CN102633899A

CN102633899A - 硒化微生物胞外多糖及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102633899A
Application number: CN2012101251879A
Authority: CN
Inventors: 赵良启; 聂瑞红; 吕利华; 刘坚
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2012-04-25
Filing date: 2012-04-25
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2032-04-25
Also published as: CN102633899B

Abstract

本发明提供了一种硒化微生物胞外多糖及其制备方法，其是将小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖加入到硝酸溶液中，搅拌，然后加入亚硒酸和氯化钡，再滴加硫酸，离心去除沉淀，上清液用氢氧化钠调PH至7，装入透析袋透析，减压浓缩透析液后加入食用酒精，析出硒化微生物胞外多糖，收集、冷冻干燥得到硒化小分子微生物胞外多糖。经测定该多糖硒含量可达586～790μg/g；经小鼠试验表明，该多糖具有良好抗肿瘤活性；该多糖可在制备抗肿瘤药物和保健品中应用。

Description

硒化微生物胞外多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及硒化多糖技术领域，具体是一种硒化小分子微生物胞外多糖及其制备方法和应用。

背景技术

生物多糖广泛存在于自然界中，参与能量转运、发育分化、免疫调节等生命活动过程。多糖种类丰富，具有絮凝性、成膜性、凝胶性、生物安全性、生物降解性、生物相容性等理化性质；并且多糖及其复合物在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、降血压等多方面具有良好的药理活性。影响多糖生物活性的结构因素包括多糖的主链性质、支链性质和多糖分子的高级结构；其中多糖主链的糖单元组成直接决定多糖的性质，如中等相对分子质量和良好的水溶性是保证抗肿瘤活性的必要条件；多糖的高级结构对其活性的影响更重要，三股螺旋空间结构是多糖产生抗肿瘤活性所必须的。因此，多糖进行适当的分子修饰和结构改造对于改变多糖的生物活性具有重要意义，修饰的方法很多，有硫酸酯化、硒化、乙酰基化、烷基化、羟甲基化等。硒化多糖因其在免疫调节、抗病毒、抗肿瘤活性、抗艾滋病方面得到了人们的广泛关注，因此近年来多糖的硒化成为多糖结构修饰的重要方向。

硒是生命必需的微量元素，硒的存在形式有无机硒和有机硒两种，常见的无机硒有亚硒酸钠和二氧化硒，有机硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能构成若干氧化酶的活性中心，可增强机体抵御相关疾病的能力。研究发现硒可延缓衰老，防治癌症，治疗克山病和大骨节病，提高视力和防治肝坏死等。人体血硒水平降低，会导致体内清除自由基的功能减退，造成有害物质积累增多，从而诱发心脑血管等疾病的发生。所以科学补硒对有效预防心脑血管，动脉硬化等疾病有较好的作用。众所周知，硒是人体必需的微量元素，但若摄入过多会对人体健康造成危害。第二军医大学附属长海医院营养科主任、第二军医大学临床营养学教研室主任和中国人民解放军临床营养中心主任蔡东联：从理论上讲，癌症病人都可以补硒。但是，如何补硒还是有讲究的。硒的特点是生物活性和毒性之间范围极端狭窄，而预防癌症需要超营养水平硒，目前向普通人群推荐硒用量控制在每天50～200μg，癌症放化疗辅助治疗一般需要大剂量硒，依不同阶段最高控制在每天800～1500μg。因此，癌症病人补硒一定要选择活性高，毒性低的硒形式。如此才能取得良好的效果。

随着生活水平的提高，众多食品保健公司，医药公司积极开发富硒食品和药品，购买富硒食品和药品已成为一种新的时尚。近年来出现了不少富硒产品和专利。如公开号ZL88103347授权了一种硒化卡拉胶的制法，该法制备的硒化卡拉胶，硒含量较低(2500～15000ppm)，生成硒化氢等有毒副产物：专利CN1560088A公开了一种硒化葡甘聚糖的制备方法，在一种Se^6-溶液中加入乙醇和盐酸，制成硒化反应液，然后加入葡甘聚糖，制成硒化葡甘聚糖，硒含量为125.4～197.3mg/kg，该硒多糖硒含量较低：专利CN101104644A公开了一种多糖亚硒酸酯的制法及其应用，该法是以糊精、右旋糖苷、阿拉伯糖基木聚糖与氟氧化硒加入吡啶中，加热反应0.1～100小时，得到一种多糖亚硒酸酯，最高硒含量可达45％，但该法反应时间较长，氟氧化硒化学性质不稳定，不适合工厂大规模生产。专利CN101024664A公开了一种硒半乳糖及其化学合成，该法是将半乳糖与有机硒化试剂反应，制备过程复杂，而且单糖不具有天然多糖所具有的药理活性。

以上专利中提到的硒化技术存在着反应时间长，反应副产物多，硒含量普遍低，反应过程复杂，可操作性差等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种硒化微生物胞外多糖及其制备方法和应用，硒化微生物胞外多糖的制备方法简单，副产物较少，制得的多糖硒含量适中，肿瘤抑制率高。

本发明提供的一种硒化小分子微生物胞外多糖，通过包括如下步骤的方法制得：

1)将小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖加入到质量浓度为1～2％的硝酸溶液中，室温下搅拌8～12小时使其溶解；然后加入亚硒酸和氯化钡，60～80℃反应6～8小时；所述的小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖与亚硒酸、氯化钡的质量比为1∶0.5～1.5∶0.6～1.2，优选1∶11∶0.9；

2)向上述反应液中滴加硫酸，滴加量按每克氯化钡加入1mol/L的硫酸10³/208mL，4000～6000转/分钟的条件离心15～20分钟去除沉淀；

3)调上清液PH值至7，装入截留分子量为3000～5000Da的透析袋，先用自来水透析48～72小时，之后用蒸馏水透析24～48小时；

4)减压浓缩至原体积的1/2，向浓缩液中加入3～4倍体积95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-50～-60℃、1～10Pa的条件下冷冻干燥24～36小时，得到硒化小分子微生物胞外多糖(简称Se-LREPS)，用紫外分光光度法检测硒含量为586～790μg/g。

经体外抗癌试验检测，制得的Se-LREPS对人肝癌细胞Hep-G2的抑制率达到7.89～67.13％；体内抗肿瘤试验检测，制得的Se-LREPS对S180荷瘤小鼠的抑瘤率达到40.8～69.2％。

所述的小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖，是将锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(可按照专利号ZL200510048129.0制备)经过微波辐照氧化降解处理(见文献：魏国琴等，小分子Rhizobium sp.N613胞外多糖的制备及其抗肿瘤活性，微生物学通报，2011，38(5)：743-749)，获得小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(简称LREPS)。

本发明的优点在于：硒化反应时间短，反应副产物少，无有毒副产物生成，反应过程简单，硒含量为586～790μg/g比较适中，肿瘤抑制率高，适于临床治疗应用。

具体实施方式：

实施例1

1)称取1.0克小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(7.216kD)加入到烧瓶中，然后加入质量浓度为1％的硝酸溶液100mL使其溶解，室温搅拌12小时；再称取0.5克亚硒酸和0.6克氯化钡加入烧瓶中，搅拌加热60℃下反应6小时；

2)向上述反应液中滴加1mol/L的硫酸2.88mL，6000转/分钟的条件离心15分钟去除沉淀；

3)用氢氧化钠调上清液PH值至7，装入截留分子量为3000Da的透析袋，先用自来水透析60小时，之后用蒸馏水透析24小时，直至用0.002mg/mL的抗坏血酸溶液检测透析袋外液不再变红为止；

4)将透析液在60℃、0.08Mpa下减压浓缩至原体积得1/2，向浓缩液中加入150mL 95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-50℃、1Pa的条件下冷冻干燥30小时，得Se-LREPS，用紫外分光光度法测的硒含量为586μg/g。

实施例2

1)称取1.0克小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(10.352kD)加入到烧瓶中，然后加入质量浓度为1％的硝酸溶液100mL使其溶解，室温搅拌8小时；再称取1.1克亚硒酸和0.9克氯化钡加入烧瓶中，搅拌加热70℃下反应7小时；

2)向上述反应液中滴加1mol/L的硫酸4.32mL，6000转/分钟的条件离心20分钟去除沉淀；

3)用氢氧化钠调上清液PH值至7，装入截留分子量为3000Da的透析袋，先用自来水透析48小时，之后用蒸馏水透析24小时，直至用0.002mg/mL的抗坏血酸溶液检测透析袋外液不再变红为止；

4)将透析液在60℃、0.08Mpa下减压浓缩至原体积得1/2，向浓缩液中加入200mL 95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-60℃、10Pa的条件下冷冻干燥24小时，得Se-LREPS，用紫外分光光度法测的硒含量为790μg/g。

实施例3

1)称取1.0克小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(30.641kD)加入到烧瓶中，然后加入质量浓度为2％的硝酸溶液100mL使其溶解，室温搅拌10小时；再称取1.5克亚硒酸和1.2克氯化钡加入烧瓶中，搅拌加热80℃下反应6小时；

2)向上述反应液中滴加1mol/L的硫酸5.76mL，5000转/分钟的条件离心15分钟去除沉淀；

3)用氢氧化钠调上清液PH值至7，装入截留分子量为5000Da的透析袋，先用自来水透析72小时，之后用蒸馏水透析36小时，直至用0.001mg/mL的抗坏血酸溶液检测透析袋外液不再变红为止；

4)将透析液在60℃、0.08Mpa下减压浓缩至原体积得1/2，向浓缩液中加入150mL 95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-55℃、5Pa的条件下冷冻干燥30小时，得Se-LREPS，用紫外分光光度法测的硒含量为670μg/g。

实施例4

1)称取1.0克小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(20.902kD)加入到烧瓶中，然后加入质量浓度为2％的硝酸溶液100mL使其溶解，室温搅拌8小时；再称取1.1克亚硒酸和1.2克氯化钡加入烧瓶中，搅拌加热60℃下反应8小时；

2)向上述反应液中滴加1mol/L的硫酸5.76mL，4000转/分钟的条件离心15分钟去除沉淀；

3)用氢氧化钠调上清液PH值至7，装入截留分子量为3000Da的透析袋，先用自来水透析72小时，之后用蒸馏水透析36小时，直至用0.001mg/mL的抗坏血酸溶液检测透析袋外液不再变红为止；

4)将透析液在60℃、0.08Mpa下减压浓缩至原体积得1/2，向浓缩液中加入150mL 95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-50℃、10Pa的条件下冷冻干燥36小时，得Se-LREPS，用紫外分光光度法测的硒含量为709μg/g。

实施例5

1)称取1.0克小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(10.352kD)加入到烧瓶中，然后加入质量浓度为2％的硝酸溶液100mL使其溶解，室温搅拌12小时；再称取1.1克亚硒酸和0.6克氯化钡加入烧瓶中，搅拌加热60℃下反应7小时；

2)向上述反应液中滴加1mol/L的硫酸2.88mL，5000转/分钟的条件离心20分钟去除沉淀；

3)用氢氧化钠调上清液PH值至7，装入截留分子量为5000Da的透析袋，先用自来水透析48小时，之后用蒸馏水透析48小时，直至用0.002mg/mL的抗坏血酸溶液检测透析袋外液不再变红为止；

4)将透析液在60℃、0.08Mpa下减压浓缩至原体积得1/2，向浓缩液中加入200mL 95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-55℃、10Pa的条件下冷冻干燥24小时，得Se-LREPS，用紫外分光光度法测的硒含量为720μg/g。

实施例6

1)称取1.0克小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖(30.641kD)加入到烧瓶中，然后加入质量浓度为2％的硝酸溶液100mL使其溶解，室温搅拌10小时；再称取1.5克亚硒酸和1.2克氯化钡加入烧瓶中，搅拌加热70℃下反应8小时；

2)向上述反应液中滴加1mol/L的硫酸5.76mL，6000转/分钟的条件离心15分钟去除沉淀；

3)用氢氧化钠调上清液PH值至7，装入截留分子量为3000Da的透析袋，先用自来水透析72小时，之后用蒸馏水透析24小时，直至用0.002mg/mL的抗坏血酸溶液检测透析袋外液不再变红为止；

4)将透析液在60℃、0.08Mpa下减压浓缩至原体积得1/2，向浓缩液中加入150mL 95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-60℃、5Pa的条件下冷冻干燥36小时，得Se-LREPS，用紫外分光光度法测的硒含量为598μg/g。

实施例7

MTT法测定不同硒含量Se-LREPS及相应硒含量Na₂SeO₃对人肝癌Hep-2细胞增殖的抑制作用。

1)溶液配制：分别取Se-LREPS(790μg/g)和Na₂SeO₃配制浓度为0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μmol/L的溶液，0.22微米微孔滤膜过滤除菌；

2)铺板：收集细胞瓶内对数生长期的细胞，经胰酶消化，于10mL离心管中离心，弃上清，加入新鲜培养基，调整细胞密度为1.5×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔加100μL。将培养板放入CO₂培养箱内12h；

3)加药：①实验组：将不同浓度的Se-LREPS与Na₂SeO₃，各孔中分别加入100μL，Se-LREPS终浓度1mg/mL。②空白对照组为细胞培养液，每组设5个复孔；

4)观察及测定：细胞板在37℃，5％CO₂下孵育24个小时，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL，即0.5％MTT)，继续培养4h。每孔加入150μL二甲基亚砜，低速振荡至结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪OD490nm处测量吸光值。每次实验重复3次。抑瘤率计算：

抑瘤率＝(对照组平均OD值-实验组平均OD值)/对照组平均OD值×100％

表1显示了Se-LREPS与亚硒酸钠对人肝癌Hep-G2细胞的抑制作用，可以看出Se-LREPS以及亚硒酸钠都有一定的抑制作用，且随着硒浓度的升高抑制率逐渐增强，其中Se-LREPS的抑制率最高达到67.13％。硒浓度在10μmol/L以下时，Se-LREPS的抑制率高于亚硒酸钠，但当硒浓度在10μmol/L以上时，亚硒酸钠抑制率高于Se-LREPS。有文献报道亚硒酸钠对正常细胞毒性较高，尤其是当硒浓度较高时，所以综合考虑，Se-LREPS作为开发高效低毒的抗癌制剂的候选优于Na₂SeO₃。

表1不同硒含量的Se-LREPS(硒含量：790μg/g)及相应硒含量的Na₂SeO₃对人肝癌细胞Hep-G2细胞增殖的影响

实施例8

1)肿瘤鼠的传代培养：将接种了S180肿瘤细胞的肿瘤鼠培养7d左右，抽出腹水，用生理盐水以1∶4的比例稀释，接种于小鼠腹腔内，(0.2mL/只)；

2)建立荷瘤小鼠模型：昆明种小鼠每组10只，雌雄各半，随机分组。分成5、10、20、30、40、50μg/g剂量组和阴性、阳性对照组。抽取接种1w左右的肝癌S180的肿瘤鼠的腹水，以生理盐水配制成10⁶个/mL的肿瘤细胞悬液，在每只小鼠左腋皮下接种0.2mL，建立荷瘤小鼠模型；

3)给药：分别给小鼠腹腔注射不同量(5、10、20、30、40、50μg·g^-1·d^-1)的和LREPS，给阴性对照组注射生理盐水，阳性对照组注射环磷酰胺，连续注射10天，然后测定Se-LREPS和LREPS(10.352kD)对S180荷瘤小鼠瘤重及脏器指数的影响，结果见表2。

表2Se-LREPS(硒含量：790μg/g)和LREPS(10.352kD)不同剂量对S180荷瘤小鼠瘤重及脏器指数的影响

表2显示，Se-LREPS和LREPS都有明显的抗肿瘤活性，Se-LREPS和LREPS的抑瘤率最高分别达到62.5％和55.0％，在给药剂量为20μg/g以下时，Se-LREPS的抑瘤率高于LREPS且小鼠免疫功能增强；但硒含量的控制也很重要，如果多糖硒含量过高，反而会产生副作用。

Claims

1.一种硒化小分子微生物胞外多糖，其特征在于，通过包括如下步骤的方法制得：

1)将小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖加入到质量浓度为1～2％的硝酸溶液中，室温下搅拌8～12小时使其溶解；然后加入亚硒酸和氯化钡，60～80℃反应6～8小时；所述的小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖与亚硒酸、氯化钡的质量比为1∶0.5～1.5∶0.6～1.2；

4)减压浓缩至原体积的1/2，向浓缩液中加入3～4倍体积95％的食用酒精析出硒化小分子胞外多糖，-50～-60℃、1～10Pa的条件下冷冻干燥24～36小时，得到硒化小分子微生物胞外多糖。

2.如权利要求1所述的硒化微生物胞外多糖，其特征在于，所述的小分子锦鸡儿根瘤菌胞外多糖与亚硒酸、氯化钡的质量比为1∶1.1∶0.9。

3.如权利要求1所述的硒化微生物胞外多糖在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.如权利要求1所述的硒化微生物胞外多糖在制备保健品中的应用。