CN112587545A - 枸杞多糖在制备舒张胸主动脉药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了枸杞多糖在制备舒张胸主动脉药物中的用途。枸杞多糖所述的枸杞多糖通过调节PKeap1/Nrf2抗氧化应激信号通路蛋白的表达增加，改善AngⅡ(血管紧张素Ⅱ)诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤的作用，进而改善心血管系统的抗氧化应激状态起到保护心血管系统的作用。同时，枸杞多糖还具有降低致炎症因子的的作用。
Description
技术领域
本发明属于心血管病领域，具体涉及枸杞多糖在制备舒张胸主动脉药物中的用途。
背景技术
Keap1/Nrf2通路在提高机体总抗氧化能力、抗凋亡、抗肿瘤、抗炎症反应以及神经保护等方面都发挥着至关重要的作用。然而，过度的氧化应激导致体内氧化系统和抗氧化系统的调控水平失衡，此时，氧化应激对组织细胞的损伤作用较为显著，而抗氧化应激通路处于一种相对抑制的状态。
枸杞作为一种食药两用的传统中药，其自身所具有的润肺止咳和养肝明目等特殊功效而被人们所青睐。枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharide，LBP)是从枸杞子中提取的活性成分，研究表明：LBP具有多种药理和生物活性，例如抗氧化、抗凋亡、、抗疲劳、免疫调节和其他药理作用，同时，枸杞多糖具有保护神经元和抑制肿瘤生长作用，此外，枸杞多糖也表现出改善大鼠胸主动脉血管顺应性，增强小鼠的肠道免疫功能以及抑制炎症的作用。然而，关于枸杞多糖是否增强心血管内皮细胞中Keap1/Nrf2抗氧化应激信号通路的表达，提高心血管内皮的抗氧化能力，改善机体的氧化应激状态，进而达到保护心血管系统的功能的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种枸杞多糖新的医药用途，具体是提供枸杞多糖在制备舒张胸主动脉药物中的用途，其机制为：通过调节P-Keap1/Nrf2抗氧化应激信号通路蛋白的表达，改善由AngⅡ(血管紧张素Ⅱ)诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤的作用，提高心血管内皮的抗氧化能力，改善机体的氧化应激状态。药物可以是治疗类的药剂或者保健类的保健品。
本发明的另一目的是提供一种舒张胸主动脉药物或保健品，作为治疗血管内皮细胞功能障碍性心血管疾病的药物制剂或保健品。所述的药物或保健品是以枸杞多糖作为唯一活性成分，或以包含枸杞多糖的药物组合物作为活性成分。所述的药物添加药学上可接受的辅料制成临床应用的药物制剂。
优选的，所述的药物制剂包括口服制剂或注射制剂。所述的口服剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或混悬剂等。所述的注射制剂包括输液、注射剂等。
本发明首次公开了枸杞多糖在制备扩张胸主动脉药物中的用途，其可用于制备疗血管内皮细胞功能障碍性心血管疾病的药物或保健品。经试验证明，LBP通过改善内皮细胞的氧化应激状态以及炎症反应，增强了内皮细胞中Keap1/Nrf2抗氧化应激信号通路的表达，进而提高内皮细胞的抗氧化应激的能力，缓解机体的氧化应激状态和血管心肌的损伤，最终起到保护心血管系统的功能。
附图说明
图1为转染后24h荧光显微镜下的RTAEC图像(×400)其中，暗场所显示的是荧光显微镜下观察到的带有红色荧光的siRNA转染成功的细胞。明场所显示的是透光显微镜下的总细胞；
图2为为Western Blot(蛋白质的电泳分离)实验结果图；其中(a)胸主动脉血管内皮细胞通过SiRNA(沉默Nrf2蛋白)后Western Blot结果；(b)Nrf2相对蛋白表达量；(b)P-Nrf2相对蛋白表达量；(c)Nrf2相对蛋白表达量；
图3为RT-qPCR熔解曲线图；
图4为SiNrf2对RTAEC中Nrf2、P-Nrf2蛋白表达的影响图；其中(a)胸主动脉血管内皮细胞通过AngⅡ干预及SiRNA(沉默Nrf2蛋白)后Western Blot结果；(b)Nrf2相对蛋白表达量；(c)P-Nrf2相对蛋白表达量；
图5为ELISA检测SiNrf2对RTAEC上清中CAT、MDA、T-AOC、GSH表达的影响，其中(a)CAT的含量；(b)MDA的含量；(c)T-AOC的含量；(d)GSH的含量；
图6为SiNrf2对LBP降低RTAEC中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平的影响；其中(a)TNF-α的mRNA表达水平；(b)IL-6的mRNA表达水平；(c)IL-1β的mRNA表达水平；
图7为SiNrf2对LBP降低RTAEC中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平的曲线图；
图8为SiNrf2对LBP降低RTAEC中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平的影响，其中，(a)Blank组；(b)空白对照组；(c)AngⅡ组；(d)AngⅡ+LBP组；(e)SiNC组；(f)SiNC+AngⅡ+LBP组；(g)SiRNA组；(h)SiRNA+AngⅡ+LBP组；
图9为SiNrf2对LBP降低RTAEC的TNF-α阳性细胞数的影响；
说明：#：P＜0.05；##：P＜0.01；###：P＜0.001；*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001；▲：P＜0.05；●：P＜0.05；●●：P＜0.01；＄：P＜0.05；＄＄：P＜0.01；※：P＜0.05；※※※：P＜0.001。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
内皮细胞位于心血管系统的最内层，参与各种生化和生物力学信号传导，当其暴露在来自循环或微环境的有害物质刺激下，表现出血管张力受损、内皮通透性增加、血管生态失衡，以上因素共同促进了血管疾病的发展。研究表明：氧化应激所致的内皮细胞损伤是心血管疾病发生的重要机制之一。
实施例
第一组试验(转染效率的检测)
实验设计以有无riboFECTTM CP Reagent LP2000为脂质体的情况下，把带有红色荧光的siRNA与RTAEC(大鼠胸主动脉内皮细胞)放入细胞培养板进行共同培养，通过前期反复实验观察，设置浓度和时间梯度筛选最佳转染浓度和时间，结果显示在转染浓度50nmol、转染后24h，细胞转染效率最高，故以此条件为标准进行后续相关转染实验。其分组情况为空白对照组、脂质体2000(LiPofectamine2000，LP2000)(－)组、LP2000(+)组。
参考图1，荧光标记的SiRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法，荧光标记的SiRNA是检测转染效率、优化转染方法最常用的一种方法，转染后24h通过荧光显微镜观察到的结果，暗场所显示的是荧光显微镜下观察到的带有红色荧光的siRNA转染成功的细胞。明场所显示的是透光显微镜下的总细胞。暗场中的红色细胞占明场中总细胞数的百分比为转染效率。从图1中可以看出，转染效率高达80％以上，可进行后续相关实验。
第二组实验(筛选最佳SiRNA)
通过Western Blot(蛋白质的电泳分离)检测Nrf2、P-Nrf2的蛋白表达水平；通过RT-qPCR检测Nrf2的蛋白表达水平。
其分组情况：空白对照组、SiNC组、SiRNA3组、SiRNA4组、SiRNA5组，进行体外细胞实验。
参考图2，Western Blot(蛋白质的电泳分离)结果显示：与空白对照组比较，SiRNA3、SiRNA4、SiRNA5组的Nrf2的蛋白表达均降低，但SiRNA5组的Nrf2蛋白表达降低更明显(P＜0.05)，与SiNC组比较，SiRNA3、SiRNA4、SiRNA5组的Nrf2的蛋白表达均降低，但SiRNA5组的Nrf2蛋白表达降低更明显(P＜0.05)，SiRNA3、SiRNA4、SiRNA5组的P-Nrf2的蛋白表达均降低，且SiRNA3组的P-Nrf2的蛋白表达降低(P＜0.05)，SiRNA5组的P-Nrf2的蛋白表达降低(P＜0.01)。通过蛋白水平结果，筛选出最佳的SiRNA组别，即SiRNA5。
参考图3，RT-qPCR(实时荧光定量PCR)结果显示：与空白对照组比较，SiRNA3组的Nrf2的mRNA表达降低(P＜0.05)，SiRNA4组的Nrf2的mRNA蛋白表达降低(P＜0.05)，但SiRNA5组的Nrf2的mRNA表达降低更明显(P＜0.05)。从mRNA表达水平筛选出最佳的SiRNA组，同蛋白水平一致即SiRNA5。
第三组试验(沉默Nrf2基因)
在体内水平实验研究中，力竭运动大鼠体内AngⅡ水平出现了一个明显的升高，同时有研究表明：内皮细胞生长因子血管紧张素AngⅠ和Ⅱ与内皮细胞上的受体结合共同维持血管内环境的稳定，与AngⅠ相反，AngⅡ结合会导致血管不稳定和炎症，以及课题组前期选用AngⅡ作为细胞氧化应激模型制备的刺激因素，因此，体外水平实验选用AngⅡ进行内皮细胞氧化应激的模型制备。
分组情况：空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+LBP组、SiNC组、SiNC+AngⅡ+LBP组、SiRNA组、SiRNA+AngⅡ+LBP组。
SiNrf2对RTAEC中Nrf2、P-Nrf2蛋白表达的影响
Western Blot(蛋白质的电泳分离)检测AngⅡ+LBP组和SiRNA+AngⅡ+LBP组Nrf2、P-Nrf2的蛋白表达水平如图4所示，结果表明：与AngⅡ+LBP组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组的Nrf2蛋白表达下降(P＜0.05)，P-Nrf2的蛋白表达下降。
SiNrf2对LBP降低RTAEC上清氧化应激指标表达水平的影响
ELISA检测GSH、MDA、T-AOC、CAT的含量变化如图5所示，结果表明，与空白对照组比较，AngⅡ组CAT、T-AOC表达水平降低(P＜0.01，P＜0.05)，MDA表达水平升高，GSH表达水平降低。与AngⅡ组比较，AngⅡ+LBP组CAT、T-AOC、GSH表达水平升高(P＜0.05)，MDA表达水平降低。与AngⅡ+LBP组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组的CAT、T-AOC、GSH表达水平降低(P＜0.01)，MDA的表达水平升高(P＜0.05)。与SiNC+AngⅡ+LBP组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组MDA表达水平升高，GSH表达水平下降(P＜0.05)，T-AOC的表达水平降低。
结果发现：AngⅡ组MDA表达升高，CAT、T-AOC、GSH表达下降，同时，TNF-α蛋白表达升高，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达升高，在LBP干预后可以将此作用反转。与AngⅡ组比较，AngⅡ+LBP组的Nrf2、GCLC、NQO1和GCLM蛋白表达水平以及mRNA表达升高，AngⅡ组的Nrf2和GCLM的阳性表达下降，LBP干预后出现了升高。
该部分的研究结果表明：LBP可增强Keap1/Nrf2抗氧化应激信号通路减轻内皮细胞的氧化应激状态。
SiNrf2对LBP降低RTAEC中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA表达水平的影响
RT-qPCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表达水平如图6和7所示，结果表明：与空白对照组比较，AngⅡ组TNF-α的表达升高(P＜0.05)，IL-6、IL-1β的表达升高(P＜0.01)。与AngⅡ组比较，AngⅡ+LBP组TNF-α的表达降低，IL-6的表达降低(P＜0.01)，IL-1β的表达降低(P＜0.001)。与AngⅡ+LBP组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组TNF-α、IL-6、IL-1β的表达升高(P＜0.05)。与SiNC+AngⅡ+LBP组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组TNF-α表达升高(P＜0.05)。与SiRNA组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组TNF-αIL-1β表达升高(P＜0.05)，IL-6表达升高(P＜0.01)。
SiNrf2对LBP降低RTAEC的TNF-α阳性细胞数的影响
流式细胞术检测TNF-α的阳性细胞数如图9所示，结果表明：与空白对照组比较，AngⅡ组TNF-α的表达升高(P＜0.01)。与SiNC组比较，SiNC+AngⅡ+LBP组TNF-α的表达降低(P＜0.001)。与AngⅡ+LBP组比较，SiRNA+AngⅡ+LBP组TNF-α表达升高(P＜0.001)。
该部分的研究结果表明：LBP可增强Keap1/Nrf2抗氧化应激信号通路减轻内皮细胞炎症反应。
图8-9为流式细胞术检测SiNrf2对RTAEC中TNF-α表达的影响。其中，图8为单个实验组的结果显示图，图9为所有实验组及空白对照组的显示结果。
通过上述研究结果，进一步表明：SiNrf2转染内皮细胞后Nrf2的总蛋白以及磷酸化蛋白的表达均下降，同时，LBP所表现出的抗炎和氧化应激作用能被SiNrf2减弱，提示LBP可以改善由AngⅡ导致的内皮细胞氧化应激指标以及炎症因子的升高。说明LBP通过增强内皮细胞当中的Keap1/Nrf2抗氧化应激信号通路的表达提高内皮抗氧化能力，进而改善心血管系统的抗氧化应激状态起到保护心血管系统的作用。
Claims (10)
1.枸杞多糖在制备舒张胸主动脉药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，通过调节PKeap1/Nrf2抗氧化应激信号通路蛋白的表达增加，改善由血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞氧化应激损伤的作用。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的扩张胸主动脉药物为治疗血管内皮细胞功能障碍性心血管疾病的药物制剂。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的枸杞多糖与药学上可接受的辅料制成药物制剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的药物制剂为口服制剂或注射制剂。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的口服剂为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂或混悬剂。
7.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述注射制剂为输液或注射剂。
8.一种舒张胸主动脉药物，其特征在于，所述的药物是以枸杞多糖作为唯一活性成分，或以包含枸杞多糖的药物组合物作为活性成分。
9.根据权利要求8所述的一种舒张胸主动脉药物，其特征在于，所述的药物添加药学上可接受的辅料制成临床应用的药物制剂。
10.根据权利要求9所述的一种舒张胸主动脉药物，其特征在于，所述的药物制剂包括口服制剂或注射制剂。
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Cited By (1)
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| CN114656577A (zh) * | 2022-05-05 | 2022-06-24 | 中国科学院兰州化学物理研究所 | 一种通过抑制氧化应激发挥防治脑卒中效果的中性均一枸杞多糖 |
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