; nº 7.378.262, titulada "Reversibly modified thermostable enzymes for DNA synthesis and amplification in vitro", publicada el 27 de mayo de 2008, de Sobek et al., y las solicitudes de patente US nº 2002/0012970, titulada "High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases", presentada el 30 de marzo de 2001, de Smith et al.; nº 2006/0078928, titulada "Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNA polymerases-for improvement of nucleic acid synthesis and amplification in vitro", presentada el 29 de septiembre de 2005, de Ankenbauer et al.

También susceptibles a las mutaciones indicadas en la presente memoria son las ADN polimerasas funcionales que han sido modificadas previamente (por ejemplo mediante sustitución, adición o deleción de aminoácidos), con la condición de que la polimerasa previamente modificada conserve el motivo de aminoácidos de SEC ID nº 1 ó SEC ID nº 33. De esta manera, las ADN polimerasa no modificadas adecuadas también incluyen las variantes funcionales de polimerasas de tipo salvaje o naturales. Dichas variantes típicamente presentan una identidad o similitud de secuencias sustancial respecto a la polimerasa de tipo salvaje o natural, típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, y más típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 90%, 95% ó 98%. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa no modificada presenta actividad de transcriptasa inversa (RT) y/o la capacidad de incorporar ribonucleótidos u otros nucleótidos modificados en la posición 2'.

Entre las polimerasas adecuadas también se incluyen, por ejemplo, determinadas ADN polimerasas quiméricas que comprende regiones polipeptídicas procedentes de dos o más enzimas. Se describen ejemplos de dichas ADN polimerasas quiméricas en, por ejemplo, la patente US nº 6.228.628. Resultan particularmente adecuadas las ADN polimerasas de la familia CS quiméricas, entre las que se incluyen las polimerasas CS5 (SEC ID nº 20) y CS6 (SEC ID nº 21) y las variantes de las mismas que presentan una identidad o similitud de secuencias sustancial respecto a la SEC ID nº 20 ó a SEC ID nº 21 (típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 80%, y más típicamente una identidad de secuencia de por lo menos 90%). Las ADN polimerasas CS5 y CS6 son enzimas quiméricos derivados de las ADN polimerasas de Thermus sp. Z05 y de Thermotoga maritima (Tma). Comprenden el dominio Nterminal de 5'-nucleasa del enzima de Thermus y los dominios C-terminal de exonucleasa 3'-5' y de polimerasa del enzima Tma. Estos enzimas presentan una actividad eficiente de transcriptasa inversa, pueden extender los cebadores que contienen análogos de nucleótidos y pueden incorporar dNTP Q-fosforotioato, dUTP, dITP y también dNTP marcados de las familias de la fluoresceína y de la cianina. Las polimerasas CS5 y CS6 también son enzimas de PCR activados por Mg2+ eficientes. Las secuencias de ácidos nucleicos codificantes de las polimerasas CS5 y CS6 se proporcionan en las figuras 2B y 3B, respectivamente. Las polimerasas quiméricas CS5 y CS6 se describen adicionalmente en, por ejemplo, la patente US nº 7.148.049.

En algunas realizaciones, la forma no modificada de la ADN polimerasa es una polimerasa que ha sido modificada previamente, típicamente por medios recombinantes, para proporcionar cierta ventaja selectiva. Entre dichas modificaciones se incluyen, por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos G46E, L329A y/o E678G en la ADN polimerasa CS5, en la ADN polimerasa CS6 o una o más mutaciones correspondientes en otras polimerasas. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en variaciones específicas, la forma no modificada de la ADN polimerasa es una de las siguientes (presentando cada una la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21, excepto por la sustitución o sustituciones designadas: G46E; G46E L329A; G46E E678G ó G46E L329A E678G. La sustitución E678G, por ejemplo, permite la incorporación de ribonucleótidos y otros nucleótidos modificados en la posición 2', aunque esta mutación aparentemente también resulta en una capacidad deteriorada de extender moldes con cebadores. En determinadas realizaciones, las mutaciones según la presente invención que resultan en una tasa de extensión más rápida de la polimerasa mutante, mejoran la capacidad deteriorada de la mutación E678G de extender los moldes con cebadores.

Las ADN polimerasas mutantes de la presente invención comprenden una o más sustituciones de aminoácidos respecto a la polimerasa no modificada, es decir, en la posición X13 de SEC ID nº 1 ó SEC ID nº 33. La sustitución de aminoácido en esta posición, es decir G en la posición X13, proporciona una actividad mejorada de incorporación de nucleótidos, rindiendo una ADN polimerasa con una tasa de extensión de ácidos nucleicos mejorada (más rápida) en comparación con la ADN polimerasa correspondiente, que de otra manera es idéntica pero incluye una E en la posición X13. Aunque sin pretensión de limitarse a ninguna teoría en particular, los presentes inventores creen que la tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos de las polimerasas mutantes de la invención es una consecuencia de la unión más fuerte a un molde, es decir, una disociación menos frecuente del molde, resultando en un enzima de "procesividad" más elevada. Estas características permiten utilizan concentraciones más bajas de la polimerasa mutante en, por ejemplo, reacciones de extensión de cebadores en comparación con las reacciones en las que participa la ADN polimerasa no modificada. De esta manera, a una concentración de enzima suficientemente alta, la tasa de extensión de la polimerasa no modificada (es decir, que no presenta las mutaciones específicas que son el objeto de la invención) podría concebirse que se aproximase a la del enzima mutante. También se espera que las polimerasas mutantes presenten un rendimiento mucho mejor que las formas no modificadas a fuerza iónica elevada. Sin embargo, a una concentarción de enzima suficientemente alta, el rendimiento de la polimerasa no modificada a fuerza iónica baja se aproximaría a la de la polimerasa mutante.

Debido a que las formas no modificadas de la ADN polimerasa son únicas, la posición aminoácida correspondiente a X13 típicamente es diferente para cada polimerasa mutante. Los programas de alineación de secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos se encuentran fácilmente disponibles (ver, por ejemplo, los indicados supra) y, dado el motivo particular identificado en la presente memoria, sirven para ayudar en la identificación de los aminoácidos exactos (y codones correspondientes) para la modificación según la presente invención. Las posiciones correspondientes a X13 se muestran en la Tabla 1 para las ADN polimerasas termoestables quiméricas representativas y para las ADN polimerasas termoestables de especies termofílicas ejemplares.

Tabla 1. Posiciones aminoácidas correspondientes a las posiciones de motivo X13 en las polimerasas termoestables ejemplares.

Organismo o secuencia quimérica

Posición X13

Consenso

T thermophilus

498

T. caldophilus

498

T. sp. Z05

498

T. aquaticus

496

T. flavus

495

T. filiformis

494

T. sp. sps17

494

D. radiodurans

586

Clon 7/familia B Hot Spring

546

B. stearothermophilus

540

B. caldotenax

540

E. coli

592

T. maritima

558

T. neapolitana

558

T. africanus

558

Familia A Hot Spring

595

CS5

558

CS6

558

Tal como se ha comentado anteriormente, en algunas realizaciones la ADN polimerasa mutante de la presente invención se deriva de la ADN polimerasa CS5 (SEC ID nº 20), de la ADN polimerasa CS6 (SEC ID Nº 21) o de una variante de dichas polimerasas (por ejemplo G46E, G46E L329A, G46E E678G, G46E L329A E678G o similar). Tal como se ha indicado anteriormente, en la ADN polimerasa CS5 ó en la ADN polimerasa CS6, la posición X13 corresponde a ácido glutámico (E) en la posición 558. De esta manera, según la invención, la polimerasa mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición X13 respecto a una ADN polimerasa CS5 ó una ADN polimerasa CS6 que de otra manera es idéntica. Entre los mutantes ejemplares de la ADN polimerasa CS5 y de la ADN polimerasa CS6 se incluyen aquellos que comprenden la sustitución o sustituciones de aminoácidos E558G. Entre otros mutantes ejemplares de las ADN polimerasas CS5 y CS6 se incluyen los siguientes (presentando cada uno la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21, excepto por las sustituciones designadas):

G46E E558G, G46E L329A E558G, G46E E558G E678G, L329A E558G E678G y G46E L329A E558G E678G.

En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones de aminoácidos individuales en la posición X13. Alternativamente, la polimerasa mutante comprende la sustitución de aminoácido de la posición X13 en combinación con sustituciones de aminoácidos en otras posiciones, particularmente aquellas sustituciones de aminoácidos que es conocido que mejoran la tasa de extensión de ácidos nucleicos de la ADN polimerasa, por ejemplo sustituciones de aminoácidos (diferentes de aquellos residuos mostrados bajo Xa8) en la posición Xa8 de las ADN polimerasas que presentan un dominio de polimerasa funcional que comprende el motivo de aminoácidos siguiente:

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Leu-Xaa-Xaa-Thr-Tyr-Xaa-Asp (también denominado en la presente memoria en el código de una letra como Xa1-Xa2-Xa3-Xa4-R-Xa6-Xa7-Xa8-K-L-Xa11-Xa12-T-Y-Xa15-Xa16 (SEC ID nº 25)), en el que:

Xa1 es Ile (I) o Leu (L), Xa2 es Gln (Q) o Leu (L), Xa3 es Gln (Q), Hes (H) o Glu (E), Xa4 es Tyr (Y), Hes (H), o Phe (F), Xa6 es Glu (E), Gln (Q) o Lys (K), Xa7 es Ile (I), Leu (L) o Tyr (Y), Xa8 es Gln (Q), Thr (T), Met (M), Gly (G) o Leu (L), Xa11 es Lys (K) o Gln (Q), Xa12 es Ser (S) o Asn (N), Xa15 es Ile (I) o Val (V) y

Xa16 es Glu (E) o Asp (D).

En algunas realizaciones, la polimerasa mutante comprende la sustitución del aminoácido de la posición X13 en combinación con las sustituciones de aminoácidos (diferentes de aquellos residuos mostrados posteriormente para Xb8) en la posición Xb8 de las ADN polimerasas que presentan un dominio de polimerasa funcional que comprende el motivo de aminoácidos siguiente:

Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-Xaa-Xaa-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn (al que también se hace referencia en la presente memoria con el código de una letra como: T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N (SEC ID nº 26)); en el que:

Xb7 es Ser (S) o Thr (T), Xb8 es Asp (D), Glu (E) o Asn (N).

En algunas realizaciones, la polimerasa mutante comprende la sustitución del aminoácido de la posición X13 en combinación con las sustituciones de aminoácidos (diferentes de aquellos residuos mostrados posteriormente para Xc4 y/o Xc6) en la posición Xc4 y/o Xc6 de las ADN polimerasas que presentan un dominio de polimerasa funcional que comprende el motivo de aminoácidos siguiente:

Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Asp-Tyr-Ser-Gln-Ile-Glu-Leu-Arg (también denominado en la presente memoria en el código de una letra como Xc1-Xc2-Xc3-Xc4-Xc5-Xc6-Xc7-D-Y-S-Q-I-E-L-R (SEC ID nº 27), en el que:

Xc1 es Gly (G), Asn (N) o Asp (D), Xc2 es Trp (W) o Hes (H); es Trp (W), Ala (A), Leu (L) o Val (V), Xc3 es Trp (W), Ala (A), Leu (L) o Val (V), Xc4 es Ile (I) o Leu (L), Xc5 es Val (V), Phe (F) o Leu (L), Xc6 es Ser (S), Ala (A), Val (V) o Gly (G) y Xc7 es Ala (A) o Leu (L).

En determinadas variaciones de la invención, la polimerasa mutante comprende una sustitución de aminoácido en la posición X13 respecto a una ADN polimerasa CS5 ó una ADN polimerasa CS6 que, de otro modo, es idéntica. Entre los mutantes ejemplares de la ADN polimerasa CS5 y de la ADN polimerasa CS6 se incluyen aquellos que comprenden la sustitución de aminoácido E558G. Entre otros mutantes ejemplares de las ADN polimerasas CS5 y CS6 se incluyen los siguientes (presentando cada uno la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21, excepto por las sustituciones designadas):

E558G Q601 R, E558G D640G, E558G 1669F, E558G S671F, E558G D640G S671 F, E558G Q601R S671F, E558G I669F S671F, E558G Q601 R D640G, E558G D640G I669F, E558G Q601 R I669F, E558G S671F D640G Q601R, E558G S671 F D640G I669F, E558G S671 F Q601R I669F, E558G D640G Q601R I669F y E558G Q601R D640G I669F S671F,

en los que la sustitución de aminoácido Q601R corresponde a una sustitución de aminoácido en la posición Xa8; la sustitución de aminoácido D640G corresponde a una sustitución de aminoácido en la posición Xb8; la sustitución de aminoácido I669F corresponde a una sustitución de aminoácido en la posición Xc4; la sustitución de aminoácido S671F corresponde a una sustitución de aminoácido en la posición Xc6.

En algunas realizaciones, la forma no modificada de la polimerasa quimérica incluye una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 que se seleccionan de entre G46E, L329A y E678G, e incluye además una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 que se seleccionan de entre S671F, D640G, Q601R e I669F. Por ejemplo, la forma no modificada de la polimerasa mutante puede ser G46E L329A S671F E678G CS5 ó similar. En realizaciones ejemplares, dichas formas no modificadas se sustituyen

para proporcionar una polimerasa mutante con una sustitución E558G. Por ejemplo, una ADN polimerasa mutante puede ser E558G G46E L329A S671F E678G CS5 ó similar.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la mutación del motivo de SEC ID nº 1 o, más preferentemente, SEC ID nº 33, solo o en combinación con otras sustituciones de aminoácidos en otras posiciones, proporciona una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADN polimerasa de otro modo idéntica. Pueden utilizarse diversos ensayos bien conocidos por el experto en la materia para medir la tasa de extensión de ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, dichos ensayos se llevan a cabo para comparar una ADN polimerasa que comprende el motivo de SEC ID nº 1 ó de SEC ID nº 33 con otra ADN polimerasa que presenta la misma secuencia de aminoácidos en cada posición excepto por una única sustitución en la posición X13. En algunas realizaciones, dichos ensayos se llevan a cabo para comparar una ADN polimerasa que comprende el motivo de SEC ID nº 1 ó de SEC ID nº 33 con otra ADN polimerasa que presenta la misma secuencia de aminoácidos en cada posición excepto por una única sustitución en la posición X13 y sustituciones en otras posiciones, tal como se indica en la presente memoria.

Además de la mutación del motivo de SEC ID nº 1 ó SEC ID nº 33 tal como se indica en la presente memoria, las ADN polimerasas mutantes también pueden incluir otra u otras modificaciones no realizadas por sustitución. Entre dichas modificaciones pueden incluirse, por ejemplo, modificaciones covalentes conocidas de la técnica para proporcionar una ventaja adicional en aplicaciones que comprenden la extensión de cebadores. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la ADN polimerasa mutante incluye además una modificación covalente térmicamente reversible. En estas realizaciones, se une covalentemente un grupo modificador a la proteína, resultando en una pérdida de la totalidad, o de prácticamente la totalidad, de la actividad enzimática. El grupo modificador se selecciona de manera que la modificación se invierta mediante incubación a una temperatura elevada. Las ADN polimerasas que comprenden dichas modificaciones térmicamente reversibles resultan particularmente adecuadas para las aplicaciones de inicio en caliente, tales como, por ejemplo, diversas técnicas de PCR de inicio en caliente. Los reactivos modificadores térmicamente reversibles que pueden utilizarse de acuerdo con las ADN polimerasas mutantes de la presente invención se describen en, por ejemplo, la patente US nº 5.773.258, de Birch et al. Entre las modificaciones ejemplares se incluyen, por ejemplo, el bloqueo reversible de los residuos lisina mediante modificación química del grupo £-amino de los residuos lisina (ver Birch et al., supra). En determinadas variaciones, la modificación covalente térmicamente reversible incluye la unión covalente con el grupo £-amino de los residuos lisina, de un anhídrido dicarboxílico tal como se describe en Birch et al., supra.

Por ejemplo, se producen polimerasas mutantes particularmente adecuadas que comprenden una modificación covalente térmicamente reversible mediante una reacción, llevada a cabo a pH alcalino a una temperatura que es inferior a aproximadamente 25ºC, de una mezcla de un enzima termoestable y un anhídrido de ácido dicarboxílico que presenta una fórmula general seleccionada de entre el grupo que consiste de:

(a) fórmula I:

en la que R1 y R2 son hidrógeno o radicales orgánicos, que pueden encontrarse unidos, y (b) fórmula II:

en la que R1 y R2 son radicales orgánicos, que pueden encontrarse unidos, y los hidrógenos se encuentran en cis, esencialmente tal como se describe en Birch et al., supra. En realizaciones específicas que comprenden una modificación covalente térmicamente reversible, la forma no modificada de la polimerasa es la ADN polimerasa CS5 G64E.

Las ADN polimerasas mutantes de la presente invención pueden construirse mediante la mutación de las secuencias de ADN que codifican la polimerasa no modificada correspondiente (por ejemplo una polimerasa de tipo salvaje o una variante correspondiente a partir de la que se deriva la polimerasa mutante de la invención), tal como mediante la utilización de técnicas comúnmente denominadas mutagénesis sitio-dirigida. Las moléculas de ácidos nucleicos codificantes de la forma no modificada de la polimerasa pueden mutarse mediante una diversidad de técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocidas por el experto ordinario en la materia (ver, por ejemplo, PCR Strategies (M.A. Innis, D.H. Gelfand y J.J. Sninsky, editores, 1995, Academic Press, San Diego, CA) en el capítulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M.A. Innis, D. H. Gelfand, J.J. Sninsky y T.J. White, editores, Academic Press, NY, 1990).

A título de ejemplo no limitativo, el sistema de dos cebadores utilizado en el kit transformante de mutagénesis sitiodirigida de Clontech, puede utilizarse para introducir mutantes sitio-dirigidos en un polinucleótido codificante de una forma no modificada de la polimerasa. Tras la desnaturalización del plásmido diana en este systema, se hibridan simultáneamente dos cebadores con el plásmido; uno de estos cebadores contiene la mutación sitio-dirigida deseada, y el otro contiene una mutación en otro punto del plásmido, resultando en la eliminación de un sitio de restricción. A continuación, se lleva a cabo la síntesis de la segunda cadena, ligando íntimamente estas dos mutaciones, y los plásmidos resultantes se transforman en una cepa mutS de E. coli. Se aísla el plásmido de ADN a partir de las bacterias transformadas, se corta con el enzima de restricción relevante (linearizando de esta manera los plásmidos no mutados) y después se transforma nuevamente en E. coli. Este sistema permite la generación de mutaciones directamente en un plásmido de expresión, sin la necesidad de subclonar o de generar fagémidos de cadena sencilla. El ligamiento íntimo de las dos mutaciones y la posterior linearización de los plásmidos no mutados resulta en una eficiencia de mutación elevada y permite un cribado mínimo. Tras la síntesis del cebador de sitio de restricción inicial, este método requiere la utilización de sólo un nuevo tipo de cebador por cada sitio de mutación. En lugar de preparar cada mutante posicional por separado, puede sintetizarse un conjunto de cebadores oligonucleótidos "degenerados de diseño" con el fin de introducir todas las mutaciones deseadas en un sitio dado simultáneamente. Los transformantes pueden cribarse mediante secuenciación del ADN plasmídico a través de la región mutagenizada con el fin de identificar y clasificar los clones mutantes. A continuación, puede cortarse cada ADN mutante y analizarse mediante electroforesis, tal como, por ejemplo, en un gel de incremento de la detección de mutaciones (Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) para confirmar que no se ha producido ninguna otra alteración de la secuencia (mediante comparación del desplazamiento de bandas con el control no mutagenizado). Alternativamente, puede secuenciarse la región de ADN completa para confirmar que no se han producido sucesos mutacionales adicionales fuera de la región diana.

Los dúplex mutantes verificados en vectores de sobreexpresión pET (u otros) pueden utilizarse para transformar E. coli, tales como, por ejemplo, la cepa E. coli BL21 (DE3) pLysS, para una producción de alto nivel de la proteína mutante y la purificación mediante protocolos estándares. El método de mapeado por BAR-EM, por ejemplo, puede utilizarse para comprobar rápidamente la fidelidad de la expresión de mutantes. Esta técnica permite la secuenciación de segmentos en toda la proteína completa y proporciona la confianza necesaria en la asignación de secuencias. En un experimento de mapeado de este tipo, la proteína se digiere con una proteasa (la elección dependerá de la región específica que debe modificarse, ya que este segmento resulta de interés primordial y el mapa restante debería ser idéntico al mapa de la proteína no mutagenizada). El conjunto de fragmentos de corte se fracciona mediante, por ejemplo, HPLC Microbore (fase inversa o intercambio iónico, nuevamente dependiendo de la región específica que debe modificarse), proporcionando varios péptidos en cada fracción, y se determinan los pesos moleculares de los péptidos mediante métodos estándares, tales como BAR-EM. La masa determinada de cada fragmento seguidamente se compara con los pesos moleculares de los péptidos esperados de la digestión de la secuencia predicha y se determina rápidamente el grado de corrección de la secuencia. Debido a que este enfoque de mutagénesis a la modificación de las proteínas es dirigido, no debería resultar necesaria la secuenciación del péptido alterado en el caso de que los datos de EM concuerden con las predicciones. En caso necesario para verificar un residuo modificado, puede utilizarse la DIC (disociación inducida por colisión)-EM en tándem/EM para secuenciar los péptidos de la mezcla en cuestión, o el péptido diana puede purificarse para la degradación Edman sustractiva o la digestión con carboxipeptidasa Y, dependiendo de la localización de la modificación.

Las ADN polimerasas de la invención con más de una sustitución de aminoácido pueden generarse de diversas maneras. En el caso de los aminoácidos situados estrechamente próximos en la cadena polipeptídica, pueden mutarse simultáneamente utilizando un oligonucleótido que codifica la totalidad de las sustituciones de aminoácidos deseadas. Sin embargo, si los aminoácidos se encuentran situados a cierta distancia entre sí (separados por más de diez aminoácidos, por ejemplo), resulta más difícil generar un solo oligonucleótido que codifique la totalidad de los cambios deseados. De esta manera, puede utilizarse cualquiera de dos métodos alternativos. En el primer método, se genera un oligonucleótido separado para cada aminoácido que debe sustituirse. A continuación, los oligonucleótidos se hibridan con el ADN molde de cadena sencilla simultáneamente, y la segunda cadena de ADN que se sintetiza a partir del molde codificará todas las sustituciones de aminoácidos deseadas. Un método alternativo implica dos o más rondas de mutagénesis para producir el mutante deseado. La primera ronda es tal como se describe para los mutantes únicos: se utiliza ADN codificante de la polimerasa no modificada para el molde, un oligonucleótido codificante de la primera o primeras sustituciones de aminoácidos deseadas se hibrida con este molde y seguidamente se genera la molécula de ADN heterodúplex. La segunda ronda de mutagénesis utiliza el ADN mutado producido en la primera ronda de mutagénesis como el molde. De esta manera, este molde ya contiene una o más mutaciones. El oligonucleótido codificante de la sustitución o sustituciones de aminoácidos deseadas adicionales seguidamente se hibrida con este molde, y la cadena resultante de ADN codifica ahora mutaciones tanto de la primera como de la segunda rondas de mutagénesis. Este ADN resultante puede utilizarse como molde en una tercera ronda de mutagénesis, y de esta manera sucesivamente. Alternativamente, puede utilizarse el método de mutagénsis multisitio de Seyfang y Jin (Anal. Biochem. 324:285-291, 2004).

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, también se proporcionan ácidos nucleicos recombinantes que codifica cualquiera de las ADN polimerasas de la presente invención. Utilizando un ácido nucleico de la presente invención, codificante de una ADN polimerasa de la invención, puede prepararse una diversidad de vectores. En la práctica de la invención puede utilizarse cualquier vector que contenga replicón y secuencias de control derivadas de una especie compatible con la célula huésped. Generalmente, entre los vectores de expresión se incluyen regiones de ácidos nucleicos reguladoras de la transcripción y la traducción operablemente ligadas al ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa mutante. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia codificante operablemente ligada en un organismo huésped particular. Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Además, el vector puede contener un elemento retrorregulador positivo (ERP) para incrementar la vida media del ARNm transcrito (ver Gelfand et al., patente US nº 4.666.848). Las regiones de ácidos nucleicos reguladoras de la transcripción y la traducción generalmente serán apropiadas para la célula huésped utilizada para expresar la polimerasa. Son conocidas de la técnica numerosos tipos de vectores de expresión apropiados, y secuencias reguladoras adecuadas, para una diversidad de células huésped. En general, entre las secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción pueden incluirse, por ejemplo, secuencias de promotor, sitios de unión ribosómica, secuencias de inicio y de parada de la transcripción, secuencias de inicio y de parada de la traducción y secuencias intensificadoras o activadoras. En realizaciones típicas, entre las secuencias reguladoras se incluyen un promotor y secuencias de inicio y de parada de la transcripción. Entre los vectores también se incluye típicamente una región policonectora que contiene varios sitios de restricción para la inserción de ADN foráneo. En determinadas realizaciones, se utilizan "etiquetas de fusión" para facilitar la purificación y, si se desea, la eliminación posterior de la secuencia de etiqueta/Flag, por ejemplo la "etiqueta His". Sin embargo, éstas generalmente resultan innecesarias al purificar una proteína termoactiva y/o termoestable a partir de un huésped mesofílico (por ejemplo E. coli), en donde puede utilizarse una "etapa de calentamiento". La construcción de vectores adecuados que contienen ADN codificante de secuencias de replicación, secuencias reguladoras, genes de selección fenotípica y la polimerasa mutante de interés se preparan utilizando procedimientos estándares de ADN recombinante. Los plásmidos, vectores víricos y fragmentos de ADN aislados se corta, se ajustan y se ligan entre sí en un orden específico para generar los vectores deseados, tal como es bien conocido de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY, 2a edición, 1989)).

En determinadas realizaciones, el vector de expresión contiene un gen de marcador seleccionable que permite la selección de las células huésped transformadas. Los genes de selección son bien conocidos de la técnica y varían según la célula huésped utilizada. Entre los genes de selección adecuados pueden incluirse, por ejemplo, genes codificantes de resistencia a la ampicilina y/o a la tetraciclina, lo que permite que las células transformadas con estos vectores crezcan en presencia de estos antibióticos.

En un aspecto de la presente invención, se introduce un ácido nucleico codificante de una ADN polimerasa mutante en una célula, solo o en combinación con un vector. La expresión "se introduce" o equivalentes gramaticales en la presente memoria se refieren a que los ácidos nucleicos se introducen en las células de una manera adecuada para la integración, amplificación y/o expresión posteriores del ácido nucleico. El método de introducción está dictado en gran medida por el tipo celular diana. Entre los métodos ejemplares se incluyen la precipitación con CaPO4, la fusión de liposomas, LIPOFECTIN®, la electroporación, la infección vírica y similares.

Los procariotas son utilizados típicamente como células huésped para las etapas de clonación iniciales de la presente invención. Resultan particularmente útiles para la producción rápida de grandes cantidades de ADN, para la producción de moldes de ADN de cadena sencilla utilizados para la mutagénesis sitio-dirigida, para el cribado de muchos mutantes simultáneamente y para la secuenciación de ADN de los mutantes generados. Entre las células huésped procarióticas adecuadas se incluyen E. coli K12 cepa 94 (ATCC nº 31.446), E. coli cepa W3110 (ATCC nº 27.325), E. coli K12 cepa DG116 (ATCC nº 53.606), E. coli X1776 (ATCC nº 31.537) y E. coli B; sin embargo, muchas otras cepas de E. coli, tales como HB101, JM101, NM522, NM538, NM539 y muchas otras especies y géneros de procariotas, incluyendo bacilos tales como Bacillus subtilis, otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas, pueden utilizarse como huéspedes. Las células huésped procarióticas u otras células huésped con paredes celulares rígidas se transforman típicamente utilizando el método del cloruro de calcio, tal como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al.,

supra. Alternativamente, puede utilizarse la electroporación para la transformación de estas células. Las técnicas de transformación de procarióticas se describen en, por ejemplo, Dower, en: Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol. 204:63, 1991. Entre los plásmidos utilizados típicamente para la transformación de E. coli se incluyen pBR322, pUCI8, pUCI9, pUCI18, pUC119 y Bluescript M13, la totalidad de los cuales se describe en las secciones 1.12-1.20 de Sambrook et al., supra. Sin embargo, también se encuentran disponibles muchos otros vectores adecuados.

Las ADN polimerasas de la presente invención se producen típicamente mediante cultivo de una célula huésped transformada con un vector de expresión que contiene un ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa mutante, bajo las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la ADN polimerasa mutante. Los métodos de cultivo de células huésped transformadas bajo condiciones adecuadas para la expresión de proteínas son bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Entre las células huésped adecuadas para la producción de las polimerasas mutantes a partir de vectores plásmidos que contienen el promotor pL de lambda se incluyen E. coli cepa DG116 (ATCC nº 53606) (ver la patente US nº 5.079.352, y Lawyer F.C. et al., PCR Methods and Applications 2:275-87, 1993). Tras la expresión, la polimerasa mutante puede recolectarse y aislarse. Los métodos para purificar la ADN polimerasa termoestable se describen en, por ejemplo, Lawyer et al., supra.

Tras la purificación, la capacidad de las ADN polimerasas mutantes para extender los moldes con cebadores puede someterse a ensayo en cualquiera de entre diversos ensayos conocidos para medir la extensión. Por ejemplo, en presencia de molécula de molde con cebadores (por ejemplo ADN de M13, etc.), un tampón apropiado, un juego completo de dNTP (por ejemplo dATP, dCTP, dGTP y dTTP) e iones metálicos, las ADN polimerasas extenderán los cebadores, convirtiendo el ADN de cadena sencilla (ADNmc) en ADN de doble cadena (ADNdc). Esta conversión puede detectarse y cuantificarse mediante, por ejemplo, la adición de un pigmento de unión a ADNdc, tal como SYBR verde I. Utilizando un termociclador cinético (ver Watson et al., Anal. Biochem. 329:58-67, 2004, y también disponible de, por ejemplo, Applied Biosystems, Stratagene y BioRAd), pueden obtenerse imágenes digitales de las placas de reacción (por ejemplo a intervalos de 10 a 30 segundos), permitiendo de esta manera realizar un seguimiento del progreso de las reacciones. El nivel de fluorescencia detectado puede convertirse fácilmente en tasas de extensión. Utilizando dichos ensayos rutinarios, pueden determinarse las tasas de extensión de los mutantes respecto a las formas no modificadas de la polimerasa.

Las ADN polimerasas de la presente invención pueden utilizarse para cualquier fin en el que dicha actividad enzimática resulte necesaria o deseada. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en otro aspecto de la invención se proporcionan métodos de extensión de cebadores utilizando las ADN polimerasas de la invención. Las condiciones adecuadas para la extensión de cebadores son conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra). Ver también Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4a edición, John Wiley & Sons, 1999). Generalmente se aparea un cebador, es decir, se hibrida, con un ácido nucleico diana, formando un complejo de cebador-molde. El complejo de cebador-molde se pone en contacto con la ADN polimerasa mutante y nucleótidos libres en un medio adecuado para permitir la adición de uno o más nucleótidos al extremo 3' del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido que es complementario al ácido nucleico diana. El cebador puede incluir, por ejemplo, uno o más análogos de nucleótido. Además, los nucleótidos libres pueden ser nucleótidos convencionales, nucleótidos no convencionales (por ejemplo ribonucleótidos o nucleótidos marcados) o una mezcla de los mismos. En algunas variaciones, la reacción de extensión de cebador comprende la amplificación de un ácido nucleico diana. Las condiciones adecuadas para la amplificación de los ácidos nucleicos utilizando una ADN polimerasa y una pareja de cebadores también son conocidas de la técnica (por ejemplo los métodos de amplificación por PCR). Ver, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubuel et al., supra; PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al., editores, Academic Press, 1999). En otras realizaciones no mutuamente exclusivas, la reacción de extensión de cebadores comprende la transcripción inversa de un molde de ARN (por ejemplo la RT-PCR). La utilización de las presentes polimerasas mutantes, que proporcionan una tasa de extensión mejorada, proporcionan, por ejemplo, la capacidad de llevar a cabo dichas reacciones de extensión de cebadores con tiempos de incubación relativamente cortos, concentraciones de enzima reducidas y/o un rendimiento de producto incrementado.

En todavía otras realizaciones, las ADN polimerasas de la invención se utilizan para la extensión de cebadores en el contexto de la secuenciación del ADN, el marcaje del ADN o el marcaje de los productos de extensión de cebadores. Por ejemplo, la secuenciación del ADN mediante el método del dideoxinucleótido de Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463, 1977) es mejorada por la presente invención para las polimerasas capaces de incorporar nucleótidos de terminación de cadena no convencionales. Los avances en el método básico de Sanger et al. han proporcionado nuevos vectores (Yanisch-Perron et al., Gene 33:103-119, 1985) y análogos de bases (Mills et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2232-2235, 1979, y Barr et al., Biotechniques 4:428-432, 1986). En general, la secuenciación del ADN requiere la extensión de cebadores dependiente de molde en presencia de análogos de bases terminadores de cadena, resultando en una distribución de fragmentos parciales que posteriormente se separan según tamaño. El procedimiento básico de secuenciación dideoxi implica: (i) la hibridación de un cebador oligonucleótido, opcionalmente marcado, con un molde, (ii) la extensión del cebador con ADN polimerasa en cuatro reacciones separadas, conteniendo cada uno una mezcla de dNTP no marcados y una cantidad limitante de un agente terminador de cadena, tal como un ddNTP, opcionalmente marcado, e (iii) la resolución de los cuatro conjuntos de productos de reacción en un gel desnaturalizante de alta resolución de poliacrilamida/urea. Los productos de reacción pueden detectarse en el gel mediante autorradiografía o mediante detección de fluorescencia, dependiendo del marcaje utilizado, y la imagen puede examinarse para inferir la secuencia de nucleótidos. Estos métodos utilizan la ADN polimerasa, tal como el fragmento Klenow de Pol I de E. coli o una ADN polimerasa de T7 modificada.

La disponibilidad de las polimerasas termoestables, tales como la ADN polimerasa Taq, resultó en métodos mejorados de secuenciación con ADN polimerasa termoestable (ver Innis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436, 1988) y modificaciones de los mismos denominadas "secuenciación cíclica" (Murray, Nuc. Acids Res. 17:8889, 1989). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, las polimerasas termoestables mutantes de la presente invención pueden utilizarse conjuntamente con dichos métodos. A modo de alternativa a la secuenciación dideoxi básica, la secuenciación cíclica es una amplificación asimétrica lineal de secuencias diana complementarias a la secuencia del molde en presencia de terminadores de cadena. Un único ciclo produce una familia de productos de extensión de todas las longitudes posibles. Tras la desnaturalización del producto de reacción de extensión a partir del ADN molde, se producen múltiples ciclos de hibridación del cebador y de extensión del cebador en presencia de terminadores tales como los ddNTP. La secuenciación cíclica requiere menos ADN molde que la secuenciación convencional de terminación de cadena. Las ADN polimerasas termoestables presentan varias ventajas en la secuenciación cíclica: toleran las temperaturas restrictivas de hibridación que resultan necesarias para la hibridación específica de los cebadores con las dianas de ácidos nucleicos, así como toleran los múltiples ciclos de desnaturalización a alta temperatura que se producen en cada ciclo, por ejemplo a 90-95ºC. Por ello, la ADN polimerasa AMPLITAQ® y sus derivados y descendientes, por ejemplo la ADN polimerasa CS AmpliTaq y la ADN polimerasa FS AmpliTaq se han incluido en los kits de secuenciación cíclica Taq comercializados por compañías tales como Perkin-Elmer (Norwalk, CT) y Applied Biosystems (Foster City, CA).

Entre las variaciones de los métodos de secuenciación por terminación de cadena se incluyen la secuenciación de pigmento-cebador y la secuenciación de pigmento-terminador. En la secuenciación de pigmento-cebador, los terminadores ddNTP no se encuentran marcados y se utiliza un cebador marcado para detectar los productos de extensión (Smith et al., Nature 32:674-679, 1986). En la secuenciación de ADN de pigmento-terminador, se utiliza una ADN polimerasa para incorporar los dNTP y los ddNTP marcados fluorescentemente en el extremo de un cebador de ADN (Lee et al., Nuc. Acids Res. 20:2471, 1992). Este procedimiento ofrece la ventaja de que no resulta necesario sintetizar cebadores marcados con pigmento. Además, las reacciones de pigmento terminador resultan más convenientes en el aspecto de que la totalidad de las cuatro reacciones puede llevarse a cabo en el mismo tubo.

Los métodos tanto de pigmento-cebador como de pigmento-terminador pueden automatizarse utilizando un instrumento de secuenciación automatizado producido por Applied Biosystems (Foster City, CA) (patente US nº 5.171.534). Al utilizar el instrumento, la mezcla de reacción de secuenciación completada se fracciona en un gel de poliacrilamida desnaturalizante o en capilares montados en el instrumento. Un láser en la parte inferior del instrumento detecta los productos fluorescentes al someterlos a electroforesis según tamaño a través del gel.

Comúnmente se utilizan dos tipos de pigmentos fluorescentes para marcar los terminadores utilizados para la secuenciación de pigmento-terminador: pigmentos fluorescentes con carga negativa y zwiteriónicos. Entre los pigmentos fluorescentes con carga negativa se incluyen los de la familia de la fluoresceína y de BODIPY. Los pigmentos BODIPY (4,4-difloro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) se describen en la publicación de patente internacional WO nº 97/00967. Entre los pigmentos fluorescentes zwiteriónicos se incluyen los de la familia de la rodamina. Los kits de secuenciación cíclica comercialmente disponibles utilizan terminadores marcados con derivados de rodamina. Sin embargo, los terminadores marcados con rodamina son bastante caros y el producto debe separarse de pigmento no incorporado-ddNTP antes de cargarlos en el gel, ya que comigran con los productos de secuenciación. Los terminadores de la familia del pigmento rodamina aparentemente estabilizan las estructuras de horquilla en las regiones ricas en GC, lo que provoca que los productos migren anómalamente. Lo anterior requiere la utilización de dITP, que relaja la estructura secundaria, aunque también afecta a la eficiencia de la incorporación del terminador.

En contraste, los terminadores marcados con fluoresceína eliminan la etapa de separación previamente a la carga en el gel, ya que presentan una carga negativa neta mayor y migran más rápidamente que los productos de secuenciación. Además, los productos de secuenciación marcados con fluoresceína presentan una migración electroforética mejor que los productos de secuenciación marcados con rodamina. Aunque la ADN polimerasa Taq de tipo salvaje no incorpora eficientemente los terminadores marcados con pigmentos de la familia de la fluoresceína, lo anterior ahora puede llevarse a cabo eficientemente mediante la utilización de los enzimas modificados que se indican en la solicitud publicada de patente US nº 2002/0142333. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, las modificaciones descritas en el documento US nº 2002/142333 pueden utilizarse en el contexto de la presente invención para producir polimerasas termoestables que incorporan pigmento de la familia de la fluoresceína que presentan tasas mejoradas de extensión de cebador. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la ADN polimerasa no modificada según la presente invención es una polimerasa termoestable modificada tal como se describe en el documento US nº 2002/0142333 y que presenta el motivo indicado en SEC ID nº 1 ó de SEC ID nº 33, respectivamente.

Entre otros formatos ejemplares de secuenciación de ácidos nucleicos en los que pueden utilizarse las ADN polimerasas de la invención se incluyen aquellos que implican compuestos terminadores que incluyen análogos 2'-PO4 de ribonucleótidos (ver, por ejemplo, las solicitudes publicadas de patente US nº 2005/0037991 y nº 2005/0037398, y la solicitud de patente US nº 11/583,605, titulada "SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OF NUCLEIC ACIDS COMPRISING 2’-TERMINATOR NUCLEOSIDES", presentada el 19 de octubre de 2006, de Bodepudi et al. y las solicitud de patente US nº 11/583,606, titulada "2’-TERMINATOR RELATED PYROPHOSPHO-ROLYSIS ACTIVATED POLYMERIZATION", presentada el 19 de octubre de 2006, de Gelfand et al.). Las ADN polimerasas indicadas en la presente memoria generalmente mejoran dichos métodos de secuenciación, por ejemplo mediante la reducción del tiempo necesario para las reacciones cicladas de extensión y/o mediante la reducción de la cantidad o concentración de enzima que se utiliza para un rendimiento satisfactorio.

En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan kits para la utilización en métodos de extensión de cebadores descritos en la presente memoria. Típicamente, el kit se compartimentaliza para facilitar el uso y contiene por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa mutada según la presente invención. También pueden incluirse uno o más recipientes adicionales que proporcionan uno o más reactivos adicionales. Dichos recipientes adicionales pueden incluir cualesquiera reactivos u otros elementos reconocidos por el experto en la materia para la utilización en procedimiento de extensión de cebadores según los métodos descritos anteriormente, incluyendo reactivos para la utilización en, por ejemplo, procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciación de ADN o procedimientos de marcaje de ADN. En particular, el kit incluye además un recipiente que proporciona un cebador sentido 5' hibridable, bajo condiciones de extensión de cebadores, con un polinucleótido molde predeterminado, o una pareja de cebadores que comprende el cebador sentido 5' y un cebador antisentido 3' correspondiente. El kit incluye además uno o más recipientes que proporciona nucleótidos libres (convencionales y/o no convencionales). En particular, el kit incluye dNTP Qfosforotioato, dUTP, dITP y/o dNTP marcados, tales como, por ejemplo, los dNTP de la familia del pigmento fluoresceína o del pigmento cianina. El kit según la invención incluye además uno o más recipientes que proporcionan un tampón adecuado para una reacción de extensión de cebadores.

Ejemplos

EJEMPLO 1: IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA ADN POLIMERASA MUTANTE CON ACTIVIDAD

DE EXTENSIÓN MEJORADA

Se identificó una mutación en las polimerasas de la familia CS que proporcionaba, por ejemplo, una capacidad mejorada de extender los moldes de ADN cebados en presencia de nucleótidos libres. En breve, entre las etapas de este procedimiento de cribado se incluían la generación de una biblioteca, la expresión y purificación parcial de enzimas mutantes, el cribado de los enzimas para la propiedad deseada, la secuenciación del ADN, la purificación clonal y la caracterización adicional de los mutantes seleccionados. Se describe en mayor detalle a continuación cada una de estas etapas.

La mutación identificada mediante este procedimiento era E558G. La mutación resultó en una capacidad mejorada de extender los moldes cebados. En el contexto particular de la mutación E678G, que permite la incorporación de ribonucleótidos y otros nucleótidos modificados en la posición 2', pero que también resultan en una capacidad deteriorada de extender moldes cebados, la mutación E558G mejora dicha propiedad de capacidad deteriorada de extensión de cebadores.

Generación de biblioteca clonal: un ácido nucleico codificante del dominio de polimerasa de la ADN polimerasa CS5 E678G se sometió a PCR mutagénica propensa a errores.

Se llevó a cabo una PCR utilizando un abanico de concentraciones de Mg2+ de entre 1,8 y 3,5 mM con el fin de generar bibliotecas con un abanico correspondiente de tasas de mutación. Las condiciones del tampón eran: bicina 50 mM, pH 8,2, KOAc 115 mM, glicerol al 8% p/v, 0,2 mM de cada dNTP y 0,2X de SYBR Verde I. Se utilizó un enzima de PCR de inicio en caliente GeneAmp® AccuRT a razón de 0,15 U/ml. Partiendo de 5x105 copias de ADN de plásmido CS5 E678G/volumen de reacción de 50 ml, se llevaron a cabo 30 ciclos de amplificación utilizando una temperatura de hibridación de 60ºC durante 15 segundos, una temperatura de extensión de 72ºC durante 45 segundos y una temperatura de desnaturalización de 95ºC durante 15 segundos.

Se purificó el amplicón resultante en una columna de centrifugación Qiaquick (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA) y se cortó con Bg1 II e Hind III, y después se purificó nuevamente. Se preparó un vector plásmido, una modificación de CS5 G46E L329A que portaba una deleción grande en el dominio de polimerasa entre los sitios BglII e HindIII, mediante el corte con los mismos dos enzimas de restricción y el tratamiento con fosfatasa intestinal bovina (FIB). El

vector cortado y la inserción mutada se mezclaron en diferentes proporciones y se trataron con ligasa de T4 durante la noche a 15ºC. Se purificaron las ligaciones y se transformaron en E. coli cepa LK3 mediante electroporación.

Se sembraron alícuotas en una placa con medio selectivo con ampicilina con el fin de determinar el número de transformantes únicos en cada transformación. Las transformaciones con los transformantes más únicos a cada tasa de mutagénesis se almacenaron a una temperatura de entre -70ºC y -80ºC en presencia de glicerol como crioprotector.

A continuación, se extendió cada biblioteca sobre placas de agar de gran formato selectivas con ampicilina. Se transfirieron colonias individuales a placas de 384 pocillos que contenía 2X caldo Luria con ampicilina y glicerol al 10% p/v utilizando un recolector automático de colonias (QPix2, Genetic Ltd.). Estas placas se incubaron durante la noche a 30ºC para permitir el crecimiento de los cultivos y después se almacenaron entre -70ºC y -80ºC. El glicerol añadido al 2X caldo Luria fue suficientemente poco para permitir el crecimiento del cultivo, aunque suficientemente alto para proporcionar crioprotección. Se prepararon varios miles de colonias a varios niveles de mutagénesis (Mg2+) de esta manera para el uso posterior.

Preparación de biblioteca de extractos Parte 1 - Fermentación: A partir de las bibliotecas clonales indicadas anteriormente, se preparó una biblioteca correspondiente de extractos parcialmente purificados adecuados para los fines de cribado. La primera etapa de este procedimiento fue preparar cultivos de expresión a pequeña escala de cada clon. Estos cultivos se cultivaron en formato de 96 pocillos; por lo tanto, había 4 placas de cultivo de expresión por cada placa de biblioteca de 384 pocillos. Se transfirió un ml de cada pocillo de la placa de biblioteca clonal a un pocillo de una placa de inóculos de 96 pocillos, que contenía 150 ml de medio A (ver la Tabla 3, posteriormente). Esta placa de inóculos se agitó durante la noche a 1.150 rpm a 30ºC en un incubador/agitador de placas iEMS (ThermoElectron). A continuación, estos cultivos de inóculos se utilizaron para inocular el mismo medio, esta vez inoculando 10 ml en 300 ml de medio A en placas de 96 pocillos de gran formato (Nunc nº 267334). Estas placas se incubaron durante la noche a 37ºC. El plásmido de expresión contenía elementos de control transcripcional que permitían la expresión a 37ºC pero no a 30ºC. Tras la incubación durante la noche, los cultivos expresaban la proteína de clon típicamente a razón de 1-10% de las proteínas celulares totales. Las células de estos cultivos se recolectaron mediante centrifugación. Estas células se congelaron (-20ºC) o se procesaron inmediatamente, tal como se indica a continuación.

Tabla 3. Medio A (esterilizado mediante filtración previamente a la utilización)

Componente

Concentración

MgSO4.7H2O

0,2 g/l

Ácido cítrico.H2O

2 g/l

K2HPO4

10 g/l

NaNH4PO4.4H2O

3,5 g/l

MgSO4

2 mM

Casaminoácidos

2,5 g/l

Glucosa

2 g/l

HCl de tiamina

10 mg/l

Ampicilina

100 mg/l

Preparación de biblioteca de extractos Parte 2 - Extracción: Se resuspendieron pellets cellulares de la etapa de fermentación en 30 ml de tampón de lisis (Tabla 4, posteriormente) y se transfirieron a placas del termociclador de 384 pocillos. Observar que el tampón contenía lisozima para ayudar a la lisis celular, y dos nucleasas para eliminar tanto el ARN como el ADN del extracto. Las placas se sometieron a tres rondas de congelación-descongelaciáon (70ºC congelación, 37ºC descongelación, no menos de 15 minutos en cada etapa) para lisar las células. Se añadió sulfato amónico (5 ml de una solución 0,75 M) y las placas se incubaron a 75ºC durante 15 minutos con el fin de precipitar e inactivar las proteínas contaminantes, incluyendo las nucleasas añadidas exógenamente. Las placas se centrifugaron a 3.000xg durante 15 minutos y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de termociclador nueva de 384 pocillos. Estas placas de extractos se congelaron a -20ºC para la utilización posterior en cribados. Cada pocillo contenía aproximadamente 0,5 a 3 mM del enzima polimerasa mutante.

Tabla 4. Tampón de lisis

Componente

Concentración o porcentaje

Tris pH 8,0

20 mM

EDTA

1 mM

MgCl2

5 mM

TLCK

1 mM

Leupeptina

1 mg/ml

Pefabloc

0,5 mg/ml

Tween-20

al 0,5% v/v

Lisozima (procedente de polvos)

2 mg/ml

ARNasa

0,025 mg/ml

ADNasa I

0,075 unidades/ml

Cribado de bibliotecas de extractos para tasa de extensión mejorada: se utilizó ADN de cadena sencilla M13mp18 (ADN de M13), cebado con un oligonucleótido que presentaba la secuencia siguiente:

5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3’ (SEC ID nº 28)

como la molécula de molde en el cribado del ensayo de extensión. En este cribado, las placas de extractos indicadas anteriormente se diluyeron 10 veces en Tris 10 mM, pH 8,0 / EDTA 1 mM/KCl 100 mM/Tween-20 al 0,2% y se trató por calor a 90ºC durante 10 minutos, con el fin de incrementar la pureza. Se añadió 1,0 ml de extracto a 13 ml de mezcla maestra de reacción que contenía 1 nM de molde de M13 cebado en placas de PCR de 384 pocillos. Se realizó un seguimiento de la extensión del molde cebado a 64ºC cada 20 segundos en un ciclador térmico cinético modificado utilizando una cámara de CCD. A continuación se lista una mezcla maestra de reacción típica. La mezcla de reacción contenía además Tricina 100 mM, pH 8,0, KOAc 20 mM, MgCl2 3 mM, tampón de almacenamiento de enzima al 2,5% v/v que contenía Tween-20 al 0,5%, 0,1 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP y SYBR Verde I a 0,6X (Molecular Probes), que permitió la detección fluorescente de la extensión de la cadena de cebador. Con el fin de distinguir la fluorescencia derivada de la extensión de la fluorescencia de fondo, se incluyeron pocillos paralelos en el experimento en el que se había bloqueado la extensión de la cadena de cebador, por ejemplo mediante adición de un quelante metálico tal como EDTA, o excluyendo los nucleótidos de la mezcla maestra de reacción.

En este cribado se identificaron extractos mutantes que mostraban una tasa incrementada de extensión. El cribado primario se llevó a cabo a la escala de miles de extractos. Los pocillos de cultivo correspondientes a los mejores extractos se seleccionaron para ensayos posteriores. En primer lugar se estriaron en placas de agar selectivas para garantizar la pureza clonal. Se purificó el enzima mutante a partir de 100 ml de cultivos en matraz de agitación y se determinó la concentración mediante densitometría en gel. Estas preparaciones de enzima cuantificadas se compararon con el enzima parental bajo las condiciones utilizadas en el cribado, aunque a igual concentración de proteína. Este cribado final garantizó que las diferencias observadas no eran simplemente efectos de la concentración de proteína.

Tras esta ronda final de cribado, aparentemente cinco clones todavía presentaban tasas de extensión mejoradas. Se determinó que las secuencias de estos clones codificaban para los cambios de aminoácidos siguientes respecto a la cepa parental:

clon 1: S671 F

clon 2: S671F

clon 3: Q610R E779K I812L M844I

clon 4: E558G I829V

clon 5: E558G K861M

En el caso de los clones 1 y 2, resulta evidente que la mutación S671F debe haber sido responsable del fenotipo observado, ya que era la única mutación de aminoácido en el clon. Para el clon 3, el fenotipo con toda probabilidad era el resultado de la mutación Q601R, basándose en otros resultados. Debido a que tanto el clon 4 como el 5 portan la misma mutación E558G, aparentemente esta mutación era con toda probabilidad responsable del fenotipo observado. Para confirmarlo, se mutó un clon parental (ADN polimerasa CS5 G46E L329A E678G, "GLE") para que incluyese una mutación E558G adicional (ADN polimerasa CS5 G46E L329A E558G E678G, "GLEE") utilizando la bien conocida técnica de la mutagénesis in vitro mediante PCR solapante. El plásmido resultante se secuenció para confirmar que portaba la mutación deseada y no otra mutaciones no deseadas que ocasionalmente se generan durante las etapas de PCR de este procedimiento.

El nuevo plásmido se transformó en el huésped E. coli cepa LK3 y la proteína polimerasa se expresó, se purificó a homogeneidad y se cuantificó. Estos nuevos enzimas mutantes resultantes se compararon con los tipos parentales y con otros mutantes, bajo condiciones similares a las del cribado original. Se muestran los resultados en la figura 4. La cepa portadora de la mutación E558G, "GLEE", era más de 12 veces más rápida en la extensión de M13 cebado que el clon parental "GLE" bajo las condiciones del presente ensayo. Resulta evidente a partir de estos datos que la mutación E558G era única responsable del fenotipo mejorado de los clones mutantes 4 y 5. La figura también demuestra la tasa relativa de otras mutaciones determinadas en el esqueleto GLE, tales como D640G ("GLDE"), D573G ("997-OI"), Q601R ("GLQE"), S671F ("GLSE"), así como clones portadores de múltiples mutaciones, tales como la combinación de Q601R, S671F y D640G ("GLQDSE") y finalmente E558G en combinación con Q601R, S671F y D640G ("GLEQDSE").

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG and Roche Diagnostics GmbH

<120> ADN polimerasas mejoradas y métodos relacionados

<130> 24304 WO

<140> Todavía no asignado

<141> Todavía no asignado

<150> US 60/949,732

<151> 2007-07-13

<160> 33

<170> FastSEQ para Windows versión 4.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable mejorada modificada, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES 45

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = His, Glu o Gln

<221> MOD_RES

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD_RES

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Asn o His

<221> MOD_RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Leu o Ile

<221> MOD_RES

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD_RES

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD_RES

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Asp, Lys o Thr

<221> MOD_RES

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Leu o Val

<221> MOD_RES

<222> (14)...(15)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Val, Ile o Leu

<221> MOD_RES

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = Phe o Tyr

<221> MOD RES

<222> (19)...(19)

<223> Xaa = Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr, un aminoácido diferente de Asp o Glu

<221> MOD RES

<222> (20)...(20)

<223> Xaa = Lys o Glu

<221> MOD RES

<222> (21)...(21)

<223> Xaa = Leu o Gln

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable mejorada modificada, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD RES

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Ala o Val

<221> MOD_RES

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Gly o Val

<221> MOD_RES

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = His, Glu o Gln

<221> MOD_RES

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD_RES

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Asn o His

<221> MOD_RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Leu, Ile o Pro

<221> MOD_RES

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Asp, Lys o Thr

<221> MOD RES

<222> (12)...(12)

<223> Xaa = Gln o His

<221> MOD RES

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Leu, Val o Ile

<221> MOD RES

<222> (14)...(15)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Val, Ile, Leu o Lys

<221> MOD RES

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = Phe, Tyr o Gln

<221> MOD RES

<222> (19)...(19)

<223> Xaa = Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp or Tyr, un aminoácido diferente de Asp o Glu

<221> MOD RES

<222> (20)...(20)

<223> Xaa = Lys, Glu o Ala

<221> MOD RES

<222> (21)...(21)

<223> Leu, Gln o Gly

<400> 2

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus thermophilus (Tth)

<400> 3

<210> 4

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus caldophilus (Tca)

<400> 4

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus sp. Z05 (Z05)

<400> 5

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus aquaticus (Taq)

<400> 6

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus flavus (Tfl)

<400> 7 <210> 8

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus filiformis (Tfi)

<400> 8

<210> 9

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermus sp. sps17 (Sps17)

<400> 9

<210> 10

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Deinococcus radiodurans (Dra)

<400> 10

<210> 11

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica familia Hot Spring/clon 7 (HspB)

<400> 11

<210> 12

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Bacillus stearothermophilus (Bst)

<400> 12

<210> 13

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Bacillus caldotenax (Bca)

<400> 13

<210> 14

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Escherichia coli (Eco)

<400> 14

<210> 15

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermotoga maritime (Tma)

<400> 15

<210> 16

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermotoga neapolitana (Tne)

<400> 16

<210> 17

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica Thermosipho africanus (Taf)

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable de la bacteria termofílica familia A Hot Spring (HspA)

<400> 18

<210> 19

<211> 24

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable del bacteriófago T7 (T7).

<400> 19

<210> 20

<211> 893 10 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS5

<400> 20

<210> 21 5 <211> 893

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6

<400> 21

<210> 22

<211> 2682

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS5

<400> 22

5

<210> 23

<211> 2682

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> ADN polimerasa termoestable quimérica CS6

<400> 23

15

<210> 24

<211> 26 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> secuencia de consenso de la región del dominio polimerasa de la ADN polimerasa termoestable, secuencia 10 de consenso de motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES

<222> (1)...(26)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<400> 24

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable mutante, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Ile o Leu

<221> MOD_RES

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Gln o Leu

<221> MOD_RES

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = Gln, His o Glu

<221> MOD_RES

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Tyr, His o Phe

<221> MOD_RES

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Glu, Gln o Lys

<221> MOD_RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Ile, Leu o Tyr

<221> MOD_RES

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Gln, Thr, Met, Gly o Leu

<221> MOD RES

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Lys o Gln

<221> MOD RES

<222> (12)...(12)

<223> Xaa = Ser o Asn

<221> MOD RES

<222> (15)...(15)

<223> Xaa = Ile o Val

<221> MOD RES

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Glu o Asp

<400> 25 <210> 26

<211> 13

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable mutante, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Ser o Thr

<221> MOD_RES

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = Asp, Glu o Asn

<400> 26

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable mutante, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES

<222> (1)...(1)

<223> Xaa = Gly, Asn o Asp

<221> MOD_RES

<222> (2)...(2)

<223> Xaa = Trp o His

<221> MOD_RES

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = Trp, Ala, Leu o Val

<221> MOD_RES

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = Ile o Leu

<221> MOD_RES

<222> (5)...(5)

<223> Xaa = Val, Phe o Leu

<221> MOD_RES

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Ser, Ala, Val o Gly

<221> MOD RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Ala o Leu

<400> 27 <210> 28

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de oligonucleótido molde para cribado de ensayo de extensión de M13mp18 (ADN de M13)

<400> 28 gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc 30

<210> 29

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de forma no modificada de ADN polimerasa termoestable, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = His, Glu o Gln

<221> MOD RES

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Asn o His

<221> MOD_RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Leu o Ile

<221> MOD_RES

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Asp, Lys o Thr

<221> MOD_RES

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Leu o Val

<221> MOD_RES

<222> (14)...(15)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD_RES

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Val, Ile o Leu

<221> MOD_RES

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = Phe o Tyr

<221> MOD_RES

<222> (19)...(19)

<223> Xaa = Asp o Glu

<221> MOD_RES

<222> (20)...(20)

<223> Xaa = Lys o Glu

<221> MOD_RES

<222> (21)...(21)

<223> Xaa = Leu or Gln

<400> 29

<210> 30

<211> 8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> motivo A conservado de sitio activo de ADN polimerasa

<400> 30

<210> 31

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable quimérica CS5

<400> 31

<210> 32

<211> 26

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable quimérica CS6

<400> 32 <210> 33

<211> 21

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> región del dominio polimerasa de ADN polimerasa termoestable mejorada modificada, motivo de dominio polimerasa

<221> MOD_RES

<222> (3)...(3)

<223> Xaa = His, Glu o Gln

<221> MOD_RES

<222> (4)...(4)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD_RES

<222> (6)...(6)

<223> Xaa = Asn o His

<221> MOD RES

<222> (7)...(7)

<223> Xaa = Leu o Ile

<221> MOD_RES

<222> (8)...(8)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (10)...(10)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (11)...(11)

<223> Xaa = Asp, Lys o Thr

<221> MOD RES

<222> (13)...(13)

<223> Xaa = Leu o Val

<221> MOD RES

<222> (14)...(15)

<223> Xaa = cualquier aminoácido

<221> MOD RES

<222> (16)...(16)

<223> Xaa = Val, Ile o Leu

<221> MOD_RES

<222> (18)...(18)

<223> Xaa = Phe o Tyr

<221> MOD RES

<222> (20)...(20)

<223> Xaa = Lys o Glu

<221> MOD RES

<222> (21)...(21)

<223> Xaa = Leu o Gln

<400> 33

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. ADN polimerasa, que comprende A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8- X9- X10-X11-L-X12-X13-X14X15, en la que:

   X1 es E, X2 es P, X3 es N, X4 es I, X5 es N, X6 es P, X7 es K, X8 es V, X9 es S, X10 es R, X11 es I, X12 es F, X13 es G, X14 es K, y X15 es L,

   en la que la polimerasa presenta una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADN polimerasa de otro modo idéntica con la excepción de que X13 es E.

2. 2.

   ADN polimerasa según la reivindicación 1, en la que la polimerasa comprende una polimerasa quimérica.

3. 3.

   ADN polimerasa según la reivindicación 2, en la que la polimerasa quimérica presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una ADN polimerasa CS5 (SEC ID nº 20) o la ADN polimerasa CS6 (SEC ID nº 21).

4. 4.

   ADN polimerasa según la reivindicación 4, en la que la polimerasa quimérica comprende SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 ó una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21, las cuales se seleccionan de entre el grupo que consiste de: G46E, L329A y E678G, e incluye un cambio E558G respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21.

5. 5.

   ADN polimerasa según la reivindicación 1, que comprende además una modificación covalente térmicamente reversible.

6. 6.

   Ácido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa según la reivindicación 1.

7. 7.

   Vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6.

8. 8.

   Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 7.

9. 9.

   Método para producir una ADN polimerasa, comprendiendo dicho método:

   cultivar la célula huésped según la reivindicación 8 bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa mutante.

10. 10.

    Método para llevar a cabo la extensión de cebadores, que comprende:

    poner en contacto una ADN polimerasa según la reivindicación 1 con un cebador, un polinucleótido molde y nucleótidos libres bajo condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido.

11. 11.

    Método según la reivindicación 10, en el que el polinucleótido molde es un ARN o un ADN.

12. 12.

    Método según la reivindicación 10, en el que los nucleótidos libres comprenden nucleótidos no convencionales, comprendiendo estos últimos ribonucleótidos o nucleótidos marcados.

13. 13.

    Método según la reivindicación 10, que comprende poner en contacto la ADN polimerasa con una pareja de cebadores, el polinucleótido molde y los nucleótidos libres bajo condiciones adecuadas para la amplificación del polinucleótido.

14. 14.

    Kit para producir un cebador extendido, que comprende:

    por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa según la reivindicación 1 y uno o más recipientes adicionales seleccionados de entre el grupo que consiste de:

    (a)

    un recipiente que proporciona un cebador hibridable, bajo condiciones de extensión de cebadores, con un polinucleótido molde predeterminado,

    (b)

    un recipiente que proporciona nucleótidos libres, y

    (c)

    un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión de cebadores.