CN114656577A

CN114656577A - 一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖

Info

Publication number: CN114656577A
Application number: CN202210478843.7A
Authority: CN
Inventors: 刘建飞; 邸多隆; 李云春
Original assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Chemical Physics LICP of CAS
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2022-06-24

Abstract

本发明提供一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖，所提供的枸杞多糖LICP009‑3F‑1a的绝对分子量Mw为10780Da，分散系数PDI为1.49；所述的LICP009‑3F‑1a是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成，其摩尔比例为36.4:239.1:80.8:24.1:9.7；所述的LICP009‑3F‑1a在水溶液中的电荷为‑24.5mV。本发明所提供的枸杞多糖LICP009‑3F‑1a具有显著的抗氧化作用，可以通过抑制氧化应激损伤发挥潜在的防治缺血性脑卒中功效，为枸杞多糖的高值利用提供了科学依据和新的思路。

Description

一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖

技术领域

本发明属于功能性大分子制备技术领域，具体涉及一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖。

背景技术

氧化应激反应是生物体内产生的自由基或其他反应性代谢物与机体自身氧化还原应激反应能力之间失衡，对活性生物分子或细胞造成损伤，从而对整个生物体产生不良影响。高水平的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)不但能够诱导诸如脂质过氧化、蛋白质和核酸等生物大分子氧化损伤，还会通过介导和调控细胞信号转导的方式诱导细胞炎症、细胞凋亡和异常生产，从而导致机体器官的功能障碍。因此，氧化应激几乎参与了生物体一切疾病的生理病理过程，是多种慢性疾病和心脑血管疾病的主要发病机制之一。

缺血性脑卒中(Ischemic stroke,IS)是威胁人类生命健康的三大杀手之一，其发病是由于局部脑动脉供血中断所引起的大脑缺氧和活性氧累积，诱发神经细胞的不可逆损伤，进而导致脑神经功能缺失甚至死亡。尽管缺血性脑卒中涉及的病理机制十分复杂，但是其发病时ROS瞬间过度产生会击溃机体的抗氧化防御系统，进而引起包括炎症反应、脂质过氧化、血脑屏障损伤、细胞自噬与凋亡等一系列生理事件，导致神经退行性变和神经元细胞的凋亡。因此，氧化应激在脑卒中扮演着主要角色，被认为是脑卒中病人死亡的关键诱因，而抑制氧化应激可能会成为防治缺血性脑卒中的主要策略。

现代药理学研究表明枸杞多糖是一种优良的抗氧化剂，可以通过清除各种自由基、上调抗氧化物酶活性、阻滞脂质过氧化、防御氧化应激损伤、螯合金属离子以及激活抗氧化应激通路等多种机制发挥抗氧化效应，从而表现出调节免疫力、延缓衰老、抗肿瘤、抗阿尔茨海默病、保护神经系统、防治眼部疾病等多种生物学功效。但是，目前的研究只是停留在粗多糖层面上，由于构成粗多糖混合物中的多糖结构极其复杂、数量十分巨大，不同的多糖具有不同的效果；因此，从粗多糖中发现、筛选出具有一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖是一项具有挑战性的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的枸杞多糖LICP009-3F-1a，其结构式如下：

R₁＝β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→

R₂＝α-L-Araf-(1→

R₃＝β-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→；

所提供的枸杞多糖LICP009-3F-1a的绝对分子量Mw为10780Da，分散系数PDI为1.49；

所述的LICP009-3F-1a是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成，其摩尔比例为36.4∶239.1∶80.8∶24.1∶9.7；

所述的LICP009-3F-1a在水溶液中的电荷为-24.5mV。

本发明所提供的枸杞多糖，在一个实施例中记载的具体制备方法如下：

1)将枸杞子粉末加水后进行高速剪切破壁提取，提取液离心收集上清液，将上清液进行浓缩后，用截留分子量为10kDa的超滤膜进行超滤，收集透过液；

所述的离心的条件是转速8000r·min^-1，离心15min；

2)将上述透过液再次通过截留分子量为5kDa的膜，收集截留液，冷冻干燥，得到固体粉末；

3)将固体粉末加入到蒸馏水中溶解后进行透析，然后用碱性溶液将透析液 pH调整至碱性后，加入双氧水H₂O₂进行处理；然后待多糖溶液冷却至室温后进行透析，再冷冻干燥获得白色絮状粉末；

所述的透析是使用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析。

4)将制备的白色絮状粉末溶于蒸馏水中，上样至层析柱，并依次用H₂O、 0.2MNaCl和0.5M NaCl水溶液进行洗脱；将蒸馏水洗脱的组分浓缩并冷冻干燥，获得白色絮状粉末；

5)将步骤4)制备的白色絮状粉末用少量水溶解，使用葡聚糖凝胶Sephadex G-50层析柱进行纯化，用蒸馏水洗脱，洗脱液冷冻干燥获得本发明的中性均一枸杞多糖LICP009-3F-1a。

本发明还提供所述的枸杞多糖LICP009-3F-1a在制备用于抑制细胞氧化应激活性的制品中的应用。

本发明还提供一种用于抑制细胞氧化应激活性的制品，所述的制品中包含有药理有效浓度的所述的枸杞多糖LICP009-3F-1a。

本发明所提供的枸杞多糖LICP009-3F-1a具有显著的抗氧化作用，可以通过抑制氧化应激损伤发挥潜在的防治缺血性脑卒中功效，为枸杞多糖的高值利用提供了科学依据和新的思路。

附图说明

图1:LICP009-3F-1a的分子排阻-多角度激光光散射色谱图；

图2:LICP009-3F-1a的单糖组成色谱图，其中左侧图为单糖对照品图，其中标号1为岩藻糖、2为鼠李糖、3为阿拉伯糖、4为半乳糖、5为葡萄糖、6为木糖、7为甘露糖、8为果糖、9为核糖；右侧图为LICP009-3F-1a的离子色谱图；

图3：LICP009-3F-1a的扫描电镜图，其中左侧图的放大倍数为500倍，右侧图的放大倍数为2000倍；

图4：不同NaOH浓度下LICP009-3F-1a的刚果红试验结果图；

图5：LICP009-3F-1a的Zeta电位分布图；

图6：LICP009-3F-1a的X-射线衍射图；

图7：LICP009-3F-1a的TG曲线图；

图8：LICP009-3F-1a的DCS曲线图；

图9：LICP009-3F-1a的FT-IR光谱图；

图10：LICP009-3F-1a的核磁共振氢谱图；

图11：LICP009-3F-1a的核磁共振碳谱图；

图12：LICP009-3F-1a的DEPT135谱图；

图13：LICP009-3F-1a的HSQC谱图；

图14：LICP009-3F-1a的¹H-¹H-COSY谱图；

图15：LICP009-3F-1a的HMBC谱图；

图16：LICP009-3F-1a的NOESY谱图；

图17：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对C2C12 细胞(A)、RAW264.7细胞(B)、C28/i2细胞(C)、PC12细胞(D)和ARPE-19细胞(E) 抗氧化活性筛选结果图，其中结果表示为平均值±SD，n＝5，*和**表示给药组与缺氧对照组相比，P<0.05和P<0.01，#和##表示缺氧对照组与空白对照组相比， P<0.05和P<0.01；

图18:不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤的增殖的影响图，其中结果表示为平均值±SD，n＝5，^*和^**表示给药组与缺氧对照组相比，P<0.05和P<0.01，^#和^##表示缺氧对照组与空白对照组相比，P<0.05和P<0.01；

图19:不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤后细胞中ROS水平的影响图，其中a为空白对照组；b 为CoCl₂处理的对照组；c为10μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；d为50μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；e为100μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；f为200 μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；g为500μg·mL^-1处理组；结果表示为平均值 ±SD，n＝3，^*和^**表示与缺氧对照组相比，P<0.05和P<0.01，^#和^##表示缺氧对照组与空白对照组相比，P<0.05和P<0.01)；

图20：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤后细胞中ROS浓度的荧光图像；

图21：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤后细胞中CAT、SOD1、Gpx1基因的mRNA水平的影响图，其中结果表示为平均值±SD，n＝3，^*和^**表示与缺氧对照组相比，P<0.05 和P<0.01，^#和^##表示缺氧对照组与空白对照组相比，P<0.05和P<0.01；

图22：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤后细胞中HIF-1α和VEGF基因的mRNA水平的影响图；其中结果表示为平均值±SD，n＝3，^*和^**表示与缺氧对照组相比，P<0.05和 P<0.01，^#和^##表示缺氧对照组与空白对照组相比，P<0.05和P<0.01；

图23：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤的凋亡的影响图，其中a为空白对照组；b为CoCl₂处理的对照组；c为10μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；d为50μg·mL^-1的 LICP009-3F-1a处理组；e为100μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；f为200 μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；g为500μg·mL^-1的LICP009-3F-1a处理组；结果表示为平均值±SD，n＝3，^*和^**表示与缺氧对照组相比，P<0.05和P<0.01， ^#和^##表示缺氧对照组与空白对照组相比，P<0.05和P<0.01；

图24：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤后细胞中Bax、Bcl2、Casp3基因的mRNA水平的影响图，其中结果表示为平均值±SD，n＝3，^*和^**表示与缺氧对照组相比，P<0.05和 P<0.01，^#和^##表示缺氧对照组与空白对照组相比，P<0.05和P<0.01；

图25：不同浓度(10、50、100、200和500μg·mL^-1)LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导PC12细胞缺氧损伤后细胞中线粒体和ATP水平的影响图。

具体实施方式

本发明从枸杞中分离获得均一性多糖LICP009-3F-1a，并研究了所获得的均一性多糖在小鼠成肌细胞C2C12、小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、人正常软骨细胞C28/i2、人视网膜上皮细胞ARPE-19和大鼠肾上腺嗜铬细胞PC12细胞中的抗疲劳、调节免疫、膝关节骨关节炎、防治老年性黄斑变性和脑卒中的活性效果。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：制备枸杞均一性多糖

称取枸杞子干燥粉末约100.0g，加入1000mL蒸馏水，待水浴温度升至60℃ 时，开启高速剪切机辅助破壁提取，剪切转速为15000r·min^-1，提取30min。待提取液温度降至室温后，置于高速离心机离心，转速8000r·min^-1，离心15min，收集并合并上清液。用旋转蒸发仪减压浓缩至600mL，分2次转移至VFA006 透析瓶，用蠕动泵泵入截留分子量为10kDa的

200超滤切向流膜，压力为0.8MPa，流速为150mL·min^-1，收集透过液。

将上述透过液再次转移至透析瓶，通过蠕动泵泵入截留分子量为5kDa的

200超滤切向流膜，压力为0.8MPa，流速为100mL·min^-1，收集截留液，冷冻干燥，得到棕色絮状固体粉末，所得样品标记为“LICP009”。

称取约5.0g的LICP009溶解于100mL的蒸馏水中，加入10mL的三氯乙酸TCA，冰浴2h后，置于高速离心机离心，转速8000r·min^-1，离心10min，收集并合并上清液，用截留分子量为1000Da的透析袋透析2天，然后将透析液置于60℃水浴，滴加氨水NH₃(aq)调节pH至8.0后，边搅拌边加入10mL的 H₂O₂，维持60℃搅拌脱色2h。待多糖溶液冷却至室温后，加入截留分子量为 1000Da的透析袋，用流动水透析48h，蒸馏水透析24h，最后置于冷冻干燥机储液盘，置于-80℃冰箱预冷冻10h，在冷阱温度为-50℃，真空度为8Pa的条件下冷冻干燥36h，得到白色絮状粉末。

将上述白色絮状粉末溶于蒸馏水中，上样至DEAE-52层析柱(3.5cm×60 cm)，并依次用H₂O、0.2和0.5M NaCl水溶液以2mL·min^-1流速逐步洗脱。每 8.0mL收集为1管，并使用苯酚硫酸法跟踪检测。用蒸馏水洗脱的组分浓缩并冷冻干燥，获得白色絮状粉末，所的样品标记为“LICP009-3F-1”。

随后将上述获得的LICP009-3F-1组分使用葡聚糖凝胶Sephadex G-50层析柱(2.6cm×30cm)进一步纯化，用蒸馏水以0.5mL·min^-1的流速洗脱，硫酸苯酚法跟踪检测并绘制洗脱曲线，合并相同组分，浓缩并冷冻干燥，获得的白色絮状粉末命名为LICP009-3F-1a。

实施例2：LICP009-3F-1a的理化性质

1、分子量测定及均一性分析

使用分子排阻色谱联用激光光散射仪(The size exclusion chromatographycoupled with multi-angel laser light scattering，SEC-MALLs)测定LICP009-3F-1a的分子量，具体测定步骤如下：

称取约2mg枸杞多糖LICP009-3F-1a，配成2mg·mL^-1的多糖溶液，过0.22 μm的微孔滤膜，然后进SEC-MALLs进行分析。SEC-MALLs分析条件如下：仪器：安捷伦1260高效液相；检测器：示差折光检测器和十八角度激光光散射检测器；色谱柱：TSKgel G3000(7.8mmI.D.×300mm,5μm)和TSKgel G2000(7.8 mm I.D.×300mm,5μm)串联；洗脱剂：超纯水；进样量：100μL；流速：0.5 mL·min^-1。

枸杞多糖LICP009-3F-1a的SEC-MALLs信息如图1所示，多角度激光光散射信号在9.8min有一个小峰，在15.8min呈现明显的单一对称峰，由于该检测器为分子量与浓度响应性检测器，说明在9.8min有一个分子量较大的多糖存在，但其浓度极低，对整个多糖结构的分析没有实质干扰。示差折光检测信号在17.2 min呈现明显的单一对称峰，进一步说明枸杞多糖LICP009-3F-1a均有良好的均一性。两个检测信号之间的保留时间差异归因于检测器之间管道的死体积所致。利用SEC-MALLs自带的分析软件可知，枸杞多糖LICP009-3F-1a的绝对分子量 Mw为10780Da，分散系数PDI为1.49，提示该多糖是一种分子量小的多分散性均一多糖。该结果进一步说明在多糖分离纯化前，用截留分子量为10kD和5 kD进行了截留预处理，达到了获取低分子量多糖的目的。值得注意的是， LICP009-3F-1a在SEC-MALLs分析中并没有获得均方根旋转半径和相应的构象信息，也主要是由于分子量低，获得的均方根旋转半径小于10nm，不能满足仪器的检测灵敏度要求所致。

2、单糖组成测定

依次称取单糖对照品岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖盐酸盐、盐酸氨基葡萄糖、N-乙酰-D氨基葡萄糖、古罗糖醛酸和甘露糖醛酸各约10mg，分别定容至1.0mL，配成约10mg·mL^-1标准溶液作为储备液。取各单糖标准溶液储备液，依次精密配置为0.01、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mg·mL^-1梯度浓度标准品溶液。用脉冲安培检测器-离子色谱仪进行分析，根据单糖摩尔质量计算摩尔比。

依次精密称取约10mg枸杞多糖样品，置于安瓿瓶中，加入10mL 3M的 TFA，120℃密封避光水解3h。用移液枪准确量取酸水解溶液2mL，转移至5mL 的EP管中，80℃氮吹除去TFA，加入2mL无水C₂H₅OH，再次氮吹后，加入5 mL去离子水涡旋混匀，吸取100μL置于1.0mL容量瓶中，用去离子水定容至刻度线，过0.22um微孔滤膜，用脉冲安培检测器-离子色谱仪进行分析。

枸杞多糖LICP009-3F-1a的色谱条件如下：色谱柱：DionexCarbopac^TMPA20 (3*150)；流动相：A:H₂O；B:100mM NaOH；流速：0.5mL·mL^-1；进样量：20μL；柱温：30℃；检测器：电化学检测器。

枸杞多糖LICP009-3F-1a的离子色谱图如图2所示，通过与单糖对照品保留时间的比对，LICP009-3F-1a是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成，其摩尔比例为36.4:239.1:80.8:24.1:9.7；由单糖组成可知，该多糖是一个中性杂多糖。

3、扫描电镜分析

枸杞多糖LICP009-3F-1a的扫描电镜图如图3所示，在放大倍数为500倍下，多糖显示出片层状形态，并分布着不均匀的圆形微孔，孔径约为10μm。同时，大量的水分子储存在多糖的微孔中，当温度升高时迅速蒸发，这也导致了热重分析中的第一阶段明显的重量损失。随着放大倍数增加到2000倍，能够清晰的观察到片层结构表面伴随着均匀的丝状图案。

4、刚果红实验分析

刚果红实验是确定多糖是否具有三螺旋结构的主要手段之一，其原理为刚果红试剂可以和具有三螺旋结构的多糖形成络合物，后者最大吸收波长较刚果红相比明显红移。通常在碱性介质中，多糖会随着碱性介质浓度的增大而发生三螺旋结构的解聚，从而使和刚果红形成的络合物的最大吸收波长减小。枸杞多糖样品的构象采用刚果红实验进行测定，具体操作如下：

称取枸杞多糖样品2mg，用蒸馏水配成1.0mg·mL^-1的溶液，再加入80 μmol·L^-1的刚果红溶液，涡旋5min，充分混合。向上述混合物中加入0.5mol·L^-1的NaOH溶液，使其混合物中NaOH的终浓度为0～0.5mol·L^-1，用蒸馏水作为空白对照。在不同NaOH浓度下测定200～800nm范围内的最大吸收波长。

枸杞多糖LICP009-3F-1a的刚果红实验结果如图4所示，向多糖与刚果红形成的络合物中添加NaOH，使其混合物总浓度为0～0.5mol·L^-1。在浓度为0～0.2 mol·L^-1时，LICP009-3F-1a与刚果红形成的络合物的最大吸收波长发生红移，但混合物中NaOH浓度为0.3～0.5mol·L^-1时，最大吸收波长并没有明显的蓝移，说明多糖和刚果红形成的络合物没有因为多糖结构的解聚发生变化，提示 LICP009-3F-1a没有三螺旋结构。氢键在维持多糖的三螺旋结构中起着重要作用，而LICP009-3F-1a可能由于分子量相对较小，产生氢键不足以形成三螺旋。

5、Zeta电位分析

多糖的电荷会影响溶液的稳定性，从而间接的决定了多糖的应用。较高的绝对Zeta电位值会降低溶液的絮凝性，而绝对Zeta电位值越低，多糖粒子之间的吸引力大于排斥力，在溶液中越倾向于凝结。通常，Zeta电位值为0～±10mV 时，多糖在溶液中快速凝结或凝聚；±10～±30mV时，多糖在溶液中开始变得不稳定；±30～±40mV时，多糖在溶液中稳定性一般；±40～±60mV时，多糖在溶液中具有较好的稳定性；当Zeta电位值超过±61mV时，多糖在溶液中具有良好的稳定性。

枸杞多糖样品的Zeta电势采用动态光散射仪进行测定，具体操作如下：称取2.0mg枸杞多糖样品，溶于蒸馏水中，配成1.0mg·mL^-1的溶液，在25℃下测定3次。

枸杞多糖LICP009-3F-1a的Zeta电位图如图5所示，结果显示LICP009-3F-1a 在水溶液中的电荷为-24.5mV，表明该多糖在溶液状态下不稳定，具有凝结的趋势。LICP009-3F-1a多糖带有负电荷，具有供电子能力。上述结果提示 LICP009-3F-1a在溶液中不稳定，最终的应用最好以固态形式存在，如果长期存在于溶液中，则需要对其进行包埋、包封或络合等制剂处理。

6、X-射线衍射分析

枸杞多糖的晶体结构通过X-射线衍射仪测定，具体操作如下：将枸杞多糖样品放入玻璃样品架样品槽内，用载玻片轻压粉末，使样品充满槽内，并轻轻刮去多余的粉末，使样品表面与玻璃架表面在同一平面。在室温保持恒定20℃，相对湿度保持70％以下，真空度≥10-5Torr进行测定，测定范围为5～80°。

枸杞多糖LICP009-3F-1a和LICP009-3F-2a的X-射线衍射图如图6所示。在10～80°区域，LICP009-3F-1a在17.2°附近有一个明显的衍射峰，在42.8°附近有一个微弱的衍射峰，这意味着多糖包含2种主要的结晶成分，是一种半结晶聚合物，同时存在结晶和无定形组分。

7、热重分析

样品在热环境中发生化学变化、分解、成分改变时都可能伴随着质量的变化。热重分析(Thermogravimetric Analysis,TG或TGA)是指在程序控温下，待测样品的质量与温度变化之间的关系，从而间接研究样品的热稳定性。通常样品的宏观热稳定性和其微观分子结构密切相关。枸杞多糖LICP009-3F-1a的TGA 热分析图如图7所示，显示多糖的失重主要分为3个阶段。第一个阶段主要发生在260℃之前，几乎都是10％的质量损失，归因于多糖由于存在孔结构和高亲水基团，吸附了很多的结合水，说明2个多糖在低温阶段都处于稳定状态；第二个阶段多糖失重最为显著，该阶段受高温诱导，多糖发生了糖链的解聚和高级结构的破坏。该阶段多糖的热重分析曲线变化明显，从热分析图可以看出，LICP009-3F-1a的分解起始温度为258.9℃，拐点温度为298.9℃，终止温度为 318.2℃，多糖质量变化为36.02％

利用差示扫描量热法(Differential Scanning Calorimetry,DSC)研究了枸杞多糖LICP009-3F-1a的热力学性质和转变热，DSC曲线见图8。LICP009-3F-1a在 25℃～800℃范围内有2个明显的放热峰，在280℃左右的放热峰归因于多糖受高温诱导发生糖链分解和骨架结构塌陷时产生了晶型的短暂转变。而 LICP009-3F-1a在700℃左右出现放热峰，说明多糖仍然处于失重过程中。

实施例3：LICP009-3F-1a的结构分析

1、傅里叶红外光谱分析

傅里叶红外光谱主要用于分析化合物的官能团，应用于多糖的结构解析，可以确定多糖的种类和糖苷键的构型。枸杞多糖LICP009-3F-1a的红外光谱如图9 所示，在3426.7cm^-1处的强吸收峰归属于糖环上羟基(-OH)的伸缩振动。2923.2 cm^-1和2892.5cm^-1处的弱吸收峰是由C-H的伸缩振动引起的。1630.5cm^-1附近的吸收带是多糖吸附的结合水的弯曲振动。通常，1720cm^-1处的典型吸收信号对应于糖醛酸中羰基(C＝O)的伸缩振动，在LICP009-3F-1a的红外光谱中并未见该吸收信号，表明该多糖是中性多糖，这与单糖组成分析结果一致。此外，C-O伸缩振动和O-H弯曲振动峰在1065.8cm^-1和1415.6cm^-1区域附近。894.7 cm^-1和854.4cm^-1处的弱吸收峰则提示β-糖苷键和α-末端差向异构体的存在。进一步结合单糖组成分析，773.3cm^-1处的吸收峰表明LICP009-3F-1a中存在D-葡萄糖。

2、甲基化分析

甲基化是研究多糖初级结构的最主要手段之一，可以确定多糖的糖苷键残基及其比例。本发明的中性枸杞多糖LICP009-3F-1a经甲基化、水解、还原和乙酰化后得到部分甲基化糖醇乙酸酯衍生物(Partially methylated sugar alcohol acetatederivatives,PMAAs)，通过气相色谱的出峰顺序和对质谱图的主要离子碎片的分析，得到每个糖残基及其摩尔比例。如表1所示，LICP009-3F-1a主要的糖残基链接方式为T-Araf、T-Glcp、T-Galp、1,2/4-Xylp、1,3-Galp、1,6-Manp、 1,6-Glcp、1,4-Glcp、1,6-Galp和1,3,6-Galp，其百分摩尔比为：8.9:6.9:10.2:5.5: 5.8:3.1:4.8:11.3:16.9:26.6。非还原性末端包括T-Araf、T-Glcp和T-Galp，链内残基由1,2/4-Xylp、1,3-Galp、1,6-Manp、1,6-Glcp、1,4-Glcp和1,6-Galp组成，分支残基仅有1,3,6-Galp，说明LICP009-3F-1a的侧链都是和1,3,6-Galp相连。非还原性末端的百分摩尔比之和为26.0，而分支残基的百分摩尔比为26.6，吻合糖链端基数与分支残基数一致的规律。

表1：ICP009-3F-1a甲基化分析结果表

3、核磁共振分析

枸杞多糖LICP009-3F-1a的¹H NMR如图10所示，从氢谱的异头氢范围能够发现该处峰重叠严重，氢谱信号主要集中在δ3.0～5.5ppm之间。δ4.37、4.45、 4.46、4.63、4.67、4.90、5.17ppm主要为端基质子峰，δ3.2～4.0ppm为糖环质子H2～H6的信号。

核磁共振碳谱如图11，碳谱信号主要集中在δ60～120ppm之间。通过观察碳谱，可以看到主要异头碳信号峰为δ99.09、102.50、103.84、104.69、104.90、 105.30、110.62ppm，异头碳区域主要在δ93～105ppm之间。而δ85.22、83.10、 81.50、77.97、76.69、74.96、74.81、74.63、74.17、74.14、73.93、72.73、72.16、 71.71、71.58、71.50、71.47、71.42、71.31、70.87、70.76、70.05、69.96、69.87、 69.82、62.64、62.45、61.67ppm主要信号峰分布在δ60～85ppm区域。从DEPT135 图谱(图12)可知，亚甲基-CH₂的信号峰为倒峰，说明该区域的信号均为C6 没有被取代的CH₂。

为了明确LICP009-3F-1a中各糖残基的氢和碳质子信号，通过二维图谱进行进一步的解析。从HSQC谱图(图13)碳化学位移区域可观察到7个异头碳- 氢质子相关峰，结合甲基化结果，可以确定LICP009-3F-1a有7个糖残基构成，分别标记为A、B、C、D、E、F和G。通过¹H-¹H-COSY谱图(图14)对糖残基进行归属，具体如下：

1)残基A：α-L-Araf-(1→的归属：

由HSQC谱图峰归属可知，残基A异头氢与异头碳质子化学位移分别为δ5.17 ppm和δ110.62ppm，提示残基A具有α构型。利用COSY谱图对残基A中H2～H6 的化学位移进行归属，以H1的化学位移δ5.17ppm为起点，依次找到H-H相关峰，然后归属其化学位移。如图16所示，H1/H2的信号为5.17/4.13，H2/H3的信号为 4.13/3.87，H3/H4的信号为3.87/4.06，H4/H5的信号为4.06/3.76，H5/H6的信号为 3.76/3.64，可以推断出H1～H6的化学位移分别为δ5.17、4.13、3.87、4.06、3.76、 3.64ppm，通过H的化学位移，再与HSQC谱图结合分析，通过C1/H1，C2/H2， C3/H3，C4/H4，C5/H5的相关峰确定相应C的化学位移，推断出相应的C1-C5为δ 110.62、82.62、77.97、85.22、62.64ppm，数据详见表2；确定残基A为α-L-Araf-(1→。

2)残基B：→3)-β-D-Galp-(1→的归属：

由HSQC谱图峰归属可知，残基B异头氢与异头碳质子化学位移分别为δ4.63 ppm和δ105.3ppm，提示残基B具有β构型。利用COSY谱图对残基B中H2～H6的化学位移进行归属，以H1的化学位移δ4.63ppm为起点，依次找到H-H相关峰，然后归属其化学位移。如图14所示，H1/H2的信号为4.63/3.70，H2/H3的信号为 3.70/3.80，H3/H4的信号为3.80/3.86，H4/H5的信号为3.86/3.57，H5/H6的信号为 3.57/3.63和3.75，H5与H6之间的两个相关峰说明该氢原子处在两个不同的化学环境中。由此可以推断出H1～H6的化学位移分别为δ4.63、3.70、3.80、3.86、3.57、 3.63/3.75ppm，通过H的化学位移，再与HSQC谱图结合分析，通过C1/H1，C2/H2， C3/H3，C4/H4，C5/H5的相关峰确定相应C的化学位移，推断出相应的C1-C5为δ 105.30、71.42、83.1、69.96、74.14和62.45ppm，数据详见表2；确定残基B为 →3)-β-D-Galp-(1→。

用同样的分析策略与方法，推断并确定残基C为→6)-β-D-Galp-(1→、残基D 为→3,6)-β-D-Galp-(1→、残基E为→4)-β-D-Glcp-(1→、残基F为 →6)-α-D-Glcp-(1→、残基G为β-D-Galp-(1→。相应的化学位移归属见表2。

表2：LICP009-3F-1a的氢谱和碳谱化学位移归属数据表(ppm)

各糖残基之间连接顺序及位点分析：

在完成所有糖残基碳氢化学位移的归属后，通过HMBC图谱(图15)对糖苷键信号进行分析及归属：

糖苷键→6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与其自身的C6有相关信号峰；表明存在 →6)-β-D-Galp-(1→6)-β-D-Galp-(1→的链接方式，即(C→C)。糖苷键 →6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与→3,6)-β-D-Galp-(1→的C6有相关信号峰；表明存在→6)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式，即(C→D)。糖苷键 →3,6)-β-D-Galp-(1→的异头氢与→3,6)-β-D-Galp-(1→的C6有相关信号峰；表明存在→3,6)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→的链接方式，即(D→D)。糖苷键 →4)-β-D-Glcp-(1→的异头氢与其→6)-β-D-Galp-(1→的C6有相关信号峰；表明存在→4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Galp-(1→，即(E→C)。糖苷键→3)-β-D-Galp-(1→ 的异头氢与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的C3有相关信号峰；同时，→3)-β-D-Galp-(1→的异头碳与其→3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关信号峰，表明存在→3)-β-D-Galp-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→，即(B→D)。

由NOESY图谱(图16)分析可知，→6)-α-D-Glcp-(1→的异头氢与 →3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关峰，表明存在→6)-α-D-Glcp-(1→3,6)-β-D- Galp-(1→，即(F→D)。β-D-Galp-(1→的异头氢与→3)-β-D-Galp-(1→的H3有相关峰，表明存在β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→，即(G→B)。α-L-Araf-(1→的异头氢与→3,6)-β-D-Galp-(1→的H3有相关峰，表明存在 α-L-Araf-(1→3,6)-β-D-Galp-(1→，即(A→D)。

综合单糖组成、红外光谱、甲基化分析、一维和二维核磁的分析结果，确定枸杞多糖LICP009-3F-1a的主链→4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Galp-(1→，支链 β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→，α-L-Araf-(1→和→6)-α-D-Glcp-(1→通过 →3,6)-β-D-Galp-(1→的O-3连接在主链上，其结构式如下：

R_l＝β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→

R₂＝α-L-AraL(l→

R₃＝β-D-Galp-(1→6)-a-D-Glcp-(1→。

实施例4：枸杞多糖预防过氧化氢和缺氧引起的细胞氧化应激活性的研究

1、LICP009-3F-1a细胞增殖的影响

选用目前常用的抗氧化相关的C2C12细胞、RAW264.7细胞、C28/i2细胞、 ARPE-19细胞和PC12细胞模型进行活性的筛选。由图17所示，经过浓度为10、 50、100、200和500μg·mL-1的LICP009-3F-1a处理的实验组的PC12细胞的存活率与未处理的缺氧组相比均有显著性差异(P<0.05)。表明枸杞多糖 LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导的缺氧PC12细胞的氧化损伤具有良好的保护作用。

2、LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导的PC12细胞缺氧损伤的保护研究

将PC12细胞(1×10⁴细胞/孔)接种到96孔板中，每组重复6次。设置空白对照组、缺氧对照组、实验组。空白对照组不加任何物质，培养48h。缺氧对照组前期培养24h后，用433.59μM的CoCl₂处理24h。实验组用不同浓度的LICP009-3F-1a(10、50、100、200和500μg·mL^-1)预处理细胞24h。用433.59 μM的CoCl₂处理24h。所有孔加入10μL的5mg·mL^-1的MTT溶液，37℃孵育 2h。然后除去MTT溶液，加入200μL的DMSO，在490nm处测定吸光度。

如图18所示，缺氧组相比于空白对照组，细胞存活率下降至50.41％ (P<0.01)。而经过浓度为10、50、100、200和500μg·mL^-1的LICP009-3F-1a 处理的实验组细胞的存活率与未处理的缺氧组相比均有显著性差异(P<0.05)。特别当LICP009-3F-1a浓度为100μg·mL^-1时，保护效果最好。

3、LICP009-3F-1a降低CoCl₂诱导的PC12细胞缺氧损伤中ROS水平

近年来，超氧化物和其他活性氧(ROS)被认为是有氧代谢的有害或有毒的副产物，同时也是各种病理生理条件中的重要信号分子。ROS或ROS依赖的信号通路以不同方式与低氧环境相关的因子有紧密的联系。本发明研究了枸杞多糖LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导的PC12细胞中ROS水平的影响。如图19所示，缺氧组中的ROS的含量是空白对照组的1.4倍(P<0.01)，说明缺氧会造成细胞内产生大量ROS。经过LICP009-3F-1a处理的实验组的ROS与未处理的缺氧组相比明显降低(P<0.01)。不同浓度的LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导的PC12 细胞缺氧损伤后的细胞中ROS含量没有明显的浓度依赖关系，当LICP009-3F-1a 浓度为200μg·mL^-1时，细胞中ROS含量最低。如图20所示，与缺氧组相比 LICP009-3F-1a组的荧光信号明显减弱，这与流式细胞仪的检测结果趋势相同。

4、LICP009-3F-1a抑制CoCl₂诱导的PC12细胞缺氧损伤的氧化应激反应

缺血性脑卒中是一个复杂的病理过程，脑卒中病人体内不仅产生了大量的活性氧，而且众多抗氧化酶失活以及自身抗氧化剂活性水平降低，破坏了机体自有的氧化还原防御系统，进而丧失了对神经元的保护作用。细胞中ROS含量的降低是由细胞中多种条件共同作用，其中抗氧化酶(SOD、CAT和GPx)被视为细胞内抗氧化应激的防御系统中的关键环节。超氧化物歧化酶(SOD)是超氧化物生成氧气和过氧化氢的关键酶。过氧化氢酶(Catalase，CAT)可以将过氧化氢分解为水和氧气。几乎所有暴露于氧气的生物体中都发现了这种酶。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)属于硒蛋白家族，可以将过氧化氢脂质还原为相应的醇类。如图21所示，LICP009-3F-1a通过激活PC12细胞中SOD、CAT和GPx 的基因，抑制了CoCl₂诱导的PC12细胞缺氧损伤下的氧化应激反应。在 LICP009-3F-1a的作用下逆转并恢复了抗氧化酶的活性。以上结果表明， LICP009-3F-1a保护了PC12细胞对抗CoCl₂诱导缺氧下的氧化应激损伤。

5、LICP009-3F-1a抑制的CoCl₂诱导的PC12细胞缺氧损伤下HIF-1α和VEGF 基因的mRNA水平的表达

缺氧诱导因子HIF在细胞对缺氧的反应中起关键作用，是细胞适应缺氧环境最主要的转录因子。这些转录因子对低氧环境极其敏感，调节其表达可使细胞适应于低氧环境。VEGF基因是HIF-1α下游的关键基因。如图22所示，CoCl₂诱导后的PC12细胞中的HIF-1α和VEGF基因的表达显著增加。而经过 LICP009-3F-1a预处理后的PC12细胞中的HIF-1α和VEGF基因被显著下调 (P<0.01)。

6、LICP009-3F-1a抑制CoCl₂诱导的PC12细胞的凋亡

缺氧与细胞凋亡紧密相关，是细胞凋亡的重要诱因。促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2在线粒体依赖性凋亡途径中起着重要的作用。Caspase3基因是细胞进入凋亡的标志性基因。LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导的PC12细胞的细胞凋亡的影响由流式细胞仪检测得到。如图23所示，与未处理组相比，CoCl₂诱导后的PC12细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。然而，LICP009-3F-1a显著抑制了CoCl₂诱导缺氧后的细胞凋亡(P<0.01)。

为了进一步确认LICP009-3F-1a对CoCl₂诱导缺氧后的细胞凋亡的抑制作用，用RT-PCR方法检测了细胞凋亡相关基因Bcl2、Bax和Caspase3的表达。

如图24所示，与空白对照组相比，CoCl₂诱导后的PC12细胞的Bax和 Caspase3基因的mRNA水平显著增加，相比之下，LICP009-3F-1a预处理组则与之相反，LICP009-3F-1a显著的抑制了Bax和Caspase3基因的表达。与Bax 和Caspase3基因不同的是，PC12细胞中Bcl2基因的mRNA的水平显著降低。相比之下，LICP009-3F-1a预处理组则可以显著上调Bcl2基因的水平。如图25 所示，与缺氧对照组相比，细胞内的线粒体水平和ATP水平在细胞经过LICP009-3F-1a处理后有显著的提高。这表明LICP009-3F-1a抑制细胞凋亡的途径很可能是线粒体依赖性的。所有结果表明，LICP009-3F-1a具有抑制CoCl₂诱导造成的PC12细胞凋亡的作用。

上述结果表明枸杞多糖LICP009-3F-1a能够通过促进神经细胞增殖、逆转并恢复抗氧化物酶SOD、CAT和GPx的活性，抑制氧化应激反应损伤，下调HIF-1α 和VEGF缺氧诱导因子，阻滞Bax和Caspase3凋亡基因、上调Bcl-2抗凋亡基因的表达发挥抗氧化作用，从而有效防治缺血性脑卒中。

综上，本发明获得的枸杞多糖LICP009-3F-1a具有显著的抗氧化作用，可以通过抑制氧化应激损伤发挥潜在的防治缺血性脑卒中功效。

Claims

1.一种枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖的结构式如下：

R₁＝β-D-Galp-(1→3)-β-D-Galp-(1→

R₂＝α-L-Araf-(1→

R₃＝β-D-Galp-(1→6)-α-D-Glcp-(1→。

2.如权利要求1所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖的绝对分子量Mw为10780Da，分散系数PDI为1.49。

3.如权利要求1所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖组成，其摩尔比例为36.4∶239.1∶80.8∶24.1∶9.7。

4.如权利要求1所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖在水溶液中的电荷为-24.5mV。

5.如权利要求1所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的枸杞多糖的制备方法如下：

3)将固体粉末加入到蒸馏水中溶解后进行透析，然后用碱性溶液将透析液pH调整至碱性后，加入双氧水H₂O₂进行处理；然后待多糖溶液冷却至室温后进行透析，再冷冻干燥获得白色絮状粉末；

4)将制备的白色絮状粉末溶于蒸馏水中，上样至层析柱，并依次用H₂O、0.2M NaCl和0.5M NaCl水溶液进行洗脱；将蒸馏水洗脱的组分浓缩并冷冻干燥，获得白色絮状粉末；

5)将步骤4)制备的白色絮状粉末用少量水溶解，使用葡聚糖凝胶Sephadex G-50层析柱进行纯化，用蒸馏水洗脱，洗脱液冷冻干燥获得枸杞多糖。

6.如权利要求5所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的1)中所述的离心的条件是转速8000r·min^-1，离心15min。

7.如权利要求5所述的枸杞多糖，其特征在于，所述的3)中的透析是使用截留分子量为1000Da的透析袋进行透析。

8.权利要求1所述的枸杞多糖在制备用于抑制细胞氧化应激反应的制品中的应用。

9.一种用于抑制细胞氧化应激反应的制品，其特征在于，所述的制品中包含有药理有效浓度的权利要求1所述的枸杞多糖。

10.如权利要求9所述的制品，其特征在于，所述的制品中，所述的枸杞多糖为固体形态，或是以液体形态存在于胶囊中。