CN113549164A - 一种果胶类多糖亚硒酸酯化物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种果胶类多糖亚硒酸酯化物及其制备方法和应用,属于有机合成技术领域。本发明提供了一种果胶类多糖亚硒酸酯化物,果胶类多糖具有显著地抗氧化活性,并且能够络合重金属铅,对重金属导致的细胞氧化损伤有保护作用,具有良好的防治PM2.5重金属损伤的研究前景。且本发明提供的果胶类多糖亚硒酸酯化物作为一种有机硒化合物,能充分发挥硒和多糖的生理活性,使两者的作用相互协调并增强,使得生物活性普遍高于多糖和硒的单独作用。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成技术领域,尤其涉及一种果胶类多糖亚硒酸酯化物及其制备方法和应用。
背景技术
铅Pb是作为雾霾天气中主要的重金属污染元素,可对人体多个系统造成损伤,主要包括神经系统、心血管系统、生殖系统、呼吸系统等,还具有一定的致癌性。研究表明,雾霾中的铅化合物经呼吸系统导入肺部,可引起肺脏的实质性损伤、氧化损伤以及炎性损伤,并能快速进入血液循环,导致血铅含量上升,并表现出临床性肺慢阻症状。而且,铅造成的肺泡上皮细胞氧化应激损伤,被证实通过其旁观者效应而被放大,造成更严重的肺组织损伤。铅化合物能够显著增加肺泡上皮细胞内ROS自由基的产生、降低抗氧化关键酶活性、破坏线粒体功能、抑制Caspase级联反应活化,进而导致肺泡上皮细胞死亡。而肺泡上皮细胞死亡被认为是肺组织功能结构损伤的重要原因之一。因此,铅化合物所造成的肺损伤将成为PM2.5健康危害防治的重点研究方向。
但是,到目前为止,对于铅化合物直接入肺导致的肺损伤的治疗还没有有效地治疗药物。临床证实保护性机械通气治疗可以降低患者的死亡率,药物如β2受体激动剂、他汀类药物尽管动物试验或某些临床试验提示有效,但III期临床试验并不支持常规使用这些药物。镇静治疗被严重低估,且丙泊酚、咪哇安定等药物存在不足。抗炎治疗未取得突破,且单一药物治疗效果差。因此,寻求不同药理作用的药物治疗显得尤为重要。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种果胶类多糖亚硒酸酯化物及其制备方法和应用。本发明提供的果胶类多糖亚硒酸酯化物对重金属铅导致的细胞氧化损伤有保护作用,具有良好的防治PM2.5重金属损伤的研究前景。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了一种果胶类多糖亚硒酸酯化物,具有式I所示的结构:
其中n为5~1000。
优选地,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物中硒元素的含量为0.2~1.0mg/g。
优选地,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的总糖含量为90wt%~100wt%。
优选地,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的半乳糖醛酸含量为90wt%~100wt%。
优选地,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物中糖残基的构型和糖苷键为→1)-β-D-GalpA-(4→。
本发明还提供了上述技术方案所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物的制备方法,包括以下步骤:
将果胶类多糖与HNO3水溶液混合,得到果胶类多糖溶液;
将所述果胶类多糖溶液和氯化钡混合,得到混合液;
将所述混合液与Na2SeO3溶液混合进行酯化反应,得到上清液;
将所述上清液透析,得到所述果胶类多糖亚硒酸酯化物。
优选地,所述果胶类多糖与HNO3水溶液的料液比为1~20mg:1mL,所述HNO3水溶液的质量浓度为0.1%~1.0%。
优选地,所述Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液的体积比为1:20~1:10,所述Na2SeO3溶液的浓度为1~10mg/mL。
优选地,所述酯化反应的温度为60~90℃,时间为8~12h。
本发明还提供了上述技术方案所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物或上述技术方案所述制备方法制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物在制备铅所致肺损伤功效的药物中的应用。
本发明提供了一种果胶类多糖亚硒酸酯化物,果胶类多糖具有显著地抗氧化活性,并且能够络合重金属铅,对重金属导致的细胞氧化损伤有保护作用,具有良好的防治PM2.5重金属损伤的研究前景。且本发明提供的果胶类多糖亚硒酸酯化物作为一种有机硒化合物,能充分发挥硒和多糖的生理活性,使两者的作用相互协调并增强,使得生物活性普遍高于多糖和硒的单独作用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)首次证实果胶类多糖亚硒酸酯化物对铅化合物所致肺损伤的治疗作用;
(2)果胶类多糖亚硒酸酯化物对于硫酸铅造成的大鼠亚急性肺损伤具有显著治疗作用;
(3)果胶类多糖亚硒酸酯化物对于乙酸铅所致的肺泡上皮细胞(ATⅡ)损伤具有显著保护作用。
本发明提供的果胶类多糖亚硒酸酯化物与其对应的未修饰果胶类多糖产品相比,具有以下优点:
(1)果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤的保护作用更显著。
(2)果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤的治疗作用更显著。
实施例的数据表明,本发明提供的果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤具有显著的保护作用:果胶类多糖亚硒酸酯化物与0.4mM乙酸铅共同作用A549细胞24h,果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅诱导的A549细胞损伤保护作用EC50≤0.5μg/mL,对乙酸铅诱导的A549细胞损伤的细胞毒作用IC50≤600μg/mL;果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤具有显著的治疗作用:大鼠非暴露性气管滴注0.5mg/kg.bw硫酸铅,连续染毒3次,每次间隔24h后,口服灌胃给予50mg/kg.bw果胶类多糖亚硒酸酯化物,连续给药7天。与不给与果胶类多糖亚硒酸酯化物的大鼠亚急性肺损伤模型对照组相比,给药组大最大自主通气量(MVV)和呼气流量峰值(PEF)分别增加10%以上和5%以上;支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量下降40%以上,白蛋白(ALB)含量下降30%以上,乳酸脱氢酶(LDH)含量下降15%以上,碱性磷酸酶(AKP)含量下降30%以上,丙二醛(MDA)含量下降20%以上;肺组织结构完整程度和炎症程度均有改善。
本发明还提供了上述技术方案所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的制备方法,本发明提供的制备方法步骤简单,流程短,产率高。
附图说明
图1为实施例1制备的果胶类多糖亚硒酸酯化物的红外光谱图;
图2为实施例1制备的果胶类多糖亚硒酸酯化物的X射线光电子能谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种果胶类多糖亚硒酸酯化物,具有式I所示的结构:
其中n为5~1000。
在本发明中,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物中硒元素的含量优选为0.2~1.0mg/g,更优选为0.2~0.5mg/g,更优选为0.22、0.48、0.35、0.37或0.41mg/g,测定方法参照GaoJ,Qin S,Huang K(2006)Assay of organic selenium and inorganic selenium ofenriched yeast by hydride generation atomic fluorescence spectrometrymethod.Journal ofAnalytical Science 22:157~159。
在本发明中,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的总糖含量优选为90wt%~100wt%,更优选为92.3wt%、97.5wt%、95.7wt%、97.7wt%或99.2wt%,测定方法参照Dubois M,Gilles KA,Hamilton JK,et al.Colorimetric methodfor determination of sugars and related substances[J].Analytical Chemistry,1956,28:350~356。
在本发明中,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的半乳糖醛酸含量优选为90wt%~100wt%,更优选为90.5wt%、95.3wt%、93.8wt%、92.1wt%或97.5wt%,测定方法参照Blumenkrantz,N.,Asboe Hansen,G.,1973.New method forquantitative determination of uronic acids.Analytical Biochemistry 54,484~489。
在本发明中,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的蛋白质含量优选为0~1wt%,更优选为0.2wt%、0.1wt%或0.02wt%,测定方法参照Sedmark JJ,Grossberg SE.A rapid,sensitive,and versatile assay forprotein using Coomassie brilliantblue G250[J].Analytical Biochemistry,1979,79:544-552。
在本发明中,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物中糖残基的构型和糖苷键优选为→1)-β-D-GalpA-(4→,测定方法参照Wang H,Gao T,Du Y,et al.Anticancer andimmunostimulating activities of a novelhomogalacturonan from Hippophaerhamnoides L.berry[J].Carbohydrate Polymers.2015,131:288~296.。
本发明还提供了上述技术方案所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物的制备方法,包括以下步骤:
将果胶类多糖与HNO3水溶液混合,得到果胶类多糖溶液;
将所述果胶类多糖溶液和氯化钡混合,得到混合液;
将所述混合液与Na2SeO3溶液混合进行酯化反应,得到上清液;
将所述上清液透析,得到所述果胶类多糖亚硒酸酯化物。
在本发明中,若无特殊说明,使用的原料均为本领域市售商品。
本发明将果胶类多糖与HNO3水溶液混合,得到果胶类多糖溶液。
在本发明中,所述果胶类多糖与HNO3水溶液的料液比优选为1~20mg:1mL,所述HNO3水溶液的质量浓度优选为0.1%~1.0%,更优选为0.4%~0.9%,最优选为0.5%,所述HNO3水溶液的作用是使果胶类多糖溶解。
在本发明中,所述果胶类多糖的结构式优选如式II所示:
其中n为5~1000。
在本发明中,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖的总糖含量优选为90wt%~100wt%,更优选为92.3wt%、97.5wt%、95.7wt%、97.7wt%或99.2wt%,测定方法优选与上述方案一致,在此不再赘述。
在本发明中,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖的半乳糖醛酸含量优选为90wt%~100wt%,更优选为90.5wt%、95.3wt%、93.8wt%、92.1wt%或97.5wt%,测定方法优选与上述方案一致,在此不再赘述。
在本发明中,所述果胶类多糖的蛋白质含量优选为0~1wt%,更优选为0.2wt%、0.1wt%或0.02wt%,测定方法优选与上述方案一致,在此不再赘述。
在本发明中,所述果胶类多糖中糖残基的构型和糖苷键优选为→1)-β-D-GalpA-(4→,测定方法优选与上述方案一致,在此不再赘述。
在本发明中,所述混合的方式优选为搅拌,所述搅拌的转速优选为200~500转/分钟,时间优选为10~30分钟。
得到果胶类多糖溶液后,本发明将所述果胶类多糖溶液和氯化钡混合,得到混合液。
在本发明中,所述氯化钡为催化剂。
本发明优选按照料液比5:1~20:1(mg/mL)加入BaC12,更优选为10:1~19:1(mg/mL),最优选为12:1(mg/mL)。
在本发明中,所述混合优选为搅拌,所述搅拌的转速优选为200~500转/分钟,时间优选为5~10分钟。
得到混合液后,本发明将所述混合液与Na2SeO3溶液混合进行酯化反应,得到上清液。
在本发明中,所述Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液的体积比优选为1:20~1:10,更优选为1:19~1:11,最优选为1:15,所述Na2SeO3溶液的浓度优选为1~10mg/mL,更优选为5~9mg/mL,最优选为7mg/mL。
在本发明中,所述酯化反应的温度优选为60~90℃,更优选为80~89℃,最优选为83℃,时间优选为8~12h,更优选为9~11h,最优选为10h。
在本发明中,所述酯化反应优选在搅拌的条件下进行,所述搅拌的转速优选为200~500转/分钟。
所述酯化反应完成后,本发明优选将所得反应液自然冷却至室温后,加入碳酸钠,调节溶液pH值至5~6,终止酯化反应,所述pH值更优选为5.1~5.5,最优选为5.2。
所述酯化反应终止后,本发明优选还将所得终止体系与Na2SO4或K2SO4混合后离心,收集液体,得到所述上清液。在本发明中,所述Na2SO4或K2SO4的作用是除去BaC12。
在本发明中,所述离心的转速优选为4000~10000转/分钟,时间优选为15~60min。
得到上清液后,本发明将所述上清液透析,得到所述果胶类多糖亚硒酸酯化物。在本发明中,所述透析的作用是去除Na+、Cl-、未反应完全的SeO3 2-杂质。
在本发明中,所述透析优选在透析袋中进行,所述透析袋优选为再生纤维素膜或纤维素酯膜,所述透析袋的截留分子量优选为500~10000Da,更优选为1000~5000Da,最优选为3500Da。
在本发明中,所述透析的过程优选依次包括流水透析和蒸馏水透析,所述流水透析的时间优选为12~48h,更优选为24~44h,最优选为26h,所述蒸馏水透析的时间优选为12~24h,更优选为17~23h,最优选为18h。
所述透析完成后,本发明优选将透析袋内溶液浓缩至原体积的1/5~1/10,冷冻干燥,得到所述果胶类多糖亚硒酸酯化物,在本发明中,所述冷冻干燥的冷阱温度优选<-60℃,真空度优选<15Pa,所述冷冻干燥优选在北京博医康实验仪器有限公司的FD-1型真空冷冻干燥机中进行。
在本发明中,所述浓缩更优选至原体积的1/6~1/9,最优选为1/8。
在本发明中,所述冷阱温度更优选为-62、-73.5、-69.5、-82或-65.5℃,真空度更优选为10.3、5.5、3.2、3或14.7Pa。
本发明还提供了上述技术方案所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物或上述技术方案所述制备方法制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物在制备铅所致肺损伤功效的药物中的应用。本发明对所述应用的具体方式没有特殊的限定,采用本领域技术人员熟知的方式即可。
为了进一步说明本发明,下面结合实例对本发明提供的果胶类多糖亚硒酸酯化物及其制备方法和应用进行详细地描述,但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)果胶类多糖(来源:沙棘果实,制备方法参照CN 104997034 A中的方法,CN104997034 A中的抗氧化沙棘HG型果胶膳食纤维记为本实施例使用的果胶类多糖,结构如式II所示,其中n为261,Mw为91.87kDa,总糖含量92.3wt%,半乳糖醛酸含量90.5wt%,蛋白质含量0.2wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→),按照料液比1:1(mg/mL),加入0.1wt%浓度HNO3水溶液,搅拌(200转/分钟)30分钟,使果胶类多糖充分溶解。
(2)按照料液比5:1(mg/mL)加入BaC12粉末,搅拌(200转/分钟)10分钟,室温充分溶解;
(3)按照Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液1:20体积比,滴加1mg/mL的Na2SeO3水溶液,60℃条件下,搅拌(200转/分钟)反应8h;
(4)反应液冷却至室温后,加入无水碳酸钠粉末,调节溶液pH值至5;
(5)加入与BaC12等物质量(摩尔质量)的Na2SO4粉末,4000转/分钟,离心60min,去除沉淀,收集上清液;
(6)上清液装入透析袋(再生纤维素膜,截留分子量500Da),流水透析12h,随后蒸馏水透析24h;
(7)透析袋内溶液浓缩至原体积的1/5,冷冻干燥(冷阱温度-62℃,真空度10.3Pa,北京博医康实验仪器有限公司,FD-1型真空冷冻干燥机)得到果胶类多糖亚硒酸酯化物(沙棘果胶类多糖亚硒酸酯化物),原子荧光光谱法检测硒元素含量为0.22mg/g。
图1为实施例1制备的果胶类多糖亚硒酸酯化物的红外光谱图;
图2为实施例1制备的果胶类多糖亚硒酸酯化物的X射线光电子能谱图。
本实施例制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物的结构式如式I所示,其中n为261,总糖含量92.3wt%,半乳糖醛酸含量90.5wt%,蛋白质含量0.2wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→)。
(8)果胶类多糖糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤具有显著的保护作用:果胶类多糖亚硒酸酯化物与0.4mM乙酸铅共同作用A549细胞24h,果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅诱导的A549细胞损伤保护作用EC50为0.48μg/mL,对乙酸铅诱导的A549细胞损伤的细胞毒作用IC50为574.1μg/mL。
(9)果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤具有显著的治疗作用:大鼠非暴露性气管滴注0.5mg/kg.bw硫酸铅,连续染毒3次,每次间隔24h后,口服灌胃给予50mg/kg.bw果胶类多糖亚硒酸酯化物,连续给药7天。与不给与果胶类多糖亚硒酸酯化物的大鼠亚急性肺损伤模型对照组相比,给药组大鼠最大自主通气量(MVV)和呼气流量峰值(PEF)分别增加12.1%和5.9%;支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量下降42.2%,白蛋白(ALB)含量下降35.3%,乳酸脱氢酶(LDH)含量下降16.5%,碱性磷酸酶(AKP)含量下降35.1%,丙二醛(MDA)含量下降22.7%;肺组织结构完整程度和炎症程度均有改善。
实施例2
(1)果胶类多糖(来源:苹果,结构如式II所示,其中n为42,Mw为14.78kDa,总糖含量97.5wt%,半乳糖醛酸含量95.3wt%,蛋白质含量0.1wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→),按照料液比20:1(mg/mL),加入1.0wt%浓度HNO3水溶液,搅拌(500转/分钟)10分钟,使果胶类多糖充分溶解。
(2)按照料液比20:1(mg/mL)加入BaC12粉末,搅拌(500转/分钟)5分钟,室温充分溶解;
(3)按照Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液1:10体积比,滴加10mg/mL的Na2SeO3水溶液,60℃条件下,搅拌(500转/分钟)反应12h;
(4)反应液冷却至室温后,加入无水碳酸钠粉末,调节溶液pH值至6;
(5)加入与BaC12等物质量(摩尔质量)的Na2SO4粉末,10000转/分钟,离心15min,去除沉淀,收集上清液;
(6)上清液装入透析袋(纤维素酯膜,截留分子量10000Da),流水透析48h,随后蒸馏水透析24h;
(7)透析袋内溶液浓缩至原体积的1/10,冷冻干燥(冷阱温度-73.5℃,真空度5.5Pa,北京博医康实验仪器有限公司,FD-1型真空冷冻干燥机)得到果胶类多糖亚硒酸酯化物,其硒元素含量为0.48mg/g。
本实施例制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物的结构式如式I所示,其中n为42,总糖含量97.5wt%,半乳糖醛酸含量95.3wt%,蛋白质含量0.1wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→)。
(8)果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤具有显著的保护作用:果胶类多糖亚硒酸酯化物与0.4mM乙酸铅共同作用A549细胞24h,果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅诱导的A549细胞损伤保护作用EC50为0.35μg/mL,对乙酸铅诱导的A549细胞损伤的细胞毒作用IC50为331.7μg/mL。
(9)果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤具有显著的治疗作用:大鼠非暴露性气管滴注0.5mg/kg.bw硫酸铅,连续染毒3次,每次间隔24h后,口服灌胃给予50mg/kg.bw果胶类多糖亚硒酸酯化物,连续给药7天。与不给与果胶类多糖亚硒酸酯化物的大鼠亚急性肺损伤模型对照组相比,给药组大鼠最大自主通气量(MVV)和呼气流量峰值(PEF)分别增加20.5%和10.2%;支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量下降67.3%,白蛋白(ALB)含量下降44.6%,乳酸脱氢酶(LDH)含量下降23.5%,碱性磷酸酶(AKP)含量下降41.9%,丙二醛(MDA)含量下降29.6%;肺组织结构完整程度和炎症程度均有改善。
实施例3:
(1)果胶类多糖(来源:柑橘,结构如式II所示,其中n为224,Mw为Mw 78.85kDa,总糖含量95.7wt%,半乳糖醛酸含量95.8wt%,蛋白质含量0.1wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→),按照料液比10:1(mg/mL),加入0.5wt%浓度HNO3水溶液,搅拌(350转/分钟)20分钟,使果胶类多糖充分溶解。
(2)按照料液比10:1(mg/mL)加入BaC12粉末,搅拌(400转/分钟)80分钟,室温充分溶解;
(3)按照Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液1:15体积比,滴加5mg/mL的Na2SeO3水溶液,80℃条件下,搅拌(300转/分钟)反应10h;
(4)反应液冷却至室温后,加入无水碳酸钠粉末,调节溶液pH值至5.5;
(5)加入与BaC12等物质量(摩尔质量)的Na2SO4粉末,8000转/分钟,离心30min,去除沉淀,收集上清液;
(6)上清液装入透析袋(再生纤维素膜,截留分子量3500Da),流水透析24h,随后蒸馏水透析18h;
(7)透析袋内溶液浓缩至原体积的1/8,冷冻干燥(冷阱温度-69.5℃,真空度3.2Pa,北京博医康实验仪器有限公司,FD-1型真空冷冻干燥机)得到果胶类多糖亚硒酸酯化物,其硒元素含量为0.35mg/g。
本实施例制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物的结构式如式I所示,其中n为224,总糖含量95.7wt%,半乳糖醛酸含量95.8wt%,蛋白质含量0.1wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→)。
(8)果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤具有显著的保护作用:果胶类多糖亚硒酸酯化物与0.4mM乙酸铅共同作用A549细胞24h,果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅诱导的A549细胞损伤保护作用EC50为0.41μg/mL,对乙酸铅诱导的A549细胞损伤的细胞毒作用IC50为392.8μg/mL。
(9)果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤具有显著的治疗作用:大鼠非暴露性气管滴注0.5mg/kg.bw硫酸铅,连续染毒3次,每次间隔24h后,口服灌胃给予50mg/kg.bw果胶类多糖亚硒酸酯化物,连续给药7天。与不给与果胶类多糖亚硒酸酯化物的大鼠亚急性肺损伤模型对照组相比,给药组大鼠最大自主通气量(MVV)和呼气流量峰值(PEF)分别增加17.3%和11.1%;支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量下降45.2%,白蛋白(ALB)含量下降37.6%,乳酸脱氢酶(LDH)含量下降21.3%,碱性磷酸酶(AKP)含量下降37.8%,丙二醛(MDA)含量下降27.4%;肺组织结构完整程度和炎症程度均有改善。
实施例4:
(1)果胶类多糖(来源:枸杞子,结构如式II所示,其中n为36,Mw为12.67Da,总糖含量93.7wt%,半乳糖醛酸含量92.1wt%,蛋白质含量0.1wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→),按照料液比13:1(mg/mL),加入0.4wt%浓度HNO3水溶液,搅拌(320转/分钟)23分钟,使果胶类多糖充分溶解。
(2)按照料液比12:1(mg/mL)加入BaC12粉末,搅拌(410转/分钟)9分钟,室温充分溶解;
(3)按照Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液1:11体积比,滴加7mg/mL的Na2SeO3水溶液,83℃条件下,搅拌(220转/分钟)反应11h;
(4)反应液冷却至室温后,加入无水碳酸钠粉末,调节溶液pH值至5.2;
(5)加入与BaC12等物质量(摩尔质量)的Na2SO4粉末,5500转/分钟,离心43min,去除沉淀,收集上清液;
(6)上清液装入透析袋(纤维素酯膜,截留分子量5000Da),流水透析26h,随后蒸馏水透析17h;
(7)透析袋内溶液浓缩至原体积的1/6,冷冻干燥(冷阱温度-82℃,真空度3Pa,北京博医康实验仪器有限公司,FD-1型真空冷冻干燥机)得到果胶类多糖亚硒酸酯化物,其硒元素含量为0.37mg/g。
本实施例制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物的结构式如式I所示,其中n为36,总糖含量93.7wt%,半乳糖醛酸含量92.1wt%,蛋白质含量0.1wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→)。
(8)果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤具有显著的保护作用:果胶类多糖亚硒酸酯化物与0.4mM乙酸铅共同作用A549细胞24h,果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅诱导的A549细胞损伤保护作用EC50为0.29μg/mL,对乙酸铅诱导的A549细胞损伤的细胞毒作用IC50为402.7μg/mL。
(9)果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤具有显著的治疗作用:大鼠非暴露性气管滴注0.5mg/kg.bw硫酸铅,连续染毒3次,每次间隔24h后,口服灌胃给予50mg/kg.bw果胶类多糖亚硒酸酯化物,连续给药7天。与不给与果胶类多糖亚硒酸酯化物的大鼠亚急性肺损伤模型对照组相比,给药组大鼠最大自主通气量(MVV)和呼气流量峰值(PEF)分别增加19.1%和7.7%;支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量下降49.6%,白蛋白(ALB)含量下降35.2%,乳酸脱氢酶(LDH)含量下降17.8%,碱性磷酸酶(AKP)含量下降36.7%,丙二醛(MDA)含量下降25.4%;肺组织结构完整程度和炎症程度均有改善。
实施例5:
(1)果胶类多糖(来源:白刺果实,结构如式II所示,其中n为24,Mw为8.45kDa,总糖含量99.2wt%,半乳糖醛酸含量97.5wt%,蛋白质含量0.02wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→),按照料液比1:1(mg/mL),加入0.9wt%浓度HNO3水溶液,搅拌(470转/分钟)28分钟,使果胶类多糖充分溶解。
(2)按照料液比19:1(mg/mL)加入BaC12粉末,搅拌(490转/分钟)9分钟,室温充分溶解;
(3)按照Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液1:19体积比,滴加9mg/mL的Na2SeO3水溶液,89℃条件下,搅拌(480转/分钟)反应9h;
(4)反应液冷却至室温后,加入无水碳酸钠粉末,调节溶液pH值至5.1;
(5)加入与BaC12等物质量(摩尔质量)的Na2SO4粉末,9000转/分钟,离心55min,去除沉淀,收集上清液;
(6)上清液装入透析袋(再生纤维素膜,截留分子量1000Da),流水透析44h,随后蒸馏水透析23h;
(7)透析袋内溶液浓缩至原体积的1/9,冷冻干燥(冷阱温度-65.5℃,真空度14.7Pa,北京博医康实验仪器有限公司,FD-1型真空冷冻干燥机)得到果胶类多糖亚硒酸酯化物,其硒元素含量为0.41mg/g。
本实施例制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物的结构式如式I所示,其中n为24,总糖含量99.2wt%,半乳糖醛酸含量97.5wt%,蛋白质含量0.02wt%,糖残基的构型和糖苷键主要为→1)-β-D-GalpA-(4→)。
(8)果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅造成的肺泡Ⅱ型上皮细胞A549损伤具有显著的保护作用:果胶类多糖亚硒酸酯化物与0.4mM乙酸铅共同作用A549细胞24h,果胶类多糖亚硒酸酯化物对乙酸铅诱导的A549细胞损伤保护作用EC50为0.22μg/mL,对乙酸铅诱导的A549细胞损伤的细胞毒作用IC50为315.7μg/mL。
(9)果胶类多糖亚硒酸酯化物对硫酸铅诱导的大鼠亚急性肺损伤具有显著的治疗作用:大鼠非暴露性气管滴注0.5mg/kg.bw硫酸铅,连续染毒3次,每次间隔24h后,口服灌胃给予50mg/kg.bw果胶类多糖亚硒酸酯化物,连续给药7天。与不给与果胶类多糖亚硒酸酯化物的大鼠亚急性肺损伤模型对照组相比,给药组大鼠最大自主通气量(MVV)和呼气流量峰值(PEF)分别增加23.6%和11.7%;支气管肺泡灌洗液(BALF)中总蛋白(TP)含量下降59.5%,白蛋白(ALB)含量下降40.9%,乳酸脱氢酶(LDH)含量下降27.2%,碱性磷酸酶(AKP)含量下降42.8%,丙二醛(MDA)含量下降30.4%;肺组织结构完整程度和炎症程度均有改善。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
2.根据权利要求1所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物,其特征在于,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物中硒元素的含量为0.2~1.0mg/g。
3.根据权利要求1所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物,其特征在于,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的总糖含量为90wt%~100wt%。
4.根据权利要求1或3所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物,其特征在于,以半乳糖醛酸为标准单糖,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物的半乳糖醛酸含量为90wt%~100wt%。
5.根据权利要求1所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物,其特征在于,所述果胶类多糖亚硒酸酯化物中糖残基的构型和糖苷键为→1)-β-D-GalpA-(4→。
6.权利要求1~5任一项所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将果胶类多糖与HNO3水溶液混合,得到果胶类多糖溶液;
将所述果胶类多糖溶液和氯化钡混合,得到混合液;
将所述混合液与Na2SeO3溶液混合进行酯化反应,得到上清液;
将所述上清液透析,得到所述果胶类多糖亚硒酸酯化物。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述果胶类多糖与HNO3水溶液的料液比为1~20mg:1mL,所述HNO3水溶液的质量浓度为0.1%~1.0%。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述Na2SeO3溶液与果胶类多糖溶液的体积比为1:20~1:10,所述Na2SeO3溶液的浓度为1~10mg/mL。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述酯化反应的温度为60~90℃,时间为8~12h。
10.权利要求1~5任一项所述的果胶类多糖亚硒酸酯化物或权利要求6~9任一项所述制备方法制得的果胶类多糖亚硒酸酯化物在制备铅所致肺损伤功效的药物中的应用。
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