CN102099464A - 突变型dna聚合酶及相关方法 - Google Patents

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Abstract

公开了相对于相应的未经修饰的聚合酶具有改良的延伸速率的突变型DNA聚合酶。突变型聚合酶能够用于公开的多种引物延伸方法。还公开了相关的组合物，包括能够用于，例如，突变型DNA聚合酶生产的重组核酸、载体以及宿主细胞。

Description

突变型DNA聚合酶及相关方法
发明领域
本发明涉及DNA聚合酶领域及它们的各种应用，包括核酸的引物延伸与扩增。
发明背景
DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂诸如Mg2+存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次产生一致的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如Mullis的美国专利号4,683,202)。
在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在DNA复制的每一循环开始时添加(参见上述美国专利号4,683,202)。后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见Gelfand的美国专利号4,889,818和Mullis的美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，靶核酸序列可能仅仅是所考察(in question)DNA或RNA的一小部分，因此不扩增的话可能难以检测到靶核酸序列的存在。
聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，包括手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见Beese等，Science 260：352-355，1993)；Patel等，BioChemistry 34：5351-5363，1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，与引入的dNTP相互作用并在化学催化作用期间稳定过渡态的基序A是重叠的，在哺乳动物polα和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之间的平均偏差大约为
Figure G2008800244615D00021
(Wang等，Cell 89：1087-1099，1997)。在结构上基序A以主要包括疏水性残基的反向平行β链起始，延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。基序A的例子中，例如，序列DYSQIELR(SEQ ID NO：30)保留在从数百万年进化的生物体包括例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和大肠杆菌(Escherichia coli)分离的聚合酶中。把这些观察结果联系在一起，它们指出聚合酶通过类似的催化机理行使功能。
除了高度保守之外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够接受特定的氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如Patel等的美国专利号6,602,695)。这样的突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。本发明，如同在此阐述的，满足这些及其它需要。
发明概述
本发明提供了相对于相应的未经修饰的聚合酶具有改良的酶活性的DNA聚合酶，它可以用于多种核酸合成应用中。在一些实施方式中，聚合酶是分离的或纯化的。在一些实施方式中，DNA聚合酶包含氨基酸序列A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：1)，其中：
X2，X5，X6，X9，和X10是任何氨基酸，
X1是H，E或Q，
X3是N或H，
X4是L或I，
X7是D，K或T，
X8是L或V，
X11是V，I或L，
X12是F或Y，
X13是D或E之外的氨基酸，
X14是K或E，并且
X15是L或Q；
其中该聚合酶相对于X13是D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率。X2，X5，X6，X9和X10可以是任何氨基酸优选，该突变型聚合酶在位点X13具有G(SEQ ID NO：33)。在一些实施方式中，该突变型聚合酶在位点X13具有R或K。在进一步优选的实施方式中，X2选自P，A，E，T和V，X5选自N，R，G和S，X6选自R，P，S和T，X9选自E，G，Q，S和A，X10选自R，T，A，V，Y，S  和N，和/或X13选自A，C，F，G，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W或Y，最优选X13是G。
在一些实施方式中，本发明的DNA聚合酶是未经修饰的聚合酶的修饰形式。在它的未经修饰的形式中，聚合酶一般是功能性的，具有核苷酸掺入活性，并且在聚合酶结构域中包括具有以下基序的氨基酸序列：
A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：29)；其中X2，X5，X6，X9，和X10是任何氨基酸；X1是H，E或Q；X3是N或H；X4是L或I；X7是D，K或T；X8是L或V；X11是V，I或L；X12是F或Y；X13是D或E；X14是K或E；X15是L或Q。
该突变型聚合酶(即，从SEQ ID NO：29修饰)的进一步特征在于相对于它的未经修饰的形式，它至少在位点X13包括氨基酸取代，并且相对于其未经修饰的形式具有改良的核酸延伸速率。在一些实施方式中，该突变型聚合酶在位点X13具有D或E之外的氨基酸。优选，该突变型聚合酶在位点X13具有G。在一些实施方式中，该突变型聚合酶在位点X13具有R或K。
多种DNA聚合酶适于根据本发明的突变。尤其适宜的是热稳定聚合酶，包括来自各种嗜热菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通过氨基酸取代、插入或缺失或其它修饰来源于上述野生型或天然存在的酶的热稳定聚合酶。示例性的聚合酶的未经修饰形式包括例如CS5或CS6 DNA聚合酶，或与其具有至少80％、85％、90％或95％的序列同一性的功能性DNA聚合酶。其它未经修饰的聚合酶包括例如来自于下列任何种类嗜热菌的DNA聚合酶(或与所述聚合酶具有至少90％的序列同一性的功能性DNA聚合酶)：海栖热袍菌(Thermotoga maritima)；水生栖热菌(Thermus aquaticus)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；黄栖热菌(Thermus flavus)；丝状栖热菌(Thermus filiformis)；栖热菌种sps17(Thermus sp.sps17)；栖热菌种Z05(Thermus sp.Z05)；那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeopolitana)；非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)；Thermuscaldophilus或热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)。适宜的聚合酶还包括那些具有逆转录酶(RT)活性和/或能够掺入非常规核苷酸诸如核糖核苷酸或其它2′-修饰的核苷酸的聚合酶。
在一些实施方式中，聚合酶未经修饰的形式包括嵌合聚合酶。在一个实施方式中，例如，嵌合聚合酶未经修饰的形式是CS5 DNA聚合酶(SEQ ID NO：20)，CS6 DNA聚合酶(SEQ ID NO：21)或与CS5 DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶具有至少90％的序列同一性的聚合酶。在一些特定的变型中，嵌合聚合酶未经修饰的形式包括相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的选自G46E、L329A和E678G的一个或更多个氨基酸取代。例如，突变型聚合酶未经修饰的形式可以是G46E CS5；G46EL329A CS5；G46E E678G CS5；或G46E L329A E678G CS5。在示例性的实施方式中，这些未经修饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。例如，所述突变型DNA聚合酶可以是下列的任何一个：G46E E558G CS5；G46E L329A E558G CS5；G46E E558G E678G CS5；G46E L329A E558G E678G CS5；等等。在一些实施方式中，未经修饰的形式的嵌合聚合酶包括相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的一个或更多个氨基酸取代，所述一个或更多个氨基酸取代选自S671F，D640G，Q601R，和I669F。例如，未经修饰的形式的突变型聚合酶可以是S671FCS5；D640G CS5；Q601R CS5；I669F CS5；S671F D640G CS5；S671FQ601R CS5；S671F I669F CS5；D640G Q601R CS5；D640G I669F CS5；Q601R I669F CS5；S671F D640G Q601R CS5；S671F D640G I669F CS5；S671F Q601R I669F CS5；D640G Q601R I669F CS5；或S671F D640GQ601R I669F CS5。在示例性的实施方式中，这些未经修饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。例如，突变型DNA聚合酶可以是下列中的任一：E558G S671F CS5；E558G D640G CS5；E558GQ601R CS5；E558G I669F CS5；E558G S671F D640G CS5；E558G S671FQ601R CS5；E558G S671F I669F CS5；E558G D640G Q601R CS5；E558GD640G I669F CS5；E558G Q601R I669F CS5；E558G S671F D640GQ601R CS5；E558G S671F D640G I669F CS5；E558G S671F Q601R I669FCS5；E558G D640G Q601R I669F CS5；E558G S671F D640G Q601RI669F CS5；等等。在一些实施方式中，未经修饰的形式的嵌合聚合酶包括相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的一个或更多个选自G46E，L329A，和E678G的氨基酸取代，并且进一步包括相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的一个或更多个选自S671F，D640G，Q601R，和I669F的氨基酸取代。例如，未经修饰的形式的突变型聚合酶可以是G46EL329A S671F E678G CS5；等等。在示例性的实施方式中，这些未经修饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。例如，突变型聚合酶可以是E558G G46E L329A S671F E678G CS5等等。
DNA聚合酶酶活性可以利用其它非取代修饰被进一步改良。一种这样的修饰是热可逆的共价修饰，它使酶失活，但是在高温，诸如通常用于引物延伸的温度下孵育其被逆转而激活酶。在一个实施方式中，包括热可逆的共价修饰的DNA聚合酶由热稳定DNA聚合酶和具有下列式I或II之一的二羧酸酐的混合物在碱性pH和低于约25℃的温度下进行的反应产生：
Figure G2008800244615D00051
其中R1和R2是氢或有机基团，它们可以连在一起；或
Figure G2008800244615D00052
其中R1和R2是有机基团，它们可以连在一起，并且氢是顺式的。在上述酶的一个特定变型中，聚合酶未经修饰的形式是G64E CS5。
在其它各方面，本发明提供编码本文所述的DNA聚合酶的重组核酸，包含该重组核酸的载体，以及用所述载体转化的宿主细胞。在特定的实施方式中，所述载体是表达载体。包含上述表达载体的宿主细胞能够用于本发明的通过在适于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞生产聚合酶的方法。
在另一方面，提供了实施引物延伸的方法。该方法大体上包括在适于引物延伸的条件下将本发明的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板以及游离核苷酸接触，从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。游离核苷酸可以包括非常规核苷酸诸如核糖核苷酸和/或标记的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一个或更多个核苷酸类似物。在一些变型中，引物延伸方法是用于多核苷酸扩增的方法，包括在适于多核苷酸扩增的条件下将本发明的DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板以及游离核苷酸接触。
本发明还提供了用于上述引物延伸方法的试剂盒。大体上，所述试剂盒包括至少一个提供本文所述的本发明的DNA聚合酶的容器。在特定的实施方式中，该试剂盒进一步包括提供一种或更多种另外的试剂的一个或更多个另外的容器。例如，在特定的变型中，一个或更多个另外的容器提供游离核苷酸，适于引物延伸的缓冲剂，和/或在引物延伸条件下能够与预定的多核苷酸模板杂交的引物。
定义
除非有另外的定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有如同本发明所属技术领域的普通技术人员通常了解的含义。尽管仅仅描述了示例性的方法和物质，实质上与本文描述相似的任何方法和原料都可被用于本发明的实践或试验。对本发明来说，下列术语定义如下。
术语“一”(“a”、“an”)，和“该”(“the”)包括复数对象，除非上下文清楚地指出别的含义。
“氨基酸”指代可以合并为肽、多肽或蛋白质的任何单体单位。如本文所述的，术语“氨基酸”包括下列20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。这20种天然氨基酸的结构见例如Stryer等，BioChemistry，5th ed.，Freeman and Company(2002)。另外的氨基酸诸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够遗传编码(Stadtman(1996)“Selenocysteine，”Annu Rev Biochem.65：83-100 and Ibba等(2002)“Genetic code：introducingpyrrolysine，”Curr Biol.12(13)：R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如侧链和/或主链被修饰)和氨基酸类似物。参见例如Zhang等(2004)“Selective incorporation of 5-hydroxytryptophaninto proteins in mammalian cells，”ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(24)：8882-8887，Anderson等(2004)“An expanded genetic code with afunctional quadruplet codon”ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(20)：7566-7571，Ikeda等(2003)“Synthesis of a novel histidineanalogue and its efficient incorporation into a protein in vivo，”Protein Eng. Des.Sel.16(9)：699-706，Chin等(2003)“An Expanded Eukaryotic GeneticCode，”Science 301(5635)：964-967，James 等(2001)“Kineticcharacterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizablephenylazophenylalanine residues，”Protein Eng.Des.Sel.14(12)：983-991，Kohrer等(2001)“Import of amber and ochre suppressor tRNAs intomammalian cells：A general approach to site-specific insertion of aminoacid analogues into proteins，”ProC.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(25)：14310-14315，Bacher等(2001)“Selection and Characterization ofEscherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise ToxicTryptophan Analogue，”J.Bacteriol.183(18)：5414-5425，Hamano-Takaku等(2000)“A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes theUnnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than Tyrosine，”J.Biol. Chem.275(51)：40324-40328和Budisa等(2001)“Proteins with{beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores andpharmaceutically active amino acids，”Protein Sci.10(7)：1281-1292。
进一步说明，氨基酸典型地为包括取代的或未被取代的氨基、取代的或未被取代的羧基和一种或更多种侧链或基团，或这些基团的任意一个的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任意组合。其它代表性的氨基酸包括但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸、其它碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂的和/或光可裂的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或更多个毒性部分的氨基酸。
在本发明的DNA聚合酶上下文中的术语“突变体”表示相对于相应的功能性DNA聚合酶包含一个或更多个氨基酸取代的多肽，典型为重组的。
在突变型聚合酶上下文中的术语“未经修饰的形式”在本文中是用来定义本发明的突变型DNA聚合酶的术语：术语“未经修饰的形式”指具有除特定的作为表征突变型聚合酶的一个或更多个氨基酸位点外的突变型聚合酶氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，用(a)其未经修饰的形式和(b)一个或更多个特定氨基酸取代提及的突变型DNA聚合酶表示除特定的氨基酸取代之外，突变型聚合酶在特定的基序中具有与未经修饰的形式相同的另外的氨基酸序列。聚合酶可以包含另外的突变以提供想要的功能性，例如改良的双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的掺入，调整的5′-核酸酶活性，调整的3′-核酸酶(或校正)活性等。据此，在实施本文所述的本发明时，DNA聚合酶未经修饰的形式是预先确定的。DNA聚合酶未经修饰的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已经有意识地修饰过的DNA聚合酶。聚合酶未经修饰的形式优选热稳定DNA聚合酶，例如来自各种嗜热菌的DNA聚合酶及与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本上的序列同一性的功能性变体。上述变体可以包括，例如嵌合DNA聚合酶，诸如美国专利号6,228,628和7,148,049描述的嵌合DNA聚合酶。在特定的实施方式中，所述聚合酶未经修饰的形式具有逆转录酶(RT)活性。
术语“热稳定聚合酶”指对热稳定的酶，它是耐热的，当在高温下经过双链核酸变性所需要的时间后，其能保留足够的活性以进行随后的引物延伸反应，并且没有不可逆变性(失活)。核酸变性所需的加热条件是本领域熟知的并在例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中举例说明。如本文所述，热稳定聚合酶适于在温度周期变化的反应诸如聚合酶链式反应(“PCR”)中使用。此处的不可逆变性指永久的和完全的酶活性损失。对于热稳定聚合酶，酶活性指以适当的方式组合核苷酸以形成与模板核酸链互补的引物延伸产品的催化作用。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌，水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，丝状栖热菌，栖热菌种sps 17，栖热菌种Z05，Thermuscaldophilus，热坚芽孢杆菌，那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。
如本文使用的，“嵌合”蛋白质指氨基酸序列代表来自至少两个不同的蛋白质氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白质。嵌合蛋白典型不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是从编码该嵌合氨基酸序列的″嵌合″基因表达出来。在特定的实施方式中，例如，本发明突变型DNA聚合酶的未经修饰形式是由来源于栖热菌属菌种DNA聚合酶的氨基端(N-末端)区域和来源于Tma DNA聚合酶的羧基端(C-末端)区域组成的嵌合蛋白。N-末端区域指从N-末端(氨基酸位置1)延伸到内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域指从内部氨基酸延伸到C-末端的区域。
在突变型DNA聚合酶的上下文中，与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“相应”是基于根据核苷酸或氨基酸的位置数的编号惯例并以最大化序列同一性百分比的方式比对序列。因为不是给定的“相应区域”内部的所有位点都需要相同，相应区域内部的非匹配位点可能被认为是“相应位点”。据此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的“与氨基酸位点[X]相应的氨基酸位点”表示其它经过验证的DNA聚合酶和结构同系物和家族中的等效位点的集合。在本发明的典型的实施方式中，氨基酸位点的“相应”是根据包含本文中进一步探讨的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33的基序的聚合酶区域来确定的。
本文中使用的“重组体”指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”表示通常经由内切核酸酶的核酸操作，最初在体外产生的不同于自然中的常规形式的核酸。因此线性形式的分离的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外产生的表达载体都被认为是本发明的重组体。很清楚的是，一旦重组核酸被制造以及重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞体内的细胞机制而不是体外操作；然而，上述核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是本发明的重组体。“重组蛋白质”是使用重组技术，即通过上述的重组核酸的表达制造的蛋白质。重组蛋白质典型依据至少一个或更多个特征而不同于天然存在的蛋白质。
当与另一个核酸序列具有功能性关系时核酸是“可操纵连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它是与编码序列可操纵连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，那么它是与编码序列可操纵连接的。
术语“宿主细胞”指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及细胞培养物中生长的来自高等植物或者动物的单个的细胞。
术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是已经插入了一条外源DNA的。所述载体可以是例如来源于质粒的。载体包含在宿主细胞中促进自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其不是在该宿主细胞中天然发现的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外来的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，可以产生载体及其插入的DNA的若干拷贝。另外，载体还可以包含容许插入的DNA转录为mRNA分子或相反使插入的DNA复制为多拷贝RNA的必要元件。某些表达载体还包括插入的DNA附近的序列元件，其能增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译成蛋白分子。因此插入的DNA编码的许多mRNA和多肽分子能迅速地合成。
术语“核苷酸”除指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体之外，本文中还应当理解为涉及其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其对于使用该核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等效的，除非上下文明确指出不同。
术语“核酸”或“多核苷酸”指聚合体，其可以相应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合体或其类似物。其包括核苷酸诸如RNA和DNA的聚合体，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰)形式，和混合聚合体(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰诸如不带电的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的键(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其它键(例如，Nielsen等(((Science254：1497-1500，1991)描述的肽核酸)，典型地核苷酸单体通过磷酸二酯键连接。核酸可以是或包括，例如，染色体或染色体片段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合体、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不局限于任何特定的长度。除非另外指出，除任何明确指出的序列之外，特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列。
术语“寡核苷酸”指包括至少2个核酸单体单位(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型地包括大约6到大约175个核酸单体单位，更典型地大约8到大约100个核酸单体单位，更典型地大约10到大约50个核酸单体单位(例如大约15，大约20，大约25，大约30，大约35，或更多的核酸单体单位)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，包括该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任意地通过任何合适的方法制备，包括但不限于现有或天然序列的分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或通过例如，Narang等的磷酸三酯法(Meth.Enzymol.68：90-99，1979)，Brown等的磷酸二酯法(Meth.Enzymol.68：109-151，1979)，Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法(Tetrahedron Lett.22：1859-1862，1981)，Matteucci等的三酯法(J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191，1981)，自动合成法，或1984年7月3日授予Caruthers等的名为“PROCESS FORPREPARING POLYNUCLEOTIDES”的美国专利号4,458,066的固相支持法，或本领域技术人员所知的其它方法的方法直接化学合成。
本文中使用的术语“引物”指在起始引物延伸的条件下(例如，在包括在适当的缓冲液中和适当的温度或温度周期(例如在聚合酶链式反应中)下存在所需的三磷酸核苷(在要复制的模板支配下)和聚合酶的条件下)能够作为起始模板指导的核酸合成的位点的多核苷酸。为进一步说明，引物还可以用于其它多种寡核苷酸介导的合成过程，包括作为RNA从头合成和体外转录相关的过程(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物典型是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适宜长度取决于该引物预定的用途，但是典型地从6到40个核苷酸，更典型地从15到35个核苷酸。短的引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须是足够互补的以与模板杂交来发生引物延伸。在特定的实施方式中，术语“引物对”表示一组引物，其包括与扩增的核酸序列的5′末端的互补序列杂交的5′有义引物(有时称为″正向″)以及与扩增的序列的3′末端杂交的3′反义引物(有时称为″反向″)(例如，如果靶序列作为RNA表达或者是RNA)。如果需要，引物可以通过与用光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的标记相结合来标记。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于酶联免疫吸附(ELISA)测定试验)、生物素、或者半抗原和蛋白质，对于其可利用抗血清或单克隆抗体。
当涉及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时，术语“常规的”或“天然的”指描述的多核苷酸中天然存在的(即，对于DNA是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外，在体外DNA合成反应诸如测序中，dITP和7-脱氮-dGTP经常被用来代替dGTP，而7-脱氮-dATP可以用来代替dATP。共同地，这些称为dNTPs。
当涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时，术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。与常规的dNTPs相比，特定的非常规核苷酸在核糖的2′位置修饰。因此，尽管对于RNA天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP，共称rNTPs)，因为这些核苷酸具有在糖2′位的羟基，与之相比dNTPs没有，如本文使用的，作为DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸是非常规的核苷酸。如本文使用的，非常规的核苷酸包括但不限于在核酸测序中用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括但不限于具有2′，3′双脱氧结构的称为双脱氧核苷三磷酸的化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地称为ddNTPs。终止剂化合物的其他例子包括核糖核苷酸的2′-PO4类似物(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398)。其它非常规的核苷酸包括硫代磷酸dNTPs([[α]-S]dNTPs)、5′-[α]-硼烷(borano)-dNTPs、[α]-膦酸甲酯dNTPs和核糖核苷三磷酸(rNTPs)。非常规的碱基可以用放射性同位素诸如32P、33P或35S，荧光标记，化学发光标记，生物发光标记，半抗原标记诸如生物素，或者酶标记诸如链霉亲和素或抗生物素蛋白来标记。荧光标记可以包括带负电荷的染料，例如荧光素家族的染料，或者电中性的染料，例如罗丹明家族的染料，或者带正电荷的染料，例如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括德克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA。Perkin-Elmer(Boston，MA)、AppliedBiosystems(Foster City，CA)或Invitrogen/Molecular Probes(Eugene，OR)销售各种染料或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、德克萨斯红和TAMRA标记的核苷酸。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，其在GE Healthcare UK Limited(Amersham Place，LittleChalfont，Buckinghamshire，England)有售。
如本文使用的，“序列同一性百分比”通过在比较窗口比较两条最佳比对的序列来确定，其中对于两条序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分与参考序列(不包括添加或缺失)相比可以包括添加或缺失(即缺口)。百分比是通过确定存在于两条序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位点的数目以得到匹配位点的数目，用比较窗口中的位点总数除匹配位点的数目并用100乘该结果以得到序列同一性百分比来计算。
在两个或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同的”或“同一性”百分比指的是当在比较窗口或者指定的区域使用下列序列比较算法中的一种或用手工比对并目检测量为最大相应而比较和比对时，相同的或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如在特定区域内60％同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一性)的两条或更多条序列或子序列。如果序列至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，或者至少55％相同的，那么它们是″基本上相同的″。这些定义也指测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于至少约50核苷酸长度的区域中，或更典型地在100到500或1000或更多核苷酸长度的区域中。
在两个或更多核酸或多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“相似性百分比”指的是当在比较窗口或者指定的区域使用下列序列比较算法中的一种或用手工比对并目检测量为最大相应而比较和比对时，具有特定百分比相同的或定义为保守氨基酸取代的相似的氨基酸残基(例如在特定区域内60％相似性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相似的)的两条或多条序列或子序列。如果序列至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，或者至少55％彼此相似的，那么它们彼此是“基本上相似的”。任选地，相似性存在于至少约50氨基酸长度的区域中，或更典型地在至少大约100到500或1000或更多氨基酸长度的区域中。
对于序列比较，通常以一条序列作为参考序列，用测试序列与它比较。当使用序列比较算法时，将试验和参考序列输入电脑，指定子序列坐标(coordinate)，如有必要，还需指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定替换参数。然后以程序参数为基础，序列比较算法计算测试序列相对于参考序列的序列同一性或相似性百分比。
如本文使用的，“比较窗口”包括涉及选自由20到600组成的组的任一数目连续位点的片段，通常大约50到大约200，更通常大约100到大约150，其中在两条序列最佳比对后序列可以与同样数目连续位点的参考序列比较。用来比较的序列比对方法是本领域熟知的。用来比较的最佳序列比对可以，例如，采用Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv.Appl.Math.2：482，1970)，用Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48：443，1970)，用Pearson和Lipman的搜索相似性法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，1988)，用这些算法的计算机化执行(例如，theWisconsin Genetics Software Package中的GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.)，或者用手工比对及目检(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(1995 supplement))。
适于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别由Altschul等(Nuc.Acids Res.25：3389-402，1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215：403-10，1990)描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法包括：首先通过在查询序列中识别长度W的短字段来识别高分序列对(HSPs)，其在与数据库序列的同样长度字段比对时匹配或满足一定阳性阈值评分T。T被认为是邻近字段评分阈值(上述Altschul等)。这些最初的邻近字段命中作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSPs。字段命中沿着各序列双向延伸，只要累计的比对分数增加。对于核苷酸序列，累计分数使用参数M(匹配残基对的奖分；始终大于0)和N(不匹配残基的罚分；始终小于0)来计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计分数。字段命中在各方向的延伸停止于：累计比对分数从它最大获得值降低数量X时；由于一个或更多个负分残基比对的累积，累计分数达到或低于0时；或者到达任一序列的末尾。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用默认字长(W)11，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用默认字长3，期望值(E)10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff and Henikoff，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1989)比对(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。
BLAST算法也执行两条序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-87，1993)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P((N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小总和概率低于大约0.2，典型地低于大约0.01，以及更典型地低于大约0.001，那么该核酸被认为是与参考序列相似的。
术语“核酸延伸速率”指的是生物催化剂(例如酶，诸如聚合酶、连接酶等)以模板依赖或非模板依赖方式把一个或更多个核苷酸加到核酸上(例如共价地)来延伸该核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)的速率。相对于DNA聚合酶未经修饰的形式，此处描述的特定的突变型DNA聚合酶相对于这些DNA聚合酶的未修饰形式具有改良的核酸延伸速率，使得在一组给定的反应条件下它们可以以比未经修饰的形式更高的速率延伸引物。
术语“逆转录效率”指的是在给定的逆转录反应中RNA分子逆转录为cDNA的分数。
附图简述
图1描述了来自多种嗜热菌和噬菌体T7的示例性热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域中区域的氨基酸序列比对：嗜热栖热菌(Tth)(SEQ IDNO：3)、Thermus caldophilus(Tca)(SEQ ID NO：4)、栖热菌种Z05(Z05)(SEQID NO：5)、水生栖热菌(Taq)(SEQ ID NO：6)、黄栖热菌(Tfl)(SEQ IDNO：7)、丝状栖热菌(Tfi)(SEQ ID NO：8)、栖热菌种sps17(Sps17)(SEQ IDNO：9)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(Dra)(SEQ IDNO：10)、温泉家族B/克隆7(HspB)(SEQ ID NO：11)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)(Bacillus stearothermophilus)(SEQ ID NO：12)、热坚芽孢杆菌(Bca)(SEQ ID NO：13)、大肠杆菌(Eco)(SEQ ID NO：14)、海栖热袍菌(Tma)(SEQ ID NO：15)、那不勒斯栖热袍菌(Tne)(SEQ ID NO：16)、非洲栖热腔菌(Taf)(SEQ ID NO：17)、温泉家族A(HspA)(SEQ ID NO：18)和噬菌体T7(T7)(SEQ ID NO：19)。氨基酸序列比对还包括来自代表性嵌合热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域(SEQ ID NO：31和32)，即CS5和CS6。此外，还包括显示在这些示例性序列中的共有氨基酸序列的序列(Cons)(SEQ ID NO：24)。进一步地，显示的多肽区域包括氨基酸基序AGXXFXXXSXXQXXXXLXXXX(SEQ ID NO：1)，其中的可变位点在此处进一步定义。对于CS5和CS6聚合酶序列，这些基序用粗体突出显示。适于根据本发明的突变的氨基酸位点用星号(*)指出。比对中的缺口用圆点(.)指出。
图2A给出嵌合热稳定DNA聚合酶CS5的氨基酸序列(SEQ IDNO：20)。
图2B给出编码嵌合热稳定DNA聚合酶CS5的核酸序列(SEQ IDNO：22)。
图3A给出嵌合热稳定DNA聚合酶CS6的氨基酸序列(SEQ IDNO：21)。
图3B给出编码嵌合热稳定DNA聚合酶CS6的核酸序列(SEQ IDNO：23)。
图4是显示G46E L329A E678G(GLE)CS5 DNA聚合酶各种突变体的标准化延伸速率的条形图。y轴代表相对延伸速率，x轴代表具有特定点突变(GLE＝G46E L329A E678G CS5 DNA聚合酶，GLDE＝G46EL329A D640G E678G CS5 DNA聚合酶，GLEE＝G46E L329A E558GE678G CS5 DNA聚合酶，GLEQDSE＝G46E L329A E558G Q601RD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶，GLQDSE＝G46E L329A Q601RD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶，GLQE＝G46E L329A Q601RE678G CS5 DNA聚合酶，GLSE＝G46E L329A S671F E678G CS5 DNA聚合酶)的DNA聚合酶。突变型聚合酶获得的延伸速率值相对于设为1.00的GLE CS5 DNA聚合酶获得的延伸速率值来标准化。
发明详述
本发明提供具有改良的引物延伸速率的新的DNA聚合酶。为达到比亲本酶更优良或相同的性能，本发明的DNA聚合酶可以更低的浓度使用。考虑到先前鉴定的其它突变体的类似活性，预期在某些实施方式中本发明的DNA聚合酶将具有伴随的逆转录酶活性和/或扩增活性的提高。因此本发明的DNA聚合酶对涉及引物延伸以及多核苷酸模板的逆转录或扩增的多种应用是有用的，包括，例如在重组DNA研究和疾病的医疗诊断中的应用。
在本发明的一些实施方式中，本发明的DNA聚合酶包含下列氨基酸基序：
Ala-Gly-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xa a-Xaa-Xaa-Xaa(此处也以单字母编码称为A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15(SEQ IDNO：1))；其中
X2，X5，X6，X9，和X10是任何氨基酸；
X1是His(H)，Glu(E)或Gln(Q)；
X3是Asn(N)或His(H)；
X4是Leu(L)或Ile(I)；
X7是Asp(D)，Lys(K)或Thr(T)；
X8是Leu(L)或Val(V)；
X11是Val(V)，Ile(I)或Leu(L)；
X12是Phe(F)或Tyr(Y)；
X13是Asp(D)或Glu(E)之外的氨基酸；
X14是Lys(K)或Glu(E)；和
X15是Leu(L)或Gln(Q)。
其中该聚合酶相对于X13为D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率。优选根据本发明，X13为G(SEQ ID NO：33)。在一些实施方式中，X13可以是A，C，F，H，I，K，L，M，N，P，Q，R，S，T，V，W，或Y。
在SEQ ID NO：1的一些实施方式中，X2，X5，X6，X9，和X10是在任何DNA聚合酶中对应位点发现的任何氨基酸。示例性的DNA聚合酶包括来自下列的那些：嗜热栖热菌、Thermus caldophilus、栖热菌种Z05、水生栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种sps17、耐放射异常球菌、温泉家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、大肠杆菌、海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌、非洲栖热腔菌、温泉家族A和噬菌体T7。在一些优选实施方式中，X2选自Pro(P)，Ala(A)，Glu(E)，Thr(T)，和Val(V)。在一些优选实施方式中，X5选自Asn(N)，Arg(R)，Gly(G)，和Ser(S)。在一些优选实施方式中，X6选自Arg(R)，Pro(P)，Ser(S)，和Thr(T)。在一些优选的实施方式中，X9选自Glu(E)，Gly(G)，Gln(Q)，Ser(S)，和Ala(A)。在一些优选实施方式中，X10选自Arg(R)，Thr(T)，Ala(A)，Val(V)，Tyr(Y)，Ser(S)和Asn(N)。
在本发明的一些实施方式中，本发明DNA聚合酶包含下列氨基酸基序：
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa(在此也以单字母编码称为T1-T2-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-T3-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15(SEQID NO：2))；其中
T1是Ala(A)或Val(V)；
T2是Gly(G)或Val(V)；
T3是Gln(L)或His(H)；
X2，X5，X6，X9，和X10是任何氨基酸或不存在；
X1是His(H)，Glu(E)，Gln(Q)或不存在；
X3是Asn(N)或His(H)；
X4是Leu(L)，Ile(I)或Pro(P)；
X7是Asp(D)，Lys(K)或Thr(T)；
X8是Leu(L)，Val(V)或Ile(I)；
X11是Val(V)，Ile(I)，Leu(L)或Lys(K)；
X12是Phe(F)，Tyr(Y)或Gln(Q)；
X13是Asp(D)或Glu(E)之外的氨基酸；
X14是Lys(K)，Glu(E)或Ala(A)；和
X15是Leu(L)，Gln(Q)或Gly(G)。
其中该聚合酶相对于X13为D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率。在特别优选的实施方式中，X13是G。上通过图1中所示所有序列的比对产生述基序(SEQ ID NO：2)，然而SEQ IDNO：1中所示基序是通过除了T7 DNA聚合酶氨基酸残基之外的图1所示所有序列的比对而产生的。
在SEQ ID NO：2的一些实施方式中，X2，X5，X6，X9，和X10是在任何DNA聚合酶的相应位点发现的任何氨基酸，所述DNA聚合酶例如来自下列的DNA聚合酶：嗜热栖热菌、Thermus caldophilus、栖热菌种Z05、水生栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种sps 17、耐放射异常球菌、温泉家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、大肠杆菌、海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌、非洲栖热腔菌、温泉家族A和噬菌体T7。在优选的实施方式中，X2选自P，A，E，T，和V，或不存在；X5选自N，R，G，和S；X6选自R，P，S和T；X9选自E，G，Q，S和A；和X10选自R，T，A，V，Y，S，N和K。
如上所讨论，X2，X5，X6，X9，和X10可以是任何氨基酸。在优选的实施方式中，X2选自Pro(P)，Ala(A)，Glu(E)，Thr(T)，和Val(V)。在优选的实施方式中，X5选自Asn(N)，Arg(R)，Gly(G)，和Ser(S)。在优选的实施方式中，X6选自Arg(R)，Pro(P)，Ser(S)，和Thr(T)。在优选的实施方式中，X9选自Glu(E)，Gly(G)，Gln(Q)，Ser(S)，和Ala(A)。在优选的实施方式中，X10选自Arg(R)，Thr(T)，Ala(A)，Val(V)，Tyr(Y)，Ser(S)和Asn(N)。
适于根据本发明的突变的未经修饰的形式的DNA聚合酶是具有功能性聚合酶结构域的那些，所述功能性聚合酶结构域包含下列氨基酸基序：
Ala-Gly-Xaa-Xaa-Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Ser-Xaa-Xaa-Gln-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Leu-Xa a-Xaa-Xaa-Xaa(在此也以单字母编码称为A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15(SEQ IDNO：29))；其中
X2，X5，X6，X9和X10是任何氨基酸；
X1是His(H)，Glu(E)或Gln(Q)；
X3是Asn(N)或His(H)；
X4是Leu(L)或Ile(I)；
X7是Asp(D)，Lys(K)或Thr(T)；
X8是Leu(L)或Val(V)；
X11是Val(V)，Ile(I)或Leu(L)；
X12是Phe(F)或Tyr(Y)；
X13是Asp(D)或Glu(E)；
X14是Lys(K)或Glu(E)；和
X15是Leu(L)或Gln(Q)。
上示基序(SEQ ID NO：29)存在于许多家族A型DNA依赖的DNA聚合酶，尤其是来自嗜热菌和噬菌体T7的热稳定DNA聚合酶的活性位点的拇指亚结构域(thumb subdomain)。例如，图1显示来自若干种细菌的DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域的氨基酸序列比对：嗜热栖热菌、Thermus caldophilus、栖热菌种Z05、水生栖热菌、黄栖热菌、丝状栖热菌、栖热菌种sps17、耐放射异常球菌、温泉家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、大肠杆菌、海栖热袍菌、那不勒斯栖热袍菌、非洲栖热腔菌、温泉家族A和噬菌体T7。图1显示的氨基酸序列比对也包括来自代表性的嵌合热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域。如同所示，SEQ ID NO：29存在于这些聚合酶中间的每一个，表明该活性位点区域的保守功能。
相应地，在一些实施方式中，DNA聚合酶未经修饰的形式是野生型或天然存在的DNA聚合酶，例如，来自上列的任何种的细菌的聚合酶。在一个变型中，未经修饰的聚合酶来自于栖热菌属的种。在本发明的其它实施方式中，未经修饰的聚合酶来自于除了栖热菌属外的嗜热菌种。许多热稳定DNA聚合酶的核酸和氨基酸的完整序列是可获得的。水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)、栖热菌种Z05、栖热菌种sps17、海栖热袍菌(Tma)和非洲栖热腔菌(Taf)聚合酶的序列已经在PCT国际专利公开号WO 92/06200中公布。来自黄栖热菌的DNA聚合酶的序列已经被Akhmetzjanov和Vakhitov公布(Nucleic Acids Research 20：5839，1992)。来自Thermus caldophilus的热稳定DNA聚合酶的序列在EMBL/GenBank登录号U62584发现。来自丝状栖热菌的热稳定DNA聚合酶的序列可以使用例如美国专利号4,889,818提供的方法以及其中提供的序列信息从ATCC保藏号42380中重新获得。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列来自于GeneSeq专利数据库登录号R98144和WO97/09451。来自热坚芽孢杆菌的热稳定DNA聚合酶的序列由例如Uemori等描述(J BioChem(Tokyo)113(3)：401-410，1993；也参见Swiss-Prot数据库登录号Q04957以及GenBank登录号D12982和BAA02361)。来自嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的序列已经公开于美国专利号6066483。可以如此处描述修饰的DNA聚合酶未经修饰的形式的例子也描述于，例如，2001年5月8日授予Gelfand等的名为“Mutant chimericDNA polymerase”的美国专利号6,228,628；2002年2月12日授予Gelfand等的名为“Thermostable DNA polymerases incorporating nucleosidetriphosphates labeled with fluorescein family dyes”的6,346,379；2006年4月18日授予Ankenbauer等的名为“Thermostable enzyme promoting thefidelity of thermostable DNA polymerases-for improvement of nucleic acidsynthesis and amplification in vitro”的7,030,220；2005年4月19日授予Sobek等的名为“Mutant B-type DNA polymerases exhibiting improvedperformance in PCR”的6,881,559；2004年9月21日授予Markau等的名为“Modified DNA-polymerase from carboxydothermus hydrogenoformansand its use for coupled reverse transcription and polymerase chain reaction”的6,794,177；2002年10月22日授予Ankenbauer等的名为“ThermostableDNA polymerase from carboxydothermus hydrogenoformans”的6,468,775；以及2007年12月12日授予Schoenbrunner等的名为“Thermostableorthermoactive DNA polymerase molecules with attenuated 3′-5′exonucleaseactivity”的7,148,049；2008年5月27日授予Sobek等的名为“Reversiblymodified thermostable enzymes for DNA synthesis and amplification invitro”的7,378,262；Smith等于2001年3月30日提交的名为“Hightemperature reverse transcription using mutant DNA polymerases”的美国专利申请号2002/0012970；Ankenbauer等于2005年9月29日提交的名为“Thermostable enzyme promoting the fidelity of thermostable DNApolymerases-for improvement of nucleic acid synthesis and amplification invitro”的2006/0078928。
已经预先修饰过的功能性DNA聚合酶(例如通过氨基酸取代、插入或缺失)只要保留SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33的氨基酸基序，同样适于此处描述的突变。因此，合适的未经修饰的DNA聚合酶也包括野生型或天然存在的聚合酶的功能性变体。上述变体通常与野生型或天然存在的聚合酶具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80％的序列同一性，更典型地至少90％、95％、或98％的序列同一性。在特定的实施方式中，未经修饰的DNA聚合酶具有逆转录酶(RT)活性和/或掺入核糖核苷酸或其它2′-修饰的核苷酸的能力。
合适的聚合酶还包括，例如，包括来自两个或更多酶的多肽区域的特定的嵌合DNA聚合酶。上述嵌合DNA聚合酶的例子描述于例如美国专利号6,228,628。特别合适的是嵌合CS家族DNA聚合酶，其包括CS5(SEQ ID NO：20)和CS6(SEQ ID NO：21)聚合酶及与SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21具有基本上的序列同一性或相似性的变体(典型地至少80％序列同一性，更典型地至少90％的序列同一性)。CS5和CS6DNA聚合酶是来源于栖热菌种Z05和海栖热袍菌(((Tma)DNA聚合酶的嵌合酶。它们包括栖热菌酶N-末端的5′-核酸酶结构域和Tma酶的C-末端的3′-5′核酸外切酶以及聚合酶结构域。这些酶具有有效的逆转录酶活性，可以延伸包含核苷酸类似物的引物，并可以掺入α-硫代磷酸dNTPs、dUTP、dITP以及荧光素和花菁染料家族标记的dNTPs。CS5和CS6聚合酶还是有效的Mg2+活化的PCR酶。编码CS5和CS6聚合酶的核酸序列分别在图2B和3B中提供。CS5和CS6嵌合聚合酶进一步描述于，例如美国专利号7,148,049中。
在一些实施方式中，DNA聚合酶未经修饰的形式是已经预先修饰的聚合酶，典型经过重组，以给予一定的选择优势。上述修饰包括，例如，CS5 DNA聚合酶、CS6 DNA聚合酶中的氨基酸取代G46E、L329A和/或E678G，或其它聚合酶中的相应突变。据此，在特定的变型中，DNA聚合酶未经修饰的形式是下列的一种(除了指定的取代外各自都具有SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的氨基酸序列)：G46E；G46E L329A；G46E E678G；或G46E L329A E678G。E678G取代，例如，容许核糖核苷酸及其他2′修饰的核苷酸的掺入，但是该突变看来似乎还导致延伸已经引发的模板的能力的削弱。在特定的实施方式中，提高突变型聚合酶延伸速率的本发明突变改善了E678G突变的已损害的延伸已经引发的模板的能力。
相对于未经修饰的聚合酶，本发明的突变型DNA聚合酶包括一个或更多个氨基酸取代，即在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33的位点X13。在该位点的氨基酸取代，特别是在位点X13的G，赋予了改良的核苷酸掺入活性，产生了相对于包括位点X13的E或D而其它方面相同的相应的DNA聚合酶具有改良的(更快的)核酸延伸速率的DNA聚合酶。并不局限于任何特定的理论，本发明人相信本发明的突变型聚合酶的改良的核酸延伸速率是与模板更紧密结合的结果，即更少频繁地从模板解离，导致更高的“持续合成能力”的酶。这些性质容许在例如引物延伸反应中，相对于涉及未经修饰的DNA聚合酶的反应，使用更低浓度的突变型聚合酶。因此，可以想象地，在足够高的酶浓度下，未经修饰的聚合酶(即缺乏本发明主题的特定突变)的延伸速率可以接近突变型酶的延伸速率。在高离子强度下突变型聚合酶的表现预期也大大优于未经修饰的形式。尽管如此，在低离子强度下，足够高酶浓度的未经修饰的聚合酶的性能可能接近突变型聚合酶的性能。
由于DNA聚合酶未经修饰的形式是唯一的，对于每一突变型聚合酶，相应于X13的氨基酸位点一般是不同的。氨基酸和核酸序列比对程序可容易地获得(参见，例如上文提及的那些)，和在给出此处鉴定的特定基序的情况下，用来帮助用于依照本发明的修饰的确切氨基酸(和相应的密码子)的鉴定。代表性的嵌合热稳定DNA聚合酶和来自示例性的嗜热菌物种的热稳定DNA聚合酶的相应于X13的位点显示于表1。
表1.在示例性的热稳定聚合酶中相应于基序位点X13的氨基酸位点。
  生物体或嵌合序列   X13位点
  共有序列
  嗜热栖热菌   498
  T.caldophilus   498
  T.sp.Z05   498
  水生栖热菌   496
  黄栖热菌   495
  丝状栖热菌   494
  T.sp.sps17   494
  耐放射异常球菌   586
  温泉家族B/克隆7   546
  嗜热脂肪芽孢杆菌   540
  热坚芽孢杆菌   540
  大肠杆菌   592
  海栖热袍菌   558
  那不勒斯栖热袍菌   558
  非洲栖热腔菌   558
  温泉家族A   595
  CS5   558
  CS6   558
如同先前讨论的，在一些实施方式中，本发明的突变型DNA聚合酶源自于CS5 DNA聚合酶(SEQ ID NO：20)，CS6 DNA聚合酶(SEQ IDNO：21)，或那些聚合酶的变体(例如，G46E；G46E L329A；G46E E678G；G46E L329A E678G等)。如同上面所提及的，在CS5 DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶中，位点X13相应于在558位的谷氨酸(E)。因此在本发明的特定变型中，相对于其它方面相同的CS5 DNA聚合酶或CS6DNA聚合酶，突变型聚合酶在位点X13包括氨基酸取代。示例性的CS5DNA聚合酶和CS6 DNA聚合酶突变体包括含有氨基酸取代E558G的那些。其它示例性的CS5 DNA聚合酶和CS6 DNA聚合酶突变体包括下列(除指定的取代外各自具有SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的氨基酸序列)：
G46E E558G；
G46E L329A E558G；
G46E E558G E678G；
L329A E558G E678G；和
G46E L329A E558G E678G
                        。
在一些实施方式中，氨基酸取代是位点X13的单个氨基酸取代。或者，突变型聚合酶包含在位点X13的氨基酸取代以及在其它位点的氨基酸取代，特别是已知改良DNA聚合酶核酸延伸速率的那些氨基酸取代，例如，具有功能性聚合酶结构域的DNA聚合酶的位点Xa8的氨基酸取代(下面所示Xa8的那些残基之外)，所述功能性聚合酶结构域包含下列氨基酸基序：
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Xaa-Lys-Leu-Xaa-Xaa-Thr-Tyr-Xaa-Asp(此处也以单字母编码称为Xa1-Xa2-Xa3-Xa4-R-Xa6-Xa7-Xa8-K-L-Xa11-Xa12-T-Y-Xa15-Xa16(SEQ ID NO：25))；
其中
Xa1是Ile(I)或Leu(L)；
Xa2是Gln(Q)或Leu(L)；
Xa3是Gln(Q)，His(H)或Glu(E)；
Xa4是Tyr(Y)，His(H)，或Phe(F)；
Xa6是Glu(E)，Gln(Q)或Lys(K)；
Xa7是Ile(I)，Leu(L)或Tyr(Y)；
Xa8是Gln(Q)，Thr(T)，Met(M)，Gly(G)或Leu(L)；
Xa11是Lys(K)或Gln(Q)；
Xa12是Ser(S)或Asn(N)；
Xa15是Ile(I)或Val(V)；和
Xa16是Glu(E)或Asp(D)
在一些实施方式中，突变型聚合酶包含位点X13的氨基酸取代以及具有功能性聚合酶结构域的DNA聚合酶的位点Xb8的氨基酸取代(下面所示Xb8的那些残基之外)，所述功能性聚合酶结构域包含下列氨基酸基序：
Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-Xaa-Xaa-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn(此处也以单字母编码称为T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N(SEQID NO：26))；其中
Xb7是Ser(S)或Thr(T)；
Xb8是Asp(D)，Glu(E)或Asn(N)。
在一些实施方式中，突变型聚合酶包含位点X13的氨基酸取代以及具有功能性聚合酶结构域的DNA聚合酶的位点Xc4和/或Xc6的氨基酸取代(下面所示Xc4和/或Xc6的那些残基之外)，所述功能性聚合酶结构域包含下列氨基酸基序：
Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Asp-Tyr-Ser-Gln-Ile-Glu-Leu-Arg(此处也以单字母编码称为Xc1-Xc2-Xc3-Xc4-Xc5-Xc6-Xc7-D-Y-S-Q-I-E-L-R(SEQ IDNO：27)；其中
Xc1是Gly(G)，Asn(N)，或Asp(D)；
Xc2是Trp(W)或His(H)；
Xc3是Trp(W)，Ala(A)，Leu(L)或Val(V)；
Xc4是Ile(I)或Leu(L)；
Xc5是Val(V)，Phe(F)或Leu(L)；
Xc6是Ser(S)，Ala(A)，Val(V)或Gly(G)；和
Xc7是Ala(A)或Leu(L)。
在本发明的某些变型中，突变型聚合酶相对于其它方面相同的CS5DNA聚合酶或CS6 DNA聚合酶包含位点X13的氨基酸取代。示例性的CS5DNA聚合酶和CS6 DNA聚合酶突变体包括包含氨基酸取代E558G的那些。其它示例性的CS5 DNA聚合酶和CS6 DNA聚合酶突变体包括下列(每个具有除了指定取代之外的SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的氨基酸序列)：
E558G Q601R；
E558G D640G；
E558G I669F；
E558G S671F；
E558G D640G S671F；
E558G Q601R S671F；
E558G I669F S671F；
E558G Q601R D640G；
E558G D640G I669F；
E558G Q601R I669F；
E558G S671F D640G Q601R；
E558G S671F D640G I669F；
E558G S671F Q601R I669F；
E558G D640G Q601R I669F；和
E558G Q601R D640G I669F S671F；
其中Q601R氨基酸取代对应于位点Xa8的氨基酸取代；D640G氨基酸取代对应于位点Xb8的氨基酸取代；I669F氨基酸取代对应于位点Xc4的氨基酸取代；S671F氨基酸取代对应于位点Xc6的氨基酸取代。
在一些实施方式中，未经修饰的形式的嵌合聚合酶包括相对于SEQ IDNO：20或SEQ ID NO：21的一个或更多个选自G46E，L329A和E678G的氨基酸取代，并且进一步包括相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21的一个或更多个选自S671F，D640G，Q601R和I669F的氨基酸取代。例如，未经修饰的形式的突变型聚合酶可以是G46E L329A S671F E678G CS5；等等。在示例性的实施方式中，这些未经修饰的形式被取代以提供具有E558G取代的突变型聚合酶。例如，该突变型DNA聚合酶可以是E558GG46E L329A S671F E678G CS5等等。
相应地，SEQ ID NO：1的基序的突变，或更优选，SEQ ID NO：33单独或与其它位点的其它氨基酸取代组合，赋予了相对于其它方面相同的DNA聚合酶的改良的核酸延伸速率。多种本领域技术人员公知的测试可用于测量核酸延伸速率。在一些实施方式中，进行所述测试以比较包含SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：33的基序的DNA聚合酶与除了位点X13的单个取代之外在每个位点具有相同氨基酸序列的另一DNA聚合酶。在一些实施方式中，如本文所述，进行所述测试以比较包含SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：33的基序的DNA聚合酶与除了位点X13的取代以及其它位点的取代之外在每个位点具有相同氨基酸序列的另一DNA聚合酶。
除此处描述的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：33的基序的突变之外，本发明的突变型DNA聚合酶还可以包括其它非取代的修饰。上述修饰可以包括，例如，本领域已知的共价修饰以给予包括引物延伸的应用中的另外的优点。例如，在特定的实施方式中，突变型DNA聚合酶进一步包括热可逆的共价修饰。在这些实施方式中，将修饰物基团共价地附着到蛋白质，导致酶活性的全部或几乎全部损失。修饰物基团是经过选择的，以便经过高温孵育逆转该修饰。包括上述热可逆修饰的DNA聚合酶特别适合于热起动的应用，例如，各种热起动的PCR技术。适于依照本发明的突变型DNA聚合酶应用的热可逆修饰物试剂描述于，例如，Birch等的美国专利号5,773,258。示例性的修饰包括，例如，通过赖氨酸残基的ε-氨基的化学修饰的赖氨酸残基可逆封闭(参见上文的Birch等)。在特定的变型中，热可逆共价修饰包括如上文的Birch等描述的二羧酸酐共价附着到赖氨酸残基的ε-氨基。
例如，包含热可逆共价修饰的特别合适的突变型聚合酶由热稳定酶和二羧酸酐的混合物在碱性pH和低于约25℃的温度下进行的反应产生，所述二羧酸酐具有选自下列的通式：(a)式I：
Figure G2008800244615D00281
其中R1和R2是氢或有机基团，它们可以连在一起；和(b)式II：
其中R1和R2是有机基团，它们可以连在一起，并且氢是顺式的，基本上如Birch等所描述的。在包含热可逆共价修饰的特定的实施方式中，未经修饰的形式的聚合酶是G64E CS5 DNA聚合酶。
本发明的突变型DNA聚合酶可以通过突变编码相应的未经修饰的聚合酶(例如，野生型聚合酶或者本发明的突变型聚合酶来源自的相应变体)的DNA序列来构建，例如通过使用通常称为定点诱变的技术。编码未经修饰形式的聚合酶的核酸分子可以通过本领域普通技术人员熟知的各种聚合酶链式反应(PCR)技术来突变。(参见，例如，PCRStrategies(M.A.Innis，D.H.Gelfand，and J.J.Sninsky eds.，1995，Academic Press，San Diego，CA)第14章；PCR ProtoCols ：A Guide toMethods and Applications(M.A.Innis，D.H.Gelfand，J.J.Sninsky，and T.J.White eds.，Academic Press，NY，1990)。
作为非限制性实例，来自Clontech的转化位点定点诱变试剂盒使用的双引物系统可以用来将定点突变引入编码聚合酶未经修饰的形式的多核苷酸。系统中的靶质粒变性之后，两条引物同时退火到质粒；引物中的一条包含需要的定点突变，另一条包含在该质粒中引起限制性位点消除的另一个位点的突变。接着进行第二条链的合成，紧密连接这两个突变，然后将产生的质粒转化入大肠杆菌mutS菌株。质粒DNA从转化的细菌中分离，用相关的限制酶限制性酶切(从而线性化未突变的质粒)，然后重新转化入大肠杆菌。该系统容许直接在表达质粒上产生突变，而不必亚克隆或者产生单链的噬粒。两个突变的紧密连接和随后的未突变质粒的线性化导致高的突变效率并容许最少的筛选。在初始限制性位点引物的合成之后，对每一个突变位点该方法只需要使用一种新的引物类型。不是分别准备各位点的突变体，可以合成一组“设计的简并”寡核苷酸引物，用于同时在给定的位点引入所有需要的突变。转化体可以通过对诱变处理区域的质粒DNA测序来筛选以鉴定并分类突变体克隆。每条突变型DNA被限制性酶切并用电泳分析，例如，在突变检测增强凝胶(Mallinckrodt Baker，Inc.，Phillipsburg，NJ)上进行以证实在该序列上没有别的改变存在(通过与未诱变处理的对照进行带移比较)。或者可以对整个DNA区域测序以证实在靶区域之外没有另外的突变事件发生。
在pET(或者其它)过表达载体上验证的突变型双链体可以用于转化大肠杆菌，例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)pLysS，来达到突变型蛋白质的高水平生产，并用标准规程来纯化。FAB-MS作图的方法，例如，可用于快速检查突变体表达的保真度。该技术提供遍及整个蛋白质的片段的测序并提供测序任务中必要的置信度。在该类型的作图实验中，蛋白质用蛋白酶消化(选择将取决于要修饰的特定区域，因为该片段是主要关心的而剩余的图谱应该与未诱变处理蛋白质的图谱一致)。切割片断组通过，例如微内径HPLC(反相或离子交换，同样取决于要修饰的特定区域)分级分离以提供在各部分的若干肽，这些肽的分子量用标准方法诸如FAB-MS测定。然后将各片段测定的质量与预测序列消化得到的期望的肽的分子量比较，并快速确定测序的正确性。因为进行蛋白质修饰的诱变是定点的，如果MS数据与预测相符，改变的肽的测序不是必要的。如有必要验证变化的残基，CAD-串联MS/MS可以用于所讨论的混合物的肽的测序，或者靶肽可以根据修饰位置被纯化来消减Edman降解或羧肽酶Y消化。
具有一个以上氨基酸取代的本发明的DNA聚合酶可以用多种方式产生。在氨基酸密集地位于多肽链上情况下，它们可以使用编码所有需要的氨基酸取代的一条寡核苷酸来同时突变。然而如果氨基酸彼此定位隔开一定距离(例如被10个以上氨基酸分开)，则产生编码所有需要的变化的单一寡核苷酸更困难。作为替代，可以用两种可选方法中的一种。在第一种方法中，对每个要取代的氨基酸产生分离的寡核苷酸。然后将寡核苷酸同时退火到单链模板DNA上，而从模板合成的DNA第二条链将编码所有需要的氨基酸取代。一个可选方法涉及两个或更多循环的诱变以产生需要的突变体。第一个循环如同单突变体描述的那样：编码未经修饰的聚合酶的DNA用作为模板，将编码第一个需要的氨基酸取代的寡核苷酸退火到该模板上，然后产生异源双链DNA分子。第二个循环的诱变利用第一个循环的诱变产生的突变DNA作为模板。因此，该模板已经包含一个或更多个突变。然后将编码另外的需要的氨基酸取代的寡核苷酸退火到该模板，于是产生的DNA链现在编码来自第一个和第二个循环的诱变两者的突变。产生的DNA能够在第三个循环的诱变中用作为模板，等等。或者可以利用Seyfang和Jin的多位点诱变法(Anal.BioChem.324：285-291.2004)。
相应地，也提供编码本发明的任何DNA聚合酶的重组核酸。使用本发明的编码本发明的DNA聚合酶的核酸可以产生各种载体。包含来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体可被用于实施本发明。通常，表达载体包括与编码突变型DNA聚合酶的核酸可操纵连接的转录和翻译调控核酸区域。术语“控制序列”指的是在特定的宿主生物体中为可操纵连接的编码序列的表达所需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵基因序列，和核糖体结合位点。此外，载体可以包含正反向调控元件(PositiveRetroregulatory Element，PRE)以提高转录的mRNA的半衰期(参见Gelfand等的美国专利号4,666,848)。转录和翻译调控核酸区域通常适合于用来表达聚合酶的宿主细胞。本领域已知用于各种宿主细胞的许多合适的表达载体和合适的调节序列。大体上，转录和翻译调节序列可以包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活序列。在典型的实施方式中，调节序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体典型地也包括含有若干用于外源DNA插入的限制性位点的多接头区域。在特定的实施方式中，“融合标志”用于帮助纯化和随后标签/标志序列的去除(如果需要的话)，例如“组氨酸标签(His-Tag)”。然而，当从嗜温宿主(例如大肠杆菌)中纯化热激活和/或热稳定蛋白质时这些通常是不必要的，其可使用“热步骤(heat-step)”。包括编码复制序列，调节序列，表型选择基因，和所关心的突变型聚合酶的DNA的合适的载体的构建使用标准重组DNA程序制备。分离的质粒、病毒载体和DNA片段的以特定的次序切割、裁剪和连接到一起以产生需要的载体，其是本领域所熟知的(参见，例如，Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，NY，2nd ed.1989))。
在特定的实施方式中，表达载体包括选择性标记基因以容许转化的宿主细胞的选择。选择基因是本领域所熟知的，其随使用的宿主细胞而变。合适的选择基因可以包括，例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，其使以这些载体转化的细胞能够在这些抗生素存在的情况下生长。
在本发明的一方面，编码突变型DNA聚合酶的核酸以单独或与载体结合的形式被引入细胞。此处“引入”或语法上的等价物表示核酸以一种适于随后的核酸整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入的方法主要由靶细胞类型支配。示例性的方法包括CaPO4沉淀，脂质体融合，
Figure G2008800244615D00311
电穿孔，病毒感染等。
原核生物通常用作本发明最初的克隆步骤的宿主细胞。它们对于大量DNA的迅速生产，用作为定点诱变模板的单链DNA的生产，同时筛选许多突变体和产生的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCC No.31,446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC No.27,325)、大肠杆菌K12菌株DG116(ATCC No.53,606)、大肠杆菌X1776(ATCC No.31,537)和大肠杆菌B；然而大肠杆菌的诸如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539的许多其它菌株，以及许多其它种和属的原核生物包括诸如枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的杆菌、诸如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)的其它肠杆菌科和各种假单胞菌属(Pseudomonas species)的菌种全部都能用作为宿主。原核宿主细胞或其它具有刚性细胞壁的宿主细胞典型使用如上文的Sambrook等在1.82节描述的氯化钙方法转化。或者可采用电穿孔法转化这些细胞。原核生物转化技术阐述于，例如，Dower，in Genetic Engineering，Principles andMethods 12：275-296(Plenum Publishing Corp.，1990)；Hanahan等，Meth.Enzymol.，204：63，1991。典型用于大肠杆菌转化的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCI18、pUC119和Bluescript M13，它们所有都描述于上文的Sambrook等的1.12-1.20部分。然而，许多其它合适的载体也是可利用的。
本发明DNA聚合酶典型在适合诱导或引起突变型DNA聚合酶表达的条件下由培养用包含编码突变型DNA聚合酶的核酸的表达载体转化的宿主细胞产生。在适于蛋白质表达的条件下培养转化的宿主细胞的方法是本领域所熟知的(参见，例如，上文的Sambrook等)。用于从包含λpL启动子的质粒载体生产突变型聚合酶的合适的宿主细胞包括大肠杆菌菌株DG116(ATCC No.53606)(参见美国专利号5,079,352和Lawyer，F.C.等，PCR Methods and Applications 2：275-87，1993)。继表达之后，可以收获和分离突变型聚合酶。纯化热稳定DNA聚合酶的方法描述于，例如，上文的Lawyer等。
纯化后，突变型DNA聚合酶延伸已经引发的模板的能力可以在用于测量延伸的任何各种已知的试验中测试。例如，在有已经引发的模板分子(例如M13 DNA等)、合适的缓冲液、整套dNTPs(例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP)和金属离子的情况下，DNA聚合酶将延伸引物，把单链DNA(ssDNA)转变为双链DNA(dsDNA)。转变可以通过，例如添加诸如SYBR Green I的结合dsDNA的染料来检测和定量。使用动态热循环仪(参见，Watson，等Anal.BioChem.329：58-67，2004，也可以从例如Applied Biosystems、Stratagene和BioRad获得)，可以获得反应板的数字影像(例如，以10-30秒的间隔)，从而容许后续反应的改进。检测的荧光数值可以容易地转变为延伸速率。使用上述常规试验，可以测定突变体相对于聚合酶未经修饰的形式的延伸速率。
本发明的DNA聚合酶可以用于其中上述酶活性是必要或需要的任何目的。相应地，在本发明的另一个方面，提供了使用本发明的DNA聚合酶的引物延伸方法。适于引物延伸的条件是本领域已知的。(参见，例如，上文的Sambrook等。也参见Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology(4th ed.，John Wiley&Sons 1999))。通常，把引物退火，即杂交到靶核酸以形成引物-模板复合物。在合适的环境中将引物-模板复合物同突变型DNA聚合酶及游离核苷酸接触，容许一个或更多个核苷酸附加到引物的3′-末端，从而产生与靶核酸互补的延伸的引物。引物可以包括，例如，一个或更多个核苷酸类似物。此外，游离核苷酸可以是常规核苷酸、非常规核苷酸(例如核糖核苷酸或标记的核苷酸)或其混合物。在一些变型中，引物延伸反应包括靶核酸的扩增。适于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件也是本领域已知的(例如PCR扩增方法)。(参见，例如，上文的Sambrook等；上文的Ausubel等；PCR Applications：ProtoCols for Functional Genomics(Innis等eds.，Academic Press 1999))。在其它非互斥的实施方式中，引物延伸反应包括RNA模板的逆转录(例如RT-PCR)。提供改良的延伸速率的本突变型聚合酶的使用容许，例如，以相对短的孵育时间，降低的酶浓度和/或增加的成品收率实施上述引物延伸反应的能力。
在其它实施方式中，本发明的DNA聚合酶用于在DNA测序、DNA标记或引物延伸产物标记的背景下的引物延伸。例如，用Sanger双脱氧核苷酸法(Sanger等，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463，1977)的DNA测序被本发明改进，因为聚合酶能够掺入非常规的链终止核苷酸。基础的Sanger等的方法的发展提供了新的载体(Yanisch-Perron等，Gene33：103-119，1985)和碱基类似物(Mills等，ProC.Natl.Acad.Sci.USA76：2232-2235，1979；和Barr等，Biotechniques 4：428-432，1986)。一般来说，DNA测序需要在有链终止碱基类似物的情况下的模板依赖的引物延伸，产生随后按大小分离的部分片段的分布。基础的双脱氧测序程序包括(i)将任选地被标记的寡核苷酸引物退火到模板；(ii)在4个分离的反应中用DNA聚合酶延伸引物，各反应包含未标记的dNTPs和限制数量的诸如ddNTP的任选地被标记的链终止剂的混合物；和(iii)在高分辨率的变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶上分离4组反应产物。反应产物可以通过放射自显影法或通过荧光检测在凝胶上检测，取决于使用的标记，然后可以检查影像以推断核苷酸序列。这些方法利用诸如大肠杆菌Pol I的Klenow片段或修饰的T7 DNA聚合酶的DNA聚合酶。
热稳定聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的可用性，导致了改良的用热稳定DNA聚合酶的测序方法(参见Innis等，ProC.Natl.Acad.Sci.USA 85：9436，1988)及称为“循环测序”的其变型方法(Murray，Nuc AcidsRes.17：8889，1989)。相应地本发明的突变型热稳定聚合酶可被用于所述方法。作为基础的双脱氧法测序的替代，循环测序是在有链终止剂的情况下互补于模板序列的靶序列的线性的、不对称的扩增。单个循环产生所有可能长度的延伸产物的家族。继延伸反应产物从DNA模板变性之后，多循环的引物退火和引物延伸在诸如ddNTPs的终止剂的存在下发生。循环测序只需要比常规的链终止测序更少的模板DNA。热稳定DNA聚合酶在循环测序中具有若干优势；它们耐受引物与核酸靶的特定杂交需要的严酷的退火温度以及耐受多循环的发生在每个循环的高温变性，例如90-95℃。为此，DNA聚合酶及其衍生物和后裔，例如AmpliTaq CS DNA聚合酶和AmpliTaq FS DNA聚合酶已经包含在诸如Perkin-Elmer(Norwalk，CT)和Applied Biosystems(FosterCity，CA)的公司商业化的Taq循环测序试剂盒中。
链终止测序法的变型包括染料-引物测序和染料-终止剂测序。在染料-引物测序中，ddNTP终止剂是未标记的，而标记的引物用来检测延伸产物(Smith等，Nature 32：674-679，1986)。在染料-终止剂DNA测序中，DNA聚合酶用于在引物DNA的末尾上掺入dNTPs和荧光标记的ddNTPs(Lee等，Nuc.Acids.Res.20：2471，1992)。该过程提供了不必合成染料标记的引物的优势。此外，染料-终止剂反应在全部4个反应可以在相同管中进行这一点上是更方便的。
染料-引物和染料-终止剂法两者都可以用Applied Biosystems(FosterCity，CA)生产的自动测序仪(美国专利号5,171,534)自动操作。当使用该仪器时，完成的测序反应混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶或装在该仪器上的毛细管上分级分离。荧光产物用仪器底部的激光检测，因为它们根据大小电泳穿越凝胶。
两种荧光染料通常用来标记用于染料-终止剂测序的终止剂--带负电荷的和两性离子的荧光染料。带负电荷的荧光染料包括荧光素和BODIPY家族的荧光染料。氟硼荧染料(BODIPY dyes，4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-indacene)描述于国际专利公布WO 97/00967。两性离子荧光染料的包括罗丹明家族的那些。市场上可买到的循环测序试剂盒使用罗丹明衍生物标记的终止剂。然而，罗丹明标记的终止剂是相当昂贵的并且产物在上样到凝胶上之前必须从未掺入的染料-ddNTPs中分离，因为它们与测序产物共同迁移。罗丹明染料家族终止剂似乎使富含GC的区域的发夹结构稳定，导致产物反常迁移。这需要使用dITP，其使二级结构松散并且还影响终止剂掺入的效率。
相反，荧光素标记的终止剂在凝胶上样前除去了分离步骤，因为它们具有更大的净负电荷并比测序产物迁移得更快。此外，荧光素标记的测序产物比罗丹明标记的测序产物具有更好的电泳迁移。尽管野生型Taq DNA聚合酶不能有效地掺入荧光素家族染料标记的终止剂，现在可以通过利用如美国专利申请公开号2002/0142333描述的修饰的酶有效地完成。相应地，如US2002/0142333描述的修饰可被用于本发明的背景以产生具有改良的引物延伸速率的荧光素家族染料掺入的热稳定聚合酶。例如，在特定的实施方式中，按照本发明的未经修饰的DNA聚合酶是如US2002/0142333描述的修饰的热稳定聚合酶并分别具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：33规定的基序。
在其中能使用本发明的DNA聚合酶的其它示例性的核酸测序方式包括涉及包括核糖核苷酸的2′-PO4类似物的终止剂化合物的那些(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398，以及Bodepudi等于2006年10月19日提交的名为″SYNTHESIS AND COMPOSITIONS OFNUCLEIC ACIDS COMPRISING 2′-TERMINATOR NUCLEOSIDES″的美国专利申请号11/583,605，和Gelfand等于2006年10月19日提交的名为″2′-TERMINATOR RELATED PYROPHOSPHOROLYSIS ACTIVATEDPOLYMERIZATION″的美国专利申请号11/583,606)。此处描述的DNA聚合酶通常，例如，通过降低循环的延伸反应需要的时间和/或通过降低用于达到满意的性能的酶的数量或浓度来改善这些测序法。
在本发明的另一个方面，提供用于此处描述的引物延伸方法的试剂盒。典型地，试剂盒被划区以便于使用并包含至少一个提供根据本发明的突变型DNA聚合酶的容器。还可以包括一个或更多个提供另外的试剂的另外的容器。上述另外的容器可以包括用于根据上面描述的方法的引物延伸程序的为熟练技术人员所知的任何试剂或其它元件，包括用于，例如，核酸扩增程序(例如PCR、RT-PCR)，DNA测序程序或DNA标记程序的试剂。例如，在特定的实施方式中，试剂盒进一步包括提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5′有义引物，或包括5′有义引物和相应的3′反义引物的引物对。在其它非互斥的变型中，试剂盒包括一个或更多个提供游离核苷酸(常规的和/或非常规的)的容器。在特定的实施方式中，试剂盒包括α-硫代磷酸(α-phophorothioate)dNTPs、dUTP、dITP，和/或标记的dNTPs，例如荧光素或花菁染料家族dNTPs。在其它非互斥的实施方式中，试剂盒包括一个或更多个提供适于引物延伸反应的缓冲剂的容器。
实施例
应当了解，此处描述的实施例和实施方式只是用于说明性目的并且不意味着限制请求保护的发明的范围。同样应当理解的是，基于此处描述的实施例和实施方式的各种修饰或变化将被启发给本领域技术人员，并包括在本申请的精神和范围以及附加的权利要求的范围内。
实施例I：具有改良的延伸活性的突变型DNA聚合酶的鉴定和特征鉴定
鉴定了提供如改良的在有游离核苷酸的情况下延伸已引发的DNA模板的能力的CS家族聚合酶中的突变。简单地说，该筛选程序中的步骤包括文库生成，突变型酶的表达和部分纯化，需要的性质的酶的筛选，DNA测序，克隆纯化，和进一步的选择的突变体的特性鉴定。这些步骤中的每一个都进一步描述于下文。
通过该方法鉴定的突变是E558G。该突变导致如改良的延伸已经引发的模板的能力。在E678G突变的特定背景中，其容许核糖核苷酸及其他2′-修饰的核苷酸的掺入，但是其也导致延伸已经引发的模板的能力的削弱，E558G突变改善该削弱的引物延伸能力的性质。
克隆文库生成：使编码CS5 E678G DNA聚合酶的聚合酶结构域的核酸经受易错诱变PCR。
使用从1.8-3.5mM的范围的Mg+2浓度进行PCR，以便产生具有相应范围突变率的文库。缓冲液条件是：50mM N-二[羟乙基]甘氨酸pH8.2，115mM KOAc，8％w/v甘油，0.2mM每种dNTPs和0.2X SYBRGreen I。以0.15U/μl使用GeneAmp AccuRT热启动PCR酶。以每50μl反应体积5×105拷贝的线性化CS5 E678G质粒DNA起始，进行30循环的扩增，使用60℃的退火温度15秒，72℃的延伸温度45秒，以及95℃的变性温度15秒。
产生的扩增子经过Qiaquick旋转柱(Qiagen，Inc.Valencia，CA，USA)纯化，用Bgl II和Hind III切割，然后重新纯化。载体质粒，在BglII和HindIII位点之间的聚合酶结构域携带大段缺失的G46E L329ACS5修饰，通过用相同的两种限制酶切割并用小牛肠磷酸酶(CIP)处理来制备。切开的载体和突变的插入片段以不同的比率混合并用T4连接酶在15℃处理整夜。纯化连接产物并用电穿孔法将其转化入大肠杆菌菌株LK3。
将等分样品覆盖在氨苄青霉素选择培养基上以便测定在各转化中单个转化体的数目。在有甘油作为冷冻保护剂的情况下，将各诱变率下具有最多单个转化体的转化存储于-70到-80℃。
然后把各文库涂布在大号氨苄青霉素选择性琼脂平板上。用自动菌落挑选机(QPix2，Genetix Ltd)把单菌落转入包括含氨苄青霉素和10％w/v甘油的2X Luria肉汤的384孔板中。这些平板于30℃孵育整夜，让培养物生长，然后存储于-70到-80℃。加到2X Luria肉汤中的甘油量足够低以容许培养物生长，然而足够高以提供冷冻保护。用这种方法制备了用于随后使用的若干诱变(Mg+2)水平下的数千个菌落。
提取物文库制备部分1——发酵：从上述克隆文库制备适于筛选目的的部分纯化提取物的相应文库。该程序的第一步是制备各克隆的小规模表达培养物。这些培养物以96孔形式生长；因此每块384孔文库平板有4块表达培养平板。从克隆文库平板的每个孔转移1μl到包含150μl培养基A(参见下面的表3)的96孔种子平板的一个孔。种子平板在iEMS平板孵育器/振荡器(ThermoElectron)中于30℃下在1150rpm振荡整夜。然后这些种子培养物被用于接种相同的培养基，这次在大号96孔板(Nunc#267334)上接种10μl入300μl培养基A中。这些平板于37℃孵育整夜。表达质粒包含转录调控元件，其容许在37℃表达而不能在30℃表达。整夜孵育后，培养物典型地以总细胞蛋白质的1-10％表达克隆蛋白质。通过离心从这些培养物中收获细胞。这些细胞被冻存(-20℃)或如下所述立即处理。
表3.培养基A(使用前过滤灭菌)
  成分   浓度
  MgSO4.7H2O   0.2g/L
  柠檬酸.H2O   2g/L
  K2HPO4   10g/L
  NaNH4PO4.4H2O   3.5g/L
  MgSO4   2mM
  酪蛋白氨基酸   2.5g/L
  葡萄糖   2g/L
  硫胺素.HCl   10mg/L
  氨苄青霉素   100mg/L
提取物文库制备部分2——提取：来自发酵步骤的细胞团在30μl裂解缓冲液(下表4)中重悬浮并转入384孔热循环仪平板。注意本缓冲液包含溶菌酶以帮助细胞裂解，和两种核酸酶以从提取物中除去RNA和DNA。使平板经受3个循环的冷冻-解冻(-70℃冷冻，37℃解冻，每一步骤不少于15分钟)以裂解细胞。添加硫酸铵(5μl的0.75M溶液)并在75℃孵育平板15分钟以便沉淀和失活污染蛋白质，包括外源添加的核酸酶。平板于3000×g离心15分钟然后把上清液转入新的384孔热循环仪平板。这些提取物平板于-20℃冻存以用于随后的筛选。每孔包含大约0.5-3μM的突变型聚合酶。
表4.裂解缓冲液
  成分   浓度或百分比
  Tris pH 8.0   20mM
  EDTA   1mM
  MgCl2   5mM
  TLCK   1mM
  亮抑酶肽   1μg/ml
  PefabloC   0.5mg/ml
  Tween 20   0.5％v/v
  溶菌酶(粉末)   2mg/ml
  Rnase   0.025mg/ml
  Dnase I   0.075单位/μl
为改良的延伸速率筛选提取物文库：M13mp18单链DNA(M13DNA)，用具有如下序列的寡核苷酸引发：5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC-3’(SEQ ID NO：28)作为延伸试验筛选的模板分子。在这种筛选中，上述提取物平板在10mM Tris pH 8.0/1mM EDTA/100mM KCl/0.2％Tween 20中稀释10倍，在90℃热处理10分钟，以提高他们的纯度。把1.0μl提取物添加到384孔PCR平板上的13μl包含1nM已经引发的M13模板的反应母液中。已经引发的模板在64℃的延伸用CCD照相机在改进的动态热循环仪中每20秒检测。典型的反应母液列于如下。反应混合物还包含100mM两性离子缓冲剂(Tricine)pH 8.0，20mM KOAc，3mM MgCl2，包含0.5％Tween 20，dATP，dCTP，dGTP，和dTTP各0.1mM的2.5％v/v的酶储存缓冲液，以及0.6×的SYBR Green I(Molecular Probes)，其容许引物链延伸的荧光检测。为了从本底荧光中辨别延伸来源的荧光，实验中包括引物链延伸被阻止的平行孔，例如，通过添加诸如EDTA的金属螯合剂或从反应母液中除去核苷酸。
在该筛选中鉴定出展现提高的延伸速率的突变体提取物。在数千提取物的规模上进行初步的筛选。相应于最高的提取物的培养孔被选择用于进一步的测试。首先把它们在选择性琼脂平板上划线以确保克隆的纯净。突变酶从100ml摇瓶培养物中纯化，并且通过基于凝胶的光密度测定法测定浓度。这些定量的酶制备物在用于筛选的条件下与相等蛋白质浓度的亲本酶相比较。该最终筛选保证观察到的差异不是简单的蛋白质浓度效应。
在最后一轮筛选之后，5个克隆看起来仍然具有改良的延伸速率。确定编码相对于亲本菌株的下列氨基酸变化的这5个克隆的序列：
克隆1：S671F
克隆2：S671F
克隆3：Q610R E779K I812L M844I
克隆4：E558G I829V
克隆5：E558G K861M
对于克隆1和2，很明显S671F突变必然决定着观察到的表型，因为它是该克隆中的唯一氨基酸突变。对于克隆3，基于其它结果，表型最可能是Q601R突变的结果。由于克隆4和5携带相同的E558G突变，看上去这种突变最有可能决定产生观察到的表型。为确认这一点，利用公知的体外诱变技术通过重叠PCR将亲本克隆(G46E L329A E678G CS5DNA聚合酶；″GLE″)突变以携带另外的E558G突变(G46E L329A E558GE678G CS5 DNA聚合酶；″GLEE″)。测序产生的质粒以确认它携带了期望的突变并且没有任何其它在该过程的PCR步骤中偶尔会产生的不希望的突变。
把该新的质粒转化入大肠杆菌菌株LK3宿主，并表达、纯化到同质，并定量聚合酶蛋白质。把这些产生的新的突变型酶在类似于原始筛选条件下与亲本型和其它突变体相比。结果示于图4。携带E558G突变的菌株，“GLEE”在该测试的条件下在延伸已经引发的M13方面的速度是亲本克隆“GLF”的超过12倍。从该数据很清楚地看出突变E558G单独地决定突变体克隆4和5改良的表型。图还显示了在GLE主链中的某些其它突变的相对速率，所述其它突变例如D640G(“GLDE”)，D573G(“997-O1”)，Q601R(“GLQE”)，S671F(“GLSE”)，以及携带多种突变的克隆，例如Q601R，S671F和D640G的组合(“GLQDSE”)，和最后E558G与Q601R，S671F和D640G的组合(“GLEQDSE”)。
应当理解，此处描述的实施例和实施方式只是用于说明性目的，而且根据其的各种修饰或变化将被暗示给本领域技术人员，并包括在本申请的精神和范围以及所附的权利要求的范围内。
序列表
<110>F.Hoffmann-La Roche AG and
Roche Diagnostics GmbH
 
<120>突变型DNA聚合酶及相关方法
 
<130>24304WO
 
<140>Not yet assigned
<141>Not yet assigned
 
<150>US 60/949,732
<151>2007-07-13
 
<160>33
 
<170>FastSEQ for Windows Version 40
 
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自修饰的改良的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(3)...(3)
<223>Xaa＝His，Glu或Gln
 
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝Asn或His
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Leu或Ile
 
<221>MOD_RES
<222>(8)...(8)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝Asp，Lys或Thr
 
<221>MOD_RES
<222>(13)...(13)
<223>Xaa＝Leu或Val
 
<221>MOD_RES
<222>(14)...(15)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(16).(16)
<223>Xaa＝Val，Ile或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(18)...(18)
<223>Xaa＝Phe或Tyr
 
<221>MOD_RES
<222>(19).(19)
<223>Xaa＝Ala，Cys，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Met，Asn，
Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp或Tyr，
不是Asp或Glu的氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(20)...(20)
<223>Xaa＝Lys或Glu
 
<221>MOD_RES
<222>(21)...(21)
<223>Xaa＝Leu或Gln
 
<400>1
Ala Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa
1         5          10           15
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
      20
 
<210>2
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自修饰的改良的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(1)..(1)
<223>Xaa＝Ala或Val
 
<221>MOD_RES
<222>(2)...(2)
<223>Xaa＝Gly或Val
 
<221>MOD_RES
<222>(3)...(3)
<223>Xaa＝His，Glu或Gln
 
<221>MOD_RES
<222>(4)...(4)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>MOD_RES
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝Asn或His
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Leu，Ile或Pro
 
<221>MOD_RES
<222>(8).(8)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝Asp，Lys或Thr
 
<221>MOD_RES
<222>(12)...(12)
<223>Xaa＝Gln或His
 
<221>MOD_RES
<222>(13)...(13)
<223>Xaa＝Leu，Val或Ile
 
<221>MOD_RES
<222>(14)...(15)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(16)...(16)
<223>Xaa＝Val，Ile，Leu或Lys
 
<221>MOD_RES
<222>(18)...(18)
<223>Xaa＝Phe，Tyr或Gln
 
<221>MOD_RES
<222>(19)...(19)
<223>Xaa＝Ala，Cys，Phe，Gly，His，Ile，Lys，Met，Asn，
Pro，Gln，Arg，Ser，Thr，Val，Trp or Tyr，
不是Asp或Glu的氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(20)...(20)
<223>Xaa＝Lys，Glu或Ala
 
<221>MOD_RES
<222>(21).(21)
<223>Leu，Gln或Gly
 
<400>2
Xaa Xaa Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1         5        10         15
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
      20
 
<210>3
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌嗜热栖热菌(Tth)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>3
Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu
      20            25
 
<210>4
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌Thermus caldophilus(Tca)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>4
Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu
      20            25
 
<210>5
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
 
<223>来自嗜热菌栖热菌种Z05(Z05)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>5
Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Arg Leu
      20            25
 
<210>6
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌水生栖热菌(Taq)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
<400>6
Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu
      20            25
 
<210>7
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌黄栖热菌(Tfl)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>7
Phe Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu
      20            25
 
<210>8
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌丝状栖热菌(Tfi)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>8
His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu
      20            25
 
<210>9
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌栖热菌种sps17(Sps17)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>9
His Arg Leu Ala Gly His Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu
1         5           10            15
Glu Arg Val Leu Phe Asp Glu Leu Gly Leu
      20            25
 
<210>10
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>来自嗜热菌耐放射异常球菌(Dra)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>10
His Glu Tyr Ala Gly Glu Glu Phe His Ile Arg Ser Pro Lys Gln Leu
1         5           10            15
Glu Thr Val Leu Tyr Asp Lys Leu Glu Leu
      20            25
 
<210>11
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌温泉家族B/克隆7(HspB)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>11
Tyr Thr Leu Ala Gly Glu Ala Phe Asn Ile Gly Ser Pro Lys Gln Leu
1         5           10            15
Gly Ala Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Leu
        20           25
 
<210>12
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>12
Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu
1         5           10            15
Gly Thr Val Leu Phe Asp Lys Leu Gln Leu
      20            25
 
<210>13
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌热坚芽孢杆菌(Bca)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>13
Tyr Glu Leu Ala Gly Gln Glu Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Leu
1         5           10            15
Gly Val Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gln Leu
      20             25
 
<210>14
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌大肠杆菌(Eco)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>14
His Glu Ile Ala Gly Glu Glu Phe Asn Leu Ser Ser Thr Lys Gln Leu
1           5           10          15
Gln Thr Ile Leu Phe Glu Lys Gln Gly Ile
       20            25
 
<210>15
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌海栖热袍菌(Tma)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>15
Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val
1           5           10           15
Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile
       20            25
 
<210>16
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌那不勒斯栖热袍菌(Tne)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>16
Tyr Gln Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val
1           5           10           15
Ser Asn Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile
       20            25
 
<210>17
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌非洲栖热腔菌(Taf)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>17
Phe Glu Ile Ala Gly Glu Thr Phe Asn Leu Asn Ser Ser Thr Gln Val
1           5           10          15
Ala Tyr Ile Leu Phe Glu Lys Leu Asn Ile
        20           25
 
<210>18
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌温泉家族A(HspA)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>18
Tyr Ala Gln Ala Gly Glu Val Phe Asn Leu Asn Ser Pro Lys Gln Leu
1           5          10           15
Gly Ser Leu Leu Phe Glu Lys Leu Lys Leu
        20          25
 
<210>19
<211>24
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嗜热菌噬菌体T7(T7)的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域
 
<400>19
Val Glu His Val Val Phe Asn pro Ser Ser Arg Asp His Ile Gln Lys
1         5           10            15
Lys Leu Gln Glu Ala Gly Trp Val
       20
 
<210>20
<211>893
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>嵌合热稳定DNA聚合酶CS5
 
<400>20
Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1         5           10           15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr phe Phe Ala Leu Lys Gly
      20            25           30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
    35           40             45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
 50              55          60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65           70          75             80
Ala Tyr Lys Ala Gly Alg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
         85             90          95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
        100          105           110
Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
    115           120           125
Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
  130           135           140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145          150           155          160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys
          165           170           175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
       180           185          190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
    195           200            205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg
  210           215           220
Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225           230           235           240
Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu
         245           250           255
Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
      260           265           270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
    275           280           285
Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu
  290           295           300
Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe
305          310            315          320
Ala Ile Asp Leu Glu Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile
          325           330           335
Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro
        340           345           350
Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys
    355           360           365
Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln
  370           375           380
Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro
385          390          395           400
Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu Pro
          405           410           415
Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly
      420           425           430
Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu
     435           440           445
Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr
  450           455           460
Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser
465           470           475           480
Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu
         485           490          495
Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr
      500           505           510
Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys
    515           520           525
Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe
  530           535           540
Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu
545           550           555             560
Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr
          565           570           575
Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro
        580          585           590
Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile
     595            600           605
Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala
  610           615          620
Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp
625          630             635         640
Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile
         645          650            655
Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala
      660             665           670
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp
    675             680           685
Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu
  690           695          700
Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu
705           710           715           720
Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val
         725          730           735
Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala
        740          745          750
Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp
    755            760          765
Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg
  770            775           780
Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp
785          790           795           800
Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile
         805          810            815
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp
      820            825            830
Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val
    835           840           845
His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu
  850           855          860
Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val
865          870          875           880
Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser
         885          890
 
<210>21
<211>893
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>嵌合热稳定DNA聚合酶CS6
 
<400>21
Met Lys Ala Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu
1         5           10           15
Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe Phe Ala Leu Lys Gly
       20           25           30
Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala
    35            40           45
Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Lys Ala Val Phe
  50            55           60
Val Val Phe Asp Ala Lys Ala pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Glu
65           70           75            80
Ala Tyr Lys Ala Gly Arg Pra Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln
         85           90            95
Leu Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Phe Thr Arg Leu
      100            105          110
Glu Val Pro Gly Phe Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Thr Leu Ala Lys
    115           120           125
Lys Ala Glu Arg Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Arg
  130           135           140
Asp Leu Tyr Gln Leu Val Ser Asp Arg Val Ala Val Leu His Pro Glu
145          150           155           160
Gly His Leu Ile Thr Pro Glu Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Lys
         165            170           175
Pro Glu Gln Trp Val Asp Phe Arg Ala Leu Val Gly Asp Pro Ser Asp
       180           185          190
Asn Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Leu Lys Leu
    195           200            205
Leu Lys Glu Trp Gly Ser Leu Glu Asn Ile Leu Lys Asn Leu Asp Arg
  210           215           220
Val Lys Pro Glu Ser Val Arg Glu Arg Ile Lys Ala His Leu Glu Asp
225           230           235           240
Leu Lys Leu Ser Leu Glu Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Leu Pro Leu
         245           250           255
Glu Val Asp Phe Ala Arg Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Gly Leu Arg
      260          265            270
Ala Phe Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly
     275          280           285
Leu Leu Glu Glu Ser Glu Pro Val Gly Tyr Arg Ile Val Lys Asp Leu
  290           295          300
Val Glu Phe Glu Lys Leu Ile Glu Lys Leu Arg Glu Ser Pro Ser Phe
305          310            315          320
Ala Ile Ala Leu Ala Thr Ser Ser Leu Asp Pro Phe Asp Cys Asp Ile
          325           330           335
Val Gly Ile Ser Val Ser Phe Lys Pro Lys Glu Ala Tyr Tyr Ile Pro
      340             345           350
Leu His His Arg Asn Ala Gln Asn Leu Asp Glu Lys Glu Val Leu Lys
    355           360           365
Lys Leu Lys Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gly Ala Lys Ile Val Gly Gln
  370           375           380
Asn Leu Lys Phe Asp Tyr Lys Val Leu Met Val Lys Gly Val Glu Pro
385          390          395           400
Val Pro Pro Tyr Phe Asp Thr Met Ile Ala Ala Tyr Leu Leu Glu pro
          405           410           415
Asn Glu Lys Lys Phe Asn Leu Asp Asp Leu Ala Leu Lys Phe Leu Gly
      420           425          430
Tyr Lys Met Thr Ser Tyr Gln Glu Leu Met Ser Phe Ser Phe Pro Leu
     435          440           445
Phe Gly Phe Ser Phe Ala Asp Val Pro Val Glu Lys Ala Ala Asn Tyr
  450           455          460
Ser Cys Glu Asp Ala Asp Ile Thr Tyr Arg Leu Tyr Lys Thr Leu Ser
465           470           475          480
Leu Lys Leu His Glu Ala Asp Leu Glu Asn Val Phe Tyr Lys Ile Glu
         485           490          495
Met Pro Leu Val Asn Val Leu Ala Arg Met Glu Leu Asn Gly Val Tyr
       500          505           510
Val Asp Thr Glu Phe Leu Lys Lys Leu Ser Glu Glu Tyr Gly Lys Lys
    515           520           525
Leu Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Tyr Arg IIe Ala Gly Glu Pro Phe
  530           535           540
Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu
545           550           555            560
Gly Ile Lys Pro Arg Gly Lys Thr Thr Lys Thr Gly Asp Tyr Ser Thr
          565           570           575
Arg Ile Glu Val Leu Glu Glu Leu Ala Gly Glu His Glu Ile Ile Pro
        580          585          590
Leu Ile Leu Glu Tyr Arg Lys Ile Gln Lys Leu Lys Ser Thr Tyr Ile
     595            600           605
Asp Ala Leu Pro Lys Met Val Asn Pro Lys Thr Gly Arg Ile His Ala
  610           615          620
Ser Phe Asn Gln Thr Gly Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser Ser Asp
625           630           635          640
Pro Asn Leu Gln Asn Leu Pro Thr Lys Ser Glu Glu Gly Lys Glu Ile
         645          650            655
Arg Lys Ala Ile Val Pro Gln Asp Pro Asn Trp Trp Ile Val Ser Ala
       660            665           670
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Ile Leu Ala His Leu Ser Gly Asp
    675             680          685
Glu Asn Leu Leu Arg Ala Phe Glu Glu Gly Ile Asp Val His Thr Leu
  690           695          700
Thr Ala Ser Arg Ile Phe Asn Val Lys Pro Glu Glu Val Thr Glu Glu
705           710           715           720
Met Arg Arg Ala Gly Lys Met Val Asn Phe Ser Ile Ile Tyr Gly Val
         725          730           735
Thr Pro Tyr Gly Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu Ala
        740          745           750
Glu Lys Met Ile Val Asn Tyr Phe Val Leu Tyr Pro Lys Val Arg Asp
     755          760           765
Tyr Ile Gln Arg Val Val Ser Glu Ala Lys Glu Lys Gly Tyr Val Arg
  770            775           780
Thr Leu Phe Gly Arg Lys Arg Asp Ile Pro Gln Leu Met Ala Arg Asp
785          790            795          800
Arg Asn Thr Gln Ala Glu Gly Glu Arg Ile Ala Ile Asn Thr Pro Ile
         805          810            815
Gln Gly Thr Ala Ala Asp Ile Ile Lys Leu Ala Met Ile Glu Ile Asp
       820           825            830
Arg Glu Leu Lys Glu Arg Lys Met Arg Ser Lys Met Ile Ile Gln Val
    835          840            845
His Asp Glu Leu Val Phe Glu Val Pro Asn Glu Glu Lys Asp Ala Leu
  850           855          860
Val Glu Leu Val Lys Asp Arg Met Thr Asn Val Val Lys Leu Ser Val
865          870          875           880
Pro Leu Glu Val Asp Val Thr Ile Gly Lys Thr Trp Ser
         885          890
 
<210>22
<211>2682
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>嵌合热稳定DNA聚合酶CS5
<400>22
atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120
gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180
aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240
gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300
aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360
gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420
accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480
ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540
gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600
ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660
aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720
cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780
gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840
ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900
gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960
gctatcgatt tggaaactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020
gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 0080
ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140
atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200
gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260
ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320
ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380
gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440
ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500
aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560
ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620
ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680
ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740
ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800
cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860
aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920
cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980
gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040
atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100
gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160
atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220
ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280
gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340
ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400
aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460
gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520
agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580
aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640
ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga                    2682
 
<210>23
<211>2682
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>嵌合热稳定DNA聚合酶CS6
 
<400>23
atgaaagcta tgttaccatt attcgaaccc aaaggccggg tcctcctggt ggacggccac 60
cacctggcct accgcacctt cttcgccctg aagggcctca ccacgagccg gggcgaaccg 120
gtgcaggcgg tttacggctt cgccaagagc ctcctcaagg ccctgaagga ggacgggtac 180
aaggccgtct tcgtggtctt tgacgccaag gccccttcct tccgccacga ggcctacgag 240
gcctacaagg caggccgcgc cccgaccccc gaggacttcc cccggcagct cgccctcatc 300
aaggagctgg tggacctcct ggggtttact cgcctcgagg ttccgggctt tgaggcggac 360
gacgtcctcg ccaccctggc caagaaggcg gaaagggagg ggtacgaggt gcgcatcctc 420
accgccgacc gggaccttta ccagctcgtc tccgaccgcg tcgccgtcct ccaccccgag 480
ggccacctca tcaccccgga gtggctttgg gagaagtacg gccttaagcc ggagcagtgg 540
gtggacttcc gcgccctcgt gggggacccc tccgacaacc tccccggggt caagggcatc 600
ggggagaaga ccgccctcaa gctcctcaag gagtggggaa gcctggaaaa tatcctcaag 660
aacctggacc gggtgaagcc ggaaagcgtc cgggaaagga tcaaggccca cctggaagac 720
cttaagctct ccttggagct ttcccgggtg cgctcggacc tccccctgga ggtggacttc 780
gcccggaggc gggagcctga ccgggaaggg cttcgggcct ttttggagcg cttggagttc 840
ggcagcctcc tccacgagtt cggccttcta gaggagtccg aacccgttgg gtaccgtata 900
gttaaagacc tggttgaatt tgaaaaactc atagagaaac tgagagaatc tccttcgttc 960
gcgatcgctc ttgcgactag ttccctcgat cctttcgact gcgacattgt cggtatctct 1020
gtgtctttca aaccaaagga agcgtactac ataccactcc atcatagaaa cgcccagaac 1080
ctggacgaaa aagaggttct gaaaaagctc aaagaaattc tggaggaccc cggagcaaag 1140
atcgttggtc agaatttgaa attcgattac aaggtgttga tggtgaaggg tgttgaacct 1200
gttcctcctt acttcgacac gatgatagcg gcttaccttc ttgagccgaa cgaaaagaag 1260
ttcaatctgg acgatctcgc attgaaattt cttggataca aaatgacatc ttaccaagag 1320
ctcatgtcct tctcttttcc gctgtttggt ttcagttttg ccgatgttcc tgtagaaaaa 1380
gcagcgaact actcctgtga agatgcagac atcacctaca gactttacaa gaccctgagc 1440
ttaaaactcc acgaggcaga tctggaaaac gtgttctaca agatagaaat gccccttgtg 1500
aacgtgcttg cacggatgga actgaacggt gtgtatgtgg acacagagtt cctgaagaaa 1560
ctctcagaag agtacggaaa aaaactcgaa gaactggcag aggaaatata caggatagct 1620
ggagagccgt tcaacataaa ctcaccgaag caggtttcaa ggatcctttt tgaaaaactc 1680
ggcataaaac cacgtggtaa aacgacgaaa acgggagact attcaacacg catagaagtc 1740
ctcgaggaac ttgccggtga acacgaaatc attcctctga ttcttgaata cagaaagata 1800
cagaaattga aatcaaccta catagacgct cttcccaaga tggtcaaccc aaagaccgga 1860
aggattcatg cttctttcaa tcaaacgggg actgccactg gaagacttag cagcagcgat 1920
cccaatcttc agaacctccc gacgaaaagt gaagagggaa aagaaatcag gaaagcgata 1980
gttcctcagg atccaaactg gtggatcgtc agtgccgact actcccaaat agaactgagg 2040
atcctcgccc atctcagtgg tgatgagaat cttttgaggg cattcgaaga gggcatcgac 2100
gtccacactc taacagcttc cagaatattc aacgtgaaac ccgaagaagt aaccgaagaa 2160
atgcgccgcg ctggtaaaat ggttaatttt tccatcatat acggtgtaac accttacggt 2220
ctgtctgtga ggcttggagt acctgtgaaa gaagcagaaa agatgatcgt caactacttc 2280
gtcctctacc caaaggtgcg cgattacatt cagagggtcg tatcggaagc gaaagaaaaa 2340
ggctatgtta gaacgctgtt tggaagaaaa agagacatac cacagctcat ggcccgggac 2400
aggaacacac aggctgaagg agaacgaatt gccataaaca ctcccataca gggtacagca 2460
gcggatataa taaagctggc tatgatagaa atagacaggg aactgaaaga aagaaaaatg 2520
agatcgaaga tgatcataca ggtccacgac gaactggttt ttgaagtgcc caatgaggaa 2580
aaggacgcgc tcgtcgagct ggtgaaagac agaatgacga atgtggtaaa gctttcagtg 2640
ccgctcgaag tggatgtaac catcggcaaa acatggtcgt ga                    2682
 
<210>24
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域的一致序列，聚合酶结构域基序一致序列
 
<221>MOD_RES
<222>(1)...(26)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<400>24
Xaa Xaa Xaa Ala Gly Xaa Xaa Phe Asn Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gln Xaa
1         5          10           15
Xaa Xaa Xaa Leu Phe Xaa Xaa Leu Xaa Xaa
      20          25
 
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自突变型热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>Xaa＝Ile或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(2)...(2)
<223>Xaa＝Gln或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(3)(3)
<223>Xaa＝Gln，His或Glu
 
<221>MOD_RES
<222>(4)..(4)
<223>Xaa＝Tyr，His或Phe
 
<221>MOD_RES
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝Glu，Gln或Lys
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Ile，Leu或Tyr
 
<221>MOD_RES
<222>(8)...(8)
<223>Xaa＝Gln，Thr，Met，Gly或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(11)..(11)
<223>Xaa＝Lys或Gln
 
<221>MOD_RES
<222>(12)...(12)
<223>Xaa＝Ser或Asn
 
<221>MOD_RES
<222>(15)...(15)
<223>Xaa＝Ile或Val
 
<221>MOD_RES
<222>(16)...(16)
<223>Xaa＝Glu或Asp
 
<400>25
Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Lys Leu Xaa Xaa Thr Tyr Xaa Xaa
1        5           10          15
<210>26
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自突变型热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Ser或Thr
 
<221>MOD_RES
<222>(8)(8)
<223>Xaa＝Asp，Glu或Asn
 
<400>26
Thr Gly Arg Leu Ser Ser Xaa Xaa Pro Asn Leu Gln Asn
1         5            10
 
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自突变型热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(1)...(1)
<223>Xaa＝Gly，Asn或Asp
 
<221>MOD_RES
<222>(2)...(2)
<223>Xaa＝Trp或His
 
<221>MOD_RES
<222>(3)...(3)
<223>Xaa＝Trp，Ala，Leu或Val
 
<221>MOD_RES
<222>(4)...(4)
<223>Xaa＝Ile或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(5)...(5)
<223>Xaa＝Val，Phe或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝Ser，Ala，Val或Gly
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Ala或Leu
 
<400>27
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg
1         5          10          15
 
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>用于M13mp18(M13DNA)延伸测定筛选的寡核苷酸模板引物
 
<400>28
gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc    30
 
<210>29
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自未修饰的形式的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(3)..(3)
<223>Xaa＝His，Glu或Gln
 
<221>MOD_RES
<222>(4)...(4)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(6)...(6)
<223>Xaa＝Asn或His
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Leu或Ile
 
<221>MOD_RES
<222>(8)...(8)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝Asp，Lys或Thr
 
<221>MOD_RES
<222>(13)...(13)
<223>Xaa＝Leu或Val
<221>MOD_RES
<222>(14)...(15)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(16)...(16)
<223>Xaa＝Val，Ile或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(18)..(18)
<223>Xaa＝Phe或Tyr
 
<221>MOD_RES
<222>(19)...(19)
<223>Xaa＝Asp或Glu
 
<221>MOD_RES
<222>(20)...(20)
<223>Xaa＝Lys或Glu
 
<221>MOD_RES
<222>(21)...(21)
<223>Xaa＝Leu或Gln
 
<400>29
Ala Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa
1         5          10           15
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa
      20
 
<210>30
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>保守的DNA聚合酶活性位点基序A
 
<400>30
Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg
1         5
 
<210>31
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嵌合热稳定DNA聚合酶CS5的聚合酶结构域的区域
 
<400>31
Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val
1           5           10           15
Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile
        20           25
<210>32
<211>26
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自嵌合热稳定DNA聚合酶CS6的聚合酶结构域的区域
 
<400>32
Tyr Arg Ile Ala Gly Glu Pro Phe Asn Ile Asn Ser Pro Lys Gln Val
1           5           10           15
Ser Arg Ile Leu Phe Glu Lys Leu Gly Ile
        20           25
 
<210>33
<211>21
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>来自修饰的改良的热稳定DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域，聚合酶结构域基序
 
<221>MOD_RES
<222>(3)(3)
<223>Xaa＝His，Glu或Gln
 
<221>MOD_RES
<222>(4)...(4)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(6)..(6)
<223>Xaa＝Asn或His
 
<221>MOD_RES
<222>(7)...(7)
<223>Xaa＝Leu或Ile
 
<221>MOD_RES
<222>(8)...(8)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(10)...(10)
<223>Xaa＝任何氨基酸
 
<221>MOD_RES
<222>(11)...(11)
<223>Xaa＝Asp，Lys或Thr
 
<221>MOD_RES
<222>(13)...(13)
<223>Xaa＝Leu或Val
<221>MOD_RES
<222>(14)...(15)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<221>MOD_RES
<222>(16)...(16)
<223>Xaa＝Val，Ile或Leu
 
<221>MOD_RES
<222>(18)...(18)
<223>Xaa＝Phe或Tyr
 
<221>MOD_RES
<222>(20)...(20)
<223>Xaa＝Lys或Glu
 
<221>MOD_RES
<222>(21)...(21)
<223>Xaa＝Leu或Gln
 
<400>33
Ala Gly Xaa Xaa Phe Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa
1         5          10           15
Leu Xaa Gly Xaa Xaa
      20
20
1

Claims (15)

1.DNA聚合酶，其包括A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15(SEQ ID NO：33)，其中
X2，X5，X6，X9，和X10是任何氨基酸，
X1是H，E或Q，
X3是N或H，
X4是L或I，
X7是D，K或T，
X8是L或V，
X11是V，I或L，
X12是F或Y，
X13是G，
X14是K或E，和
X15是L或Q；
其中所述聚合酶相对于X13为D或E而其它方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速率。
2.权利要求1的DNA聚合酶，其中
X2选自P，A，E，T，和V；
X5选自N，R，G，和S；
X6选自R，P，S，和T；
X9选自E，G，Q，S，和A；和
X10选自R，T，A，V，Y，S，和N。
3.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包括嵌合聚合酶。
4.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述嵌合聚合酶与CS5 DNA聚合酶(SEQ ID NO：20)或CS6DNA聚合酶(SEQ ID NO：21)具有至少90％的序列同一性。
5.权利要求3的DNA聚合酶，其中所述嵌合聚合酶
包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21，或相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21包含一个或更多个选自G46E、L329A、和E678G的氨基酸取代；并且
相对于SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21包括E558G改变。
6.权利要求1的DNA聚合酶，其进一步包含热可逆共价修饰。
7.重组核酸，其编码根据权利要求1的DNA聚合酶。
8.表达载体，其包含权利要求7的重组核酸。
9.宿主细胞，其包含权利要求8的表达载体。
10.生产DNA聚合酶的方法，所述方法包括：
在适合编码突变型DNA聚合酶的核酸表达的条件下，培养权利要求9的宿主细胞。
11.实施引物延伸的方法，其包括：
在适合引物延伸的条件下，使权利要求1的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触，从而产生延伸的引物。
12.权利要求11的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA或DNA。
13.根据权利要求11的方法，其中所述游离核苷酸包括非常规核苷酸，所述非常规核苷酸包括核糖核苷酸或标记的核苷酸。
14.权利要求11的方法，其包括在适合多核苷酸扩增的条件下，使DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触。
15.生产延伸的引物的试剂盒，包括：
至少一个提供根据权利要求1的DNA聚合酶的容器，
选自下列的一个或更多个另外的容器：
(a)提供在引物延伸条件下能够与预定的多核苷酸模板杂交的引物的容器；
(b)提供游离核苷酸的容器；和
(c)提供适合引物延伸的缓冲剂的容器。
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