CN116832088B - 蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用，属于药物技术领域。本发明通过蛇莓提取物干预便秘，结果发现蛇莓提取物可以增加粪便中的含水量，提高肠道推动能力，增加排便的数量，从而缓解便秘症状。同时，蛇莓提取物也可以调节与胃肠动力相关基因的表达，改善肠道功能，缓解肠道炎症。

Description

蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，特别涉及蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用。

背景技术

便秘是生活中最常见的胃肠道疾病之一，其症状大致为困难、不频繁或不完全排便，主要影响大肠，肛门等器官。便秘病因明确，与结肠的传输或排便功能的紊乱、肠道疾病、内分泌疾病、神经系统疾病、肌肉疾病等有关，常常是多因素共同作用的结果。虽然大部分患者通过正规治疗，增加运动量和膳食纤维的摄入量，便秘的症状能够缓解，但仍然有部分症状严重的患者在经过治疗后复发。因此，便秘的治疗仍然存在一定的挑战性，开发有效的治疗方法不仅可以减少对患者的影响，而且还能减轻医疗负担，将具有重大的意义。

蛇莓为蔷薇科蛇莓属植物，生活力强，喜温暖湿润环境，耐旱，耐瘠，并且对土壤要求不严，所以适宜栽在斜坡作地被植物。作为中草药，有清热解毒，凉血止血，散瘀消肿的功效，研究表明，蛇莓有多种活性成分，包括黄酮类、生育酚、多糖、萜类等，药理作用有抗癌，增强免疫功能、抗炎、抑菌、抗氧化等作用。主要应用于抑制肿瘤细胞增殖和生长，诱导癌细胞凋亡。还可用作天然植物杀菌剂。但其是否具有便秘缓解功效还未见文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用，本发明提供的蛇莓提取物可显著促进小肠推进率，增加排便的数量，降低粪便的失水率，缓解便秘。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用。

本发明还提供一种蛇莓提取物在制备肠道推进药物中的应用。

本发明还提供一种蛇莓提取物在制备提高干细胞因子受体c-Kit药物中的应用。

本发明还提供一种蛇莓提取物在制备调节胃肠激素分泌药物中的应用。

优选地，所述蛇莓提取物为蛇莓的醇提取物。

优选地，所述蛇莓的醇提取物的制备方法包括以下步骤：

S1、选取新鲜蛇莓，真空冷冻干燥后粉碎，得蛇莓粉；

S2、按比例加入乙醇溶液，水浴加热回流后常温超声回流，过滤，得滤液和滤渣；

S3、取滤渣，重复S2两次，合并三次所得的滤液，过滤，旋蒸至乙醇除尽，分装后4℃保藏。

优选地，所述S2中的乙醇的体积分数为75％。

优选地，所述S2中的比例为蛇莓和乙醇的g：mL比为(0.8～1.2)：(18～22)。

优选地，所述S2中的水浴加热回流为65℃～75℃水浴加热回流55min～65min。

优选地，所述S2中的常温超声回流为常温、80W下超声回流45min～55min。

有益技术效果：本发明提供了一种蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用，本发明通过蛇莓提取物干预便秘，结果发现蛇莓提取物可以增加粪便中的含水量，提高肠道推动能力，增加排便的数量，从而缓解便秘症状。同时，蛇莓提取物也可以调节与胃肠动力相关基因的表达，改善肠道功能，缓解肠道炎症。

附图说明

图1为实验流程图；

图2为血清中相关水平检测的操作步骤；

图3为提取细胞RNA的操作步骤；

图4为肠道推进率；其中，NC,正常组；GM，模型组；DF-H，蛇莓提取物高剂量组；DF-L，蛇莓提取物低剂量组；BC，比沙可啶药物对照组；

图5为小肠H&E染色；其中，NC,正常组；GM，模型组；DF-H，蛇莓提取物高剂量组；DF-L，蛇莓提取物低剂量组；BC，比沙可啶药物对照组；

图6为小肠中mRNA表达；其中，NC,正常组；GM，模型组；DF-H，蛇莓提取物高剂量组；DF-L，蛇莓提取物低剂量组；BC，比沙可啶药物对照组。

具体实施方式

本发明提供了一种蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用。

在本发明中，所述蛇莓提取物可以增加粪便中的含水量，提高肠道推动能力，增加排便的数量，从而缓解便秘症状。

在本发明中，对所述药物的剂型没有特殊限定，采用蛇莓提取物在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用相应剂型的制备方法即可。本发明对所述药物中蛇莓提取物的含量没有特殊限定，采用药物中常规活性物质的含量即可。

本发明还提供一种蛇莓提取物在制备肠道推进药物中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型、制备方法和活性成分含量与上述相同，在此不再赘述。本发明所述蛇莓提取物可以促进小肠蠕动，加快肠道内物质在小肠中的推进速度。

本发明还提供一种蛇莓提取物在制备提高干细胞因子受体c-Kit表达量药物中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型、制备方法和活性成分含量与上述相同，在此不再赘述。本发明所述c-Kit受体(CD117)被称为干细胞因子受体，是ICC的特异性标志物，与其配体干细胞因子SCF(stem cell factor)结合所启动的信号通路，对ICC的发育、分化及表型维持有十分重要的意义。Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)是肠神经系统中与肠神经元及平滑肌活动密切相关的间质细胞，它在肠道蠕动中扮演着十分重要的角色，有大量研究证实它对胃肠道动力有重要的调控作用。研究表明与便秘有关的患者结肠组织内ICC数量会出现下降，并认为其数量下降是由于c-Kit表达下调引起的。本发明所述蛇莓提取物可以明显提高c-Kit表达量。

本发明还提供一种蛇莓提取物在制备调节胃肠激素分泌药物中的应用。

在本发明中，所述药物的剂型、制备方法和活性成分含量与上述相同，在此不再赘述。本发明所述胃肠激素是胃肠道神经细胞和内分泌细胞释放的一组小分子活性化学物质，是调节胃肠运动的重要物质，其与靶细胞上的受体结合后，可以通过不同的信号对消化系统起到重要的调节作用，在便秘的发生或者说发展过程中起到重要的作用。例如，SS分泌会导致血管活性肽VIP和神经递质SP的分泌，导致平滑肌松弛，从而影响结肠运动的兴奋性而导致便秘。SP是一种神经递质，会刺激肠道的感觉和运动。而5-HT是广泛在胃肠道黏膜嗜铬细胞之中存在的信号分子，有多种生物学功能，包括参与胃肠道运动、摄食、睡眠等在内的多重生理功能的调控。其合成、释放、与其受体结合等信号传导的任何环节异常均有可能导致胃肠道动力及其分泌功能的异常。本发明所述蛇莓提取物可以显著提高SP、GAS的水平，抑制SS、VIP、5-HT的含量，调节胃肠激素的分泌。

在本发明中，所述蛇莓提取物为蛇莓的醇提取物；所述蛇莓的醇提取物的制备方法优选包括以下步骤：

S1、选取新鲜蛇莓，真空冷冻干燥后粉碎，得蛇莓粉；

S2、按比例加入乙醇溶液，水浴加热回流后常温超声回流，过滤，得滤液和滤渣；

S3、取滤渣，重复S2两次，合并三次所得的滤液，过滤，旋蒸至乙醇除尽，分装后4℃保藏。

在本发明中，所述S2中的乙醇的体积分数优选为75％；所述S2中的比例优选为蛇莓和乙醇的g：mL比为(0.8～1.2)：(18～22)，更优选为1:20。

在本发明中，所述S2中的水浴加热回流优选为65℃～75℃水浴加热回流55min～65min，更优选为70℃水浴加热回流60min；所述S2中的常温超声回流优选为常温、80W下超声回流45min～55min，更优选为常温、80W下超声回流50min。

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。本发明实施例及试验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得；本发明实施例及试验例中所用的方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

1材料和方法

1.1实验动物

六周龄SPF级雌性昆明小鼠40只，均从重庆医科大学购得，在重庆第二师范学院功能性食品协同创新中心的动物实验室饲养，所有实验操作皆遵循《动物实验的伦理准则与指南》，并在获得重庆第二师范学院重庆市功能性食品协同创新中心动物伦理委员会审批后开始实验。

1.2主要试剂

本发明所用主要试剂的规格及来源如表1所示。

表1主要试剂的规格及来源

1.3主要仪器

本发明所用主要仪器的型号及厂家如表2所示。

表2主要仪器的型号及厂家

1.4药物制备

蛇莓提取液：15g蛇莓溶于300mL 75％乙醇中(料液比比1:20)，水浴70℃加热回流60min，然后常温超声回流提取50min，过滤，旋蒸至乙醇除尽，分至试管，放至冰箱4℃冷冻。

盐酸洛哌丁胺混悬液(1mg/mL)：15粒盐酸洛哌丁胺胶囊(2mg/粒)，去除胶囊中粉末于试管混匀，加入无菌水30mL，临用配置。

比沙可啶水溶液(20mg/mL):分析天平称量80mg比沙可啶，置于试管，加入4mL无菌水，混匀，临用配置。

活性炭混悬液(50g/L)：分析天平称量阿拉伯树胶50g，置于烧杯，加水400mL，混匀，煮沸直至溶液透明，称取活性炭25g，加至上述溶液中煮沸三次，溶液凉后，加水定容至500mL，获得活性炭混悬液(50g/L)，放于冰箱4℃保存。

1.5实验流程

实验流程如图1所示。小鼠适应性培养一周后，随机分为五组：正常组(NC)、模型组(GM)、比沙可啶药物治疗组(BC)、蛇莓提取液低剂量组(DF-L)、蛇莓提取液高剂量组(DF-H)，每组八只。第1～3天，除NC组外，其它四组每天两次(上午九点，下午两点)灌胃0.25mL(1mg/mL)盐酸洛哌丁胺混悬液，诱导小鼠功能性便秘，NC组相同时间灌胃0.25mL生理盐水。每天收集两次灌药期间小鼠产生的粪便，称量并记录颗粒数和重量。第三天灌胃完成后，晚上九点之后所有小鼠禁食不禁水，持续时间12小时。从第4天至第10天，DF-L组小鼠每天灌胃蛇莓提取液0.2mL，DF-H组小鼠每天灌胃蛇莓提取液0.25mL，BC组小鼠每天灌胃(20mg/mL)比沙可啶水溶液0.25mL，NC组与GM组小鼠每天相同时间灌胃生理盐水0.25mL，隔天收集并记录相同时间内小鼠粪便数量和重量。

实验周期结束之后，所有小鼠空腹处理过夜，第二天每只灌胃0.25mL活性炭混悬液之后，收集全血，以及肠道组织，以备后续实验。

1.6肠道推进率检测

实验周期结束后，小鼠提前一晚起，禁食不禁水12h，以排空肠道内容物，第二天灌胃0.25mL活性炭混悬液。20min之后，断颈处死小鼠，迅速提取小鼠幽门至肛门的全肠道，无张力拉直后测量肠道全长，观察活性炭在肠道中的推进率。

1.7粪便含水量测定

实验期间，收集小鼠两次给药期间的粪便称重，重量记为W1，放入烘箱干燥脱水，脱水后再次进行称重，重量记为W2，计算粪便含水量(R)：

R＝W2-W1

1.8小肠组织H&E染色

实验周期结束后，取0.5cm的小肠于组织固定液4℃中固定24h，制备H&E染色(Hematoxylin and eosin staining，苏木精-伊红染色)切片，显微镜观察小肠组织的染色切片。

1.9血清中相关水平检测

实验周期结束之后，通过眼眶取血收集小鼠全血，于冰箱4℃静置1h，3000r/min，离心10min获得血清，将所得血清适量分装后放于-80℃冰箱保存备用。按照ELISA试剂盒操作说明，测定血清中p物质(Substance P，SP)，胃泌素(Gastrin，Gas)，生长抑素(Smotostatin，SS)，血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)，五-羟色胺(5-HT)的含量。血清中相关水平检测的操作步骤如图2所示。

1.10荧光定量PCR(RT-qPCR)测定小肠组织中相关基因的mRNA表达

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测小肠组织中Mus，c-kit，NFκB，eNOS，iNOS，nNOS，SCF的mRNA表达。

1.10.1提取细胞RNA

提取细胞RNA的操作步骤如图3所示。

1.10.2RNA纯度鉴定

1μL RNA和49μL DEPC水放入200μL EP管中混匀，混匀后取1μL用微量分光光度计测定RNA的浓度与纯度，如果OD₂₆₀/OD₂₈₀数值在1.8～2.0之间，那么提取的RNA纯度良好。

1.10.3RNA反转录为cDNA

操作步骤如下：

(1)如表3所述体系于离心管中混匀，梯度PCR仪中65℃反应5min

表3PCR反应体系

(2)反应完成后在离心管中继续加入如表4所述试剂：

表4

(3)上述体系混匀之后简短离心，于42℃反应60min，70℃反应5min，提取得到cDNA，于微量分光光度计测定其浓度，保存于-20℃冰箱备用。注：qPCR扩增时需要将cDNA浓度稀释至1μg/μL之后使用。

1.10.4RT-qPCR扩增

(1)八联管中PCR体系如表5所示：

表5八联管中PCR体系

其中，Mus、c-kit、NFκB、eNOS、iNOS、nNOS、SCF的引物序列如表6所示。

表6Mus、c-kit、NFκB、eNOS、iNOS、nNOS、SCF的引物序列

(2)上述体系混匀后简短离心，放入StepOnePlus Real-Time PCR仪上进行扩增检测。

(3)扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸30s，变性-退火-延伸过程进行40次循环。

(4)肌动蛋白(actin)作为标准化内参。使用2^-ΔΔCt方法计算最终的mRNA的表达量。

2实验结果

本发明通过小鼠功能性便秘模型来研究蛇莓提取物的便秘缓解功效，在使用盐酸洛哌丁胺造模后，发现GM组较NC组小鼠三日内排便颗粒数、粪便含水量明显减少，说明该造模方法是成功的。

2.1肠道推进率

肠道推进率如图4所示。由图4可知，GM组小鼠和其余组小鼠相比小肠推进率有缩短的现象，而DF-L、DF-H、BC组小鼠小肠推进率与GM组小鼠相比得到提高，其中DF-H组小鼠效果更为明显。结果说明蛇莓提取物可以促进小肠蠕动，加快活性炭在小肠中的推进速度。

2.2粪便含水量测定

粪便含水量是评价便秘模型造模是否成功的重要指标，便秘患者肠道蠕动功能减弱，粪便干结，导致粪便含水量的减少。粪便含水量记录如表7所示。由表7可以看出，造模期间，除NC组外，其余组小鼠的单颗粪便含水量均呈现出不同程度的下降趋势，至造模最后一天，GM组小鼠粪便含水量显著低于NC组小鼠的粪便含水量，表明建模成功。干预治疗后，DF-L、DF-H、BC组小鼠的粪便含水量与GM组小鼠相比有所提高，且DF-H和BC组小鼠的粪便含水量更接近于NC组的粪便含水量，说明蛇莓提取物可以通过增加小鼠的粪便含水量来改善便秘的症状。同时，实验过程中，蛇莓提取液对小鼠并未造成小鼠腹泻的情况，也无其它不良影响，说明蛇莓提取物对便秘模型小鼠的缓解便秘功效比较温和。

表7粪便含水量记录表

注：NC,正常组；GM，模型组；DF-H，蛇莓提取物高剂量组；DF-L，蛇莓提取物低剂量组；BC，比沙可啶药物对照组

2.3H&E染色

当小肠绒毛受到损伤后，其肠道蠕动功能也会受到不同程度的影响，而肠道蠕动减慢正是引起便秘的因素之一，所以小肠绒毛的完整性对评价便秘也起到十分重要的作用。H&E染色如图5所示，由图5可以看出，NC组小鼠小肠绒毛排列整齐均一，不存在断裂或皱缩现象，杯状细胞丰富。GM组小鼠小肠绒毛出现严重断裂和皱缩，刷状缘杂乱无序，且杯状细胞不完整。虽然DF-L、DF-H组小肠绒毛也存在一定程度的皱缩和断裂，但小肠绒毛明显比GM小鼠的小肠绒毛更为完整，且DF-H组小鼠的小肠绒毛完整性更为明显。

2.4血清指标

胃肠激素通过不同的信号对消化系统的吸收、运动、分泌及免疫产生重要的调节作用，与便秘的发生也密切相关。结果如表8所示，GM组小鼠血清中p物质(Substance P，SP)、和胃泌素(Gastrin，Gas)的含量较NC组小鼠显著降低，生长抑素(Smotostatin，SS)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、五-羟色胺(5-HT)的含量上调。与GM组小鼠相比，DF-L、DF-H、BC组小组的SP、和GAS水平得到了显著提高，而随着灌胃蛇莓提取物浓度的增加，SP的浓度升高更明显。此外，SS、VIP和5-HT的含量下调，下调效果同样呈现剂量依赖效果。该结果说明可以通过灌胃蛇莓提取物调节胃肠激素的分泌，加快胃肠道运输，从而达到缓解便秘的效果。

本发明发现，便秘模型中GAS和SP的含量降低，SS、VIP、5-HT的含量升高，是肠道运动能力减弱的重要指标，DF-L、DF-H、BC组小鼠的相关水平因子含量相比于GM组小鼠，明显提高了SP、GAS的水平，抑制了SS、VIP、5-HT的含量，而且抑制水平与蛇莓提取物灌胃含量存在剂量依赖现象，高剂量的蛇莓提取物对其肠胃激素调剂更为明显。

表8血清激素水平

注：a、b、c小写字母相同表示无显著性差异，p>0.05；NC，正常组；GM，模型组；DF-H，蛇莓提取物高剂量组；DF-L，蛇莓提取物低剂量组；BC，比沙可啶药物对照组。

2.6RT-qPCR

通过RT-qPCR分析便秘小鼠小肠组织中Mus、c-kit、NFκB、eNOS、iNOS、nNOS、SCF的mRNA表达。结果如图6，GM组小鼠小肠组织中NFκB、iNOS、nNOS的表达相对于NC组上调，c-kit、Mus、SCF、eNOS的表达相对于NC下调。与GM相比，DF-L、DF-H、BC组小鼠处理后的小肠组织中NFκB、iNOS、nNOS的表达下调，c-kit、Mus、SCF、eNOS的表达上调，且表达效果随蛇莓提取物浓度的增加而显著。所以该mRNA的表达结果说明给便秘小鼠灌胃蛇莓提取物能对小鼠小肠组织的基因表达产生影响。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.蛇莓提取物在制备缓解便秘药物中的应用，其特征在于，所述蛇莓提取物为蛇莓的醇提取物，所述蛇莓的醇提取物的制备方法包括以下步骤：

S1、选取新鲜蛇莓，真空冷冻干燥后粉碎，得蛇莓粉；

S2、按比例加入乙醇溶液，水浴加热回流后常温超声回流，过滤，得滤液和滤渣；所述乙醇的体积分数为75％，所述比例为蛇莓和乙醇的g：mL比为(0.8～1.2)：(18～22)；水浴加热回流为65℃～75℃水浴加热回流55min～65min；常温超声回流为常温、80W下超声回流45min～55min；

S3、取滤渣，重复S2两次，合并三次所得的滤液，过滤，旋蒸至乙醇除尽，分装后4℃保藏。