CN104987433A - 一种具有抗衰老活性的rg-i型枸杞果胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将枸杞加水经微波-超声波协同提取、过滤、浓缩，得到浓缩液；⑵浓缩液中加入无水乙醇，混匀后经静置、离心得到沉淀产物；⑶沉淀产物复溶后经离心、干燥即得枸杞多糖；⑷枸杞多糖上样进行DEAE-纤维素柱层析分离后洗脱，并经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞中性多糖LBP-N和枸杞酸性多糖LBP-A；⑸枸杞酸性多糖LBP-A经Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离后洗脱，并经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞酸性多糖LBP-A-1和LBP-A-2；⑹枸杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化后，用0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，并经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品。本发明操作简单、提取率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法。
背景技术
枸杞子为枸杞的干燥成熟果实，系茄科（Solanaceae）、茄族（Solanceae Reihb）、枸杞亚族（Lyciinae Wettst）、枸杞属（Lycium L.），最负盛名的是宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）。枸杞子是我国的传统名贵中药材，它在我国传统医学中具有重要的地位，其药用价值备受历代医家的推崇。
现代药理学研究表明，枸杞子的药理和保健作用与其中含有的生物活性物质枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide，LBP）有很大关系，是枸杞调节免疫、延缓衰老的主要活性成分，可改善老年人易疲劳、食欲不振和视力模糊等症状，并具有降血脂、抗脂肪肝、抗衰老等功效（殷玥琪等，2012）。鉴于枸杞的诸多功效与抗氧化有关，枸杞多糖抗氧化作用研究已成为国内外天然产物领域研究的热点。
在心血管疾病产生方面，氧化与抗氧化的失衡会引起心血管系统的病变，如动脉粥样硬化、高血压、心脏病、心肌缺血等，而这些病变也会加剧机体以及组织的氧化应激水平。实验证明，枸杞多糖具有抗氧化应激的功效，可以防止高血脂引发的动脉粥样硬化（李煜淇等，2010；刘新岩等，2011；姜清茹等，2011；周国亮等，2011）。在肝脏氧化损伤防护方面，枸杞多糖不仅可以显著抑制高脂饲料造成的氧化性肝损伤，还可以通过清除体内氧自由基、提高内源性抗氧化酶活力、抑制脂质过氧化等途径，减低小鼠血液和肝脏中铅的含量（Wu HT et al., 2010）。在神经系统损伤保护方面，枸杞多糖能够对氧化应激诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠周围神经细胞凋亡具有保护作用（吴庆秋，2010）。在内分泌系统氧化损伤保护方面，枸杞多糖可以通过抑制自由基产生、清除已产生的自由基、提高抗氧化酶活力等途径显著改善高血糖状况下因多元醇代谢的亢进、葡萄糖的自身氧化而造成的血管内皮细胞结构和功能损伤（余小平等，2011）。在抗衰老方面，根据自由基伤害理论，自由基过量产生是导致皮肤自然衰老和光老化的主要原因。枸杞多糖能够通过抑制自由基产生、清除已产生的自由基、提高抗氧化酶活力等途径，减轻皮肤组织氧化损伤，降低皮肤癌的发病几率，有效延缓皮肤衰老，并与维生素E有良好的协同作用（李响等，2009；王发选等，2011）。
目前研究人员已经从枸杞子中提取、分离纯化得到多种结构类型的多糖成分，包括糖蛋白LbGP（分子量88kDa，糖含量70%，单糖为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖，其摩尔比为2.5:1.0:1.0）、LBPNP（单糖组成为木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、赤藓糖及少量岩藻糖和山梨糖，前5种糖基摩尔比为10:l:1:6.7:4）、Lbp3（分子量92.5 kDa，单糖组成为阿拉伯糖和葡萄糖，其摩尔比为1:1）、Lbp4（分子量214.8 kDa，单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖，其摩尔比为1.5:2.50.43:0.23）、Lbp5（分子量23.7 kDa，单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖，其摩尔比为0.33:0.52:0.42:0.94:0.85:1）、LBPC4（分子量10kDa，α-1,4-1,6 连接的葡聚糖肽）、杂多糖肽（LBPA3、LBPBI、LBPC2，分子量分别为66kDa, 18kDa, 12kDa，均为β-1,4-1,6连接）和阿拉伯半乳聚糖（AGP）。
为了得到高抗氧化活性的枸杞多糖，研究人员对枸杞多糖的提取工艺进行了优化研究。刘凌等（2009）对提取纯化工艺对枸杞多糖抗氧化功能的影响进行了研究。结果表明，样品体外抗氧化能力强弱关系为枸杞多糖Ⅱ（脱蛋白、脱寡糖、脱脂）>枸杞多糖Ⅰ（脱寡糖、脱脂）>枸杞粗多糖。枸杞多糖Ⅱ在0.2~1mg /mL时,其DPPH自由基清除能力达到85%，相比枸杞粗多糖提高1~8倍。张民等（2012）研究建立了超细粉碎辅助提取枸杞多糖的工艺技术，并初步探讨了超细粉碎对枸杞多糖结构及抗氧化活性的影响。结果表明，采用超细粉碎技术，枸杞多糖的提取率可以达到4.0±0.13%，比常规粉碎法提高了15.6%。超细粉碎后枸杞多糖在2~10mg/mL范围内，DPPH自由基清除率为20.65%~76.07%，比常规粉碎法得到的枸杞多糖提高了48.45%~55.21%。中国发明专利“一种高抗氧化活性枸杞多糖的制备方法”（CN 102936292 A），在制备过程中枸杞子经超细粉碎前处理、乙醇前处理、水提取、真空浓缩、乙醇沉淀、蛋白质脱除、乙醇分级沉淀处理制备得到高抗氧化活性枸杞多糖。与未经超细粉碎前处理的枸杞多糖比较，该方法所获得的枸杞多糖对DPPH 自由基的半数抑制浓度（IC50）降低60% 以上，对ABTS 自由基的IC50 值降低70% 以上。
目前，提高枸杞多糖抗氧化活性的制备方法还只是针对多糖提取和除杂过程，并未涉及活性多糖组分的进一步分离纯化，因此不找到抗氧化活性中心，很难从根本上提高枸杞多糖的抗氧化能力。但是，到现在为止，还没有关于枸杞多糖抗氧化活性中心及其分离纯化方法的专利和报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、提取率高的具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，包括以下步骤：
⑴将枸杞加水经微波-超声波协同提取，得到提取液，该提取液经过滤去除沉淀，收集滤液；所述滤液在温度为60~80℃的条件下浓缩至所述滤液体积的1/6~1/8后，得到浓缩液；
⑵所述浓缩液中加入其体积3~4倍的无水乙醇，混匀后4℃~10℃静置12~24h，经离心得到沉淀产物；
⑶所述沉淀产物按1：6~10的质量体积比加水复溶后，经离心除杂，得到上清液，该上清液于-70℃~ -85℃预冻4~6h后经冷冻干燥，即得枸杞多糖；
⑷将DEAE-纤维素按常规方法依次用0.5~1 mol/L HCl和0.5~1 mol/L NaOH水溶液处理为OH-型后装入阴离子交换柱，所述枸杞多糖上样进行柱层析分离后，依次用2~3倍柱体积的蒸馏水和0.5 mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液A；所述洗脱液A依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞中性多糖LBP-N和枸杞酸性多糖LBP-A；
⑸所述枸杞酸性多糖LBP-A经Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离后，依次用1~1.5倍柱体积的0.05~0.5mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液B；所述洗脱液B依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞酸性多糖LBP-A-1和枸杞酸性多糖LBP-A-2；
⑹所述枸杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化后，依次用3~5倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液C；所述洗脱液C依次经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品。
所述步骤⑴中的枸杞为宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果实。
所述步骤⑴中的微波-超声波协同提取条件是指料液质量体积比为1：10~20，提取温度为60~100℃，超声波功率600~800W，微波功率340~380W，提取总时间为20~30min。
所述步骤⑵和所述步骤⑶中的离心条件均是指转速为4000rpm~5000rpm，时间为15min~20min。
所述步骤⑶、所述步骤⑷、所述步骤⑸、所述步骤⑹中冷冻干燥的条件均是指真空度为10~100 Pa、温度为-55℃~ -70℃、干燥时间为24~72 h。
所述步骤⑷中DEAE-纤维素柱层析分离的条件是指色谱柱直径10~30cm、长度50~100cm，流动相依次为蒸馏水和0.5 mol/L NaCl，流速为20~40cm/h。
所述步骤⑷、所述步骤⑸、所述步骤⑹中透析除盐的条件均是指透析袋截留分子量500~3500Da，蒸馏水中透析24~48h。
所述步骤⑸中Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离的条件是指色谱柱直径1~5cm、长度80~120cm，流动相为0.05~0.5mol/L NaCl水溶液，流速为10~20cm/h。
所述步骤⑹中DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化的条件是指色谱柱直径5~10cm、长度40~70cm，用3~5倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，流速为15~30cm/h。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明以高原珍稀药用植物枸杞果实为原料，利用低功率微波穿透式内外加热，在降低活性多糖结构破坏风险的同时促进多糖溶出、节省提取时间，而且利用超声波的空化效应，进一步提高活性多糖的微波提取效率，同时降低了能耗和污染物排放，具有工业化生产的实际意义。
2、本发明应用DEAE-纤维素阴离子交换柱层析（参见图1），在脱除提取物中蛋白质、色素等强吸附杂质，提高枸杞多糖纯度的同时，将枸杞多糖中性组分和酸性组分分离（参见图4、图6），为枸杞多糖的按组成特点精确区分利用奠定基础。
多糖理化性质测定：按照文献（Weihua Ni, Tingting Gao et al. Journal of Ethnopharmacology, 2013, 150: 529-535）方法，多糖纯度及分子量测定采用HPGPC法，糖含量测定采用苯酚-硫酸法，糖醛酸含量测定采用间羟基联苯法，蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法（参见表1）。
表1 枸杞多糖各级分的理化性质
3、本发明应用Sepharose CL-6B和DEAE-Sepharose Fast Flow 柱层析联用技术（参见图2、图3），首次制备得到RG-I型枸杞果胶纯品。
4、按照文献（Hongtao Bi, Tingting Gao et al. Food Chemistry, 2013, 138: 1470-1475）方法，多糖的单糖基组成测定采用PMP-柱前衍生化法，多糖的单糖基连接键型采用13C-NMR法测定（参见图5、图7、图8），结果表明，本发明所制备得到的抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品的糖含量97.4%，糖醛酸含量10.7%，不含蛋白质，分子量62.3kDa，主要由鼠李糖（4.77%）、半乳糖醛酸（9.30%）、半乳糖（42.66%）和阿拉伯糖（38.63%）组成，其中α-L-Araf以1→5 连接为主，β-D-Galp 以1→3、1→6 和1→3,6 连接为主，α-D-GalpA 以1→4 连接为主，α-L-Rhap 以1→2 和1→3 连接为主。
5、采用本发明分离纯化得到的RG-I型枸杞果胶纯品，总抗氧化能力886.89mg Trolox/100g，超氧负离子（O2 -·）清除效果的IC50值为0.63 mg/mL，过氧化氢（H2O2）清除效果的IC50值为2.11 mg/mL，DPPH自由基清除效果的IC50值，0.05 mg/mL，羟基自由基（·OH）清除效果的IC50值为0.09 mg/mL。结果表明，RG-I型枸杞果胶纯品，不仅能够有效阻止自由基的产生，而且能够显著清除已产生的自由基，具有良好的抗衰老活性。
抗氧化能力测定：总抗氧化能力测定采用ABTS快速法，阻止自由基产生活性分析采用自由基产生必需中间体超氧负离子（O2 -·）清除实验和H2O2清除实验，自由基清除活性分析采用DPPH自由基清除实验和羟基自由基（·OH）清除实验。
⑴总抗氧化能力评价：
ABTS法测定总抗氧化能力的原理是，ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制，在414nm或734nm测定ABTS+的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力。Trolox是一种维生素E的类似物，具有和维生素E相近的抗氧化能力，用作其它抗氧化物总抗氧化能力的参考。例如，Trolox的总抗氧化能力为1，相同浓度情况下，其它物质的抗氧化能力用其抗氧化能力和Trolox相比的倍数来表示。
机体中存在多种抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除体内产生的各种活性氧，以阻止活性氧诱导的氧化应激（oxidative stress）的产生。一个体系内的各种抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的总的水平即体现了该体系内的总抗氧化能力。因此 植物或中草药抽提液、或各种抗氧化物溶液的总抗氧化能力的检测可以用于检测各种溶液的抗氧化能力的强弱，可以用于筛选强抗氧化能力的药物。
具体操作：分别于比色皿中加入400 μL 5 mM ABTS 溶液、250 μL 1.0 μM HRP 溶液、10 μL 1.5 mM H2O2 溶液，340 μL 50 mM pH 7.5 磷酸缓冲液，混合溶液总体积1mL，其中包含2 mM ABTS，15 μM H2O2，0.25 μM HRP；测试温度为25℃；730nm光吸收值稳定后，加入10 μL待测样品溶液，5min后测定光吸收值A730nm。以Trolox ng/10μL（X）和光吸收值A730nm （Y）为横、纵坐标，做线性回归分析，得到标准曲线。按照标准曲线计算待测物质总抗氧化能力。
⑵超氧负离子（O2-·）清除实验：
活性氧指的是一系列由氧产生的化学活性分子，大量研究表明其与人体的衰老以及多种疾病（肿瘤、心脑血管等）密切相关。O2-·作为活性氧的一种，由氧分子在自然条件下得到一个电子而产生，其活性并不很强。但是，它能够在自然条件或过氧化物歧化酶的作用下得到一个电子成为H2O2，继而产生活性极强的·OH。本实验采用PMS-NADH-NBT体系测定多糖的O2 -·清除能力。
具体操作：取1 mL不同浓度样品溶液（0.25-4 mg/mL），加入1 mL氯化硝基四氮唑NBT（300 μM），1 mL还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH（936 μM），加入1 mL吩嗪硫酸二甲酯PMS（120 μM）启动反应，25℃水浴反应5 min后，测定其560 nm处的吸光值（A560 nm）。0.1 M pH 7.4的磷酸盐缓冲液作为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。按下面公式计算超氧负离子（O2 -·）清除率：
超氧负离子（O2 -·）清除率=(1–Asample/Acontrol)×100%，其中Asample为测试样品的A560 nm，Acontrol为空白对照的A560 nm。
⑶H2O2清除实验：
H2O2也是活性氧的一种，虽属中等活性，但却是许多活性较强的自由基产生过程的中间体，如H2O2在髓过氧化物酶的作用下，参与产生次氯酸（HClO），在金属离子存在下，参与产生羟自由基。因此，清除H2O2就阻止了自由基产生的链式反应。本实验采用辣根过氧化物酶法测定多糖对H2O2的清除作用。
具体操作：取1 mL不同浓度样品溶液（0.25-4 mg/mL），加入0.4 mL H2O2（5 mM），在室温下放置20 min，再加入0.6 mL辣根过氧化物酶（HRpase 300 μg/mL，苯酚红4.5 mM在100 mM pH7.4磷酸缓冲液中），静置10 min后，测定其610 nm处的吸光值A610 nm。按下面公式计算多糖的H2O2清除率：
H2O2清除率=(1–Asample/Acontrol)×100%，其中Asample为测试样品的A610 nm，Acontrol为空白对照的A610 nm。
⑷DPPH自由基清除实验：
DPPH是一种稳定的有机自由基，其乙醇溶液呈紫红色，在可见光区最大吸收峰为517 nm。当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其逐渐消失，其褪色程度与所接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。利用DPPH的以上特性，用分光光度法测定加入胶陀螺多糖后混合溶液517 nm波长处的吸光值（A517 nm）的变化程度可以反映其对有机自由基的消除能力。
具体操作：取4 mL不同浓度的多糖溶液（0.5-4 mg/mL），与0.1 M DPPH甲醇溶液1 mL混合，剧烈振荡，于暗处静置15 min，再于室温下静置20 min。蒸馏水作为空白对照，抗坏血酸为阳性对照。用分光光度计测定反应溶液的A517 nm。按照下面的公式计算多糖的DPPH清除率：
DPPH清除率=(1–Asample/Acontrol)×100%，其中Asample为测试样品的A517 nm，Acontrol为空白对照的A517 nm。
⑸羟基自由基（·OH）清除实验：
羟基自由基（·OH）是代谢过程中产生的非常活泼的自由基，毒性很大，能够造成蛋白质、核酸、脂类等生物大分子的损伤，从而导致体内代谢紊乱，引起许多病理变化。本研究采用脱氧核糖-铁体系法对多糖的羟基自由基（·OH）清除能力进行测定。
具体操作：依次向试管中加入50 mM pH 7.5的磷酸盐缓冲液0.4 mL，0.5-10 mg/mL的样品溶液0.1 mL（对照用蒸馏水），1 mM的EDTA溶液0.1 mL，10 mmol/L的H2O2 0.1 mL，2 mM的抗坏血酸溶液0.1 mL，60 mM的脱氧核糖溶液0.1 mL（样品空白不加），1 mM的FeCl3溶液0.1 mL，各管最终体积为1.0 mL，37 °C水浴1 h，取出后迅速加入10%的三氯乙酸1.0 mL终止反应，再加入1%硫代巴比妥酸1.0 mL，沸水浴反应15 min后立即冷却，于532 nm波长处测定吸光值（A532 nm），按下式计算清除率：
羟基自由基（·OH）清除率=(1–Asample/Acontrol)×100%，其中Asample为测试样品的A532 nm，Acontrol为空白对照的A532 nm。
⑹统计方法：
所获得数值型实验数据以SPSS13.0软件进行统计分析，半数抑制浓度（IC50，mg/mL）采用概率单位回归计算得出，多组样本之间的两两比较采用方差分析q检验。检验水准α=0.01。
所得枸杞多糖各级分的抗氧化能力如表2所示。IC50值可以体现天然产物的抗氧化能力，是抗氧化功能评价的一个常用指标，该值没有一个界限值，通常数值越小表明抗氧化能力越强。从上述结果可以看出，枸杞多糖LBP和RG-I型枸杞果胶的抗氧化能力显著优于阳性对照物香菇多糖的抗氧化能力，特别是RG-I型枸杞果胶的抗氧化能力更为显著。与枸杞多糖LBP相比，RG-I型枸杞果胶的总抗氧化能力提高76.05%，超氧负离子（O2 -·）清除能力提高4.52倍，H2O2清除能力提高19.91%，DPPH自由基清除能力提高30.2倍，羟基自由基（·OH）清除能力提高5倍。
因此，本发明可以极大程度的提高枸杞多糖的抗氧化能力，所获得的RG-I型枸杞果胶，不仅能够有效阻止自由基的产生，而且能够显著清除已产生的自由基，表现出良好的抗衰老能力。
表2 枸杞多糖抗氧化能力评价结果
注：与阳性对照组市售香菇多糖相比，a P < 0.01；与枸杞多糖LBP相比，b P < 0.01。
6、本发明在不涉及有害有机溶剂的温和条件下，显著提高了枸杞多糖的抗氧化能力，分离得到的枸杞多糖抗氧化活性中心——RG-I型枸杞果胶，结构明确，质量可控，具有显著的抗衰老活性，在保健食品、化妆品、医药等健康领域有着重要意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1为本发明枸杞多糖LBP的DEAE-纤维素柱层析洗脱图。
图2为本发明枸杞酸性糖LBP-A的Sepharose CL-6B柱层析洗脱图。
图3为本发明枸杞酸性糖LBP-A-1的DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析洗脱图。
图4为本发明枸杞中性糖LBP-N的HPGPC洗脱图。
图5为本发明RG-I型枸杞果胶的HPGPC洗脱图。
图6为本发明枸杞酸性糖LBP-A-2的HPGPC洗脱图。
图7为本发明RG-I型枸杞果胶的单糖组成分析HPLC洗脱图。
图8为本发明RG-I型枸杞果胶的13C-NMR波谱图。
具体实施方式
实施例1 一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，包括以下步骤：
⑴将枸杞加水经微波-超声波协同提取，得到提取液，该提取液经过滤去除沉淀，收集滤液；滤液在温度为60℃的条件下浓缩至所述滤液体积的1/6后，得到浓缩液。
其中：枸杞为宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果实。
微波-超声波协同提取条件是指料液质量体积比（g/mL）为1：10，提取温度为60℃，超声波功率600W，微波功率340W，提取总时间为20min。
⑵浓缩液中加入其体积3倍的无水乙醇，混匀后4℃℃静置12h，经离心得到沉淀产物。
其中：离心条件是指转速为4000rpm，时间为15min。
⑶沉淀产物按1：6的质量体积比（g/mL）加水复溶后，经离心除杂，得到上清液，该上清液于-70℃预冻4h后经冷冻干燥，即得枸杞多糖。
其中：离心条件是指转速为4000rpm，时间为15min。
冷冻干燥的条件是指真空度为10Pa、温度为-55℃、干燥时间为24 h。
⑷将DEAE-纤维素按常规方法依次用0.5mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH水溶液处理为OH-型后装入阴离子交换柱，枸杞多糖上样进行柱层析分离后，依次用2倍柱体积的蒸馏水和0.5 mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液A；洗脱液A依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞中性多糖LBP-N和枸杞酸性多糖LBP-A。
其中：DEAE-纤维素柱层析分离的条件是指色谱柱直径10cm、长度50cm，流动相依次为蒸馏水和0.5 mol/L NaCl，流速为20cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量500Da，蒸馏水中透析24h。
冷冻干燥的条件是指真空度为10 Pa、温度为-55℃、干燥时间为24h。
⑸枸杞酸性多糖LBP-A经Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离后，依次用1倍柱体积的0.05mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液B；洗脱液B依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞酸性多糖LBP-A-1和枸杞酸性多糖LBP-A-2。
其中：Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离的条件是指色谱柱直径1cm、长度80cm，流动相为0.05mol/L NaCl水溶液，流速为10cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量500Da，蒸馏水中透析24h。
冷冻干燥的条件是指真空度为10 Pa、温度为-55℃、干燥时间为24 h。
⑹枸杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化后，依次用3倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液C；洗脱液C依次经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品。
其中：DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化的条件是指色谱柱直径5cm、长度40cm，用3倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，流速为15cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量500~Da，蒸馏水中透析24h。
冷冻干燥的条件是指真空度为10 Pa、温度为-55℃、干燥时间为24 h。
实施例2 一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，包括以下步骤：
⑴将枸杞加水经微波-超声波协同提取，得到提取液，该提取液经过滤去除沉淀，收集滤液；滤液在温度为80℃的条件下浓缩至所述滤液体积的1/8后，得到浓缩液。
其中：枸杞为宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果实。
微波-超声波协同提取条件是指料液质量体积比（g/mL）为1：20，提取温度为100℃，超声波功率800W，微波功率380W，提取总时间为30min。
⑵浓缩液中加入其体积4倍的无水乙醇，混匀后10℃静置24h，经离心得到沉淀产物。
其中：离心条件是指转速为5000rpm，时间为20min。
⑶沉淀产物按1：10的质量体积比（g/mL）加水复溶后，经离心除杂，得到上清液，该上清液于-85℃预冻6h后经冷冻干燥，即得枸杞多糖。
其中：离心条件是指转速为5000rpm，时间为20min。
冷冻干燥的条件是指真空度为100 Pa、温度为-70℃、干燥时间为72 h。
⑷将DEAE-纤维素按常规方法依次用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH水溶液处理为OH-型后装入阴离子交换柱，枸杞多糖上样进行柱层析分离后，依次用3倍柱体积的蒸馏水和0.5 mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液A；洗脱液A依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞中性多糖LBP-N和枸杞酸性多糖LBP-A。
其中：DEAE-纤维素柱层析分离的条件是指色谱柱直径30cm、长度100cm，流动相依次为蒸馏水和0.5 mol/L NaCl，流速为40cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量3500Da，蒸馏水中透析48h。
冷冻干燥的条件是指真空度为100 Pa、温度为-70℃、干燥时间为72 h。
⑸枸杞酸性多糖LBP-A经Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离后，依次用1.5倍柱体积的0.5mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液B；洗脱液B依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞酸性多糖LBP-A-1和枸杞酸性多糖LBP-A-2。
其中：Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离的条件是指色谱柱直径5cm、长度120cm，流动相为0.5mol/L NaCl水溶液，流速为20cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量3500Da，蒸馏水中透析48h。
冷冻干燥的条件是指真空度为100 Pa、温度为-70℃、干燥时间为72 h。
⑹枸杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化后，依次用5倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液C；洗脱液C依次经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品。
其中：DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化的条件是指色谱柱直径10cm、长度70cm，用5倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，流速为30cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量3500Da，蒸馏水中透析48h。
冷冻干燥的条件均是指真空度为100 Pa、温度为-70℃、干燥时间为72 h。
实施例3 一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，包括以下步骤：
⑴将枸杞加水经微波-超声波协同提取，得到提取液，该提取液经过滤去除沉淀，收集滤液；滤液在温度为70℃的条件下浓缩至所述滤液体积的1/7后，得到浓缩液。
其中：枸杞为宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果实。
微波-超声波协同提取条件是指料液质量体积比（g/mL）为1：15，提取温度为80℃，超声波功率700W，微波功率360W，提取总时间为25min。
⑵浓缩液中加入其体积3.5倍的无水乙醇，混匀后7℃静置18h，经离心得到沉淀产物。
其中：离心条件是指转速为4500rpm，时间为18min。
⑶沉淀产物按1：8的质量体积比（g/mL）加水复溶后，经离心除杂，得到上清液，该上清液于-75℃预冻5h后经冷冻干燥，即得枸杞多糖。
其中：离心条件是指转速为4500rpm，时间为18min。
冷冻干燥的条件是指真空度为50 Pa、温度为-60℃、干燥时间为48h。
⑷将DEAE-纤维素按常规方法依次用0.8 mol/L HCl和0.8 mol/L NaOH水溶液处理为OH-型后装入阴离子交换柱，枸杞多糖上样进行柱层析分离后，依次用2.5倍柱体积的蒸馏水和0.5 mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液A；洗脱液A依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞中性多糖LBP-N和枸杞酸性多糖LBP-A。
其中：DEAE-纤维素柱层析分离的条件是指色谱柱直径20cm、长度80cm，流动相依次为蒸馏水和0.5 mol/L NaCl，流速为30cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量2000Da，蒸馏水中透析36h。
冷冻干燥的条件是指真空度为50 Pa、温度为-60℃、干燥时间为48h。
⑸枸杞酸性多糖LBP-A经Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离后，依次用1.2倍柱体积的0.05~0.5mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液B；洗脱液B依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞酸性多糖LBP-A-1和枸杞酸性多糖LBP-A-2。
其中：Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离的条件是指色谱柱直径3cm、长度100cm，流动相为0.2mol/L NaCl水溶液，流速为15cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量2000Da，蒸馏水中透析36h。
冷冻干燥的条件是指真空度为50 Pa、温度为-60℃、干燥时间为48h。
⑹枸杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化后，依次用4倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液C；洗脱液C依次经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品。
其中：DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化的条件是指色谱柱直径8cm、长度55cm，用4倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，流速为20cm/h。
透析除盐的条件是指透析袋截留分子量2000Da，蒸馏水中透析36h。
冷冻干燥的条件是指真空度为50 Pa、温度为-60℃、干燥时间为48h。
上述实施例1~3中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
上述实施例1~3中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
枸杞购自青海省海西蒙古族藏族自治州诺木洪农场枸杞加工企业；微波提取装置为XH-300B微波超声波合成/萃取仪（北京祥鹄科技发展有限公司），冷冻干燥机为FD-2型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）。
Claims (9)
1.一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，包括以下步骤：
⑴将枸杞加水经微波-超声波协同提取，得到提取液，该提取液经过滤去除沉淀，收集滤液；所述滤液在温度为60~80℃的条件下浓缩至所述滤液体积的1/6~1/8后，得到浓缩液；
⑵所述浓缩液中加入其体积3~4倍的无水乙醇，混匀后4℃~10℃静置12~24h，经离心得到沉淀产物；
⑶所述沉淀产物按1：6~10的质量体积比加水复溶后，经离心除杂，得到上清液，该上清液于-70℃~ -85℃预冻4~6h后经冷冻干燥，即得枸杞多糖；
⑷将DEAE-纤维素按常规方法依次用0.5~1 mol/L HCl和0.5~1 mol/L NaOH水溶液处理为OH-型后装入阴离子交换柱，所述枸杞多糖上样进行柱层析分离后，依次用2~3倍柱体积的蒸馏水和0.5 mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液A；所述洗脱液A依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞中性多糖LBP-N和枸杞酸性多糖LBP-A；
⑸所述枸杞酸性多糖LBP-A经Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离后，依次用1~1.5倍柱体积的0.05~0.5mol/L NaCl水溶液洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液B；所述洗脱液B依次经透析除盐、冷冻干燥，分别得到枸杞酸性多糖LBP-A-1和枸杞酸性多糖LBP-A-2；
⑹所述枸杞酸性多糖LBP-A-1经DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化后，依次用3~5倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，并根据洗脱液糖含量分布曲线，收集洗脱液C；所述洗脱液C依次经透析除盐、冷冻干燥，即得抗衰老活性RG-I型枸杞果胶纯品。
2.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中的枸杞为宁夏枸杞（Lycium barbarum L.）的成熟果实。
3.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑴中的微波-超声波协同提取条件是指料液质量体积比为1：10~20，提取温度为60~100℃，超声波功率600~800W，微波功率340~380W，提取总时间为20~30min。
4.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑵和所述步骤⑶中的离心条件均是指转速为4000rpm~5000rpm，时间为15min~20min。
5.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑶、所述步骤⑷、所述步骤⑸、所述步骤⑹中冷冻干燥的条件均是指真空度为10~100 Pa、温度为-55℃~ -70℃、干燥时间为24~72 h。
6.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷中DEAE-纤维素柱层析分离的条件是指色谱柱直径10~30cm、长度50~100cm，流动相依次为蒸馏水和0.5 mol/L NaCl，流速为20~40cm/h。
7.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑷、所述步骤⑸、所述步骤⑹中透析除盐的条件均是指透析袋截留分子量500~3500Da，蒸馏水中透析24~48h。
8.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑸中Sepharose CL-6B凝胶过滤柱层析分离的条件是指色谱柱直径1~5cm、长度80~120cm，流动相为0.05~0.5mol/L NaCl水溶液，流速为10~20cm/h。
9.如权利要求1所述的一种具有抗衰老活性的RG-I型枸杞果胶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑹中DEAE-Sepharpse Fast Flow阴离子交换柱层析纯化的条件是指色谱柱直径5~10cm、长度40~70cm，用3~5倍柱体积的0~0.5 mol/L NaCl水溶液连续梯度洗脱，流速为15~30cm/h。
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