CN101148481A - 低聚葡萄糖硫酸酯及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低聚葡萄糖硫酸酯及其制备方法，通过有机溶剂分散浓硫酸，进而利用其进行酯化和分解反应同步进行，得到分子量较大的低聚葡萄糖硫酸酯，进一步水解或酶解可降低其分子量。本发明利用纤维素、淀粉所制备的低聚葡萄糖硫酸酯结构可控，可调节分子量和硫酸根取代度，从而获得不同聚合度和取代度的低聚葡萄糖硫酸酯，所制得的低聚葡萄糖硫酸酯具有免疫调节和抗癌活性的作用。且本发明方法工艺简单，原料来源丰富。
Description
技术领域
本发明涉及糖类衍生物的生产，具体地说是涉及低聚葡萄糖的硫酸酯化衍生物及其制备方法。
背景技术
多糖硫酸酯(polysaccharides sulfated，PSS)是指含有硫酸基团的天然及其半合成的酸性多糖，多糖大分子链中单糖分子上的某些羟基被硫酸根所取代而形成的一类化学结构复杂、生物活性多样、构效关系鲜明的多糖衍生物。硫酸酯化多糖的制备包括从天然原材料中分离纯化和人工合成两条途径。天然多糖硫酸酯主要通过从陆地、海洋动植物的组织和微生物中提取获得，主要有肝素、软骨素、褐藻多糖硫酸酯、硫酸酯化半乳聚糖；人工合成的硫酸酯化多糖主要是通过人工化学修饰的方法使多糖含硫酸基团，主要包括硫酸化右旋糖酐、硫酸化香菇多糖、硫酸化裂褶多糖(硫酸化戊聚糖、硫酸化木聚糖、硫酸化地衣多糖等。通过对天然硫酸多糖的研究表明，多糖硫酸酯具有抗凝、增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒(如艾滋病毒HIV、巨噬细胞病毒、流感病毒)等一系列生物活性。早在1964年Nahmias等就报道肝素对单纯疱疹有抑制作用；1987年又发现硫酸酯化葡聚糖具有抑制艾滋病毒HIV活性；德国已研制出治疗艾滋病的木聚糖硫酸酯，临床上已试用，获得良好的效果。多糖硫酸酯种类繁多，其活性大小总的来说受其分子量的大小、硫酸基团的取代度和支链结构的影响。譬如，一些硫酸葡聚糖因分子量大，无法跨越细胞膜障碍，而无法发挥生物学活性；另外有些多糖硫酸化衍生物，由于硫酸根基团过多，甚至表现出一定的毒副作用。因此，采取一定的方法调节多糖的聚合度和取代度是获得目标活性多糖分子的有效方法。
近年来，对于直接提取各种天然多糖硫酸酯的研究较多。而对于利用自然界中大量存在的纤维素、淀粉来制备低聚葡萄糖硫酸酯的研究尚未见报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用纤维素、淀粉制备的可调节分子量和硫酸根取代度的低聚葡萄糖硫酸酯。
本发明的另一目的是提供一种利用纤维素、淀粉来制备具有可调节分子量和硫酸根取代度的低聚葡萄糖硫酸酯的方法。
本发明的技术方案如下：
低聚葡萄糖硫酸酯，其特征在于：糖链中仅含β-D-葡萄糖，并通过α-1，4-糖苷键或β-1，4-糖苷键连接而成，部分葡萄糖上羟基被硫酸根基团取代，其重均分子量为5×102Da～1×104Da，硫酸根取代度为0.1～0.5。
上述低聚葡萄糖硫酸酯的制备方法，具体由下列步骤实现：
步骤1：将容器置于-10℃～0℃恒温环境中，磁力搅拌，向硫酸中滴加正丙醇，按正丙醇：硫酸摩尔比为1∶1～1∶2.5配置混合反应液；
步骤2：将淀粉或纤维素50g加入0.5L～3L上述反应液中，保持温度-10℃～0℃，反应1h～10h；
步骤3：将步骤二反应完成的反应液抽滤，并用乙醇或丙醇洗涤，直到洗涤液中不再显酸性；
步骤4：将抽滤后的残渣溶于1L～3L水中，维持温度在60℃～90℃，搅拌使均匀；
步骤5：常温抽滤，滤液即为不同聚合度的葡萄糖硫酸酯水溶液，向上述水溶液中加入1～50倍体积乙醇，将所得溶液3000rpm高速离心机离心10min～15min，可得分级沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯；沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸酯粉末。
上述步骤4中同时滴加NaOH或KOH溶液，调节其pH值到7～9，搅拌反应2h～5h。
还包括步骤6：以每升溶液中加入100-300克粉末的比例将得到的低聚葡萄糖硫酸酯粉末加入浓度为10％～20％的稀硫酸或浓度为5％-15％的纤维素酶溶液中，低聚葡萄糖硫酸酯粉末溶解于此稀硫酸或纤维素酶溶液，进一步降低低聚葡萄糖硫酸酯的聚合度，将此溶有低聚葡萄糖硫酸酯粉末的溶液通过液相色谱并通过折光示差检测器可分离得到具有不同聚合度的低聚葡萄糖硫酸酯。
采用上述方案后，通过有机溶剂分散浓硫酸，进而利用其进行酯化和分解反应同步进行，得到分子量较大的低聚葡萄糖硫酸酯，进一步水解或酶解可降低其分子量。本发明利用纤维素、淀粉所制备的低聚葡萄糖硫酸酯结构可控，可调节分子量和硫酸根取代度，从而获得不同聚合度和取代度的低聚葡萄糖硫酸酯，所制得的低聚葡萄糖硫酸酯具有免疫调节和抗癌活性的作用。且本发明方法工艺简单，原料来源丰富。
具体实施方式
本发明低聚葡萄糖硫酸酯，糖链中仅含β-D-葡萄糖，并通过α-1，4-糖苷键或β-1，4-糖苷键连接而成，部分葡萄糖上羟基被硫酸根基团取代，其重均分子量为5×102Da～1×104Da，硫酸根取代度为0.1～0.5。
本发明低聚葡萄糖硫酸酯的制备方法：
实施例1：低聚葡萄糖硫酸酯的制备方法
量取800ml浓硫酸(98％)倒入烧杯，将烧杯置于-5℃的低温恒温槽中，加入正丙醇600ml。称取干棉花40g加入上述配置好的反应液中，保持温度0℃，反应5h。用砂芯漏斗抽滤除去反应液，用5L丙醇洗涤，直至洗涤液中不再显酸性。将抽滤后的残渣溶于2L水中，维持温度在60℃，搅拌使均匀。常温抽滤，滤液即为葡萄糖硫酸酯水溶液，向上述水溶液中加入10倍体积乙醇，将所得溶液3000rpm高速离心机离心10min，可得低聚葡萄糖硫酸酯沉淀。沉淀干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸酯粉末。
实施例2：低聚葡萄糖硫酸钾的制备方法
量取800ml浓硫酸(98％)倒入烧杯，将烧杯置于-5℃的低温恒温槽中，加入正丙醇600ml。称取干棉花40g加入上述配置好的反应液中，保持温度0℃，反应5h。用砂芯漏斗抽滤除去反应液，用5L丙醇洗涤，直至洗涤液中不再显酸性。将抽滤后的残渣溶于2L水中，维持温度在60℃，搅拌使均匀，并同时滴加KOH溶液，调节其pH到9，搅拌反应2h。常温抽滤，滤液即为葡萄糖硫酸钠水溶液，向上述水溶液中加入10倍体积乙醇，将所得溶液3000rpm高速离心机离心10min，可得低聚葡萄糖硫酸钾沉淀。可得低聚葡萄糖硫酸钾沉淀。沉淀干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸钾粉末。
实施例3：低聚葡萄糖硫酸钾的制备方法
量取800ml浓硫酸(98％)倒入烧杯，将烧杯置于-5℃的低温恒温槽中，加入正丙醇400ml。称取干棉花40g加入上述配置好的反应液中，保持温度0℃，反应10h。用砂芯漏斗抽滤除去反应液，用5L丙醇洗涤，直至洗涤液中不再显酸性。将抽滤后的残渣溶于2L水中，维持温度在90℃，搅拌使均匀，并同时滴加KOH溶液，调节其pH到9，搅拌反应4h。常温抽滤，滤液即为葡萄糖硫酸钠水溶液，向上述水溶液中加入50倍体积乙醇，将所得溶液3000rpm高速离心机离心15min，可得低聚葡萄糖硫酸钾沉淀。可得低聚葡萄糖硫酸钾沉淀。沉淀干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸钾粉末。
本发明低聚葡萄糖硫酸酯在制备药物中的应用：
应用1：低聚葡萄糖硫酸酯的抗凝血活性作用
取多份健康人的血液混合，3.8％的柠檬酸钠与血浆体积比1∶9混合抗凝，迅速于3000rpm离心20min，取上清液为贫血小板血浆(PPP)，分装至塑料离心管内，-20℃冷冻储存，临用时用37℃恒温水浴融化，5h内测量相应指标。
分别取浓度为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的低聚葡萄糖硫酸钠溶液0.5mL，加入血浆0.5mL，混匀后放入凝血仪，仪器自动吸取血浆混合液0.1mL和凝血活酶试剂0.1mL，37℃下保温3min，再自动加入0.1mL浓度为0.025mol/L的CaCl2溶液，混合后自动记录血浆凝固时间，即为APTT。按照上述取样，仪器自动吸取0.2mL血浆混合液，37℃下保温2min，再加入已保温的凝血酶0.2mL，混合后自动记录血浆凝固时间，即为TT。按照上述取样，仪器自动吸取0.1mL血浆混合液，37℃下保温2min，再加入已保温好的含钙凝血活酶0.2mL，混合后自动记录血浆凝固时间，即为PT。所得结果如表1。
表1低聚葡萄糖硫酸钠的抗凝血活性
| 样品 | 浓度(μg/mL) | APTT(s) | PT(s) | TT(s) |
| 空白 | 0.5 | 33.8 | 16.6 | 23.3 |
| 肝素 | 1 | 55.0 | 24.8 | 30.0 |
| 2 | ＞120 | 36.0 | 44.4 | |
| 5 | ＞120 | 36.3 | ＞50 | |
| 低聚葡萄糖硫酸钠 | 5 | 62.4 | 22.2 | 29.1 |
| 10 | 85.5 | 28.7 | 36.2 | |
| 20 | ＞120 | 30.5 | ＞50 |
应用2：低聚葡萄糖硫酸酯的病毒空斑抑制作用
Vero细胞在24孔板上培养至单层分组备用，4％小牛血清2倍1640培养基和融化的1.2％琼脂糖溶液于43～45℃等体积混合，得到2％小牛血清、0.6％琼脂糖营养覆盖培养基。低聚葡萄糖硫酸钠用营养覆盖培养基稀释至相应浓度(20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、)。HSV-2病毒稀释到约30～50PFU/孔，加入含糖营养覆盖培养基，混匀后立即加入对应孔内。细胞对照组只加营养培养基，病毒对照组加含HSV-2病毒覆盖培养基，实验组加含HSV-2病毒和相应浓度低聚葡萄糖硫酸钠营养覆盖培养基。待营养覆盖培养基凝固后倒置培养2d，加入含1∶25000中性红的0.6％琼脂糖上层培养基，凝固后倒置培养1d。观察病斑形成情况，结果如表2。
表2低聚葡萄糖硫酸钠对HSV-2空斑形成的抑制
| CKcell | CKvirus | 样品浓度(μg/mL) | |||||
| 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | |||
| 空斑数(x±s) | - | 30.5±8.7 | 14.5±2 | 9.4±1.2 | 5.2±1.1 | 2.4±0.6 | - |
| 空斑抑制率(％) | - | - | 52.5 | 69.2 | 83 | 92.2 | 100 |
应用3：低聚葡萄糖硫酸酯对小鼠的免疫调节和抗癌活性作用
用本发明的产品按现有方法对小鼠作抗癌活性实验，结果如表3。从表中可看出，本发明产品能提高荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数，抑瘤率达到32％，具有一定的免疫和抗癌活性。
表3低聚葡萄糖硫酸钠对小鼠的免疫活性和抗癌活性
| 组别 | 瘤株 | 给药途径和剂量 | 胸腺指数 | 脾指数 | 抑瘤率 |
| 生理盐水组 | S180 | 8.83 | 2.12 | 0％ | |
| 顺铂组 | S180 | ip(2mg/kg) | 3.76 | 0.82 | 82％ |
| 低聚葡萄糖硫酸钠组 | S180 | ip(2mg/kg) | 9.32 | 1.56 | 32％ |
| 低聚葡萄糖硫酸钾组 | S180 | ip(2mg/kg) | 7.66 | 1.87 | 42％ |
Claims (4)
1.低聚葡萄糖硫酸酯，其特征在于：糖链中仅含β-D-葡萄糖，并通过α-1，4-糖苷键或β-1，4-糖苷键连接而成，部分葡萄糖上羟基被硫酸根基团取代，其重均分子量为5×102Da～1×104Da，硫酸根取代度为0.1～0.5。
2.低聚葡萄糖硫酸酯的制备方法，其特征在于，具体由下列步骤实现：
步骤1：将容器置于-10℃～0℃恒温环境中，磁力搅拌，向硫酸中滴加正丙醇，按正丙醇：硫酸摩尔比为1∶1～1∶2.5配置混合反应液；
步骤2：将淀粉或纤维素50g加入0.5L～3L上述反应液中，保持温度-10℃～0℃，反应1h～10h；
步骤3：将步骤二反应完成的反应液抽滤，并用乙醇或丙醇洗涤，直到洗涤液中不再显酸性；
步骤4：将抽滤后的残渣溶于1L～3L水中，维持温度在60℃～90℃，搅拌使均匀，并同时滴加NaOH或KOH溶液，调节其pH到7～9，搅拌反应2h～5h；
步骤5：常温抽滤，滤液即为不同聚合度的葡萄糖硫酸酯水溶液，向上述水溶液中加入1～50倍体积乙醇，将所得溶液3000rpm高速离心机离心10min～15min，可得分级沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯；沉淀的低聚葡萄糖硫酸酯干燥粉碎后得低聚葡萄糖硫酸酯粉末。
3.根据权利要求2所述的低聚葡萄糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：上述步骤4中同时滴加NaOH或KOH溶液，调节其pH值到7～9，搅拌反应2h～5h。
4.根据权利要求2所述的低聚葡萄糖硫酸酯的制备方法，其特征在于，还包括步骤6：以每升溶液中加入100-300克粉末的比例将得到的低聚葡萄糖硫酸酯粉末加入浓度为10％～20％的稀硫酸或浓度为5％-15％的纤维素酶溶液中，低聚葡萄糖硫酸酯粉末溶解于此稀硫酸或纤维素酶溶液，进一步降低低聚葡萄糖硫酸酯的聚合度，将此溶有低聚葡萄糖硫酸酯粉末的溶液通过液相色谱并通过折光示差检测器可分离得到具有不同聚合度的低聚葡萄糖硫酸酯。
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